JPH034171A - 溶解剤及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般には赤血球及び白血球集団の流動血球計算
測定に有用な試薬及び方法、より特定的には、赤血球を
溶解させ、白血球を被包（ｓｈｅａｔｈ）すると同時に
抗菌剤として機能する芳香族オキシエタノールを含有し
ており、自動化装置で白血球用に係る。

末梢血液の検査は個体の健康状態を調べるのに重要な側
面である。この検査の重要な１パラメータは白血球の分
別算定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｗｈｉｔｅ　ｃｅ
ｌｌｃｏｕｎｔ）である、この試験は現在３種預の方法
のうちの１種で実施される。最も一般的な方法によると
、血液スミアを作成し、その後、ロマノ７スキー法によ
りスミアを染色する。この染色は全血の稲々の構成成分
を色別する。技術者は染色した血液スミアの顕微鏡検査
により種々の白血球類（典型的には好中球、リンパ球、
単球、好酸球及び好塩基球）を計数することができる。

この手作業による分別は非常に労Ｓ集約的であるので、
自動化された血液サンプルの検査方法を得るために実質
的な研究及び開発への努力が払われている。

最近、自動化項微鏡を用いて自動的に複数のサブ集団の
白血球分別分析が得られるようになった。

これらの自動化Ｍ　＠　鏡の例としては、Ｇｅｏｍｅｔ
ｒｉｃＤａｔａ社（Ｗａｙｎｅ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａ
ｎｉａ）の製品であるＨｅｍａｔｒａｋ系や、Ｃｏｕｌ
ｔｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ１社（Ｃｏｎｃｏｒｄ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の製品であるＤｉｆｆ３
５０及び−１００がある。これらの装置にＲｏｍａｎｏ
ｗｓｋｙ染色した血液スミアを配置し、イメージ分析コ
ンピュータを使用すると、これらの装置は技術者が人為
的に行うと同様の視覚的分類基準を使用して白血球の位
置を決定し、分類する。これらの基準は典型的には核及
び細胞質光学密度、色、形状並びに組織を含む。

別の自動化白血球分別のアプローチは流動血球計算（ｆ
ｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を使用する。この方法に
よると、懸濁液中の血球をトランスデユーサに通し、光
吸収、光散乱又は電気インピーダンスのような数個の測
定可能なパラメータに基づいて血球を分類する。これら
の流動血球計算システムは、サンプル処理量が比較的高
く、サンプル当たりに計数できる血球数が多く、従って
、サンプリングノイズが減少するという点において、閉
微鏡に基づくシステムよりも有利である。従来、市販の
臨床血球計算装置は３種類の白血球サブ集団の分別に限
定されている。白血球は顆粒球、単球及びリンパ球と呼
称されるサブ集団に分類される。既存の３部分分別装置
は光散乱又は電気インピーダンスの測定に基づ（、０ｒ
ｔｈｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｍ６３ｔｗｏｏｄ
　。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のＥＬＴ　１５００のよ
うな光散乱装置は典型的には「低い」及び「直角」と呼
称される２つの異なる角度で測定した光散乱特徴に基づ
いて白血球サブ集団を分類する。　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅ
ｏｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社（Ｈｉａｌｅａｈ、　Ｆｌｏｒ
ｉｄａ）のＳ十系及び５ｅｑｕｏｉａ−Ｔｕｒｎｅｒ社
（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉ
ａ）のような電気インピーダンス装置は、容量修正試薬
へのｓＢ後の容量に基づいて白血球を分類する。

最近まで５つのサブ集団の白血球分別を得ることが可能
な唯一の市販の臨床流動血球計算装置はＴｅｃｈｎｉｃ
ｏｎ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｔａｒｒｙｔｏｗ
ｎ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）のＩ（−６０００及びＨ
＊１であった。これらの装置は血球の精巧な細胞化学的
染色後に光散乱及び吸収を測定することにより白血球を
分類する。この染色方法は比較的遅いので、これらの装
置の処理量は限られている。

５ｅｑｕｏｉａ−Ｔｕｒｎｅｒ社（ｔ４ｏｕｎｔａｉｎ
　Ｖｉｅｕ＋、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）のＣｅ１ｌ−
Ｄｙｎ　３０００は、染色しない白血球の光散乱特徴の
みに基づいて従来の５つのサブ集団の分別を行う１元々
時間のかかる細胞化学的染色を使用しないので、この装
置のサンプル処理量は極めて高度に維持される。　Ｃｅ
１ｌ−Ｄｙｎ　３０００により実現された改良の大部分
は、脱偏光（ｄｅｐｏｌａｒｉｚｅｄ）直角光散乱の測
定と本発明の溶解剤という２つの新技術の結果であり、
リンパ球と単球の良好な分解により５つのサブ集団の白
血球分別分析が得られる。

流動血球計算を使用する市販の自動装置では、白血球分
類及び分別は光散乱又は電気インピーダンスと血球寸法
の相関により得られる。どちらの型の装置でも、全血サ
ンプル中の赤血球を溶解させてヘモグロビンを放出させ
なければならない。

電気インピーダンス測定に基づくシステムでは、第４ア
ンモニウム塩をベースとする溶解剤が使用されている。

これらの電気インピーダンスシステムは白血球の溶解剤
の溶解効果を実質的に無効にするような相当の応答時間
を有する。光散乱測定に基づくシステムでは、赤血球溶
解剤が白血球の光散乱特徴に及ぼす悪影響は更に深刻で
あり、設計面に過重の要求が課される。溶解剤は赤血球
を迅速に溶解させなから、同時に白血球散乱特徴が本質
的に乱されないような窓を提供しなければならない。

赤血球及び白血球の溶解範囲はｐＨと共に増加するので
、これらの基準は典型的にはアルカリ性のｐＨを有する
溶解剤を使用することにより満たされる。広く使用され
ている塩化アンモニウム／重炭酸カリウム／ジＮａＥＤ
Ｔ＾溶解溶液は７．２〜７．４のｐＨを有するが、典型
的には赤血球を完全に溶解させるのに５〜１０分を要す
る。　０ｒｔｈｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社の”Ｌｙ
ｓｅ　Ｒｉｇｈｔ”のような溶解剤は８．５のｐｉ（を
有しており、数秒で赤血球を完全に溶解させることがで
きるが、１分間程度の間に白血球の光散乱特徴に悪影響
を与える。　ｐＦＩを８，５よりも著しく高くするか、
又は約３よりも低くすると、赤血球と白血球とをほぼ瞬
時に溶解させるような溶解剤が得られる。

従って、本発明の目的は、サブ集団分別を得るために十
分な時間の間、白血球の光散乱特徴を維持しなから赤血
球を十分に溶解させる溶解剤を提供することである。

本発明の別の目的は、好中球、リンパ球、単球、好酸球
及び好塩基球として同定される５つの白血球サブ集団を
流動血球計算光散乱システムで計数することが可能な溶
解剤を提供することである。

本発明の別の目的は、市販用として許容可能な貯蔵寿命
を有する溶解剤を提供することである。

本発明の以上及びその他の目的は本明細書の記載及び添
付図面を参考にすることにより当業者に理解されよう。

即ち、本発明によると、芳香族オキシエタノールと、８
，５又はその近傍のｐＫを有する有機緩衝剤と、非イオ
ン界、（、ｎｏ；　諾た：を背、Ｍ＋、ｊ、から成る流
動血球計算用溶解剤が提供される。

本発明の流動血球計算用溶解剤は、白血球を好中球、リ
ンパ球、単球、好酸球及び好塩基球として同定されるサ
ブ集団に分けて５部分分別計数を実現することができる
。溶解剤は芳香族オキシエタノールと、ｐＨ［衝能力を
提供し且つ溶解剤の導電率を増加するように機能する８
、５又はその近傍のｐＫを有する有機緩衝剤と、非イオ
ン界面活性剤成分とから構成される。芳香族オキシエタ
ノールは好ましくは２−フェノキシエタノールである。

有機緩衝剤はＴＲＩＳ／ＩＩｃＩ、ホウ酸、グリシル／
グリシン及び１３ＴｃＩＮＥから構成される群から選択
される。

非イオン界面活性剤はＴｒｉＬｏｎ　Ｘ−１００．Ｔｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ−１１４、ポリオキシエチレン又は糖から
誘導される界面活性剤から構成される群から選択される
。

好適な溶解剤は本質的に、２０ｍＭ〜８０ｍＭの濃度の
２−フェノキシエタノール、ＴＲＩＳ／ｌｌＣｌ緩ｉ剤
及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１００から構成される。

本発明の方法は上記溶解剤を希釈した全血サンプルと組
み合わせるものである。希釈した全血サンプルに溶解剤
を加えた後、赤血球及び白血球に集束レーザービームを
交差（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ）させる。

次ニ、０゛、１０’、９０°及び脱偏光しり９０’Ｃ”
４つ（７）光散乱パラメータを測定する。測定したこれ
らのパラメータをその後、解析し、好中球、リンパ球、
単球、好酸球及び好塩基球の５サブ集団分別計数を得る
。

本発明の溶解剤は、好ましい実施態様では、ＴｒｉＬｏ
ｎ　Ｘ−１００と２−フェノキシエタノールとＴＲＩＳ
／＋（ＣＩバッファとの水溶液を含む、この溶解剤を全
血と混合するのであるが、溶解剤の量は全血より過剰に
し、通常は５０倍にする。赤血球の溶解は、浸透ショッ
クと非イオン系界面活性剤の作用と約８．５のｐＨとの
組合わせによって瞬時に生じる。この溶解剤中の２−フ
ェノキシエタノールは２つの機能を有する。第１はリン
パ球の溶解を遅延させる白血球保護試薬としての機能で
あり、溶解剤によって白血球の光学的特性に実質的な悪
Ｐ１７が与えられる前に亜集団を検出できるようにする
。２−フェノキシエタノールは第２に、より一般的な機
能として殺菌薬の役割を果たし、当該試薬が調製接受な
くとも１年間は細菌によって汚染されないようにする。

ＴＲＩＳ／ＨＣＩは生化学溶液で一般的に使用されるバ
ッファであり、　ｐｈｉ！衝能力を与える他に、溶液の
導電率を増加させて、器具の試薬リザーバ内の該溶液の
存在が一対の電極の使用によって容易に検出され得るよ
うにする。　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００は湿潤剤として
機能し、Ｃｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００管及び光変換器内
での気泡の停滞（ｈａＢ　ｕｐ）を低下させる。

本発明の溶解剤のａｉｍ或は下記の通りである。

２−フェノキシエタノール（２５℃で液体）、、　７５
０Ｉ＋＋１０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）水性ＴｒｉＬｏ
ｎ　Ｘ−１００，、、、、、１００ｍ１脱イオン水、、
、、、、、、、、、、、、、、１０ｏｘに対する残りこ
の最適組成では２−フェノキシエタノールが約４１１Ｎ
の濃度で存在するが、有用濃度範囲は２０〜８０ｍＭで
ある。ＴＲＩＳバツフアのｐＨは、性能に余り影響を与
えずにｐ［（８，１まで低下させ得る。　ｐ）１９．０
を超えると白血球の部分的破壊が生じ得る。約５％（ｖ
ｏｌ／ｖｏｌ）以下の少量のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
又は類似の非イオン系界面活性剤を含ませると、−最に
溶解が難しいと見なされている種の不適当な溶解によっ
て生じる問題が回避される。前述のごとき種としては、
血色業病患者及び赤血球数の多い被験者からの血液試料
が挙げられる。

ＴＲＩＳ／ｌｌＣｌに代えて別の有機バッファを使用す
ることもできる。　ｐＫが８．５又はほぼ８．５のバッ
ファの中では、ホウ酸、グリシル／グリシン及びＢＩＣ
ＩＭＥ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社から市販）が本発明で
使用できる。

本発明の溶解剤の非イオン系界面活性剤成分としてはＴ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４を使用し得る。ポリオキシエチ
レン又はサツカリドヘッド基を有するものから別の親水
性界面活性剤を選択してもよい。

前記最適組成を使用すると、白血球をその光散乱特性に
基づいて示差的に５つの部分に分解できる。　Ｃｅ１ｌ
−Ｄｙｎ　３０００は、各白血球が収束レーザビームと
交差した時点で４つの光散乱パラメータを測定する。こ
れらのパラメータは下記の通りである。

（１’）　ｒｏ°光散乱」：レーザビームに対して約１
〜３゛で実際に光散乱した場合。

（２）　ｒｌｏ°光散乱」：レーザビームに対して約３
〜１０”で実際に光散乱した場合。

（３）　ｒ９０°光散乱」：レーザビームに対して直角
に光散乱した場合。

（４）ｒ９０°偏光解消（ｄｅｐｏｌａｒｉｚｅｄ）光
散乱」：白血球との交差によってもはや垂直には偏光し
ないレーザビームに対して直角に光散乱した場合。

２−フェノキシエタノールは、殺菌薬としての一般的な
機能を果たすと共に、白血球保護剤としても効果的であ
ることが判明した。また、２−フェノキシエタノールを
使用すると、流動細胞計測光散乱法によってリンパ球及
び単球が以前より這かに良く分解された。実際、２フエ
ノキシエタノールを用いると、低角且つ直角の光散乱に
基づいて４つの部分への示差的分解、即ちリンパ球、好
塩基性球、単球、好中球及び好酸球への分解が簡単に得
られる。以前は、これら２つのパラメータな用いて白血
球を３つの部分にしか分解できなかった。

この現象は０ｒｔｈｏ　ＤｉａＦｉｎｏｓｔｉｃ　５ｙ
ｓｔｅ＋ｎｓ　Ｉｎｃ、製造の成る種の器具、例えばＥ
ＬＴ　１５００に見られる。

２−フェノキシエタノールを水に溶解しただけの簡単な
水溶液も効果的な溶解剤ではあるが、器具のリザーバー
内の溶解試薬の存在を電気的に検出する場合には、この
試薬の電気伝導率では低すぎる。そこで、我々は溶解剤
にＴＲＩＳ／ｌｌＣｌバツフアを混入して溶解試薬溶液
の導電率を増加させ、且つｐＨを安定させるようにした
０部分的白血球溶解に起因する問題を最少限に抑えるべ
く、我々は少量の非イオン系バッファＴｒｉｔｏｎ　Ｘ
−１００も組成物中に混入した。この化学物質は試薬ラ
イン（ｒｅａｇｅｎｔｌｉｎｅ）内の溶解剤の湿潤性を
高める機能も有する。

Ｃｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００の器具１０（第１図）では
一対の変換器を細胞測定に使用する。白血球は光散乱に
よって測定される。このチャンネルでは、流体測定がシ
リンジポンプを介して行われる。赤血球及び血小板は夫
々の電子インピーダンスによって測定される。このチャ
ンネルでは容積測定管が使用される。

Ｃｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００の操作はシステムの状態、
記憶データ、ＱＣ実行プログラム、フラグ異常データを
モニターし且つ診断チエツクを行う３つのマイクロプロ
セッサ−によって制御される。

使用者はスクリーンの１２のレベルを用いて８つのモー
ドのうち任意のものを選択できる。メンプランキーボー
ド又はフルＰＣキーボードを用いればどのモードでも得
られる。主要操作モードは下記の通りである。

５ＥＴＵＰ　　　　　システム操作のセットアツプ又は
訂正。

ＲＵＮ　　　　　　種及び対照の追跡。

ＤＡＴＡ　ＬＯＧ　　　　記憶データのレビュー又は印
字。

ＱＣ制御中のデータのレビューもし くは印字、又はファイルの複写。

ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮ　　ｌ−ザー較正ｆ１７）レビ
ュー又ハ実行。

ＤＩＡＧＮＯＳＴｒＣＳ　　障害解決のためにシステム
のチエツクを行う。

１１ＥＬＰ　　　　　　器具の操作でユーザーの手助け
をする。

の手続きを実行する。

運搬を容易にすべく　、Ｃｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００は
２つのモジュールに分割される。主モジュール１４は混
合チャンバ、バルブ、ポンプ、ヘモグロビンフローセル
及びインピーダンス変換器がいずれも器具１０の正面か
ら簡単にアクセスできるように構成されている。器具の
裏側には２つのマイクロプロセッサ−が内臓されている
。上方コンパートメントにはレンズ、レーザー、光検出
器及び融解石英フローセルを載置した光学ベンチが収容
されている。これについては第４図を参照されたい。第
２モジユール１６はビデオモニター、ＰＣ及びキーボー
ドを収容している。

Ｃｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００は血球及びヘモグロビン濃
度のデータを集めるのに３つの変換器を使用する。これ
らの変換器はインピーダンス変換器、光変換器及びヘモ
グロビン変換器と称される。

Ｃｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００は赤血球及び血小板の計数
にインピーダンス変換器を使用する。第２図はインピー
ダンス細胞の計数及びサイズ測定の原理を示している。

この原理は、粒子１８が細孔２０を通る時に生じる電気
抵抗率の変化の測定を基本とする。各細胞が孔２０を矢
印２１の方向に通過すると、孔２０を挟んで位置する水
面下の電［２２及び２４（ここでは電極２２が負に帯電
され、電極２４が正に帯電される）の間の通路の電気抵
抗率が増加する。パルスの数は細胞の計数を表し、パル
スの振幅は細胞の大きさに関係する。パルス振幅の度数
分布は体積ヒストグラムを構成する。これらのヒストグ
ラムは赤血球及び血小板のパラメータ、例えばＭＣＶ（
平均細胞体積）及びＲＤＷ（赤血球分布幅）を得るのに
使用される。

Ｃｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００のインピーダンス孔２０は
直径が６０１ＩＩ１１、長さが７０１１Ｉ１１である。

Ｃｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００は白血球の光散乱特性の測
定に光変換器を使用する。この変換器２６は第３図に簡
単に示されている。赤血球が溶解された状態で含まれて
いる血液懸濁液を試料ノズル２８（直径約１６０ミクロ
ン）から低速度で送出すると、この懸濁液が高速層流状
シース（ｓｈｅａｔｈ）流３０と接触する。流体力学的
収束（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ　ｆｏｃｕｓｉＢ）と
して知られている方法では、試料の流れが次第に細くな
って中央コア３２の状態になる。このコアは融解石英フ
ローセル内で２５〜３０１ｍの直径を有する。このよう
な構造にすると、通常はいつでも単一の白血球が検出領
域内に存在することになり、従ってコインシデンスの問
題が最少限に抑えられる。また、物理的な孔が大きいく
２５０平方ＩＪＩ１１）ため、フローセル３４の詰まり
が生しにくく、しかも遥かに小さい変換器で解析できる
。

白血球測定プロセスの機能が良く理解されるように、こ
こでＣｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００光学ベンチを簡単に説
明する。第４図にＣｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３００Ｇ光学ベン
チの簡単な説明図を示した。尚、本明細書は、本出願人
の同時係属米国特許出願第０７／３２７，４１６号明細
書“Ｐａｒｔｉｃｌｅ　ＤｉｓｅｒｉｍｉｎａＬｏｒ　
ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ”を参考として包含する。光源４
０は波長６３２．８ｎ請の偏光５Ｉヘリウム−ネオンレ
ーザ−である、このレーザーのヘッドは偏光面が垂直に
なるように配向される。

レーザービームは前面鏡４２、円筒レンズ４４、前面＠
４６、垂直スリット４８（幅１２５ミクロン）及びレー
ザー収束レンズ５０によって整形及び収束され、その結
果試料流の中央コア５２領域（２５０平方ミクロンのチ
ャンネルを有する融解石英フローセル）内では、ビーム
の垂直面上の強度プロフィルが（”ｏｎｅｏｖｅｒｅ　
５ｑｕａｒｅｄ”）約７０１４１の直径でガウスの定理
を満足することになる。このプロフィルは水平面では、
偏平上部が約８０Ｈの「トップハツト（ｔｏｐ　ｈａｔ
）」の様相を示す、このような構造にすると、試料コア
が正常位置から少しずれても、器具は信頼できるデータ
を与え続ける。

（以下余白） 焦点に集められたレーザービームに入り込んだ白血球は
光を全ての方向に散乱させる。光の波長は細胞の大きさ
と比較して小さいので、この散乱現象はミー理論（Ｈｉ
ｅ　ｔｈｅｏｒｙ）によって説明される。

散乱光の一部のみを４つの光検出器によって回収する。

２つのシリコン光検出器５４及び５Ｂはそれぞれレーザ
ービームに対して約１〜３度及び約３〜１゜度の半角で
散乱した光を測定する。これらの光検出器５４及び５６
をそれぞれ「０度」及び「１０度」検出器と称する。直
接レーザー光は観測棒５８によって遮蔽される。上記低
角度における光の散乱はある種の細胞サイズの複合関数
である。更にレーザービームに対して９０度で散乱した
光は、２つの光増倍管（ＰＨＴ）６０及び６２を使用し
て回収される。９０度チャネルにおいては、比較的小さ
い光が高角度で散乱されるので、光ダイオードではなく
てＰＭＴを使用する。一方のＰＨＴ　６２はその前方に
水平方向偏光器６１を備えている。これによって垂直方
向に偏光された光が光電陰極に衝突するのが回避され、
「９０度」偏光解消（ｄｅｐｏｌａｒｉｚｅｄ）ＰＭＴ
　６２によって検出された全ての光は、白血球との相互
作用によって偏光解消された光である。「９０度ＪＰ１
４Ｔと称される第２の光増倍管６０は、４５度傾けて設
置されているカバーガラスビームスプリッタ−６３で反
射された光を受容する。この光の大部分は依然として垂
直方向に偏光している。

対物レンズ６４と散乱ストップ６６とによって直交方向
散乱チャネルが完成する。更に低角度散乱チャネルは孔
あき鏡７０を包含する。

４つの光検出器から得られたデータは、第５図〜第８図
に示したサンプルを表わす一対の撒布図を作成するため
に使用される。

赤血球分析に対しては、ヘモグロビンをヘム−シアン化
物錯体に変換し、経路長１ｃ＋＊のフローセル内で５５
Ｏｎ−における吸光測定によって測定する。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３Ｇ００においては、全血（１２０
，１’開管、２Ｓｏ、ｌ閉管）を標本プローブによって
またはキャップ孔抜けによって３つの正確なアリコート
を分離する剪断弁（ｓｈｅａｒ　ｖａｌｖｅ）内に吸引
する。３つのアリコートを適当な希釈剤を用いて希釈し
、変換器に向かって移動させる０本発明では水溶液にお
ける組成が、ＮａＣ１７，９ｙ／１、にＣＩ　０．４ｇ
／ｌ、ＮａｔｌｚＰＯ＜０．２ｙ／１．ＮａＪＰＯ，１
，９ＦＩ／１．　ＮＪＩ２ＥＤＴＡ　０．３ｇ／ｆｌ、
ＮａＦ　０．４ｇ／ｌ、２−７工ノキシエタノール３ｍ
ｌ／１及び水残り１１となるまでの量である希釈剤を使
用する。この希釈剤はｐＨ７，４±０．０５及び浸透度
（ｏｓｍｏ−１ａ１ｉｔｙ）３４０±３ｍｏｈｓを有す
る。３２．＆のセグメントは、本発明の溶解剤を用いて
２５０倍に希釈され、白血球数及び白血球画分の測定の
ために光学変換器へと移送される。　１２．１のセグメ
ントは、剪断され、ヘモグロビン試薬を用いて２５０倍
に希釈され、ヘモグロビン変換器へと移送される。この
ヘモグロビン試薬は、第四級アンモニウム塩／ＫＣＮ溶
液と前記希釈剤との混合物である。最も良いＢ様におい
ては第四級アンモニウム塩溶液は、テトラデシルトリメ
チルアンモニウムプロミド９０ｇ／ｌ及びシアン化カリ
ウム０．７５ｇ／ｌを脱イオン水ｌｌ中に混合した溶液
からなる。次いで第四級アンモニウム塩溶液１Ｎを前記
希釈剤１１１と混合し、最後にＴｒ　ｉ　ｔｏｎＸ−１
１４を濃度０．２５ｍｊ！／ｌで加える。０．８−のセ
グメントは、赤血球希釈剤を用いて１２，５００に希釈
され、赤血球及び血小板を測定するなめにインピーダン
ス変換器へと移送される。

感知ゾーンを通過する粒子から得られる各パルスは増幅
され、内部基準電圧と比較される。このように、白血球
チャネルにおいては白血球が赤血球ストローマ及び血小
板と区別され、同様に、赤血球／血小板チャネルにおい
ては赤血球及び血小板が区別される。

赤血球の絶対数をカウントするためには、データ取得に
際して変換器を通過する希釈血液の容積が既知であらね
ばならない、赤血球／血小板チャネルにおいては、これ
は計量管を使用して得られる。各カウントサイクルの際
に、インピーダンス開口を通して細胞が引っ張られるの
で、流体は計量管を通って引っ張られる。試薬メニスカ
スが光学検出器を通過するとカウントサイクルが開始さ
れる。正確に２００μｌの希釈血液が変換器を通過した
後にメニスカスが第２の光学検出器を通過したならば、
カウントサイクルは停止される。カウント時間は、かか
る材料は有効開口を小さくし、カウント時間を増大する
が故に、オリフィス内の残渣を検出するために使用し得
る。この残渣はサイジングデータに悪影響を及ぼし得る
。

白血球チャネルにおいては、流体計量はシリンジポンプ
（ｓｙｒｉＢｅ　ｐｕｍｐ）を使用して行われる。白血
球チャネル内の最も狭い通路は比較的大きいので（サン
プルノズルの直径１６０ｐｌ、ヒユームドシリカフロー
セル２５０平方ＩＪｌ１１）、残渣の蓄積ははるかに起
こりにくい。

カウントの間に１つ以上の血球粒子が感知ゾーン内に同
時に存在し得る可能性がある。それを無視すると、この
同時共存は血球数を人為的に小さくする。同時共存は、
オリフィスの有効容積及び血球濃度に直接関係しており
、従って数学的に補正することができる。これは、白血
球、赤血球及び血小板の数の各々に対して自動的に実施
される。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００は、各測定サイクル後に自
動的に全ての数値データ及びグラフィックデータを表示
する。標本測定は、実行モードを選択することにより実
施される。標本は５つのタイプ、即ち患者、低コントロ
ール、正常コントロール、高コントロール及び反復実験
のうちのいずれか１つとして同定され得る。キーボード
を介して操作員ＩＤ、日付け、時間等を入力することが
できる。表示データはグラフィックプリンターによって
折り畳み用紙（８，５″×１１″）上に、またはページ
ごとに一枚の報告書に印刷することができる。更に光学
式チケットプリンターによって複写チケットレポートを
印刷することもできる。

現在のｔ、ｏｏｏサイクルに対する数値データはＰＣハ
ードディスク上に自動的に記憶される。このデータログ
は所望により再度見ることもできるし印刷することもで
きる。各データファイルは連続番号、標本タイプ、使用
するのであれば標本１０番号、選択された全てのパラメ
ータに対する数値データ、日付け、時間及び操作員ＩＤ
を含む。

セットアツプモードを使用して、使用者は任意の数値デ
ータに対して制限を設けることができる。

かかる制限の外にある全てのデータはビデオスクリーン
上に反転表示され、また太字で印刷される。

血小板に対する度数分布データまたは白血球に対する撒
布図データが所定の基準を満足しない場合には、各関連
領域を領域警告を用いて知らせる。

各測定サイクルの終了時には、結果がモニター上に表示
される。白血球からの光散乱データは−対の撒布図とし
て表示される。絶対白血球数は全血１μ！当なりの量を
１０００を単位として表示される。

赤血球データは、横座標の目盛りがＩＱ−１５リツトル
で表された容積頻度分布ヒストグラムとして表示される
。絶対赤血球数は全血１ｕ１当たりの量を百方を単位と
して表示される。血小板データは、横座標の目盛りが１
０柑５リツトルで表された容積頻度分布ピストグラムと
して表示される。絶対血小板数は全血１μｒ当たりの量
を１０００を単位として表示される。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００はヘモグロビンをヘモ−シ
アン化物錯体として測定する。ヘモグロビン試薬は、カ
チオン性洗剤及びシアン化カリウムのアルカリ性溶液で
ある。この洗剤は赤血球を溶解してヘモグロビンを遊離
させる。　ｐＨが高いとヘモグロビンはヘモ発色団を遊
離し、このヘモ発色団は、存在するシアン化物と反応し
て安定な錯体を形成する。

これは、試薬ブランクに対する５４０ｎ−における吸光
により測定される。ヘモグロビンの結果は、全血におけ
るその濃度について報告される。使用者は、ｇ／ｄｉ、
　ＩＩ／ｌまなはｍｓ＋ｏｌ／ｉ’の任意の単位を選択
することができる。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００は、赤血球のサイズ分布が
ち平均血球容積（ＨＣＶ）を決定する。この結果はＩＱ
−１５リツトルで直接報告される。ヘマトクリット（Ｈ
ＣＴ）は赤血球数及びＭＣＶから式： ％式％） によって計算される。この結果はパーセント包含赤血球
として、または全血１容積当たりに含まれる赤血球の割
合：Ｌ／Ｌとして報告される。

赤血球分布幅（ＲＤＷ）は、赤血球容積分布から決定さ
れる。これは単に、ピークのｃｖをパーセントで表わし
たものである（ｃｖ＝（ｓｄ／平均値）ｘｌｏｏ）。

このパラメーターは赤血球異性の指数である。

ＲＤ−は、血液塗抹に見られる異方性サイト−シス（ａ
ｎｉｓｏｃｙＬｏｓｉｓ）の程度とともに増加する。診
断に有効な情報はＭＣＶ及びＲＤ−の両方を検討するこ
とにより得ることができる。

５部の白血球画分は、単に光散乱をベースとして測定さ
れる。細胞化学的染色は必要ないので、ＣＥＬＬ−ＤＹ
Ｎ　３０００はかなり高いスループットを与える（１時
間当たり１０９の割合でＣＢＣ／ＰＬＴ／ＷＢＣ画分を
与える）０本発明の溶解試薬は赤血球を即座に溶解する
が、関係する測定時間内で白血球の光散乱特性に影響す
ることはない。各白血球の散乱特性についてのデータは
４つの光検出器から得られる。

「０度」検出器は、レーザービームに対して約１〜３度
の半角で散乱した光を回収し、「１０度」検出器は３〜
１０度の半角で散乱した光を回収する。このような低い
角度での散乱は細胞容積の関数である。

レーザービームと直角をなすような高角度での散乱は、
その血球における構造の全量、即ち「構造化されたもの
（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｎｅｓｓ）　Ｊの関数である。

他のものは全て等しいのであれば、細胞の高角度の散乱
は、例えば核の小裂片が増加するとともに、または細胞
質粒状化が増大するとともに増大する。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００は、「９０度」散乱及びｒ
９０度偏光解消」光散乱を回収するために２つの光増倍
管を使用する。本発明者らの用途においては、少なくと
も、この偏光解消信号は、白血球内の多重散乱現象から
生じる。それは、人為的な交差偏光解消（ｃｒｏｓｓｄ
ｅｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）または自己蛍光発光（ａ
ｕｔ。

ｒ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ではない。

これら新規のパラメーター、即ち平均血小板容積（ＭＰ
Ｖ）、血小板分布幅〔ＰＤＷ）及び血小板限界値（ＰＣ
Ｔ）の臨床上の有効性は未だ確証されていない。

公開された知見に間しても議論がなされている。

現在米国においてはＦＤ＾規制によって、臨床上の使用
が確証されるまでこれらのパラメーターの報告が禁止さ
れている。それ以外のところではこれらの結果は必要に
より報告することができる。

ＭＰＶデータが必要であれば、標本は、ＭＰＶが安定す
る採取接受なくとも１時間であることが強く推奨される
。−最にＥＤＴＡ中に採取した後、最初の約１時間でＭ
ＰＶは増大する。

ＣＥＬＬ−ＤＹＮ　３０００は対数正規曲線が所定の一
組の点を通るように調整されている血小板のヒストグラ
ムからＭＰＶを計算する。このパラメーターを直接ｉｏ
−”ｌで表す。ＰＣＴを血小板総数から計算すると、Ｍ
Ｐｖは以下の式： ％式％） で表される。結果をパーセント又はｌ１１１／１で表す
。

ＰＤＷＪま血小板の寸法分布の幾何学的標準偏差（ｓ、
ｄ、）である、　ＰＤＷを血小板のヒストグラムのデー
タから引き出して、１０（ｇ、ｓ、ｄ）として表す。

これらの赤血球指数は赤血球の形態を有効に指示するも
のであり、また貧血の分類に役立つ、更には、特定標本
用又は標本採取用指数データは非常に安定しており、た
とえ各計算に使用する値が相当変化し得たとしても、長
期間にわたってそれほど変化するはずがない、この安定
性のために、赤血球指数を品質調整機器の性能に使用し
得る。

Ｂｕｌｌの移動（ｍｏｖｉｎｇ）平均ＱＣプログラムは
この原理を使用している。

平均細胞ヘモグロビン（ＭＣＩ）及び平均細胞ヘモグロ
ビン濃度（ＭＣＨＣ）は適切な時はいつでも測定される
パラメーターである。以下の式： ％式％） ） が適用される０ＭＣｌをＩＱ−１２ｇ又は１０−　”モ
ルで表す。

ＭＣＨＣはｇ／ｌ、ｇ／ｄ１又はＩＩＩＭ／ｌで表す。

火１月ユ 本明細書に記載の溶菌剤と混合した後の正常な供血者の
全血のレーザー光散乱特性を示す点図衣を第５図に示す
。

ｙ軸：　０°の散乱 Ｘ軸：１０ａの散乱 ｙ軸：９０°の散乱 Ｘ軸：９０゛の偏光解消された（ｄｅｐｏｌａｒｉｓｅ
ｄ）散乱 血ｊ４！８腓干（分 １＝リンパ球、２＝好基塩基、３＝単球、４＝好中球及
び好酸球、５＝好中球、６＝好酸球。

え隨１ 多量の単球及び好酸球を含んでいたためにこの患者試料
を選択した。以前はリンパ球と単球とを分離して数える
ことが困難だったために、これらの試料は容易に５つの
部分に分けられなかった。

第６図の区域５．６は実施例１の第５図の場合と同一の
軸情報を使用して、それぞれ好中球と好酸球とのカウン
トを示している。

Ｋ１月ユ 多量の単球及び好酸球を含んでいたためにまたこの患者
試料を選択した。第７図の区域５．６は実施例１の第５
図の場合と同一の軸情報を使用して、それぞれ好中球と
好酸球とのカウントを示している。

犬ＪＪＬま 多量の単球及び好酸球を含んでいたためにまたこの患者
試料を選択した。第８図の区域５，６は実施例１の第５
図の場合と同一の軸情報を使用して、それぞれ好中球と
好酸球とのカウントを示している。

本発明を説明するためにある代表的な実施例及び詳細を
示しているが、特許請求の範囲で定義された如き発明の
範囲を逸脱することなく本発明に種々の変更及び改良を
加えることができる。

６・　　　　−一タ 標本識別番号： タイプ：ファイル３ 開放試料モード（Ｏｐｅｎ ＲＢＣ：　　　　６．４に／ｕｌ し ＬＹＮ：　　　　０．８１３．０％ｆ ＮＥＵ：　　　　４．９７５．７％Ｎ ＥＯＳ： ＢＡＳＯ： ＲＢＣ： ＨＧＢ： ＨＣＴ： ＮＣＶ： ＮＣ）ｌ・ ＭＣｌＩＣ： ＲＤＷ： ｐｔ丁： ＭＰＶ： Ｓａｍｐｌｅ　　Ｍｏｄｅ） 未熟顆粒子ｆ　：　　　　　　　０．１不完全溶解％：
４，８ １０Ｄパラメーターでの粒状ＣＶ （Ｇｒａｎ　ＣＶ　ｉｎ　１００　ｐａｒｓ）＋　１２
．ＩＲＢＣ上方メニスカス時間 （ＲＢＣｕｐｒ　　ｍｅｎｉｓ　　ｔｉｓ＋ｅ）：　　
　３８８５０．２２．４％Ｅ　　　ＲＢＣカウント時間
：　　　　７０８５Ｍ０ＮＯ：　　　　ｏ、ｅ　８．６
％Ｎ０．００．４％Ｂ ５．２１　　Ｈａｕｌ １５．５ｇ／ｄＮ ５０．６％ ９７、Ｈｚ ２９．７ｐｇ ３０、Ｂｇ／ｄ１ １２．９％ ２５０、に／ｕｆ １ ６．９ ＰＣＴ： ％ ＰＤＷ： １０（に５ｏｌ） １見１ 第６図ａ に−１０Ｉ） ｙ−０［１ 第６図ｂ　　ｘ−ＰＬＴ ｙ−数 ７パ　　　　−一タ 標本識別番号＝７１２フ タイブ：患者 開放試料モード ０．１７ １６．９ 第６図ｃ　　ｘ−９００ ｙ−９０ＤＥＰ 第６図ｄ　　ｘ−ＲＢＣ ｙ−数 未熟顆粒球＝０．１ 不完全溶解％：２．１ １００パラメーターでの粒状（：Ｂ：１２．３ＲＢＣ上
方メニス力ス時間：３９７Ｏ ＲＢＣカウント時間：　　　　　　７０８０綬ＢＣ： ＬＹＭ： ＮＥＯ： ＭＯＮＯ： ＥＯＳ＋ ＢＡＳＯ： ８．３Ｋｊｕｌ ０．７　　８゜３％す ６．５　　　　７７．５％Ｎ ｏ、ｓ　　　　　ｔｏ、ｔ％Ｈ Ｏ，３３，５％Ｅ Ｏ，１０，５％Ｂ ＲＢＣ： １１ＧＢ　： ＨＣＴ： ＭＣＶ： ＭＣＩＩ： ＭＣｌＩＣ： ＲＤ１４： ＰＬＴ： ＭＰＶ： ＰＣＴ： ＰＤＮ： 座」１軸 ４．１２Ｍ／ｕＩ Ｈ，７ｇ７ｄ１ ３８．６％ ９３．７ｆ１ ２Ｂ、５ｐｇ ３０．４ｇ７ｄ１ １６．０％ １１６に／ｕ／ １ ％ １０（ＧＳＤ）　　　１８．９ ０．０８ ７．２ 第６図ａ 第６図Ｃ −１００ −００ −９００ ｙ−９０ＤＥＰ 第６図す 第６図ｄ −ＰＬＴ ｙ−数 −ＲＢＣ ｙ−数 ＋　８　　用　　Ｗ−一タ 標本識別番号二 タイプ：ファイル１ 開放試料モード 未熟顆粒球： 不完全溶解％： １００パラメーターでの粒状Ｃｖ。

ＲＢＣ上方メニスカス時間： ＲＢＣカウント時間： ０．０ １．２ １１．７ ９０５ ０７０ １１Ｂｃ ＬＹＭ： ＮＥＯ： ８ＯＮＯ： ＥＯＳ： ＢＡＳＯ： ＲＢＣ： １１ＧＢ： １１ｃＴ： ＭＣＶ： ＭＣＨ： ＭＣＨＣ・ ７．４に／ｕｌ Ｏ，５６，８％し ５．９　　　７９．５％Ｎ Ｏ，７９，８％Ｈ Ｏ，３３，５％ε ０．０　　　０．６％Ｂ ５．１４Ｈ／ｕ１ １３．８ｇ／ｄ１ ４６．１％ ８９．６ｆｔ！ ２６．９ｐ。

３０．０ｇ／ｄｉ ＲＤＷ：　　　　　　１５．７％ ＰＬＴ：　　　　　３９４に／ｕｌ ＨＰＶ：　　　　　　ｆ／　　　　　　　　７．２ＰＣ
Ｔ：　　　　　％　　　　　　０．２８ＰＤ賀：　　　
　　１０（ＧＳＤ）　　　１６．７座」Ｌ軸 第６図ａ　　ｘ−１００第６図ｃ　　ｘ−９００ｙ−Ｑ
ｌ）　　　　　　　　　　　ｙ−９０ＤＥＰ第６図ｂ　
　Ｘ−ＰＬＴ　　　第６図ｄ　　ｘ−ＲＢＣｙ−数　　
　　　　　　　ｙ−数

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実践する自動血液学機器Ｃｅ１ｌＤｙ
ｎ　３０００の斜視図、第２図はインピーダンス細胞の
カウント及び寸法測定の原理を示す概略図、第３図はＣ
ｅ１ｌ−Ｄｙｎ　３０００機器の光学変換器の概略血試
料用白血球点図表、第８図は実施例３に記載の全血試料
用白血球点図衣である。 ２８、、、ノズル、３４．　、　、フローセル、４０．
、、光源、５２、、、中央コア、５４．５６・・・光検
出器、５８・・・観測棒、６０．６２・・・光増倍管、
６３・・・ビームスプリッタ−６４・・・対物レンズ、
６６・・・散乱ストップ、７０・・・孔あき鏡。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａ）芳香族オキシエタノールと、 ｂ）８．５又はその近傍のｐＫを有する有機緩衝剤と、 ｃ）非イオン界面活性剤との水溶液から成る溶解剤。 （２）芳香族オキシエタノールが２−フェノキシエタノ
   ールであることを特徴とする請求項１に記載の溶解剤。 （３）有機緩衝剤がＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ホウ酸、グリシ
   ル／グリシン及びＢＩＣＩＮＥから構成される群から選
   択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の溶解
   剤。 （４）非イオン界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
   、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４、ポリオキシエチレン又は
   糖から誘導される界面活性剤から構成される群から選択
   されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項
   に記載の溶解剤。 （５）２−フェノキシエタノール、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩
   衝剤及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の水溶液から成る溶
   解剤。 （６）２−フェノキシエタノールの濃度が２０ｍＭ〜８
   ０ｍＭであることを特徴とする請求項５に記載の溶解剤
   。 （７）流動血球計算方法における請求項１から６のいず
   れか一項に記載の溶解剤の使用。（８）全血サンプルか
   らの白血球サブ集団の５部分分別定量方法であって、 ａ）赤血球及び白血球を含有する全血サンプルを希釈剤
   と接触させる段階と、 ｂ）１）芳香族オキシエタノールと、 ２）８．５又はその近傍のｐＫを有する有機緩衝剤と、 ３）非イオン界面活性剤成分とを含有する流動血球計算
   用溶解剤を、前記の希釈した全血サンプルに加えること
   により、赤血球を溶解させると共に白血球を被包する段
   階と、 ｃ）溶解した赤血球及び被包した白血球に集束レーザビ
   ームを交差させる段階と、 ｄ）交差から得られる光散乱を測定する段階と、 ｅ）測定した光散乱パラメータを解析し、好中球、リン
   パ球、単球、好酸球及び好塩基球の５つのサブ集団の分
   別計数を得る段階とを含む方法。 （９）該芳香族オキシエタノールが２−フェノキシエタ
   ノールであることを特徴とする請求項８に記載の方法。 （１０）該有機緩衝剤がＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ホウ酸、グ
   リシル／グリシン及びＢＩＣＩＮＥから構成される群か
   ら選択されることを特徴とする請求項８又は９に記載の
   方法。 （１１）該非イオン界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
   ００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４、ポリオキシエチレン
   又は糖から誘導される界面活性剤から構成される群から
   選択されることを特徴とする請求項８から１０のいずれ
   か一項に記載の方法。 （１２）該流動血球計算用溶解剤が本質的に、２−フェ
   ノキシエタノール、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝剤及びＴｒｉ
   ｔｏｎ　Ｘ−１００の水溶液から構成されることを特徴
   とする請求項８に記載の方法。 （１３）該２−フェノキシエタノールの濃度が２０ｍＭ
   〜８０ｍＭであることを特徴とする請求項１２に記載の
   方法。 （１４）白血球保護剤としての２−フェノキシエタノー
   ルの使用。 （１５）溶解剤としての芳香族オキシエタノールの使用
   。 （１６）芳香族オキシエタノールが２−フェノキシエタ
   ノールであることを特徴とする請求項１５に記載の使用
   。