KR20150130291A - 염색 및 샘플 처리를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 염색 방법에 관한 것으로, 이 방법은 단일 단계로 세포를 신속하게 염색할 수 있는 입자 조영제 조성물을 사용한다. 입자 조영제 조성물은 하나 이상의 입자 조영제, 하나 이상의 투과화제, 및 하나 이상의 고정제의 배합으로 이루어질 수 있다. 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사포닌, 및 글루테르알데하이드를 포함할 수 있다.
Description
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 발명의 명칭이 "유체 샘플 중의 입자의 분석(Analysis of Particles in Fluid Samples)"인 미국 특허 출원 제61/799,152호의 이득을 주장하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
본 발명은 대체로 입자 조영제(particle contrast agent)에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 샘플 중의 혈구와 같은 입자를 구별하고 정량화하기 위하여 전체 또는 부분 자동화 디바이스에서 사용하기 위한 입자 조영제 조성물에 관한 것이다.
혈구 분석은 환자의 건강 상태의 개관을 제공하기 위해 가장 일반적으로 수행되는 의학적 검사들 중 하나이다. 혈액 샘플이 환자의 신체로부터 채취되고, 혈병형성(clotting)을 방지하기 위해 항응고제를 함유하는 시험관 내에 저장될 수 있다. 전혈 샘플은 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함한 3가지 주요 부류의 혈구들을 통상 포함한다. 각각의 부류는 구성원들의 하위부류들로 추가로 세분될 수 있다. 예를 들어, 백혈구(WBC)의 5가지 주요 유형 또는 하위부류는 상이한 형상 및 기능을 갖는다. 백혈구는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구를 포함할 수 있다. 또한, 적혈구 유형들의 하위부류들이 있다. 샘플 중의 입자의 외관은 병리학적 상태, 세포 성숙 및 다른 원인들에 따라 상이할 수 있다. 적혈구의 하위부류들은 망상적혈구(reticulocyte) 및 유핵 적혈구를 포함할 수 있다.
RBC, WBC 또는 혈소판의 농도를 평가하는 혈구 카운트(blood cell count)는 수동으로 또는 자동 분석기를 사용하여 행해질 수 있다. 혈구 카운트가 수동으로 행해지는 경우, 혈액 한 방울을 박층 도말(thin smear)로서 현미경 슬라이드에 적용한다. 전통적으로, 5가지 유형의 백혈구의 수 또는 상대량을 결정하기 위해 현미경 슬라이드 상에서의 혈액의 건조된 염색 도말의 수동 검사가 사용되어 왔다. 세포 또는 세포 구조를 염색하기 위해 조직학적 염료(dye) 및 염색제(stain)가 사용되어 왔다. 예를 들어, 라이트 염색제(Wright's stain)는 광학 현미경 하에서의 검사를 위한 혈액 도말을 염색하는 데 사용되어 온 조직학적 염색제이다. 샘플의 염색은, 염색제가 올바르게 적용되고 세포 구조가 적절히 보존되도록 보장하기 위하여 적절한 순서로 다수의 용액 및 단계를 사용하는 것을 포함한다. 샘플을 분해로부터 보존하고 세포 구조를 유지하기 위하여 고정제가 제1 단계에서 샘플에 적용될 수 있다. 그 후, 염색제가 세포로 진입될 수 있도록 세포막을 용해시키기 위하여 투과화제(permeabilizing agent)가 제2 단계에서 샘플에 적용될 수 있다. 염색제는 적절한 구조를 염색하기 위하여 제3 단계에서 샘플에 적용될 수 있다. 이러한 샘플은 관찰을 위하여 추가로 헹구어질 수 있거나, 다른 작용들을 수행하기 위해 추가 염색제, 대비염색제(counterstain), 또는 기타를 적용하도록 추가 단계들이 취해질 수 있다.
적절한 시간 동안 적절한 순서대로 이러한 단계들을 수행하는 것이 중요하다. 샘플이 고정되기 전에 투과화된다면, 샘플 내의 세포 구조는 고정되기 전에 분해될 수 있으며, 원래의 세포 형태를 파악하는 어떠한 능력도 상실된다. 부가적으로, 염색은 투과화 단계 전에 일어날 수 없거나, 염색제는 세포를 적절하게 침투하여 세포 내의 구조를 염색하지 못할 것이다. 부가적으로, 고정 단계, 투과화 단계, 및 염색 단계와 같은 단계들 중 어느 것도 너무 급속히 수행된다면, 세포의 형태는 상실될 수 있고/있거나 세포 및 그의 내부 구조는 적절히 염색될 수 없다. 현재의 염색 기술은 다수의 단계들 및 상당한 시간을 필요로 한다.
현재의 염색 기술은 샘플을 조영제 중에서 일반적으로 약 1:500 또는 1:5000으로 희석하는 것을 필요로 한다. 따라서, 현재의 염색 기술 하에서의 적절한 염색이 결과로 나타난다.
자동화 분석기가 더 많이 보급되어 가고 있다. 자동화 분석기를 사용하여 온혈구 카운트(Complete Blood Count, CBC)가 얻어질 수 있는데, 이러한 자동화 분석기의 하나의 유형은 혈액 샘플 중의 상이한 입자들 또는 세포들이 소형 관을 따라 감지 영역(sensing area)을 통과함에 따라 임피던스 또는 동적 광 산란에 기초하여 이러한 입자들 또는 세포들의 수를 카운팅한다. 자동화 CBC는 RBC, WBC 및 혈소판(PLT)을 포함한 세포들의 상이한 유형들 사이를 감별하기 위하여 기기 또는 방법을 사용할 수 있으며, 이때 이들 세포는 별개로 카운팅될 수 있다. 예를 들어, 대세포(large cell)만을 카운팅하기 위하여 최소 입자 크기 또는 부피를 필요로 하는 카운팅 기술이 사용될 수 있다. 혈액 중의 비정상 세포와 같은 소정의 세포가 올바르게 카운팅되지 않거나 식별되지 않을 수 있다. 서로에게 부착되는 소세포들이 대세포로서 잘못 카운팅될 수 있다. 잘못된 카운트가 의심되는 경우에는, 세포를 입증 및 식별하기 위하여 기기의 결과에 대해 수작업으로 재검토하는 것을 필요로 할 수 있다.
자동화 혈구 카운팅 기술은 유세포분석(flow cytometry)을 포함할 수 있다. 유세포분석은 좁은 유로를 제공하는 것, 및 개별 혈구들의 통과를 감지 및 카운팅하는 것을 포함한다. 유세포분석 방법은 유체 중에 현탁된 입자들, 예컨대 혈액 샘플 중의 세포들을 검출하는 데, 그리고 이러한 입자들을 입자 유형, 치수, 및 부피 분포에 대해 분석하여 혈액 샘플 중의 각각의 입자 유형 또는 입자 부피의 농도를 추론하도록 하는 데 사용되어 왔다. 유체 중에 현탁된 입자들을 분석하기에 적합한 방법의 예에는 침강, 현미경적 특성화(microscopic characterization), 임피던스에 기초한 카운팅, 및 동적 광 산란이 포함된다. 이들 툴(tool)은 오류(error) 시험의 대상이다. 다른 한편으로, 입자의 농도 및 유형의 정확한 특성화는 의학적 진단과 같은 응용에서 결정적일 수 있다.
이미징에 기초한 카운팅 기술에서는, 관찰 영역(viewing area)을 통과하는 중일 수 있는 준비된 샘플의 픽셀 데이터 이미지가, 디지털 카메라에 커플링된 현미경 대물 렌즈를 사용하여 캡처링된다. 픽셀 이미지 데이터는 데이터 처리 기술을 사용하여 분석되고, 또한 모니터 상에 표시될 수 있다.
플로우셀(flowcell)에 의한 자동화 진단 시스템의 양상들이, 터너(Turner) 등에게 허여된 미국 특허 제6,825,926호 및 모두가 카스단(Kasdan) 등에게 허여된 미국 특허 제6,184,978호; 제6,424,415호; 및 제6,590,646호에 개시되어 있으며, 이들은 마치 본 명세서에 완전히 기술된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
동적 광 산란 또는 임피던스를 사용하는 자동화 시스템이 온혈구 카운트(CBC), 즉 전체 백혈구 카운트(WBC), 적혈구의 전체 세포 부피(RBC 분포), 헤모글로빈 HGB(혈액 중의 헤모글로빈의 양); 평균 세포 부피(MCV)(적혈구의 평균 부피); MPV(평균 PLT 부피); 적혈구용적률(HCT); MCH(HGB/RBC)(적혈구당 헤모글로빈의 평균량); 및 MCHC(HGB/HCT)(세포 중의 헤모글로빈의 평균 농도)를 얻는 데 사용되어 왔다. 백혈구 5종 감별 카운팅 및 혈액 샘플 분석을 가능하게 하기 위하여 자동화 공정 또는 부분 자동화 공정이 사용되어 왔다.
전술된 다양한 자동화 시스템은 샘플의 신속한 분석에 의지한다. 염색 과정의 단계들의 수 및 지속기간은 자동화 입자 분석 시스템의 속도 및 효능에서 제한 인자(limiting factor)일 수 있다. 염색 과정이 단축된다면 자동화 입자 분석 시스템은 더 효율적일 수 있으며, 염색 과정이 단일 단계로 수행된다면 더욱 더 효율적일 수 있다. 부가적으로, 자동화 입자 분석 시스템은 샘플의 전체 크기가 최소한으로 유지된다면 더 효율적일 수 있다.
자동화 입자 분석 시스템에서 이미징되는 혈액 유체 샘플을 염색하기 위한 입자 조영제 조성물이 개시된다. 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet), 뉴 메틸렌 블루(New Methylene Blue), 메틸 그린(Methyl Green), 에오신(Eosin) Y, 및 사프라닌(Safranin) O로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 입자 조영제를 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 계면활성제(surfactant), 사포닌, 4차 암모늄 염, 비이온성 계면활성제, 표면활성제(detergent), 및 쯔비터이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 투과화제를 추가로 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 글루테르알데하이드 및 포름알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 고정제를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 투과화제는 염색 조건 하에서 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 사포닌일 수 있다. 고정제는 염색 조건 하에서 0.1% 이하의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 글루테르알데하이드일 수 있다.
일 실시 형태에서, 적어도 하나의 입자 조영제는 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 및 에오신-Y를 포함할 수 있다. 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비는 염색 조건 하에서 약 1:90 내지 약 1:110일 수 있다. 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 3 μM 내지 약 300 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
일 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 6 μM 내지 약 10 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 70 μM 내지 약 2.4 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 10 μM 내지 약 50 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 대략 90% 순도 이상이다. 뉴 메틸렌 블루는 대략 70% 순도 이상일 수 있다. 에오신-Y는 대략 80% 순도 이상일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 7.8 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 735 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 27 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 완충제 성분을 추가로 포함할 수 있다.
자동화 입자 분석 시스템을 사용하여 이미징될 혈액 유체 샘플의 입자를 처리하는 방법이 개시된다. 본 방법은 혈액 유체 샘플을 입자 조영제 조성물과 배합하여 샘플 혼합물을 얻는 단계 및 90초 미만 동안 약 37℃ 내지 약 60℃의 온도에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 메틸 그린, 에오신 Y, 및 사프라닌 O로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 입자 조영제; 계면활성제, 사포닌, 4차 암모늄 염, 비이온성 계면활성제, 표면활성제, 및 쯔비터이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 투과화제; 및 글루테르알데하이드 및 포름알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 고정제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제는 염색 조건 하에서 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비가 약 1:1 내지 약 1:500이 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛 뉴 메틸렌 블루를 포함할 수 있다. 사포닌은 염색 조건 하에서 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 글루테르알데하이드는 염색 조건 하에서 0.1% 이하의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 본 방법은 샘플 혼합물을 60초 미만 동안 인큐베이팅하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 염색 조건 하에서 약 6 μM 내지 약 10 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛을 포함할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 70 μM 내지 약 2.4 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 10 μM 내지 약 50 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 혈액 유체 샘플은 입자 조영제 조성물과 약 1:2 내지 약 1:10의 혈액 유체 샘플 대 입자 조영제 조성물의 비로 배합될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 샘플 혼합물을 40 내지 50초 동안 46℃ 내지 약 49℃로 가열하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 대략 90% 순도 이상일 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 대략 70% 순도 이상일 수 있다. 에오신-Y는 대략 80% 순도 이상일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제는 염색 조건 하에서 약 7.8 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛; 염색 조건 하에서 약 735 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 뉴 메틸렌 블루; 및 염색 조건 하에서 약 27 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 에오신-Y를 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 완충제 성분을 추가로 포함할 수 있다. 혈액 유체 샘플은 입자 조영제 조성물과 약 1:3 내지 약 1:4의 혈액 유체 샘플 대 입자 조영제 조성물의 비로 배합될 수 있다. 샘플 혼합물은 약 45초 동안 약 47℃로 가열될 수 있다.
본 발명의 실시 형태의 전술된 특징 및 부수하는 이점 및 많은 다른 특징 및 부수하는 이점이, 첨부된 도면과 함께 고려할 때 하기의 상세한 설명을 참고함으로써 명백해지고 한층 더 이해될 것이다.
본 명세서는 하기의 첨부된 도면들을 참고하며, 여기서 상이한 도면들에서의 동일한 도면 부호의 사용은 동일하거나 유사한 구성요소들을 예시하는 것으로 의도된다.
도 1은 일 실시 형태에 따른 샘플 유체를 수송하기 위한 플로우셀의 개략도이다.
도 2는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물의 제조의 개략도이다.
도 3은 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정의 흐름도(flowchart)이다.
도 4는 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정에 따라 염색된 선택된 백혈구들의 대표적인 예시이다.
도 5는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물로 염색된 샘플로부터 선택된 백혈구들의 대표적인 예시이다.
도 6은 초기 실시예 1에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 7은 초기 실시예 2에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 8은 초기 실시예 3에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 9는 초기 실시예 4에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 10은 초기 실시예에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 11은 초기 실시예 5에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 12는 초기 실시예 6에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 1은 일 실시 형태에 따른 샘플 유체를 수송하기 위한 플로우셀의 개략도이다.
도 2는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물의 제조의 개략도이다.
도 3은 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정의 흐름도(flowchart)이다.
도 4는 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정에 따라 염색된 선택된 백혈구들의 대표적인 예시이다.
도 5는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물로 염색된 샘플로부터 선택된 백혈구들의 대표적인 예시이다.
도 6은 초기 실시예 1에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 7은 초기 실시예 2에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 8은 초기 실시예 3에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 9는 초기 실시예 4에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 10은 초기 실시예에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 11은 초기 실시예 5에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 12는 초기 실시예 6에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
본 발명은 샘플에서의 시각적 구분을 신속하게 생성하기 위한 의외의 예기치 않은 입자 조영제 조성물에 관한 것이다. 입자 조영제 조성물은 자동화 유세포분석 시스템에서 특히 유용할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 입자 조영제, 투과화제, 및 고정제의 배합으로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사포닌, 및 글루테르알데하이드의 혼합물이다. 의외로 효과적인 일 실시 형태에서, 염색 조건 하에서, 크리스탈 바이올렛은 약 7.8 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고, 뉴 메틸렌 블루는 약 735 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고, 사포닌은 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하며, 본 조성물은 약 27 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 에오신-Y를 추가로 포함하고, 글루테르알데하이드는 0.1% 이하의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다.
이들 예시적인 실시예는 본 명세서에 논의된 일반 주제에 대해 독자에게 소개하기 위해 제공되며, 개시된 개념의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 하기의 섹션들은 도면 - 여기서, 동일한 도면 부호는 동일한 요소를 나타냄 - 을 참고하여 다양한 추가의 특징 및 실시예를 기술하고, 안내 설명이 예시적인 실시 형태를 기술하기 위해 사용되지만, 이는 예시적인 실시 형태와 마찬가지로 본 발명을 제한하는 데 사용되어서는 안 된다. 본 명세서에서 이러한 예시들에 포함된 요소들은 축적대로 그려지지 않을 수 있다.
본 발명의 입자 조영제 조성물은, 혈액 유체 샘플에 적용될 때, 그러한 샘플에서의 세포들의 염색을 일으키는데, 이는 표준 혈액 도말 염색제로 처리된 혈액 도말의 것과 유사하며, 특히 라이트 염색제에 의한 혈액 도말 염색과 유사하다. 라이트 염색제는 혈구 유형들(예를 들어, WBC)의 감별을 용이하게 하는 조직학적 염색제이다. 이는 광학 현미경 하에서 조사되는 말초 혈액 도말 및 골수 흡인물을 염색하는 데 주로 사용된다. 세포유전학에서, 이는 증후군 및 질병의 진단을 용이하게 하기 위하여 염색체를 염색하는 데 사용된다. 완충 라이트 염색제, 라이트-김자 염색제, 및 완충 라이트-김자 염색제로서 알려진 관련 염색제들이 있다. 라이트 염색 과정은 알코올 용매를 포함하기 때문에, 이러한 염색 절차는 생존 세포들에 대해 파괴적이고 사실상 온전한 세포들을 생성하지 않는다. 더 강한 착색을 생성하는 메이-그륀발트() 염색제는 또한 수행하는 데 더 오랜 시간이 걸린다.
본 발명의 태양 및 실시 형태는, 예를 들어 염색제/염료 조성물 및/또는 이들의 조합을 포함한 소정의 입자 조영제 조성물이, 자동화 이미지-기반 샘플 분석, 예컨대 혈액 분석을 수행하는 데 사용될 때, 예기치 않은 특성 및 효능을 갖는다는 의외의 예기치 않은 발견에 기초한다.
혈액학 - 입자 분석 시스템
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 많은 상이한 유형의 혈액학 이미징 시스템(hematology imaging system)과 함께 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 이미지-기반 샘플 분석, 예컨대 플로우셀 분석과 함께 사용될 수 있다. 그러한 플로우셀 분석의 일 예는 유세포분석의 전통적인 공지된 방법들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 유리하게는 하기에 간략하게 상술되고, 2014년 3월 17일에 동시출원된 출원 번호 __/___,___이며 발명의 명칭이 "혈액 샘플에서의 입자 분석을 위한 플로우셀 시스템 및 방법(Flowcell Systems And Methods For Particle Analysis In Blood Samples)"인 출원, 및 2014년 3월 17일에 동시출원된 출원 번호 PCT________이며 발명의 명칭이 "혈액학 시스템 및 방법(Hematology Systems and Methods)"인 출원에서 추가로 기술된 플로우셀 분석 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있으며, 이들 둘 모두는 본 명세서에서 참고로 포함된다.
도 1은 디지털 이미지 처리를 사용하여 샘플 유동 스트림(32) 중의 현미경적 입자를 이미징하기 위한 구성에서 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 관찰 구역(23)을 통해 샘플 유체(예를 들어, 하기에 기술된 샘플 혼합물)를 수송하기 위한 예시적인 플로우셀(22)의 개략도이다. 플로우셀(22)은 샘플 유체의 공급원(25)에 커플링되는데, 이러한 샘플 유체는, 하기에 추가로 상술된 바와 같이 입자 조영제 조성물과 접촉되는 것과 같은 처리를 거쳤을 수 있다. 플로우셀(22)은 또한 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(particle and/or intracellular organelle alignment liquid, PIOAL), 예컨대 샘플 유체의 점도보다 더 큰 점도를 갖는 투명 글리세롤 용액의 하나 이상의 공급원(27)에 커플링된다.
샘플 유체는, 샘플 공급관(29)의 원위 단부(28)에서 납작한 개구부를 통해, 그리고 PIOAL 유동이 사실상 확립된 지점에서 플로우셀(22)의 내부 내로 주입되어서, 리본형 샘플 스트림의 위 및 아래에서(또는 대향하는 면들 상에서) PIOAL의 안정하고 대칭인 층류가 생성되게 된다. 샘플 스트림 및 PIOAL 스트림은, 사실상 협소화되는 유로를 따라, 주입된 샘플 유체와 함께 PIOAL을 이동시키는 정밀 계량 펌프들에 의해 공급될 수 있다. PIOAL은 유로가 협소화되는 구역(21)에서 샘플 유체를 봉입 및 압축한다. 따라서, 구역(21)에서의 유로 두께의 감소는 샘플 스트림(32)의 기하학적 포커싱(geometric focusing)에 기여할 수 있다. 샘플 유체 리본(32)은 협소화 구역(21)의 하류에서 PIOAL에 의해 봉입되고 그와 함께 운반되어, 예를 들어 CCD를 사용하여 이미지가 수집되는 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 전방에서, 또는 아니면 관찰 구역(23)을 통해 통과한다. 샘플 유체 리본은 PIOAL과 함께 배출구(33)로 유동한다.
여기에 나타낸 바와 같이, 협소화 구역(21)은, 원위 두께 DT가 근위 두께 PT보다 더 작도록, 근위 두께 PT를 갖는 근위 유로 부분(21a) 및 원위 두께 DT를 갖는 원위 유로 부분(21b)을 가질 수 있다. 따라서, 샘플 유체는 근위 부분(21a)에 대해 원위이고 원위 부분(21b)에 대해 근위인 위치에서 샘플관(29)의 원위 단부(28)를 통해 주입될 수 있다. 따라서, 샘플 유체는 PIOAL 스트림이 구역(21)에 의해 압축됨에 따라 PIOAL 봉입물로 진입될 수 있으며, 이때 구역(21)에서 샘플 유체 주입관은 원위 출구를 가지며, 이를 통해 샘플 유체가 유동하는 시스 유체(sheath fluid) 내로 주입되고, 이러한 원위 출구는 플로우셀의 유로 크기의 감소에 의해 경계지어진다.
대물 렌즈(46)를 갖는 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 리본형 샘플 스트림(32)과 교차하는 광학 축을 따라 지향된다. 대물 렌즈(46)와 플로우셀(33) 사이의 상대 거리는 광센서 어레이 상의 포커싱된 디지털화 이미지를 분해 및 수집하기 위하여 모터 드라이브(54)의 작동에 의해 변동가능하다.
입자 조영제 조성물
도 2는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물의 제조의 개략도이다. 블록(208)에서, 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206)가 배합되어 입자 조영제 조성물(210)을 생성한다. 일 실시 형태에서, 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206)는 동시에 배합된다. 다른 실시 형태에서는, 임의의 순서대로, 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206) 중 하나가 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206) 중 다른 하나와 배합되고, 이어서 이는 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206) 중 마지막 하나와 배합된다. 블록(208)에서의 배합은 임의의 순서대로 그리고 임의의 적합한 방법으로 수행될 수 있다.
대안적인 실시 형태에서, 투과화제(204) 및 고정제(206) 중 하나는 입자 조영제 조성물(210) 중에 포함되지 않는다. 또 다른 실시 형태에서는, 하기에 추가로 상술된 바와 같이, 추가 재료들이 입자 조영제 조성물(210)의 일부로서 블록(208)에서 배합된다.
입자 조영제 조성물(210)은 키트(kit)의 일부로서 제공될 수 있다. 입자 조영제 조성물(210)은 이미 제조된 상태로 제공되거나 하나 이상의 성분으로서 제공되어 이들 성분이 배합되어야 할 수도 있다.
입자 조영제
입자 조영제(202)는 가시적인 구분을 생성할 수 있는 임의의 조영제, 예컨대 라이트 염색제와 유사한 것들일 수 있다. 그러한 조영제의 예에는 하기가 포함된다: 알시안 블루(Alcian Blue) 및 알시안 블루 86(PAS 중성 및 산성 점액물질); 알리자린 레드(Alizarin Red) S; 알루라 레드(Allura Red) AC(아조염료 적색 염료 40호); 아날린 블루(Analine Blue)(옥살산으로 강화된 섬모(cilia)); 오라민(Auramine) O; 아주르(Azure) B; 아주르 C; 비스마르크 브라운(Bismarck Brown); 브릴리언트 블루(Brilliant Blue) FCF(쿠마시 블루(Comassie blue)); 브릴리언트 크레실 블루(Brilliant cresyl blue); 브릴리언트 그린(Brilliant green); 카르뮴(Carmium)(카르민산 및 칼륨 명반으로 이루어진 적색 핵 염료); 콩고 레드(Congo red); 클로로졸 블랙(Chlorozol black) E(핵 흑색, 세포 회색, 글리코겐 분홍색); 크레실 바이올렛 아세테이트; 다로우 레드(Darrow red); 에오신 블루이시(Eosin bluish); 에리트로신(Erythrosin) B(적색 염료 3호); 에틸 에오신(Ethyl eosin); 패스트 그린(Fast Green) FCF(녹색 염료 3호); 염기성 푹신(Fuchin basic)- (핵 및 편모); 플루오레세인(Fluorescein)- (머큐로크롬(Mercurochrome)); 김자- 말초 혈액 도말; 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin)- 퇴행성 핵 염색제(regressive nuclear stain); 인디고 카르민(Indigo Carmine)(청색 염료 2호); 야누스 그린(Janus Green) B(미토콘드리아); 제너(Jenner) 염색제- (말초 혈액 도말); 라이트 그린(Light Green) SF 옐로우이시(yellowish); 맥닐(MacNeal)- (테트라크롬 혈액 염색제); 말라카이트 그린(Malachite green); 메틸 오렌지(Methyl orange); 마르티우스 옐로우(Martius yellow); 마이어 헤마톡실린(Mayer's Hematoxylin)- 진행성 핵 염색제(progressive nuclear stain); 메틸 바이올렛(Methyl violet) 2B; 메테나민 은-페로이드산(Methenamine Silver-Peroidic acid); 메틸렌 바이올렛(Methylene violet); 메이 그륀발트- 혈액학적 염색제; MTT- 포르마잔 염색제; 뮤시카르민(Mucicarmine)- 1차 종양 염색제; 뉴트럴 레드(Neutral red); 니그로신(Nigrosin); 닐 블루(Nile Blue) A; 뉴클리어 패스트 레드(Nuclear Fast red) C.I. 60760; 나프탈(Napthal) AS; 니트로-블루 테트라졸륨(Nitro-Blue Tetrazolium)- 견뢰 포르마잔 염료; 오렌지(Orange) G; 오렌지 II; 오르세인(Orcein); 파파니콜라우(Papanicolaou) 염색제 EAS- 선명한 세포질 염색; 파라로사닐린(Pararosanilin); 파라로사날린(Pararosanaline); 페리오드산 시프(Periodic Acid Schiff)-(PAS, 특정 탄수화물 염색제); 필록신(Phyloxine) B; 프로타르골(Protargol) S; 피로닌(Pyronin) B; 피로닌 Y; 레사주린(Resazurin); 로마노우스키-김자(Romanowsky-Giemsa); 로즈 벵갈(Rose Bengal); 사프라닌 O; 수단 블랙(Sudan Black) B; 수단 III- (알파-나프톨에 의해 골수성 과립을 염색함); 수단 IV- 트라이글리세라이드를 염색함; 타르트라진(Tartrazine)- (아조 염료 황색 5호); 티오닌(Thionin)- 메타 염색질을 염색함; 트라이페닐 테트라졸륨(Triphenyl Tetrazolium); TTC- 포르마잔 적색 염료; 톨루이딘 블루(Toluidine Blue) O; 라이트 염색제- (종래의 혈액 도말을 위한 고정제, 완충제 및 염색제); 및 라이트 김자.
많은 노력과 실험을 통해, 본 명세서에서 추가로 상술된 바와 같이, 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사프라닌 O, 에오신 Y 및 메틸 그린 중 적어도 하나를 포함하는 입자 조영제(202)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 입자 조영제(202)는 이미지-기반 범주화 및 하위범주화를 위하여 생존 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들을 염색하기에 유효한 양으로 첨가된다. 입자 조영제(202)는 상기 언급된 입자 조영제들 중 2개 이상의 임의의 조합일 수 있다. 입자 조영제(202)는 생명유지 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들의 "라이트-유사" 염색된 이미지를 효과적으로 얻도록 선택될 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛을 포함한다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 1 μM 내지 약 100 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염색 조건 하에서"는 그 성분이 샘플과 혼합될 때를 지칭한다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 6 μM 내지 약 10 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 7.8 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 아주 거의 7.8 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 90% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛 단독일 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 입자 조영제와 조합된 크리스탈 바이올렛일 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 뉴 메틸렌 블루를 포함한다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 70 μM 내지 약 2.4 mM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 500 μM 내지 약 950 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 735 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 아주 거의 735 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 70% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 100% 순도 이상으로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)가 크리스탈 바이올렛 및 뉴 메틸렌 블루 둘 모두를 포함하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성된다. 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비는 약 1:1 내지 약 1:500(몰농도/몰농도)일 수 있다. 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비는 약 1:50 내지 약 1:160(몰농도/몰농도)일 수 있다. 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비는 약 1:90 내지 약 1:110(몰농도/몰농도)일 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 에오신 Y를 포함한다. 에오신 Y는 염색 조건 하에서 약 3 μM 내지 약 300 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신 Y는 염색 조건 하에서 약 10 μM 내지 약 50 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신 Y는 염색 조건 하에서 약 27 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신 Y는 염색 조건 하에서 아주 거의 27 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신 Y는 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 에오신 Y는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 에오신 Y는 100% 순도 이상으로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)가 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 및 에오신 Y의 조합인 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성되며, 이들 각각은 전술된 바와 같은 농도 및 순도의 임의의 조합을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 구체적으로 약 7.8 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛, 약 735 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 뉴 메틸렌 블루, 및 약 27 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 에오신 Y이다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 구체적으로 약 7.8 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 99% 순도 이상의 크리스탈 바이올렛, 약 735 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 99% 순도 이상의 뉴 메틸렌 블루, 및 약 27 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 99% 순도 이상의 에오신 Y이다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 사프라닌 O를 포함한다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 1 μM 내지 약 100 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 3 μM 내지 약 30 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 9 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 아주 거의 9 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 사프라닌 O는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 사프라닌 O는 100% 순도 이상으로 정제될 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 메틸 그린을 포함한다. 메틸 그린은 염색 조건 하에서 약 0.1 g/L를 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 메틸 그린은 염색 조건 하에서 아주 거의 0.1 g/L를 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 메틸 그린은 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 메틸 그린은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 메틸 그린은 100% 순도 이상으로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사프라닌 O, 에오신 Y 및 메틸 그린 중 하나 이상을, 예를 들어 이미징을 위해 제공될 때 샘플 중의 입자들의 세포내 내용물 특징부를 증강시킴으로써 입자들에서의 시각적 구분을 생성하기에 유효한 양으로 포함한다. 입자 조영제(202)는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구뿐만 아니라 망상적혈구, 유핵 적혈구, 혈소판, 아세포(blast), 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 또는 세포 단편의 세포하(subcellular) 구조를 증강 및/또는 염색하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 시각화가능한 또는 시각적 구분은 임의의 광원(예를 들어, UV, 가시광, IR)을 사용하여 시각화가능하거나 달리 검출가능할 수 있는 임의의 입자 특징부 또는 입자내(intraparticle) 특징부를 포함할 수 있다.
입자 조영제 조성물(210)이 2개 이상의 입자 조영제(202)들을 포함하는 실시 형태에서, 입자 조영제(202)들의 각각의 양은, 입자 조영제(202)들이 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분의 생성에 대해 독립적, 경쟁적 및/또는 증강 효과를 갖는지의 여부에 따라 적절히 조정될 수 있다.
투과화제
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 계면활성제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 사포닌을 포함할 수 있다. 대안적인 실시 형태에서, 투과화제(204)는 4차 암모늄 염, 비이온성 계면활성제, 및 쯔비터이온성 계면활성제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 투과화제는 세포내 내용물에 대한 입자 조영제(202)의 접근성을 증가시키도록 세포의 투과성을 변경시킬 수 있다. 투과화제는 신속한 1 단계 염색 절차를 허용하기에 충분한 양으로 선택되고 포함될 수 있다.
비이온성 계면활성제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: (1) 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리옥시에틸렌 에탄올에 대해 에테르화된 직쇄 지방족 소수성 물질을 포함한, 폴리옥시에틸렌 알킬 또는 아릴 에테르(폴리에톡실레이트), 예를 들어 브리즈(Brij)(등록상표) 35; (2) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에테르화된 분지쇄 지방족/방향족(예를 들어, 옥틸페놀) 소수성 물질, 예를 들어 트리톤(Triton) X(등록상표)-100; (3) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에테르화된 직쇄 지방족/방향족(예를 들어, n-노닐페놀) 소수성 물질, 예를 들어 아이게팔(Igepal)(등록상표) C0897; 및 (4) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에스테르화된 직쇄 지방족(예를 들어, 카르복실산) 소수성 물질, 예를 들어 미르즈(Myrj)(등록상표) 53, 및 기타. 비이온성 폴리옥시에틸렌 알킬 또는 아릴 에테르(폴리에톡실레이트) 계면활성제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: 폴리옥시에틸렌(4) 라우릴 에테르(브리즈(등록상표) 30); 폴리옥시에틸렌(23) 라우릴 에테르(브리즈(등록상표) 35); 폴리옥시에틸렌(2) 세틸 에테르(브리즈(등록상표) 52); 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르(브리즈(등록상표) 58); 폴리옥시에틸렌(2) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 72); 폴리옥시에틸렌(10)스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 76); 폴리옥시에틸렌(20) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 78); 폴리옥시에틸렌(2) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 92); 폴리옥시에틸렌(10) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 96); 폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 98); 폴리옥시에틸렌(21) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 721); 폴리옥시에틸렌(100) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 700); 및 기타. 비이온성 계면활성제의 추가 예에는 트리톤 X(등록상표)-100(비환원 또는 환원됨), 트리톤(등록상표)X-114(비환원 또는 환원됨), 트리톤 X(등록상표)-165, 및 트리톤 X(등록상표)-305(비환원 및 환원됨), 및 기타가 포함될 수 있다.
일 실시 형태에서, 투과화제(204)는 염색 조건 하에서 약 0.10 g/L 내지 약 0.20 g/L 의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 브리즈(등록상표) 35를 포함할 수 있다. 브리즈(등록상표) 35는 염색 조건 하에서 약 0.10 g/L 내지 약 0.16 g/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 브리즈(등록상표) 35는 약.012 g/L 내지 약 0.14 g/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
쯔비터이온성 계면활성제의 예에는 TDAPS(테트라데실다이메틸암모니오프로판설포네이트), CHAPSO(3-[(3-콜아미도프로필) 다이메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트), 약 12 내지 약 16개의 탄소 원자를 갖는 알킬 N, N-다이메틸 N-옥사이드, 라우릴 다이메틸아민 N-옥사이드(LO), DDAPS(N-도데실-N, N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트), 및 기타가 포함될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 적혈구를 용해시키기에 충분한 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 망상적혈구 또는 유핵 적혈구 이외의 적혈구를 용해시키기에 충분한 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 백혈구, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 혈소판, 및 다른 세포가 사실상 온전하게 유지되어 있는 동안에 적혈구를 용해시키기에 충분한 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 백혈구, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 및/또는 혈소판의 구성원 및/또는 핵막이 더 투과성 및/또는 다공성이게 하여 입자 조영제(202)에 의한 접근을 용이하게 한다.
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 입자 조영제(202)가 샘플 내의 세포들로 진입될 수 있게 하는 데 필요한 기공 또는 개구부를 신속히 생성할 수 있도록 선택된다.
많은 노력과 실험을 통해, 미국 플로리다주 Ft. 라우더데일 소재의 클리니컬 다이아그노스틱 솔루션즈(Clinical Diagnostic Solutions)(CDS)로부터 입수가능한 5PD-라이틱(Lytic)을 포함하는 투과화제(204)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 5PD-라이틱은 사포닌을 포함한다. 5PD-라이틱은 개괄적으로 미국 특허 제6,632,676호에 기술되어 있으며, 이 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다.
많은 노력과 실험을 통해, 염색 조건 하에서 약 10 mg/L 내지 약 1000 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 사포닌을 포함하는 투과화제(204)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 일부 실시 형태에서, 사포닌은 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 실시 형태에서, 사포닌은 4차 암모늄-치환된 사포닌 에테르일 수 있다.
고정제
일부 실시 형태에서, 고정제(206)는 염색 및 이미징 동안 백혈구가 분해되지 않음을 보장하도록 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 고정제(206)는 다른 세포들 및 세포 구조들이 분해되지 않음을 보장할 수 있다. 고정제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: 글루타르알디드; 포름알데하이드; 가교결합제; 등장 식염수 중 암모니아 피크레이트(예를 들어, 메틸렌 블루 염색용); 에틸 알코올; 메탄올(예를 들어, 실온, - 20℃ 또는 -70℃에서); 하이덴하인(Heidenhain)의 수사(Susa) ― HgCl2, NaCl 트라이클로로아세트산, 포르말린; 보우인(Bouin) 고정제 ― 피크르산, 포르말린, 아세트산; 두보섹-브라질(Duboseq-Brazil) ― 80% EtOH를 갖는 보우인 고정제; 카르노이(Carnoy) 고정제 ― EtOH, 클로로포름, 아세트산; 젠커(Zenker) 고정제 ― HgCl2, K2CrO7, NaSO4.H2O; 아세토카르민; 가텐스비(Gatensby) 고정제 ― 크롬산, 사산화오스뮴, NaCl; 베이커(Baker) 고정제 ― 포르말린, CaCl2; 스미스(Smith) 고정제 ― K2Cr2O7, 포르말린, 아세트산; 1% 메틸 그린, 1% 아세트산; 페놀, 포르말린, 글리세롤, 겐티안 바이올렛(Gentian violet); 샤우딘(Schaudin) ― HgCl2, EtOH, 아세트산; 챔피(Champy) 고정제 ― 크롬산, K2CrO7, OsO4; 플레밍(Fleming) 고정제 ― 크롬산, OsO4, 아세트산; 포르몰-은(Formol-Silver) ― 포름알데하이드, AgNO3; 스트렉(Streck) 조직 고정제 ― 브로노폴, 다이아졸리디닐 우레아, ZnSO4 .7H2O, 소듐 시트레이트; PBS 중 1% 이미다졸리디닐 우레아; 글리옥살: 글리오픽스(Glyofix), 프레퍼(Prefer), 세이프픽스(Safefix), 히스토초이스(Histochoice); 글리단트-하이단토인(Glydant- Hydantoin); 다이메틸올 우레아; 소듐 하이드록시메틸글리시네이트; 카르노브스키(Karnovsky) 고정제; 염화제2수은(B-5); 홀란데(Hollande) 고정제; 및 기타. 게다가, 적합한 예시적인 고정제는 하기 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 고정제(206)는 산화제, 수은제, 피크레이트, 헤페스-글루탐산 완충제-매개 유기 용매 보호 효과(hepes-glutamic acid buffer-mediated organic solvent protection effect, HOPE) 고정제, 또는 수용성 방부제일 수 있다. 산화제의 예에는 중크롬산칼륨, 크롬산, 과망간산칼륨, 및 기타가 포함된다. 수은제의 예에는 B-5, 젠커 고정제, 및 기타가 포함된다. 수용성 방부제의 예에는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 다이메틸올우레아, 2-피리딘티올-1-옥사이드, 소르브산, 소르브산칼륨, 및 기타가 포함된다.
많은 노력과 실험을 통해, 글루테르알데하이드 및 포름알데하이드 중 적어도 하나를 포함하는 고정제(206)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
일부 실시 형태에서, 글루테르알데하이드를 0.1 중량% 이하로 포함하는 고정제(206)를 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
추가 성분
일부 실시 형태에서, 선택적 추가 성분(212)들이 선택적으로 블록(208)에서 입자 조영제 조성물(210) 내로 배합될 수 있다. 추가 성분(212)들의 예에는 완충제 성분, 점도 개질제, 항미생물제, 삼투압 조정제, 이온 강도 개질제, 계면활성제, 킬레이트화제, 및 기타가 포함될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)이 인산염 완충 식염수를 포함하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
예시적인 점도 개질제에는 하기가 포함된다: 천연 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 카라기난, 로커스트 빈 검(locust bean gum), 구아 검, 및 젤라틴; 당(sugar)(및 유도체), 예컨대 덱스트로스, 프룩토스; 폴리덱스트로스; 덱스트란; 폴리덱스트란; 당류(saccharide); 및 다당류(polysaccharide); 반합성 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스; 합성 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 카르보폴(Carbopol)(등록상표); 및 점토(및 유도체), 예컨대 벤토나이트 및 비검(Veegum)(등록상표).
신속한 1 단계 염색 과정
도 3은 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정(300)의 흐름도이다. 신속한 1 단계 염색 과정(300)은 여러 하위단계들을 포함할 수 있지만, 용어 "1 단계"는 샘플이 염색 절차 동안 다수의 상이한 용액들에 도입될 필요가 없음을 나타내는 데 사용된다. 도 2를 참고하여 전술된 바와 같이, 입자 조영제 조성물(210)이 블록(302)에서 제조된다. 선택적으로, 일부 실시 형태에서, 성분들, 예컨대 임의의 입자 조영제(202)들이 블록(306)에서 정제될 수 있다. 입자 조영제(202)들의 정제는 샘플과의 접촉시에 형성된 침전물의 수준을 감소시키며, 그럼으로써 백그라운드를 감소시키고 이미지-기반 혈액 샘플 분석의 결과를 개선할 수 있으며, 아울러 이미지 또는 슬라이드의 추가의 재검토, 또는 수동으로 준비된 현미경법에 대한 필요성이 감소된다.
블록(308)에서, 입자 조영제 조성물(210)은 샘플과 배합된다. 입자 조영제 조성물(210)은, 함께 혼합하는 것을 포함한 임의의 적합한 방식으로 샘플과 배합될 수 있다. 블록(308)에서의 배합은, 샘플을 소정량의 입자 조영제 조성물(210)을 사용하여 희석시키는 것을 포함할 수 있다. 샘플은 입자 조영제 조성물(210)을 사용하여 희석될 수 있다. 희석량은 이미지-기반 분석 동안 프레임당 최적의 세포수를 제공하도록 선택될 수 있다. 희석량은 이미지-기반 분석 동안 프레임당 최적의 백혈구 수를 제공하도록 선택될 수 있다. 희석량은 임의의 다른 이미지-비기반 분석에 대해 최적 부피를 제공하도록 달리 선택될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 약 2:1 내지 약 20:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비는 약 3:1 내지 약 10:1일 수 있다. 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비는 약 3:1 내지 약 4:1일 수 있다. 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비는 약 3:1 또는 약 4:1일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 아주 거의 3:1 또는 아주 거의 4:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비를 사용하여 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
입자 조영제를, 10:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 희석비를 갖고서, 40 mL의 5PD-라이틱 및 50 mL의 인산염 완충 식염수와 함께 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 입자 조영제를, 5:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 희석비를 갖고서, 40 mL의 5PD-라이틱, 추가 사포닌, 및 40 mL의 인산염 완충 식염수와 함께 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 입자 조영제를, 4:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 희석비를 갖고서, 40 mL의 5PD-라이틱, 추가 사포닌, 및 36 mL의 인산염 완충 식염수와 함께 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 승온, 예컨대 인큐베이팅과 관련하여 하기에 기재된 온도들 중 임의의 온도에서 입자 조영제 조성물(210)과 배합된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 배합된 샘플 및 입자 조영제 조성물(210)은 샘플 혼합물로 지칭된다.
블록(310)에서, 샘플 혼합물은 소정 온도에서 소정 시간 동안 인큐베이팅된다. 인큐베이션은 세포들 또는 그들의 내부 구조의 투과성을 증가시킬 수 있어서, 입자 조영제(202)가 세포들 또는 세포 구조들을 더 잘 침윤시킬 수 있게 한다. 인큐베이션의 시간 및 온도는 입자 조영제 조성물(210)이 샘플을 적절히 투과하고, 고정시키고, 염색할 수 있도록 선택될 수 있다. 인큐베이션의 시간 및 온도는 백혈구, 혈소판, 및 유핵 적혈구를 사실상 온전하게 유지하면서 적혈구의 용해를 보장하도록 선택될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 약 1 내지 60초 동안 약 37℃ 내지 약 60℃의 온도에서의 샘플 혼합물의 인큐베이션에 의해 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 샘플 혼합물은 약 46℃ 내지 약 49℃의 온도로 가열될 수 있다. 샘플 혼합물은 40 내지 50초 동안 인큐베이팅될 수 있다. 샘플 혼합물은 최대 1시간 인큐베이팅될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 약 45초 동안 약 48℃에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 약 45초 동안 약 47℃에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 블록(308)에서의 배합 및 블록(310)에서의 인큐베이팅은, 샘플 혼합물이 이미징 장치에서 처리되고 그러한 이미징 장치의 라인들이 플러싱 및/또는 세정되는 데 걸리는 시간과 대략적으로 동일한 시간이나 그보다 적은 시간 내에 완료된다. 이러한 방식으로, 제2 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅되고 있는 동안에 제1 샘플 혼합물이 이미징될 수 있다. 일단 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제2 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있다.
대안적인 실시 형태에서, 블록(308)에서의 배합 및 블록(310)에서의 인큐베이팅은 샘플 혼합물이 이미징 장치에서 처리되고 그러한 이미징 장치의 라인들이 플러싱 및/또는 세정되는 데 걸리는 시간의 2배 미만 내에 완료된다. 이러한 방식으로, 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 있는 동안에, 제2 샘플 혼합물이 이미징될 준비를 할 수 있고, 제3 샘플 혼합물 및 제4 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅되는 과정에 있을 수 있다. 일단 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제2 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있다. 제3 샘플 혼합물은 그의 배합 및 인큐베이팅을 종료하는 중일 수 있고, 제4 샘플 혼합물은 여전히 배합 및 인큐베이팅하는 중일 수 있다. 일단 제2 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제3 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있으며, 이 동안에 제4 샘플 혼합물은 배합 및 인큐베이팅을 종료하기 시작하고, 제5 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅을 시작한다. 이 과정은 샘플 혼합물을 연속적으로 이미징하도록 무한히 계속될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 입자 조영제 조성물(210)의 소정 실시 형태, 입자 조영제 조성물(210)을 샘플과 배합하는 소정 방식, 및 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 소정 방식의 조합을 통해 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
구체적으로, 염색 조건 하에서 약 7.8 μM인 90% 순도 이상의 크리스탈 바이올렛, 염색 조건 하에서 약 735 μM인 70% 순도 이상의 뉴 메틸렌 블루, 염색 조건 하에서 약 27 μM인 80% 순도 이상의 에오신-Y, 염색 조건 하에서 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L인 사전처리된 사포닌, 및 염색 조건 하에서 약 0.1% 이하인 글루테르알데하이드를 포함하는 입자 조영제 조성물(210)을 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있는데, 여기서 입자 조영제(210)는 샘플과 약 3:1 내지 약 4:1의 입자 조영제(210) 대 샘플의 비로 배합되고; 생성된 샘플 혼합물은 약 45초 동안 약 48℃에서 인큐베이팅된다.
소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는, 비알코올계 용매 시스템 중 염료를 사용하여 자동화 시각적 분석기에 의해, 생명유지 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들의 "라이트-유사" 염색된 이미지가 효과적으로 얻어질 수 있게 한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 다양한 세포 성분, 핵엽(nuclear lobe), 및 과립 구조가 명백히 구분가능하도록 샘플들의 신속한 염색을 가능하게 한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 초생체(supravital) 염색에 적합하다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 혈청, 뇌척수액, 흉막액, 활액, 정액, 복수, 양수, 세척액(lavage fluid), 골수 흡인액, 침출물, 삼출물, 또는 혈액 샘플 중의 입자들의 세포내 내용물 특징부를 증강시키는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 원주(cast), 세균, 상피, 및/또는 기생충을 염색하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는, 예를 들어 세포들 내의 1차 및 2차 과립의 감별 염색(differential staining)을 제공함으로써, 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성하는 데, 예컨대 1차 및 2차 과립의 감별 염색 또는 증강에 기반한 미성숙 과립구들의 하위범주화 및 그들의 수명(age) 결정에 도움을 주는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 적혈구, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 및 혈소판의 카운팅 및 특성화를 위한, 뿐만 아니라 백혈구 감별 카운팅 및 백혈구 특성화 및 분석을 위한 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 생명유지 및/또는 생존 세포들 및/또는 사실상 온전하게 유지된 구조를 갖는 세포들에서 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구뿐만 아니라 망상적혈구, 유핵 적혈구, 혈소판, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 또는 세포 단편의 세포하 구조를 염색하는 데 효과적이다.
본 명세서에 기재된 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차에 의해 가능한 신속한 염색은 수동 또는 반자동 이미징 및/또는 분석 절차와 함께 사용될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 비알코올계 용매 시스템 중 입자 조영제들을 포함하는 입자 조영제 조성물(210)의 소정 실시 형태에 의해 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었는데, 이러한 실시 형태는, 본 발명자들이 알고 있는 한 최초로, 생명유지 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들의 "라이트-유사" 염색 이미지를 생성할 수 있으며, 이러한 이미지에 의해 다양한 세포 성분, 핵엽, 및 과립 구조를 밝혀내고 이들 입자 및/또는 세포 특징부들을 시각적으로 구분할 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 실시 염색 시약이, 40 mL의 뉴 메틸 블루 및 5 mL의 크리스탈 바이올렛을 혼합함으로써 제조된, 표 1에 열거된 바와 같이 구성된 입자 조영제 조성물(210)을 사용할 때, 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
[표 1]
도 4는 표 1에 기재된 입자 조영제 조성물(210)로 염색되고 상기에 기재된 신속한 1 단계 염색 절차를 사용하여 염색된 샘플로부터 선택된 백혈구들의 대표적인 예시이다. 이들 백혈구는 온전하고 라이트 염색제의 염색 특성을 나타낸다. 다양한 유형의 백혈구(예를 들어, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구 등)가 시각적으로 감별가능하다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 입자 조영제 조성물에 의해 염색된 세포들의 특징부들이 표 2에 기재되어 있다.
[표 2]
소정 실시 형태에서, 염색제/염료 조성물은 안정성, 저장 용이성, 처분, 및/또는 제한된 독성을 위해 제형화된다.
도 5는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물(210)로 염색된 샘플로부터 선택된 백혈구들의 대표적인 예시로서, 이에는 수동 습식 마운트(wet mount) 이미징 및 자동 유동 이미징을 통해 이미징된 세포들이 포함된다.
초기 실험
하기의 실시예를 참고하여 설명된 바와 같이, 전술된 실시 형태들을 생성하기 위하여 다수의 염색 조성물 및 방법을 시험하고 변형시켰다.
초기 실시예 1에서는, 2 단계 염색 방법이 나타나 있는데, 이 방법에서는 샘플과 입자 조영제 조성물의 초기 실시 형태를 배합하고 47.5℃에서 40초 동안 인큐베이팅하고, 이어서 켄칭 시약(quenching reagent)을 샘플 혼합물에 적용하였다. 이 입자 조영제 조성물은 콜터(Coulter) LH 시리즈 희석제, 콜터 라이즈 S III 디프 라이틱 시약(Lyse S III diff Lytic Reagent), 콜터 LH 시리즈 팩(Pak) 시약 키트, 및 콜터 LH 시리즈 레틱 팩(RETIC PAK) 시약 키트를 포함하였다. 결과가 도 6에서 보여진다.
실시예 1 후에의 초기 실시예 2에서는, 실시예 1의 2 단계 염색 방법을 1 단계 염색 방법으로 대체하였다. 실시예 1의 결과와 비교하여 호염기구의 개선된 결과가 도 7에서 보여진다.
초기 실시예 3에서는, 글루테르알데하이드를 포함하지 않는 입자 조영제 조성물이 약화된 백혈구를 생성하였으며, 이러한 백혈구는 플로우셀에서의 전단력으로 인해 부서졌을 것이다. 손상된 막을 보여주는 실시예 3의 결과의 이미지가 도 8에 도시되어 있다.
실시예 3 후에의 초기 실시예 4에서는, 입자 조영제 조성물에 글루테르알데하이드를 첨가하였다. 백혈구 막은 실시예 4에서 더 온전하였지만, 핵막은 여전히 손상되었다. PIOAL에 대해 조정을 실시하여 글리세롤 함량을 감소시킨 후에는, 백혈구들의 형태가 도 9에 도시된 바와 같이 이미징 동안 거의 변하지 않았다.
뉴 메틸렌 블루 및 크리스탈 바이올렛의 입자 조영제 조성물을 사용하는 2 염료 염색제에 의한 초기 실시예들에서는, 호산구를 제외하고는 대부분의 세포 유형이 잘 구분가능하였는데, 호산구는, 도 10에 도시된 바와 같이, 다소 일관성이 없었으며 호중구와 구분하는 것이 항상 용이한 것은 아니었다. 후속 실시예 5 및 실시예 6에서는, 제3 입자 조영제를 상기 입자 조영제 조성물에 첨가하였다.
실시예 5에서는, 메틸 그린을 상기 입자 조영제 조성물에 첨가하였다. 메틸 그린은 호산구를 더 잘 염색하도록 도와주었지만, 세포들의 핵은 원하는 자색으로 더 이상 염색되지 않고 청색으로 염색된다. 도 11은 실시예 5의 호중구의 이미지를 도시하는데, 여기서는 핵은 청색으로 염색되어 있지만 과립 세부 모습은 상실하였다.
실시예 6에서는, 입자 조영제 조성물 중의 제3 입자 조영제로서 메틸 그린 대신에 에오신-Y를 사용하였다. 도 12에서 보여지는 바와 같이, 에오신-Y는 핵의 자색 염색을 유지하였으며, 과립은 약간 오렌지색으로 빛나면서 일관성 있게 염색된다.
상기에 언급된 실험 및 추가 실험을 통해, 개시된 실시 형태 및 청구된 실시 형태가 우선적인 결과를 제공하는 것으로 판명되었다.
본 명세서에 논의된 모든 특허, 특허 공보, 특허 출원, 학술지 기사, 서적, 기술 참고 문헌 등이 모든 목적들을 위해 그들 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 사용된 임의의 제목들은 단지 체계적인 목적을 위한 것이며 본 명세서 또는 특허청구범위를 어떠한 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
전술되거나 도면에 도시된 구성요소들뿐만 아니라 도시되거나 기술되지 않은 구성요소들 및 단계들의 상이한 배열들도 가능하다. 유사하게, 일부 특징들 및 하위조합들이 유용하며, 다른 특징들 및 하위조합들에 상관없이 채용할 수 있다. 본 발명의 실시 형태들은 예시적인 그러나 비제한적인 목적을 위해 기술되었으며, 대안적인 실시 형태들이 본 특허의 독자들에게 명백해질 것이다. 소정의 경우에, 방법 단계들 또는 동작들이 상이한 순서대로 수행 또는 실행될 수 있거나, 동작들이 추가, 삭제 또는 변형될 수 있다. 본 발명의 소정 태양에서는, 요소 또는 구조를 제공하거나 주어진 기능 또는 기능들을 수행하기 위하여, 단일 구성요소가 다수의 구성요소들로 대체될 수 있고, 다수의 구성요소들이 단일 구성요소로 대체될 수 있음이 이해될 수 있다. 그러한 치환이 본 발명의 소정 실시 형태를 실시하도록 작용하지 않게 될 경우를 제외하고는, 그러한 치환은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명은 전술되거나 도면에 도시된 실시 형태들로 제한되지 않으며, 하기의 특허청구범위의 범주로부터 벗어나지 않고서 다양한 실시 형태 및 변형이 이루어질 수 있다.
Claims (13)
- 자동화 입자 분석 시스템에서 이미징되는 혈액 유체 샘플을 염색하기 위한 입자 조영제 조성물로서,
크리스탈 바이올렛(Crystal Violet), 뉴 메틸렌 블루(New Methylene Blue), 메틸 그린(Methyl Green), 에오신(Eosin) Y, 및 사프라닌(Safranin) O로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 입자 조영제;
계면활성제(surfactant), 사포닌, 4차 암모늄 염, 비이온성 계면활성제, 표면활성제(detergent), 및 쯔비터이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 투과화제(permeabilizing agent); 및
글루테르알데하이드 및 포름알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 고정제를 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 투과화제는 염색 조건 하에서 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 사포닌이고;
상기 고정제는 염색 조건 하에서 0.1% 이하의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 글루테르알데하이드인, 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 적어도 하나의 입자 조영제는 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 및 에오신-Y를 포함하며,
상기 크리스탈 바이올렛 대 상기 뉴 메틸렌 블루의 비가 염색 조건 하에서 약 1:90 내지 약 1:110이고;
상기 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 3 μM 내지 약 300 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 6 μM 내지 약 10 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고;
상기 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 70 μM 내지 약 2.4 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고;
상기 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 10 μM 내지 약 50 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 크리스탈 바이올렛은 대략 90% 순도 이상이고;
상기 뉴 메틸렌 블루는 대략 70% 순도 이상이고;
상기 에오신-Y는 대략 80% 순도 이상인, 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 7.8 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고;
상기 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 735 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고;
상기 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 27 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물. - 제4항에 있어서,
완충제 성분을 추가로 포함하는, 조성물. - 자동화 입자 분석 시스템을 사용하여 이미징될 혈액 유체 샘플의 입자를 처리하는 방법으로서,
상기 혈액 유체 샘플을 제1항의 상기 입자 조영제 조성물과 배합하여 샘플 혼합물을 얻는 단계; 및
90초 미만 동안 약 37℃ 내지 약 60℃의 온도에서 상기 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함하는, 방법. - 제8항에 있어서,
상기 입자 조영제 조성물은
염색 조건 하에서 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비가 약 1:1 내지 약 1:500이 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛 뉴 메틸렌 블루;
염색 조건 하에서 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 사포닌;
염색 조건 하에서 0.1% 이하의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 글루테르알데하이드를 포함하고,
상기 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계는 상기 샘플 혼합물을 60초 미만으로 가열하는 단계를 포함하는, 방법. - 제9항에 있어서,
상기 입자 조영제 조성물은
염색 조건 하에서 약 6 μM 내지 약 10 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛;
염색 조건 하에서 약 70 μM 내지 약 2.4 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 뉴 메틸렌 블루; 및
염색 조건 하에서 약 10 μM 내지 약 50 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 에오신-Y를 포함하고,
상기 혈액 유체 샘플을 상기 입자 조영제 조성물과 배합하는 단계는 약 1:2 내지 약 1:10의 상기 혈액 유체 샘플 대 상기 입자 조영제 조성물의 비로 배합하는 단계를 포함하는, 방법. - 제9항에 있어서, 상기 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계는 상기 샘플 혼합물을 40 내지 50초 동안 약 46℃ 내지 약 49℃로 가열하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 크리스탈 바이올렛은 대략 90% 순도 이상이고;
상기 뉴 메틸렌 블루는 대략 70% 순도 이상이고;
상기 에오신-Y는 대략 80% 순도 이상인, 방법. - 제11항에 있어서,
상기 입자 조영제 조성물은
염색 조건 하에서 약 7.8 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛;
염색 조건 하에서 약 735 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 뉴 메틸렌 블루;
염색 조건 하에서 약 27 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 에오신-Y; 및
완충제 성분을 포함하고,
상기 혈액 유체 샘플을 상기 입자 조영제 조성물과 배합하는 단계는 약 1:3 내지 약 1:4의 상기 혈액 유체 샘플 대 상기 입자 조영제 조성물의 비로 배합하는 단계를 포함하고;
상기 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계는 상기 샘플 혼합물을 약 45초 동안 약 47℃로 가열하는 단계를 포함하는, 방법.
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