JPH0726956B2

JPH0726956B2 - 溶解剤及びその使用

Info

Publication number: JPH0726956B2
Application number: JP2125266A
Authority: JP
Inventors: ポール・エヌ・マーシヤル
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1989-05-15
Filing date: 1990-05-15
Publication date: 1995-03-29
Anticipated expiration: 2010-03-29
Also published as: EP0398652B1; AU5503790A; DE69011198D1; CA2016699C; ES2060949T3; DE69011198T2; ATE109568T1; EP0398652A1; US5510267A; CA2016699A1; JPH034171A; AU636607B2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は一般には赤血球及び白血球集団の流動血球計算
測定に有用な試薬及び方法、より特定的には、赤血球を
溶解させ、白血球を被包（sheath）すると同時に抗菌剤
として機能する芳香族オキシエタノールを含有してお
り、自動化装置で白血球の５つのサブ集団を分別できる
ような溶解剤（lytic agent）の使用に係る。

末梢血液の検査は個体の健康状態を調べるのに重要な側
面である。この検査の重要な１パラメータは白血球の分
別算定（differential white cell count）である。こ
の試験は現在３種類の方法のうちの１種で実施される。
最も一般的な方法によると、血液スミアを作成し、その
後、ロマノフスキー法によりスミアを染色する。この染
色は全血の種々の構成成分を色別する。技術者は染色し
た血液スミアの顕微鏡検査により種々の白血球類（典型
的には好中球、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球）
を計数することができる。この手作業による分別は非常
に労働集約的であるので、自動化された血液サンプルの
検査方法を得るために実質的な研究及び開発への努力が
払われている。

最近、自動化顕微鏡を用いて自動的に複数のサブ集団の
白血球分別分析が得られるようになった。これらの自動
化顕微鏡の例としては、Geometric Data社（Wayne,Penn
sylvania）の製品であるHematrak系や、Coulter Biomed
ical社（Concord,Massachusetts）の製品であるDiff350
及び400がある。これらの装置にRomanowsky染色した血
液スミアを配置し、イメージ分析コンピュータを使用す
ると、これらの装置は技術者が人為的に行うと同様の視
覚的分類基準を使用して白血球の位置を決定し、分類す
る。これらの基準は典型的には核及び細胞質光学密度、
色、形状並びに組織を含む。

別の自動化白血球分別のアプローチは流動血球計算（fl
ow cytometry）を使用する。この方法によると、懸濁液
中の血球をトランスデューサに通し、光吸収、光散乱又
は電気インピーダンスのような数個の測定可能なパラメ
ータに基づいて血球を分類する。これらの流動血球計算
システムは、サンプル処理量が比較的高く、サンプル当
たりに計数できる血球数が多く、従って、サンプリング
ノイズが減少するという点において、顕微鏡に基づくシ
ステムよりも有利である。従来、市販の臨床血球計算装
置は３種類の白血球サブ集団の分別に限定されている。
白血球は顆粒球、単球及びリンパ球と呼称されるサブ集
団に分類される。既存の３部分分別装置は光散乱又は電
気インピーダンスの測定に基づく。Ortho Instruments
社（Westwood,Massachusetts）のELT1500のような光散
乱装置は、典型的には「低い」及び「直角」と呼称され
る２つの異なる角度で測定した光散乱特徴に基づいて白
血球サブ集団を分類する。Coulter Eoectronics社（Hia
leah,Florida）のＳ＋系及びSequoia−Turner社（Mount
ain View,California）のような電気インピーダンス装
置は、容量修正試薬への暴露後の容量に基づいて白血球
を分類する。

最近まで５つのサブ集団の白血球分別を得ることが可能
な唯一の市販の臨床流動血球計算装置はTechnicon Inst
ruments社（Tarrytown,New York）のＨ−6000及びＨ＊
１であった。これらの装置は血球の精巧な細胞化学的染
色後に光散乱及び吸収を測定することにより白血球を分
類する。この染色方法は比較的遅いので、これらの装置
の処理量は限られている。

Sequoia−Turner社（Mountain View,California）のCel
l−Dyn3000は、染色しない白血球の光散乱特徴のみに基
づいて従来の５つのサブ集団の分別を行う。元々時間の
かかる細胞化学的染色を使用しないので、この装置のサ
ンプル処理量は極めて高度に維持される。Cell−Dyn300
0により実現された改良の大部分は、脱偏光（depolariz
ed）直角光散乱の測定と本発明の溶解剤という２つの新
技術の結果であり、リンパ球と単球の良好な分解により
５つのサブ集団の白血球分別分析が得られる。

流動血球計算を使用する市販の自動装置では、白血球分
類及び分別は光散乱又は電気インピーダンスと血球寸法
の相関により得られる。どちらの型の装置でも、全血サ
ンプル中の赤血球を溶解させてヘモグロビンを放出させ
なければならない。電気インピーダンス測定に基づくシ
ステムでは、第４アンモニウム塩をベースとする溶解剤
が使用されている。これらの電気インピーダンスシステ
ムは白血球の溶解剤の溶解効果を実質的に無効にするよ
うな相当の応答時間を有する。光散乱測定に基づくシス
テムでは、赤血球溶解剤が白血球の光散乱特徴に及ぼす
悪影響は更に深刻であり、設計面に過重の要求が課され
る。溶解剤は赤血球を迅速に溶解させながら、同時に白
血球散乱特徴が本質的に乱されないような窓を提供しな
ければならない。

赤血球及び白血球の溶解範囲はpHと共に増加するので、
これらの基準は典型的にはアルカリ性のpHを有する溶解
剤を使用することにより見たされる。広く使用されてい
る塩化アンモニウム／重炭酸カルシウム／ジNaEDTA溶解
溶液は7.2〜7.4のpHを有するが、典型的には赤血球を完
全に溶解させるのに５〜10分を要する。Ortho Instrume
nts社の“Lyse Right"のような溶解剤は8.5のpHを有し
ており、数秒で赤血球を完全に溶解させることができる
が、１分間程度の間に白血球の光散乱特徴に悪影響を与
える。pHを8.5よりも著しく高くするか、又は約３より
も低くすると、赤血球と白血球とをほぼ瞬時に溶解させ
るような溶解剤が得られる。

従って、本発明の目的は、サブ集団分別を得るために十
分な時間の間、白血球の光散乱特徴を維持しながら赤血
球を十分に溶解させる溶解剤を提供することである。

本発明の別の目的は、好中球、リンパ球、単球、好酸球
及び好塩基球として同定される５つの白血球サブ集団を
流動血球計算光散乱システムで計数することが可能な溶
解剤を提供することである。

本発明の別の目的は、市販用として許容可能な貯蔵寿命
を有する溶解剤を提供することである。

本発明の以上及びその他の目的は本明細書の記載及び添
付図面を参考にすることにより当業者に理解されよう。

即ち、本発明によると、芳香族オキシエタノールと、8.
5又はその近傍のpKを有する有機緩衝剤と、非イオン界
面活性剤（non−ionic detergent）との水溶液から成る
流動血球計算用溶解剤が提供される。

本発明の流動血球計算用溶解剤は、白血球を好中球、リ
ンパ球、単球、好酸球及び好塩基球として同定されるサ
ブ集団に分けて５部分分別計数を実現することができ
る。溶解剤は芳香族オキシエタノールと、pH緩衝能力を
提供し勝つ溶解剤の導電率を増加するように機能する8.
5又はその近傍のpKを有する有機緩衝剤と、非イオン界
面活性剤成分とから構成される。芳香族オキシエタノー
ルは好ましくは２−フェノキシエタノールである。有機
緩衝剤はTRIS/HCl、ホウ酸、グリシル／グリシン及びBI
CINEから構成される群から選択される。非イオン界面活
性剤はTriton X−100、Triton X−114、ポリオキシエチ
レン又は糖から誘導される界面活性剤から構成される群
から選択される。好適な溶解剤は本質的に、20mM〜80mM
の濃度の２−フェノキシエタノール、TRIS/HCl緩衝剤及
びTriton X−100から構成される。

本発明の方法は上記溶解剤を希釈した全血サンプルと組
み合わせるものである。希釈した全血サンプルに溶解剤
を加えた後、赤血球及び白血球に集束レーザービームを
交差（intersect）させる。次に、０゜、10゜、90゜及
び脱偏光した90゜で４つの光散乱パラメータを測定す
る。測定したこれらのパラメータをその後、解析し、好
中球、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球の５サブ集
団分別計数を得る。

本発明の溶解剤は、好ましい実施態様では、Triton X−
100と２−フェノキシエタノールとTRIS/HClバッファと
の水溶液を含む。この溶解剤を全血と混合するのである
が、溶解剤の量は全血より過剰にし、通常は50倍にす
る。赤血球の溶解は、浸透ショックと非イオン系界面活
性剤の作用と約8.5のpHとの組合わせによって瞬時に生
じる。この溶解剤中の２−フェノキシエタノールは２つ
の機能を有する。第１はリンパ球の溶解を遅延させる白
血球保護試薬としての機能であり、溶解剤によって白血
球の光学的特製に実質的な悪影響が与えられる前に亜集
団を検出できるようにする。２−フェノキシエタノール
は第２に、より一般的な機能として殺菌薬の役割を果た
し、当該試薬が調製後少なくとも１年間は細菌によって
汚染されないようにする。TRIS/HClは生化学溶液で一般
的に使用されるバッファであり、pH緩衝能力を与える他
に、溶液の導電率を増加させて、器具の試薬リザーバ内
の該溶液の存在が一対の電極の使用によって容易に検出
され得るようにする。Triton X−100は湿潤剤として機
能し、Cell−Dyn3000管及び光変換器内での気泡の停滞
（hang up）を低下させる。

本発明の溶解剤の最適組成は下記の通りである。

２−フェノキシエタノール（25℃で液体） ……750ml TRIS/HClバッファ、pH8.5（1M HClでpH8.5に滴定した50
0mM TRIS） ……1500ml 0.5％（vol/vol）水性Triton X−100 ……100ml 脱イオン水 ……100に対する残りこの最適組成では２−フェノキシエタノールが約41mMの
濃度で存在するが、有用濃度範囲は20〜80mMである。TR
ISバッファのpHは、性能に余り影響を与えずにpH8.1ま
で低下させ得る。pH9.0を超えると白血球の部分的破壊
が生じ得る。約５％（vol/vol）以下の少量のTriton X
−100又は類似の非イオン系界面活性剤を含ませると、
一般に溶解が難しいと見なされている種の不適当な溶解
によって生じる問題が回避される。前述のごとき種とし
ては、血色素病患者及び赤血球数の多い被験者からの血
液試料が挙げられる。

TRIS/HClに代えて別の有機バッファを使用することもで
きる。pKが8.5又はほぼ8.5のバッファの中では、ホウ
酸、グリシル／グリシン及びBICINE（CalBiochem社から
市販）が本発明で使用できる。本発明の溶解剤の非イオ
ン系界面活性剤成分としてはTriton X−114を使用し得
る。ポリオキシエチレン又はサッカリドヘッド基を有す
るものから別の親水性界面活性剤を選択してもよい。

前記最適組成を使用すると、白血球をその光散乱特性に
基づいて示差的に５つの部分に分解できる。Cell−Dyn3
000は、各白血球が収束レーザビームと交差した時点で
４つの光散乱パラメータを測定する。これらのパラメー
タは下記の通りである。

（１）「０゜光散乱」：レーザビームに対して約１〜３
゜で実際に光散乱した場合。

（２）「10゜光散乱」：レーザビームに対して約３〜10
゜で実際に光散乱した場合。

（３）「90゜光散乱」：レーザビームに対して直角に光
散乱した場合。

（４）「90゜偏光解消（depolarized）光散乱」：白血
球との交差によってもはや垂直には偏光しないレーザビ
ームに対して直角に光散乱した場合。

２−フェノキシエタノールは、殺菌薬としての一般的な
機能を果たすと共に、白血球保護剤としても効果的であ
ることが判明した。また、２−フェノキシエタノールを
使用すると、流動細胞計測光散乱法によってリンパ球及
び単球が以前より遥かに良く分解された。実際、２フェ
ノキシエタノールを用いると、低角且つ直角の光散乱に
基づいて４つの部分への示差的分解、即ちリンパ球、好
塩基性球、単球、好中球及び好酸球への分解が簡単に得
られる。以前は、これら２つのパラメータを用いて白血
球を３つの部分にしか分解できなかった。この現象はOr
tho Diagnostic Systems Inc.製造の或る種の器具、例
えばELT1500に見られる。

２−フェノキシエタノールを水に溶解しただけの簡単な
水溶液も効果的な溶解剤ではあるが、器具のリザーバー
内の溶解試薬の存在を電気的に検出する場合には、この
試薬の電気伝導率では低すぎる。そこで、我々は溶解剤
にTRIS/HClバッファを混入して溶解試薬溶液の導電率を
増加させ、且つpHを安定させるようにした。部分的白血
球溶解に起因する問題を最少限に抑えるべく、我々は少
量の非イオン系バッファTriton X−100も組成物中に混
入した。この化学物質は試薬ライン（reagent line）内
の溶解剤の湿潤性を高める機能も有する。

Cell−Dyn3000の器具10（第１図）では一対の変換器を
細胞測定に使用する。白血球は光散乱によって測定され
る。このチャンネルでは、流体測定がシリンジポンプを
介して行われる。赤血球及び血小板は夫々の電子インピ
ーダンスによって測定される。このチャンネルでは容積
測定管が使用される。

Cell−Dyn3000の操作はシステムの状態、記憶データ、Q
C実行プログラム、フラグ異常データをモニターし且つ
診断チェックを行う３つのマイクロプロセッサーによっ
て制御される。

使用者はスクリーンの12のレベルを用いて８つのモード
のうち任意のものを選択できる。メンブランキーボード
又はフルPCキーボードを用いればどのモードでも得られ
る。主要操作モードは下記の通りである。

SETUP システム操作のセットアップ又は訂正。

RUN 種及び対照の追跡。

DATA LOG 記憶データのレビュー又は印字。

QC 制御中のデータのレビューもしくは印字、又はファ
イルの複写。

CALIBRATION ユーザー較正のレビュー又は実行。

DIAGNOSTICS 障害解決のためにシステムのチェックを
行う。

HELP 器具の操作でユーザーの手助けをする。

SPECIAL PROTOCOLS 試料バルブの洗浄又は試料ライン
のプライミングのような特別の手続きを実行する。

運搬を容易にすべく、Cell−Dyn3000は２つのモジュー
ルに分割される。主モジュール14は混合チャンバ、バル
ブ、ポンプ、ヘモグロビンフローセル及びインピーダン
ス変換器がいずれも器具10の正面から簡単にアクセスで
きるように構成されている。器具の裏側には２つのマイ
クロプロセッサーが内臓されている。上方コンパートメ
ントにはレンズ、レーザー、光検出器及び融解石英フロ
ーセルを載置した光学ベンチが収容されている。これに
ついては第４図を参照されたい。第２モジュール16はビ
デオモニター、PC及びキーボードを収容している。

Cell−Dyn3000は血球及びヘモグロビン濃度のデータを
集めるのに３つの変換器を使用する。これらの変換器は
インピーダンス変換器、光変換器及びヘモグロビン変換
器と称される。

Cell−Dyn3000は赤血球及び血小板の計数にインピーダ
ンス変換器を使用する。第２図はインピーダンス細胞の
計数及びサイズ測定の原理を示している。この原理は、
粒子18が細孔20を通る時に生じる電気抵抗率の変化の測
定を基本とする。各細胞が孔20を矢印21の芳香に通過す
ると、孔20を挟んで位置する水面下の電極22及び24（こ
こでは電極22が負に帯電され、電極24が正に帯電され
る）の間の通路の電気抵抗率が増加する。パルスの数は
細胞の計数を表し、パルスの振幅は細胞の大きさに関係
する。パルス振幅の度数分布は体積ヒストグラムを構成
する。これらのヒストグラムは赤血球及び血小板のパラ
メータ、例えばMCV（平均細胞体積）及びRDW（赤血球分
布幅）を得るのに使用される。

Cell−Dyn3000のインピーダンス孔20は直径が60μｍ、
長さが70μｍである。

Cell−Dyn3000は白血球の光散乱特性の測定に光変換器
を使用する。この変換器26は第３図に簡単に示されてい
る。赤血球が溶解された状態で含まれている血液懸濁液
を試料ノズル28（直径約160ミクロン）から低速度で送
出すると、この懸濁液が高速層流状シース（sheath）流
30と接触する。流体力学的収束（hydrodynamic focusin
g）として知られている方法では、試料の流れが次第に
細くなって中央コア32の状態になる。このコアは融解石
英フローセル内で25〜30μｍの直径を有する。このよう
な構造にすると、通常はいつでも単一の白血球が検出領
域内に存在することになり、従ってコインシデンスの問
題が最少限に抑えられる。また、物理的な孔が大きい
（250平方μｍ）ため、フローセル34の詰まりが生じに
くく、しかも遥かに小さい変換器で解析できる。

白血球測定プロセスの機能が良く理解されるように、こ
こでCell−Dyn3000光学ベンチを簡単に説明する。第４
図にCell−Dyn3000光学ベンチの簡単な説明図を示し
た。尚、本明細書は、本出願人の同時係属米国特許出願
第07/327,416号明細書“Particle Discriminator and M
ethod"を参考として包含する。光源40は波長632.8nmの
偏光5mWヘリウム−ネオンレーザーである。このレーザ
ーのヘッドは偏光面が垂直になるように配向される。レ
ーザービームは前面鏡42、円筒レンズ44、前面鏡46、垂
直スリット48（幅125ミクロン）及びレーザー収束レン
ズ50によって整形及び収束され、その結果試料流の中央
コア52領域（250平方ミクロンのチャンネルを有する融
解石英フローセル）内では、ビームの垂直面上の強度プ
ロフィルが（“one overe squared"）約70μｍの直径で
ガウスの定理を満足することになる。このプロフィルは
水平面では、偏平上部が約80μｍの「トップハット（to
p hat）」の様相を示す。このような構造にすると、試
料コアが正常位置から少しずれても、器具は信頼できる
データを与え続ける。

焦点に集められたレーザービームに入り込んだ白血球は
光を全ての方向に散乱させる。光の波長は細胞の大きさ
と比較して小さいので、この散乱現象はミー理論（Mie
theory）によって説明される。散乱光の一部のみを４つ
の光検出器によって回収する。２つのシリコン光検出器
54及び56はそれぞれレーザービームに対して約１〜３度
及び約３〜10度の半角で散乱した光を測定する。これら
の光検出器54及び56をそれぞれ「０度」及び「10度」検
出器と称する。直接レーザー光は観測棒58によって遮蔽
される。上記低角度における光の散乱はある種の細胞サ
イズの複合関数である。更にレーザービームに対して90
度で散乱した光は、２つの光増倍管（PMT）60及び62を
使用して回収される。90度チャネルにおいては、比較的
小さい光が高角度で散乱されるので、光ダイオードでは
なくてPMTを使用する。一方のPMT62はその前方に水平方
向偏光器61を備えている。これによって垂直方向に偏光
された光が光電陰極に衝突するのが回避され、「90度」
偏光解消（depolarized）PMT62によって検出された全て
の光は、白血球との相互作用によって偏光解消された光
である。「90度」PMTと称される第２の光増倍管60は、4
5度傾けて設置されているカバーガラスビームスプリッ
ター63で反射された光を受容する。この光の大部分は依
然として垂直方向に偏光している。

対物レンズ64と散乱ストップ66とによって直交方向散乱
チャネルが完成する。更に低角度散乱チャネルは孔あき
鏡70を包含する。

４つの光検出器から得られたデータは、第５図〜第８図
に示したサンプルを表わす一対の撤布図を作成するため
に使用される。

赤血球分析に対しては、ヘモグロビンをヘム−シアン化
物錯体に変換し、経路長1cmのフローセル内で550nmにお
ける吸光測定によって測定する。

CELL−DYN3000においては、全血（120μ開管、250μ
閉管）を標本プローブによってまたはキャップ孔抜け
によって３つの正確なアリコートを分離する剪断弁（sh
ear valve）内に吸引する。３つのアリコートを適当な
希釈剤を用いて希釈し、変換器に向かって移動させる。
本発明では水溶液における組成が、NaCl7.9g/、KCl/
0.4g/、NaH₂PO₄0.2g/、Na₂HPO₄1.9g/、Na₂EDTA0.
3g/、NaF0.4g/、２−フェノキシエタノール3ml/
及び水残り１となるまでの量である希釈剤を使用す
る。この希釈剤はpH7.4±0.05及び浸透度（osmo−lalit
y）340±3mohsを有する。32μのセグメントは、本発
明の溶解剤を用いて250倍に希釈され、白血球数及び白
血球画分の測定のために光学変換器へと移送される。12
μのセグメントは、剪断され、ヘモグロビン試薬を用
いて250倍に希釈され、ヘモグロビン変換器へと移送さ
れる。このヘモグロビン試薬は、第四級アンモニウム塩
/KCN溶液と前記希釈剤との混合物である。最も良い態様
においては第四級アンモニウム塩溶液は、テトラデシル
トリメチルアンモニウムブロミド90g/及びシアン化カ
リウム0.75g/を脱イオン水１中に混合した溶液から
なる。次いで第四級アンモニウム塩溶液１を前記希釈
剤11と混合し、最後にTriton X−114を濃度0.25ml/
で加える。0.8μのセグメントは、赤血球希釈剤を用
いて12,500に希釈され、赤血球及び血小板を測定するた
めにインピーダンス変換器へと移送される。

感知ゾーンを通過する粒子から得られる各パルスは増幅
され、内部基準電圧と比較される。このように、白血球
チャネルにおいては白血球が赤血球ストローマ及び血小
板と区別され、同様に、赤血球／血小板チャネルにおい
ては赤血球及び血小板が区別される。

赤血球の絶対数をカウントするためには、データ取得に
際して変換器を通過する希釈血液の容積が既知であらね
ばならない。赤血球／血小板チャネルにおいては、これ
は計量管を使用して得られる。各カウントサイクルの際
に、インピーダンス開口を通して細胞が引っ張られるの
で、流体は計量管を通って引っ張られる。試薬メニスカ
スが光学検出器を通過するとカウントサイクルが開始さ
れる。正確に200μの希釈血液が変換器を通過した後
にメニスカスが第２の光学検出器を通過したならば、カ
ウントサイクルは停止される。カウント時間は、かかる
材料は有効開口を小さくし、カウント時間を増大するが
故に、オリフィス内の残渣を検出するために使用し得
る。この残渣はサイジングデータに悪影響を及ぼし得
る。

白血球チャネルにおいては、流体計量はシリンジポンプ
（syringe pump）を使用して行われる。白血球チャネル
内の最も狭い通路は比較的大きいので（サンプルノイズ
の直径160μｍ、ヒュームドシリカフローセル250平方μ
ｍ）、残渣の蓄積ははるかに起こりにくい。

カウントの間に１つ以上の血球粒子が感知ゾーン内に同
時に存在し得る可能性がある。それを無視すると、この
同時共存は血球数を人為的に小さくする。同時共存は、
オリフィスの有効容積及び血球濃度に直接関係してお
り、従って数学的に補正することができる。これは、白
血球、赤血球及び血小板の数の各々に対して自動的に実
施される。

CELL−DYN3000は、各測定サイクル後に自動的に全ての
数値データ及びグラフィックデータを表示する。標本測
定は、実行モードを選択することにより実施される。標
本は５つのタイプ、即ち患者、低コントロール、正常コ
ントロール、高コントロール及び反復実験のうちのいず
れか１つとして同定され得る。キーボードを介して操作
員ID、日付け、時間等を入力することができる。表示デ
ータはグラフィックプリンターによって折り畳み用紙
（8.5″×11″）上に、またはページごとに一枚の報告
書に印刷することができる。更に光学式チケットプリン
ターによって複写チケットレポートを印刷することもで
きる。

現在の1,000サイクルに対する数値データはPCハードデ
ィスク上に自動的に記憶される。このデータログは所望
により再度見ることもできるし印刷することもできる。
各データファイルは連続番号、標本タイプ、使用するの
であれば標本ID番号、選択された全てのパラメータに対
する数値データ、日付け、時間及び操作員IDを含む。

セットアップモードを使用して、使用者は任意の数値デ
ータに対して制限を設けることができる。かかる制限の
外にある全てのデータはビデオスクリーン上に反転表示
され、また太字で印刷される。血小板に対する度数分布
データまたは白血球に対する撤布図データが所定の基準
を満足しない場合には、各関連領域を領域警告を用いて
知らせる。

各測定サイクルの終了時には、結果がモニター上に表示
される。白血球からの光散乱データは一対の撤布図とし
て表示される。絶対白血球数は全血１μ当たりの量を
1000を単位として表示される。赤血球データは、横座標
の目盛りが10^-15リットルで表された容積頻度分布ヒス
トグラムとして表示される。絶対赤血球数は全血１μ
当たりの量を百万を単位として表示される。血小板デー
タは、横座標の目盛りが10^-15リットルで表された容積
頻度分布ヒストグラムとして表示される。絶対血小板数
は全血１μ当たりの量を1000を単位として表示され
る。

CELL−DYN3000はヘモグロビンをヘモ−シアン化物錯体
として測定する。ヘモグロビン試薬は、カチオン性洗剤
及びシアン化カリウムのアルカリ性溶液である。この洗
剤は赤血球を溶解してヘモグロビンを遊離させる。pHが
高いとヘモグロビンはヘモ発色団を遊離し、このヘモ発
色団は、存在するシアン化物と反応して安定な錯体を形
成する。これは、試薬ブランクに対する540nmにおける
吸光により測定される。ヘモグロビンの結果は、全血に
おけるその濃度について報告される。使用者は、g/dl、
g/またはmmol/の任意の単位を選択することができ
る。

CELL/DYN3000は、赤血球のサイズ分布から平均血球容積
（MCV）を決定する。この結果は10^-15リットルで直接報
告される。ヘマトクリット（HCT）は赤血球数及びMCVか
ら式： HCT＝（RBC数×MCV）/10 によって計算される。この結果はパーセント包含赤血球
として、または全血１容積当たりに含まれる赤血球の割
合:L/Lとして報告される。

赤血球分布幅（RDW）は、赤血球容積分布から決定され
る。これは単に、ピークのcvをパーセントで表わしたも
のである〔cv＝（sd/平均値）×100〕。このパラメータ
ーは赤血球異性の指数である。RDWは、血液塗抹に見ら
れる異方性サイトーシス（anisocytosis）の程度ととも
に増加する。診断に有効な情報はMCV及びRDWの両方を検
討することにより得ることができる。

５部の白血球画分は、単に光散乱をベースとして測定さ
れる。細胞化学的染色は必要ないので、CELL−DYN3000
はかなり高いスループットを与える（１時間当たり109
の割合でCBC/PLT/WBC画分を与える）。本発明の溶解試
薬は赤血球を即座に溶解するが、関係する測定時間内で
白血球の光散乱特性に影響することはない。各白血球の
散乱特性についてのデータは４つの光検出器から得られ
る。「０度」検出器は、レーザービームに対して約１〜
３度の半角で散乱した光を回収し、「10度」検出器は３
〜10度の半角で散乱した光を回収する。このような低い
角度での散乱は細胞容積の関数である。レーザービーム
と直角をなすような高角度での散乱は、その血球におけ
る構造の全量、即ち「構造化されたもの（structuredne
ss）」の関数である。他のものは全て等しいのであれ
ば、細胞の高角度の散乱は、例えば核の小裂片が増加す
るとともに、または細胞質粒状化が増大するとともに増
大する。CELL−DYN3000は、「90度」散乱及び「90度偏
光解消」光散乱を回収するために２つの光増倍管を使用
する。本発明者らの用途においては、少なくとも、この
偏光解消信号は、白血球内の多重散乱現象から生じる。
それは、人為的な交差偏光解消（cross depolarisatio
n）または自己蛍光発光（auto−fluorescence）ではな
い。

これら新規のパラメーター、即ち平均血小板容積〔MP
V〕、血小板分布幅〔PDW〕及び血小板限界値〔PCT〕の
臨床上の有効性は未だ確証されていない。公開された知
見に関しても議論がなされている。現在米国においては
FDA規制によって、臨床上の使用が確証されるまでこれ
らのパラメーターの報告が禁止されている。それ以外の
ところではこれらの結果は必要により報告することがで
きる。MPVデータが必要であれば、標本は、MPVが安定す
る採取後少なくとも１時間であることが強く推奨され
る。一般にEDTA中に採取した後、最初の約１時間でMPV
は増大する。

CELL−DYN3000は対数正規曲線が所定の一組の点を通る
ように調整されている血小板のヒストグラムからMPVを
計算する。このパラメーターを直接10^-15で表す。PCT
を血小板総数から計算すると、MPVは以下の式： PCT＝（PLT×MPV）/10 で表される。結果をパーセント又はml/で表す。PDWは
血小板の寸法分布の幾何学的標準偏差（s.d.）である。
PDWを血小板のヒストグラムのデータから引き出して、1
0（g.s.d.）として表す。

これらの赤血球指数は赤血球の形態を有効に指示するも
のであり、また貧血の分類に役立つ。更には、特定標本
用又は標本採取用指数データは非常に安定しており、た
とえ各計算に使用する値が相当変化し得たとしても、長
期間にわたってそれほど変化するはずがない。この安定
性のために、赤血球指数を品質調整機器の性能に使用し
得る。Bullの移動（moving）平均QCプログラムはこの原
理を使用している。

平均細胞ヘモグロビン（MCH）及び平均細胞ヘモグロビ
ン濃度（MCHC）は適切な時はいつでも測定されるパラメ
ーターである。以下の式： MCH＝（HGB/RBC総数）×10 MCHC＝（HGB/HCT）×10 が適用される。MCHを10^-12g又は10^-15モルで表す。MCHC
はg/、g/dl又はmM/で表す。

実施例１本明細書に記載の溶菌剤と混合した後の正常な供血者の
全血のレーザー光散乱特性を示す点図表を第５図に示
す。

点図表第５図ａ、第６図ａ、第７図ａ、第８図ａｙ軸:0℃の散乱ｘ軸:10゜の散乱点図表第５図ｂ、第６図ｃ、第７図ｃ、第８図ｃｙ軸:90゜の散乱ｘ軸:90゜の偏光解消された（depolarised）散乱血液の細区分１＝リンパ球、２＝好塩基球、３＝単球、４＝好中球及
び好酸球、５＝好中球、６＝好酸球。

実施例２多量の単球及び好酸球を含んでいたためにこの患者試料
を選択した。以前はリンパ球と単球とを分離して数える
ことが困難だったために、これらの試料は容易に５つの
部分に分けられなかった。第６図の区域5,6は実施例１
の第５図の場合と同一の軸情報を使用して、それぞれ好
中球と好酸球とのカウントを示している。

実施例３多量の単球及び好酸球を含んでいたためにまたこの患者
試料を選択した。第７図の区域5,6は実施例１の第５図
の場合と同一の軸情報を使用して、それぞれ好中球と好
酸球とのカウントを示している。

実施例４多量の単球及び好酸球を含んでいたためにまたこの患者
試料を選択した。第８図の区域5,6は実施例１の第５図
の場合と同一の軸情報を使用して、それぞれ好中球と好
酸球とのカウントを示している。

本発明を説明するためにある代表的な実施例及び詳細を
示しているが、特許請求の範囲で定義された如き発明の
範囲を逸脱することなく本発明に種々の変更及び改良を
加えることができる。

第６図用技術データ標本識別番号：タイプ：ファイル３開放試料モード（Open Sample Mode） WBC:6.4K/ul 未熟顆粒球:0.1 LYM:0.8 13.0％Ｌ不完全溶解％:4.8 NEU:4.9 75.7％Ｎ 10Dパラメーターでの粒状CV（Gran CV in10D parm）:1
2.1 MONO:0.6 8.6％Ｍ RBC上方メニスカス時間（RBC upr menis time）:3885 EOS:0.2 2.4％Ｅ RBCカウント時間:7085 BASO:0.0 0.4％Ｂ RBC:5.21M/ul HGB:15.5g/dl HCT:50.6％ MCV:97.1fl MCH:29.7pg MCHC:30.6g/dl RDW:12.9％ PLT:250,K/ul MPV:fl 6.9 PCT:％ 0.17 PDW:10（GSD） 16.9 座標軸第６図ａｘ−10D 第６図ｃｘ−90D ｙ−0D ｙ−90DEP 第６図ｂｘ−PLT 第６図ｄｘ−RBC ｙ−数ｙ−数第７図用技術データ標本識別番号:7127 未熟顆粒球:0.1 タイプ：患者不完全溶解％:2.1 開放試料モード 10Dパラメーターでの粒状CB:12.3 RBC上方メニスカス時間:3970 RBCカウント時間:7080 WBC:8.3K/ul LYM:0.7 8.3％Ｌ NEU:6.5 77.5％Ｎ MONO:0.8 10.1％Ｍ EOS:0.3 3.5％Ｅ BASO:0.1 0.5％Ｂ RBC:4.12M/ul HGB:11.7g/dl HCT:38.6％ MCV:93.7fl MCH:28.5pg MCHC:30.4g/dl RDW:16.0％ PLT:116K/ul MPV:fl 7.2 PCT:％ 0.08 PDW:10（GSD） 16.9 座標軸第６図ａｘ−10D 第６図ｂｘ−PLT ｙ−0D ｙ−数第６図ｃｘ−90D 第６図ｄｘ−RBC ｙ−90DEP ｙ−数第８図用技術データ標本識別番号：未熟顆粒球:0.0 タイプ：ファイル１不完全溶解％:1.2 開放試料モード 10Dパラメーターでの粒状CV:11.7 RBC上方メニスカス時間:3905 RBCカウント時間:7070 WBC:7.4K/ul LYM:0.5 6.6％Ｌ NEU:5.9 79.5％Ｎ MONO:0.7 9.8％Ｍ EOS:0.3 3.5％Ｅ BASO:0.0 0.6％Ｂ RBC:5.14M/ul HGB:13.8g/dl HCT:46.1％ MCV:89.6fl MCH:26.9pg MCHC:30.0g/dl RDW:15.7％ PLT:394K/ul MPV:fl 7.2 PCT:％ 0.28 PDW:10（GSD） 16.7 座標軸第６図ａｘ−10D 第６図ｃｘ−90D ｙ−0D ｙ−90DEP 第６図ｂｘ−PLT 第６図ｄｘ−RBC ｙ−数ｙ−数

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実践する自動血液学機器Cell−Dyn300
0の斜視図、第２図はインピーダンス細胞のカウント及
び寸法測定の原理を示す概略図、第３図はCell−Dyn300
0機器の光学変換器の概略横断面図、第４図はCell−Dyn
3000機器の光学ベンチの概略図、第５図及び第６図は実
施例１に記載の全血試料用白血球点図表、第７図は実施
例２に記載の全血試料用白血球点図表、第８図は実施例
３に記載の全血試料用白血球点図表である。 28……ノズル、34……フローセル、40……光源、52……
中央コア、54,56……光検出器、58……観測棒、60,62…
…光増倍管、63……ビームスプリッター、64……対物レ
ンズ、66……散乱ストップ、70……孔あき鏡。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭60−61659（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−125061（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−73356（ＪＰ，Ａ) 特開平２−31162（ＪＰ，Ａ) 特開平１−102365（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−70167（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−134957（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−134959（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−134958（ＪＰ，Ａ) 米国特許4286963（ＵＳ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】希釈された全血サンプルからの白血球サブ
集団の５部分分別用溶解および被包試薬であって、ａ）
試薬に白血球保護作用を付与するのに役立つ芳香族オキ
シエタノールと、ｂ）試薬にpH緩衝能を与え、かつ試薬
の電気伝導度を上げるのに役立つ8.5又はその近傍のpK
を有する有機緩衝剤と、ｃ）非イオン界面活性剤成分と
の水溶液から成る溶解および被包試薬。
【請求項２】芳香族オキシエタノールが２−フェノキシ
エタノールであることを特徴とする請求項１に記載の溶
解および被包試薬。
【請求項３】有機緩衝剤がTRIS/HCl、ホウ酸、グリシル
／グリシン及びBICINEから構成される群から選択される
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の溶解および被
包試薬。
【請求項４】非イオン界面活性剤がTriton X−100、Tri
ton X−114、ポリオキシエチレン又は糖から誘導される
界面活性剤から構成される群から選択されることを特徴
とする請求項１から３のいずれか一項に記載の溶解およ
び被包試薬。
【請求項５】２−フェノキシエタノール、TRIS/HCl緩衝
剤及びTriton X−100の水溶液から成る溶解および被包
試薬。
【請求項６】２−フェノキシエタノールの濃度が20mM〜
80mMであることを特徴とする請求項５に記載の溶解およ
び被包試薬。
【請求項７】流動血球計算方法における請求項１から６
のいずれか一項に記載の溶解および被包試薬の使用。
【請求項８】ａ）赤血球及び白血球を含有する全血サン
プルを希釈剤と接触させる段階と、ｂ）流動血球計算用
溶解剤であって、１）流動血球計算用溶解剤に白血球保
護作用を付与するのに役立つ芳香族オキシエタノール
と、２）溶解剤にpH緩衝能を与え、かつ溶解剤の電気伝
導度を上げるのに役立つ8.5又はその近傍のpKを有する
有機緩衝剤と、３）非イオン界面活性剤成分とを本質的
に含有する溶解剤を、前記の希釈した全血サンプルに加
えることにより、赤血球を溶解させると共に白血球を被
包する段階と、ｃ）溶解した赤血球及び被包した白血球
に集束レーザビームを交差させる段階と、ｄ）１）０度
光散乱、２）10度光散乱、３）90度光散乱、４）90度偏
光解消光散乱の交差から得られる４つの光散乱パラメー
タを測定する段階と、ｅ）測定した光散乱パラメータを
解析し、好中球、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球
の５つのサブ集団の分別計数を得る段階とを含む全血サ
ンプルからの白血球サブ集団の５部分分別定量方法。
【請求項９】該芳香族オキシエタノールが２−フェノキ
シエタノールであることを特徴とする請求項８に記載の
５部分分別定量方法。
【請求項１０】該有機緩衝剤がTRIS/HCl、ホウ酸、グリ
シル／グリシン及びBICINEから構成される群から選択さ
れることを特徴とする請求項８に記載の５部分分別定量
方法。
【請求項１１】該非イオン界面活性剤がTriton X−10
0、Triton X−114、ポリオキシエチレン又は糖基を有す
る親水性界面活性剤から構成される群から選択されるこ
とを特徴とする請求項８に記載の５部分分別定量方法。
【請求項１２】該流動血球計算用溶解剤が本質的に、２
−フェノキシエタノール、TRIS/HCl緩衝剤及びTriton X
−100の水溶液から構成されることを特徴とする請求項
８に記載の５部分分別定量方法。
【請求項１３】該２−フェノキシエタノールの濃度が20
mM〜80mMであることを特徴とする請求項12に記載の５部
分分別定量方法。