CN105143849B - 用于血液样品中粒子分析的动态范围扩展系统和方法 - Google Patents

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Abstract

为了分析包含至少两种类目的粒子的样品，诸如包含血细胞的样品，将受限于检测限值的粒子计数器与能区分粒子数量比率的分析仪诸如视觉分析仪及处理器耦合。第一类目的粒子可以超出检测范围限值存在而第二类目粒子在各自的检测范围限值内存在。通过所述粒子计数器测定所述第二类目的粒子的所述浓度。在所述分析仪上测定所述第一类目与所述第二类目的计数比率。基于所述比率和所述第二类目的粒子的所述计数或浓度，在所述处理器上计算所述第一类目的粒子的所述浓度。

Description

用于血液样品中粒子分析的动态范围扩展系统和方法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/799,152的优先权权益，并且也要求2014年3月17日提交的美国专利申请No.14/217,034的优先权，所述临时专利申请和所述专利申请的内容以引用方式并入本文。本专利申请还涉及2014年3月17日提交的美国专利申请No.14/215,834、14/216,533、14/216,339、14/216,811和14/217,034以及国际专利申请No.PCT/US2014/030928、PCT/US2014/030902、PCT/US2014/030850和PCT/US2014/030851，以及2014年3月18日提交的国际专利申请No.PCT/US2014/030942。这些提交专利中的每一者的内容均以引用方式并入本文。
背景技术
本公开涉及使用全自动化或部分自动化设备区分和定量样品中的粒子(诸如血细胞)的分析粒子(包括对流体样品中的粒子成像)的装置、系统、组合物和方法领域。本公开还涉及可用于分析得自受试者的样品中的粒子的粒子和/或细胞内细胞器配向液体(particle and/or intracellular organelle alignment liquid,PIOAL)，用于制备所述液体的方法，以及使用所述液体检测和分析粒子的方法。本发明还公开了可用于进行基于图像的生物流体样品分析的组合物、系统、设备和方法。本公开的组合物、系统、设备和方法还可用于对生物流体中的粒子(诸如红血细胞、网织红细胞、有核红血细胞、血小板)进行检测、计数和表征，以及用于基于图像和形态的白血细胞分类计数、分类、子分类、表征和/或分析。
血细胞分析是用于提供患者健康状态的概况的最常执行的医学检验之一。血液样品可从患者身体抽取并储存在含有抗凝血剂以防止凝结的试管中。全血样品通常包含三大类血细胞，包括红血细胞(红血球)、白血细胞(白血球)和血小板(凝血细胞)。每一类又可分成成员亚类。例如，五大类型或亚类的白血细胞(WBC)具有不同的形状和功能。白血细胞可包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。也存在红血细胞类型的亚类。样品中粒子的外观可根据病理状况、细胞成熟度和其他原因而不同。红血细胞亚类可包括网织红细胞和有核红血细胞。
估计RBC、WBC或血小板浓度的血细胞计数可以人工方式或使用自动分析仪进行。当血细胞计数以人工方式进行时，将一滴血作为薄层涂片而施加到显微镜载片上。传统上，已将人工检查显微镜载片上的干燥、染色血涂片用来确定五种类型的白血细胞的数量或相对量。已将组织学染料和染剂用于对细胞或细胞结构染色。例如，瑞氏染剂是已用于对血涂片染色以在光学显微镜下检查的组织学染剂。全血计数(CBC)可使用自动化分析仪获得，其中一种类型基于粒子或细胞沿着小管通过感测区时的阻抗或动态光散射而对血液样品中的不同粒子或细胞的数量计数。自动化CBC可采用多种仪器或方法区分不同类型的细胞，这些细胞包括RBC、WBC和血小板(PLT)，它们可单独地进行计数。例如，要求最小粒度或体积的计数技术可用于仅对大细胞计数。血液中的某些细胞(诸如异常细胞)可能无法正确计数或鉴定。彼此粘附的小细胞可能被错误地计数为大细胞。当怀疑计数有误时，可能需要对仪器结果进行人工复查以确认和鉴定细胞。
自动化血细胞计数技术可涉及流式细胞术。流式细胞术涉及提供窄的流路，以及对单个血细胞的通过进行感测和计数。流式细胞术方法已用于检测悬浮在流体中的粒子，诸如血液样品中的细胞，以及用于分析粒子的粒子类型、尺寸和体积分布以便推断出血液样品中相应粒子类型或粒子体积的浓度。分析悬浮在流体中的粒子的合适方法的例子包括沉降、微观表征、基于阻抗的计数和动态光散射。这些工具易出现测试误差。另一方面，准确表征粒子的类型和浓度在诸如医学诊断的应用中可能至关重要。
在基于成像的计数技术中，使用耦合到数字相机的显微镜物镜镜头捕获可能正在通过观察区的制备样品的像素数据图像。像素图像数据可用数据处理技术加以分析，并且还显示在监视器上。
具有流通池的自动化诊断系统的各方面在授予Turner等人的美国专利No.6,825,926以及均授予Kasdan等人的美国专利No.6,184,978、6,424,415和6,590,646中有所公开，它们据此以引用方式并入，如同在本文完整示出一样。
使用动态光散射或阻抗的自动化系统已用于获得全血计数(CBC)：总白血细胞计数(WBC)、红血细胞总细胞体积(RBC分布)、血红蛋白HGB(血红蛋白在血液中的量)；平均细胞体积(MCV)(红细胞的平均体积)；MPV(平均PLT体积)；血细胞比容(HCT)；MCH(HGB/RBC)(每个红血细胞的血红蛋白的平均量)；和MCHC(HGB/HCT)(细胞中血红蛋白的平均浓度)。自动化或部分自动化方法已用来便于白血细胞五部分分类计数和血液样品分析。
虽然此类目前已知的粒子分析系统和方法连同相关的医学诊断技术可为医生、临床医生和患者提供实际益处，但是仍需要进一步的改进。本发明的实施例对这些待解决的需求中的至少一些提供了解决方案
发明内容
本发明的实施例涵盖使用示例性动态或检测范围扩展技术定量存在于血液流体样品中的细胞或粒子的系统和方法。
例如，示例性实施例涵盖用于基于参数诸如粒子体积来校正与至少一个检测范围相关的不准确粒子计数的技术。通过操作如本公开中所述的装置，可准确地检测和测量浓度和/或体积在检测范围之外的粒子。
如本文所用，与本公开提及的粒子计数器相关的术语“检测限值”或“检测范围之外”应当理解为涵盖这样的范围，在该范围内粒子计数更准确和/或在该范围之外粒子计数较不准确或甚至不可操作。检测范围可包括检测上限和/或检测下限，通常表示为最大或最小浓度，但也可以表示为在给定精度公差内对粒子进行计数的最大或最小频率。因此，本发明的实施例涵盖用于血液流体样品的并行流通池和阻抗分析以定量稀少和/或大量物质计数的系统和方法。
检测范围可基于浓度(可包括局部浓度)和/或其他规定的一种或多种标准。例如，比正常PLT更小的粒子诸如血细胞或碎片(即，具有小于2μm的直径)可能难以在粒子计数器中准确地检测和计数。比正常白细胞更大的异常细胞(即，具有高于15μm的直径)可能难以在粒子计数器中准确地检测和计数。此外，在高浓度时，RBC和PLT可能难以准确地计数。即使在稀释后，RBC和PLT也可能聚集形成团块，导致使用粒子计数器得到的粒子计数的读数错误。此外，难以提供以低浓度存在于样品中的一些未成熟或异常血细胞的准确计数。
例如，通过使用本文所述的装置，测量的检测范围、WBC的检测上限在一些实施例中可扩展最多至每单位体积300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000。PLT的检测下限在一些实施例中可扩展到低于每μl 20,000、19,000、18,000,17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,500、9,000、8,500、8,000、7,500、7,000、6,500、6,000、5,500、5,000、4,500、4,000、3,500、3,000、2,500、2,000、1,500或1,000、或500。
相关地，示例性实施例涵盖用于通过区分在一个通道中检测到的不同类别(包括每种类别的成员)的粒子来校正粒子计数器中获得的不准确结果的技术。如本文所述，一些粒子具有类似体积或形态并且可在一个通道中检测到。例如，在被设计成检测WBC的一个通道中，“巨大”PLT、PLT聚集体或团块和有核RBC可被计数为“WBC”。此外，其他物质诸如未裂解细胞、冷球蛋白、海因茨小体和疟原虫可被计数为“WBC”，从而得出的WBC计数高于实际存在于样品中的WBC计数。相似地，高浓度的WBC和巨大PLT可被计数为“RBC”并导致RBC计数高于实际值。小细胞性红细胞、红细胞内含物、白细胞碎片、尘粒、溶血/裂细胞和甚至电子/电噪声的存在可导致PLT的计数高于实际值。另一方面，相同类别内的凝集和涂抹细胞或一种类别的细胞与另一种类别的混淆可导致粒子计数器上对应类别的细胞的计数不准确且偏低。
在本公开方法的一些方面，第一类目和/或亚类目的粒子以高于适用于第一类目和/或亚类目的粒子的检测范围的浓度存在于样品中；并且第二类目和/或亚类目的粒子在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围内存在于样品中。在本发明方法的其他方面，第一类目和/或亚类目的粒子以低于适用于第一类目和/或亚类目的粒子的检测范围的浓度存在于样品中，并且第二类目和/或亚类目的粒子在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围内存在于样品中。在其他方面，第一类目和/或亚类目的粒子包括异常血细胞、未成熟血细胞、成团血细胞、具有大于15微米的直径的血细胞、以及具有小于2微米的直径的血细胞中的至少一种类型；并且第二类目和/或亚类目的粒子包括白血细胞。
通过操作如本公开中所述的装置，在粒子计数器的一个通道中被错误计数为另一种类型的粒子的那些粒子可单独并准确地进行测量。示例性方法也可用于测定不能在粒子计数器上准确地检测的粒子的粒子计数或浓度。这些粒子包括但不限于在正常体积范围之外的粒子和/或以在粒子计数器上可检测的浓度的高端或低端附近或之外的浓度存在的粒子。相关地，通过操作如所述的系统装置(特别包括粒子计数器和图像分析仪)连同如本公开中所述的示例性粒子对比剂组合物和PIOAL，在粒子计数器的一个通道中可能被错误计数为另一种类型的粒子的一些粒子可单独并准确地进行测量。本发明的方法也可在一些情况下用于测定不能在粒子计数器上准确地检测的粒子的粒子计数或浓度。这些粒子包括但不限于在检测范围之外的粒子和/或以在粒子计数器上可检测的浓度的高端或低端附近或之外的浓度存在的粒子。这通过应用得自图像分析仪的信息来进行。
总而言之，通过操作如本文所公开的装置，例如使用示例性粒子对比剂组合物和PIOAL鞘流体，可在粒子计数器的标称检测范围之外的检测范围内进行包含粒子诸如血细胞或其他碎片的样品的分析。相关地，使用如本文所述的系统和组合物时，可在基于参数诸如浓度或粒子体积的扩展检测范围内进行血液流体样品的分析。扩展检测范围可在粒子计数器的检测范围之外。
在一些实施例中，系统或装置可包括粒子计数器。在其他实施例中，该粒子计数器具有至少一个检测范围。在某些方面，分析仪和处理器可被配置成提供另外的信息以校正与粒子计数器相关的测试误差，并且还测定样品中不同类目和/或亚类目的粒子的准确粒子计数或浓度。如果可从粒子计数器和分析仪获得关于在粒子的至少两种类目和/或亚类目内的计数、一个或多个比率和/或分布的信息，则可校正来自粒子计数器的计数、分类和/或子分类的误差，并且可得到最初未被粒子计数器报告的计数、类目和/或亚类目。
本发明的实施例涵盖使用示例性动态或检测范围扩展技术定量存在于血液流体样品中的细胞或粒子的系统和方法。
例如，示例性实施例涵盖用于基于参数诸如粒子体积来校正与至少一个检测范围相关的不准确粒子计数的技术。通过操作如本公开中所述的装置，可准确地检测和测量浓度和/或体积在检测范围之外的粒子。
如本文所用，与本公开提及的粒子计数器相关的术语“检测限值”或“检测范围之外”应当理解为涵盖这样的范围，在该范围内粒子计数更准确和/或在该范围之外粒子计数较不准确或甚至不可操作。检测范围可包括检测上限和/或检测下限，通常表示为最大或最小浓度，但也可以表示为在给定精度公差内对粒子进行计数的最大或最小频率。因此，本发明的实施例涵盖用于血液流体样品的并行流通池和阻抗分析以定量稀少和/或大量物质计数的系统和方法。
检测范围可基于浓度(可包括局部浓度)和/或其他规定的一种或多种标准。例如，比正常PLT更小的粒子诸如血细胞或碎片(即，具有小于2μm的直径)可能难以在粒子计数器中准确地检测和计数。比正常白细胞更大的异常细胞(即，具有高于15μm的直径)可能难以在粒子计数器中准确地检测和计数。此外，在高浓度时，RBC和PLT可能难以准确地计数。即使在稀释后，RBC和PLT也可能聚集形成团块，导致使用粒子计数器得到的粒子计数的读数错误。此外，难以提供以低浓度存在于样品中的一些未成熟或异常血细胞的准确计数。
例如，通过使用本文所述的装置，测量的检测范围、WBC的检测上限在一些实施例中可扩展最多至每单位体积300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000。PLT的检测下限在一些实施例中可扩展到低于每μl 20,000、19,000、18,000,17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,500、9,000、8,500、8,000、7,500、7,000、6,500、6,000、5,500、5,000、4,500、4,000、3,500、3,000、2,500、2,000、1,500或1,000、或500。
相关地，示例性实施例涵盖用于通过区分在一个通道中检测到的不同类别(包括每种类别的成员)的粒子来校正粒子计数器中获得的不准确结果的技术。如本文所述，一些粒子具有类似体积或形态并且可在一个通道中检测到。例如，在被设计成检测WBC的一个通道中，“巨大”PLT、PLT聚集体或团块和有核RBC可被计数为“WBC”。此外，其他物质诸如未裂解细胞、冷球蛋白、海因茨小体和疟原虫可被计数为“WBC”，从而得出的WBC计数高于实际存在于样品中的WBC计数。相似地，高浓度的WBC和巨大PLT可被计数为“RBC”并导致RBC计数高于实际值。小细胞性红细胞、红细胞内含物、白细胞碎片、尘粒、溶血/裂细胞和甚至电子/电噪声的存在可导致PLT的计数高于实际值。另一方面，相同类别内的凝集和涂抹细胞或一种类别的细胞与另一种类别的混淆可导致粒子计数器上对应类别的细胞的计数不准确且偏低。
在本公开方法的一些方面，第一类目和/或亚类目的粒子以高于适用于第一类目和/或亚类目的粒子的检测范围的浓度存在于样品中；并且第二类目和/或亚类目的粒子在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围内存在于样品中。在本发明方法的其他方面，第一类目和/或亚类目的粒子以低于适用于第一类目和/或亚类目的粒子的检测范围的浓度存在于样品中，并且第二类目和/或亚类目的粒子在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围内存在于样品中。在其他方面，第一类目和/或亚类目的粒子包括异常血细胞、未成熟血细胞、成团血细胞、具有大于15微米的直径的血细胞、以及具有小于2微米的直径的血细胞中的至少一种类型；并且第二类目和/或亚类目的粒子包括白血细胞。
通过操作如本公开中所述的装置，在粒子计数器的一个通道中被错误计数为另一种类型的粒子的那些粒子可单独并准确地进行测量。示例性方法也可用于测定不能在粒子计数器上准确地检测的粒子的粒子计数或浓度。这些粒子包括但不限于在正常体积范围之外的粒子和/或以在粒子计数器上可检测的浓度的高端或低端附近或之外的浓度存在的粒子。相关地，通过操作如所述的系统装置(特别包括粒子计数器和图像分析仪)连同如本公开中所述的示例性粒子对比剂组合物和PIOAL，在粒子计数器的一个通道中可能被错误计数为另一种类型的粒子的一些粒子可单独并准确地进行测量。本发明的方法也可在一些情况下用于测定不能在粒子计数器上准确地检测的粒子的粒子计数或浓度。这些粒子包括但不限于在检测范围之外的粒子和/或以在粒子计数器上可检测的浓度的高端或低端附近或之外的浓度存在的粒子。这通过应用得自图像分析仪的信息来进行。
总而言之，通过操作如本文所公开的装置，例如使用示例性粒子对比剂组合物和PIOAL鞘流体，可在粒子计数器的标称检测范围之外的检测范围内进行包含粒子诸如血细胞或其他碎片的样品的分析。相关地，使用如本文所述的系统和组合物时，可在基于参数诸如浓度或粒子体积的扩展检测范围内进行血液流体样品的分析。扩展检测范围可在粒子计数器的检测范围之外。
在一些实施例中，系统或装置可包括粒子计数器。在其他实施例中，该粒子计数器具有至少一个检测范围。在某些方面，分析仪和处理器可被配置成提供另外的信息以校正与粒子计数器相关的测试误差，并且还测定样品中不同类目和/或亚类目的粒子的准确粒子计数或浓度。如果可从粒子计数器和分析仪获得关于在粒子的至少两种类目和/或亚类目内的计数、一个或多个比率和/或分布的信息，则可校正来自粒子计数器的计数、分类和/或子分类的误差，并且可得到最初未被粒子计数器报告的计数、类目和/或亚类目。
在一个方面，本发明的实施例涵盖用于测量血液流体样品中的第一细胞类型的数量的方法。样品可包括第二细胞类型。示例性方法包括通过使第一体积流过血液学细胞计数器来测定样品的第一体积中的第二细胞类型的群体；通过将样品的第二体积注入流通池内流动的鞘流体中以便提供具有厚度和大于厚度的宽度的样品料流，从而采集第一数量的第一类型细胞和第二数量的第二细胞类型的图像，所述采集的图像是沿着横越样品料流的厚度的图像路径采集的；使用所述采集的图像测定第一数量的第一细胞类型与第二数量的第二细胞类型的比率；以及使用所述比率和第二细胞类型的群体计算样品中的第一细胞类型的细胞数量量度。在一些情况下，细胞数量量度包括血液流体样品中的第一细胞类型的细胞浓度。在一些情况下，细胞数量量度包括血液流体样品中的第一细胞类型的细胞计数。在一些情况下，细胞计数器具有与对第一细胞类型计数相关的第一精确度和与对第二细胞类型计数相关的第二精确度，第二精确度优于第一精确度。在一些情况下，血液学细胞计数器具有所需精确度范围，所需精确度范围在第一体积中的细胞的最小群体与第一体积中的细胞的最大群体之间延伸，其中该体积中的第二细胞类型的所测定群体在所需精确度范围之内，并且其中该样品的第一细胞类型的所计算细胞数量量度在所需精确度范围之外。在一些情况下，方法包括由于第一体积流过血液学细胞计数器而测定样品的第一体积中的第一细胞类型的群体，其中第一体积中的第一细胞类型的所测定群体高于或低于第一细胞类型的所需精确度范围，并且不同于第一细胞类型的所计算细胞数量量度。在一些情况下，第一细胞类型的所测定群体为零。在一些情况下，第一细胞类型的所测定群体大于零。在一些情况下，血液学细胞计数器包括响应于第二类型细胞流过细胞计数器而检测电阻抗的变化的传感器机构。在一些情况下，血液学细胞计数器包括响应于第二类型细胞流过细胞计数器而检测光路的遮挡的传感器机构。在一些情况下，血液学细胞计数器具有第一细胞类型的最小可检测浓度限值和最大可检测浓度限值，以及第二细胞类型的最小可检测浓度限值和最大可检测浓度限值，第二细胞类型的所测定群体基于高于第二细胞类型最小限值并低于最大限值的第二细胞类型的所检测浓度参数，并且第一细胞类型以低于第一细胞类型最小限值或高于最大限值的浓度存在。在一些情况下，血液学细胞计数器具有第一细胞类型的最小可检测体积限值和最大可检测体积限值，以及第二细胞类型的最小可检测体积限值和最大可检测体积限值，第二细胞类型的所测定群体基于高于第二细胞类型最小限值并低于最大限值的第二细胞类型的所检测体积参数，并且第一细胞类型以低于第一细胞类型最小限值或高于最大限值的体积参数存在。在一些情况下，血液学细胞计数器具有第一细胞类型的最小可检测尺寸限值和最大可检测尺寸限值，以及第二细胞类型的最小可检测尺寸限值和最大可检测体积尺寸，第二细胞类型的所测定群体基于高于第二细胞类型最小限值并低于最大限值的第二细胞类型的所检测尺寸参数，并且第一细胞类型以低于第一细胞类型最小限值或高于最大限值的尺寸参数存在。在一些情况下，样品第一体积中的第二细胞类型的群体的测定包括将第一细胞类型的细胞和第二细胞类型的细胞分组在一起。在一些情况下，方法包括使用比率和第二细胞类型的群体计算样品中的第二细胞类型的细胞数量量度。在一些情况下，样品的第一体积中的第二细胞类型的群体的测定包括将第一细胞类型的细胞和第二细胞类型的细胞分组在一起，其中方法还包括由于第一体积流过血液学细胞计数器而测定样品的第一体积中的第一细胞类型的群体，并且其中样品中第一细胞类型的细胞数量量度的计算使用比率、第二细胞类型的群体和第一细胞类型的群体。
在另一个方面，本发明的实施例涵盖用于测量血液流体样品中的第一细胞类型的数量的系统。样品可包括第二细胞类型。示例性系统包括血液学细胞计数器，所述血液学细胞计数器具有通道和输出口，所述输出口操作地耦合到通道以便产生指示流过通道的样品的第一体积中的第二细胞类型的群体的信号；流通池，所述流通池被配置成有利于样品料流的流动，所述样品料流具有样品的第二体积和鞘流体，并且具有厚度和大于所述厚度的宽度；成像装置，所述成像装置被配置成采集第一数量的第一类型细胞和第二数量的第二类型细胞的图像，所述采集的图像是沿着横越样品料流的厚度的图像路径采集的；处理器；图像分析模块，所述图像分析模块包括体现机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便使用采集的图像测定第一数量的第一细胞类型与第二数量的第二细胞类型的比率；以及细胞数量模块，所述细胞数量模块包括体现机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便使用所述比率和指示第二细胞类型的群体的信号来计算样品中的第一细胞类型的细胞数量量度。在一些情况下，处理器耦合到血液学细胞计数器以接收指示第二细胞类型的群体的信号。在一些情况下，处理器耦合到成像装置以接收所采集的图像。在一些情况下，流通池和成像装置是执行组合式粘度和几何流体聚焦以对血液流体样品中的细胞进行成像的血液学分析仪的部件。在一些情况下，鞘流体和血液流体样品之间的粘度差与流通池的流路尺寸的缩减段相结合，能有效地在流通池的图像捕获位点处流体聚焦样品料流。
当结合附图来考虑时通过参考下文的具体实施方式，本发明实施例的上述特征和许多其他特征以及伴随的优点将会变得显而易见和得到进一步地理解。
附图说明
图1是以部分截面表示的且未按比例绘制的示意图，显示了用于使用数字图像处理进行样品图像分析的示例性流通池、自聚焦系统和高光学分辨率成像设备的各操作方面。
图3A和图3B提供了根据本发明实施例的流通池的附加截面图。
图2是根据示例性实施例的流通池的透视图。
图3是沿着图2所示的流通池的线3-3的纵向正中截面图。
图3A和图3B提供了根据本发明实施例的流通池的附加截面图。
图4示出了根据本发明实施例的成像系统的各方面。
图4A、图4B描绘了根据本发明实施例的流通池的各方面。
图4A-1和图4A-2分别描绘了根据本发明实施例在插管出口和图像捕获位点的流通池内的鞘流体(例如PIOAL)包层和样品流体料流尺寸的横截面视图。
图4K和4L示出了根据本发明实施例的流过流通池的图像捕获位点的样品料流。
图4O示出了根据本发明实施例的使用PIOAL获得的图像与使用非PIOAL鞘流体获得的图像的比较。
图4P和4Q示出了根据本发明实施例的使用标准鞘流体和示例性PIOAL流体获得的图像的比较。
图5是根据本发明实施例的框图，示出了用于实现在血液样品中进行粒子分析的动态或检测范围扩展的系统和方法的另外方面。
图6示出了根据本发明实施例的用于分析样品的示例性装置。
图6A描绘了根据本发明实施例的示例性计数器或计数模块的各方面。
图6B描绘了根据本发明实施例的模块系统的各方面。
图7描绘了根据本发明实施例的用于测量血液流体样品中的第一细胞类型的数量的系统和方法的各方面。
图8示出了根据本发明实施例的用于分析包含粒子的样品的方法。
图9示出了根据本发明实施例的测定两个亚类目的粒子的浓度的示例性方法。
图10A、10B、10C和10D示出了根据本发明实施例的多种类目的粒子的检测。
具体实施方式
本公开涉及用于分析包含粒子的样品的装置、系统、组合物和方法。在一个实施例中，本发明涉及包括分析仪(可以为例如视觉分析仪)的自动化粒子成像系统。在一些实施例中，视觉分析仪还可以包括便于图像的自动化分析的处理器。
根据本公开，提供了包括视觉分析仪的系统以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。该系统可用于例如表征生物流体中的粒子，诸如检测和定量红血球、网织红细胞、有核红血细胞、血小板和白血细胞，包括白血细胞分类计数、分类及子分类和分析。还可以想到其他类似用途，诸如表征来自其他流体的血细胞。
辨别血液样品中的血细胞是主题特别适合的示例性应用。将样品通过自动化技术制备并作为薄带形样品料流呈递给高光学分辨率成像设备，以在带形样品料流流经视野的同时周期性地成像。粒子(诸如血细胞)的图像可使用像素图像数据编程的处理技术完全自动地或以有限的人工辅助而彼此区分、分类、子分类和计数，以鉴定和计数细胞或粒子。除了细胞图像(其可在粒子的异常或关键特征的情况下存储和供使用)之外，输出数据还包括所记录的样品图像中区分开的各特定类目和/或亚类目的细胞或粒子的出现次数。
可进一步处理存在于每个图像中的不同粒子的计数，例如用于积累整体样品中每种区分开的类目和/或亚类目的细胞的准确且统计上显著的比率。可稀释用于视觉辨别的样品，但在稀释的样品中表示各类目和/或亚类目中的细胞的比例，特别是在已处理多个图像之后。
本文所公开的装置和方法可用于基于视觉差别而辨别和定量样品中的细胞。样品可以为生物样品，例如包含白血细胞的体液样品，包括但不限于血液、血清、骨髓、灌洗液、渗漏液、渗出液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液和羊水。在一些实施例中，样品可以为实体组织样品，例如，已进行了处理而产生细胞悬液的活检样品。样品也可以为通过处理粪便样品而得到的悬液。样品也可以为包含粒子的实验室或生产线样品，诸如细胞培养样品。术语样品可用于指代得自患者或实验室的样品或其任何级分、部分或等分试样。样品可在一些过程中进行稀释、分成多个部分或进行染色。
在一个方面，本公开的系统、组合物和方法提供流动中的细胞的令人惊讶的高质量的图像。在一个方面，视觉分析仪可用于本公开的方法以提供自动化的基于图像的WBC分类计数。在某些实施例中，本公开的方法涉及视觉差别(包括形态特征和/或异常)的自动化鉴定，以用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染和/或对治疗响应还是无响应进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断。该系统在一些实施例中还可以包括粒子计数器。应用包括对流体样品(诸如血液样品)中的细胞进行分类和/或子分类以及计数。也设想了用于对另外类型的粒子和/或其他流体样品中的粒子进行计数的其他类似的用途。本发明的系统、组合物和方法可用于采用任何合适的自动化粒子识别算法进行实时分类及子分类以及图像观察。可存储各样品的捕获图像以日后观察。
在另一方面，本发明的装置、组合物和方法提供令人惊讶更准确的基于图像的细胞分类及子分类和标记，与使用目前的自动化分析仪时的人工复查率相比，所述标记降低人工复查率。所述系统、组合物和方法降低人工复查率并允许在仪器上进行人工复查。此外，本公开的系统、组合物和方法还降低在自动化分析期间标记为需要人工复查的样品的百分比。
本公开还涉及用于将全血计数(CBC)计数器与分析仪(诸如视觉分析仪)相结合的系统、方法和组合物，以便得到CBC以及基于图像的扩展白血细胞分类计数和基于图像的扩展血小板计数，从而延伸血小板计数的有效检测范围。
因此，在一些实施例中，本公开提供用于分析包含粒子(例如，血细胞)的样品的装置和方法。根据本公开，提供视觉分析仪以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。在一些实施例中，视觉分析仪包括流通池和自聚焦部件，其中使包含所关注粒子的液体样品流过具有观察孔的流通池，而耦合到物镜镜头的相机通过所述观察孔捕获粒子的数字图像。流通池耦合到样品流体源，诸如经稀释和/或处理的血液样品或如本文所述的其他体液样品，并耦合到透明鞘流体或粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)源。
在一个实施例中，所述装置还包括具有至少一个检测范围的粒子计数器，以及分析仪和处理器。所述分析仪和处理器被配置成提供另外的信息以校正与粒子计数器相关的计数、分类和子分类误差，并且还确定样品中不同类目和/或亚类目的粒子的准确粒子计数或浓度。
本公开在进行基于图像的样品分析中提供可用于粒子和/或细胞内细胞器配向的方法和组合物。在一些实施例中，本公开涉及用于组合式计数和成像系统的方法和组合物，该系统能够执行全血计数(WBC)和基于图像的扩展白血细胞(WBC)分类，而能够鉴定并计数细胞类型，诸如WBC、RBC和/或血小板，包括例如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、网织红细胞、有核RBC、母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞，并提供WBC计数和形态、红血细胞(RBC)计数和形态以及血小板(PLT)计数和形态的基于图像的信息。
在其他实施例中，本公开涉及可用于如本文所述的基于图像的粒子分析的PIOAL。血液样品中的细胞分类和/或子分类计数在本公开中用作可以分析的样品的分类的非限制性例子。在一些实施例中，存在于样品中的细胞还可以包括细菌或真菌细胞以及白血细胞、红血细胞和/或血小板。在一些实施例中，可以分析得自组织或抽吸物的粒子悬液。
辨别血液样品中的血细胞是主题特别适合的示例性应用。将样品通过自动化技术制备并作为带形样品料流呈递给高光学分辨率成像设备以在样品流经视野的同时周期性地成像。粒子(诸如血细胞)的图像可使用像素图像数据编程的处理技术完全自动地或以有限的人工辅助而彼此区分、分类、子分类和/或计数，以鉴定和计数细胞或粒子。除了细胞图像(其可在异常或关键特征的情况下存储和供使用)之外，输出数据还包括所记录的样品图像中区分开的各特定类目和/或亚类目的细胞或粒子的出现次数。可进一步处理存在于每个图像中的不同粒子的计数，例如用于积累整体样品中每种区分开的类目和/或亚类目的细胞的准确且统计上显著的成比例比率或其函数。也可高度稀释用于视觉区别的样品，但在稀释样品的分布中表示各类目和/或亚类目中的细胞的比例，特别是在已处理多个图像之后。
在一些方面，样品以自动化方式呈递、成像和分析。就血液样品而言，样品可用水或盐水溶液进行充分稀释，这降低在未稀释或稀释不够的样品中一些细胞的视野可能被其他细胞隐藏的程度。细胞可用增强一些细胞方面的对比度的试剂加以处理，例如使用透化剂使细胞膜为可渗透的，以及使用组织学染剂粘附并揭示特征，诸如颗粒和细胞核。在一些实施例中，可能有利的是，对样品的等分试样进行染色以用于对包括网织红细胞、有核红血细胞和血小板的粒子进行计数和表征，以及用于白血细胞分类、表征和分析。在其他实施例中，包含红血细胞的样品可在引入流通池并成像之前进行稀释。
用于样品稀释、透化和组织学染色的样品制备装置和方法的详情一般使用由一个或多个可编程控制器操作的精密泵和阀门来实现，并且不是本公开的重点。例子可见于转让给国际遥感成像系统公司(International Remote Imaging Systems,Inc.)的专利，诸如关于可编程控件的US 7,319,907。同样，用于借助其属性(诸如相对尺寸和颜色)而区分某些细胞类目和/或亚类目的技术可见于与白血细胞相关的US 5,436,978。这些专利的公开内容据此以引用方式并入。
为了提高对诸如细胞的粒子进行分类和/或子分类的能力、速度和有效性，有利的是提供清晰的高质量血细胞图像以通过数据处理系统进行自动化分析。根据本公开，将制备的样品料流以在流通池的相对壁之间具有稳定位置的薄带形式布置。样品料流的定位且其变平成薄带形状可通过引入流通池的PIOAL的层之间的流动而实现，所述PIOAL与样品流体的粘度不同并流过对称流动通道。
PIOAL具有合适的粘度和密度，并且在样品引入流通池时的流速使得样品流体变平为薄带。带形样品料流与PIOAL一起被携带通过观察孔的前面，其中物镜镜头和光源被布置成允许观察带形样品料流。将样品流体引入，例如，在PIOAL的流路对称变窄的点处注入。因此，样品流体料流变平并被拉伸成薄带。本公开的PIOAL可作为鞘流体与本公开的任何视觉分析仪一起使用。在一个实施例中，可将PIOAL引入流通池的末端以将样品流体一起带向排放口。
观察区中的带形样品料流的尺寸受PIOAL流路的几何变薄以及样品流体和PIOAL的差异线速度的影响，导致带形样品料流的变薄和拉伸。样品与PIOAL的初始差异线速度可在0.5:1至5:1的范围内。PIOAL流路横截面可通过降低深度而变薄约10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、105:1、110:1、115:1、125:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1或200:1的因子。在一个实施例中，几何变薄为40:1。在一个实施例中，几何变薄为30:1。所考虑的因素为穿过流通池的通过时间，样品通量的所需速率，实现与粒子尺寸相当的带形样品料流厚度，获得粒子和细胞器的配向，实现粒子的焦点内内容物，在操作限值内平衡压力、流动和粘度，优化带形样品料流厚度，获得所需的线速度，可制造性考量，以及所需的样品和PIOAL体积。
可对插管的长度和容积以及横截面变平进行选择以缩短样品流动不稳定的时期，从而提高通量。在一些实施例中，流动不稳定的时期可小于约3、2.75、2.5、2.25、2、1.75、1.5、1.25或小于约1秒。较小的插管容积也可缩短所述时间并减少在样品运行之间清洗插管所需的稀释剂的体积。在一些实施例中，穿过流通池的通过时间为1、2、3或4秒，或那些时间中任何两个之间的任何范围。在一些实施例中，该通过时间可小于4、3或2秒。
样品流体和PIOAL的粘度和流速以及流通池的轮廓被布置成使得PIOAL流变平并将样品流拉伸成平带，所述平带在可靠位置一致地穿过观察区。样品流体料流可被压缩成大约2至3μm的流体流厚度。若干血细胞类型都具有大于料流厚度的直径。在平行于流动方向的方向上的剪切力导致在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中粒子的图像投影增加和/或导致粒子内结构(例如，细胞内结构、细胞器或小叶)定位、重定位和/或更好地定位成基本上平行于流动方向。高光学分辨率成像设备视野深度最多为7μm，例如1-4μm。
与带形样品料流一起携带的PIOAL的流动横截面穿过观察孔(物镜镜头被引导穿过其中)前面的观察区时保持一致。物镜镜头可以是高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的物镜部件。带形样品料流在流通池内的已知且可重复的位置处(例如，在离流通池的两个壁的已知且可重复的距离处)顺着横跨观察区的路径流动，并在下游排放。
当带形样品料流被携带穿过观察孔前面的观察区时，来自样品中的粒子的光学信息通过分析仪中的检测段检测，从而生成来自样品中所含粒子/细胞的数据。使用该分析仪允许对样品中所含的细胞和/或粒子进行捕获、处理、分类及子分类和计数。PIOAL液体可通过添加粘度改性剂、缓冲剂、pH调节剂、抗微生物剂、离子强度改性剂、表面活性剂和/或螯合剂而制备。本公开中的分析仪的示例性功能部件和/或特征可包括例如采集和/或处理来自图像分析、样品染色处理、图像处理和/或粒子图像鉴定、计数和/或分类及子分类的数据的能力。
在一个实施例中，本公开基于以下令人惊讶且出人意料的发现：在PIOAL中添加适量的粘度剂明显改善流通池中的粒子/细胞配向，从而使焦点内细胞或细胞组分的百分比更高，以及使流动中的细胞和/或粒子的图像的质量更高。添加粘度剂增加对细胞(比如RBC)的剪切力，这改善在基本上平行于流动方向的平面中的细胞配向，从而导致图像优化。这还导致粒子内结构(诸如细胞内结构、细胞器或小叶)基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位，从而导致图像优化。粘度剂还减少细胞的不良配向，所述细胞通常为直径比流动料流小的细胞，但不限于这些细胞。
直径比流动料流小的细胞(例如，红血细胞)的配向可通过例如增大PIOAL的粘度或通过增大流速比而获得。这导致RBC平行于流动方向配向。在一些实施例中，RBC不良配向的减少和/或RBC配向的增加通过增大PIOAL的粘度而实现。
带形样品料流厚度可受样品流体和PIOAL的相对粘度和流速的影响。样品源和/或PIOAL源(例如，包括精密容积泵)可被配置成以受控的流速提供样品和/或PIOAL以优化带形样品料流的尺寸，即作为至少与高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的视野一样宽的薄带。
与带形样品料流一起携带的PIOAL的流动横截面穿过观察孔(高光学分辨率成像设备被引导穿过其中)前面的观察区时保持一致。带形样品料流在离流通池前壁和后壁任一者的已知且可重复的距离处顺着横跨观察区的路径流动，并在其下游排放。
术语高光学分辨率成像设备可包括能够获得粒子图像的设备，所述图像具有充分的视觉差别以区分形态特征和/或变化。示例性高光学分辨率成像设备可包括光学分辨率为1微米或更低的设备，包括例如0.4至0.5微米，诸如0.46微米。
在一些实施例中，在本发明的任何组合物和/或方法中获得的图像可为数字化图像。在一些实施例中，所得的图像为显微镜图像。在某些实施例中，所述图像可以人工方式获得。在其他实施例中，获得图像的程序的至少一部分为自动化的。在一些实施例中，使用包括流通池、高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备(任选地具有自聚焦特征)的视觉分析仪获得图像。
在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或细胞核组分相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的颗粒组分和/或其他形态特征相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或颗粒组分相关的信息。颗粒和/或细胞核图像和/或特征独立地或彼此相结合地为细胞分类及子分类决定性的。
在本发明方法的一个方面，与粒子对比剂组合物接触和/或成像的细胞为有核红血细胞。在又一个方面，本发明的方法涉及用于执行基于图像的红血细胞分类及子分类的方法，其包括：a)对红血细胞的一部分成像；以及b)确定所成像的红血细胞的形态。如本文所用，红血细胞(RBC)可包括例如正常或异常的红血细胞、网织红细胞、有核红血细胞和/或疟疾感染的细胞。在一些实施例中，使用本公开的装置(诸如包括粒子计数器、视觉分析仪和处理器的装置)进行成像。
如本文所用，示例性全血计数(CBC)可包括医生或其他医疗专业人员通常需要的测试板，其提供关于患者血液样品中的粒子和/或细胞的信息。在血流中循环的示例性细胞可通常分成三种类型：包括但不限于例如白血细胞(例如，白血球)、红血细胞(例如，红血球)和血小板(例如，凝血细胞)。
如本文所用，异常高或低的计数可指示存在疾病、失调和/或病症。因此，CBC是在医学中常常进行的血液检验中的一种，因为其可提供患者一般健康状态的概况。因此，CBC通常在年度体检期间进行。
如本文所用，通常采血师从受试者采集血液样品，而血液一般被抽入通常容纳有抗凝剂(例如EDTA，有时为柠檬酸盐)以防止其凝结的试管。然后将样品转运到实验室。有时，用巴斯德吸管穿刺手指而抽吸血液以通过自动化计数器立即处理。在一个实施例中，在粒子被包封在鞘流体或PIOAL中的同时采集粒子图像。在某些实施例中，可在显微镜下在用患者血液的样品制作的载玻片上观察血液样品(血膜或外周涂片)。在某些实施例中，通过自动化分析仪进行全血计数。
如本文所用，一般来讲，血液分析仪可通过窄管路抽吸非常少量的样本。传感器可检测通过管路的细胞的计数和/或数量，并且可鉴定细胞的类型。示例性传感器可包括光(例如，可见、UV或IR)和/或电阻抗的检测器。示例性检测参数可包括尺寸、体积和/或细胞特征。在某些实施例中，传感器可检测约200nm至约10000nm范围内的波长谱中的可见和不可见光。在某些实施例中，传感器可检测约380nm与约760nm之间的波长。
如本文所用，血液计数的数据/参数包括例如总红血细胞；血红蛋白-血液中血红蛋白的量；血细胞比容或红细胞压积(PCV)；平均红细胞体积(MCV)-红细胞的平均体积(基于该值是高于还是低于预期正常范围而将贫血分类成小红细胞性或大红细胞性贫血。可影响MCV的其他病症包括地中海贫血、网状细胞过多症和酒精中毒)；平均红细胞血红蛋白(MCH)-每个红血细胞的血红蛋白的平均量，单位为微微克；平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)-细胞中的血红蛋白的平均浓度；红血细胞分布宽度(RDW)-RBC群体的细胞体积的变化；总白血细胞；中性粒细胞(可指示细菌感染，通常在急性病毒感染中增加)。由于细胞核的分段式外观，中性粒细胞有时称为“seg”(分段中性粒细胞)。不太成熟的中性粒细胞的细胞核不分段，但具有带式或细长形状。不太成熟的中性粒细胞(最近从骨髓释放到血流中的那些)称为“band”(带状中性粒细胞)。血液计数的其他数据/参数也可包括例如淋巴细胞(例如，在一些病毒感染诸如腺热的情况下以及在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中增加，或因HIV感染而减少)；单核细胞(可在细菌感染、肺结核、疟疾、落基山斑疹热、单核细胞性白血病、慢性溃疡性结肠炎和局限性肠炎中增加)；嗜酸性粒细胞(例如，在寄生虫感染、哮喘或变态反应中增加)；嗜碱性粒细胞(例如，在骨髓相关病症诸如白血病或淋巴瘤中增加)。
如本文所用，血液计数的数据/参数还可以包括例如与血小板相关的数据，包括血小板数、其在血液中的尺寸和尺寸范围的相关信息；平均血小板体积(MPV)-血小板平均尺寸的度量。
在本发明的方法的另一个方面，与粒子对比剂组合物接触和/或成像的细胞为异常细胞，诸如疟疾感染的细胞、非典型淋巴细胞。在本发明的一些方面，细胞是可用于对病症、疾病、感染和/或综合征鉴定、预测、诊断、预后或支持诊断的异常细胞。
在本发明的方法的另一方面，细胞为血小板。
除非另外明确指明，否则本公开中提及的“粒子”应当理解为涵盖分散于流体中的任何离散的或有形的物体。如本文所用，“粒子”可包括生物流体中的所有可测量且可检测(例如，通过图像和/或其他可测量参数)的组分。粒子具有任何材料、任何形状和任何尺寸。在某些实施例中，粒子可包括细胞。粒子的例子包括但不限于细胞，包括血细胞、胎儿细胞、上皮细胞、干细胞、肿瘤细胞，或细菌、寄生生物或任何前述例子的碎片或生物流体中的其他碎片。血细胞可以为任何血细胞，包括可能存在于生物流体中的任何正常或异常、成熟或未成熟的细胞，例如红血细胞(RBC)、白血细胞(WBC)、血小板(PLT)和其他细胞。成员也包括未成熟的或异常的细胞。未成熟的WBC可包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞。除了成熟的RBC之外，RBC的成员还可以包括有核RBC(NRBC)和网织红细胞。PLT可包括“巨大”PLT和PLT团块。血细胞和有形成分在本公开的其他地方进一步描述。
示例性粒子可包括生物流体样品中的有形成分，包括例如球形和非球形粒子。在某些实施例中，粒子可包括非球形组分。非球形组分的图像投影可在高光学分辨率成像设备的焦平面中最大化。在某些实施例中，非球形粒子在高光学分辨率成像设备的焦平面中配向(在基本上平行于流动方向的平面中配向)。在一些实施例中，作为粒子对血小板、网织红细胞、有核RBC以及WBC(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和未成熟的WBC(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)计数和分析。
如本文所用，可检测和可测量的粒子参数可包括例如尺寸、形状、对称性、轮廓和/或其他特性的基于视觉和/或非图像的指标。
样品可为分离和/或制备的生物样品，包括例如体液样品、血液、血清、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液、唾液、精液、泪液、汗液、母乳、羊膜液、灌洗液、骨髓穿刺液、渗漏液、渗出液、或从受试者获得的其他样品(例如，经处理产生细胞悬液的活检样品、或包含粒子的实验室或生产线样品)。在一些实施例中，样品可以为实体组织样品，例如，已进行了处理而产生细胞悬液的活检样品。样品也可以为通过处理粪便样品而得到的悬液。样品也可为包含粒子的实验室、化学、工业或生产线样品，诸如细胞培养样品。术语样品可用于指代得自患者或实验室的样品或其任何级分、部分或等分试样。样品可在一些过程中进行稀释、分成多个部分、或用对比剂处理。
本文所公开的方法适用于来自广泛生物体的样品，所述生物体包括哺乳动物，例如人类、非人灵长类(例如，猴)、马、牛或其他牲畜、狗、猫或其他作为宠物饲养的哺乳动物、大鼠、小鼠或其他实验室动物；禽类，例如鸡；爬行动物，例如短吻鳄；鱼类，例如鲑鱼或其他养殖品种；以及两栖动物。
可通过任何常规方法，例如排泄、抽取、收获、抽吸或活检，来获得样品。样品可来自被认为健康的受试者，例如作为日常体检的一部分而采集的样品。样品也可来自具有失调、有失调风险或疑似具有失调的受试者。失调可由疾病、遗传异常、感染、损伤或未知原因引起。作为另外一种选择或除此之外，方法可用于在治疗失调的过程期间监测受试者。如果存在对治疗和/或疗法的非响应性的迹象，临床医生可选择替代或辅助药剂。根据受试者的病症和具体失调(如果有的话)，可每日、每周、每月或每年采集一次(或两次、三次等等)样品。
粒子可根据样品而有所差异。粒子可为生物细胞，例如，血细胞、胎儿细胞、干细胞、肿瘤细胞或其碎片。在一些实施例中，粒子可为感染因子，例如病毒或细菌。
本公开中提及的“血细胞”应当理解为涵盖可能存在于生物流体中的任何正常或异常、成熟或未成熟细胞，例如，红血细胞(RBC)、白血细胞(WBC)、血小板(PLT)和其他细胞。一般来讲，正常RBC、PLT和WBC分别具有6-8μm、2-3μm和8-15μm范围内的粒径。正常RBC、PLT和WBC分别以3.9-5.7×1012个细胞/L、1.4-4.5×1011个细胞/L、3.5-11×109个细胞/L的近似浓度范围存在于来自正常患者的全血样品中。参见Barbara J.Bain,Blood Cells,APractical Guide,4th ed.,Blackwell Publishing,2007,34-36(Barbara J.Bain，《血细胞，实用指南》，第4版，布莱克威尔出版公司，2007年，第34-36页)。
提及的“有形成分”应当理解为涵盖存在于生物流体样品中的非流体成分。有形成分包括例如基于科学分类或生理功能的血细胞的类别，包括红血球(RBC)、白血球(WBC)和血小板(PLT)、WBC团块、白血球的亚类别，所述白血球的亚类别包括成熟淋巴细胞和未成熟白血球诸如单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。可用于本文的“有形成分”也将包括粒子诸如微生物、细菌、真菌、寄生生物或其碎片或其他细胞碎片。WBC的主要成员包括但不限于中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。成员也包括未成熟的或异常的细胞。例如，未成熟WBC可包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞。除了成熟的RBC之外，RBC的成员还可以包括有核RBC(NRBC)和网织红细胞。PLT可包括正常PLT和“巨大”PLT，“巨大”PLT的尺寸接近正常WBC的尺寸。本公开中提及的一类目和/或亚类目粒子的“成员”应当理解为涵盖一类目或亚类目粒子内的单独粒子。
除非另外明确指明，本公开中提及的一“类目”粒子应当理解为涵盖使用至少一种测量的、检测的或推导的检测标准诸如尺寸、形状、质构或颜色所检测的一群粒子。在一些实施例中，通过本公开的装置计数的至少一种类目和/或亚类目的粒子的成员将为有形成分的相同类型。
此类粒子可在一个“通道”中检测。本公开中提及的“通道”应当理解为涵盖粒子计数器的一部分，该部分包括耦合到信号源的检测器，从而提供随符合至少一个通道检测标准的粒子的较强或较弱检测而变化的输出。例如，通道检测标准可基于粒子的尺寸或体积。在一些实施例中，粒子计数器中的通道数量为一个。在一些其他实施例中，粒子计数器中的通道数量为两个或更多个。
粒子计数器的一个通道中检测到的一种类目和/或亚类目的粒子可包括不同类别和亚类别的粒子以及两种或更多种亚类别的粒子的成群成员。本公开中提及的一“类目”粒子应当理解为涵盖与测量的、检测的或推导的标准诸如尺寸、形状、质构或颜色相对应的一群粒子。在一些实施例中，通过本公开的装置计数的至少一种类目和/或亚类目的粒子的成员将为有形成分的相同类型。
如本文所用，术语高光学分辨率成像设备可包括能够获得粒子图像的设备，所述图像具有充分的视觉差别以区分形态特征和/或变化。示例性高光学分辨率成像设备可包括光学分辨率为1微米或更低的设备，包括例如0.4至0.5微米，诸如0.46微米。
如本文所用，粒子对比剂组合物可适于与粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)组合用于视觉分析仪以分析得自受试者的样品中的粒子。示例性PIOAL可用于例如得自受试者的样品中的不同类型的粒子的自动化识别方法。
在另一方面，在获得图像时细胞可被包封在PIOAL中。在本文描述了合适的示例性细胞内细胞器配向液体。
如本文所用，“配向”可部分地由球形和/或非球形粒子的配向来表征。例如，粒子诸如非球形粒子可在基本上平行于流动方向的平面中配向。在某些实施例中，非球形粒子的配向通过这样的粒子取向来表征，该取向增大了非球形粒子在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中的图像投影。粒子诸如球形粒子可具有增加量的粒子和细胞的焦点内粒子内内容物，从而能有效地产生用于粒子分类和子分类的视觉差别。粒子诸如球形粒子的粒子内结构可定位、重定位和/或更好定位成基本上平行于流动方向。例如，细胞内结构、细胞器或小叶也可定位、重定位和/或更好定位成基本上平行于流动方向。
本公开中提及的一“类别”粒子应当理解为涵盖基于科学分类的一群粒子。例如，全血样品中存在三大类血细胞，包括RBC、WBC和PLT。
本公开中提及的粒子的“成员”应当理解为涵盖一类目或亚类目粒子中的粒子。例如，每种类目的血细胞可进一步分成亚类目或成员。WBC的主要成员包括但不限于中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。成员也包括未成熟的或异常的细胞。例如，未成熟WBC可包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞和早幼粒细胞。除了成熟的RBC之外，RBC的成员还可以包括有核RBC(NRBC)和网织红细胞。PLT可包括正常PLT和“巨大”PLT，“巨大”PLT的尺寸接近正常WBC的尺寸。
提及的“未成熟细胞”应当理解为涵盖特定发育阶段中，例如骨髓内部或从骨髓释放不久之后但在完全发育成成熟细胞之前的细胞。
提及的“异常细胞”应当理解为涵盖具有异常形态特性的细胞或与特定疾病或病症相关的细胞、或者可能在某些情况下与某些疾病或病症相关的异常。特定疾病的例子包括但不限于红细胞增多症、多血症、贫血症、幼红细胞减少症、白细胞增多症、白细胞减少症、淋巴细胞增多症、淋巴细胞减少症、粒细胞增多症、粒细胞减少症或粒细胞缺乏症、中性粒细胞增多症、中性粒细胞减少症、嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性粒细胞减少症、嗜碱性粒细胞增多症、嗜碱性粒细胞减少症、血小板增多症、血小板减少症和全血细胞减少症。一种类别的细胞在血流中可增多或减少。在一些条件下，比正常白细胞大得多的异常细胞以小浓度存在于血液样品中。尺寸、形状、颜色和/或细胞内结构的变化可与某些疾病或病症相关。
本公开中提及的粒子的“计数”或“粒子计数”应当理解为涵盖从粒子计数器的一个通道获得的粒子的数量。本公开中提及的粒子的某类别或成员的“浓度”应当理解为意指每单位体积(例如每升)或已知体积的每个样品的粒子的数量。例如，粒子计数器可为各类目的粒子提供计数或浓度或其他基于计数的函数，同时视觉分析仪可为每种类目或亚类目的粒子提供计数、浓度、比率或其他基于浓度的参数。
本公开中提及的“比率”应当理解为涵盖粒子的两种类目/亚类目、类别或成员的任何定量的和/或成比例的比率。此类比率的例子包括但不限于按浓度、重量和/或按粒子数量的比率。通常比率涉及一种类目、类别或成员的计数相对于另一种这样的类目、类别或成员的计数的数字分数。在一些实施例中，也可使用加权的计数或加权的和/或成比例的比率进行确定。
血液学–粒子分析系统
现在转到附图，图1示意性地示出了示例性流通池22，所述流通池用于将样品流体传送经过高光学分辨率成像设备24的观察区23，所述高光学分辨率成像设备被配置用于使用数字图像处理使样品流动料流32中的微观粒子成像。流通池22耦合到可经受处理(诸如与粒子对比剂组合物接触并加热)的样品流体源25。流通池22还耦合到一个或多个粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)源27，诸如粘度大于样品流体的粘度的透明甘油溶液。
样品流体被注入通过样品进料管29的远端28的变平开口，并在一定的点进入流通池22的内部，在所述点已基本上确立了PIOAL流，从而在带形样品料流的上方和下方(或在其相对侧上)产生稳定和对称的PIOAL层流。样品和PIOAL料流可由精密计量泵提供，该泵使PIOAL与注入的样品流体一起沿着基本上变窄的流路移动。PIOAL在流路变窄的区21中包封并压缩样品流体。因此，在区21的流路厚度降低可有助于样品料流32的几何聚焦。样品流体带32被包封并与PIOAL一起被携带到变窄区21的下游，从而在高光学分辨率成像设备24的观察区23前面通过或以其他方式穿过观察区23，在所述成像设备中例如使用CCD 48采集图像。处理器18可接收来自CCD 48的像素数据作为输入。样品流体带与PIOAL一起流向排放口33。
如这里所示，变窄区21可具有近侧流路部分21a和远侧流路部分21b，近侧流路部分具有近侧厚度PT而远侧流路部分具有远侧厚度DT，使得远侧厚度DT小于近侧厚度PT。样品流体可因此在位于近侧部分21a远侧和远侧部分21b近侧的位置注入通过样品管29的远端28。因此，当PIOAL料流被区21压缩时，样品流体可进入PIOAL包层。其中样品流体注入管具有远侧出口，样品流体穿过该远侧出口注入流动鞘流体中，该远侧出口由流通池的流路尺寸的缩减段界定。
具有物镜镜头46的数字高光学分辨率成像设备24被沿着与带形样品料流32相交的光轴引导。物镜46和流通池33之间的相对距离可通过操作电机驱动器54而改变，以便在光传感器阵列上分辨和采集聚焦的数字化图像。
流通池
流通池22的实践实施例进一步在图2和3中描绘。如这里所示，流通池22可以与样品源25耦合并且还可以耦合到PIOAL材料源27。样品流体经由插管29例如通过插管29的远侧出口31而注入流通池22。通常，PIOAL鞘流体在其通过流通池中的弯曲通道段41从源27向观察区23行进时不处于层流状态。然而，流通池22可被配置成使得PIOAL鞘流体在流过将样品流体引入流动鞘流体中的远侧出口31时为层流或变成层流，或显示出平坦的速度剖面(velocity profile)。样品流体和PIOAL可以大致如箭头A所示的方向沿着流通池22流动，然后经由排放口33流出流通池22。流通池22限定以流动方向A对称变窄(例如，在过渡区21)的内部流路20。流路的对称性有助于样品料流稳健而居中的流动。流通池22被配置成引导被PIOAL包封的样品流32通过流通池中的观察区23，即在观察孔57背后。与观察孔57相关联的是自聚焦光栅44。流通池22还具有被配置成接受或接纳显微镜物镜(未示出)的倒圆或凹陷座58。
根据一些实施例，自聚焦光栅44可具有相对于流通池22固定的且位于离带形样品料流32平面一定位移距离的位置。在这里所示的实施例中，自聚焦光栅(靶标44)在高光学分辨率成像设备(未示出)通过观察孔57采集的图像中可见的位置直接施加到流通池22。流通池22可由第一或上部区段或层22a和第二或下部区段或层22b构成。如这里所示，玻璃或透明窗格60附接到第一区段22a或与第一区段一体化。窗格60可限定流通池内的样品流路的至少一部分。来自光源42的光可穿过自聚焦光栅44的孔隙或通路行进，以便照明在流动料流32内流动的样品粒子。
在一些情况下，窗格60的厚度可具有约150μm至约170μm范围内的值。如上所述，窗格60可限定或形成流路或鞘流体(例如PIAOL)通道的一部分。通过使用薄窗格60，可以将显微镜物镜置于非常靠近样品流体带的位置，并因此得到沿着流路流动的粒子的高倍放大图像。
图3A描绘了流通池实施例的各方面，其中成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离为约8.24mm。远侧过渡区部分316与插管出口331之间的距离为约12.54mm。插管出口331与鞘流体入口301之间的距离为约12.7mm。插管出口331与近侧过渡区部分318之间的距离为约0.73mm。图3B描绘了流通池实施例的各方面，其中插管出口已被移动到相对于过渡区更远侧的位置，如相比于图3A实施例。如这里所示，插管远端向流通池的变窄过渡区推进，并且成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离在约16mm至约26mm的范围内。在一些情况下，成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离为约21mm。
返回参照图1，流通池内部轮廓(例如，在过渡区21)以及PIOAL和样品流速可被调整成使得样品形成为带形料流32。料流可与包封在带形样品料流中的粒子大约一样薄或甚至更薄。白血细胞可具有例如约10μm的直径。通过提供厚度小于10μm的带形样品料流，当带形样品料流被鞘流体或PIOAL拉伸时细胞可以取向。令人惊讶的是，带形样品料流沿着变窄流路在粘度与带形样品料流不同(诸如更高粘度)的PIOAL层内的拉伸有利地往往会使非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，并对细胞施加力，从而改善细胞的细胞内结构的焦点内内容物。高光学分辨率成像设备24的光轴基本上正交(垂直)于带形样品料流的平面。带形样品料流在成像点的线速度可为例如20-200mm/s。在一些实施例中，带形样品料流的线速度可为例如50-150mm/s。
带形样品料流厚度可受样品流体和PIOAL的相对粘度和流速的影响。样品源25和/或PIOAL源27(例如，包括精密容积泵)可被配置成以可控的流速提供样品和/或PIOAL以优化带形样品料流32的尺寸，即作为至少与高光学分辨率成像设备24的视野一样宽的薄带。
在一个实施例中，PIOAL源27被配置成以预定的粘度提供PIOAL。该粘度可与样品的粘度不同，并且可以高于样品的粘度。对PIOAL的粘度和密度、样品材料的粘度、PIOAL的流速和样品材料的流速进行协调以在离自聚焦光栅的位移距离处维持带形样品料流，并具有预定的尺寸特性，诸如有利的带形样品料流厚度。
在实践实施例中，PIOAL具有比样品更高的线速度和比样品更高的粘度，从而将样品拉伸成平带。PIOAL粘度可为最高10厘泊。
还参照图2和3，流通池的内部流路在带形样品料流注入PIOAL的点的下游变窄，以产生带形样品料流厚度，例如最多至7μm，和/或内部流路产生500-3,000μm的带形样品料流宽度。在示例性实施例中，如图1中所描绘，流通池的内部流路始于样品料流注入PIOAL的点的上游的变窄过渡区。
在另一个实施例中，内部流路变窄以产生厚度为2-4μm的带形样品料流厚度，和/或内部流路形成宽度为2000μm的带形样品料流。这些尺寸尤其可用于血液学。料流在此情况下的厚度小于一些粒子(诸如处于其松弛状态的红血细胞)的直径。因此，这些粒子可变成重新取向，以使其更宽的尺寸面向成像轴，这可有助于展现出区别特性。
带形样品料流的线速度可被充分限制以防止在光传感器阵列的图像曝光时间数字化图像的运动模糊。光源可任选地为闪烁以短时间施加高入射振幅的闪光灯。因为自聚焦光栅44和图像处于相同的视野中，所以光源被配置成同时照明带形样品料流和自聚焦光栅。然而，在其他实施例中，成像和自聚焦的视野可以不同，例如单独地照明和/或成像。
主题开发具有方法以及装置方面。聚焦视觉分析仪的方法包括在相对于流通池22固定的自聚焦光栅44上聚焦高光学分辨率成像设备24，其可以为数字高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备，其中自聚焦光栅44位于离带形样品料流32的位移距离52处。数字高光学分辨率成像设备24具有物镜，其光轴与带形样品料流32相交。物镜与流通池22之间的相对距离通过操作电机驱动器54而改变，而沿着光轴在高光学分辨率成像设备与最佳聚焦点之间的距离是已知的。数字高光学分辨率成像设备被配置成在光传感器阵列上分辨和收集数字化图像。操作电机驱动器以在自聚焦过程中在自聚焦光栅上聚焦。然后在所述位移距离上操作电机驱动器，从而在带形样品料流上聚焦高光学分辨率成像设备。
所述方法还可以包括使带形样品料流形成带形。呈现带形以使得高光学分辨率成像设备的光轴基本上垂直于带形样品料流，即与带形料流的平面正交。
图4描绘了用于使血液流体样品中的粒子成像的系统400的各方面。如这里所示，系统400包括样品流体注入系统410、流通池420和图像捕获设备430以及处理器440。流通池420提供任选地与样品料流相结合而传递鞘流体流的流路422。根据一些实施例，样品料流注入系统410可包括插管或管412或与插管或管412耦合。样品流体注入系统410可与流路422流体连通，并且可以操作而将样品流体424注入穿过插管412的远侧出口413并进入流通池420内的流动鞘流体426中以便提供样品流体料流428。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使样品流体注入系统410将样品流体424注入流动鞘流体426中。如这里所示，鞘流体426可通过鞘流体注入系统450而引入流通池420中。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使鞘流体注入系统450将鞘流体426注入流通池420中。
样品流体料流428具有邻近注入管412的第一厚度T1。流通池的流路422具有流路尺寸的缩减段使得样品流体料流428的厚度从初始厚度T1减小到邻近图像捕获位点432的第二厚度T2。图像捕获设备430与图像捕获位点432配向以便在流通池420的图像捕获位点432对来自第一样品流体的第一多个粒子成像。
处理器440与样品流体注入系统410、图像捕获设备430以及任选鞘流体注入系统450耦合。处理器440被配置成终止第一样品流体向流动鞘流体426中的注入并开始第二样品流体向流动鞘流体426中的注入，使得引发样品流体瞬变。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使样品流体注入系统410将第二样品流体注入流动鞘流体426中，使得引发样品流体瞬变。
另外，处理器440被配置成在样品流体瞬变后并在对第一多个粒子成像的4秒内引发在流通池420的图像捕获位点432捕获来自第二样品流体的第二多个粒子的图像。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成在样品流体瞬变后并在对第一多个粒子成像的四秒内使图像捕获设备430引发在流通池420的图像捕获位点432捕获来自第二样品流体的第二多个粒子的图像。
如图4A中所描绘的流通池实施例中所示，流路尺寸的缩减段(例如，在过渡区419a)可由流路422a的相对壁421a、423a限定。相对壁421a、423a可沿着流路422a径向向内成一角度，通常围绕将样品流体料流428a二等分的横向平面451a对称。平面451a可将样品料流428a二等分，其中样品料流在样品料流428a离开插管或样品注入管412a的远侧部分427a的位置处具有第一厚度T1。相似地，平面451a可将样品料流428a二等分，其中样品料流在样品料流428a经过图像捕获位点432a的位置处具有第二厚度T2。根据一些实施例，第一厚度T1具有约150μm的值，而第二厚度T2具有约2μm的值。在此类情况下，样品带料流的压缩比为75:1。根据一些实施例，第一厚度T1具有约50μm至约250μm范围内的值，而第二厚度T2具有约2μm至约10μm范围内的值。当样品料流流体流过流通池时，带在加速和被拉伸时变薄。流通池的两个特征可有助于样品流体带的变薄。首先，鞘流体包层与样品流体带之间的速度差可起到降低带的厚度的作用。其次，过渡区的渐缩几何形状可起到降低带的厚度的作用。
通常，第一厚度T1远大于样品粒子的尺寸，因此粒子被完全包含在样品带料流内。然而，第二厚度T2可小于某些样品粒子的尺寸，因此那些粒子可延伸到样品流体之外并进入周围的鞘流体中。如图4A中所示，样品带料流可总体上沿着与其离开插管并朝图像捕获位点行进的相同平面流动。
流通池还可以在远侧插管部分427a与图像捕获位点432a之间提供分隔距离430a。根据一些实施例，样品流体注入管412a的远侧部分427a可定位在离图像捕获位点432a的轴向分隔距离430a处，其中轴向分隔距离432a具有约21mm的值。在一些情况下，轴向分隔距离430a具有约16mm至约26mm范围内的值。
插管出口与图像捕获位点之间的轴向分隔距离430a可影响样品流体从出口向图像捕获位点行进时流体的传递时间。例如，相对更短的轴向分隔距离430a可有助于更短的传递时间，而相对更长的轴向分隔距离430a可有助于更长的传递时间。
插管远侧部分427a处的出口相对于流路过渡区419a或相对于流路过渡区419a的近侧部分415a的位置也可推断出样品流体从出口向图像捕获位点行进时流体的传递时间。例如，鞘流体可在近侧部分415a具有相对更慢的速度，而在近侧部分415a与远侧部分416a之间的位置具有相对更快的速度。因此，如果将远侧部分427a处的插管出口定位在近侧部分415a，则样品流体到达图像捕获位点将花费更长的时间，这不仅因为行进距离更长，还因为样品流体在离开插管远侧端口后的初始速度更慢(由于更慢的鞘流体速度)。换句话说，样品流体存在于流通池的较厚部分(例如，靠近近侧部分415a)的时间越长，则样品到达图像捕获位点所花的时间越长。反之，如果将远侧部分427a的插管出口定位在近侧部分415a的远侧(例如，在近侧部分415a与远侧部分416a之间的中心位置，如图4A中所描绘)，则样品流体到达图像捕获位点所花的时间将更短，这不仅是因为行进距离更短，还因为样品流体在离开插管远侧端口后的初始速度更快(由于更快的鞘流体速度)。如本文其他地方所讨论，鞘流体在穿过过渡区419a流动时因区419a的变窄横截面积而被加速。
根据一些实施例，传递时间越短，图像捕获位点处采集图像可用的时间越多。例如，当从插管远侧顶端到成像区域的传递持续时间缩短时，可以在特定的时长内处理更多的样品，并相关地可以在特定的时长内获得更多的图像(例如，每分钟的图像数)。
虽然存在与将插管远侧部分427a的出口定位在更靠近图像捕获位点432a的位置相关的优点，但在所述出口与捕获位点之间维持一定的距离也是可取的。例如，如图3中所描绘，成像设备的光学物镜或前透镜可定位在流通池22的座58中。如果插管的出口31太靠近座58，则样品流体在被注入鞘流体中后可能不够稳定，而不能在图像捕获位点提供所需的成像性质。相似地，可能有利的是将渐缩过渡区21保持在离观察区23一定的距离处，以使得渐缩区不干扰接纳图像捕获设备物镜的座58的定位。
继续参照图4A，样品流体注入管412a的下游端427a可定位在流路过渡区419a的近侧部分415a的远侧。相关地，样品流体注入管412a的下游端427a可定位在流路过渡区419a的远侧部分416a的近侧。因此，根据一些实施例，样品流体可从注入插管412a在过渡区419a内的某一位置注入流通池。
根据一些实施例，流路尺寸的缩减段(例如，在流路过渡区419a)的对称性起到限制血液流体样品中的粒子不良配向的作用。例如，这种对称性可有效将血液流体样品中的红血细胞成像取向不良配向限制到小于约20％。
根据一些实施例，本文所公开的方法可起到使血液计数分析期间的标记率(flagging rate)低于样品的30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％或5％的作用。
根据一些实施例，图像捕获位点432a具有约150μm×150μm与400μm×400μm之间的视野433a。在一些情况下，图像捕获位点432a具有约275μm×275μm的视野433a。在一些情况下，视野可根据长度乘以宽度加以限定。如果表示为表面积，则275μm×275μm视野具有75,625μm2的面积。根据一些实施例，视野可由成像设备物镜及其放大倍数确定。在一些情况下，视野可对应于由采集光学元件(例如，物镜、镜筒透镜和相机)成像的场(区域)范围。在一些情况下，视野远小于图像捕获位点处的透明区的观察孔。
图4A-1和图4A-2示出了当样品料流从插管出口向图像捕获位点行进时流体聚焦对样品料流的影响。如图4A-1中所示，样品料流可具有约150μm的高度H(S)和约1350μm的宽度W(S)。另外，PIOAL鞘料流可具有约6000μm的高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。在流体聚焦之后，如图4A-2中所示，样品料流可具有约2μm的高度H(S)和约1350μm的宽度W(S)。另外，PIOAL鞘料流可具有约150μm的高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。在一个实施例中，PIOAL鞘料流在插管出口处的横截面积是图像捕获位点附近的横截面积的40倍。
根据一些实施例，其可用于确定图像捕获位点处的流通池通道的横截面。这可对应于如图4A-2中所描绘的约150μm的PIOAL鞘料流高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。其还可用于确定在图像捕获位点处流过流通池的合并样品和鞘流体的体积流速。当已知横截面积和流速时，可以确定图像捕获位点处的合并样品和鞘流体的速度。
根据一些实施例，样品和鞘流体穿过流通池的流动可用平行板轮廓模型估算。相关地，样品流体料流的中心的流速(例如，如图4A-2中所描绘)可为合并样品和鞘流体料流的平均流速的约1.5倍。
根据一些实施例，在插管出口处的样品流的横截面积(例如，图4A-1中的W(S)×H(S))为成像位点处的样品流的横截面积(例如，图4A-2中的W(S)×H(S))的40倍。在成像区域处的鞘流体的体积流速可为约45μL/s。在成像区域处的样品流体的体积流速可为约0.232μL/s。在一些情况下，在成像位点处的合并的鞘料流和样品料流的横截面积为600,000μm2。在一些情况下，在成像位点处的平均流动料流速度为75mm/s。
流速或速度可作为产生清晰和聚焦的细胞图像的速率而确定。示例性流速和速度基于据观察在成像位点实现一定样品流动料流带形或特性的两个样品的流速而发现。例如，在约75mm/s(或20-200mm/s范围内)的流速下，细胞不会流动得过慢以使得在连续图像中存在细胞的重叠，也不会流动得过快以使得形成幻影效应(模糊的图像)。相关地，通过避免过高的流速，可以节省更多的试剂和样品。根据一些实施例，最佳的或所需的线速度可通过改变体积流量(泵速)或插管形状而实现。
穿过图像捕获区的样品料流的流动速度也可与图像捕获设备相对于流通池功能的性能相关。例如，如果样品料流流动得过快，则可能难以获得样品中所含的粒子的清晰图像(例如，图像捕获设备的快门速度可能过慢，从而产生模糊的图像)。相似地，如果样品料流流动得过慢，则图像捕获设备可能获得同一粒子的连续图像(例如，同一粒子保持在两次图像捕获期间的捕获帧中)。在一些实施例中，样品带的速度可相对于图像捕获速率进行调节(例如，通过调整多个流通池操作参数中的任何一个)，以使得在帧捕获之间存在最少的流动，并因此能对高百分比的样品成像。
根据一些实施例，粒子分析系统和相关部件可被配置成使得当鞘流体和流体样品流过流通池时，鞘流体可以45μL/s的鞘流体体积速率流动，而流体样品可以0.232μL/s(或在0.2至0.35μL/s的范围内)的流体样品体积流速流动。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约200。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率具有约70至200范围内的值。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约193。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约70。在一些情况下，在流通池内流动的鞘流体体积与流体样品体积的比率可在25:1至250:1的范围内。
根据一些实施例，所述系统和相关部件可被配置成使得当鞘流体和流体样品流过流通池420时，鞘流体可以75mm/s的鞘流体速度在成像区域前流动，而流体样品可以130mm/s的流体样品速度在成像区域前流动。在一些情况下，在流通池内流动的鞘流体体积与流体样品体积的比率可在100:1至200:1的范围内。
在一些情况下，流通池可具有约50:1的最小压缩比和约125:1的最大压缩比。在一些情况下，最小压缩比可为约30:1或20:1。该压缩比是指当将图4A-1与图4A-2比较时的流动料流厚度的比率H(S):H(S)。该压缩比可受几何压缩(例如，当将图4A-1与图4A-2比较时的鞘流体厚度的比率H(P):H(P)，其也可大致上对应于图4A中所示的流通池变窄渐缩过渡区419a的尺寸)和流体动力压缩(例如，也对应于速度差)的组合的影响。根据一些实施例，几何压缩比为约40:1。
对应于过渡区的流路尺寸的缩减段可由近侧流路部分和远侧流路部分限定，近侧流路部分具有近侧厚度或高度，而远侧流路部分具有比近侧厚度或高度小的远侧厚度或高度。例如，如图4B的局部视图所示，流路的过渡区419b可在近侧部分415b与远侧部分416b之间具有长度L，其中近侧部分415b具有近侧高度417b，而远侧部分416b具有远侧高度418b。如本文其他地方所述，过渡区的形状或轮廓可以为弯曲的或平滑的，并例如以S形曲线或正切曲线的形状提供。根据一些实施例，近侧高度417b具有约6000μm的值。在一些情况下，近侧高度417b具有约3000μm至约8000μm范围内的值。根据一些实施例，远侧高度418b具有约150μm的值。在一些情况下，远侧高度418b具有约50μm至约400μm范围内的值。
过渡区419a的几何形状可提供在第一流路边界403b与二等分横向平面451b之间的第一角度α1，和在第二流路边界404b与二等分横向平面451b之间的第二角度α2。在一些情况下，角度α1为约45度而角度α2为约45度。在一些情况下，角度α1具有约10度至约60度范围内的值。在一些情况下，角度α2具有约10度至约60度范围内的值。根据一些实施例，角度α1和α2具有相同的值。可对角度α1和α2进行选择以便在样品流体从近侧部分415b向远侧部分416b行进时维持样品流体的层流或最大程度降低样品流体的湍流，继而可增强样品内的粒子沿着横向平面451b的配向。如上文参照图4A所述，过渡区的远侧和近侧边界或部分可以为弯曲的或平滑的，而不是成角度的。
如图4K中所示，穿过流通池420k的图像捕获位点432k流动的样品料流带R可具有约2μm的厚度T。在一些情况下，样品料流带的厚度T可最多为约3μm。通常，小于样品料流厚度的细胞或粒子将被包含在带内。示例性红血细胞(RBC)可呈现为双面凹陷的圆盘并可具有约6.2μm与约8.2μm之间的直径D。另外，示例性红血细胞可具有约2μm与约2.5μm之间的最大厚度T1和约0.8μm与约1μm之间的最小厚度T2。在一些情况下，红血细胞可具有最多约3μm的厚度。示例性人类血小板在尺寸上可以变化，并且也可具有约2μm的厚度或直径。虽然这里未按比例示出，但是流通池可在图像捕获位点处限定值为约150μm的流路厚度H。在一些情况下，流路厚度F具有50μm与400μm之间的值。该流路厚度F还可对应于图4B中所描绘的远侧部分461b的远侧高度418b。
如图4K中所示，样品流体料流的厚度T与粒子(红血细胞)的厚度的比率为约1:1。根据一些实施例，在图像捕获位点处的样品流体料流的厚度T与粒子之一的尺寸的比率在0.25至25的范围内。在一些情况下，厚度T可具有0.5μm至5μm范围内的值。可对鞘流体与样品流体之间的粘度差进行选择以便实现带形样品料流在流通池内的所需定位。
如本文别处和共同待审的美国专利申请No.____中所讨论，样品带R的流体与鞘流体之间的粘度差可起到沿着流动方向配向样品料流中的粒子(例如红血细胞)或使其取向的作用。当如此配向时，如图4K中所示，成像设备或相机可获取红血细胞的图像使得它们看起来为圆的，因为该血细胞的主表面面向相机。这样，红血细胞呈现的配向展示出相对于流动的低阻力。因此，鞘流体和样品流体的相对粘度特性可有助于高百分比或数量的红血细胞面向相机，从而增强粒子分析系统的评估能力。
根据一些实施例，鞘流体的粘度特性起到限制血液流体样品中的粒子不良配向的作用。例如，粘度差可有效将血液流体样品中的红血细胞成像取向不良配向限制到小于约10％。也就是说，样品中的100个红血细胞中的90个或更多个红血细胞可配向以使得其主表面面向成像设备。对称的变窄过渡区可提供20％的值。根据一些实施例，鞘流体具有类似于水的折射率(即n＝1.3330)。在一些情况下，鞘流体的水含量为约89％。除了因粘度差而观察到的配向作用外，还因双侧渐缩过渡区观察到了配向作用。在一些情况下，据观察，双侧(即，对称)渐缩过渡区是相比于不对称渐缩过渡区设计在配向粒子时的有效性的两倍。
红血细胞的有效配向可有助于改善诊断。在一些情况下，可将成像的红血细胞的形状用于确定从其获取样品的患者是否具有特定的生理状况或疾病。例如，具有镰形细胞病的患者存在形状异常(即，镰形形状)的血细胞。因此，通过获得配向红血细胞的高质量图像，可以确保准确的诊断。红血细胞的其他形状变化，例如具有薄周边区域和大平坦中心区域因而看起来具有自行车轮胎轮廓的红血细胞，可使用本发明的配向技术有效地成像。相似地，可出于诊断目的对具有小中心部分和厚周边区域因而红血细胞看起来具有卡车轮胎轮廓的红血细胞成像。本文所公开的改进的成像技术还可用于评估其他红血细胞特性，诸如血红蛋白含量、铁含量等。
不受任何特定理论的束缚，据信，鞘流体的粘度与样品流体的粘度之间的粘度差产生改变的抛物线剖面，其中该剖面大致为抛物线的，并具有对应于加速度增大的流动中心区域的中心隆起，并且该中心隆起有助于样品粒子或粒子内细胞器的配向。根据一些实施例，鞘流体与样品带之间的速度差和粘度差生成剪切力以增加细胞器或细胞内粒子的配向。鞘流体抛物线剖面的示例性方面在共同待审的美国专利申请No.________中有所讨论，该专利申请的内容以引用方式并入本文。
白血细胞通常大于红血细胞和血小板。例如，示例性中性粒细胞和嗜酸性粒细胞可具有约10μm与约12μm之间的直径。示例性嗜碱性粒细胞可具有约12μm与约15μm之间的直径。示例性淋巴细胞(小)可具有约7μm与约8μm之间的直径，而示例性淋巴细胞(大)可具有约12μm与约15μm之间的直径。示例性单核细胞可具有约12μm与约20μm之间的直径。粒子分析系统的构形(包括鞘流体和流体样品带在穿过流通池时它们之间的相互作用)可在白血细胞穿过图像捕获位点432l行进时起到压缩白血细胞的作用，如图4L中所指示。因此，例如，白血细胞(WBC)的中心部分可定位于样品流体带R内，而白血细胞的周边部分可定位于鞘流体内。因此，当带使白血细胞穿过流通池传输时，白血细胞的侧面可延伸到鞘流体中。
根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可起到配向存在于诸如白血细胞的细胞内的细胞器或其他细胞内特征的作用。不受任何特定理论的束缚，据信，与鞘流体和样品流体之间的粘度差相关的剪切力可作用于白血细胞而配向细胞内特征。在一些情况下，与鞘流体和样品流体之间的速度差相关的剪切力可有助于这种配向。这些配向作用也可受粒子与样品流体带之间的尺寸差异的影响。例如，如果粒子的部分延伸到样品流体带之外并进入周围的鞘流体中，则与粘度差相关的剪切力可对细胞内特征配向具有明显的影响。
如图4L中所描绘，细胞(诸如白血细胞)的部分可延伸到鞘流体中。本发明的实施例涵盖鞘流体组合物，该鞘流体组合物在细胞暴露于鞘流体时不裂解或破碎细胞或者说是影响外部细胞膜的完整性。该鞘流体中的粘度剂可起到保持样品流体料流中的细胞的活力的作用，从而在细胞膜或细胞壁横越样品流体带与鞘流体包层之间的界面时或者说是从样品流体料流延伸到流动鞘流体中时使细胞的结构(例如，形状)和内容物(例如，细胞核)保持完整。
通常，当细胞或粒子沿着流通池在样品流体带内流动时存在作用于细胞或粒子的压缩力。因此，细胞可与鞘流体接触，同时细胞因变窄过渡区而处于压缩状态或者说是经受压缩力。鞘流体的粘度剂可起到保护被压缩的细胞免于在从薄样品流体带出现并暴露于粘性鞘流体时(至少在细胞到达图像捕获位点之前)破碎或毁坏的作用。因此，鞘流体的粘度剂组合物可充当细胞保护剂，同时还增强粒子或粒子内内容物的配向。
参照图4K和图4L，在一些情况下，细胞或粒子的部分可延伸到薄样品流体带R之外并进入周围的鞘流体中。如在共同待审的美国专利申请No.____中所讨论，鞘流体可包含抑制或防止鞘流体破坏或裂解细胞或粒子的细胞保护剂。例如，鞘流体可包含当将细胞暴露于鞘流体的化学环境时维持细胞壁的结构完整性的细胞保护剂。相似地，细胞保护剂也可在细胞经历流通池几何形状所引起的任何剪切力和样品流体与鞘流体之间的速度和/或粘度差时起到维持细胞壁的结构完整性的作用。相关地，保护剂可保护细胞或粒子免受样品流体与鞘流体之间的速度差所引起的力的影响。这样，细胞在到达图像捕获位点时保持其活力。
剪切力在样品流体带与鞘流体包层之间的界面处可能是显著的。根据一些实施例，流通池流路内的流动可由抛物线流动剖面表征。根据一些实施例，尺寸足够大的粒子将经受一定量的剪切力，甚至在此类粒子被完全容纳在单一流体相内时(即，在鞘流体包层内或者在样品流体带内)。
在一些情况下，鞘流体的速度可与样品流体的速度不同。例如，鞘流体可以80mm/s行进而样品流体可以60mm/s行进。因此，在一些情况下，样品流体以慢于周围包层的鞘流体速度的样品流体速度离开远侧插管端口。因此，鞘流体可起到沿着插管的流路拖动样品流体的作用，从而加速样品流体并降低样品流体带的厚度。样品流体带保持总体积和质量不变，因此当其行进得越快时变得越薄。根据一些实施例，鞘流体和样品流体在图像捕获位点处具有约20与200mm/s之间的速度。
通常，当样品流体从插管出口向图像捕获位点行进时，样品流体的速度增加。在一些情况下，在图像捕获位点处样品流体的速度是样品流体离开插管远侧部分的插管端口时的速度的40倍。根据一些实施例，样品带的横截面积的减小与速度的增加呈线性关系。根据一些实施例，如果在插管出口处的鞘流体速度高于样品带速度，则这也将增大成像区域处的最终样品带速度。
鞘流体可起到对样品流体带和样品流体带内的粒子施加显著的剪切力的作用。一些力平行于流动方向，而粒子也可能遇到垂直于流动方向的力。通常，当鞘流体和样品流体接近图像捕获位点或区时，鞘流体和样品流体以相同的速度或接近相同的速度行进。因此，当鞘流体和样品流体通过图像捕获位点时在它们之间的边界或界面可呈现出与远侧插管出口处或渐缩过渡区处的边界或界面相比更低的剪切力。例如，在渐缩过渡区处，鞘流体包层与样品流体带之间的边界或界面可处于过渡中，以使得最初较慢较厚的样品带变得更快更薄，并且样品流体中的粒子变得更配向。换句话说，剪切力在渐缩过渡区可能是突出的，并可向图像捕获位点耗散。在图像捕获位点处的剪切力可由抛物线剖面表示，并可远低于渐缩过渡区处的剪切力。因此，细胞或粒子可在通过过渡区时经受更高的剪切力，并在通过图像捕获位点时经受更低的剪切力。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可使红血细胞配向并从而聚焦。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可使白血细胞的细胞器配向并从而聚焦。相关地，可得到因料流的几何变窄和鞘流体与样品流体之间的速度差而配向并聚焦的细胞和细胞器组分的增强的成像结果。
如本文其他地方所述，并参照图4K和4L，当鞘流体和样品流体R流过流通池的流路尺寸缩减段或过渡区并流向成像位点432k或432l时，与鞘流体粘度和样品流体粘度之间的粘度差相关的鞘流体和样品流体R之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸缩减段或过渡区相关的鞘流体和样品流体R之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，在成像位点432k或432l处在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态。
在一些情况下，本发明的实施例包括与如本文所述的血液学系统一起使用的组合物，诸如鞘流体或粒子和细胞内细胞器配向液体(PIOAL)。此类鞘流体或PIOAL适用于组合式粘度和几何流体聚焦视觉分析仪。PIOAL可起到引导或促进给定粘度的血液样品流体流过视觉分析仪的变窄流通池过渡区的作用。PIOAL可包含粘度比样品的粘度更高的流体。与粘度差相关的PIOAL流体和样品流体之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和变窄流通池过渡区相关的PIOAL流体和样品流体之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，可有效地在视觉分析仪的成像位点在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时维持血液样品流体中的细胞的活力。
图4M描绘了具有内部细胞器(诸如小叶410m)的示例性中性粒细胞400m(一种类型的白血细胞)。因样品流体与鞘流体之间的粘度差，内部细胞器可在细胞内配向，如图4N所指示。因此，内部细胞器可通过图像捕获设备430m有效地成像，而细胞器不彼此重叠。也就是说，不是如图4M中所描绘的小叶彼此堆叠，当从图像捕获设备的成像轴或光轴观察时，小叶配向和并排，如图4N中所描绘。因此，可在捕获的图像中更有效地看见小叶。内部细胞器配向是样品流体与鞘流体之间的粘度差令人惊讶且出人意料的结果。因此，使用粘度差、流体动力流和几何压缩特征实现了对应于细胞配向和处于焦点内的增强的成像结果。
如本文其他地方所述，并参照图4M和4N，当鞘流体和样品流体R流过流通池的流路尺寸缩减段或过渡区并流向图像捕获设备430m或430n的成像位点时，与鞘流体粘度和样品流体粘度之间的粘度差相关的鞘流体和样品流体R之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸缩减段或过渡区相关的鞘流体和样品流体R之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，在成像位点处在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态。根据一些实施例，靶标成像状态可对应于成像状态的分布。
在一些情况下，靶标成像状态可涉及相对于成像位点处的焦平面的靶标粒子内结构取向(例如，配向和/或位置)。例如，如图4N中所描绘，内部结构410m(例如，细胞内结构、细胞器、小叶等)可相对于焦平面F取向。在一些情况下，靶标配向涉及相对于成像位点处的焦平面F的靶标粒子内结构配向，类似于图4K-3中所描绘的粒子配向关系。在一些情况下，靶标位置涉及相对于成像位点处的焦平面的靶标粒子内结构位置，类似于图4K-1中所描绘的粒子位置关系。在一些情况下，粒子内结构的靶标取向既可包括相对于焦平面的靶标配向也可包括相对于焦平面的靶标位置。在一些情况下，靶标成像状态可涉及成像位点处的靶标变形。例如，如图4N中所描绘，粒子400m具有与图4M中所描绘的粒子形状相比压缩的形状。因此，可以看出的是，流通池的运行可对粒子形状产生侧向压缩作用。相关地，粒子内特征可在粒子本身的形状被压缩时在位置或方向上取向(例如，相对于焦平面F和/或带形流平面配向)。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的速度差可在流动料流内产生摩擦，而鞘流体与样品流体之间的粘度差可放大该流体动力摩擦。
可使用流过流通池的样品流体的图像执行多种血液学或血液粒子分析技术中的任一种。通常，图像分析可涉及确定某些细胞或粒子参数，或测量、检测或评价某些细胞或粒子特征。例如，图像分析可涉及评价细胞或粒子尺寸、细胞核特征、细胞质特征、细胞内细胞器特征等。相关地，分析技术可涵盖某些计数或分类方法或诊断测试，包括白血细胞(WBC)分类。在一些情况下，使用流通池得到的图像可支持5分法WBC分类测试。在一些情况下，使用流通池得到的图像可支持9分法WBC分类测试。相关地，参照图4，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使系统400基于得自图像捕获设备的图像来区分不同类型的细胞。相似地，参照图6B，处理器604b可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使系统600b或系统642b基于得自图像捕获设备的图像来区分不同类型的细胞。例如，诊断或测试技术可用于区分各种细胞(例如，中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞)。
图4O示出了使用PIOAL获得的图像与使用非PIOAL鞘流体获得的图像的比较。使用PIOAL产生了更多的焦点内细胞内容物，诸如小叶、细胞质和/或颗粒。在该实例中，将包含粘度剂(约30％甘油)的PIOAL用于处理样品。将pH调节到约6.8至7.2的pH，并通过(0.9％氯化钠)使样品混合物为等渗的。此处所示的结果证实了用在图像分析仪上的示例性PIOAL配向细胞和细胞内细胞器的效力。
图4P和4Q示出了使用标准鞘流体获得的图像(图P上图和下图)与使用示例性PIOAL流体获得的图像(图4Q上图和下图)的比较。如这里所示，使用PIOAL导致了改善的RBC配向。使用仪器聚焦方案(对如图1中所描绘的示例性靶标44)分析样品，并通过视觉分析仪使靶标聚焦。然后使聚焦系统偏置位移距离52，从而使带形样品料流中的粒子处于焦点内。血液样品之前用样品稀释剂进行了稀释。样品流过插管并沿着流通池的流路流动，从而产生在两层PIOAL或标准鞘流体(在对照中)之间的带形样品料流(例如，2微米厚)。视觉分析仪然后生成待用于分析的带形样品料流中的粒子的聚焦图像(例如，以每秒约60帧)。血液样品得自受试者并进行处理以通过血液分析仪进行分析。在使用标准鞘流体或PIOAL处理样品的同时，捕获流通池中RBC的图像。基于成像数据(例如，4P和4Q)，相对百分比展示了配向RBC的数量的显著提高。结果证实了：使用如本文所述的聚焦仪器/方案，PIOAL有效地增加了带形样品料流中处于流动中的RBC的配向百分比。
另据观察，基于在对称和不对称流通池中使用浓度渐增的甘油(gly)，PIOAL的具体实施导致了改善的配向。
这些结果为以下令人惊讶且出人意料的发现提供了证据：某些PIOAL组合物在用于执行基于图像的粒子/细胞分析时具有出人意料的配向细胞和重定位细胞内结构的性质。
动态范围扩展
图5是根据本发明实施例的框图，示出了用于实现在血液样品中进行粒子分析的动态或检测范围扩展的系统和方法的另外方面。如此处所描绘，耦合至少一个数字处理器18以操作电机驱动器54并分析如在相对于靶标自聚焦光栅44的不同焦点位置处采集的来自光传感器阵列的数字化图像。处理器18被配置成测定自聚焦光栅44的焦点位置，即自聚焦于靶标自聚焦光栅44并且从而确定高光学分辨率成像设备24与自聚焦光栅44之间的最佳距离。这可通过图像处理步骤来实现，诸如施加算法以评估第一距离处图像中的对比度水平，该算法可施加到整个图像或至少自聚焦光栅44的边缘。处理器使电机54移动到另一个位置并评估该位置或边缘处的对比度，并且在两次或更多次迭代后测定使自聚焦光栅44上的焦点的精确度最大化(或如果已移动到该位置，则将优化焦点的精确度)的最佳距离。处理器依赖于自聚焦靶标自聚焦光栅44与带形样品料流之间的固定间距，处理器18然后控制电机54将高光学分辨率成像设备24移动到正确距离以聚焦于带形样品料流32。更具体地讲，处理器操作电机以使高光学分辨率成像设备与带形样品料流32之间的距离位移所述位移距离52(参见图1)，带形样品料流从靶标自聚焦光栅44位移所述位移距离52。这样，高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。
根据一些实施例，视觉分析仪17为图1的示例性分析仪17。视觉分析仪17可包括至少一个流通池22和至少一个成像设备24诸如具有成像传感器如数字相机的高光学分辨率成像设备。视觉分析仪17还可包括样品注射器29。样品注射器29被配置成向所述至少一个流通池22中提供样品12。流通池22限定内部PIOAL流路，所述流路例如在流动方向对称地变窄。流通池22被配置成引导样品流32穿过流通池22中的观察区。
图5示出了如所述的数字成像的自聚焦和其他方面。此类技术可结合血细胞装置一起使用，其不基于成像或可能与所述实施例相比较少与图像相关，诸如库尔特血细胞计数器，也称为流式细胞仪。此类计数器已知用于检测和计数流体中的血细胞和粒子，但通常不通过成像来进行。在这种类型的计数器中，流通池被布置成输运包封在流体中的粒子流。流通池变窄而迫使流路中的粒子成单行。横跨流路的一对电极或其他检测器通过在细胞穿过时检测电阻抗的脉冲式变化或光源与光检测器之间的光路的遮挡来产生计数。
流式细胞仪是有利的，因为可对大量细胞或其他粒子进行计数，远大于可实际上在视觉计数器中成像的细胞的数量。但流式细胞仪在如下方面不那么有效：按类型区分细胞，或实现正常与异常细胞之间的区别，或将成群细胞诸如血小板团块与离散血细胞区分开。通过在统计上显著数量的带形样品料流的图像帧中操作分析仪，例如如所述的视觉分析仪，可测量血细胞类型的分布或成比例比率。由视觉分析仪测定的成比例比率或其函数应用于血细胞计数，并且更大数量的血细胞由流式细胞仪计数，但就细胞类型而言较少区分或未区分，从而提供利用这两种类型的分析仪的特殊优点的准确总血液计数。
根据一些实施例，可通过应用算法，例如基于粒子计数的成比例比率的算法，来推断粒子计数。图5示出了适于血液分析的示例性装置。在一些实施例中，粒子计数器15和视觉分析仪17可串联而非并联。粒子计数器15可为例如库尔特血细胞计数器，其检测并计数流体中的血细胞和粒子。在这种类型的计数器中，流路(未示出)被布置成输运包封在流体中的粒子流。流路变窄而迫使流路中的粒子成单行。横跨流路的一对电极或其他检测器通过在细胞穿过时检测电阻抗的脉冲式变化或光源与光检测器之间的光路的遮挡来产生计数。粒子计数器15被配置成对大量细胞或其他粒子进行计数。但粒子计数器15可能不能区分各亚类目细胞的各成员和/或区分正常与异常细胞，或将成群细胞诸如血小板团块与离散血细胞区分开。
视觉分析仪17还可包括至少一个接触室25，所述接触室被配置成提供能有效产生用于粒子分类和/或子分类的视觉差别的至少一种化学品，所述化学品包括稀释剂、透化剂、对比剂中的至少一者。例如，如参照图1和5所示，通过样品注射器29将接触的样品引入流通池中，并且从注射器27引入鞘流体或细胞内细胞器配向试剂。可使用稀释剂将样品稀释到合适的浓度。使用对比剂和/或透化剂产生用于分类和/或子分类粒子的视觉差别。使用PIOAL使特定类型的细胞或细胞结构在更好成像的方向上配向。在一些实施例中，可施加所述至少一种化学品以首先接触样品，然后将所处理的样品提供于视觉分析仪17上。通过至少添加至少一种化学品对样品的处理可在室温下进行。在一些实施例中，此类处理可在诸如10、15、20、25、30、35、36、37、38、38、39、40、45、46、47、48、49或50℃的温度下进行。在所选温度下的处理可在培养箱中进行，所述培养箱与视觉分析仪17分隔开或在视觉分析仪17上，并且是温度受控的。
在一些实施例中，视觉分析仪可具有对比剂注射器以用于使样品与对比剂和/或透化剂或表面活性剂接触。在其他实施例中，可在注入视觉分析仪中之前，使样品与对比剂、透化剂接触。在其他实施例中，视觉分析仪包含加热元件以用于在与对比剂和/或透化剂接触时将样品在受控温度下加热受控时间。视觉分析仪还可具有冷却元件以用于在加热步骤之后冷却样品混合物。可用于处理血液流体样品的示例性对比剂组合物和方法在共同待审的美国专利申请号________中有所公开，所述专利的内容以引用方式并入本文中。
通过在统计上显著数量的带形样品料流的图像帧中操作如所述的视觉分析仪17，可通过处理器18测定各细胞类目和/或亚类目中的细胞的成比例比率。由视觉分析仪17测定的成比例比率应用于血细胞计数，并且更大数量的血细胞由粒子计数器15计数，但就细胞类目和/或亚类目内的成员而言较少区分或未区分，从而提供利用粒子计数器15和视觉分析仪17两者的特殊优点的准确总血液计数。
除了提供准确结果之外，包括粒子计数器15和视觉分析仪17的装置还提供改善分析速度方面的显著优点。在图5中，计数不同血细胞的准确结果可通过显示器63输出。在分析过程期间，操作人员可通过终端65与处理器18进行交互。之前，通过用对比剂制备由操作人员在显微镜下检查的载片来人工复查最多至约25％至30％的结果。相比之下，使用本发明的装置的示例性方法包括粒子计数器上的CBC以及根据一些实施例分类和/或子分类血细胞。通过操作如本公开中所述的装置，可在视觉分析仪上复查图像并且样品将需要更少频率的人工复查。
电机54可包括精度略微小于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备所成像的区别性特征(特别是血细胞的各方面)的齿轮步进电机。如果调节高光学分辨率成像设备24的位置以将光学物镜的位置定位于带形样品料流的宽度内，则带形样品料流中的细胞/粒子的视图在焦点内。自聚焦光栅可位于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的视野的边缘处，并且因此不会干扰观察。
此外，当高光学分辨率成像设备在位移距离内移动并且自聚焦光栅偏离焦点时，出现在焦点内的特征是血细胞而非自聚焦光栅。根据一些实施例，自聚焦光栅可由视野中的形状限定。所述形状为有限尺寸的相对薄的离散形式，并且因此在移动位移距离之后，当聚焦于带形样品料流时所述形式在数字化图像中基本上不可见。在尺寸适合血液学(血细胞)成像应用的流通池中，典型的位移距离可为例如50至100μm。在一些实施例中，自聚焦特征保持高光学分辨率成像设备处于最佳焦距的1μm内。
可调节流通池内部轮廓以及PIOAL和样品流速以使得样品形成带形料流。料流可与包封在带形样品料流中的粒子大约一样薄或甚至更薄。白血细胞可具有例如约10μm的直径。通过提供厚度小于10μm的带形样品料流，当带形样品料流被鞘流体或PIOAL拉伸时细胞可以取向。令人惊讶的是，带形样品料流沿着变窄流路在粘度与带形样品料流不同(诸如更高粘度)的PIOAL层内的拉伸有利地往往会使非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，并对细胞施加力，从而改善细胞的细胞内结构的焦点内内容物。高光学分辨率成像设备24的光轴基本上正交(垂直)于带形样品料流的平面。带形样品料流在成像点的线速度可为例如20-200mm/s。在一些实施例中，带形样品料流的线速度可为例如50-150mm/s。
带形样品料流厚度可受样品流体和PIOAL的相对粘度和流速的影响。样品源25和/或PIOAL源27(例如，包括精密容积泵)可被配置成以可控的流速提供样品和/或PIOAL以优化带形样品料流32的尺寸，即作为至少与高光学分辨率成像设备24的视野一样宽的薄带。
在一个实施例中，PIOAL源27被配置成以预定的粘度提供PIOAL。该粘度可与样品的粘度不同，并且可以高于样品的粘度。对PIOAL的粘度和密度、样品材料的粘度、PIOAL的流速和样品材料的流速进行协调以在离自聚焦光栅的位移距离处维持带形样品料流，并具有预定的尺寸特性，诸如有利的带形样品料流厚度。
在实践实施例中，PIOAL具有比样品更高的线速度和比样品更高的粘度，从而将样品拉伸成平带。PIOAL粘度可为最高10厘泊。
在图5中所示的实施例中，用于分析从光传感器阵列获得的像素数字图像的相同数字处理器18也用于控制自聚焦电机54。然而，高光学分辨率成像设备24并不会对每张捕获的图像自聚焦。自聚焦过程可周期性地或例如在适当传感器检测到温度或其他工艺变化时或在图像分析发现可能需要重聚焦时完成。在其他实施例中还可以使血液学图像分析由一个处理器完成，并且使单独的处理器，任选地与其自身光传感器阵列相关联，被布置用于处理自聚焦于固定靶标44的步骤。
在图5中，至少一个所述数字处理器18被配置成在程序化时间或在程序化条件下或根据用户需求自聚焦，并且还被配置成执行基于图像的粒子的分类和子分类。示例性粒子包括细胞、白血细胞、红血细胞等等。
在一个实施例中，至少一个所述数字处理器18被配置成检测自聚焦再引发信号。自聚焦再引发信号可由检测到的温度变化、如由像素图像日期的参数所识别的聚焦质量的降低、时间的流逝或用户输入而触发。有利的是，从测量位移距离52以重新校准的意义上说，不必要重新校准。任选地，自聚焦可程序化以在运行之间以特定频率/间隔重新校准以便进行质量控制和/或保持聚焦。
位移距离52在一个流通池与另一个流通池之间略有差异，但对于给定流通池而言保持恒定。作为装配图像分析仪与流通池时的安装过程，首先估计位移距离，然后在其中执行自聚焦和成像方面的校准步骤期间，测定流通池的准确位移距离并作为常数输入处理器18的程序设计中。
参照图6，根据一些实施例用于分析包含粒子的样品12的示例性装置10包括具有至少一个检测范围的粒子计数器15、分析仪17和处理器18。图6的框图是出于举例说明的目的。粒子计数器15、分析仪17和处理器18可以彼此连接或可以不彼此连接。在一些实施例中，处理器可耦合到分析仪和/或粒子计数器。在其他实施例中，处理器可为分析仪和/或粒子计数器的部件。
粒子计数器15包括至少一个通道，并且被配置成为至少一种类目和/或亚类目的粒子提供粒子计数。在一些实施例中，粒子计数器15包括用于不同类目和/或亚类目的粒子的至少两个通道。在一些实施例中，通过感测样品的电阻抗或光散射来对粒子进行计数。合适粒子计数器15的例子包括但不限于流式细胞仪。在一些实施例中，响应于不同物理性质而同时或顺序地在多个通道中的每个中发生检测。
分析仪17被配置成区分不同类目和/或亚类目以及每种类目和/或亚类目的粒子的对应成员。合适分析仪17的例子包括但不限于视觉分析仪、数字相机或可捕获像素数据的任何其他像素数据分析仪，并且被程序化为区分像素文件中代表的属性。处理器18和分析仪17被配置成应用算法，诸如测定两种类目或两种对应亚类目的粒子的计数的成比例比率，以及将此成比例比率应用于在粒子计数器15的至少一个通道中获得的至少一种类目和/或亚类目的粒子的粒子计数。在数据分析之后，处理器18在输出20处提供样品12中的每种类目和每种对应亚类目的粒子的浓度的准确量度。
在一些实施例中，在样品12中，至少第一类目和/或亚类目的粒子可以适用于第一类目和/或亚类目的粒子的检测范围之外的浓度存在，而至少第二类目和/或亚类目的粒子以适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围之内的浓度存在。在粒子计数器15上测定第二类目和/或亚类目的粒子的浓度。在分析仪17上测定第一类目和/或亚类目与第二类目和/或亚类目的粒子的成比例比率。至少部分地通过如下方式在处理器18上计算第一类目和/或亚类目中的粒子的浓度：将此成比例比率应用于第二类目和/或亚类目的粒子的浓度。
在一些实施例中，粒子计数器15的所述至少一个通道中检测到的一类目和/或亚类目的粒子可包括至少两种类别的粒子。并且每种类别的粒子可包括多种亚类别。粒子计数器15被配置成检测符合例如基于预定尺寸范围的一项或多项选择标准的多个粒子并提供其粒子计数。选择标准涵盖至少两种类别的粒子的成员。分析仪17和处理器18被程序化以区分所述至少两种类目和/或亚类目的粒子的成员。在处理器18上测定每个成员在至少两种类目和/或亚类目内的分布。处理器18使用此分布校正粒子计数器15上获得的所述至少两种类目和/或亚类目中至少一者的成员的粒子计数。
更具体地讲，装置10可用于鉴定和定量样品中的不同血细胞，包括RBC、WBC、PLT和其他血细胞、胎儿细胞、或细菌细胞、病毒粒子、寄生生物、囊肿(包括寄生虫性囊肿)、晶体或其碎片或其他细胞碎片。
图6A描绘了根据本发明实施例的示例性计数器或计数模块600a的各方面。此类计数器可以操作以控制或实施针对WBC、RBC和PLT细胞计数和血红蛋白测量的各种机械功能以及电子和光度测量功能。示例性计数器可用于制备CBC分析用样品，以及经由孔浴槽组件(例如，WBC浴槽610a和RBC浴槽620a)生成CBC参数测量值。根据一些实施例，图6的计数器15可由图6A的计数器600a表示。相似地，根据一些实施例，图5的计数器15可由图6A的计数器600a表示。根据一些实施例，图7的计数器722可由图6A的计数器600a表示。
可使用电阻抗方法对血液的细胞成分(例如，红血球、白血球和血小板)进行计数。例如，可将抽吸的全血样品分成两个等分试样，并与等渗稀释剂混合。可将第一稀释液递送到RBC孔浴槽620a，并可将第二稀释液递送到WBC孔浴槽610a。在RBC室中，可通过细胞穿过感测孔时的电阻抗对RBC和血小板两者进行计数和区分。例如，可将介于2fL和20fL之间的颗粒计作血小板，且可将大于36fL的那些颗粒计作RBC。对于WBC室处理而言，可将RBC裂解试剂添加到WBC稀释液等分试样，用于裂解RBC和释放血红蛋白，然后可在WBC浴槽的感测孔中通过阻抗对WBC进行计数。在一些情况下，所述浴槽可包括多个孔。因此，例如，可使用RBC三孔浴槽来获得血细胞计数技术中所使用的血细胞计数。
示例性CBC样品制备技术可包括两个过程，即样品采集和样品递送。样品采集可在抽吸165μL患者样品并将该样品导向至血液采样阀(BSV)时进行。BSV可操作以将特定体积的患者样品与处理试剂一起导向，以递送到两个三孔浴槽。患者样品和处理试剂能够以一定角度递送到孔浴槽的底部，该孔浴槽由于具有圆形设计，允许样品和试剂充分混合而不会混合气泡。然后可以制备供测量和分析用的样品。根据一些实施例，在WBC浴槽中，6.0mL(±1.0％)稀释剂和28μL样品可以与1.08mL(±1.0％)DxH细胞裂解物混合，达到1:251的最终稀释度。根据一些实施例，在RBC浴槽中，10mL(±1.0％)稀释剂和1.6μL样品可进行混合，达到1:6250的最终稀释度。在患者样品和试剂进行混合之后，可对孔施加真空和孔电流，以测量细胞计数和细胞体积。RBC和PLT计数还可包括施用扫流技术，以防止细胞在孔附近发生再循环。在某些实施例中，针对RBC和PLT的数据采集可持续最多20秒，且针对WBC的数据采集可持续最多10秒。在某些实施例中，可通过前置放大器卡放大由孔组件生成的所有模拟脉冲，然后将所述模拟脉冲发送到CBC信号调节分析器卡以进行模拟-数字转换和参数提取。根据一些实施例，可以使用系统测量针对每个细胞事件的多种参数，并且可以使用数字参数提取方法提供数字测量值，诸如时间、体积(脉冲属性，包括振幅和脉冲宽度)、计数和计数率、以及等待时间。可使用此类测量值进行脉冲编辑、重叠校正、计数投票，生成WBC、RBC和PLT的直方图，进行直方图投票、模式分析、以及干扰校正，等等。
图6B为示例性模块系统的简化框图，该框图广义地例示了可如何以分离方式或更集成化的方式实施模块系统600b的个体系统元件。模块系统600b可以是根据本发明实施例的用于使血液样品流体中的粒子成像的粒子分析系统的一部分或与该粒子分析系统相连。模块系统600b非常适于生成与动态范围扩展技术相关的数据或指令、接收与动态范围扩展技术相关的输入、和/或处理与动态范围扩展技术相关的信息或数据，如本文其他地方所述。在一些情况下，模块系统600b包括经由总线子系统602b电耦合的硬件元件，包括一个或多个处理器604b、一个或多个输入设备606b(诸如用户界面输入设备)、和/或一个或多个输出设备608b(诸如用户界面输出设备)。在一些情况下，系统600b包括网络接口610b、和/或分析仪或计数器系统接口640b，其可从分析仪/计数器系统642b接收信号和/或将信号传送到分析仪/计数器系统642b。在一些情况下，分析仪/计数器系统642b可包括如图6中所描绘的分析仪17和/或粒子计数器15。在一些情况下，系统600b包括软件元素，所述软件元素例如在此处被显示为当前正位于存储器614b的工作存储器612b、操作系统616b和/或其他代码618b(诸如被配置为实施本文所公开技术的一个或多个方面的程序)内。
在一些实施例中，模块系统600b可以包括存储子系统620b，该存储子系统可以存储提供本文所公开的各种技术的功能的基础编程和数据构造。例如，实现如本文所述方法方面的功能的软件模块可以存储于存储子系统620b中。这些软件模块可由一个或多个处理器604b执行。在分布式环境中，所述软件模块可存储在多个计算机系统上并由所述多个计算机系统的处理器执行。存储子系统620b可以包括存储器子系统622b和文件存储子系统628b。存储器子系统622b可包括多个存储器，包括用于在程序执行期间存储指令和数据的主随机存取存储器(RAM)626b，以及其中存储固定指令的只读存储器(ROM)624b。文件存储子系统628b可为程序和数据文件提供永久性(非易失性)存储，并且可以包括有形存储介质，该有形存储介质可以任选地体现样品、患者、治疗、评估数据，或其他数据。文件存储子系统628b可以包括硬盘驱动器、连同相关联的可移动介质的软盘驱动器、紧凑型数字只读存储器(CD-ROM)驱动器、光盘驱动器、DVD、CD-R、CD RW、固态可移动存储器、其他可移动的介质盒或盘，等等。所述驱动器中的一个或多个可位于在其他位点处耦合到模块系统600b的其他连接计算机上的远程位置处。在一些情况下，系统可以包括存储一个或多个指令序列的计算机可读存储介质或其他有形存储介质，所述一个或多个指令序列在被一个或多个处理器执行时，可导致所述一个或多个处理器执行本文所公开的技术或方法的任何方面。实现本文所公开技术的功能的一个或多个模块可由文件存储子系统628b存储。在一些实施例中，所述软件或代码将提供允许模块系统600b与通信网络630b进行通信的协议。任选地，此类通信可以包括拨号连接通信或互联网连接通信。
应当理解，系统600b可被配置成实施本发明方法的各方面。例如，处理器部件或模块604b可以是微处理器控制模块，该微处理器控制模块被配置成从传感器输入设备或模块632b、从用户界面输入设备或模块606b、和/或从分析仪/计数器系统642b，任选地经由分析仪/计数器系统接口640b和/或网络接口610b以及通信网络630b接收信号或数据。在一些情况下，传感器输入设备可包括粒子分析系统或为粒子分析系统的一部分，所述粒子分析系统被装配为获得血液流体样品的图像。在一些情况下，用户界面输入设备606b和/或网络接口610b可被配置成接收由粒子分析系统生成的图像参数信号，所述粒子分析系统被装配为获得图像参数。在一些情况下，分析仪/计数器系统642b可包括粒子分析系统或为粒子分析系统的一部分，所述粒子分析系统被装配为获得与血液流体样品相关的图像参数和/或计数参数。
处理器部件或模块604b还可以被配置成将任选地根据本文所公开任何一种技术处理的粒子分析参数信号或图像参数信号传递到传感器输出设备或模块636b、到用户界面输出设备或模块608b、到网络接口设备或模块610b、到分析仪/计数器系统接口640b、或到它们的任何组合。根据本发明实施例的设备或模块中的每一个可以包括位于被处理器处理的计算机可读介质上的一个或多个软件模块，或硬件模块，或它们的任何组合。可使用多种常用平台(诸如Windows、MacIntosh和Unix)中的任何一种，及多种常用编程语言中的任何一种，来实现本发明的实施例。
用户界面输入设备606b可以包括(例如)触摸板、键盘、指示设备(诸如鼠标)、轨迹球、图形输入板、扫描器、操纵杆、结合到显示器中的触摸屏、音频输入设备(诸如语音识别系统)、麦克风、以及其他类型的输入设备。用户输入设备606b还可以从有形存储介质或从通信网络630b下载计算机可执行代码，该代码体现本文所公开方法或其各方面中的任何一者。应当理解，终端软件可以时常更新，并且在适当的情况下被下载到终端。一般来讲，使用术语“输入设备”旨在包括用于将信息输入模块系统600b中的多种常规和专属的设备和方法。
用户界面输出设备606b可以包括(例如)显示子系统、打印机、传真机、或非视觉显示器(诸如音频输出设备)。显示子系统可以是阴极射线管(CRT)、平板设备(诸如液晶显示器(LCD))、投影设备等等。显示子系统还可以诸如经由音频输出设备提供非视觉显示。一般来讲，使用术语“输出设备”旨在包括用于从模块系统600b向用户输出信息的多种常规和专属的设备和方法。
总线子系统602b提供用于使模块系统600b的各种部件和子系统彼此按预期的方式或根据需要进行通信的机制。模块系统600b的各种子系统和部件无需处于相同的物理位置，而是可以分布在分布式网络内的各个位置处。尽管总线子系统602b被示意性地显示为单根总线，但是总线子系统的另选实施例可以利用多根总线。
网络接口610b可提供通向外部网络630b或其他设备的接口。外部通信网络630b可被配置成根据需要或期望实现与其他方的通信。该外部通信网络由此可以接收来自模块系统600b的电子数据包，并且根据需要或期望将任何信息传输回模块系统600b。如此处所描绘，通信网络630b和/或分析仪/计数器系统接口640b可向分析仪/计数器系统642b传输信息或接收来自分析仪/计数器系统642b的信息，该分析仪/计数器系统642b被装配为获得对应于血液流体样品的多个图像或图像参数和/或计数参数。
除了提供系统内部的此类基础结构通信链接之外，通信网络系统630b还可以为诸如互联网之类的其他网络提供连接，并且可以包括有线、无线、调制、和/或其他类型的接口连接。
对技术人员显而易见的是，可以根据具体要求来使用大量的变型。例如，也可以使用定制的硬件并且/或者可以在硬件、软件(包括便携式软件，诸如小应用程序)或这两者中实现特定的元件。此外，可以采用至其他计算设备(诸如网络输入/输出设备)的连接。模块终端系统600b本身可以是包括计算机终端、个人计算机、便携式计算机、工作站、网络计算机、或任何其他数据处理系统的不同类型的模块终端系统。由于计算机和网络的不断变化的性质，因此图6B中描绘的模块系统600b的描述仅旨在作为出于举例说明本发明的一个或多个实施例的目的的具体例子。模块系统600b的比图6B中所描绘的模块系统具有更多或更少部件的许多其他构形是可能的。模块系统600b的模块或部件中的任何一个或此类模块或部件的任何组合可以与本文所公开的粒子分析和/或成像系统实施例中的任何一个耦合、或集成到其中、或以其他方式被配置成与其建立连接。相关地，以上论述的硬件和软件部件中的任何一个可以与在其他位置处使用的其他医疗评估或治疗系统集成在一起或被构造成与所述系统接合。
在一些实施例中，模块系统600b可以被配置成接收输入模块处的血液流体样品的一种或多种图像参数。可将图像参数数据传输到评估模块，在评估模块处，可基于图像数据的分析来预测或确定诊断或其他结果。图像或诊断数据可以经由输出模块输出至系统用户。在一些情况下，模块系统600b可例如通过使用诊断模块来确定血液流体样品的诊断结果。诊断信息可以经由输出模块输出至系统用户。任选地，该诊断的某些方面可以由输出设备确定，并且传输至诊断系统或诊断系统的子设备。可将与血液流体样品或从其获得样品的患者相关的多个数据中的任何一个输入到模块系统中，包括年龄、体重、性别、治疗史、病史，等等。可以基于这种数据来确定治疗方案或诊断评价的参数。
相关地，在某些情况下，系统包括被配置成接收图像数据作为输入的处理器。任选地，处理器、存储介质或这两者可以结合在血液学或粒子分析机器内。在一些情况下，血液学机器可以生成用于输入到处理器中的图像数据或其他信息。在一些情况下，处理器、存储介质或这两者可以结合在计算机内，并且该计算机可以与血液学机器进行通信。在一些情况下，处理器、存储介质或这两者可以结合在计算机内，并且该计算机可以经由网络与血液学机器进行远程通信。
图7描绘了根据本发明实施例用于测量血液流体样品中的第一细胞类型的数量的系统和方法的各方面，其中样品还包含第二细胞类型。如这里所示，方法700可包括从血液流体样品710获得样品的第一体积720和样品的第二体积730。如步骤724所指示，方法可包括通过使第一体积流过血液学细胞计数器722来测定样品的第一体积720中的第二细胞类型的群体。通常，细胞计数器722适用于在样品中有足够量的电可区分类型的细胞时且不在细胞类型的量超过特定限值或阈值时准确地对细胞进行计数。细胞计数器可用于在较短时长内对血液样品中的红血细胞或其他组分(例如，大组分)的总数进行计数。在一些情况下，当区分血液中的白血细胞和其他组分(例如，大组分)或可能存在若干不同物质但每种物质数量相对较少时，细胞计数器可遇到挑战。
此外，方法700可包括如步骤732所指示通过将样品的第二体积730注入流通池内流动的鞘流体中以便提供具有厚度和大于厚度的宽度的样品料流，从而采集第一数量的第一类型细胞和第二数量的第二细胞类型的图像，所采集的图像是沿着横越样品料流的厚度的图像路径采集的。在一些情况下，使用如图5和/或图6中所描绘的分析仪17进行图像采集732。在一些情况下，分析仪可有效地区分血液流体样品中的白血细胞、巨大血小板和其他大组分。然而，当使用此类分析仪获得样品中的全粒子计数时，可能存在挑战。此外，在一些情况下，可能不期望使用分析仪获得某些计数(例如，所有红血细胞的计数)，因为除获得计数之外，此类计数工序还可涉及进行粒子的表征。根据一些实施例，分析仪用于获得通过分析仪处理的仅一定百分比或一部分的样品的图像。
如图7中所描绘，方法700可包括如步骤738所指示使用所采集的图像测定第一数量的第一细胞类型734与第二数量的第二细胞类型736的比率。方法还包括如步骤740所指示使用比率738和第二细胞类型724的群体计算样品中的第一细胞类型的细胞数量量度。
根据一些实施例，步骤740处计算的细胞数量量度为血液流体样品710中的第一细胞类型的细胞浓度。在一些情况下，步骤740处计算的细胞数量量度为血液流体样品710中的第一细胞类型的细胞计数。在一些情况下，细胞计数器722具有与对第一细胞类型计数相关的第一精确度和与对第二细胞类型计数相关的第二精确度，其中第二精确度优于或高于第一精确度。在一些情况下，(参见例如图10A和10B)血液学细胞计数器722具有所需精确度范围，并且所需精确度范围在第一体积720中的细胞的最小群体与第一体积720中的细胞的最大群体之间延伸，其中在步骤724处测定的体积的第二细胞类型的群体在所需精确度范围之内，并且其中在步骤740处计算的样品的第一细胞类型的细胞数量量度在所需精确度范围之外。
如图7中进一步描绘(且继续参照图10A和10B)，方法可任选地包括由于第一体积流过血液学细胞计数器722而测定样品的第一体积中的第一细胞类型726的群体。第一体积中的第一细胞类型726的所测定群体可高于或低于第一细胞类型的所需精确度范围，并且也可不同于如步骤740中所计算的第一细胞类型的细胞数量量度。在一些情况下，(例如，图10A)，第一细胞类型726的所测定群体为零。在一些情况下，(例如，图10B)，第一细胞类型726的所测定群体大于零。
根据本发明的一些实施例，血液学细胞计数器722可包括响应于第二类型细胞流过细胞计数器而检测电阻抗的变化的传感器机构。根据一些实施例，血液学细胞计数器722包括响应于第二类型细胞流过细胞计数器而检测光路的遮挡的传感器机构。
在一些情况下，血液学细胞计数器722具有第一细胞类型的最小可检测浓度限值和最大可检测浓度限值，以及第二细胞类型的最小可检测浓度限值和最大可检测浓度限值。第二细胞类型724的所测定群体可基于高于第二细胞类型最小限值并低于最大限值的第二细胞类型的所检测浓度参数。第一细胞类型可以低于第一细胞类型最小限值或高于最大限值的浓度存在。
在一些情况下，血液学细胞计数器722具有第一细胞类型的最小可检测体积限值和最大可检测体积限值，以及第二细胞类型的最小可检测体积限值和最大可检测体积限值。第二细胞类型724的所测定群体可基于高于第二细胞类型最小限值并低于最大限值的第二细胞类型的所检测体积参数。第一细胞类型可以低于第一细胞类型最小限值或高于最大限值的体积参数存在。
在一些情况下，血液学细胞计数器722具有第一细胞类型的最小可检测尺寸限值和最大可检测尺寸限值，以及第二细胞类型的最小可检测尺寸限值和最大可检测体积尺寸。第二细胞类型724的所测定群体可基于高于第二细胞类型最小限值并低于最大限值的第二细胞类型的所检测尺寸参数。第一细胞类型可以低于第一细胞类型最小限值或高于最大限值的尺寸参数存在。
根据本发明的一些实施例，(参照图13b、c)，样品第一体积中的第二细胞类型724的群体的测定包括将第一细胞类型的细胞和第二细胞类型的细胞分组在一起。在一些情况下，方法还可包括使用比率和第二细胞类型的群体计算样品中的第二细胞类型的细胞数量量度。在一些情况下(例如，如图10D中所描绘)，样品第一体积中的第二细胞类型724的群体的测定包括将第一细胞类型的细胞和第二细胞类型的细胞分组在一起，以及由于第一体积流过血液学细胞计数器722而测定样品的第一体积中的第一细胞类型726的群体。如步骤740中计算的样品中的第一细胞类型的细胞数量量度可使用比率738、第二细胞类型724的群体和第一细胞类型726的群体。
在其他方面，例如如图8和/或图10A和10B中所描绘，提供了用于分析包含粒子的样品的方法。在此方法中，将样品提供于具有检测限值的粒子计数器上，如图8的方法70中的步骤72所指示。至少第一类目和/或亚类目的粒子可以适用于第一类目和/或亚类目的粒子的检测范围之外的浓度存在于样品中，并且至少第二类目和/或亚类目的粒子在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围内存在于样品中。在粒子计数器上测定样品中第二类目和/或亚类目的粒子的浓度，如步骤74所指示。还将样品提供于分析仪上以测定第一类目和/或亚类目的粒子与第二类目和/或亚类目的粒子的成比例比率，如步骤76所指示。至少部分地通过如下方式计算第一类目和/或亚类目中的粒子的浓度：将成比例比率应用于第二类目和/或亚类目的粒子的浓度，如步骤78所指示。图10A示出了样品中低于检测范围的粒子的检测，并且图10B示出了以高于检测范围存在于样品中的粒子的检测。
图8因此示出了根据一些实施例的测定第一类目的粒子的浓度的示例性方法70，所述第一类目的粒子以粒子计数器的检测范围之外的浓度存在于样品中。在步骤72中，还参照图6和8，将样品12提供于具有至少一个检测范围的粒子计数器15上。样品12包含可分散于流体中的粒子。在一些实施例中，第一类目的粒子以高于适用于第一类目的粒子的检测范围的上限的浓度存在于样品中。第二类目的粒子在适用于第二类目的粒子的检测范围内存在于样品中。例如，第一类目和/或亚类目的粒子可包括WBC。第二类目的粒子可包括血小板。
在一些实施例中，第一类目的粒子以低于适用于第一类目的粒子的可检测范围的下限的浓度存在于样品中。第二类目的粒子在适用于第二类目的粒子的检测范围内存在于样品中。例如，第一类目的粒子包括血小板。第二类目的粒子包括白血细胞。
在图8的步骤74中，在粒子计数器15上测定样品12中的第二类目的粒子的浓度。粒子计数器可包括至少一个通道。在一些实施例中在通道之一中测量第二类目的粒子。在一些实施例中粒子计数器可包括至少两个通道。如果浓度在适用于第一类目的粒子的检测范围内，则第一类目的粒子可在另一个通道中进行计数。
在图8的步骤76中，将样品12提供于分析仪诸如视觉分析仪17(例如，如图5或6中所描绘)上以测定第一类目的粒子与第二类目的粒子的成比例比率。在一些实施例中，视觉分析仪17包括如上所述连接到成像设备的流通池22。可根据本文所述的方法测定第一类目的粒子与第二类目的粒子的成比例比率。例如，可将包括稀释剂、透化剂和对比剂中至少一者的至少一种化学品引入样品中。可用于处理血液流体样品的示例性化学品、组合物、对比剂和相关组合物在共同待审的美国专利申请No.____中有所讨论，所述专利的内容以引用方式并入本文中。对比剂可有效地产生能区分第一类目和/或亚类目和第二类目和/或亚类目的粒子的视觉差别。在一些实施例中可将图5中所描绘的所制备样品12B施加到所述至少一个流通池22。捕获所制备样品12B的粒子的图像。通过分析仪进行图像分析，所述分析仪可为视觉分析仪17和/或处理器18。然后通过分析带形样品料流的多个图像，测定第一类目的粒子与第二类目的粒子的成比例比率。
在图8的步骤78中，然后可通过处理器18(例如，如图6中所描绘)至少部分地通过将成比例比率应用于第二类目的粒子的浓度来计算第一类目中的粒子的浓度。
本公开还提供用于分析包含粒子的样品的方法。图9示出了根据一些实施例测定两种亚类目的粒子的浓度的示例性方法80，所述粒子不能被粒子计数器区分开。在步骤82中，将样品(例如，图6的样品12)提供于粒子计数器(例如，图6的粒子计数器15)上，所述粒子计数器具有希望区分开的至少两种类目或亚类目的粒子所符合的检测标准。来自粒子计数器的结果涵盖图9的步骤84中单个计数内的这些类目或亚类目。
在步骤86中，将样品提供于分析仪(诸如视觉分析仪)上以测定第一类目或亚类目的粒子与第二类目或亚类目的粒子的成比例比率。在一些实施例中，例如如图5和/或6中所描绘，视觉分析仪17包括连接到成像设备的流通池22。
可根据本文所述的方法测定第一类目或亚类目的粒子与第二类目或亚类目的粒子的成比例比率。将包括稀释剂、透化剂和对比剂中至少一者的至少一种化学品引入样品中。对比剂能有效地产生用于将第一类目或亚类目与第二类目或亚类目的粒子区分开的粒子分类和子分类的视觉差别。如图5中所描绘，在一些实施例中可将所制备样品12B施加到所述至少一个流通池22。捕获所制备样品12B的粒子的图像。通过视觉分析仪和/或处理器18进行图像分析。然后通过分析多个图像，测定所述至少第一类目的粒子与第二类目的粒子的成比例比率。
在图9的步骤88中，然后可通过处理器18，如图5或6中所描绘，至少部分地通过将成比例比率应用于从粒子计数器获得的单个计数(例如，图9的步骤84)来计算第一类目或亚类目中的粒子的浓度。
在一些实施例中，第一类目和/或亚类目的粒子以高于适用于第一类目和/或亚类目的粒子的检测范围的上限的浓度存在于样品中。第二类目和/或亚类目的粒子在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围内存在于样品中。例如，第一类目的粒子包括白血细胞。第二类目的粒子包括血小板。如图10B所示，来自本公开分析仪的粒子计数可用于校正与粒子计数器所用的至少一个检测范围诸如粒子浓度、体积和/或尺寸相关的不准确粒子计数。通过操作如本公开中所述的装置，可准确地检测和测量以高于检测范围的上限的量存在的粒子。
在一些实施例中，第一类目和/或亚类目的粒子以低于适用于第一类目和/或亚类目的粒子的某种参数例如浓度的可检测范围的下限存在于样品中，如图10A所示。第二类目和/或亚类目的粒子在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围内存在于样品中。如图10A所示，来自本公开分析仪的两种类目和/或亚类目中的粒子计数的成比例比率可用于校正来自粒子计数器的至少一种类目和/或亚类目的不准确计数。通过操作如本公开中所述的装置，可准确地测量不能通过粒子计数器检测的以低于检测范围限值存在的粒子。
如图10A所示，粒子计数器提供类目2的粒子计数。分析仪提供类目1和2的粒子计数的成比例比率。通过将成比例比率乘以类目2的粒子计数，该过程得到类目1的粒子计数。第一类目和/或亚类目的粒子可包括例如血小板。第二类目和/或亚类目的粒子包括白血细胞。根据一些实施例，当样品中所含的血小板数量较低时，本文所公开的动态或检测范围扩展系统和方法可用于获得准确的血小板计数。
在一些实施例中，分析仪包括成像设备和连接到成像设备的流通池以测定第一类目和/或亚类目的粒子与第二类目和/或亚类目的粒子的成比例比率。将稀释剂、透化剂、对比剂中的至少一者引入样品中。所述至少一种化学品能有效地产生能区分第一和第二类目和/或亚类目的粒子的视觉差别。在测定此成比例比率的步骤中，将样品施加到存在于一些实施例中的所述至少一个流通池中。捕获样品的粒子的多个图像以提供计数或成比例比率的统计上显著的估计。然后通过对第一和第二类目和/或亚类目的粒子每者中的粒子进行计数，测定所述至少第一类目和/或亚类目的粒子与第二类目和/或亚类目的粒子的成比例比率。
在另一方面，如图9和/或图10D中所描绘，提供了用于分析包含粒子的样品的方法80以校正粒子计数器上获得的粒子计数。例如，本公开的来自分析仪的结果例如相对计数可用于获得粒子计数器单独所用的一种或多种检测标准无法区分开的各类目和/或亚类目的粒子的准确粒子计数。
在图10C中所示的另一个实施例中，计数器可为多种粒子提供基本上准确的计数。所述多种粒子涵盖至少两种亚类目的成员，但计数无法在亚类目之间区分。可在分析仪上测定所述至少两种亚类目的成员每者的分布。亚类目的分布是各自亚类目的计数与总计数的成比例比率。处理器被程序化以区分所述至少两种亚类目的成员。通过使用来自分析仪的分布和来自粒子计数器的总粒子计数，例如如图10C中所描绘，然后可由处理器通过使用所述成员每者的分布测定所述至少两种亚类目中的至少一者的成员的粒子计数。
根据一些实施例，如图10D中所描绘，样品可具有存在的两种类目的粒子。在该上下文中，类目可理解为包括多种类目和/或多种亚类目的可能性。通过操作如本公开中所述的装置，可对粒子的计数进行校正，其中来自至少一种另外类目的粒子的至少一些成员被粒子计数器错误分类或子分类为第一类目的粒子的成员。在此方法中，可使用预定范围例如尺寸和/或体积范围在粒子计数器上提供其粒子计数，从而测定多种粒子的计数。在粒子计数中所述预定范围将第一类目的粒子的成员和至少第二类目的粒子的至少一些成员分组在一起。可使用被配置成区分样品中的粒子在第一类目的粒子和所述至少第二类目的粒子内的分布的分析仪，单独且准确地测量在装置的一个通道中被错误计数为另一种类目的粒子的一种或多种类目或亚类目中的那些粒子。类目和/或亚类目的分布是各自类目和/或亚类目的计数与总计数的成比例比率。处理器然后使用该分布计算第一类目和所述至少第二类目和/或亚类目的粒子的成员的粒子计数。在该实施例中，如图10D所示，可校正本公开的装置和方法及每种类目和/或亚类目中的粒子的计数。
如图10D所示，粒子计数器可提供包含两种类目的基本上准确的总计数。该计数可包括类目1和2的假定计数。然而，该假定计数不准确，因为粒子计数器将类目2的至少一个成员错误分类为类目1。分析仪为类目1和2提供基于比粒子计数器中所用更小的样品的粒子计数的分布，但分析仪产生准确的分布。处理器使用该信息得到这两种类目的准确计数。该相同方法可用于包含不止两种类目和/或亚类目的粒子的样品。
例如，具有类似尺寸或形态的不同粒子类目或亚类目的成员可能不能被粒子计数器准确地分类或子分类。例如，“巨大”PLT、PLT聚集体、团块、多个血小板和有核RBC可被错误计数为WBC，导致WBC计数高于样品中实际存在的计数。又如，小细胞性红细胞、细胞碎片、伪影和甚至电子噪声可被错误计数为血小板，导致PLT的不准确高计数。
在一些实施例中，分析仪是包括成像设备和流通池的视觉分析仪。例如，将包括稀释剂、透化剂、对比剂中至少一者的至少一种化学品引入样品中。所述至少一种化学品能有效地产生能区分第一类目和/或亚类目和第二类目和/或亚类目的粒子的视觉差别。在测定此分布的步骤中，将样品施加到存在于一些实施例中的所述至少一个流通池中。
在测定至少两种类目和/或亚类目的粒子的成员每者的分布的步骤中，将样品的至少一部分施加到所述至少一个流通池中。所述至少一种化学品能有效地产生能区分各类目和/或亚类目的粒子的成员的视觉差别。捕获样品的粒子的多个图像。捕获样品的粒子的多个图像以提供计数或成比例比率的统计上显著的估计。然后通过对第一和第二类目和/或亚类目的粒子每者中的粒子进行计数，测定所述至少第一类目和/或亚类目的粒子与第二类目和/或亚类目的粒子的成比例比率。
可基于样品的粒子的多个图像来测定两种或更多种亚类目的粒子每者的成员在一种类目和/或亚类目的粒子内的成比例比率、和/或第一类目和/或亚类目的粒子的成员与至少一种其他类目和/或亚类目的粒子的成员的成比例比率。然后可计算、估计、推测和/或导出每种类目和/或亚类目的粒子的计数或浓度值。例如，可基于来自分析仪的每种类目的粒子的成比例比率以及来自粒子计数器的该类目中的粒子的总数的计数，来测定各亚类目的粒子的浓度。在一些实施例中，所述至少两种亚类目的成员包括选自以下亚类目的至少一种类型的粒子：白血细胞、血小板和红血细胞。
因此，在一些实施例中，所述方法还包括基于来自分析仪和/或处理器的样品的粒子的多个图像，测定以适用于粒子计数器的一种类目的粒子的检测范围之外的浓度存在的所述一种类目和/或亚类目的粒子中的粒子的计数与在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的检测范围内的第二类目和/或亚类目的粒子中的粒子的计数的成比例比率。然后可通过将成比例比率应用于粒子计数器上获得的粒子计数，测定在粒子计数器的检测范围之外的所述类目和/或亚类目的粒子在样品中的浓度。例如，在一些实施例中，第一类目和/或亚类目的粒子以高于适用于第一类目和/或亚类目的粒子的检测范围限值的上限的浓度存在于样品中。第二类目和/或亚类目的粒子在适用于第二类目和/或亚类目的粒子的粒子计数器的检测范围内(低于检测范围的上限并高于检测范围的下限)存在于样品中。又如，当粒子计数器所用的一种或多种检测标准通过将第一类目和/或亚类目的粒子与至少第二类目和/或亚类目的粒子分组在一起而错误分类粒子时，可由根据来自视觉分析仪和/或处理器的样品的粒子的多个图像所测定的粒子的成比例比率来校正第一和第二类目和/或亚类目的粒子计数。
测量值的检测范围在图6中单独的粒子计数器15上可受到限制。例如，WBC的检测上限在粒子计数器15上可能小于100,000至200,000个/μL。PLT的检测下限可能高于10,000个/μL。通过使用本文所述的装置，可扩展测量值的有效检测范围，例如在一些实施例中WBC的检测上限可扩展最多至约300,000、350,000、400,000、410,000、420,000、430,000、440,000、450,000、460,000、470,000、480,000、490,000、500,000、510,000、520,000、530,000、540,000、550,000、560,000、570,000、580,000、590,000、600,000、610,000、620,000、630,000、640,000、650,000、660,000、670,000、680,000、690,000、700,000、710,000、720,000、730,000、740,000、750,000、760,000、770,000、780,000、790,000、800,000、810,000、820,000、830,000、840,000、850,000、860,000、870,000、880,000、890,000、900,000、910,000、920,000、930,000、940,000、950,000、960,000、970,000、980,000、990,000、或1,000,000、1,000,000、1,010,000、1,020,000、1,030,000、1,040,000、1,050,000、1,060,000、1,070,000、1,080,000、1,090,000、1,100,000、1,110,000、1,120,000、1,130,000、1,140,000、1,150,000、1,160,000、1,170,000、1,180,000或约1,190,000个细胞/μL、或这些值中任何两者之间的任何范围。在一些实施例中PLT的检测下限可扩展低至10,000、9,500、9,000、8,500、8,000、7,500、7,000、6,500、6,000、5,500、5,000、4,500、4,000、3,500、3,000、2,500、2,000、1,500或1,000、或500、400、300、200、或100个细胞/μL。
分析仪优选地包括视觉分析仪17，所述视觉分析仪可操作以测定第一类目和/或亚类目的粒子与第二类目和/或亚类目的粒子的成比例比率。在该实施例中，可通过分析视觉分析仪17上拍摄的样品中的粒子的多个图像来测定如上所述的成比例比率。
视觉分析仪17可被配置成向样品中引入包括稀释剂、透化剂和/或对比剂中至少一者的至少一种化学品以产生用于粒子分类和/或子分类的视觉差别。此类视觉差别将所述至少两种类目的成员区分开。捕获样品的粒子的图像。视觉分析仪17和处理器18被配置成通过区分样品的粒子的图像来测定每种类目或亚类目的粒子的成比例比率。然后计算每种类目或亚类目的粒子的浓度。例如，可测定WBC、巨大PLT和NRBC的准确结果。在粒子计数器上，由于类似的尺寸或形态，巨大PLT和NRBc被计数为WBC。通过操作如所述的装置，可准确地报告巨大PLT和nRBC的粒子计数或浓度。
在一些实施例中，样品可包含尺寸在粒子计数器15的检测尺寸范围之外的粒子。视觉分析仪17和处理器18被配置成检测粒子并且基于样品的粒子的图像来测定粒子计数器15的检测尺寸范围之外的粒子与检测尺寸范围之内的粒子的成比例比率。然后可计算在粒子计数器15的检测尺寸范围之外的该类目和亚类目的粒子的浓度。
一般来讲，提供了用于分析包含粒子的样品的方法以校正粒子计数器上获得的粒子计数。示例性方法可用于区分不同类目的粒子，包括属于粒子计数器15上的相同类目和/或亚类目的粒子的对应亚类目，例如如图5和6中所描绘。所述方法可用于校正粒子计数器15中获得的粒子计数。在一些实施例中，例如，第一类目和/或亚类目的粒子包括异常血细胞、未成熟血细胞、成团血细胞或异常尺寸的血细胞中的一种或多种类型。第二类目和/或亚类目的粒子包括白血细胞。通过操作如本文所述的装置，可通过分析仪区分各亚类目中的粒子，并且可校正由粒子计数器获得的各类目和/或亚类目的粒子的计数。
将样品或其部分提供于粒子计数器15上以检测粒子并且基于可涵盖至少两种类目的粒子的亚类目的一种或多种选择标准提供粒子计数。例如，来自粒子计数器的所声称WBC类目也可包含少量巨大PLT和NRBC。来自粒子计数器的该类目还可包含不能被粒子计数器区分的各亚类目的白血细胞。如下所述也可在视觉分析仪上分析样品的另一部分以分辨这些错误分类和/或对未经区分的WBC亚类目进行子分类。
可在如图5中所描绘的分析仪17上测定所述至少两种亚类目或类目每者的分布。此分布可以数值比率、成比例比率和/或相对计数的其他函数呈现。在一些实施例中，可根据本文所公开的方法在包括流通池22和成像设备24的视觉分析仪17上测定此分布。如所述，可将样品12A(可为样品的一部分)施加到所述至少一个流通池22。将包括稀释剂、透化剂和对比剂中至少一者的至少一种化学品引入样品12A中。包括稀释剂、透化剂和/或对比剂中至少一者的所述至少一种化学品能有效地产生能区分所述至少两种类目的粒子并区分所述至少一种类目的粒子的所述至少两种亚类目的视觉差别。捕获样品12B的粒子的多个图像。在视觉分析仪17和/或处理器18上进行图像分析。
在一些实施例中，处理器18被程序化以区分所述至少两种类目和/或亚类目的成员。可基于样品的粒子的多个图像，测定所述至少两种亚类目或类目的粒子每者中的粒子的计数的成比例比率。然后可在处理器18上通过使用亚类目每者的分布来校正由粒子计数器15获得的所述至少两种类目中至少一者的亚类目的粒子计数。可基于每种亚类目的粒子的成比例比率以及由粒子计数器获得的该类目粒子的粒子计数，在处理器18上计算每种亚类目的粒子的浓度。
根据一些实施例，本文所公开的方法还可用于区分在粒子计数器15的检测范围之外的一种或多种类型的粒子。例如，这些粒子可为血细胞或其他碎片，对于在粒子计数器15上检测而言它们不是太大就是太小。在视觉分析仪17上，可基于样品的粒子的多个图像，测定在粒子计数器的检测范围之外的一种类型的粒子与在粒子计数器的检测范围之内的另一种类型的粒子的计数的成比例比率。然后可通过至少部分地将成比例比率应用于粒子计数器15上获得的粒子计数，测定样品中在检测范围之外的该类型粒子的浓度。
因此，本发明的实施例涵盖混合系统和方法，例如其结合了电子细胞计数和摄影细胞成像技术，例如以分析可能难以在电学上区分的细胞，或分析以使得获得其准确电子计数变得困难的量存在的细胞。
可使用计算机或具有硬件、软件和/或固件的其他处理器来执行本文描述的计算或操作中的每一个。各个方法步骤可通过模块执行，并且所述模块可包括被布置用于执行本文所述的方法步骤的多种多样的数字和/或模拟数据处理硬件和/或软件中的任何一种。所述模块任选地包括数据处理硬件，该数据处理硬件由于具有与其相关联的适当机器编程代码而适于执行这些步骤中的一个或多个，用于两个或更多个步骤(或两个或更多个步骤的部分)的模块被集成到单个处理器板中或采用多种多样的集成式和/或分布式处理架构中的任何一种被分成不同的处理器板。这些方法和系统通常将采用有形介质，该有形介质体现具有用于执行上述方法步骤的指令的机器可读代码。合适的有形介质可包括存储器(包括易失性存储器和/或非易失性存储器)、存储介质(诸如软盘、硬盘、磁带等上的磁记录；光学存储器诸如CD、CD-R/W、CD-ROM、DVD等上的磁记录；或任何其他数字或模拟存储介质)，等等。
本公开中所论述的所有专利、专利公布、专利申请、期刊论文、书籍、技术参考手册等全文以引用方式并入本文中以用于所有目的。
在附图中描绘或上文所述的部件的不同布置，以及未示出或描述的部件和步骤也是可行的。相似地，一些特征结构和子组合是可用的，且它们可以在与其他特征结构和子组合无关的情况下被采用。出于例示性和非限制性的目的描述了本发明的实施例，但可供选择的实施例对于本专利的读者而言将是显而易见的。在某些情况下，方法步骤或操作可按不同的顺序执行或实施，或者可对操作进行添加、删除或修改。应当理解，在本发明的某些方面，可用多个部件来替换单个部件，并且可用单个部件来替换多个部件，以提供元件或结构或者执行给定的一种或多种功能。除了这种替换将不能有效实践本发明的某些实施例的情况之外，这种替换被视为在本发明的范围之内。因此，本发明不限于上文所述或在附图中描绘的实施例，并且可以在不脱离下方权利要求的范围的前提下，采取各种实施例和修改。

Claims (21)

1.一种用于测量血液流体样品中的第一细胞类型的数量的方法，所述样品包括第二细胞类型，所述方法包括：
通过使第一体积流过血液学细胞计数器来测定所述样品的所述第一体积中的所述第二细胞类型的群体，其中，所述血液学细胞计数器不包括成像装置，并且不对所述样品的所述第一体积进行成像；
通过将所述样品的第二体积注入流通池内流动的鞘流体中以便提供具有厚度和大于厚度的宽度的样品料流，从而采集第一数量的所述第一细胞类型和第二数量的所述第二细胞类型的图像，所述采集的图像是沿着横越所述样品料流的所述厚度的图像路径采集的，其中所述第二体积不同于所述第一体积，并且所述第一体积不被注入所述流通池内的所述鞘流体中；
使用所述采集的图像测定所述第一数量的所述第一细胞类型与所述第二数量的所述第二细胞类型的比率；以及
使用所述比率和所述第二细胞类型的所述群体计算所述样品中的所述第一细胞类型的细胞数量量度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞数量量度包括用于所述血液流体样品中的所述第一细胞类型的细胞浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞数量量度包括用于所述血液流体样品中的所述第一细胞类型的细胞计数。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞计数器具有与对所述第一细胞类型计数相关的第一精确度和与对所述第二细胞类型计数相关的第二精确度，所述第二精确度优于所述第一精确度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液学细胞计数器具有所需精确度范围，所述所需精确度范围在所述第一体积中的细胞的最小群体与所述第一体积中的细胞的最大群体之间延伸，其中所述体积中的所述第二细胞类型的所测定群体在所述所需精确度范围之内，并且其中所述样品的所述第一细胞类型的所计算细胞数量量度在所述所需精确度范围之外。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括由于所述第一体积流过所述血液学细胞计数器而测定所述样品的所述第一体积中的所述第一细胞类型的群体，其中所述第一体积中的所述第一细胞类型的所测定群体高于或低于所述第一细胞类型的所需精确度范围，并且不同于所述第一细胞类型的所计算细胞数量量度。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一细胞类型的所测定群体为零。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一细胞类型的所测定群体大于零。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液学细胞计数器包括响应于第二类型细胞流过所述细胞计数器而检测电阻抗的变化的传感器机构。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液学细胞计数器包括响应于第二类型细胞流过所述细胞计数器而检测光路的遮挡的传感器机构。
11.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述血液学细胞计数器具有所述第一细胞类型的最小可检测浓度限值和最大可检测浓度限值，以及所述第二细胞类型的最小可检测浓度限值和最大可检测浓度限值，
所述第二细胞类型的所测定群体基于高于所述第二细胞类型所述最小限值并低于所述最大限值的所述第二细胞类型的所检测浓度参数，以及
所述第一细胞类型以低于所述第一细胞类型的所述最小限值或高于所述最大限值的浓度存在。
12.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述血液学细胞计数器具有所述第一细胞类型的最小可检测体积限值和最大可检测体积限值，以及所述第二细胞类型的最小可检测体积限值和最大可检测体积限值，
所述第二细胞类型的所测定群体基于高于所述第二细胞类型所述最小限值并低于所述最大限值的所述第二细胞类型的所检测体积参数，以及
所述第一细胞类型以低于所述第一细胞类型的所述最小限值或高于所述最大限值的体积参数存在。
13.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述血液学细胞计数器具有所述第一细胞类型的最小可检测尺寸限值和最大可检测尺寸限值，以及所述第二细胞类型的最小可检测尺寸限值和最大可检测体积尺寸，
所述第二细胞类型的所测定群体基于高于所述第二细胞类型所述最小限值并低于所述最大限值的所述第二细胞类型的所检测尺寸参数，以及
所述第一细胞类型以低于所述第一细胞类型的所述最小限值或高于所述最大限值的尺寸参数存在。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品的所述第一体积中的所述第二细胞类型的所述群体的所述测定包括将所述第一细胞类型的细胞和所述第二细胞类型的细胞分组在一起。
15.根据权利要求6所述的方法，还可包括使用所述比率和所述第二细胞类型的所述群体计算所述样品中的所述第二细胞类型的细胞数量量度。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品的所述第一体积中的所述第二细胞类型的所述群体的所述测定包括将所述第一细胞类型的细胞和所述第二细胞类型的细胞分组在一起，其中所述方法还包括由于所述第一体积流过所述血液学细胞计数器而测定所述样品的所述第一体积中的所述第一细胞类型的群体，并且其中所述样品中的所述第一细胞类型的所述细胞数量量度的所述计算使用所述比率、所述第二细胞类型的所述群体和所述第一细胞类型的所述群体。
17.一种用于测量血液流体样品中的第一细胞类型的数量的系统，所述样品包括第二细胞类型，所述系统包括：
血液学细胞计数器，所述血液学细胞计数器具有通道和输出口，所述输出口操作地耦合到所述通道以便产生指示流过所述通道的所述样品的第一体积中的所述第二细胞类型的群体的信号，其中，所述血液学细胞计数器不包括成像装置；
流通池，所述流通池被配置成有利于样品料流的流动，所述样品料流包括所述样品的第二体积和鞘流体，并且具有厚度和大于所述厚度的宽度，其中，所述第二体积不同于所述第一体积；
成像装置，所述成像装置被配置成在所述第二体积中采集第一数量的所述第一细胞类型和第二数量的所述第二细胞类型的图像，所述采集的图像是沿着横越所述样品料流的所述厚度的图像路径采集的；
处理器，所述处理器使用所述采集的图像测定所述第一数量的所述第一细胞类型与所述第二数量的所述第二细胞类型的比率以及使用所述比率和指示所述第二细胞类型的群体的信号计算所述样品中的所述第一细胞类型的细胞数量量度。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述处理器耦合到所述血液学细胞计数器以接收指示所述第二细胞类型的所述群体的信号。
19.根据权利要求17所述的系统，其中所述处理器耦合到所述成像装置以接收所述采集的图像。
20.根据权利要求17所述的系统，其中所述流通池和所述成像装置是执行组合式粘度和几何流体聚焦以对所述血液流体样品中的细胞进行成像的血液学分析仪的部件。
21.根据权利要求17所述的系统，其中所述鞘流体和所述血液流体样品之间的粘度差与所述流通池的流路尺寸的缩减段相结合，能有效地在所述流通池的图像捕获位点处流体聚焦所述样品料流。
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