JP5209103B2

JP5209103B2 - 顕微鏡画像撮像装置

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Publication number: JP5209103B2
Application number: JP2011217896A
Authority: JP
Inventors: 茂内山; 貴之井上; 正利奥河
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2005-03-17
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2026-03-17
Also published as: US8422127B2; WO2006098443A1; EP1865354A4; EP1865354A1; EP1865354B1; JP4871264B2; US20090002811A1; JP2012042970A; US20130084390A1; JPWO2006098443A1

Description

この発明は、試料載置ステージに載置された試料表面を所定方向にスキャンしながら該試料表面の局所顕微鏡画像を順次撮像していく顕微鏡画像撮像装置に関するものである。

従来から、対物レンズの光軸に直交する平面（スキャン平面）に沿って移動可能な試料載置ステージを備えた顕微鏡画像撮像装置が知られている。このような顕微鏡画像撮像装置は、試料が載置された試料載置ステージをスキャン平面に沿って移動させながら該試料表面の局所顕微鏡画像を順次撮像していく。この際、撮像部の焦点は、試料載置ステージの移動に合わせて試料表面における所望の撮像位置に逐次一致するよう微調整される。

また、上述のような構造を有する顕微鏡画像撮像装置に適用可能なフォーカシング装置としては、例えば特許文献１に記載されたフォーカシング装置が知られている。この特許文献１に記載されたフォーカシング装置は、試料表面における任意の３点Ｘ、Ｙ、Ｚの座標情報から予め該試料表面に相当する仮想平面の数式情報を求め、この数式情報に基づいて該試料面の傾き成分が補正された観察点のＺ座標情報を求め、そして、このＺ座標情報に基づいて対物レンズをＺ軸方向に駆動することにより観察点に焦点を合わせる。

特開平９−３０４７０３号公報

発明者らは、従来の顕微鏡画像撮像装置について検討した結果、以下のような課題を発見した。具体的には、上記特許文献１に記載されたような従来の顕微鏡画像撮像装置において、対物レンズをＺ軸方向（対物レンズの光軸方向）に駆動するフォーカス用アクチュエータとして例えばステッピングモータなどが採用された場合、以下のような課題が発生する。

すなわち、ステッピングモータにより構成された対物レンズの駆動系には、モータの正逆回転時の誤差、ギヤのバックラッシュ、ボールネジ機構の捩じれ剛性による誤差などに起因するロストモーションがある。そのため、対物レンズをＺ軸方向に沿って一方向（プラス側）へ駆動した直後に逆方向（マイナス側）に駆動する場合、あるいは、マイナス側へ駆動した直後にプラス側に駆動する場合、対物レンズがリアルタイムに追従できなくなり、撮像対象エリア内に設定される各撮像位置にＣＣＤカメラなどの撮像部の焦点を確実に合わせることができなくなる。

この発明は、上述のような課題を解決するためになされたものであり、フォーカス用アクチュエータの種類によらず、試料が存在する撮像対象エリア内において撮像部の撮像可能エリアを所定方向にスキャンさせる際、該撮像対象エリア内に設定される撮像位置に撮像部の焦点を確実に合わせていくことが可能な構造を備えた顕微鏡画像撮像装置を提供することを目的としている。

この発明に係る顕微鏡画像撮像装置は、撮像部の撮像可能エリアを所定方向にスキャンしながら試料表面の局所顕微鏡画像を順次撮像していく顕微鏡画像撮像装置に関し、試料載置ステージと、ＣＣＤカメラなどの撮像部と、対物レンズと、第１駆動機構と、第２駆動機構と、そして、制御部を備える。試料載置ステージは、顕微鏡観察用試料が載置される試料載置面を有する。撮像部は、試料載置面に対向するよう配置され、該試料載置面上の撮像対象エリアのうち撮像可能エリア（撮像部が一度に撮像可能な領域）内に存在する試料の一部を順次撮像する。対物レンズは、撮像部と試料載置面との間に配置され、撮像対象エリアのうち撮像可能エリアの像（撮像部の撮像対象となった試料の局所顕微鏡画像）を撮像部に結像する。第１駆動機構は、試料載置ステージを平面に沿って移動させる。これにより、第１駆動機構は、試料載置ステージ及び対物レンズの相対位置を調節する。第２駆動機構は、対物レンズを該対物レンズの光軸方向に沿って移動させる。これにより、第２駆動機構は、試料載置ステージ及び対物レンズの相対位置を調節する。そして、制御部は、第１及び第２駆動機構を制御することで、撮像対象エリアにおける撮像部の焦点位置を調節しながら該撮像部の撮像可能エリアを所定のスキャン方向に沿って相対的に移動させる。

特に、この発明に係る顕微鏡画像撮像装置において、制御部は、撮像対象エリアに対して複数の焦点計測位置を設定し、設定された複数の焦点計測位置における合焦点位置に基づいて、フォーカスマップを作成し、撮像対象エリア内において撮像部の撮像可能エリアが所定のスキャン方向に相対的に移動している間、作成されたフォーカスマップに基づいて、対物レンズをその光軸方向に沿って移動させる。その際、複数の焦点測定位置は、前記撮像エリアを構成する撮像単位ごとに設定されるのが好ましい。また、試料載置ステージの試料載置面は、スキャン平面に対して傾いている。より具体的には、試料載置ステージの試料載置面は、対物レンズの光軸と交差する該試料載置面上の直線がスキャン平面と所定角度で交差する程度の傾きを有する。

上述のように、この発明に係る顕微鏡画像撮像装置は、試料載置ステージと対物レンズとが所定のスキャン方向に相対的に移動するのに伴い、撮像対象エリアに対して撮像部の撮像可能エリアが該所定のスキャン方向に移動していくよう構成されている。この際、制御部は、撮像対象エリア内において撮像部の撮像可能エリアが所定のスキャン方向に相対的に移動している間、該撮像部の焦点位置が対物レンズの光軸方向に沿って一方向のみに単調に調節されるよう、第１駆動機構を制御する。なお、この「焦点位置の単調な調節」には、焦点位置が一定に維持されている状態も含まれる。そのため、対物レンズを撮像部の焦点位置に微調整する方向は、試料表面に対して焦点位置を浅くするマイナス方向又は試料表面に対して焦点位置を深くするプラス方向のいずれかとなる。

また、この発明に係る顕微鏡画像撮像装置において、試料載置ステージの試料載置面は、試料載置面上に試料、例えば組織片が配置されたスライドガラスが載置されたとき、該スライドガラスの対物レンズを介して撮像部に対面する面がスキャン平面に対して傾斜する程度の傾きを有するのが好ましい。試料載置面上に載置される試料の体積及び形状は一定ではなく、したがって、該組織片を覆うカバーガラスの表面の傾斜は、試料載置面の傾斜に依存しない場合がある。この場合、撮像部の焦点位置を微調整する方向が一方向のみに安定しなくなる可能性がある。そのため、スキャン面に対する試料載置面の傾斜角θは、少なくとも、試料載置面上の試料表面が該試料載置面の傾斜方向に一致する程度（必ずしも傾斜角は一致しなくてもよい）必要となる。

なお、この発明に係る各実施例は、以下の詳細な説明及び添付図面によりさらに十分に理解可能となる。これら実施例は単に例示のために示されるものであって、この発明を限定するものと考えるべきではない。

また、この発明のさらなる応用範囲は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明及び特定の事例はこの発明の好適な実施例を示すものではあるが、例示のためにのみ示されているものであって、この発明の思想及び範囲における様々な変形及び改良はこの詳細な説明から当業者には自明であることは明らかである。

この発明に係る顕微鏡画像撮像装置によれば、撮像部の撮像可能エリアが撮像対象エリア内を所定のスキャン方向に移動していく間、該撮像部の焦点距離は、試料載置面の傾斜に応じて単調変化する（なお、この単調変化には、撮像部の焦点距離が維持されている状態も含む）。その結果、対物レンズの光軸方向に沿って該対物レンズの位置を微調整する方向は、一定方向のみに制限される。

上記構成により、この発明の顕微鏡画像撮像装置は、フォーカス用アクチュエータとしてステッピングモータが適用された場合であっても、該ステッピングモータによる駆動系でのロストモーションの発生が効果的に抑制され、撮像対象エリア内に設定される各撮像位置に撮像部の焦点を正確に合わせることが可能になる（試料表面における特定部位の明瞭な局所顕微鏡画像が得られる）。

また、この発明に係る顕微鏡画像撮像装置によれば、試料載置ステージの試料載置面は、試料載置面上に試料が載置されたとき、該試料の対物レンズを介して撮像部に対面する面がスキャン平面に対して傾斜する程度の傾きを有する。この場合、試料の体積及び形状によらず、対物レンズの光軸方向に沿って該対物レンズの位置を微調整する方向を、一定方向のみに制限することが可能になる。

上記構成により、この発明に係る顕微鏡画像撮像装置は、フォーカス用アクチュエータとしてステッピングモータが採用された場合であっても、該ステッピングモータによる駆動系でのロストモーションの発生が確実に防止され、撮像対象エリア内に設定される各撮像位置に撮像部の焦点を正確に合わせることが可能になる（試料表面における特定部位の明瞭な局所顕微鏡画像が得られる）。

この発明に係る顕微鏡画像撮像装置の一実施例の概略構成を示す斜視図である。図１に示されたスライドガラス収納部（カセットホルダ含む）の構成を示す斜視図であって、カセットホルダのホルダ部が傾斜した状態を示す。図２に示されたカセット部へスライドガラスカセットを装着する作業を説明するための斜視図である。図２に示されたスライドガラス搬送部のＸ軸ステージの構成を示す部分斜視図である。図１に示されたスライドガラス載置部の、マクロ観察ポジションにおける平面図である。図１に示されたスライドガラス載置部の、スキャンポジションにおける平面図である。図１に示されたスライドガラス撮像部の構成を示す模式図である。図７に示されたスライドガラス内のサンプル試料の撮像対象エリアが、それぞれ撮像部の撮像可能エリアと同程度のサイズである複数の撮像単位に区分された第１例を示す模式図である。図７に示されたように傾斜した試料載置面上に一列に並んだ撮像単位に対する撮像部の焦点位置を、図８に示されたスキャニング方向に沿って示すグラフである。比較例として、水平な試料載置面上に一列に並んだ撮像単位に対する撮像部の焦点位置を、図８に示されたスキャニング方向に沿って示すグラフである。図７に示されたスライドガラス内のサンプル試料の撮像対象エリアが、それぞれ撮像部の撮像可能エリアよりも大きいサイズである複数の撮像単位に区分された第２例を示す模式図である。撮像対象エリアにおける焦点位置の他の決定方法を説明するための図である。

以下、この発明に係る顕微鏡画像撮像装置の一実施例を、図１〜図１２を用いて詳細に説明する。なお、図面の説明において、同一部分、同一要素には同一符号を付して重複する説明を省略する。また、以下の説明では、図面の上部及び下部が装置上部及び下部にそれぞれ対応しているものとして説明する。

図１は、この発明に係る顕微鏡画像撮像装置の一実施例の概略構成を示す斜視図である。

図１に示された顕微鏡画像撮像装置は、サンプル試料、例えば、病理組織試料の組織片が密封されたスライドガラス（プレパラート）などの顕微鏡画像を撮像する装置である。この顕微鏡画像撮像装置は、サンプル試料が密封された複数のスライドガラスを収納するスライドガラス収納部１と、スライドガラス収納部１からスライドガラスを１枚ずつ取り出し、順次搬送するスライドガラス搬送部２と、スライドガラス搬送部２により搬送されたスライドガラスを載置し、該スライドガラスを所定方向に移動させるスライドガラス載置部３と、スライドガラス載置部３上のサンプル試料の顕微鏡画像を撮像するスライドガラス撮像部４を、少なくとも備える。

スライドガラス収納部１は、図２に示されたように、支持枠１１、ホルダ部１２、スライドガラスカセット１３を備える。なお、少なくとも支持枠１１及びホルダ部１２によりカセットホルダが構成されている。ホルダ部１２は、水平軸ＡＸを中心に矢印Ｓ１で示された方向に回転可能な状態で支持枠１１に保持されており、支持枠１１は、スライドガラスの取り出し口が図２に示されたように上方を向くようにスライドガラスカセット１３が傾けられた姿勢（第１姿勢）でホルダ部１２を保持するとともに、スライドガラスの取り出し口が垂直に位置するようスライドガラスカセット１３が起立している姿勢（第２姿勢）でホルダ部１２を保持する。これら第１及び第２姿勢間では、ホルダ部１２が水平軸ＡＸを中心に一定の回転速度で回動する。また、縦長のボックス形状を有するスライドガラスカセット１３には、図３に示されたように、複数のスライドガラスＳＧが正面の開口部から取出し可能な状態で積層されている。

図２に示されたように、スライドガラス搬送部２は、スライドガラス収納部１の手前側に配置されており、左右のＹ軸方向に延びるＹ軸ステージ２１と、Ｙ軸ステージ２１により左右のＹ軸方向に位置制御されるＺ軸ステージ２２と、Ｚ軸ステージ２２により上下のＺ軸方向に位置制御されるＸ軸ステージ２３とを備える。Ｘ軸ステージ２３には、図４に示されたように、スライドガラス収納部１の各スライドガラスカセット１３に収納されたスライドガラスＳＧを１枚ずつ引き出すように前後のＸ軸方向に進退駆動される引出しハンド２３Ａが設けられている。

ここで、図５及び図６に示されたように、スライドガラス載置部３は、ステップ送りステージ３２と、スキャン送りステージ３３を備える。ステップ送りステージ３２は、ベースステージ３１に付設されたステッピングモータ３１Ａによりボールねじ機構を介してＸ軸方向に位置制御される。また、スキャン送りステージ３３は、ステップ送りステージ３２に付設されたステッピングモータ３２Ａによりボールねじ機構を介してＹ軸方向に位置制御される。なお、このスキャン送りステージ３３が試料載置ステージとして機能する。

試料載置ステージとしてのスキャン送りステージ３３には、スライドガラスＳＧを載置したスライドガラス搬送部２の引出しハンド２３Ａ（図４参照）が上下に通過できる切欠きが形成されている。この切欠きの両側の部分が引出しハンド２３Ａより幅広のスライドガラスＳＧの左右の側縁部を支持することで、スライドガラスＳＧを載置する試料載置面が構成されている。

スキャン送りステージ３３上には、引出しハンド２３Ａにより試料載置面に載置されたスライドガラスＳＧの例えば左側の側辺を受け止める位置決めブロック３４が固定されている。また、スキャン送りステージ３３上には、スライドガラスＳＧの例えば右側の側辺を位置決めブロック３４側に押圧してスライドガラスＳＧを所定位置に保持するためのスライドガラス押さえアーム３５がピン３６を介して回転可能な状態で支持されている。

スライドガラス押さえアーム３５は、スライドガラスＳＧの左側の側方に向かって延びる受動部３５Ａと、スライドガラスＳＧの右側の側方に向かって延びる押動部３５Ｂにより構成され、Ｕ字状の平面形状を有する。また、スライドガラス押さえアーム３５は、ピン３６を中心に反時計方向に回動するようにばね付勢されている。

このスライドガラス押さえアーム３５において、スキャン送りステージ３３が図５に示されたように左端側のマクロ観察ポジションに移動すると、受動部３５Ａは、ベースステージ３１側の不動部材である当て板３７に当接することでピン３３Ｃを中心に時計方向に回動する。このとき、押動部３５Ｂは、スライドガラスＳＧの右側の側辺から離間する。

また、スライドガラス押さえアーム３５において、スキャン送りステージ３３が図６に示されたように右端側のスキャンポジションに移動すると、受動部３５Ａは、当て板３７から離間することでピン３３Ｃを中心に反時計方向に回動する。このとき、押動部３５Ｂは、スライドガラスＳＧの右側の側辺を位置決めブロック３４側に押圧し、該スライドガラスＳＧを所定位置に保持するよう機能する。

図１に示されたスライドガラス撮像部４は、図７に模式的に示されたように、
スキャン光源４１と、光学系４２と、撮像部であるＣＣＤカメラ４３と、ステージ用ＸＹ軸駆動機構３８（第１駆動機構）と、フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４（第２駆動機構）と、制御装置５（制御部）とを備える。スキャン光源４１は、スキャン送りステージ３３（図６参照）の試料載置面３３Ａに載置されたスライドガラスＳＧに下方から撮像光を照射する。光学系４２は、スライドガラスＳＧを透過した撮像光が入射される対物レンズ４２Ａを含む。ＣＣＤカメラ４３は、光学系４２を介して撮像光を受光する。ステージ用ＸＹ軸駆動機構３８は、スキャン送りステージ３３を、対物レンズ４２Ａの光軸に直交するスキャン面に沿って移動させる。フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４は、ＣＣＤカメラ４３とともに光学系４２の対物レンズ４２ＡをＺ軸の光軸方向に位置制御することでスライドガラスＳＧに対するＣＣＤカメラ４３の焦点位置を調整するとを備えている。

ＣＣＤカメラ４３は、２次元画像の取り込み動作が可能な構成を有する。また、フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４は、汎用性の高いステッピングモータにボールねじ機構を組み合わせた構成を有する。そして、これらＣＣＤカメラ４３及びフォーカス用Ｚ軸駆動機構４４は、制御装置５により、上述のスキャン送りステージ３３（図６参照）をＸ軸方向及びＹ軸方向に駆動するステッピングモータ３１Ａ、３２Ａなどを含むステージ用ＸＹ軸駆動機構３８とともに制御される。

制御装置５は、例えばパーソナルコンピュータのハードウェア及びソフトウェアを利用して構成され、入出力インターフェースＩ／Ｏ、Ａ／Ｄコンバータ、プログラム及びデータを記憶したＲＯＭ（Read OnlyMemory）、入力データ等を一時記憶するＲＡＭ（Random Access Memory）、プログラムを実行するＣＰＵ（CentralProcessing Unit）等をハードウェアとして備える。

この制御装置５は、スライドガラスＳＧを載置したスキャン送りステージ３３をＹ軸方向のスキャン方向及びＸ軸方向のステップ送り方向に移動させるようにステージ用ＸＹ軸駆動機構３８を制御する。その際、スライドガラスＳＧに密封されたサンプル試料を含む撮像対象エリア内に設定される各撮像位置に順次ＣＣＤカメラ４３の焦点が合うように対物レンズ４２ＡをＺ軸の光軸方向に位置制御する（ＣＣＤカメラ４３の焦点位置の微調整）。そして、制御装置５は、対物レンズ４２Ａを介して試料表面の局所顕微鏡画像を順次取り込むようにＣＣＤカメラ４３を制御する。

ここで、フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４は、ステッピングモータにボールねじ機構を組み合わせた構造を有するので、駆動方向が反転する際には、モータの正逆回転時の誤差、ギヤのバックラッシュ、ボールネジ機構の捩じれ剛性による誤差などに起因するロストモーションが発生する虞がある。その結果、対物レンズ４２ＡはＺ軸の光軸方向にリアルタイムに追従できなくなり、スライドガラスＳＧに密封されたサンプル試料の各部（ＣＣＤカメラ４３の撮像可能エリアが位置する部分）に順次ＣＣＤカメラ４３の焦点を合わせゆくのが困難になることが予測される。

そこで、このような事態を回避して対物レンズ４２Ａがサンプル試料の各部（像対象エリア内における撮像位置）に順次焦点を合わせることができるようにする必要がある。そこで、この実施例において、スキャン送りステージ３３の試料載置面３３Ａは、対物レンズ４２Ａの光軸に直行するスキャン平面に対して所定の傾斜角θだけ傾斜している。この試料載置面３３Ａの傾きは、サンプル試料が密封されたスライドガラスＳＧの表面の傾斜よりも大きくなるように設定されている。

図８には、サンプル試料を含む撮像対象エリアＦを例えば一辺が２５ｍｍの正方形とし、この撮像対象エリアＦを縦横１０×１０の格子状に区分することにより、一辺が２．５ｍｍの正方形の撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９で撮像対象エリアＦが構成されている第１例が示されている。なお、図中、撮像単位Ｆ００から撮像Ｆ０９へ向かう実線矢印の縦方向がスキャン方向を示し、撮像単位Ｆ００から撮像単位Ｆ９０へ向かう実線矢印の横方向がステップ送り方向を示す。また、この図８の例では、ＣＣＤカメラ４３の撮像可能エリアのサイズは各撮像単位と略同じであり、したがって、符号Ｐは各撮像単位の中心点Ｐの位置が各撮像単位に対するＣＣＤカメラ４３の焦点位置となっている。また、この明細書では、光学系４２を介してＣＣＤカメラ４３に結像される撮像可能エリアの像を局所顕微鏡画像と規定しているので、この図８の第１例の場合、得られる局所顕微鏡画像それぞれが一撮像単位となる。

ここで、サンプル試料が病理組織試料である場合、撮像単位Ｆ００から撮像単位Ｆ０９までの一列のスキャン方向の長さ２５ｍｍ内における撮像対象エリアＦの高所と低所とを結ぶ最大傾斜は、通常、１０〜２０μｍ／２５ｍｍ程度である。そこで、この実施例においては、試料載置面３３Ａの傾きの大きさは、２５〜５０μｍ／２５ｍｍ（＝１〜２μｍ／ｍｍ）の範囲のうち、例えば５０μｍ／２５ｍｍ（２００μｍ／１００ｍｍ）に設定されている。なお、試料載置面３３Ａの傾斜は、スキャン方向に沿って傾斜するように、例えばスキャンの開始位置が高く、終了位置が低くなるように設定されている。

次に、以上のように構成された顕微鏡画像撮像装置の動作について説明する。なお、この顕微鏡画像撮像装置では、図７に示されたスキャン送りステージ３３の傾斜した試料載置面３３Ａに載置されたスライドガラスＳＧを対象とし、これに密封されたサンプル試料を含む撮像対象エリアＦ（図８参照）における各撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９の局所顕微鏡画像が順次撮像されるものとする。

まず、制御装置５は、図８に示された撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９それぞれの中心点Ｐにおける焦点位置データを取得し、これをフォーカスマップとして記憶しておく。

フォーカスマップの作成に当たり、制御装置５は、ステージ用ＸＹ軸駆動機構３８へ制御信号を出力することにより、図８に示された撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９の順にＣＣＤカメラ４３の撮像位置が一致するようスキャン方向及びステップ送り方向に順次スキャン送りステージ３３を移動させる。すなわち、スキャン送りステージ３３は、撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９それぞれが順番に対物レンズ４２Ａの直下に位置するよう移動する。

その間、制御装置５は、対物レンズ４２Ａの直下に位置する撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９それぞれの中心点ＰにおけるＣＣＤカメラ４３の焦点データを取得する。すなわち、制御装置５は、フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４へ制御信号を出力し、対物レンズ４２ＡをＣＣＤカメラ４３の焦点位置の前後でＺ軸（対物レンズ４２Ａの光軸方向）に沿って連続的に移動させる。同時に、制御装置５は、ＣＣＤカメラ４３へ制御信号を出力し、焦点位置の異なる複数の顕微鏡画像を該ＣＣＤカメラ４３に撮像させる。

そして、制御装置５は、焦点位置の異なる複数の顕微鏡画像のコントラスト、明度など画像特性を比較評価し、鮮明な画像が得られた焦点位置を撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９それぞれの中心点ＰにおけるＣＣＤカメラ４３の焦点データとして取得し、撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９のフォーカスマップを作成する。

撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９のフォーカスマップを作成した後、制御装置５は、ステージ用ＸＹ軸駆動機構３８への制御信号を出力し、撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９それぞれが順次ＣＣＤカメラ４３の撮像可能エリアに一致していくよう、スキャン送りステージ３３を図８に示されたように移動させる（図８に示されたスキャン方向及びステップ送り方向にスキャン送りステージ３３を順次移動させることで、撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９それぞれの直上に対物レンズ４２Ａが位置するように移動させる）。その間、制御装置５は、フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４への制御信号を出力し、フォーカスマップに記憶されたＣＣＤカメラ４３の焦点位置に一致させるよう対物レンズ４２ＡをＺ軸方向に移動させ。そして、制御装置５は、所定の焦点位置でＣＣＤカメラ４３へ制御信号を出力し、撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９それぞれの局所顕微鏡画像を順次該ＣＣＤカメラ４３に撮像させる。

ここで、図９は、上述のフォーカスマップにデータとして記憶された撮像対象エリアＦの任意一列のスキャン方向に沿って焦点位置を結んだグラフである。図中、２点鎖線で示す斜線は、上述のように例えば５０μｍ／２５ｍｍ（２００μｍ／１００ｍｍ）の傾斜を有する試料載置面３３Ａ（基準面）を示している。

この図９に示されたように、任意一列のスキャン方向に沿ったＣＣＤカメラ４３の焦点位置は、プラス１００μｍ〜マイナス１００μｍの間で階段状に順次減少している。これは、各撮像単位の中心ＰにＣＣＤカメラ４３の焦点を合わせるようにフォーカス用Ｚ軸駆動機構４４が対物レンズ４２ＡをＺ軸の光軸方向に微調整する方向がマイナス方向の一方のみに制限されることを示している。

したがって、この実施例に係る顕微鏡画像撮像装置によれば、フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４がステッピングモータにボールねじ機構を組み合わせた構造を有するにも拘わらず、フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４にはロストモーションが発生しなくなる。その結果、対物レンズ４２Ａを介して撮像可能エリアと一致したサンプル試料の一部にＣＣＤカメラ４３の焦点を正確に合わせることができるようになる。

一方、図１０は、比較例として、水平な試料載置面上に一列に並んだ局所領域に対する撮像部の焦点位置を、図８に示されたスキャニング方向に沿って示すグラフである。この図１０に示されたグラフでは、任意一列のスキャン方向に沿った各撮像単位の焦点位置は、プラス２０μｍ〜マイナス２０μｍの間でノコギリ歯状に増減している。これは、各撮像単位の中心ＰにＣＣＤカメラ４３の焦点を合わせるようにフォーカス用Ｚ軸駆動機構４４が対物レンズ４２ＡをＺ軸方向（対物レンズ４２Ａの光軸方向）に微調整する方向がプラス方向からマイナス方向へ、また、マイナス方向からプラス方向へと変化することを示している。この場合、フォーカス用Ｚ軸駆動機構４４にロストモーションが発生し、その結果、対物レンズ４２Ａが捉えるサンプル試料の各部、具体的には各撮像単位の中心PにＣＣＤカメラ４３の焦点を正確に合わせることができなくなる。

なお、この発明に係る顕微鏡画像撮像装置は、上述の実施例に限定されるものではない。例えば、図７に示されたフォーカス用Ｚ軸駆動機構４４は、スキャン送りステージ３３を対物レンズ４２Ａの光軸方向に一致したＺ軸方向に位置制御してもよい。また、スキャン送りステージ３３に替え、ＸＹ軸駆動機構又はＸＹＺ軸駆動系が光学系４２及びＣＣＤカメラ４３に設けられてもよい。

また、図７に示されたＣＣＤカメラ４３は、一次元画像の取り込み動作を行う一次元ＣＣＤカメラであってもよい。例えば、一般的なラインセンサやＴＤＩセンサなどが適用されてもよい。すなわち、一次元ＣＣＤカメラなどの撮像部による顕微鏡画像の撮像動作は、以下のように行われる。なお、図１１は、図７に示されたスライドガラス内のサンプル試料全体を含む撮像対象エリアが、それぞれ撮像部の撮像可能エリアよりも大きいサイズである複数の撮像単位に区分された第２例を示す模式図である。

図１１に示されたように、撮像対象エリアＦは、複数のストリップ状撮像単位Ｆ１〜Ｆ９に区分されている。一次元ＣＣＤカメラの撮像可能エリアは、図１１中の撮像単位Ｆ１内に斜線で示したＸ軸方向を長手方向とする領域である。試料が載置されたスキャン送りステージ４３上において、撮像可能エリアがスキャン方向（Ｙ軸の負の方向）に走査されることにより、順次結像され取得される該撮像可能エリアの複数の局所顕微鏡画像がＹ軸方向に並べられた撮像単位Ｆ１の画像（ストリップ形状を有する画像）が得られる。このように、この撮像単位Ｆ１のストリップ状画像が図１１の第２例における一撮像単位となる。さらに、図１１に示されたように、撮像単位Ｆ１で行われた撮像可能エリアのスキャニングが、撮像対象エリアＦの長手方向（Ｘ軸の正の方向）に沿ってステップしながら複数回繰り返されることにより、撮像単位Ｆ１〜Ｆ９のストリップ状画像がそれぞれ得られる。このようにして得られた撮像単位Ｆ１〜Ｆ９のストリップ状画像をＸ軸方向に並べた状態で合成することで、試料の全体画像（撮像対象エリアＦ全体の顕微鏡画像）が生成される。

また、上述の実施例では、対物レンズ４２Ａの光軸に直交するスキャン平面に対して傾斜した試料載置面３３Ａを有するスキャン送りステージ３３が例示されているが、これに限定されるものではなく、例えば、市販のスキャン送りステージが、その試料載置面がスキャン平面に対して傾斜するように固定されてもよい。あるいは、傾斜角度を可変可能な傾斜ステージやチルトステージが適用されてもよい。傾斜角度が可変可能なステージが適用される場合には、試料載置面の傾斜が無い状態で載置された試料について作成されたフォーカスマップに基づいて、試料載置面のスキャン平面に対する傾斜角度が設定されるのが好ましい。

また、フォーカスマップの作成に関し、図８では、撮像単位Ｆ００〜Ｆ９９それぞれの中心点Ｐにおける焦点位置データが取得されたが、これに限定されるものではない。図１２は、試料の撮像対象エリアＦ全体に対する焦点情報の取得方法の他の例を示す模式図である。この図１２に示された焦点情報の取得方法では、撮像対象エリアＦに対して３点の焦点計測位置ＰＦが設定されている。そして、３点の焦点計測位置ＰＦのそれぞれについて上述の方法で焦点計測が行われることで、合焦点位置が求められる。このとき、３点の焦点計測位置ＰＦに基づいて求められた合焦点位置から、直線補完によって撮像対象エリアＦ内の任意の位置に対する合焦点位置が求められる。このような方法によっても、撮像対象エリアＦの各部に対する合焦点位置などの焦点情報が効率的に取得され得る。また、撮像対象エリアＦ内において４点以上の焦点計測位置ＰＦを設定し、最小二乗法によって撮像対象エリアＦ内の任意の位置に対する合焦点位置を求める場合、さらに精度良く焦点位置の制御が可能なる。

以上の本発明の説明から、本発明を様々に変形しうることは明らかである。そのような変形は、本発明の思想及び範囲から逸脱するものとは認めることはできず、すべての当業者にとって自明である改良は、以下の請求の範囲に含まれるものである。

この発明に係る顕微鏡画像撮像装置は、細胞分析などの検査装置に適用可能である。

１…スライドガラス収納部（カセットホルダ）、２…スライドガラス搬送部、３…スライドガラス載置部、３１…ベースステージ、３２…ステップ送りステージ、３３…スキャン送りステージ、３３Ａ…試料載置面、３８…ステージ用ＸＹ軸駆動機構（第１駆動機構）、４…スライドガラス撮像部、４１…スキャン光源、４２…光学系、４３…ＣＣＤカメラ（撮像部）、４４…フォーカス用Ｚ軸駆動機構（第２駆動機構）、４５…制御装置、ＳＧ…スライドガラス。

Claims

試料が載置される試料載置面を有する試料載置ステージと、
前記試料載置面に対向するよう配置され、前記試料載置面上の撮像対象エリア内の各部を順次撮像する撮像部と、
前記撮像部と前記試料載置面との間に配置され、前記撮像対象エリアのうち前記撮像部の撮像可能エリアの局所顕微鏡画像を前記撮像部に結像するための対物レンズと、
前記試料載置ステージをスキャン平面に沿って移動させることにより、前記試料載置ステージ及び前記対物レンズの相対位置を調節する第１駆動機構と、
前記対物レンズを前記対物レンズの光軸方向に沿って移動させることにより、前記試料載置ステージ及び前記対物レンズの相対位置を調節する第２駆動機構と、そして、
前記第１及び第２駆動機構を制御することで、前記撮像対象エリアにおける前記撮像部の焦点位置を調節しながら前記撮像部の撮像可能エリアを所定のスキャン方向に沿って相対的に移動させる制御部と、を備え、
前記試料載置ステージの試料載置面は、前記スキャン平面に対して傾いており、
前記制御部は、
前記撮像対象エリアに対して複数の焦点計測位置を設定し、
設定された前記複数の焦点計測位置における合焦点位置に基づいて、フォーカスマップを作成し、
前記撮像対象エリア内において前記撮像部の撮像可能エリアが前記所定のスキャン方向に相対的に移動している間、作成された前記フォーカスマップに基づいて、前記対物レンズをその光軸方向に沿って移動させる
ことを特徴とする顕微鏡画像撮像装置。
前記制御部は、前記撮像対象エリア内において前記撮像部の撮像可能エリアが前記所定のスキャン方向に相対的に移動している間、前記撮像部の焦点位置が前記対物レンズの光軸方向に沿って一方向のみに単調に調節されるよう、前記第１駆動機構を制御することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像撮像装置。
前記試料載置ステージの試料載置面は、前記対物レンズの光軸と交差する該試料載置面上の直線が前記スキャン平面と所定角度で交差する程度の傾きを有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像撮像装置。
前記複数の焦点測定位置は、前記撮像エリアを構成する撮像単位ごとに設定されることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像撮像装置。
前記試料載置ステージの前記試料載置面は、前記試料載置面上に試料が載置されたとき、該試料の前記対物レンズを介して前記撮像部に対面する面を前記スキャン平面に対して傾斜させる程度の傾きを有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像撮像装置。