KR101772782B1 - 소변 샘플을 염색 및 처리하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 염색 방법에 관한 것으로, 이 방법은 단일 단계로 세포를 신속하게 염색할 수 있는 입자 조영제 조성물을 사용한다. 입자 조영제 조성물은 하나 이상의 입자 조영제와 하나 이상의 투과화제의 배합으로 이루어질 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 고정제 및 다른 성분들을 포함한다. 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛, 5PD-라이틱, 및 프로클린 300을 포함할 수 있다.
Description
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 발명의 명칭이 "소변 샘플 중의 입자의 분석(Analysis of Particles in Urine Samples)"인 미국 특허 출원 제61/799,014호의 이득을 주장하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
본 발명은 대체로 입자 조영제(particle contrast agent)에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 유체 샘플, 예컨대 소변 샘플 중의 입자들을 구별하고 정량화하기 위하여 전체 또는 부분 자동화 디바이스에서 사용하기 위한 입자 조영제 조성물에 관한 것이다.
요침사(urine sediment) 분석은 환자의 건강 상태의 개관을 제공하기 위해 가장 일반적으로 수행되는 진단 검사들 중 하나이다. 소변 샘플이 환자의 신체로부터 얻어지고, 추후의 처리 및 분석을 위하여 시험관 내에 저장될 수 있다. 소변 샘플 중의 유형적 요소(formed element)로도 불리는 소정의 특징적 침사의 외관은 임상적으로 유의하고/하거나 대상체에서의 병리학적 질환을 나타낼 수 있다.
일반적으로, 비정상 소변은 다양한 유형적 요소들, 예컨대 혈구, 상피 세포, 결정(crystal), 원주(cast), 또는 미생물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 소변 샘플은 혈액학적 기원의 세포들을 함유할 수 있다. 적혈구 또는 RBC는 사구체로부터 요도까지의 비뇨생식기계에서의 임의의 지점에서의 출혈의 결과로서 소변 중에 존재할 수 있다(혈뇨). 백혈구 또는 WBC, 호중구, 호산구의 존재는 임상적 유의성을 가질 수 있다. 글리터 세포(glitter cell)는 비중 1.010 이하의 저장성(hypotonic) 소변에서 관찰되는 호중구의 일 유형이다. 림프구의 존재는 이식 후의 신장 거부의 초기 지표로 사용되어 왔다. 호산구는 약물-유발 간질성 신장염과 관련되며, 신장 또는 하부 요로로부터 기원되는 점액사(Mucus thread)가 존재할 수 있다.
소변 샘플은 또한 상피 기원의 세포들을 함유할 수 있다. 신장 세뇨관 세포로도 불리는 약간의 신장 상피 세포들이 정상적인 탈락(exfoliation)으로 인해 건강한 사람의 소변 중에서 발견될 수 있다. 그러나, 과도한 신장 세뇨관 세포의 존재는 활동성 신장 질병 또는 세뇨관 상해를 나타낸다. 소변 중에서 발견되는 상피 세포들의 다양한 유형들(신장 상피 세포, 이행 또는 요로 상피 세포, 및 편평 상피 세포) 중에서, 신장 상피 세포가 임상적으로 가장 유의하다. 이들은 급성 세뇨관 괴사, 바이러스성 감염(예컨대, 거대세포바이러스), 및 신장 이식 거부와 관련된다. 이들의 존재는 또한 열, 화학적 독소, 약물(특히, 아스피린), 중금속, 염증, 감염, 및 신생물(neoplasm)과 함께 증가된다. 더욱이, 봉입체(inclusion body)의 존재가 바이러스성 감염, 예컨대 풍진 및 헤르페스에서 발견되며, 특히 거대세포바이러스와 함께 관찰될 수 있다.
소변은 또한 이행 상피 세포 또는 요로 세포를 함유할 수 있다. 이행 상피 세포는 신우로부터 남성 요도의 원위부까지 그리고 여성에서의 방광(삼각부(trigone))의 기저부까지의 요로의 안을 싸고 있는 다층의 상피 세포이다. 이는 신장 상피 세포와 구분하기가 어려울 수 있지만, 이는 대체로 더 크고 더 구형이다. 약간의 이행 세포들이 건강한 사람의 소변 중에 존재한다. 증가된 수는 감염과 관련된다. 이들 세포의 큰 응괴(clump) 또는 시트(sheet)가 이행 세포 암종과 함께 관찰될 수 있다.
소변은 또한 편평 상피 세포를 함유할 수 있다. 편평 상피 세포는 여성에서의 요도 및 남성 요도의 원위부의 안을 싸고 있다. 여성에서의 다수의 편평 세포의 존재는 일반적으로 질 오염을 나타낸다.
소변은 또한 단서 세포(clue cell)를 함유할 수 있다. 단서 세포는 질 기원의 편평 세포의 다른 유형이며, 요침사를 오염시키는 것으로 관찰될 수 있다. 이러한 편평 상피 세포는 가드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis) 세균에 의해 덮여지거나 가피(encrust)되는데, 이의 존재는 세균성 질염을 나타낸다.
소변은 또한 난형 지방체, 신장 세뇨관 지방, 또는 신장 세뇨관 지방체를 함유할 수 있다. 이러한 체(body)들은 지방 또는 지질 소적들로 충전된 신장 상피 세포(또는 대식세포)이다. 이러한 지방은 중성 지방(트라이글리세라이드) 또는 콜레스테롤일 수 있으며; 이들은 임상적으로 동일한 유의성을 갖는다. 소변 중에서의 난형 지방체의 존재는 질병 비정상을 나타내며 간과되어서는 안 된다. 이들은 종종 요침사 중에서 지방 원주들 및 지방 소적들과 함께 관찰되며, 신증후군에서 관찰되는 바와 같은 대량의 단백뇨와 관련된다.
소변은 또한 세균 및 효모와 같은 미생물을 함유할 수 있다. 정상적으로는, 소변은 무균이거나 세균이 없다. 그러나, 소정의 세균이 전형적으로 알칼리성 pH의 소변에서 관찰된다. 관련된 침사 소견에는 WBC(호중구) 및 원주(WBC 원주, 세포 원주, 과립 원주, 또는 세균 원주)의 존재가 포함될 수 있다. 장(enteric) 기원의 그람-음성 간균으로 인한 감염이 가장 흔하기는 하지만, 감염성 유기체가 또한 그람-양성 구균일 수 있다.
게다가, 특히, 효모 감염을 가진 여성 환자로부터의 오염과 같은 질 오염의 결과로서, 소변 중에서 효모가 관찰될 수 있다. 이는 또한 요중 글루코스의 존재로 인해 진성 당뇨병(diabetes mellitus)과 관련된다. 효모는 피부 및 환경으로부터의 흔한 오염물이며, 쇠약하고 면역억제 또는 면역손상된 환자에게서의 감염이 문제이다.
전통적으로, 소변 중의 침사의 분석은 일반 실험실에서 현미경을 사용하여 시각적 검사에 의해 수행되어 왔다. 이러한 접근에서는, 소변 샘플이 먼저 원심분리를 거치고 농축(enrich)된다. 이렇게 얻어진 침사는 일부 경우에 염색되고, 이어서 현미경 슬라이드 상에 장착되고, 현미경 하에서 수동 결정 및 카운팅을 거친다.
샘플 준비 단계들은 원심분리에 의한 요침사의 농축, 그리고 때로는, 예를 들어 RBC, WBC, 및 상피 세포와 같은 침사 유형들 사이에 대비를 증강시키기 위한 현미경 염색제의 적용을 포함할 수 있다. 수동 카운트에서, 기술자는 습식 마운트(wet mount) 슬라이드를 검토하여, 전문적인 판단을 이용하여 가시적인 세포들의 유형들 사이를 또는 그들의 외관에 의해 구분하고, 사전결정된 영역 내에서의 상이한 유형들의 관찰된 요침사의 수를 수동으로 카운팅한다.
소변 샘플 중에서 발견되는 세포들 또는 세포 구조들을 염색하기 위해 다양한 염색제가 사용되어 왔다. 예를 들어, 라이트 염색제(Wright's stain)는 광학 현미경 하에서의 검사를 위한 소변 샘플을 염색하는 데 사용되어 온 염색제이다. 소변 샘플의 염색은, 염색제가 올바르게 적용되고 세포 구조가 적절히 보존되도록 보장하기 위하여 적절한 순서로 다수의 용액 및 단계를 사용하는 것을 포함한다. 샘플을 분해로부터 보존하고 세포 구조를 유지하기 위하여 고정제가 제1 단계에서 샘플에 적용될 수 있다. 그 후, 염색제가 세포로 진입될 수 있도록 세포막을 용해시키기 위하여 투과화제(permeabilizing agent)가 제2 단계에서 샘플에 적용될 수 있다. 염색제는 적절한 구조를 염색하기 위하여 제3 단계에서 샘플에 적용될 수 있다. 이러한 샘플은 관찰을 위하여 추가로 헹구어질 수 있거나, 다른 작용들을 수행하기 위해 추가 염색제, 대비염색제(counterstain), 또는 기타를 적용하도록 추가 단계들이 취해질 수 있다.
적절한 시간 동안 적절한 순서대로 이러한 단계들을 수행하는 것이 중요하다. 샘플이 고정되기 전에 투과화된다면, 샘플 내의 세포 구조는 고정되기 전에 분해될 수 있으며, 원래의 세포 형태를 판별하는 어떠한 능력도 상실된다. 부가적으로, 염색은 투과화 단계 전에 일어날 수 없거나, 염색제는 세포를 적절하게 침투하여 세포 내의 구조를 염색하지 못할 것이다. 부가적으로, 고정 단계, 투과화 단계, 및 염색 단계와 같은 단계들 중 어느 것도 너무 급속히 수행된다면, 세포의 형태는 상실될 수 있고/있거나 세포 및 그의 내부 구조는 적절히 염색될 수 없다. 또한, 소변 본연의 pH에서 적절히 기능할 수 없는 성분들의 적절한 기능성을 보장하기 위하여 다른 단계들 전에 pH 조절제의 사용이 필요할 수 있다. 현재의 염색 기술은 다수의 단계들 및 상당한 시간을 필요로 한다.
현재의 염색 기술은 샘플을 조영제 중에서 일반적으로 약 9부의 조영제 대 1 부의 샘플로 희석하는 것을 필요로 한다. 이미지-기반 분석 시스템, 예컨대 유세포분석(flow cytometery) 시스템과의 사용을 위하여 큰 부피의 혼합물을 갖는 것이 바람직하지 않을 수 있는데, 이는 적어도 혼합물의 부피를 처리하는 데 걸리는 시간 때문이다.
자동화 분석기가 더 많이 보급되어 가고 있다. 소변 분석을 위한 시스템의 사용은 전반적으로, 발명의 명칭이 "컴팩트 위생 요분석 유닛(Compact Sanitary Urinalysis Unit)"인 빌라-리얼(Villa-Real)의 미국 특허 제4,473,530호; 둘 모두가 맥도날드(McDonald)에게 허여된, 발명의 명칭이 "소변 수집 및 분석 디바이스(Urine Collection and Analysis Device)"인 미국 특허 제3,894,845호 및 발명의 명칭이 "미생물 분석 디바이스(Microorganism Analysis Device)"인 미국 특허 제3,988,209호; 발명의 명칭이 "요분석을 위한 디바이스(Device for Urinalysis)"인 슐터(Schluter)의 미국 특허 제4,973,450호; 발명의 명칭이 "소변 중의 미생물, 백혈구 및 편평 상피 세포의 검출 및 정량화(Detection and Quantitation of Microorganisms, Leukocytes and Squamous Epithelial Cells in Urine)"인 맨소어(Mansour) 등의 미국 특허 제4,622,298호; 및 발명의 명칭이 "검사용 액체의 준비를 위한 방법 및 장치(Method and Apparatus for Preparation of Liquids for Examination)"인 파커(Parker)의 미국 특허 제5,132,232호; 발명의 명칭이 "유체 샘플 중의 입자를 분석하는 방법(Method of Analyzing Particles in a Fluid Sample)"인 다인되르퍼(Deindoerfer) 등의 미국 특허 제4,612,614호에 기재되어 있으며, 현미경 슬라이드 또는 플로우셀(flowcell)과 같은 확대된 영역에 걸쳐 샘플을 분포시킴으로써 요침사를 분석하기 위한 방법을 보고한다. 다인되르퍼 등은 샘플의 복수의 광학 정지 이미지들의 사용을 보고하는데, 이들 이미지는 전자 이미지들로 변환되며, 이러한 전자 이미지들은 시각적으로 판별가능한 특성들의 부류들에 의해 질서정연한 배열로 표시된다. 그러나, 초기에 개발된 이러한 소변 분석 시스템의 다수는 일반적으로, 모든 의도된 목적을 위하여 모든 표적/대상체에 걸친 적응에 필요한 일반적 적용성, 정확도, 및/또는 처리량이 결여되어 있다.
요침사 결정의 자동화를 위하여, 자동화 유동 현미경(automated flow microscope)이 사용될 수 있다(예를 들어, 유동형 자동 현미경-- iQ(등록상표)200, 아이리스 다이아그노스틱스(Iris Diagnostics)). 이러한 유형의 디바이스에서는, 사전농축 없이 편평형 플로우셀에 소변 샘플이 도입되고, 샘플이 플로우셀을 통해 유동하고 있는 동안에 이미지가 촬영되고 저장된다. 그러나, 요침사들은 그들의 형태가 다양하고 많은 침사들이 손상되고 있으며, 이에 따라 우수한 정확도로 촬영된 이미지의 결정은 달성되기 어렵다. 외부 사용자 검증 없이 우수한 정확도로 작은 크기의 침사, 예컨대 적혈구(특히, 이형(dysmorphic) 적혈구), 세균 및 결정을 판정하기란 특히 어렵다.
전술된 다양한 자동화 시스템은 샘플의 신속한 분석에 의지한다. 염색 과정의 단계들의 수 및 지속기간은 자동화 입자 분석 시스템의 속도 및 효능에서 제한 인자(limiting factor)일 수 있다. 염색 과정이 단축된다면 자동화 입자 분석 시스템은 더 효율적일 수 있으며, 염색 과정이 단일 단계로 수행된다면 더욱 더 효율적일 수 있다. 부가적으로, 자동화 입자 분석 시스템은 샘플의 전체 크기가 최소한으로 유지된다면 더 효율적일 수 있다.
자동화 입자 분석 시스템에서 이미징하기 위한 비뇨기 유체(urological fluid) 샘플의 입자들을 염색하기 위한 입자 조영제 조성물이 개시된다. 입자 조영제 조성물은 염색 조건 하에서 50 μM 내지 500 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)을 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 5 PD 라이틱(Lytic) 및 사포닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 투과화제를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 투과화제는 염색 조건 하에서 약 3.5 중량%의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 5 PD 라이틱일 수 있다. 일 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 86 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 일 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 적어도 제2인산나트륨 및 제1인산칼륨을 포함하는 인산염 완충 식염수를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 항미생물제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항미생물제는 프로클린(Proclin) 300일 수 있으며, 입자 조영제 조성물은 염색 조건 하에서 약 86 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 80% 순도 이상의 크리스탈 바이올렛을 또한 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 염화나트륨, 및 적어도 제2인산나트륨 및 제1인산칼륨을 포함하는 인산염 완충 식염수를 또한 포함할 수 있다.
자동화 입자 분석 시스템에서 사용하여 이미징하기 위한 비뇨기 유체 샘플의 입자들을 처리하기 위한 방법이 개시된다. 본 방법은 입자 조영제 조성물과 비뇨기 유체 샘플을 배합하여 샘플 혼합물로 하되, 입자 조영제 조성물의 최종 농도가 샘플 혼합물의 중량 기준으로 약 1% 내지 약 20%가 되는 샘플 혼합물로 하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 90초 미만 동안 20℃ 초과의 온도에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 염색 조건 하에서 50 μM 내지 500 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛 및 5PD-라이틱을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 5PD-라이틱은 염색 조건 하에서 약 3.5 중량%의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 86 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 입자 조영제 조성물의 최종 농도는 샘플 혼합물의 중량 기준으로 약 10% 내지 약 20%일 수 있다. 샘플 혼합물은 60초 미만 동안 30℃ 내지 50℃에서 인큐베이팅될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물의 최종 농도는 샘플 혼합물의 중량 기준으로 약 15%이고, 샘플 혼합물은 60초 미만 동안 30℃ 내지 50℃에서 인큐베이팅된다.
일부 실시 형태에서, 샘플 혼합물은 30 내지 35초 동안 40℃ 내지 50℃에서 인큐베이팅된다. 크리스탈 바이올렛은 대략 80% 순도 이상일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 프로클린 300을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 염화나트륨, 및 적어도 제2인산나트륨 및 제1인산칼륨을 포함하는 인산염 완충 식염수를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 실시 형태의 전술된 특징 및 부수하는 이점과 많은 다른 특징 및 부수하는 이점이, 첨부된 도면과 함께 고려할 때 하기의 상세한 설명을 참고함으로써 명백해지고 한층 더 이해될 것이다.
본 명세서는 하기의 첨부된 도면들을 참고하며, 여기서 상이한 도면들에서의 동일한 도면 부호의 사용은 동일하거나 유사한 구성요소들을 예시하는 것으로 의도된다.
도 1은 일 실시 형태에 따른 샘플 유체를 수송하기 위한 플로우셀의 개략도이다.
도 2는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물의 제조의 개략도이다.
도 3은 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정의 흐름도(flowchart)이다.
도 4는 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 대표적인 예시이다.
도 5는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 6은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 7은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 8은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 9는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 10은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 11은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 12는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 13은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 14는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 15는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 16은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 17은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 18은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 19는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 20은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 21은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 1은 일 실시 형태에 따른 샘플 유체를 수송하기 위한 플로우셀의 개략도이다.
도 2는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물의 제조의 개략도이다.
도 3은 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정의 흐름도(flowchart)이다.
도 4는 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 대표적인 예시이다.
도 5는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 6은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 7은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 8은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 9는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 10은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 11은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 12는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 13은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 14는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
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도 16은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 17은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 18은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 19는 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 20은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
도 21은 하나의 초기 실시예에 따라 염색된, 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 이미지이다.
본 발명은 유체 샘플, 예컨대 소변 샘플에서의 시각적 구분을 신속하게 생성하기 위한 의외의 예기치 않은 입자 조영제 조성물에 관한 것이다. 입자 조영제 조성물은 자동화 유세포분석 시스템에서 특히 유용할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 입자 조영제와 투과화제의 배합으로 이루어진다. 입자 조영제 조성물은 고정제 및/또는 항미생물제를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛, 사포닌, 및 프로클린 300의 혼합물이다. 의외로 효과적인 일 실시 형태에서, 염색 조건 하에서, 크리스탈 바이올렛은 약 0.57 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고, 사포닌은 대략 23.3 중량%의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고, 프로클린 300은 대략 0.05 중량%의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고, 이와 함께 탈이온수가 약 76.7 중량%로 존재한다.
이들 예시적인 실시예는 본 명세서에 논의된 일반 주제에 대해 독자에게 소개하기 위해 제공되며, 개시된 개념의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 하기의 섹션들은 도면 - 여기서, 동일한 도면 부호는 동일한 요소를 나타냄 - 을 참고하여 다양한 추가의 특징 및 실시예를 기술하고, 안내 설명이 예시적인 실시 형태를 기술하기 위해 사용되지만, 이는 예시적인 실시 형태와 마찬가지로 본 발명을 제한하는 데 사용되어서는 안 된다. 본 명세서에서 이러한 예시들에 포함된 요소들은 축적대로 그려지지 않을 수 있다.
본 명세서에 기술된 실시 형태들 이전에는, 감별 시각화를 증강시키는, 백혈구, 상피 세포, 세균 염색을 달성하도록, 유동 중에 일어나는 염색 단계 및 투과화 단계를 선택사항으로 하여, 생존 세포들 또는 사실상 온전한 세포들을 유지하면서, 이미지-기반 분석을 위한 소변 샘플에서의 입자/세포 감별 범주화 및 하위범주화를 수행하기 위한 입자 조영제 조성물의 개발 및 사용 방법을 가능하게 하는 공개된 프로토콜이 없었다.
본 발명의 태양 및 실시 형태는, 예를 들어 염색제/염료 조성물 및/또는 이들의 조합을 포함한 소정의 입자 조영제 조성물이, 자동화 이미지-기반 샘플 분석, 예컨대 요침사 샘플 분석을 수행하는 데 사용되는 경우에 예기치 않은 특성 및 효능을 갖는다는 의외의 예기치 않은 발견에 기초한다.
요분석 - 입자 분석 시스템
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 여러 상이한 유형의 소변 분석 이미징 시스템, 예컨대 아이리스 인터내셔널(Iris International)에 의해 판매되는 IQ 우린 어낼리시스(IQ Urine Analysis)와 함께 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 이미지-기반 샘플 분석, 예컨대 플로우셀 분석과 함께 사용될 수 있다. 그러한 플로우셀 분석의 일 예는 유세포분석의 전통적인 공지된 방법들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 유리하게는 하기에 간략하게 상술되고, 2014년 3월 17일에 동시출원된 출원 번호 __/___,___이며 발명의 명칭이 "소변 샘플에서의 입자 분석을 위한 플로우셀, 시스 유체, 및 오토포커스 시스템 및 방법(Flowcell, Sheath Fluid, and Autofocus Systems and Methods For Particle Analysis In Urine Samples)"인 출원에서 추가로 기술된 플로우셀 분석 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있으며, 이 출원은 본 명세서에서 참고로 포함된다.
도 1은 디지털 이미지 처리를 사용하여 샘플 유동 스트림(32) 중의 현미경적 입자를 이미징하기 위한 구성에서 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 관찰 구역(23)을 통해 샘플 유체(예를 들어, 하기에 추가로 상술된 바와 같은 샘플 혼합물)를 수송하기 위한 예시적인 플로우셀(22)의 개략도이다. 플로우셀(22)은 샘플 유체의 공급원(25)에 커플링되는데, 이러한 샘플 유체는 처리, 예컨대 입자 조영제 조성물과의 접촉 및 가열을 거쳤을 수 있다.
플로우셀(22)은 또한 시스 유체 공급원(27)에 커플링되어 샘플의 유동을 도울 수 있다. 일 실시 형태에서, 시스 유체는 20℃에서 비중이 1.007이고 pH가 약 7.0인 수성 염 용액이며, 이는 아이리스 인터내셔널, 인크.로부터 상표명 라미나(LAMINA)로 입수될 수 있다.
샘플 유체는, 샘플 공급관(29)의 원위 단부(28)에서 납작한 개구부를 통해, 그리고 시스 유체 유동이 사실상 확립된 지점에서 플로우셀(22)의 내부 내로 주입되어서, 리본형 샘플 스트림의 위 및 아래에서(또는 대향하는 면들 상에서) 시스 유체의 안정하고 대칭인 층류가 생성되게 된다. 샘플 시스 유체는, 사실상 협소화되는 유로를 따라, 주입된 샘플 유체와 함께 시스 유체를 이동시키는 정밀 계량 펌프들에 의해 공급될 수 있다. 일 실시 형태에서, 시스 유체는 유로가 협소화되는 구역(21)에서 샘플 유체를 봉입 및 압축한다. 따라서, 구역(21)에서의 유로 두께의 감소는 샘플 스트림(32)의 기하학적 포커싱(geometric focusing)에 기여할 수 있다. 샘플 유체 리본(32)은 협소화 구역(21)의 하류에서 시스 유체와 함께 운반되어, 예를 들어 CCD를 사용하여 이미지가 수집되는 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 전방에서, 또는 아니면 관찰 구역(23)을 통해 통과한다. 샘플 유체 리본은 시스 유체와 함께 배출구(33)로 유동한다.
여기에 나타낸 바와 같이, 협소화 구역(21)은, 원위 두께 DT가 근위 두께 PT보다 더 작도록, 근위 두께 PT를 갖는 근위 유로 부분(21a) 및 원위 두께 DT를 갖는 원위 유로 부분(21b)을 가질 수 있다. 따라서, 샘플 유체는 근위 부분(21a)에 대해 원위이고 원위 부분(21b)에 대해 근위인 위치에서 샘플관(29)의 원위 단부(28)를 통해 주입될 수 있다. 따라서, 샘플 유체는 시스 유체 스트림이 구역(21)에 의해 압축됨에 따라 시스 유체 봉입물로 진입될 수 있다.
대물 렌즈(46)를 갖는 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 리본형 샘플 스트림(32)과 교차하는 광학 축을 따라 지향된다. 대물 렌즈(46)와 플로우셀(22) 사이의 상대 거리는 광센서 어레이 상의 포커싱된 디지털화 이미지를 분해 및 수집하기 위하여 모터 드라이브(54)의 작동에 의해 변동가능하다.
입자 조영제 조성물
도 2는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물의 제조의 개략도이다. 블록(208)에서, 입자 조영제(202)와 투과화제(204)가 배합되어 입자 조영제 조성물(210)을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 선택적인 고정제(206)가 또한 배합된다. 블록(208)에서의 배합은 임의의 순서대로 그리고 임의의 적합한 방법으로 수행될 수 있다.
대안적인 실시 형태에서는, 하기에 추가로 상술된 바와 같이, 추가 성분들(212)이 입자 조영제 조성물(210)의 일부로서 블록(208)에서 배합된다.
입자 조영제 조성물(210)은 키트(kit)의 일부로서 제공될 수 있다. 입자 조영제 조성물(210)은 이미 제조된 상태로 제공되거나 하나 이상의 성분으로서 제공되어 이들 성분이 배합되어야 할 수도 있다. 본 키트는 또한 본 명세서에 기재된 방법들 중 임의의 것에 따른 입자 조영제 조성물의 사용에 대한 사용설명서 및/또는 키트의 임의의 다른 구성요소의 사용에 대한 사용설명서를 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 하나 이상의 완충제 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 키트 및/또는 완충제는 pH 조정제; 이온 강도 개질제, 계면활성제(surfactant), 킬레이트화제, 당(sugar), 당 알코올, 단백질 안정제, 및/또는 항미생물제 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 키트는 또한 세정 또는 플러싱 용액을 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 양성 및 음성 대조군을 위한 표준물, 교정기(calibrator), 또는 대조군을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표준물은 표준 함유 교정기 및/또는 대조군을 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 키트의 구성요소들을 전달하기 위한 일회용 마이크로피펫, 팁 또는 관을 포함할 수 있다.
입자 조영제
입자 조영제(202)는 소변 샘플 중의 입자들에서 가시적인 구분을 생성할 수 있는 임의의 조영제일 수 있다. 상이한 조영제들이 세포의 상이한 부분들에서 반응하거나 집중되고, 이러한 특성들은 특정 부분들 또는 영역들을 드러내는 데 유리하게 하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 조영제(예를 들어, 염색제)의 예에는 하기가 포함된다: 알시안 블루(Alcian Blue) 및 알시안 블루 86(PAS 중성 및 산성 점액물질); 알리자린 레드(Alizarin Red) S; 알루라 레드(Allura Red) AC(아조염료 적색 염료 40호); 아날린 블루(Analine Blue)(옥살산으로 강화된 섬모(cilia)); 오라민(Auramine) O; 아주르(Azure) B; 아주르 C; 비스마르크 브라운(Bismarck Brown); 브릴리언트 블루(Brilliant Blue) FCF(쿠마시 블루(Comassie blue)); 브릴리언트 크레실 블루(Brilliant cresyl blue); 브릴리언트 그린(Brilliant green); 카르뮴(Carmium)(카르민산 및 칼륨 명반으로 이루어진 적색 핵 염료); 콩고 레드(Congo red); 클로로졸 블랙(Chlorozol black) E(핵 흑색, 세포 회색, 글리코겐 분홍색); 크레실 바이올렛 아세테이트; 다로우 레드(Darrow red); 에오신 블루이시(Eosin bluish); 에리트로신(Erythrosin) B(적색 염료 3호); 에틸 에오신(Ethyl eosin); 패스트 그린(Fast Green) FCF(녹색 염료 3호); 염기성 푹신(Fuchin basic)- (핵 및 편모); 플루오레세인(Fluorescein)- (머큐로크롬(Mercurochrome)); 김자- 말초 혈액 도말; 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin)- 퇴행성 핵 염색제(regressive nuclear stain); 인디고 카르민(Indigo Carmine)(청색 염료 2호); 야누스 그린(Janus Green) B(미토콘드리아); 제너(Jenner) 염색제- (말초 혈액 도말); 라이트 그린(Light Green) SF 옐로우이시(yellowish); 맥닐(MacNeal)- (테트라크롬 혈액 염색제); 말라카이트 그린(Malachite green); 메틸 오렌지(Methyl orange); 마르티우스 옐로우(Martius yellow); 마이어 헤마톡실린(Mayer's Hematoxylin)- 진행성 핵 염색제(progressive nuclear stain); 메틸 바이올렛(Methyl violet) 2B; 메테나민 은-페로이드산(Methenamine Silver-Peroidic acid); 메틸렌 바이올렛(Methylene violet); 메이 그륀발트- 혈액학적 염색제; MTT- 포르마잔 염색제; 뮤시카르민(Mucicarmine)- 1차 종양 염색제; 뉴트럴 레드(Neutral red); 니그로신(Nigrosin); 닐 블루(Nile Blue) A; 뉴클리어 패스트 레드(Nuclear Fast red) C.I. 60760; 나프탈(Napthal) AS; 니트로-블루 테트라졸륨(Nitro-Blue Tetrazolium)- 견뢰 포르마잔 염료; 오렌지(Orange) G; 오렌지 II; 오르세인(Orcein); 파파니콜라우(Papanicolaou) 염색제 EAS- 선명한 세포질 염색; 파라로사닐린(Pararosanilin); 파라로사날린(Pararosanaline); 페리오드산 시프(Periodic Acid Schiff)-(PAS, 특정 탄수화물 염색제); 필록신(Phyloxine) B; 프로타르골(Protargol) S; 피로닌(Pyronin) B; 피로닌 Y; 레사주린(Resazurin); 로마노우스키-김자(Romanowsky-Giemsa); 로즈 벵갈(Rose Bengal); 사프라닌(Safranin) O; 수단 블랙(Sudan Black) B; 수단 III- (알파-나프톨에 의해 골수성 과립을 염색함); 수단 IV- 트라이글리세라이드를 염색함; 타르트라진(Tartrazine)- (아조 염료 황색 5호); 티오닌(Thionin)- 메타 염색질을 염색함; 트라이페닐 테트라졸륨(Triphenyl Tetrazolium); TTC- 포르마잔 적색 염료; 톨루이딘 블루(Toluidine Blue) O; 라이트 염색제- (종래의 혈액 도말을 위한 고정제, 완충제 및 염색제); 및 라이트 김자.
많은 노력과 실험을 통해, 본 명세서에서 추가로 상술된 바와 같이, 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사프라닌 O, 에오신 Y 및 메틸 그린 중 적어도 하나를 포함하는 입자 조영제(202)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 입자 조영제(202)는 이미지-기반 범주화 및 하위범주화를 위하여 생존 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들을 염색하기에 유효한 양으로 첨가된다. 입자 조영제(202)는 상기 언급된 입자 조영제들 중 2개 이상의 임의의 조합일 수 있다. 입자 조영제(202)는 생명유지 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들의 판별가능한 염색된 이미지를 효과적으로 얻도록 선택될 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛을 포함한다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 50 μM 내지 약 500 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염색 조건 하에서"는 그 성분이 샘플과 혼합될 때를 지칭한다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 50 μM 내지 약 500 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 320 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛이 염색 조건 하에서 약 0.57 mM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 크리스탈 바이올렛이 염색 조건 하에서 아주 거의 0.57 mM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 5% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다. 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛 단독일 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 입자 조영제와 조합된 크리스탈 바이올렛일 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 사프라닌 O를 포함한다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 100 μM 내지 약 1000 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 600 μM 내지 약 900 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 850 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 아주 거의 850 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 사프라닌 O는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 사프라닌 O는 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)가 크리스탈 바이올렛과 사프라닌 O 둘 모두를 포함하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성된다. 크리스탈 바이올렛 대 사프라닌 O의 비는 약 0.05:1 내지 약 5:1(몰농도/몰농도)일 수 있다. 크리스탈 바이올렛 대 사프라닌 O의 비는 약 3:1(몰농도/몰농도)일 수 있다. 크리스탈 바이올렛 대 사프라닌 O의 비는 아주 거의 3:1(몰농도/몰농도)일 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 뉴 메틸렌 블루를 포함한다. 뉴 메틸렌 블루는 50% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 에오신 Y를 포함한다. 에오신 Y는 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 에오신 Y는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 에오신 Y는 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 메틸 그린을 포함한다. 메틸 그린은 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 메틸 그린은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 메틸 그린은 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사프라닌 O, 에오신 Y 및 메틸 그린 중 하나 이상을, 예를 들어 이미징을 위해 제공될 때 샘플 중의 입자들의 세포내 내용물 특징부를 증강시킴으로써 입자들 중에서의 시각적 구분을 생성하기에 유효한 양으로 포함한다. 입자 조영제(202)는 입자들을 증강 및/또는 염색하기에 충분한 양으로 존재할 수 있으며, 이러한 입자들에는 적혈구(RBC), 이형 적혈구, 백혈구(WBC), 호중구, 림프구, 식세포, 호산구, 호염기구, 편평 상피 세포, 이행 상피 세포, 디코이(decoy) 세포, 신장 세뇨관 상피 세포, 원주, 결정, 세균, 효모, 기생충, 난형 지방체, 지방 소적, 정자, 점액, 트리코모나스, 세포 응괴, 세포 단편, 및 소변 샘플 중에서 발견되는 다른 세포들뿐만 아니라 이들의 하위세포 구조들이 포함된다. 염색은 입자들을 식별, 구분, 카운팅, 특성화, 및 분석하는 것을 도울 수 있고/있거나 병상, 질병, 또는 질환과 관련된 형태학적 특징부들을 식별하는 것을 도울 수 있다. 시각화가능한 또는 시각적 구분은 임의의 광원(예를 들어, UV, 가시광, IR)을 사용하여 시각화가능하거나 달리 검출가능할 수 있는 임의의 입자 특징부 또는 입자내(intraparticle) 특징부를 포함할 수 있다.
입자 조영제 조성물(210)이 2개 이상의 입자 조영제(202)들을 포함하는 실시 형태에서, 입자 조영제(202)들의 각각의 양은, 입자 조영제(202)들이 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분의 생성에 대해 독립적, 경쟁적 및/또는 증강 효과를 갖는지의 여부에 따라 적절히 조정될 수 있다.
투과화제
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 입자 막 및/또는 벽 투과화제일 수 있다. 투과화제(204)는 계면활성제 및/또는 표면 인장 개질제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 사포닌을 포함할 수 있다. 대안적인 실시 형태에서, 투과화제(204)는 4차 암모늄 염, 비이온성 계면활성제, 및 쯔비터이온성 계면활성제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 투과화제는 세포내 내용물에 대한 입자 조영제(202)의 접근성을 증가시키도록 세포의 투과성을 변경시킬 수 있다. 투과화제는 신속한 1 단계 염색 절차를 허용하기에 충분한 양으로 선택되고 포함될 수 있다.
비이온성 계면활성제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: (1) 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리옥시에틸렌 에탄올에 대해 에테르화된 직쇄 지방족 소수성 물질을 포함한, 폴리옥시에틸렌 알킬 또는 아릴 에테르(폴리에톡실레이트), 예를 들어 브리즈(Brij)(등록상표) 35; (2) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에테르화된 분지쇄 지방족/방향족(예를 들어, 옥틸페놀) 소수성 물질, 예를 들어 트리톤(Triton) X(등록상표)-100; (3) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에테르화된 직쇄 지방족/방향족(예를 들어, n-노닐페놀) 소수성 물질, 예를 들어 아이게팔(Igepal)(등록상표) C0897; 및 (4) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에스테르화된 직쇄 지방족(예를 들어, 카르복실산) 소수성 물질, 예를 들어 미르즈(Myrj)(등록상표) 53, 및 기타. 비이온성 폴리옥시에틸렌 알킬 또는 아릴 에테르(폴리에톡실레이트) 계면활성제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: 폴리옥시에틸렌(4) 라우릴 에테르(브리즈(등록상표) 30); 폴리옥시에틸렌(23) 라우릴 에테르(브리즈(등록상표) 35); 폴리옥시에틸렌(2) 세틸 에테르(브리즈(등록상표) 52); 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르(브리즈(등록상표) 58); 폴리옥시에틸렌(2) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 72); 폴리옥시에틸렌(10)스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 76); 폴리옥시에틸렌(20) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 78); 폴리옥시에틸렌(2) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 92); 폴리옥시에틸렌(10) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 96); 폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 98); 폴리옥시에틸렌(21) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 721); 폴리옥시에틸렌(100) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 700); 및 기타. 비이온성 계면활성제의 추가 예에는 트리톤 X(등록상표)-100(비환원 또는 환원됨), 트리톤(등록상표)X-114(비환원 또는 환원됨), 트리톤 X(등록상표)-165, 및 트리톤 X(등록상표)-305(비환원 및 환원됨), 및 기타가 포함될 수 있다.
일 실시 형태에서, 투과화제(204)는 염색 조건 하에서 약 0.10 g/L 내지 약 0.20 g/L 의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 비이온성 계면활성제(예를 들어, 브리즈(등록상표) 35)를 포함할 수 있다. 비이온성 계면활성제는 염색 조건 하에서 약 0.10 g/L 내지 약 0.16 g/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 비이온성 계면활성제는 약.012 g/L 내지 약 0.14 g/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
쯔비터이온성 계면활성제의 예에는 TDAPS(테트라데실다이메틸암모니오프로판설포네이트), CHAPSO(3-[(3-콜아미도프로필) 다이메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트), 약 12 내지 약 16개의 탄소 원자를 갖는 알킬 N, N-다이메틸 N-옥사이드, 라우릴 다이메틸아민 N-옥사이드(LO), DDAPS(N-도데실-N, N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트), 및 기타가 포함될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 세포 구조를 사실상 온전하게 하면서 세포, 막, 및/또는 벽의 투과성을 증가시키기에 충분한 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 막 및/또는 벽이 더 투과성 및/또는 다공성이게 하여 입자 조영제(202)에 의한 접근을 용이하게 한다.
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 입자 조영제(202)가 샘플 내의 세포들로 진입될 수 있게 하는 데 필요한 기공 또는 개구부를 신속히 생성할 수 있도록 선택된다.
많은 노력과 실험을 통해, 미국 플로리다주 포트 라우더데일 소재의 클리니컬 다이아그노스틱 솔루션즈(Clinical Diagnostic Solutions)(CDS)로부터 입수가능한 5PD-라이틱을 포함하는 투과화제(204)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 5PD-라이틱은 사포닌을 포함한다. 5PD-라이틱은 개괄적으로 미국 특허 제6,632,676호에 기술되어 있으며, 이 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다. 입자 조영제 조성물(210)의 약 23.3 중량%의 비로 5PD-라이틱을 사용하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 입자 조영제 조성물(210)의 아주 거의 23.3 중량%의 비로 5PD-라이틱을 사용하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 염색 조건 하에서 약 0.01 mg/L 내지 약 100 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 사포닌을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 사포닌은 약 0.05 mg/L 내지 약 11 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 의외로 효과적인 실시 형태에서, 사포닌은 염색 조건 하에서 약 0.2 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 의외로 효과적인 실시 형태에서, 사포닌은 염색 조건 하에서 아주 거의 0.2 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 샘플에 첨가하기 전의 사포닌 스톡 용액의 농도는 최종 사포닌 농도의 최대 100배일 수 있다. 시판 사포닌은 순수한 재료가 아니기 때문에, 공급되는 각종 많은 사포닌 분말에 대하여 농도에서의 조정이 필요할 수 있다. 한계 내에서, 주어진 소변 샘플에 첨가되는 사포닌의 농도를 변화시킬 수 있는데, 단 사포닌 시약의 부피에서의 보상 변화가 또한 이루어진다는 조건에서이다. 일부 실시 형태에서, 사포닌은 4차 암모늄-치환된 사포닌 에테르일 수 있다.
고정제
일부 실시 형태에서, 고정제(206)는 염색 및 이미징 동안 원하는 세포들 및 세포 구조들이 분해되지 않음을 보장하도록 선택될 수 있다. 고정제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: 글루타르알디드; 포름알데하이드; 다이아졸리디닐 우레아; 가교결합제; 등장 식염수 중 암모니아 피크레이트(예를 들어, 메틸렌 블루 염색용); 에틸 알코올; 메탄올(예를 들어, 실온, - 20℃ 또는 -70℃에서); 하이덴하인(Heidenhain)의 수사(Susa) - HgCl2, NaCl 트라이클로로아세트산, 포르말린; 보우인(Bouin) 고정제 - 피크르산, 포르말린, 아세트산; 듀보스크-브라질(Duboscq-Brazil) - 80% EtOH를 갖는 보우인 고정제; 카르노이(Carnoy) 고정제 - EtOH, 클로로포름, 아세트산; 젠커(Zenker) 고정제 - HgCl2, K2CrO7, NaSO4.H2O; 아세토카르민; 가텐스비(Gatensby) 고정제 - 크롬산, 사산화오스뮴, NaCl; 베이커(Baker) 고정제 - 포르말린, CaCl2; 스미스(Smith) 고정제 - K2Cr2O7, 포르말린, 아세트산; 1% 메틸 그린, 1% 아세트산; 페놀, 포르말린, 글리세롤, 겐티안 바이올렛(Gentian violet); 샤우딘(Schaudin) - HgCl2, EtOH, 아세트산; 챔피(Champy) 고정제 - 크롬산, K2CrO7, OsO4; 플레밍(Fleming) 고정제 - 크롬산, OsO4, 아세트산; 포르몰-은(Formol-Silver) - 포름알데하이드, AgNO3; 스트렉(Streck) 조직 고정제 - 브로노폴, 다이아졸리디닐 우레아, ZnSO4 .7H2O, 소듐 시트레이트; PBS 중 1% 이미다졸리디닐 우레아; 글리옥살: 글리오픽스(Glyofix), 프레퍼(Prefer), 세이프픽스(Safefix), 히스토초이스(Histochoice); 글리단트-하이단토인(Glydant- Hydantoin); 다이메틸올 우레아; 소듐 하이드록시메틸글리시네이트; 카르노브스키(Karnovsky) 고정제; 염화제2수은(B-5); 홀란데(Hollande) 고정제; 및 기타.
일부 실시 형태에서, 고정제(206)는 산화제, 수은제, 피크레이트, 헤페스-글루탐산 완충제-매개 유기 용매 보호 효과(hepes-glutamic acid buffer-mediated organic solvent protection effect, HOPE) 고정제, 또는 수용성 방부제일 수 있다. 산화제의 예에는 중크롬산칼륨, 크롬산, 과망간산칼륨, 및 기타가 포함된다. 수은제의 예에는 B-5, 젠커 고정제, 및 기타가 포함된다. 수용성 방부제의 예에는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 다이메틸올우레아, 2-피리딘티올-1-옥사이드, 소르브산, 소르브산칼륨, 및 기타가 포함된다.
많은 노력과 실험을 통해, 글루테르알데하이드, 포름알데하이드, 및 다이아졸리디닐 우레아 중 적어도 하나를 포함하는 고정제(206)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
일부 실시 형태에서, 글루테르알데하이드를 0.1 중량% 이하로 포함하는 고정제(206)를 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 다이아졸리디닐 우레아를 216 mM 또는 약 216 mM로 포함하는 고정제(206)를 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
추가 성분
일부 실시 형태에서, 선택적 추가 성분(212)들이 선택적으로 블록(208)에서 입자 조영제 조성물(210) 내로 배합될 수 있다. 추가 성분(212)들의 예에는 pH 조정제, 완충제 성분, 당, 당 알코올, 삼투압 조정제, 단백질 안정제, 항미생물제, 이온 강도 개질제, 계면활성제, 및 킬레이트화제, 및 기타가 포함될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)이 인산염 완충 식염수를 포함하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)은 pH를 3 또는 약 3으로 유지하기 위해 pH 조정제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)이 pH를 소변 샘플의 pH 또는 대략 그러한 pH로 유지하기 위해 pH 조정제를 포함하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)은 하나 이상의 당 및/또는 당 알코올, 또는 다른 막 안정제를 포함한다. 용액 중의 당 및 당 알코올은 세포/세포 막을 보존하도록 도울 수 있다. 적합한 당의 예에는 트레할로스, 말토스, 수크로스, 글리세롤, 말툴로스, 아이소말토스, 셀로비오스, 락툴로스, 겐티오불로스, 멜리비오스, 만노비오스, 팔라티노스, 코지비오스, 니게로스, 소포로스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 이노시톨, 람니톨, 푸시톨, 리비톨, 트레이톨, 에리트리톨, 및 글루시톨이 포함된다. 구체적으로, 당 트레할로스는 사포닌에 의한 용혈을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 입자 조영제 조성물(210)은 염색 조건 하에서 약 5 내지 약 200 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 트레할로스를 포함할 수 있다. 트레할로스는 염색 조건 하에서 약 10 내지 약 100 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 트레할로스는 염색 조건 하에서 약 67.7 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 트레할로스는 단백질 안정제 및 막 안정제 둘 모두이며, 건조, 가열, 냉동, 및/또는 효소적 조직 분해의 극한 조건에서 세포 완전성을 유지하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)은 우레아의 탈안정화 효과를 상쇄하는 하나 이상의 단백질 안정제 또는 다른 양립가능한 용질을 포함한다. 적합한 단백질 안정제의 예에는 메틸아민 및 아미노산 단백질 안정제, 트라이메틸아민 N-옥사이드(TMAO), 트라이메틸아민, 글리세로포스포릴 콜린, 베타인, 글리신-베타인, 피퍼콜레이트 베타인, 사르코신, N-카르바모일-L-글루타민-I-아미드, N-아세틸글루타미닐-글루타민 아미드, 타우린, 다이메틸 타우린, 하이포타우린, N-메틸 타우린, 티오타우린, 옥토핀, 아르기닌, 글리신, 다이메틸 글리신, N-트라이메틸 글리신, 에코토인, 프롤린, 프롤린-베타인, 베타-알라닌, 글루타메이트, 글루타메이트-베타인, N-아세틸-베타 라이신, 콜린-o-설페이트, GABA, 호마린, 및 다이메틸설포노프로프리오네이트가 포함된다. 일 실시 형태에서, 양립가능한 용질 전략이 세포 단백질을 안정화하면서 소변 샘플 중의 세포들의 염색 강도를 증가시킬 수 있다. 트라이메틸아민 N-옥사이드(TMAO)가 소변 중에서 발견되는 염화나트륨 및 우레아에 의한 단백질 가용화(탈안정화)를 상쇄할 수 있다. TMAO는 1 부의 TMAO 대 2 부의 단백질 탈안정제의 비로 단백질 탈안정제의 효과를 조절할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)은 염색 조건 하에서 약 5 mM 내지 약 200 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 TMAO를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)은 pH를 조정하기 위한 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 완충제는 또한 적합한 점도제/점도 개질제, 고정제, 이온 강도 개질제, 계면활성제, 및 표면활성제(detergent) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)은 점도 개질제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 점도 개질제는 글리세롤일 수 있다. %글리세롤은 사용되는 특정 샘플 및 분석기의 원하는 특성에 따라 변할 수 있다. 점도 개질제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: PVP, 천연 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 카라기난, 로커스트 빈 검(locust bean gum), 구아 검, 및 젤라틴; 당(및 유도체), 예컨대 덱스트로스, 프룩토스; 폴리덱스트로스; 덱스트란; 폴리덱스트란; 당류(saccharide); 및 다당류(polysaccharide); 반합성 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스; 합성 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 카르보폴(Carbopol)(등록상표); 및 기타.
신속한 1 단계 염색 과정
도 3은 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정(300)의 흐름도이다. 신속한 1 단계 염색 과정(300)은 여러 하위단계들을 포함할 수 있지만, 용어 "1 단계"는 샘플이 염색 절차 동안 다수의 상이한 용액들에 도입될 필요가 없음을 나타내는 데 사용된다. 도 2를 참고하여 전술된 바와 같이, 입자 조영제 조성물(210)이 블록(302)에서 제조된다. 선택적으로, 일부 실시 형태에서, 성분들, 예컨대 임의의 입자 조영제(202)들이 블록(306)에서 정제될 수 있다. 입자 조영제(202)들의 정제는 샘플과의 접촉시에 형성된 침전물의 수준을 감소시키며, 그럼으로써 백그라운드를 감소시키고 이미지-기반 소변 샘플 분석의 결과를 개선할 수 있으며, 아울러 이미지 또는 습식 마운트의 추가의 재검토, 또는 수동으로 준비된 현미경법에 대한 필요성이 감소된다.
블록(308)에서, 입자 조영제 조성물(210)은 샘플과 배합된다. 입자 조영제 조성물(210)은, 함께 혼합하는 것을 포함한 임의의 적합한 방식으로 샘플과 배합될 수 있다. 블록(308)에서의 배합은, 샘플을 소정량의 입자 조영제 조성물(210)을 사용하여 희석시키는 것을 포함할 수 있다. 샘플은 입자 조영제 조성물(210)을 사용하여 희석될 수 있다. 희석량은 이미지-기반 분석 동안 프레임당 최적의 세포수를 제공하도록 선택될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 생성된 샘플 혼합물 중 최대 20% (v/v) 입자 조영제 조성물(210)로 샘플과 배합되는 경우에, 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 생성된 샘플 혼합물 중 입자 조영제 조성물(210)의 백분율은 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 약 20% (v/v)일 수 있다. 입자 조영제 조성물(210)을, 생성된 샘플 혼합물 중 15% 입자 조영제 조성물(210)(즉, 85% 샘플)의 백분율로 샘플과 혼합함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 15% 이하의 백분율로 소변 샘플과 혼합되도록 제형화된 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 낮은 희석률에 의한 염색은 이미지-기반 소변 샘플 분석 시스템을 매우 효과적이게 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 승온, 예컨대 인큐베이팅과 관련하여 하기에 기재된 온도들 중 임의의 온도에서 입자 조영제 조성물(210)과 배합된다.
소정 실시 형태에서, 샘플은 입자 조영제 조성물(210)과 배합하기 전에 준비 또는 처리(예를 들어, 농축, 희석)될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 배합된 샘플 및 입자 조영제 조성물(210)은 샘플 혼합물로 지칭된다.
블록(310)에서, 샘플 혼합물은 소정 온도에서 소정 시간 동안 인큐베이팅된다. 인큐베이션은 세포들 또는 그들의 내부 구조의 투과성을 증가시킬 수 있어서, 입자 조영제(202)가 세포들 또는 세포 구조들을 더 잘 침윤시킬 수 있게 한다. 인큐베이션의 시간 및 온도는 입자 조영제 조성물(210)이 샘플을 적절히 투과하고, 고정시키고, 염색할 수 있도록 선택될 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)은 계면활성제를 포함할 수 있으며, 인큐베이션 동안 상승된 열이, 막 투과화를 달성하여 RBC 완전성을 유지하는 데, 그리고 여전히 WBC, 상피 세포 및 세균 염색 효능을 원하는 분해능으로 달성하는 데 사용될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 약 1 내지 90초 동안 약 40℃ 내지 약 50℃의 온도에서의 샘플 혼합물의 인큐베이션에 의해 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 샘플 혼합물은 약 41℃ 내지 약 44℃의 온도로 가열될 수 있다. 샘플 혼합물은 1 내지 60초 동안 인큐베이팅될 수 있다. 샘플 혼합물은 30 내지 35초 동안 인큐베이팅될 수 있다. 샘플 혼합물은 30초 미만 동안 인큐베이팅될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 약 30초 동안 약 42℃ 내지 약 43℃에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 블록(308)에서의 배합 및 블록(310)에서의 인큐베이팅은, 샘플 혼합물이 이미징 장치에서 처리되고 그러한 이미징 장치의 라인들이 플러싱 및/또는 세정되는 데 걸리는 시간과 대략적으로 동일한 시간이나 그보다 적은 시간 내에 완료된다. 이러한 방식으로, 제2 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅되고 있는 동안에 제1 샘플 혼합물이 이미징될 수 있다. 일단 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제2 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있다.
대안적인 실시 형태에서, 블록(308)에서의 배합 및 블록(310)에서의 인큐베이팅은 샘플 혼합물이 이미징 장치에서 처리되고 그러한 이미징 장치의 라인들이 플러싱 및/또는 세정되는 데 걸리는 시간의 2배 미만 내에 완료된다. 이러한 방식으로, 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 있는 동안에, 제2 샘플 혼합물이 이미징될 준비를 할 수 있고, 제3 샘플 혼합물 및 제4 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅되는 과정에 있을 수 있다. 일단 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제2 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있다. 제3 샘플 혼합물은 그의 배합 및 인큐베이팅을 종료하는 중일 수 있고, 제4 샘플 혼합물은 여전히 배합 및 인큐베이팅하는 중일 수 있다. 일단 제2 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제3 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있으며, 이 동안에 제4 샘플 혼합물은 배합 및 인큐베이팅을 종료하기 시작하고, 제5 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅을 시작한다. 이 과정은 샘플 혼합물을 연속적으로 이미징하도록 무한히 계속될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 입자 조영제 조성물(210)의 소정 실시 형태, 입자 조영제 조성물(210)을 샘플과 배합하는 소정 방식, 및 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 소정 방식의 조합을 통해 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
구체적으로는, 염색 조건 하에서 약 0.57 mM인 80% 순도 이상의 크리스탈 바이올렛, 23.3 중량%의 5PD-라이틱, 및 0.05%의 프로클린 300을 포함하는 입자 조영제 조성물(210)을 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있으며; 여기서 입자 조영제(210)는 샘플과 배합되어, 그 결과 입자 조영제 조성물의 농도가 샘플 혼합물의 중량 기준으로 약 15% 내지 약 20%가 되고; 생성된 샘플 혼합물은 약 30 내지 35초 동안 약 40℃ 내지 약 50℃에서 인큐베이팅된다.
소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 비교적 높은 소변 대 시약 비로 샘플들의 신속한 염색을 가능하게 한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 다양한 세포 성분, 핵엽(nuclear lobe), 및 과립 구조가 명백히 구분가능하도록 샘플들의 신속한 염색을 가능하게 한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 초생체(supravital) 염색에 적합하다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 혈청, 뇌척수액, 흉막액, 활액, 정액, 복수, 양수, 세척액(lavage fluid), 골수 흡인액, 침출물, 삼출물, 또는 혈액 샘플 중의 입자들의 세포내 내용물 특징부를 증강시키는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 원주, 세균, 상피, 및/또는 기생충을 염색하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는, 예를 들어 세포들 내의 1차 및 2차 과립의 감별 염색(differential staining)을 제공함으로써, 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성하는 데, 예컨대 1차 및 2차 과립의 감별 염색 또는 증강에 기반한 미성숙 과립구들의 하위범주화 및 그들의 수명(age) 결정에 도움을 주는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는, 백혈구의 범주화 및 하위범주화를 포함한, 백혈구, 상피 세포 및/또는 세균을 카운팅 및 특성화하기 위한 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 유형적 요소 식별이 용이해질 수 있다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 생명유지 및/또는 생존 세포들 및/또는 사실상 온전하게 유지된 구조를 갖는 세포들에서 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 세균, 기생충, 또는 트리코모나스를 염색하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 질환, 질병, 감염 및/또는 증후군을 식별, 예측, 진단, 예후하고/하거나 이들의 진단을 지원하는데, 그리고/또는 대상체가 치료에 반응성인지 비반응성인지를 모니터링하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 소변 원주 내의 세포 및/또는 세포 요소 내포물들을 염색하는 데 효과적인데, 이는 원주들의 하위범주화에 도움이 될 수 있다.
본 명세서에 기재된 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차에 의해 가능한 신속한 염색은 수동 또는 반자동 이미징 및/또는 분석 절차와 함께 사용될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 표 1에 열거된 바와 같이 구성된 입자 조영제 조성물(210)을 사용하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
[표 1]
도 4는 표 1에 기재된 입자 조영제 조성물(210)로 염색되고, 상기에 기재된 신속한 1 단계 염색 절차를 사용하여 염색된, 구체적으로는 표 1에 기재된 300 μL의 입자 조영제 조성물(210)을 시험관 내로 피펫으로 분주하고 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하고, 이후에 샘플 혼합물을 60℃의 수조에서 30초 동안 가온함으로써 염색된 소변 샘플로부터 선택된 입자들의 대표적인 예시이다. 적혈구, 백혈구, 편평 상피 세포, 원주, 결정, 및 효모가 시각적으로 감별가능하다.
많은 노력과 실험을 통해, 표 2에 열거된 바와 같이 구성된 입자 조영제 조성물(210)을 사용하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
[표 2]
많은 노력과 실험을 통해, 표 3에 열거된 바와 같이 구성된 입자 조영제 조성물(210)을 사용하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
[표 3]
많은 노력과 실험을 통해, 표 4에 열거된 바와 같이 구성된 입자 조영제 조성물(210)을 사용하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
[표 4]
일부 실시 형태에서, 본 발명의 입자 조영제 조성물에 의해 염색된 이미징된 세포들의 특징부들이 표 5에 기재되어 있다.
[표 5]
소정 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)은 안정성, 저장 용이성, 처분, 및/또는 제한된 독성을 위해 제형화된다.
초기 실험
하기의 실시예를 참고하여 설명된 바와 같이, 전술된 실시 형태들을 생성하기 위하여 다수의 염색 조성물 및 방법을 시험하고 변형시켰다.
초기 실시예 1에서는, 입자 조영제 조성물이 67 μM의 0.1% 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 및 332 μM의 NaPO4와 188 μM의 KPO4를 갖는 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 2.55 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 5에서 보여지는 바와 같이, 너무 밝았으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 2를 시도하였다.
후속 실시예 2에서는, 입자 조영제 조성물이 86 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 및 312 μM의 NaPO4와 177 μM의 KPO4를 갖는 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 2.55 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 6에서 보여지는 바와 같이, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 3을 시도하였다.
후속 실시예 3에서는, 입자 조영제 조성물이 크리스탈 바이올렛 염색제, 탈이온수, 및 추가 희석제를 포함하였는데, 이들은 각각 86 μM, 13.5% 및 1%의 농도로 소변 샘플과 혼합된다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 7에서 보여지는 바와 같이, 매우 밝게 염색되었으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 4를 시도하였다.
후속 실시예 4에서는, 입자 조영제 조성물이 크리스탈 바이올렛 염색제 및 탈이온수를 포함하였는데, 이들은 각각 86 μM 및 13.5%의 농도로 소변 샘플과 혼합된다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 8에서 보여지는 바와 같이, 담염(pale staining)을 나타내었으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 5를 시도하였다.
후속 실시예 5에서는, 입자 조영제 조성물이 150 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 30.6%의 탈이온수, 및 0.0037 mg/mL의 사포닌을 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 9에서 보여지는 바와 같이, 과도염색된 점액을 포함하였으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 6을 시도하였다.
후속 실시예 6에서는, 입자 조영제 조성물이 52 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 11.3%의 탈이온수, 및 0.0075 mg/mL의 사포닌을 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 10에서 보여지는 바와 같이, 너무 밝았으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 7을 시도하였다.
후속 실시예 7에서는, 입자 조영제 조성물이 100 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 9.4%의 탈이온수, 및 0.0075 mg/mL의 사포닌을 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 11에서 보여지는 바와 같이, 너무 밝았으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 8을 시도하였다.
후속 실시예 8에서는, 입자 조영제 조성물이 91 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 및 203 μM의 NaPO4와 115 μM의 KPO4를 갖는 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 12에서 보여지는 바와 같이, 과도염색된 점액을 포함하였으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 9를 시도하였다.
후속 실시예 9에서는, 입자 조영제 조성물이 150 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 7.3%의 탈이온수, 및 0.0075 mg/mL의 사포닌을 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 13에서 보여지는 바와 같이, 과도염색된 점액을 포함하였으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 10을 시도하였다.
후속 실시예 10에서는, 입자 조영제 조성물이 150 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 및 8.8%의 탈이온수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 14에서 보여지는 바와 같이, 불균일한 염색을 포함하였으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 11을 시도하였다.
후속 실시예 11에서는, 입자 조영제 조성물이 150 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 8.8%의 탈이온수, 0.0075 mg/mL의 사포닌, 및 0.03%의 글루테르알데하이드를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 15에서 보여지는 바와 같이, 과도염색된 점액을 포함하였으며, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 12를 시도하였다.
후속 실시예 12에서는, 입자 조영제 조성물이 86 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 50% 에리트롤라이즈(Erythrolyze)(베크만 컬터(Beckman Coulter)에 의해 제조됨), 및 312 μM의 NaPO4와 177 μM의 KPO4를 갖는 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 16에서 보여지는 바와 같이, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 13을 시도하였다.
후속 실시예 13에서는, 입자 조영제 조성물이 285 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 및 1040 μM의 NaPO4와 590 μM의 KPO4를 갖는 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.0 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 17에서 보여지는 바와 같이, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 14를 시도하였다.
후속 실시예 14에서는, 입자 조영제 조성물이 28 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 5PD-라이틱, 및 104 μM의 NaPO4와 0.059 μM의 KPO4를 갖는 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.9 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 18에서 보여지는 바와 같이, 입자들 및 세포들을 적절하게 감별하는 데 효과적이지 않았다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 15를 시도하였다.
후속 실시예 15에서는, 입자 조영제 조성물이 91 μM의 크리스탈 바이올렛 및 3.5%의 사포닌/피로황산칼륨 용액을 포함하였으며, 인산염 완충 식염수는 포함하지 않았다. 입자 조영제 조성물을 1.850 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 19에서 보여지는 바와 같이, 과도염색된 점액을 포함하였으며, 그 결과 염색이 효과적이지 않게 되었다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 16을 시도하였다.
후속 실시예 16에서는, 입자 조영제 조성물이 86 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 50% 에리트롤라이즈(베크만 컬터에 의해 제조됨), 및 312 μM의 NaPO4와 177 μM의 KPO4를 갖는 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 20에서 보여지는 바와 같이, 충분한 암도(darkness) 및 선명도로 염색되지 않는다. 염색을 개선하기 위해, 실시예 17을 시도하였다.
후속 실시예 17에서는, 입자 조영제 조성물이 86 μM의 크리스탈 바이올렛, 3.5%의 사포닌/피로황산칼륨 용액, 및 312 μM의 NaPO4와 177 μM의 KPO4를 갖는 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 입자 조영제 조성물을 1.7 mL의 소변 샘플과 혼합하였다. 결과는, 도 21에서 보여지는 바와 같이, 충분한 암도 및 선명도로 염색되지 않는다. 염색을 개선하기 위해, 본 명세서에 개시된 바와 같은 입자 조영제 조성물의 추가 실시 형태를 시도하였다.
다수의 초기 실시예에서, 입자 조영제 농축물은, 하기 표 6에 기재된 바와 같이, 트레할로스(TRE), 트라이메틸 아민 N-옥사이드(TMAO), 테트로닉 1107(T1107), 테트로닉 90R4(T90R4), 크리스탈 바이올렛(CV), 사프라닌 O(SO), 사포닌(SAP), 다이에틸 아민 클로라이드(DEA), 다이메틸 아민 클로라이드(DMA), 및 다이아졸리디닐 우레아(DU)의 많은 변형들을 포함하였다.
[표 6]
실시예 18 내지 실시예 76은 세포들을 구분하기 위한 최적의 결과를 제공하지 않았다.
본 명세서에 논의된 모든 특허, 특허 공보, 특허 출원, 학술지 기사, 서적, 기술 참고 문헌 등이 모든 목적들을 위해 그들 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 사용된 임의의 제목들은 단지 체계적인 목적을 위한 것이며 본 명세서 또는 특허청구범위를 어떠한 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
전술되거나 도면에 도시된 구성요소들뿐만 아니라 도시되거나 기술되지 않은 구성요소들 및 단계들의 상이한 배열들도 가능하다. 유사하게, 일부 특징들 및 하위조합들이 유용하며, 다른 특징들 및 하위조합들에 상관없이 채용할 수 있다. 본 발명의 실시 형태들은 예시적인 그러나 비제한적인 목적을 위해 기술되었으며, 대안적인 실시 형태들이 본 특허의 독자들에게 명백해질 것이다. 소정의 경우에, 방법 단계들 또는 동작들이 상이한 순서대로 수행 또는 실행될 수 있거나, 동작들이 추가, 삭제 또는 변형될 수 있다. 본 발명의 소정 태양에서는, 요소 또는 구조를 제공하거나 주어진 기능 또는 기능들을 수행하기 위하여, 단일 구성요소가 다수의 구성요소들로 대체될 수 있고, 다수의 구성요소들이 단일 구성요소로 대체될 수 있음이 이해될 수 있다. 그러한 치환이 본 발명의 소정 실시 형태를 실시하도록 작용하지 않게 될 경우를 제외하고는, 그러한 치환은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명은 전술되거나 도면에 도시된 실시 형태들로 제한되지 않으며, 하기의 특허청구범위의 범주로부터 벗어나지 않고서 다양한 실시 형태 및 변형이 이루어질 수 있다.
Claims (13)
- 자동화 입자 분석 시스템에서 이미징하기 위한 비뇨기 유체(urological fluid) 샘플의 입자들을 염색하기 위한 입자 조영제 조성물로서,
염색 조건 하에서 50 μM 내지 500 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet), 및
사포닌을 포함하는 5-부 감별(5-part differential) (5 PD) 라이틱 제제(lytic reagent)를 포함하는 투과화제(permeabilizing agent)를 포함하며,
상기 사포닌은 염색 조건 하에서 0.01 mg/L 내지 100 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 5 PD 라이틱 제제는 염색 조건 하에서 3.5 중량%의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 86 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물. - 제3항에 있어서,
적어도 제2인산나트륨 및 제1인산칼륨을 포함하는 인산염 완충 식염수를 추가로 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서, 항미생물제를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 86 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고;
상기 크리스탈 바이올렛은 80% 순도 이상인, 조성물. - 제6항에 있어서,
염화나트륨, 및
적어도 제2인산나트륨 및 제1인산칼륨을 포함하는 인산염 완충 식염수를 추가로 포함하는, 조성물. - 자동화 입자 분석 시스템에서 사용하여 이미징하기 위한 비뇨기 유체 샘플의 입자들을 처리하는 방법으로서,
입자 조영제 조성물과 상기 비뇨기 유체 샘플을 배합하여 샘플 혼합물로 하되, 입자 조영제 조성물의 최종 농도가 샘플 혼합물의 중량 기준으로 1% 내지 20%가 되는 샘플 혼합물로 하는 단계, 및
90초 미만 동안 20℃ 초과의 온도에서 상기 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함하며,
상기 입자 조영제 조성물은
염색 조건 하에서 50 μM 내지 500 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛, 및
사포닌을 포함하는 5-부 감별 (5 PD) 라이틱 제제를 포함하는 투과화제를 포함하고,
상기 사포닌은 염색 조건 하에서 0.01 mg/L 내지 100 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는, 방법. - 제8항에 있어서,
상기 5 PD 라이틱 제제는 염색 조건 하에서 3.5 중량%의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고;
상기 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 86 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고;
상기 입자 조영제 조성물의 최종 농도는 상기 샘플 혼합물의 중량 기준으로 10% 내지 20%이고;
상기 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계는 60초 미만 동안 30℃ 내지 50℃에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함하는, 방법. - 제9항에 있어서,
상기 입자 조영제 조성물의 최종 농도는 상기 샘플 혼합물의 중량 기준으로 15%이고;
상기 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계는 60초 미만 동안 30℃ 내지 50℃에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함하는, 방법. - 제10항에 있어서,
상기 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계는 30초 내지 35초 동안 40℃ 내지 50℃에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함하는, 방법. - 제11항에 있어서,
상기 크리스탈 바이올렛은 80% 순도 이상이고;
상기 입자 조영제 조성물은 항미생물제를 추가로 포함하는, 방법. - 제12항에 있어서,
상기 입자 조영제 조성물은 염화나트륨, 및 적어도 제2인산나트륨 및 제1인산칼륨을 포함하는 인산염 완충 식염수를 추가로 포함하는, 방법.
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