WO2006018946A1 - 自動焦点装置及びそれを用いた顕微鏡装置 - Google Patents

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WO2006018946A1
WO2006018946A1 PCT/JP2005/013299 JP2005013299W WO2006018946A1 WO 2006018946 A1 WO2006018946 A1 WO 2006018946A1 JP 2005013299 W JP2005013299 W JP 2005013299W WO 2006018946 A1 WO2006018946 A1 WO 2006018946A1
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focus
sample
image
measurement
changing
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PCT/JP2005/013299
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French (fr)
Inventor
Shigeru Uchiyama
Takayuki Inoue
Masatoshi Okugawa
Original Assignee
Hamamatsu Photonics K.K.
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Publication date
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B7/00—Mountings, adjusting means, or light-tight connections, for optical elements
    • G02B7/28—Systems for automatic generation of focusing signals
    • G02B7/36—Systems for automatic generation of focusing signals using image sharpness techniques, e.g. image processing techniques for generating autofocus signals
    • G02B7/38—Systems for automatic generation of focusing signals using image sharpness techniques, e.g. image processing techniques for generating autofocus signals measured at different points on the optical axis, e.g. focussing on two or more planes and comparing image data
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N23/00—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof
    • H04N23/60—Control of cameras or camera modules
    • H04N23/67—Focus control based on electronic image sensor signals

Definitions

  • the present invention relates to an autofocus device for controlling the focus when acquiring an image of a sample, and a microscope apparatus using the autofocus device.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 5-288981
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, and provides an autofocus device that can accurately determine the in-focus position in a short time, and a microscope device using the autofocus device. For the purpose.
  • the autofocus device includes (1) an imaging means for acquiring an image based on an optical image of a sample to be observed, and (2) light from a sample force. And a light guide optical system that guides the optical image of the sample to the imaging means, and (3) changes the focal position of the sample with respect to the image pickup means and the light guide optical system in the optical axis direction.
  • the image power of multiple samples acquired in the first focus measurement executed while continuously changing the focus position in one direction.Calculate the first focus measurement value and set the focus position to the first focus. Multiple tests acquired in the second focus measurement performed while continuously changing in the opposite direction to the measurement. It calculates the power of the image the second focal point measurement value, and obtains the focus position in the sample based on the first focal point measurement value and the second focal point measurement value.
  • the focal point for acquiring images of a plurality of samples while continuously changing the focal point position is not stopped at every fixed change interval.
  • the in-focus position is obtained using a measurement method. This makes it possible to acquire focus information for the observation position of the sample in a short time.
  • the focus position is changed twice and the focus measurement is performed twice, and the in-focus position is determined by referring to the focus measurement values calculated for each. .
  • the effect of the delay in changing the focus position is reversed in the two focus measurements. Therefore, the final in-focus position can be accurately obtained by using the focus measurement values obtained by calculating the plurality of image forces in the two focus measurements.
  • a microscope apparatus controls acquisition of an image of a sample based on the above-described autofocus device and focus information including a focused position obtained by a focus control unit with respect to the observation position of the sample. And image acquisition control means.
  • the focus position is changed twice and the focus measurement is performed twice, and the focal position calculated with respect to the observation position of the sample is obtained with reference to the focus measurement values calculated respectively.
  • the microscope apparatus is configured using the autofocus apparatus. This makes it possible to accurately obtain the in-focus position when acquiring an image of the sample in a short time, and to execute the sample observation with high accuracy and efficiency.
  • the image of a plurality of samples is obtained while continuously changing the focal position by focus measurement for obtaining the in-focus position.
  • the focus direction is changed twice and the focus measurement is performed twice, and the in-focus position is obtained by referring to the focus measurement values calculated in each case.
  • the in-focus position can be accurately obtained in a short time.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a configuration of an embodiment of a microscope apparatus using an autofocus device.
  • FIG. 2 is a graph showing the in-focus position obtained by focus measurement in one direction.
  • Fig. 3 is a graph showing the in-focus position obtained by bidirectional focus measurement.
  • FIG. 4 is a graph showing a delay in changing the focus position in focus measurement.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of a method of acquiring focus information for the entire observation target region of the sample.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing another example of a method for acquiring focus information for the entire observation target region of a sample.
  • FIG. 7 is a graph showing a change in straightness error with respect to the stage feed position.
  • FIG. 8 is a graph showing a change in straightness error with respect to the stage feed position. Explanation of symbols
  • 1A Microscope device, 10 ... Sample stage, 15 ... Stage drive unit, 20 ... Light guiding optical system, 21 ... Objective lens, 25 ... Optical system drive unit, 30 "CCD Camera (imaging device), 50 ... Control equipment 51, focus control unit, 52 ... image acquisition control unit, 55 ... focus information storage unit, 58 ... input device, 59 ... display device.
  • CCD Camera imaging device
  • FIG. 1 is a block diagram showing a configuration of an embodiment of a microscope apparatus using an autofocus device according to the present invention.
  • This microscope apparatus 1A is used for acquiring an image of the sample S.
  • the vertical direction that is the optical axis direction in the microscope apparatus 1A is the z-axis direction
  • the horizontal direction that is perpendicular to the optical axis is the X-axis direction and the y-axis direction.
  • the sample S to be observed by the microscope apparatus 1A is a biological sample, for example, and is placed on the sample stage 10.
  • the sample stage 10 is an XY stage that is movable in the X direction and the y direction (horizontal direction). By driving the XY stage 10 in the xy plane, a microscope apparatus 1 A for the sample S is used. The observation position is set or changed. The sample stage 10 is driven and controlled by the XY stage driving unit 15. In this configuration, the XY stage driving unit 15 functions as an observation position changing unit that changes the observation position of the sample S with respect to the microscope apparatus 1A in the direction perpendicular to the optical axis.
  • a light guide optical system 20 for guiding a light image of the sample S is provided above the stage 10 with respect to the sample S on the sample stage 10.
  • the light guide optical system 20 includes an objective lens 21 on which light from the sample S is incident and an optical element necessary for guiding and focusing the light image of the sample S.
  • a CCD camera 30 as an imaging device is installed at a predetermined position on the optical path where the light image of the sample S is guided by the light guide optical system 20.
  • the CCD camera 30 is an imaging unit that acquires an image based on an optical image of the sample S.
  • the light guide optical system 20 and the CCD camera 30 are integrally fixed with the optical axis and the distance between the optical system 20 and the camera 30 adjusted.
  • an optical system drive unit 25 is installed for the light guide optical system 20 and the CCD camera 30. Yes.
  • the optical system drive unit 25 is configured using, for example, a stepping motor or a piezoelectric actuator, and moves the optical system 20 and the camera 30 fixed to the optical system 20 in the z-axis direction that is the optical axis direction.
  • the optical system driving unit 25 functions as a focus changing unit that changes the focal position of the sample S with respect to the CCD camera 30 and the light guide optical system 20 in the optical axis direction.
  • the optical system driving unit 25 is used for controlling the focus in acquiring an image of the sample S.
  • a control device 50 having a focus control unit 51 and an image acquisition control unit 52 is installed for the sample stage 10, the light guide optical system 20, and the CCD camera 30.
  • the focus control unit 51 uses the CCD camera 30 and the optical system drive unit 25 to acquire focus information including the in-focus position in the image acquisition of the sample S.
  • the sample stage 10 the light guide optical system 20, the CCD camera 30 as the imaging means, the stage drive unit 15 as the observation position changing means, and the optical as the focus changing means.
  • the system drive unit 25 and the focus control unit 51 of the control device 50 constitute an automatic focus device for acquiring focus information used when acquiring an image of the sample S.
  • the focus information acquired by the focus control unit 51 is stored in the focus information storage unit 55.
  • the image acquisition control unit 52 determines the in-focus position obtained by the focus control unit 51 with respect to the observation position of the sample S.
  • the acquisition of the image of the sample S is controlled based on the included focus information.
  • the image acquisition control unit 52 refers to the focus information including the in-focus position read from the focus information storage unit 55, and the CCD camera 30 performs the image acquisition operation of the sample S. Then, the focus change operation by the optical system drive unit 25 and the observation position change operation by the stage drive unit 15 are controlled, and the observation of the sample S and the acquisition of the image are executed under the desired observation conditions.
  • the control device 50 including the focus control unit 51 and the image acquisition control unit 52 is configured by a computer including a CPU and a storage device such as a necessary memory and a hard disk, for example.
  • An input device 58 and a display device 59 are connected to the control device 50.
  • the input device 58 includes, for example, a keyboard and mouse force connected to a computer, and the focus information acquisition operation or the image by the focus control unit 51 in the microscope device 1A. It is used for inputting information, instructions, etc. necessary for execution of an image acquisition operation by the image acquisition control unit 52.
  • the display device 59 is configured by, for example, a CRT display or a liquid crystal display connected to a computer, and is used for displaying necessary information regarding focus information acquisition and image acquisition in the microscope device 1A.
  • the focus information including the in-focus position in the image acquisition of the sample S is performed by the focus control unit 51 of the control device 50 as described above.
  • the focus control unit 51 uses the CCD camera 30, which is an imaging unit, the optical system driving unit 25, which is a focal point changing unit, or the stage driving unit 15, which is an observation position changing unit, if necessary. Execute focus information acquisition for acquisition.
  • the focus control unit 51 drives the CCD camera 30 and the light guide optical system 20 in the z-axis direction, which is the optical axis direction, by the optical system driving unit 25, and sets the focal position in the sample S along the z-axis direction. Change continuously. During the continuous change of the focal position, focus measurement is performed to acquire an image of the sample S at every predetermined change interval, and analysis is performed on the obtained plurality of images. In addition, a focus measurement value indicating an in-focus position where the image acquisition focus by the light guide optical system 20 is calculated is calculated.
  • the change range of the focus position at which the focus measurement is performed is appropriately set so that the focus position is included in the change range.
  • For calculation of focus measurement values using multiple images acquired by the CCD camera 30 over the set focus position change range for example, contrast between multiple images, brightness levels, etc.
  • a method is used in which a change in image characteristics is evaluated, and based on the evaluation result, the position where the image acquisition is most focused and calculated as a focus measurement value is used.
  • FIG. 2 is a graph showing the in-focus position obtained by focus measurement in one direction.
  • the horizontal axis represents the measurement time t in the focus measurement performed while continuously changing the focal position z of the sample S
  • the vertical axis represents the focal position z.
  • graph A1 shows the focal position that the focus control unit 51 instructs the optical system driving unit 25
  • graph A2 shows the actual focal position set by the optical system driving unit 25.
  • FIG. 3 is a graph showing the in-focus position obtained by bidirectional focus measurement.
  • graph B1 shows the focus position that the focus control unit 51 instructs the optical system drive unit 25
  • graph B2 shows the actual focus position set by the optical system drive unit 25. .
  • the focus control unit 51 performs the first focus measurement while continuously changing the focus position on the sample S in one direction along the z-axis direction.
  • the first focus measurement value is also calculated for the image force of the sample S acquired at predetermined change intervals during that time. At this time, the obtained first focus measurement value has an error due to a delay in changing the focus position, as indicated by an arrow B6 in FIG.
  • the focus control unit 51 further executes the second focus measurement while continuously changing the focus position in the sample S in the direction opposite to the first focus measurement along the z-axis direction. In the meantime, the second focus measurement value of the image force of the sample S acquired at every predetermined change interval is calculated. At this time, the obtained second focus measurement value has an error in the opposite direction to the first focus measurement value due to the delay in changing the focus position, as indicated by an arrow B7 in FIG. Yes.
  • the focus control unit 51 obtains the in-focus position in the sample S from the average value of the first focus measurement value and the second focus measurement value, as indicated by a broken line BO in FIG.
  • the focus position is continuously changed by the optical system driving unit 25 that does not stop the change of the focus position in the sample S at every fixed change interval.
  • the focal position is obtained using a focus measurement method in which images of a plurality of samples S are acquired by the CCD camera 30 while changing. Thereby, it is possible to acquire the focus information for the observation position of the sample S in a short time.
  • the focus position change direction with respect to the optical axis direction is changed, and the focus measurement is performed twice.
  • the in-focus position is obtained with reference to the calculated focus measurement value.
  • the error of the focus measurement value due to the influence of the delay in changing the focus position is in the reverse direction. Therefore, the final in-focus position can be accurately obtained by using the first and second focus measurement values obtained by calculating the plurality of image forces in each of the first and second focus measurements.
  • the in-focus position for acquiring the image of the sample S can be accurately obtained in a short V and time, and the sample S can be efficiently obtained with high accuracy. It becomes possible to carry out observations.
  • the effects of the autofocus device and the microscope device 1A will be described in detail.
  • the delay of the focal position changing operation due to this is a few tens of ms: about LOOms (milliseconds).
  • the focus control unit The focal position instructed by 51 and the actual focal position set by the optical system driving unit 25 are shifted by 3 images in terms of the number of images. Such image shift is further increased by using an imaging device having a high frame rate. According to the above-described apparatus configuration and focus information acquisition method, the influence of such image shift can be eliminated by performing focus measurement in both directions.
  • the frame rate of image acquisition is 30 Hz
  • the number of images acquired for focus measurement is 30 for one direction.
  • the time required for bidirectional focus measurement is 2 seconds.
  • Figure 4 is a graph showing the delay in changing the focus position in focus measurement.
  • a graph C1 indicates a focus position instructed by the focus control unit 51 to achieve a predetermined change speed
  • a graph C2 indicates an actual focus position set by the optical system driving unit 25.
  • Graph D1 shows the focus position indicated by the focus control unit 51 so that the change speed is slower than the change speed in the graph C1
  • the graph D2 shows the actual focus position set by the optical system drive unit 25. Is shown.
  • the delay in changing the focal point position at Dl and D2 when the change speed is set slow is the change at Cl and C2 when the change speed is set fast. Smaller than the delay.
  • the focus position change delay in focus measurement and the error that occurs in the focus measurement value vary depending on the specific conditions of focus measurement such as the focus position change speed. Such a difference in error also occurs due to, for example, the type of equipment used in the optical system driving unit 25, individual characteristics, or changes in apparatus characteristics over time.
  • the focus information acquisition method described above uses a method that performs two focus measurements and cancels the influence of the delay in changing the focus position, it is related to the uncertainty of such errors. Therefore, it is possible to reliably obtain the in-focus position.
  • the focus measurement is performed under the same conditions with respect to the conditions other than the change direction of the focus position, for example, the change range of the focus position, the change interval, etc. in the two focus measurements. It is preferable. Alternatively, conditions other than the changing direction of the focal position may be set to different conditions.
  • the focus position on the sample S in the first focus measurement and the second focus measurement With respect to the change interval it is preferable to acquire a plurality of images used for calculation of the focus measurement value by acquiring the image of the sample S for each change interval of the focus position set to the depth of field or less. .
  • the in-focus position with respect to the observation position of the sample S can be obtained with sufficiently high accuracy.
  • NA the numerical aperture of the objective lens 21 used in the light guide optical system 20
  • NA It is about 0.5 m at 0.7.
  • the focal position changing interval for example, a method of setting the changing interval with half the depth of field can be used.
  • the focal position change interval may be set larger than the depth of field in accordance with the required focal position accuracy.
  • the derivation of the in-focus position using the first focus measurement value and the second focus measurement value is based on the average value of the first and second focus measurement values. It is preferable to determine the position. In the first and second focus measurements in which the direction of change of the focal position is reversed, the direction of the delay in changing the focal position is usually reverse and the magnitude is approximately equal. Therefore, by setting the average value of the first and second focus measurement values as the in-focus position as described above, the in-focus position in a state where the influence of the delay in changing the focus position has been canceled can be easily and reliably obtained. Can be sought.
  • the method for deriving the in-focus position a method other than the specific focus measurement method and the method for setting the average value to the in-focus position according to the characteristics of the equipment used to change the focus position, etc. May be used.
  • the imaging unit that acquires the image of the sample S acquires the focus information by the focus control unit 51 and the image acquisition control unit 52 acquires the image of the sample S.
  • a different imaging device may be used.
  • two optical paths, a focus control optical path and an image acquisition optical path, are set, and an imaging apparatus for focus control and an image acquisition apparatus for image acquisition are installed on each optical path.
  • the structure to be used can be used.
  • a configuration may be adopted in which an imaging device for focus control and an imaging device for image acquisition are switched and installed on a single optical path.
  • an image sensor such as a CCD camera capable of acquiring a two-dimensional image of the sample S as the imaging device for focus control.
  • an imaging device for image acquisition a linear sensor that can acquire a one-dimensional image of the sample S or an image sensor that can acquire a two-dimensional image can be used.
  • a linear sensor (line sensor) or TDI operation can be used as an imaging device for image acquisition.
  • TDI operation can be used as an imaging device for image acquisition.
  • a two-dimensional image sensor or the like In the configuration shown in FIG. 1, a CCD camera capable of both a normal two-dimensional image acquisition operation and a TDI line sensor operation may be used as the CCD camera 30.
  • an XY stage movable in the xy plane is used as the sample stage 10, and an XY stage driving unit 15 is provided for the stage 10.
  • the observation position with respect to the sample S can be adjusted in the xy plane.
  • the observation position on the sample S is set perpendicular to the optical axis in the xy plane by the XY stage driving unit 15. It is possible to change the direction.
  • the focus control unit 51 when acquiring an image of the sample S for a certain observation target region, as a method of acquiring focus information for the entire observation target region, the focus control unit 51 observes the sample S.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of a method for acquiring focus information for the entire observation target region of the sample.
  • the sample S is scanned over a wide range using the microscope apparatus 1A to acquire image data
  • the change in the focal position in the observation target region due to the tilt of the sample stage 10 or the shape of the sample S becomes a problem.
  • the observation area is small
  • the change in the focal position is not a problem even when the image of the sample S is acquired at multiple observation positions.
  • the observation target region R is divided into a plurality of focus measurement regions.
  • 10 ⁇ 10 focus measurement regions RF are set by dividing the rectangular observation target region R into 10 in the horizontal direction and 10 in the vertical direction. Then, by performing focus measurement for each of the 100 focus measurement areas RF by obtaining the focus position by the method described above, mapping data of the focus position with respect to the entire observation target area R can be created. According to such a method, it is possible to efficiently acquire focus information such as a focal point position with respect to the observation target region R including a plurality of observation positions.
  • the classification conditions such as the number of divisions of the observation target region R into the focus measurement region RF are appropriate depending on the specific size of the observation target region R and the accuracy of the required focus information. Set it.
  • the central point of the focus measurement region RF is the representative point RC, and this representative point RC is used as the measurement position to focus. It is preferable to perform measurement and derivation of the in-focus position.
  • the image acquisition control unit 52 performs mapping data of focus information stored in the focus information storage unit 55.
  • the image of sample S can be obtained by scanning the image and scanning the observation area R while referring to the data.
  • FIG. 5 shows an example of a method for acquiring the image of the sample S in the observation target region R.
  • an image scan from the upper side to the lower side in the figure (solid arrow) is repeated from the left side to the right side (dashed arrow) in the observation target region R, and the sample is applied to the entire area scale.
  • Get S images In this case, refer to the mapping data of the focus information and acquire the image while adjusting the focus position so as to follow the image scan in the observation target region R. You can get a good image.
  • the focus control unit 51 sets three or more focus measurement positions in the observation target region of the sample S, obtains the focus position for each of the three or more focus measurement positions, and determines the focus positions. It is preferable to use a method of obtaining a focal point position for each observation position in the observation target region.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing another example of a method for acquiring focus information for the entire observation target region of the sample.
  • three focus measurement positions PF are set for the observation target region R as described above.
  • focus measurement is performed by the above-described method to determine the in-focus position!
  • the in-focus position with respect to an arbitrary observation position in the observation target region R can be obtained by linear interpolation from the in-focus positions obtained at the three focus measurement positions PF.
  • the straightness of the XY stage is such as the eccentricity of the ball screw used to move the stage, the straightness of the guide itself (for example, the warp of the rail on which the stage moves), the flatness of the base part to which the guide is attached, and the guide mounting.
  • the stage may not move linearly due to the effects of undulations due to the screw fixing of the screw and vibration associated with the passing of rolling elements when the guide is a ball circulation type.
  • FIG. 7 and FIG. 8 are each a diagram showing changes in straightness error with respect to the stage feed position.
  • the graph in Figure 7 shows the change in straightness error over a wide feed position range. Yes. This mainly corresponds to the error pattern due to the warp of the rail on which the stage moves.
  • the graph in Fig. 8 shows the change in straightness error for a narrow feed position range. This mainly corresponds to an error pattern due to a feeding screw.
  • the automatic focusing apparatus and the microscope apparatus 1A described above it is possible to simultaneously correct the straightness of such a stage by acquiring the focus information by focus measurement.
  • the autofocus device and the microscope device according to the present invention are not limited to the above-described embodiments and configuration examples, and various modifications are possible.
  • focus changing means for changing the focal position of the sample S relative to the imaging means and the light guide optical system in the optical axis direction!
  • the CCD camera 30 and the light guide optical system are used.
  • Force using the optical system drive unit 25 that drives 20 in the z-axis direction.Other configurations such as a configuration in which the sample stage 10 on which the sample S is mounted are driven in the z-axis direction may be used! ,.
  • the observation position changing means for changing the observation position (imaging position) in the sample S in the direction perpendicular to the optical axis is the XY stage that drives the sample stage 10 in the xy plane in the configuration shown in FIG.
  • other configurations such as a configuration in which the CCD camera 30 and the light guide optical system 20 are driven in the xy plane may be used.
  • such an observation position changing means is not provided if it is not necessary, such as when acquiring an image with respect to the sample S at only one observation position.
  • the autofocus device includes (1) imaging means for acquiring an image based on an optical image of a sample to be observed, and (2) an objective lens on which light from the sample force is incident, A light guide optical system that guides the optical image of the light to the image pickup means, and (3) a focus change means that changes the focal position of the sample relative to the image pickup means and the light guide optical system in the optical axis direction, and (4) A focus control means for acquiring focus information when acquiring an image of the sample using the imaging means and the focus change means, and (5) the focus control means continuously moves the focus position in one direction by the focus change means.
  • the image power of multiple samples acquired in the first focus measurement performed while changing to the first focus measurement value is calculated, and the focus position is continuously changed in the opposite direction to the first focus measurement.
  • the image power of multiple samples acquired in the second focus measurement performed while calculating the second focus measurement value Both focus points on the sample based on the first and second focus measurements. I prefer to find the position!
  • the focus control means obtains the in-focus position from an average value of the first focus measurement value and the second focus measurement value. In this case, the in-focus position in a state where the influence of the delay in changing the focal position has been canceled can be reliably obtained.
  • other methods may be used depending on the specific focus measurement method for determining the in-focus position.
  • the focus control means acquires images of a plurality of samples at every focus position change interval set to a depth of field or less. This is preferred. In this case, the in-focus position with respect to the observation position of the sample can be obtained with sufficiently high accuracy.
  • the automatic focusing device includes observation position changing means for changing the observation position of the sample with respect to the imaging means and the light guide optical system in a direction perpendicular to the optical axis, and the focus control means includes the observation target region of the sample. May be divided into a plurality of focus measurement areas, and the in-focus position may be mapped to the observation target area based on the in-focus positions obtained for each of the plurality of focus measurement areas.
  • the automatic focusing apparatus includes observation position changing means for changing the observation position in the sample with respect to the imaging means and the light guide optical system in a direction perpendicular to the optical axis, and the focus control means includes the observation target region of the sample.
  • observation position changing means for changing the observation position in the sample with respect to the imaging means and the light guide optical system in a direction perpendicular to the optical axis
  • the focus control means includes the observation target region of the sample.
  • 3 or more focus measurement positions are set, and for each of the 3 or more focus measurement positions, the in-focus position for each observation position in the observation target area is obtained using the in-focus position obtained. It's also good.
  • the microscope apparatus controls the acquisition of the image of the sample based on the above-described automatic focus apparatus and focus information including the in-focus position obtained by the focus control unit with respect to the observation position of the sample. It is preferable to include an image acquisition control unit.
  • the automatic focusing apparatus and the microscope apparatus according to the present invention shorten the in-focus position! It can be used as an autofocus device that can be obtained and a microscope device using it.

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Abstract

　試料Ｓの画像を取得するＣＣＤカメラ３０と、試料Ｓの光像をカメラ３０へと導く導光光学系２０と、カメラ３０及び光学系２０を駆動して試料Ｓでの焦点位置をｚ軸方向について変更する光学系駆動部２５と、焦点制御部５１を含む制御装置５０とを備えて顕微鏡装置１Ａを構成する。また、焦点制御部５１は、焦点位置を一方向に連続的に変更しつつ実行される第１の焦点計測で取得された複数の画像から第１の焦点計測値を算出し、焦点位置を第１の焦点計測とは逆方向に連続的に変更しつつ実行される第２の焦点計測で取得された複数の画像から第２の焦点計測値を算出するとともに、第１、第２の焦点計測値に基づいて試料Ｓの合焦点位置を求める。これにより、合焦点位置を短い時間で正確に求めることが可能な自動焦点装置、及びそれを用いた顕微鏡装置が実現される。

Description

明 細 書
自動焦点装置及びそれを用いた顕微鏡装置
技術分野
[0001] 本発明は、試料の画像を取得する際の焦点を制御するための自動焦点装置、及び 自動焦点装置を用いた顕微鏡装置に関するものである。
背景技術
[0002] 顕微鏡を用いて試料の画像を取得する場合、装置内の光学系、機構系の傾き、あ るいは試料自体の傾き、凹凸形状などによる焦点ずれが問題となる。これに対して、 従来、顕微鏡装置において、 CCDカメラなどの撮像装置による撮像の焦点を自動的 に制御する自動焦点 (オートフォーカス）が行われて 、る。このような自動焦点を行う 装置としては、例えば、特許文献 1に記載された装置がある。
特許文献 1：特開平 5 - 288981号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 上記した文献 1には、顕微鏡の対物レンズと、顕微鏡による観察対象となる試料と の間での焦点位置を連続的に変更しながら一定の変更間隔毎に試料の画像を取得 し、得られた複数の画像力 合焦点位置を求める方法が開示されている。しかしなが ら、このような方法では、顕微鏡の各部を駆動して焦点位置を変更するのにステツピ ングモータやピエゾァクチユエータなどの機器が用いられるため、焦点位置を連続的 に変更していく際にその機器特有の遅れが発生する。したがって、上記した方法で の焦点計測によって合焦点位置を求めた場合、焦点位置の変更の遅れに起因する 誤差が生じると 、う問題がある。
[0004] 一方、このような焦点位置の変更の遅れの影響を解消する方法として、焦点位置を 変更していく際に一定の変更間隔毎に機器を停止させ、焦点位置が安定して力 試 料の画像を取得することを繰り返す方法を用いることができる。し力しながら、この方 法では、合焦点位置を求めるのに必要な複数の画像を取得する際に、 1回の画像取 得毎に焦点位置の安定を待たなければならない。したがって、合焦点位置を求める のに必要な時間が非常に長くなるという問題がある。
[0005] 本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、合焦点位置を短い 時間で正確に求めることが可能な自動焦点装置、及びそれを用いた顕微鏡装置を 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] このような目的を達成するために、本発明による自動焦点装置は、（1)観察対象と なる試料の光像による画像を取得する撮像手段と、 (2)試料力ゝらの光が入射する対 物レンズを含み、試料の光像を撮像手段へと導く導光光学系と、（3)撮像手段及び 導光光学系に対する試料における焦点位置を光軸方向にっ 、て変更する焦点変更 手段と、（4)撮像手段及び焦点変更手段を用いて、試料の画像を取得する際の焦点 情報を取得する焦点制御手段とを備え、（5)焦点制御手段は、焦点変更手段によつ て焦点位置を一方向に連続的に変更しつつ実行される第 1の焦点計測で取得され た複数の試料の画像力 第 1の焦点計測値を算出し、焦点位置を第 1の焦点計測と は逆方向に連続的に変更しつつ実行される第 2の焦点計測で取得された複数の試 料の画像力 第 2の焦点計測値を算出するとともに、第 1の焦点計測値及び第 2の焦 点計測値に基づいて試料における合焦点位置を求めることを特徴とする。
[0007] 上記した自動焦点装置にお!、ては、一定の変更間隔毎に焦点位置の変更を停止 するのではなぐ焦点位置を連続的に変更しつつ複数の試料の画像を取得する焦 点計測方法を用いて合焦点位置を求めている。これにより、試料の観察位置に対す る焦点情報を短い時間で取得することが可能となる。さらに、合焦点位置を求めるた めの焦点計測について、焦点位置の変更方向を変えて 2回の焦点計測を行い、その それぞれで算出された焦点計測値を参照して合焦点位置を求めている。このとき、 2 回の焦点計測では、焦点位置の変更の遅れの影響が逆になる。したがって、 2回の 焦点計測においてそれぞれ複数の画像力 算出される焦点計測値を用いることによ り、最終的な合焦点位置を正確に求めることが可能となる。
[0008] 本発明による顕微鏡装置は、上記した自動焦点装置と、試料の観察位置に対して 焦点制御手段によって求められた合焦点位置を含む焦点情報に基づいて、試料の 画像の取得を制御する画像取得制御手段とを備えることを特徴とする。 [0009] 上記した顕微鏡装置においては、焦点位置の変更方向を変えて 2回の焦点計測を 行い、そのそれぞれで算出された焦点計測値を参照して試料の観察位置に対する 合焦点位置を求める上記した自動焦点装置を用いて顕微鏡装置を構成して 、る。こ れにより、試料の画像を取得する際の合焦点位置を短い時間で正確に求めて、高い 精度で効率良く試料の観察を実行することが可能となる。
発明の効果
[0010] 本発明の自動焦点装置及びそれを用いた顕微鏡装置によれば、合焦点位置を求 めるための焦点計測にっ 、て、焦点位置を連続的に変更しつつ複数の試料の画像 を取得するとともに、焦点位置の変更方向を変えて 2回の焦点計測を行い、そのそれ ぞれで算出された焦点計測値を参照して合焦点位置を求めることにより、試料の観 察位置に対する合焦点位置を短い時間で正確に求めることが可能となる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は、自動焦点装置を用いた顕微鏡装置の一実施形態の構成を示すブロッ ク図である。
[図 2]図 2は、一方向の焦点計測で求められる合焦点位置について示すグラフである
[図 3]図 3は、双方向の焦点計測で求められる合焦点位置について示すグラフである
[図 4]図 4は、焦点計測における焦点位置の変更の遅れについて示すグラフである。
[図 5]図 5は、試料の観察対象領域の全体に対する焦点情報の取得方法の一例を示 す模式図である。
[図 6]図 6は、試料の観察対象領域の全体に対する焦点情報の取得方法の他の例を 示す模式図である。
[図 7]図 7は、ステージ送り位置に対する真直度誤差の変化を示すグラフである。
[図 8]図 8は、ステージ送り位置に対する真直度誤差の変化を示すグラフである。 符号の説明
[0012] 1A…顕微鏡装置、 10…試料ステージ、 15· ··ステージ駆動部、 20· ··導光光学系、 21 · ··対物レンズ、 25· ··光学系駆動部、 30· "CCDカメラ (撮像装置）、 50· ··制御装 置、 51· ··焦点制御部、 52…画像取得制御部、 55· ··焦点情報記憶部、 58· ··入力装 置、 59· ··表示装置。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下、図面とともに本発明による自動焦点装置、及びそれを用いた顕微鏡装置の 好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素 には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明の ものと必ずしも一致して 、な 、。
[0014] 図 1は、本発明による自動焦点装置を用いた顕微鏡装置の一実施形態の構成を示 すブロック図である。この顕微鏡装置 1Aは、試料 Sの画像の取得に用いられるもので ある。ここで、顕微鏡装置 1Aでの光軸方向となる垂直方向を z軸方向、光軸に垂直 な方向である水平方向を X軸方向、 y軸方向とする。また、本顕微鏡装置 1Aによる観 察対象となる試料 Sは、例えば生体サンプルであり、試料ステージ 10上に載置されて いる。
[0015] 試料ステージ 10は、 X方向及び y方向（水平方向）に可動な XYステージカゝらなり、こ の XYステージ 10を xy面内で駆動することにより、試料 Sに対する顕微鏡装置 1 Aで の観察位置が設定または変更される。また、試料ステージ 10は、 XYステージ駆動部 15によって駆動制御されている。この構成において、 XYステージ駆動部 15は、顕微 鏡装置 1 Aに対する試料 Sにおける観察位置を光軸に垂直な方向について変更する 観察位置変更手段として機能する。
[0016] 試料ステージ 10上の試料 Sに対し、ステージ 10の上方に、試料 Sの光像を導光す るための導光光学系 20が設けられている。この導光光学系 20は、試料 Sからの光が 入射する対物レンズ 21、及び試料 Sの光像の導光、集束に必要な光学要素を含ん で構成されている。また、試料 Sの光像が導光光学系 20によって導かれる光路上の 所定位置には、撮像装置である CCDカメラ 30が設置されている。この CCDカメラ 30 は、試料 Sの光像による画像を取得する撮像手段である。これらの導光光学系 20、 及び CCDカメラ 30は、その光軸及び光学系 20—カメラ 30間の距離等が調整された 状態で、一体に固定されている。
[0017] また、導光光学系 20及び CCDカメラ 30に対して、光学系駆動部 25が設置されて いる。光学系駆動部 25は、例えばステッピングモータやピエゾァクチユエータなどを 用いて構成され、光学系 20及び光学系 20に対して固定されたカメラ 30を光軸方向 である z軸方向に移動させる。この構成において、光学系駆動部 25は、 CCDカメラ 3 0及び導光光学系 20に対する試料 Sにおける焦点位置を光軸方向について変更す る焦点変更手段として機能する。この光学系駆動部 25は、試料 Sの画像取得におけ る焦点の制御に用いられる。
[0018] これらの試料ステージ 10、導光光学系 20、及び CCDカメラ 30に対し、焦点制御部 51及び画像取得制御部 52を有する制御装置 50が設置されて 、る。焦点制御部 51 は、 CCDカメラ 30、及び光学系駆動部 25を用いて、試料 Sの画像取得における合 焦点位置を含む焦点情報を取得する。
[0019] 図 1に示す顕微鏡装置 1Aでは、上記した試料ステージ 10、導光光学系 20、撮像 手段である CCDカメラ 30、観察位置変更手段であるステージ駆動部 15、及び焦点 変更手段である光学系駆動部 25と、制御装置 50の焦点制御部 51とによって、試料 Sの画像を取得する際に用いられる焦点情報を取得するための自動焦点装置が構 成されている。また、焦点制御部 51で取得された焦点情報は、焦点情報記憶部 55 に さ 4 る。
[0020] 画像取得制御部 52は、 CCDカメラ 30を用いて実際に試料 Sの画像の取得を実行 する場合に、試料 Sの観察位置に対して焦点制御部 51によって求められた合焦点 位置を含む焦点情報に基づいて、試料 Sの画像の取得を制御する。図 1に示した構 成にぉ 、ては、画像取得制御部 52は、焦点情報記憶部 55から読み出した合焦点位 置を含む焦点情報を参照し、 CCDカメラ 30による試料 Sの画像取得動作、光学系駆 動部 25による焦点変更動作、及びステージ駆動部 15による観察位置変更動作を制 御して、所望の観察条件で試料 Sの観察及び画像の取得を実行する。
[0021] 焦点制御部 51及び画像取得制御部 52を有する制御装置 50は、例えば、 CPU及 び必要なメモリ、ハードディスクなどの記憶装置を含むコンピュータによって構成され る。また、この制御装置 50に対して、入力装置 58及び表示装置 59が接続されている 。入力装置 58は、例えばコンピュータに接続されたキーボードやマウス等力も構成さ れ、本顕微鏡装置 1Aにおける焦点制御部 51による焦点情報取得動作、あるいは画 像取得制御部 52による画像取得動作の実行に必要な情報、指示の入力等に用いら れる。また、表示装置 59は、例えばコンピュータに接続された CRTディスプレイや液 晶ディスプレイ等カゝら構成され、本顕微鏡装置 1Aにおける焦点情報取得及び画像 取得に関する必要な情報の表示等に用 、られる。
[0022] 次に、図 1に示した自動焦点装置及び顕微鏡装置 1Aにおける焦点情報の取得方 法について説明する。
[0023] 本実施形態の顕微鏡装置 1Aにおいては、試料 Sの画像取得における合焦点位置 を含む焦点情報の取得は、上記したように制御装置 50の焦点制御部 51によって行 われる。焦点制御部 51は、撮像手段である CCDカメラ 30、焦点変更手段である光 学系駆動部 25、あるいはさらに必要に応じて観察位置変更手段であるステージ駆動 部 15を用いて、試料 Sの画像取得のための焦点情報取得を実行する。
[0024] 焦点制御部 51は、光学系駆動部 25によって CCDカメラ 30及び導光光学系 20を 光軸方向である z軸方向に駆動し、試料 Sにおける焦点位置を z軸方向に沿って一方 向に連続的に変更する。そして、この焦点位置の連続的な変更の間に、所定の変更 間隔毎に試料 Sの画像を取得する焦点計測を行うとともに、得られた複数の画像に 対して解析を行って、 CCDカメラ 30及び導光光学系 20による画像取得の焦点が合 う合焦点位置を示す焦点計測値を算出する。
[0025] 焦点計測を実行する焦点位置の変更範囲については、合焦点位置が変更範囲内 に含まれるように適宜設定される。また、設定された焦点位置の変更範囲にわたって CCDカメラ 30によって取得された複数の画像を用いた焦点計測値の算出について は、例えば、複数の画像の間でのコントラストの高低、明るさの高低などの画像特性 の変化を評価し、その評価結果に基づ 、て最も画像取得の焦点が合って 、る位置を 焦点計測値として算出する方法が用いられる。
[0026] 図 2は、一方向の焦点計測で求められる合焦点位置について示すグラフである。こ のグラフにおいて、横軸は試料 Sにおける焦点位置 zを連続的に変更しつつ実行さ れる焦点計測での計測時間 tを示し、縦軸は焦点位置 zを示している。また、図 2中に おいて、グラフ A1は焦点制御部 51が光学系駆動部 25に対して指示する焦点位置 を示し、グラフ A2は光学系駆動部 25によって設定される実際の焦点位置を示してい る。
[0027] このグラフからわ力るように、ステッピングモータやピエゾァクチユエータなどの機器 を用いた光学系駆動部 25によって焦点位置を連続的に変更すると、グラフ A2に示 す実際の焦点位置の変化では、グラフ A1に示す指示された焦点位置の変化力 み て矢印 A6で示した変更の遅れが発生する。したがって、上記した焦点計測で取得さ れた複数の画像力 焦点計測値を算出した場合、算出された焦点計測値において、 焦点位置の変更の遅れに起因する誤差が生じる。
[0028] 図 1に示した自動焦点装置及び顕微鏡装置 1Aにおいては、このような焦点計測値 の誤差を低減するため、双方向の焦点計測を実行して合焦点位置を求める。図 3は 、双方向の焦点計測で求められる合焦点位置について示すグラフである。図 3中に おいて、グラフ B1は焦点制御部 51が光学系駆動部 25に対して指示する焦点位置 を示し、グラフ B2は光学系駆動部 25によって設定される実際の焦点位置を示してい る。
[0029] 具体的には、焦点制御部 51は、試料 Sにおける焦点位置を z軸方向に沿って一方 向に連続的に変更しつつ第 1の焦点計測を実行する。そして、その間に所定の変更 間隔毎に取得された試料 Sの画像力も第 1の焦点計測値を算出する。このとき、得ら れる第 1の焦点計測値は、図 3中に矢印 B6で示したように、焦点位置の変更の遅れ に起因した誤差を有して 、る。
[0030] 焦点制御部 51は、さらに、試料 Sにおける焦点位置を z軸方向に沿って第 1の焦点 計測とは逆方向に連続的に変更しつつ第 2の焦点計測を実行する。そして、その間 に所定の変更間隔毎に取得された試料 Sの画像力 第 2の焦点計測値を算出する。 このとき、得られる第 2の焦点計測値は、図 3中に矢印 B7で示したように、焦点位置 の変更の遅れに起因した第 1の焦点計測値とは逆方向の誤差を有している。焦点制 御部 51では、図 3中に破線 BOによって示すように、これらの第 1の焦点計測値及び 第 2の焦点計測値の平均値によって試料 Sにおける合焦点位置を求める。
[0031] 上記実施形態による自動焦点装置及び顕微鏡装置の効果について説明する。
[0032] 図 1に示した自動焦点装置においては、一定の変更間隔毎に試料 Sにおける焦点 位置の変更を停止するのではなぐ光学系駆動部 25によって焦点位置を連続的に 変更しつつ CCDカメラ 30によって複数の試料 Sの画像を取得する焦点計測方法を 用いて合焦点位置を求めている。これにより、試料 Sの観察位置に対する焦点情報 を短い時間で取得することが可能となる。
[0033] さらに、上記したように焦点位置を連続的に変更しつつ実行される焦点計測につい て、光軸方向についての焦点位置の変更方向を変えて 2回の焦点計測を行い、その それぞれで算出された焦点計測値を参照して合焦点位置を求めている。このとき、 2 回の焦点計測では、図 3中に矢印 B6、 B7で示したように、焦点位置の変更の遅れの 影響による焦点計測値の誤差が逆方向となる。したがって、第 1、第 2の焦点計測の それぞれで複数の画像力 算出された第 1、第 2の焦点計測値を用いることにより、 最終的な合焦点位置を正確に求めることが可能となる。また、このような自動焦点装 置を用いた顕微鏡装置 1Aによれば、試料 Sの画像を取得する際の合焦点位置を短 V、時間で正確に求めて、高 、精度で効率良く試料 Sの観察を実行することが可能と なる。
[0034] 自動焦点装置及び顕微鏡装置 1Aの効果について詳述する。光学系駆動部 25に ピエゾ素子等を用いた場合、それによる焦点位置の変更動作の遅れは大きいもので は数 10ms〜： LOOms (ミリ秒)程度になる。これに対して CCDカメラ 30での画像を取り 込むフレームレートを 30Hzとし、連続的に焦点位置を変更しながら試料 Sの画像の 取得を行うと、変更動作の遅れが 100msの場合、焦点制御部 51によって指示された 焦点位置と、光学系駆動部 25によって設定された実際の焦点位置とは、画像数でい えば 3画像分ずれていることとなる。このような画像のずれは、フレームレートが高い 撮像装置を用いればさらに大きくなる。上記した装置構成及び焦点情報の取得方法 によれば、双方向で焦点計測を行うことにより、このような画像のずれの影響が解消さ れる。
[0035] また、このような焦点情報の取得方法を用いることにより、焦点情報の取得を高速に 行うことができる。例えば、一定の変更間隔毎に試料 Sにおける焦点位置の変更を停 止して焦点計測を行うことを考える。この場合、変更動作の遅れを 100ms、変更され た焦点位置が安定するまでの時間を遅れの 3倍の 300ms、画像取得のフレームレー トを 30Hz (画像取得時間 lZ30s)、焦点計測に用いられる画像の取得枚数を 30枚 とすると、焦点計測に要する時間は (画像取得時間 +焦点位置の安定時間） X画像 の取得枚数 = (lZ30 + 0. 3) X 30= 10秒となる。
[0036] 一方、焦点位置を連続的に変更しつつ双方向で焦点計測を行う上記方法では、同 様に画像取得のフレームレートを 30Hz、焦点計測に用いられる画像の取得枚数を 一方向について 30枚とすると、双方向での焦点計測に要する時間は 2秒となる。この ように、上記構成の自動焦点装置及び顕微鏡装置によれば、焦点情報の取得に要 する時間を大幅に短縮することが可能である。
[0037] なお、焦点計測における焦点位置の変更の遅れ、及びその影響による焦点計測値 の誤差は、焦点位置の変更速度によって大きさが変化する。図 4は、焦点計測にお ける焦点位置の変更の遅れについて示すグラフである。図 4中において、グラフ C1 は所定の変更速度となるように焦点制御部 51が指示する焦点位置を示し、グラフ C2 は光学系駆動部 25によって設定される実際の焦点位置を示している。また、グラフ D 1はグラフ C1での変更速度よりも遅い変更速度となるように焦点制御部 51が指示す る焦点位置を示し、グラフ D2は光学系駆動部 25によって設定される実際の焦点位 置を示している。
[0038] このグラフからわ力るように、変更速度を遅く設定した場合のグラフ Dl、 D2での焦 点位置の変更の遅れは、変更速度を速く設定した場合のグラフ Cl、 C2での変更の 遅れよりも小さくなる。すなわち、焦点計測における焦点位置の変更の遅れ、及び焦 点計測値に生じる誤差は、焦点位置の変更速度などの焦点計測の具体的な条件に よって異なるものとなる。また、このような誤差の違いは、例えば光学系駆動部 25に 用いられる機器の種類、個々の特性、あるいは装置特性の経時変化等によっても発 生する。これに対して、上記した焦点情報の取得方法では、 2回の焦点計測を実行し て焦点位置の変更の遅れの影響を打ち消す方法を用いているため、そのような誤差 の不確定性にかかわらず、確実に合焦点位置を求めることが可能である。
[0039] ここで、 2回の焦点計測にっ 、ては、焦点位置の変更方向以外の条件、例えば焦 点位置の変更範囲、変更間隔等については、同一の条件として焦点計測を実行す ることが好ましい。あるいは、焦点位置の変更方向以外の条件も異なる条件に設定し ても良い。また、第 1の焦点計測及び第 2の焦点計測における試料 Sでの焦点位置 の変更間隔については、被写界深度以下に設定された焦点位置の変更間隔毎に試 料 Sの画像の取得を行って、焦点計測値の算出に用いられる複数の画像を取得する ことが好ましい。
[0040] このように焦点位置の変更間隔を設定して焦点計測を行うことにより、試料 Sの観察 位置に対する合焦点位置を充分に高い精度で求めることができる。なお、顕微鏡装 置 1Aにおける被写界深度は、導光光学系 20において用いられる対物レンズ 21の 開口数 NAによって異なる力 例えば、 NA=0. 4の場合で 1. 5 μ m程度、 NA=0. 7で 0. 5 m程度である。また、具体的な焦点位置の変更間隔の設定については、 例えば被写界深度の半分の分解能で変更間隔を設定する方法を用いることができる 。あるいは、必要とされる焦点位置の精度等に応じて、焦点位置の変更間隔を被写 界深度よりも大きく設定しても良い。
[0041] また、第 1の焦点計測値及び第 2の焦点計測値を用いた合焦点位置の導出につい ては、上記したように、第 1、第 2の焦点計測値の平均値によって合焦点位置を求め ることが好ましい。焦点位置の変更方向が逆の第 1、第 2の焦点計測では、通常、焦 点位置の変更の遅れは方向が逆、大きさは略等しくなる。したがって、上記のように 第 1、第 2の焦点計測値の平均値を合焦点位置とすることで、焦点位置の変更の遅 れの影響が打ち消された状態の合焦点位置を容易かつ確実に求めることができる。 また、このような合焦点位置の導出方法については、具体的な焦点計測方法や、焦 点位置の変更に用いる機器の特性等に応じて、平均値を合焦点位置とする方法以 外の方法を用いても良い。
[0042] また、試料 Sの画像を取得する撮像手段にっ 、ては、図 1に示した構成では焦点制 御部 51による焦点情報の取得、及び画像取得制御部 52による試料 Sの画像の取得 に同一の CCDカメラ 30を用いて 、るが、それぞれ別の撮像装置を用いる構成として も良い。この場合には、導光光学系 20において焦点制御用光路及び画像取得用光 路の 2つの光路を設定し、それぞれの光路上に焦点制御用の撮像装置及び画像取 得用の撮像装置を設置する構成を用いることができる。あるいは、単一の光路上にお いて焦点制御用の撮像装置及び画像取得用の撮像装置を切換えて設置する構成と しても良い。 [0043] 一般には、焦点制御用の撮像装置としては、試料 Sの 2次元の画像を取得可能な C CDカメラなどのイメージセンサを用いることが好ましい。また、画像取得用の撮像装 置としては、試料 Sの 1次元の画像を取得可能なリニアセンサ、または 2次元の画像を 取得可能なイメージセンサを用いることができる。例えば、試料 Sに対してある程度の 範囲の観察対象領域をスキャンしつつ画像を取得するような場合には、画像取得用 の撮像装置としてはリニアセンサ (ラインセンサ）、または TDI動作が可能な 2次元の イメージセンサなどを用いることが好ましい。また、図 1に示した構成では、 CCDカメラ 30として、通常の 2次元画像の取得動作と、 TDIラインセンサ動作との両方の動作が 可能な CCDカメラを用いても良い。
[0044] 図 1に示した自動焦点装置及び顕微鏡装置 1Aにおける焦点情報の取得方法につ いてさらに説明する。
[0045] 図 1の顕微鏡装置 1Aでは、試料ステージ 10として xy面内で可動な XYステージを 用いるとともに、このステージ 10に対して XYステージ駆動部 15を設けている。このよ うな試料ステージ 10及び XYステージ駆動部 15を用いれば、試料 Sに対する観察位 置を xy面内で調整することができる。あるいは、試料 Sに対して、ある程度の広さの観 察対象領域について画像の取得を行う場合には、 XYステージ駆動部 15により、試 料 Sにおける観察位置を xy面内で光軸に垂直な方向について変更することが可能 である。
[0046] このように一定の観察対象領域に対して試料 Sの画像の取得を行う場合、観察対 象領域の全体に対する焦点情報を取得する方法としては、焦点制御部 51が、試料 S の観察対象領域を複数の焦点計測領域に区分し、複数の焦点計測領域のそれぞれ について合焦点位置を求めて、それらの合焦点位置によって観察対象領域に対す る合焦点位置のマッピングを行う方法を用いることが好まし 、。
[0047] 図 5は、試料の観察対象領域の全体に対する焦点情報の取得方法の一例を示す 模式図である。顕微鏡装置 1Aを用いて試料 Sを広 、範囲でスキャンして画像データ を取得する場合、試料ステージ 10の傾きや試料 Sの形状などによる観察対象領域内 での焦点位置の変化が問題となる。観察対象領域が狭い場合には、複数の観察位 置で試料 Sの画像取得を行う場合でも焦点位置の変化は問題とはならな 、が、例え ば 20mm X 20mmの範囲を観察対象領域とする例のように、広い範囲で試料 Sの画 像取得を行う場合には、観察位置による焦点位置の変化を考慮する必要がある。
[0048] これに対して、図 5に示した焦点情報の取得方法では、上記したように、観察対象 領域 Rを複数の焦点計測領域に区分する。図 5の例では、矩形状の観察対象領域 R を横方向 10、縦方向 10に区切って、 10 X 10個の焦点計測領域 RFを設定している 。そして、 100個の焦点計測領域 RFのそれぞれについて上記した方法で焦点計測 を行って合焦点位置を求めることにより、観察対象領域 Rの全体に対する合焦点位 置のマッピングデータを作成することができる。このような方法によれば、複数の観察 位置を含む観察対象領域 Rに対する合焦点位置などの焦点情報を効率的に取得す ることが可能である。
[0049] ここで、観察対象領域 Rの焦点計測領域 RFへの区分数などの区分条件について は、具体的な観察対象領域 Rの広さや必要とされる焦点情報の精度などに応じて適 宜設定すれば良い。また、各焦点計測領域 RFでの焦点計測及び合焦点位置の導 出については、例えば図 5に示すように焦点計測領域 RFの中心点を代表点 RCとし 、この代表点 RCを計測位置として焦点計測及び合焦点位置の導出を行うことが好ま しい。
[0050] このような方法で取得された焦点情報を用いて実際に試料 Sの画像を取得する際 には、画像取得制御部 52は、焦点情報記憶部 55に記憶された焦点情報のマツピン グデータを読み出し、そのデータを参照しながら観察対象領域 R内をスキャンして試 料 Sの画像を取得すれば良 、。
[0051] 図 5には、このような観察対象領域 R内での試料 Sの画像の取得方法の一例を合わ せて示している。この例では、観察対象領域 R内で図中の上側から下側への画像ス キャン (実線矢印）を左側から右側へ向けて繰り返して行って (破線矢印）、領域尺の 全体に対して試料 Sの画像を取得する。この場合、焦点情報のマッピングデータを参 照し、観察対象領域 R内での画像スキャンに追従するように焦点位置を調整しながら 画像を取得することにより、領域 Rの全体で焦点が合った良好な画像を取得すること ができる。
[0052] あるいは、試料 Sの観察対象領域の全体に対する焦点情報を取得する方法として は、焦点制御部 51が、試料 Sの観察対象領域内で 3点以上の焦点計測位置を設定 し、 3点以上の焦点計測位置のそれぞれについて合焦点位置を求めて、それらの合 焦点位置を用いて観察対象領域内での各観察位置に対する合焦点位置を求める方 法を用いることが好ましい。
[0053] 図 6は、試料の観察対象領域の全体に対する焦点情報の取得方法の他の例を示 す模式図である。図 6に示した焦点情報の取得方法では、上記したように、観察対象 領域 Rに対して 3点の焦点計測位置 PFを設定している。そして、 3点の焦点計測位 置 PFのそれぞれにつ 、て上記した方法で焦点計測を行って合焦点位置を求めて!/ヽ る。このとき、 3点の焦点計測位置 PFで求められた合焦点位置から、直線補完によつ て観察対象領域 R内の任意の観察位置に対する合焦点位置を求めることができる。 このような方法によっても、観察対象領域 Rに対する合焦点位置などの焦点情報を効 率的に取得することが可能である。
[0054] このような方法は、例えば、試料ステージ 10が充分に平面状で、観察対象領域 R内 での焦点位置の変化がステージ 10の傾きのみによる場合など、焦点位置の変化が 平面的である場合に特に有効である。ただし、図 6に示したように 3点の焦点計測位 置 PFを用いる場合、 3点が一直線上にないことが必要である。また、観察対象領域 R 内で 4点以上の焦点計測位置を設定し、最小二乗法によって観察対象領域 R内の 任意の観察位置に対する合焦点位置を求めることとすれば、さらに精度良く焦点位 置を制御することができる。
[0055] また、図 5及び図 6に示した例のように、観察対象領域 Rに対して焦点情報の取得 を行う場合には、試料ステージ 10の真直度についても同時に補正を行うことが好まし い。一般に、 XYステージの真直度では、ステージの移動に用いられるボールネジの 偏芯等、ガイド自体の真直度 (例えばステージが移動するレールの反り）、ガイドを取 り付けるベース部分の平面度、ガイド取付のネジ固定による波打ち、ガイドがボール 循環式の場合の転動体の通過に伴う振動、などの影響を受け、ステージが直線動作 をしない場合がある。
[0056] 図 7及び図 8は、それぞれステージ送り位置に対する真直度誤差の変化を示すダラ フである。図 7のグラフは、広い送り位置範囲についての真直度誤差の変化を示して いる。これは、主にステージが移動するレールの反りによる誤差パターンに対応して いる。また、図 8のグラフは、狭い送り位置範囲についての真直度誤差の変化を示し ている。これは、主に送り用のネジによる誤差パターンに対応している。これに対して 、上記した自動焦点装置及び顕微鏡装置 1Aによれば、このようなステージの真直度 についても、焦点計測による焦点情報の取得によって同時に補正することが可能で ある。
[0057] 本発明による自動焦点装置及び顕微鏡装置は、上記した実施形態及び構成例に 限られるものではなぐ様々な変形が可能である。例えば、撮像手段及び導光光学 系に対する試料 Sにおける焦点位置を光軸方向にっ 、て変更する焦点変更手段に つ!、ては、図 1に示した構成では CCDカメラ 30及び導光光学系 20を z軸方向に駆 動する光学系駆動部 25を用いている力 例えば試料 Sが載置された試料ステージ 1 0を z軸方向に駆動する構成など、他の構成を用いても良!、。
[0058] また、試料 Sにおける観察位置 (撮像位置）を光軸に垂直な方向について変更する 観察位置変更手段については、図 1に示した構成では試料ステージ 10を xy面内で 駆動する XYステージ駆動部 15を用いて 、るが、例えば CCDカメラ 30及び導光光 学系 20を xy面内で駆動する構成など、他の構成を用いても良い。あるいは、このよう な観察位置変更手段については、試料 Sに対して 1つの観察位置のみで画像取得 を行う場合など、不要であれば設けな 、構成としても良 、。
[0059] ここで、自動焦点装置は、（1)観察対象となる試料の光像による画像を取得する撮 像手段と、（2)試料力ゝらの光が入射する対物レンズを含み、試料の光像を撮像手段 へと導く導光光学系と、（3)撮像手段及び導光光学系に対する試料における焦点位 置を光軸方向につ!、て変更する焦点変更手段と、（4)撮像手段及び焦点変更手段 を用いて、試料の画像を取得する際の焦点情報を取得する焦点制御手段とを備え、 (5)焦点制御手段は、焦点変更手段によって焦点位置を一方向に連続的に変更し つつ実行される第 1の焦点計測で取得された複数の試料の画像力 第 1の焦点計測 値を算出し、焦点位置を第 1の焦点計測とは逆方向に連続的に変更しつつ実行され る第 2の焦点計測で取得された複数の試料の画像力 第 2の焦点計測値を算出する とともに、第 1の焦点計測値及び第 2の焦点計測値に基づいて試料における合焦点 位置を求めることが好まし!/、。
[0060] また、焦点制御手段は、第 1の焦点計測値及び第 2の焦点計測値の平均値によつ て合焦点位置を求めることが好ましい。この場合、焦点位置の変更の遅れの影響が 打ち消された状態の合焦点位置を確実に求めることができる。あるいは、合焦点位置 を求める方法にっ 、ては、具体的な焦点計測方法に応じて他の方法を用いても良 、
[0061] また、焦点制御手段は、第 1の焦点計測及び第 2の焦点計測において、複数の試 料の画像の取得を、被写界深度以下に設定された焦点位置の変更間隔毎に行うこ とが好ましい。この場合、試料の観察位置に対する合焦点位置を充分に高い精度で 求めることができる。
[0062] また、自動焦点装置は、撮像手段及び導光光学系に対する試料における観察位 置を光軸に垂直な方向について変更する観察位置変更手段を備え、焦点制御手段 は、試料の観察対象領域を複数の焦点計測領域に区分し、複数の焦点計測領域の それぞれについて求められた合焦点位置によって観察対象領域に対する合焦点位 置のマッピングを行うこととしても良い。
[0063] あるいは、自動焦点装置は、撮像手段及び導光光学系に対する試料における観察 位置を光軸に垂直な方向について変更する観察位置変更手段を備え、焦点制御手 段は、試料の観察対象領域内で 3点以上の焦点計測位置を設定し、 3点以上の焦点 計測位置のそれぞれにつ 、て求められた合焦点位置を用いて観察対象領域内での 各観察位置に対する合焦点位置を求めることとしても良い。
[0064] これらの構成によれば、観察対象の試料に対して複数の観察位置で画像の取得を 行う場合に、複数の観察位置を含む観察対象領域に対する合焦点位置などの焦点 情報を効率的に取得することができる。
[0065] また、顕微鏡装置は、上記した自動焦点装置と、試料の観察位置に対して焦点制 御手段によって求められた合焦点位置を含む焦点情報に基づいて、試料の画像の 取得を制御する画像取得制御手段とを備えることが好ましい。
産業上の利用可能性
[0066] 本発明による自動焦点装置及び顕微鏡装置は、合焦点位置を短!、時間で正確に 求めることが可能な自動焦点装置、及びそれを用いた顕微鏡装置として利用可能で める。

Claims

請求の範囲
[1] 観察対象となる試料の光像による画像を取得する撮像手段と、
前記試料力ゝらの光が入射する対物レンズを含み、前記試料の光像を前記撮像手 段へと導く導光光学系と、
前記撮像手段及び前記導光光学系に対する前記試料における焦点位置を光軸方 向につ 1、て変更する焦点変更手段と、
前記撮像手段及び前記焦点変更手段を用いて、前記試料の画像を取得する際の 焦点情報を取得する焦点制御手段とを備え、
前記焦点制御手段は、前記焦点変更手段によって前記焦点位置を一方向に連続 的に変更しつつ実行される第 1の焦点計測で取得された複数の前記試料の画像か ら第 1の焦点計測値を算出し、前記焦点位置を前記第 1の焦点計測とは逆方向に連 続的に変更しつつ実行される第 2の焦点計測で取得された複数の前記試料の画像 力 第 2の焦点計測値を算出するとともに、前記第 1の焦点計測値及び前記第 2の焦 点計測値に基づ 、て前記試料における合焦点位置を求めることを特徴とする自動焦 点装置。
[2] 前記焦点制御手段は、前記第 1の焦点計測値及び前記第 2の焦点計測値の平均 値によって前記合焦点位置を求めることを特徴とする請求項 1記載の自動焦点装置
[3] 前記焦点制御手段は、前記第 1の焦点計測及び前記第 2の焦点計測において、複 数の前記試料の画像の取得を、被写界深度以下に設定された前記焦点位置の変更 間隔毎に行うことを特徴とする請求項 1または 2記載の自動焦点装置。
[4] 前記撮像手段及び前記導光光学系に対する前記試料における観察位置を光軸に 垂直な方向にっ 、て変更する観察位置変更手段を備え、
前記焦点制御手段は、前記試料の観察対象領域を複数の焦点計測領域に区分し 、前記複数の焦点計測領域のそれぞれについて求められた前記合焦点位置によつ て前記観察対象領域に対する合焦点位置のマッピングを行うことを特徴とする請求 項 1〜3のいずれか一項記載の自動焦点装置。
[5] 前記撮像手段及び前記導光光学系に対する前記試料における観察位置を光軸に 垂直な方向にっ 、て変更する観察位置変更手段を備え、
前記焦点制御手段は、前記試料の観察対象領域内で 3点以上の焦点計測位置を 設定し、前記 3点以上の焦点計測位置のそれぞれについて求められた前記合焦点 位置を用いて前記観察対象領域内での各観察位置に対する前記合焦点位置を求 めることを特徴とする請求項 1〜3のいずれか一項記載の自動焦点装置。
請求項 1〜5のいずれか一項記載の自動焦点装置と、
前記試料の観察位置に対して前記焦点制御手段によって求められた前記合焦点 位置を含む前記焦点情報に基づ!/ヽて、前記試料の画像の取得を制御する画像取得 制御手段と
を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
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