BR112015021593B1

BR112015021593B1 - método para imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo usando um sistema de análise de partícula configurado para a hidrofocalização geométrica, e sistema de análise de partícula que realiza a hidrofocalização geométrica para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo

Info

Publication number: BR112015021593B1
Application number: BR112015021593-9A
Authority: BR
Inventors: Bart J. Wanders; Brett Jordan; Warren Groner; Gregory A. Farrell; Thomas H. Adams
Original assignee: Iris International, Inc.
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2020-12-29
Also published as: CN105102959A; US20230243731A1; KR20150130291A; US20170370820A1; JP2016512336A; EP3489656A1; US20140273068A1; EP2972208B1; KR102067317B1; TR201901203T4; US10060846B2; CN105143850A; CN105074422B; US20180149576A1; BR112015019969A2; WO2014145984A1; EP3467472B1; CN105074422A; US20140273081A1; WO2014146030A1

Abstract

SISTEMAS DE FOCALIZAÇÃO AUTOMÁTICA E MÉTODOS PARA ANÁLISE DE PARTÍCULA EM AMOSTRAS DE SANGUE. A presente invenção refere-se a partículas que, tais como as células do sangue, podem ser categorizadas e contadas por um processador de imagem digital. Uma câmera de microscópio digital pode ser direcionada em uma célula de fluxo definindo uma trajetória de fluxo que se estreita simetricamente na qual a corrente da amostra flui em uma fita achatada pelos parâmetros de fluxo e viscosidade entre as camadas do fluido de revestimento. Um padrão contrastante para a focalização automática é fornecido na célula de fluxo, por exemplo, em uma borda de uma abertura de iluminação traseira. O processador de imagem avalia a exatidão do foco a partir do contraste dos dados de pixel. Um mecanismo de posicionamento move o microscópio e/ou a célula de fluxo ao longo de um eixo óptico para focalização automática no alvo do padrão de contraste. O processador então desloca o microscópio e a célula de fluxo por uma distância conhecida entre o padrão de contraste e a corrente da amostra, focalizando assim na corrente da amostra. As imagens da célula do sangue são coletadas a partir daquela posição até a focalização (...).

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o pedido de patente provisório n° US 61/799,152 depositado em 15 de março de 2013, e também reivindica prioridade do pedido de patente n° 14/216,811, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência. Este pedido também está relacionado aos pedidos de patente n°s US 14/215.834, 14/216.533, 14/216.339, 14/216.811 e 14/217.034; e pedidos de patente internacionais N°s PCT/US2014/030850, PCT/US2014/030902 e PCT/US2014/030851 depositados em 17 de março de 2014 e PCT/US2014/030939 e PCT/US2014/030942 depositados em, 18 de março de 2014. O conteúdo de cada um destes depósitos é incorporado aqui a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Esta descrição está relacionada ao campo de aparelhos, sistemas, composições e métodos para análise das partículas, incluindo o imageamento de partículas em amostras fluidas, usando dispositivos totalmente ou parcialmente automatizados para discriminar e quantificar partículas como células sanguíneas na amostra. A presente descrição também se refere a um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) útil para analisar partículas em uma amostra de um indivíduo, a métodos para produzir o líquido, e métodos para usar o líquido para detectar e analisar as partículas. As composições, sistemas, dispositivos e métodos úteis para conduzir a análise da amostra de fluido biológico com base em imagem são também descritos. As composições, sistemas, dispositivos e métodos da presente descrição também são úteis para a detecção, contagem e caracterização de partículas em fluidos biológicos, como os eritrócitos, reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas, e para a contagem diferencial, categorização, subcategorização, caracterização e/ou análise de leucócitos com base em imagem e morfologicamente.

[0003] Análise das células do sangue é um dos exames médicos mais comumente realizados para fornecer uma visão geral da condição de saúde de um paciente. Uma amostra de sangue pode ser extraída do corpo de um paciente e armazenada em um tubo de ensaio contendo um anticoagulante para evitar a coagulação. Uma amostra de sangue total é normalmente composta por três classes principais de células do sangue, incluindo células vermelhas do sangue (eritrócitos), células brancas do sangue (leucócitos) e plaquetas (trombócitos). Cada classe pode ser ainda dividida em subclasses de membros. Por exemplo, cinco tipos ou subclasses principais de células brancas do sangue (WBCs) têm diferentes formatos e funções. As células brancas do sangue podem incluir neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Há também subclasses dos tipos de células vermelhas do sangue. As aparências das partículas em uma amostra podem diferir de acordo com condições patológicas, maturidade da célula e outras causas. As subclasses de células vermelhas do sangue podem incluir reticulócitos e células vermelhas do sangue nucleadas.

[0004] Uma contagem de células do sangue que estima a concentração de RBCs, WBCs ou plaquetas pode ser feita manualmente ou usando um analisador automático. Quando as contagens das células do sangue são feitas manualmente, uma gota de sangue é aplicada a uma lâmina de microscópio, como um esfregaço fino. Tradicionalmente, o exame manual de um esfregaço de sangue corado, seco, em uma lâmina de microscópio tem sido usado para determinar o número ou quantidades relativas dos cinco tipos de células brancas do sangue. Corantes histológicos e colorações têm sido usados para corar as células ou estruturas celulares. Por exemplo, o corante de Wright é um corante histológico que tem sido usado para corar esfregaços de sangue para exame ao microscópio de luz. Uma Contagem Completa de Sangue (CBC) pode ser obtida usando um analisador automatizado, um tipo que conta o número de diferentes partículas ou células em uma amostra de sangue com base na impedância ou dispersão dinâmica de luz na medida em que as partículas ou células passam através de uma área de detecção ao longo de um pequeno tubo. A CBC automatizada pode usar instrumentos ou métodos para diferenciar entre diferentes tipos de células que incluem RBCs, WBCs e plaquetas (PLTs), que podem ser contados separadamente. Por exemplo, uma técnica de contagem que requer um volume ou tamanho mínimo de partículas pode ser usada para contar apenas células grandes. Certas células, como as células anormais no sangue não podem ser contadas ou identificadas corretamente. Pequenas células que se aderem umas às outras podem ser erroneamente contadas como uma célula grande. Quando contagens erradas são suspeitas, a revisão manual dos resultados do instrumento pode ser necessária para verificar e identificar as células.

[0005] Técnicas de contagem de células do sangue automatizadas podem envolver a citometria de fluxo. A citometria de fluxo envolve o fornecimento de uma trajetória de fluxo estreita, e detecção e contagem da passagem de células sanguíneas individuais. Métodos de citometria de fluxo têm sido usados para detectar as partículas em suspensão em um fluido, como as células em uma amostra de sangue, e para analisar as partículas quanto ao tipo de partícula, dimensão, e distribuição de volume de modo a deduzir a concentração do respectivo tipo de partícula ou volume de partículas na amostra de sangue. Exemplos de métodos adequados para a análise de partículas suspensas em um fluido incluem sedimentação, caracterização microscópica, contagem com base na impedância, e dispersão dinâmica de luz. Estas ferramentas são sujeitas a erros de teste. Por outro lado, a caracterização precisa dos tipos e da concentração de partículas pode ser crítica em aplicações como o diagnóstico médico.

[0006] Nas técnicas de contagem baseadas em imageamento, imagens de dados de pixel de uma amostra preparada que pode estar passando através de uma área de visualização são capturadas com o uso de uma lente objetiva de microscopia acoplada a uma câmera digital. Os dados de imagem de pixel podem ser analisados com o uso de técnicas de processamento de dados, e também exibidos em um monitor.

[0007] Aspectos de sistemas de diagnóstico automatizados com células de fluxo estão descritos na Patente US n° 6.825.926 concedida a Turner et al. e nas Patentes US n°s 6.184.978; 6.424.415; e 6.590.646, todas para Kasdan et al., que estão aqui incorporadas a título de referência como se apresentadas completamente aqui.

[0008] Sistemas automatizados que usam impedância ou dispersão dinâmica de luz têm sido usados para obter uma contagem completa de sangue (CBC): contagem de leucócitos totais (WBC), volume celular total de eritrócitos (distribuição de RBC), hemoglobina HGB (a quantidade de hemoglobina no sangue); volume médio celular (MCV) (volume médio das células vermelhas); MPV (volume médio de PLT); hematócrito (HCT); MCH (HGB/RBC) (a quantidade média de hemoglobina por eritrócitos); e MCHC (HGB/HCT) (a concentração média de hemoglobina nas células). Processos automatizados ou parcialmente automatizados têm sido usados para facilitar a contagem diferencial em cinco partes das células brancas do sangue (leucócitos) e as análises de amostra de sangue.

[0009] Embora tais sistemas e métodos de análise de partículas conhecidos atualmente, juntamente com técnicas de diagnóstico médicos relacionadas, possam fornecer benefícios reais para os médicos, clínicos e pacientes, melhorias adicionais são desejáveis. As modalidades da presente invenção fornecem soluções para pelo menos algumas dessas necessidades pendentes.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00010] As modalidades da presente invenção abrangem determinadas técnicas de focalização que permitem que sistemas e métodos de hematologia produzam imagens de alta qualidade das partículas que estão presentes nas amostras sanguíneas fluidas. Tais imagens de alta qualidade fornecem a base para a obtenção de altos níveis de discriminação que são úteis para classificar precisamente as células e permitem o uso dos sistemas ópticos tendo uma alta ampliação e objetiva de alta abertura numérica. Técnicas de alinhamento óptico ou focalização exemplificadoras facilitam a produção de imagens com alto nível de resolução, com uma profundidade de campo curta que corresponde a uma fita fina da amostra do fluido que carrega as partículas.

[00011] Em alguns casos, sistemas de hematologia podem ser refocalizados em uma base regular para ajustar as mudanças na temperatura local e outros fatores. Por exemplo, técnicas de focalização automática, conforme discutido neste documento, podem compensar a expansão térmica ou outros fatores presentes em um analisador para hematologia que muda a distância entre uma objetiva de imageamento e uma célula de fluxo e, portanto, afeta negativamente os resultados do imageamento, por exemplo, pela produção de uma imagem que está fora de foco. As modalidades da presente invenção também abrangem sistemas e métodos de focalização automática para instrumentos de hematologia que envolvem focalizar automaticamente um sistema de formação de imagens sem a necessidade por um líquido ou solução de focalização ou outra intervenção do usuário. Por exemplo, técnicas de focalização automática exemplificadoras podem envolver a obtenção de um foco inicial sobre um alvo fixo em relação à célula de fluxo, ao invés de usar técnicas que são baseadas na maximização do próprio indivíduo que aparece na imagem.

[00012] Determinadas modalidades da presente invenção são baseadas pelo menos em parte na observação de que a posição da corrente dentro da célula de fluxo não muda em resposta às flutuações de temperatura, e podem envolver a focalização em um alvo em algum lugar na célula de fluxo e depois o uso de um deslocamento fixo para conseguir bom foco na corrente da amostra. Tais abordagens podem ser implementadas sem o uso de uma solução de focalização que flui através da célula de fluxo, e pode ser realizada automaticamente e totalmente de modo transparente para o usuário.

[00013] De acordo com algumas modalidades, esta descrição refere- se a um analisador visual para o imageamento de uma amostra compreendendo partículas suspensas em um líquido, no qual o aparelho inclui uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL, sendo que a célula de fluxo define uma trajetória de fluxo interna, a célula de fluxo sendo configurada para direcionar um fluxo de uma corrente de amostra em forma de fita envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo. Uma lente objetiva associada com um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é disposta sobre um eixo óptico que cruza a corrente de amostra em forma de fita. A distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo é variável pela operação de um motor de acionamento acoplado a um controlador, para apresentar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. Um padrão de foco automático ou alvo de imageamento é fornecido em uma posição fixa em relação à célula de fluxo, o padrão de foco automático sendo localizado a uma distância predeterminada a partir do plano da corrente de amostra em forma de fita preparada. Uma fonte de luz ilumina a corrente de amostra em forma de fita e o padrão de foco automático. Pelo menos um processador digital é associado ao controlador acoplado para operar o motor de acionamento. O processador também está disposto para analisar a imagem digitalizada. O processador determina uma posição de foco do padrão de foco automático para gerar uma imagem focalizada e então desloca relativamente a objetiva e a célula de fluxo ao longo da distância predeterminada (por exemplo, uma distância de deslocamento) a partir da posição focalizada, para focalizar o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução na corrente de amostra em forma de fita.

[00014] Em um aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem os métodos para formação de imagens de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo usando um sistema de análise de partícula. O sistema de análise de partícula pode ser configurado para hidrofocalização geométrica. Em alguns casos, o sistema pode ser configurado para viscosidade combinada e hidrofocalização geométrica. Em alguns casos, as partículas podem ser incluídas em uma amostra de fluido sanguíneo tendo uma viscosidade fluida da amostra. Métodos exemplificadores podem incluir o fluxo de um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo do sistema de análise de partícula. Em alguns casos, o fluido de revestimento pode ter uma viscosidade do fluido de revestimento que difere da viscosidade fluida da amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa de diferença de viscosidade predeterminada. Os métodos também podem incluir injetar a amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que o líquido da amostra de fluido sanguíneo flua em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo, a corrente de fluxo da amostra fluindo através de uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo e atravessando um eixo de imageamento. Adicionalmente, os métodos podem incluir focar um dispositivo de captura de imagem pelo imageamento de um alvo de imageamento tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Além disso, métodos podem incluir adquirir uma imagem focalizada das partículas, adequada para a caracterização e contagem de partículas, dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem, onde o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo da amostra usando uma distância de deslocamento. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento e amostra de fluido sanguíneo, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para hidrofocalizar a corrente de fluxo da amostra no eixo de imageamento enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade das células na corrente de fluxo da amostra deixando a estrutura e o teor das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluxo da amostra para o fluido de revestimento que está fluindo. Em alguns casos, a corrente de fluxo da amostra tem uma espessura no eixo de imageamento dentro de uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Em alguns casos, a trajetória de fluxo tem uma espessura de cerca de 150 μm no eixo de imageamento. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado em uma janela de porta de visualização disposta entre a corrente de fluxo da amostra e o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado sobre uma janela de iluminação, e a corrente de fluxo da amostra está disposta entre a janela de iluminação e o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, a distância de deslocamento é zero. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado entre uma janela de iluminação e uma janela de porta de visualização. Em alguns casos, na etapa de aquisição, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo da amostra pelo ajuste de uma distância focal do dispositivo de captura de imagem com base na distância de deslocamento.

[00015] De acordo com algumas modalidades, o processo para adquirir a imagem focalizada inclui ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo usando a distância de deslocamento. Em alguns casos, ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo inclui mover um componente do dispositivo de captura de imagem. O componente do dispositivo de captura de imagem pode ser uma lente de aumento, um espelho do dispositivo de captura de imagem, ou um conjunto que inclui o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo inclui mover a célula de fluxo. Em alguns casos, ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo inclui mover pelo menos um elemento óptico do dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo. Em alguns casos, a distância de deslocamento é uma distância ao longo do eixo de imageamento entre o alvo de imageamento e a corrente de fluxo da amostra. Em alguns casos, a distância de deslocamento é uma diferença de distância entre uma primeira distância focal entre o dispositivo de captura de imagem e o alvo e uma segunda distância focal entre o dispositivo de captura de imagem e a corrente de fluxo da amostra. Em alguns casos, os métodos incluem uma etapa de focalização automática que inclui injetar uma amostra de fluido de teste dentro do fluido de revestimento para formar uma corrente de fluxo da amostra de teste dentro da célula de fluxo, obter uma primeira imagem focalizada do alvo de imageamento usando o dispositivo de captura de imagem, de modo que o alvo de imageamento focalizado e o dispositivo de captura de imagem definam uma primeira distância focal, obter uma segunda imagem focalizada da corrente de fluxo da amostra de teste usando o dispositivo de captura de imagem, de modo que a corrente de fluxo da amostra de teste focalizada e o dispositivo de captura de imagem definam uma segunda distância focal, e obter a distância de deslocamento pelo cálculo de uma diferença entre a primeira distância focal e a segunda distância focal. Em alguns casos, a amostra de fluido de teste é a mesma amostra de fluido sanguíneo e a corrente de fluxo da amostra de teste é a mesma que a corrente de fluxo da amostra. Em alguns casos, a etapa de focalização automática estabelece um plano focal associado com o dispositivo de captura de imagem, e o plano focal permanece estacionário em relação ao dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo da amostra usando uma temperatura como uma temperatura do fluido da amostra, uma temperatura do fluido de revestimento, uma temperatura da célula de fluxo, ou uma temperatura do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado na corrente de fluxo da amostra usando uma temperatura, como uma temperatura da célula de fluxo no local de imageamento, uma temperatura da célula de fluxo em um local a montante do local de imageamento, e uma temperatura da célula de fluxo em um local a jusante do local de imageamento. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra usando uma taxa de temperatura de mudança, como uma taxa de mudança da temperatura do fluido da amostra, uma taxa de mudança de temperatura do fluido de revestimento, uma taxa de mudança de temperatura da célula de fluxo, ou uma taxa de mudança de temperatura do dispositivo de captura de imagem.

[00016] De acordo com algumas modalidades, os métodos podem incluir detectar um sinal de reiniciação de foco automático, e repetir as etapas de focalização automática e captura de imagem em resposta ao sinal de reiniciação de foco automático. Em alguns casos, o sinal de reiniciação de foco automático inclui ou é baseado em uma mudança na temperatura, uma diminuição na qualidade do foco, um intervalo de tempo decorrido, ou uma entrada do usuário. Em alguns casos, a focalização do dispositivo de captura de imagem na corrente de fluxo da amostra é realizada independentemente de uma temperatura do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o alvo de imageamento inclui uma escala para uso no posicionamento do eixo de imageamento do dispositivo de captura de imagem em relação à corrente de fluxo da amostra. Em alguns casos, o alvo de imageamento inclui uma íris alinhada em relação ao eixo de imageamento, de modo que as partículas da imagem são dispostas dentro de uma abertura definida pela íris, e uma ou mais porções de borda da íris são imageadas durante a focalização automática. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo da amostra pela implementação da rotação axial do dispositivo de captura de imagem em torno do eixo de imageamento, a rotação axial da célula de fluxo ao redor de um eixo que se estende ao longo do eixo de imageamento e dentro do campo de vista do dispositivo de imageamento, rotação da ponta do dispositivo de captura de imagem ao redor de um eixo que se estende ao longo da trajetória de fluxo, rotação da ponta da célula de fluxo ao redor de um eixo que se estende ao longo e dentro da trajetória de fluxo, rotação de inclinação do dispositivo de captura de imagem ao redor do eixo que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo de imageamento, e/ou rotação de inclinação da célula de fluxo ao redor do eixo que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo de imageamento e dentro do campo de vista do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo da amostra pela implementação de uma rotação da célula de fluxo, a rotação centrada no campo de visão do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, a focalização automática do dispositivo de captura de imagem inclui determinar uma posição de foco ideal dentre uma pluralidade de posições de foco.

[00017] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo. Os métodos exemplificadores podem incluir o fluxo de um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, e injetar a amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido sanguíneo flui em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo. A célula de fluxo pode ter uma temperatura associada. Os métodos também podem incluir focar um dispositivo de captura de imagem, ao longo de um eixo de imageamento, sobre a corrente de fluxo para um primeiro estado focal enquanto a temperatura associada com a célula de fluxo está em uma primeira temperatura, e adquirir uma primeira imagem focalizada de um primeiro subconjuntos das partículas dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no primeiro estado focal. Os métodos podem incluir ainda determinar que a temperatura associada com a célula de fluxo sofreu uma mudança a partir da primeira temperatura para uma segunda temperatura, e automaticamente ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem a partir do primeiro estado focal para um segundo estado focal em resposta à mudança na temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura da célula de fluxo e foco desejado. Adicionalmente, os métodos podem incluir adquirir uma segunda imagem focalizada de um segundo subconjunto das partículas dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no segundo estado focal. Em alguns casos, ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem envolve ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo usando a mudança na temperatura e a relação conhecida entre a temperatura da célula de fluxo e foco desejado. Em alguns casos, ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem envolve ajustar uma distância focal do dispositivo de captura de imagem usando a mudança na temperatura e a relação conhecida entre temperatura da célula de fluxo e foco desejado. Em alguns casos, ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem envolve implementar a rotação axial do dispositivo de captura de imagem em torno do eixo de imageamento, a rotação axial da célula de fluxo ao redor de um eixo que se estende ao longo do eixo de imageamento e dentro do campo de vista do dispositivo de imageamento, a rotação da ponta do dispositivo de captura de imagem ao redor de um eixo que se estende ao longo da trajetória de fluxo, a rotação da ponta da célula de fluxo ao redor de um eixo que se estende ao longo e dentro da trajetória de fluxo, a rotação de inclinação do dispositivo de captura de imagem ao redor do eixo que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo de imageamento, e/ou rotação de inclinação da célula de fluxo ao redor do eixo que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo de imageamento e dentro do campo de vista do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo da amostra pela implementação de uma rotação da célula de fluxo, a rotação centrada no campo de visão do dispositivo de captura de imagem.

[00018] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção englobam sistemas de análise de partícula que realizam a hidrofocalização geométrica, ou em alguns casos viscosidade combinada e hidrofocalização geométrica, para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo. Sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo tendo uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo de imageamento através da mesma. A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo. Os sistemas também podem incluir uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo. Adicionalmente, os sistemas podem incluir uma entrada de fluido do sangue em comunicação fluida com o tubo de injeção. A entrada de fluido do sangue pode ser configurada para injetar a amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido sanguíneo flui em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo. Em alguns casos, o fluido de revestimento pode ter uma viscosidade que é maior do que uma viscosidade da amostra de fluido sanguíneo. Além disso, os sistemas podem incluir um dispositivo de captura de imagem, um mecanismo de focalização configurado para definir um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo, e um alvo de imageamento tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Em alguns casos, o alvo de imageamento e corrente de fluxo da amostra podem definir uma distância de deslocamento ao longo do eixo de imageamento. Adicionalmente, os sistemas podem incluir um processador, e um módulo de focalização tendo um meio tangível que incorpora código legível por máquina executado no processador para operar o mecanismo de focalização para definir o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partícula, usando a distância de deslocamento. Em alguns casos, uma diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento e amostra de fluido sanguíneo, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para hidrofocalizar a corrente de fluxo da amostra no eixo de imageamento enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade das células na corrente de fluxo da amostra deixando a estrutura e o teor das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluxo da amostra para o fluido de revestimento que está fluindo. Em alguns casos, o mecanismo de focalização pode incluir um motor de acionamento configurado para ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado em uma janela de porta de visualização disposta entre a corrente de fluxo da amostra e o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado sobre uma janela de iluminação, e a corrente de fluxo da amostra está disposta entre a janela de iluminação e o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o sistema é configurado para realizar uma etapa de aquisição que inclui focar o dispositivo de captura de imagem na corrente de fluxo da amostra pelo ajuste de uma distância focal do dispositivo de captura de imagem com base na distância de deslocamento. Em alguns casos, o sistema é configurado para realizar uma etapa de aquisição para obter uma imagem focalizada pelo ajuste de uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo usando a distância de deslocamento. Em alguns casos, o sistema configurado para ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo pelo movimento da célula de fluxo. Em alguns casos, o sistema é configurado para realizar uma etapa de focalização automática que inclui injetar uma amostra de fluido de teste no fluido de revestimento para formar uma corrente de fluxo da amostra de teste dentro da célula de fluxo, obter uma primeira imagem focalizada do alvo de imageamento usando o dispositivo de captura de imagem, de modo que o alvo de imageamento focalizado e o dispositivo de captura de imagem definam uma primeira distância focal, obter uma segunda imagem focalizada da corrente de fluxo da amostra de teste usando o dispositivo de captura de imagem, de modo que a corrente de fluxo da amostra de teste focalizada e o dispositivo de captura de imagem definem uma segunda distância focal, e obter a distância de deslocamento pelo cálculo de uma diferença entre a primeira distância focal e a segunda distância focal. Em alguns casos, o sistema é configurado para focalizar o dispositivo de captura de imagem sobre a corrente de fluxo da amostra usando uma temperatura, como uma temperatura do fluido da amostra, uma temperatura do fluido de revestimento, uma temperatura da célula de fluxo, ou uma temperatura do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o sistema é configurado para detectar um sinal de reiniciação de foco automático, e repetir as etapas de focalização automática e de aquisição de imagem em resposta ao sinal de reiniciação de foco automático.

[00019] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção englobam sistemas para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo tendo uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo de imageamento através dela, uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo, e uma entrada de fluido do sangue em comunicação fluida com o tubo de injeção. A entrada de fluido do sangue pode ser configurada para injetar a amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido sanguíneo flui em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo. Os sistemas também podem incluir um dispositivo de captura de imagem, um mecanismo de focalização configurado para definir um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo, um sensor de temperatura termicamente acoplado à célula de fluxo, um processador, e um módulo de focalização. O módulo de focalização pode incluir um meio tangível que incorpora código legível por máquina executado no processador para operar o mecanismo de focalização para definir o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partícula, em resposta a uma mudança na temperatura detectada pelo sensor de temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura e o foco desejado. Em alguns casos, o mecanismo de focalização inclui um motor de acionamento configurado para ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo.

[00020] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção englobam métodos para a análise das células em uma amostra de fluido sanguíneo. Os métodos exemplificadores podem incluir o fluxo de um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, e injeção da amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que o líquido da amostra de fluido sanguíneo flui em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo mais larga do que uma espessura de corrente de fluxo. A corrente de fluxo da amostra pode ser deslocada, ao longo de um eixo de imageamento, a partir de uma janela de imageamento da célula de fluxo por uma primeira distância. Os métodos também podem incluir a focalização automática de um dispositivo de captura de imagem pelo imageamento de um alvo de imageamento afixado à célula de fluxo. O alvo de imageamento pode ser posicionado em uma segunda distância a partir da janela de imageamento ao longo do eixo de imageamento. Adicionalmente, os métodos podem incluir adquirir imagens focalizadas das células, adequadas para a caracterização e contagem de células, dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra usando a etapa de focalização automática e uma relação conhecida entre a primeira distância e a segunda distância.

[00021] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção englobam sistemas para a análise das células em uma amostra de fluido sanguíneo. Sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo tendo uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo de imageamento através da mesma. Os sistemas também podem incluir uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo, e uma entrada de fluido do sangue em comunicação fluida com um tubo de injeção. A entrada de fluido do sangue pode ser configurada para injetar a amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido sanguíneo flui em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo. A corrente de fluxo da amostra pode ser deslocada, ao longo do eixo de imageamento, da janela de imageamento da célula de fluxo por uma primeira distância. Os sistemas também podem incluir um dispositivo de captura de imagem orientável ao longo do eixo de imageamento. O dispositivo de captura de imagem pode incluir um mecanismo de focalização. Adicionalmente, os sistemas podem incluir um alvo de imageamento afixado à célula de fluxo. O alvo de imageamento pode estar a uma segunda distância a partir da superfície da janela de imageamento ao longo do eixo de imageamento. Além disso, os sistemas podem incluir um processador acoplado ao mecanismo de focalização. O processador pode ser configurado para adquirir imagens focalizadas das partículas dentro da corrente de fluxo, suficientes para caracterizar e contar as células, pela focalização do dispositivo de captura de imagem sobre o alvo, e pelo uso de uma relação conhecida entre a primeira distância e a segunda distância.

[00022] Ainda em outro aspecto, as modalidades da presente invenção englobam sistemas para a análise das células em uma amostra de fluido sanguíneo. Sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo tendo uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo de imageamento através da mesma. Adicionalmente, os sistemas podem incluir uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo, e uma entrada da amostra de fluido sanguíneo em comunicação fluida com o tubo de injeção. A entrada de fluido da amostra pode ser configurada para injetar a amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido sanguíneo flui em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo. Adicionalmente, os sistemas podem incluir um dispositivo de captura de imagem orientável ao longo do eixo de imageamento, e o dispositivo de captura de imagem pode incluir um mecanismo de focalização. Os sistemas também podem incluir um sensor de temperatura termicamente acoplado à célula de fluxo, e um processador acoplado ao sensor de temperatura e o mecanismo de focalização. Em alguns casos, o processador é configurado para ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem, suficiente para caracterizar e contar as células, em resposta a uma mudança na temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura e foco desejado.

[00023] De acordo com algumas modalidades, um analisador visual pode incluir uma célula de fluxo acoplada a uma fonte de uma amostra e a uma fonte de um fluido de revestimento. A célula de fluxo pode definir uma trajetória de fluxo interna, e pode ser configurada para direcionar um fluxo da amostra envelopada com o fluido de revestimento através de uma zona de visualização na célula de fluxo. O analisador também pode incluir um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução com uma objetiva sobre um eixo óptico que cruza a corrente de amostra em forma de fita, e uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo pode ser variável pela operação de um motor de acionamento, para apresentar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. O analisador também pode incluir um padrão de foco automático tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo, o padrão de foco automático estando localizado a uma distância de deslocamento a partir do plano da corrente de amostra em forma de fita. A distância de deslocamento pode ser predeterminada. O analisador também pode incluir uma fonte de luz configurada para iluminar a corrente de amostra em forma de fita e o padrão de foco automático. Adicionalmente, o analisador pode incluir pelo menos um processador digital acoplado para operar o motor de acionamento e para analisar a imagem digitalizada. O processador pode ser configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático e para deslocar relativamente um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a célula de fluxo ao longo da distância de deslocamento a partir da posição focalizada, de modo que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica fique focalizado na corrente de amostra em forma de fita. De acordo com algumas modalidades, o padrão de foco automático inclui formas com tamanho limitado e a distância de deslocamento é suficiente para que as formas sejam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizada sobre a corrente de amostra em forma de fita. Em alguns casos, o eixo óptico é substancialmente perpendicular à corrente de amostra em forma de fita.

[00024] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção englobam métodos de focalização de um analisador visual para análise da amostra. Os métodos exemplificadores podem incluir a focalização de um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução a um padrão de foco automático fixo em relação a uma célula de fluxo, o padrão de foco automático estando localizado a uma distância de deslocamento a partir de uma corrente de amostra em forma de fita que é predeterminada, o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução com uma objetiva em um eixo óptico que cruza a corrente de amostra em forma de fita, uma distância relativa entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo sendo variável pela operação de um motor de acionamento, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica sendo configurado para apresentar e coletar uma imagem digitalizada sobre uma matriz do fotossensor. Adicionalmente, os métodos podem incluir operar o motor de acionamento ao longo da distância de deslocamento para focalizar o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução sobre a corrente de amostra em forma de fita.

[00025] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção englobam métodos de imageamento de partículas em uma amostra. Os métodos exemplificadores podem incluir fornecer um analisador visual para uma amostra compreendendo partículas suspensas em um líquido, estabelecendo um fluxo que tem seções laminares que são de viscosidade superior e inferior no analisador visual. O analisador pode incluir uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL tendo uma viscosidade maior do que a viscosidade da amostra. A célula de fluxo pode definir uma trajetória de fluxo interna, e pode direcionar um fluxo da amostra envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo. O analisador também pode incluir um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução com uma objetiva em um eixo óptico que cruza a corrente de amostra em forma de fita, uma distância relativa entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a célula de fluxo sendo variável pela operação de um motor de acionamento, para apresentar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. O analisador também pode incluir um padrão de foco automático tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo, o padrão de foco automático estando localizado a uma distância de deslocamento a partir do plano da corrente de amostra em forma de fita que foi predeterminada, uma fonte de luz configurada para iluminar a corrente de amostra em forma de fita e o padrão de foco automático, pelo menos um processador digital acoplado para operar o motor de acionamento e para analisar a imagem digitalizada, onde o processador é configurado para determinar a posição de foco do padrão de foco automático e para deslocar relativamente o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a célula de fluxo ao longo da distância de deslocamento a partir da posição focalizada, de modo que o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução focalize a corrente de amostra em forma de fita. Em alguns casos, um analisador pode incluir uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL onde a célula de fluxo define uma trajetória de fluxo interna e é configurada para direcionar um fluxo da amostra envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo, um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução com uma objetiva em um eixo óptico que cruza a corrente de amostra em forma de fita, uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo sendo variável pela operação de um motor de acionamento, para apresentar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor, um padrão de foco automático tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo, o padrão de foco automático estando localizado a uma distância de deslocamento a partir do plano da corrente de amostra em forma de fita que foi predeterminada, uma fonte de luz configurada para iluminar a corrente de amostra em forma de fita e o padrão de foco automático, e pelo menos um processador digital acoplado para operar o motor de acionamento e para analisar a imagem digitalizada, onde o processador é configurado para determinar a posição de foco do padrão de foco automático e para deslocar relativamente o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a célula de fluxo ao longo da distância de deslocamento a partir da posição focalizada, de modo que o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução focalize a corrente de amostra em forma de fita.

[00026] Em alguns casos, as imagens obtidas pelos sistemas e métodos aqui descritos podem ser imagens digitalizadas. Em alguns casos, as imagens podem ser imagens de microscopia. Em alguns casos, as imagens podem ser observadas manualmente ou por automação.

[00027] As outras características descritas acima e muitas outras e vantagens concomitantes das modalidades da presente invenção serão evidentes e mais bem compreendidas por referência à seguinte descrição detalhada quando consideradas em conjugação com os desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00028] A Figura 1 é uma ilustração esquemática, parcialmente em seção e não em escala, mostrando os aspectos operacionais de uma célula de fluxo, sistema de foco automático e dispositivo de imageamento óptico de alta resolução exemplificadores para a análise de imagem da amostra usando o processamento de imagem digital.

[00029] As Figuras 1A e 1B mostram uma disposição de banco óptico de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00030] A Figura 1C é um diagrama de blocos de um analisador para hematologia de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00031] A Figura 1D mostra um fluxograma de um processo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00032] A Figura 1E mostra aspectos de um sistema de módulo exemplificador de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00033] A Figura 2 é uma ilustração em perspectiva de uma célula de fluxo de acordo com uma modalidade exemplificadora.

[00034] A Figura 3 é uma vista seccional média longitudinal ao longo das linhas 3-3 da célula de fluxo mostrada na Figura 2.

[00035] As Figuras 3A e 3B fornecem vistas em corte adicionais das células de fluxos de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00036] A Figura 4 ilustra aspectos de um sistema de formação de imagens de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00037] As Figuras 4A e 4B ilustram aspectos de células de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00038] As Figuras 4A-1 e 4A-2 ilustram vistas em seção transversal do envelope do fluido de revestimento (por exemplo, PIOAL) e dimensões da corrente de fluido da amostra dentro de uma célula de fluxo em uma porta de saída da cânula e um local de captura de imagem, respectivamente, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00039] As Figuras 4K e 4L mostram uma corrente da amostra que flui através de um local de captura de imagem de uma célula de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00040] As Figuras 4K-1 e 4K-2 mostram um local de imageamento alvo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00041] A Figura 4K-3 ilustra o aspecto do alinhamento de partícula em uma corrente de fluxo da amostra, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00042] A Figura 4L-1 ilustra aspectos dos perfis de velocidade da corrente de fluxo do fluido dentro de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00043] As Figuras 4M e 4N mostram recursos de alinhamento de partícula intracelular exemplificadores de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00044] A Figura 5 ilustra aspectos de uma técnica de focalização de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00045] A Figura 6 ilustra aspectos de uma técnica de focalização de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00046] As Figuras 7 e 8 ilustram aspectos da taxa de esforço da corrente de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00047] A Figura 9A ilustra um alvo de foco automático exemplificador de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00048] A Figura 9B mostra uma imagem capturada de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00049] As Figuras 10 e 11 ilustram alvos de foco automático exemplificadores de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00050] A Figura 12A ilustra um alvo de foco automático exemplificador de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00051] A Figura 12B mostra uma vista de perto da porção central do alvo de foco automático de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00052] As Figuras 13A, 13B, e 13C ilustram vistas de sensores de temperatura da célula de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00053] As Figuras 14A e 14B fornecem vistas laterais de seção transversal que ilustram aspectos dos sistemas e métodos de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00054] A Figura 14C ilustra uma vista lateral de seção transversal de uma célula de fluxo que ilustra aspectos dos sistemas e métodos de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00055] A Figura 14D fornece uma vista lateral de seção transversal que ilustra aspectos dos sistemas e métodos de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00056] A Figura 15 ilustra aspectos do padrão de foco automático e técnicas de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00057] As Figuras 16A e 16B mostram aspectos dos sistemas e métodos de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00058] A presente descrição está relacionada aos aparelhos, sistemas, composições, e métodos para analisar uma amostra contendo partículas. Em uma modalidade, a invenção está relacionada a um sistema de formação de imagens de partícula automatizado que compreende um analisador que pode ser, por exemplo, um analisador visual. Em algumas modalidades, o analisador visual pode ainda compreender um processador para facilitar a análise automatizada das imagens.

[00059] Partículas exemplificadoras podem incluir qualquer um dos elementos formados em amostras de fluido biológico como revelado aqui, incluindo, por exemplo, partículas esféricas e não esféricas. O PIOAL alinha partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo, o que resulta na otimização da imagem. O PIOAL também ajuda as células esféricas no posicionalmente, reposicionamento e/ou melhor posicionamento das estruturas, organelas ou lóbulos intracelulares substancialmente paralelos à direção do fluxo. Em algumas modalidades, plaquetas, reticulócitos, RBCs nucleados, e WBCs, incluindo neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, e WBCs imaturos incluindo blastos, promielócitos, mielócitos ou metamielócitos são contados e analisados como partículas.

[00060] O PIOAL pode ser introduzido em uma célula de fluxo e carrega a amostra através da área de imageamento, depois ao longo em direção à descarga. A corrente de fluido da amostra pode ser injetada através de uma cânula com uma abertura achatada para estabelecer uma trajetória de fluxo com uma largura considerável. Por exemplo, o PIOAL pode ter uma viscosidade relativamente maior do que o fluido da amostra, densidade adequada, e vazões no ponto de injeção da amostra são tais que o fluido da amostra se afina em um formato de fita fina. A fita do fluido da amostra é carregada juntamente com o PIOAL, para passar em frente a uma porta de visualização onde um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e uma fonte de luz são dispostos para visualizar a corrente de amostra em forma de fita.

[00061] A corrente de amostra em forma de fita é carregada juntamente com o PIOAL, para passar em frente a um porta de visualização onde um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e uma fonte de luz (por exemplo, UV, visível, ou IR) são dispostos para visualizar a corrente de amostra em forma de fita. O dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e fonte de luz podem ser colocados em lados opostos da célula de fluxo, para obter imagens contra a luz das partículas como células do sangue. O dispositivo de imageamento óptico de alta resolução captura imagens de dados de pixel da amostra através de uma porta de visualização na célula de fluxo. Por exemplo, o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução captura imagens a uma taxa de repetição compatível com a velocidade de fluxo da amostra de modo que as seções da corrente de amostra em forma de fita sejam imageadas sem lacunas substanciais ou sobreposição.

[00062] As modalidades da presente invenção fornecem vários elementos estruturais e funcionais implementados no design e operação de um sistema para coletar imagens de uma corrente de amostra em forma de fita que flui através de uma célula de fluxo. As modalidades exemplificadoras são configuradas para obter imagens suficientemente focalizadas das partículas, com clareza e resolução suficientes para revelar os diferentes elementos de várias partículas como células do sangue, que permitem que a partícula e/ou tipos de célula sejam diferenciados uns dos outros.

[00063] A fim de trazer a corrente de amostra em forma de fita para o foco, a distância entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a corrente de amostra em forma de fita pode ser definida de modo que a corrente de amostra em forma de fita esteja a uma distância desejada (por exemplo, a distância de focalização) do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ao longo do eixo óptico.

[00064] Uma distância de focalização é uma característica das lentes do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução usado para apresentar a imagem sobre uma matriz do fotossensor, definida especificamente pelo material, formato e pelas dimensões dos elementos da lente e sua configuração e colocação ao longo do eixo óptico. As dimensões da área da amostra que é imageada, e a profundidade do campo que está em foco na amostra, são determinadas pela configuração da lente.

[00065] Ajustes de abertura e ajustes de ampliação são possíveis, mas para fins de simplicidade, determinados exemplos nesta descrição são tais que a focalização do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução sobre as partículas na corrente de amostra em forma de fita simplesmente requer posicionar relativamente o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a corrente de amostra em forma de fita na célula de fluxo a uma distância correta, especificamente, a distância que apresenta uma imagem focalizada na matriz do fotossensor (por exemplo, uma matriz de dispositivo de acoplamento de carga) das partículas na corrente de amostra em forma de fita. O dispositivo de imageamento óptico de alta resolução pode incluir uma câmera que registra ou transmite imagens imóveis ou imagens de vídeo para visualização e/ou processamento e/ou transmissão.

[00066] Em um aspecto, a natureza simétrica da célula de fluxo e a maneira de injeção do fluido da amostra e PIOAL fornecem uma posição repetível dentro da célula de fluxo para a corrente de amostra em forma de fita no PIOAL. Entretanto, as posições relativas da célula de fluxo e do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução são sujeitas à mudança e requerem ajustes de posição ocasionais para manter a distância ideal entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a corrente de amostra em forma de fita, fornecendo assim uma imagem de foco de qualidade.

[00067] As modalidades da presente invenção englobam sistemas e métodos de analisador visual automatizados para sangue e/ou outros fluidos biológicos que incorporam um dispositivo/aparelho de foco automático para fornecer imagens focalizadas confiavelmente da amostra pelo ajuste muito preciso da distância entre a corrente de amostra em forma de fita e o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução. Em um aspecto, as modalidades do sistema de focalização automática apresentadas na presente invenção podem definir muito precisamente a distância entre a corrente de amostra em forma de fita e o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e capturar imagens focalizadas confiavelmente da amostra. Em algumas modalidades, os algoritmos são usados para estabelecer a distância que atinge bons resultados de foco.

[00068] É um objetivo empregar uma célula de fluxo, que fornece uma posição estável e altamente repetível para uma corrente de amostra em forma de fita envelopada em um fluxo de PIOAL, em combinação com um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e dispositivo/aparelho de foco automático que mantém a distância ideal entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a corrente de amostra em forma de fita, fornecendo assim uma imagem focalizada de qualidade.

[00069] Tais aparelhos e métodos são descritos e reivindicados na presente invenção. Uma célula de fluxo simétrica é fornecida, que foi descoberta por produzir uma posição de corrente de amostra em forma de fita repetível dentro da célula de fluxo. A focalização envolve definir uma posição relativa correta precisamente do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução em relação à corrente de amostra em forma de fita, de modo a manter o foco na corrente de amostra em forma de fita.

[00070] Vantajosamente, a célula de fluxo e/ou o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução podem ser movidos em relação ao outro em um processo de focalização automática usando um padrão de foco automático como um padrão de alto contraste ou alvo de focalização similar, de preferência um alvo plano com elementos nitidamente contrastantes, como bordas, o padrão de foco automático sendo fixo na posição em relação à célula de fluxo e usado como um objeto de focalização ao invés da própria amostra. A corrente de amostra em forma de fita é uma fita fina a uma distância fixa a partir do padrão de foco automático ao longo da linha paralela ao eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução. A distância de deslocamento entre o padrão de foco automático e a posição da corrente de amostra em forma de fita é uma distância constante, que é determinada inicialmente e programada no procedimento de foco automático. A técnica exemplificadora depois disso é focalizar automaticamente no padrão de foco automático, depois deslocar o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e/ou célula de fluxo em relação um ao outro pela distância predeterminada conhecida e constante, após isso a distância entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e o local da corrente de amostra em forma de fita é a distância ideal para fornecer uma imagem focalizada de qualidade da corrente de amostra em forma de fita. Por exemplo, em primeiro lugar, um algoritmo de foco automático focaliza a posição do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução no padrão de foco automático localizado a uma distância fixa a partir da corrente de amostra em forma de fita. Tendo focado no padrão de foco automático, o processador opera o motor de acionamento ao longo da distância fixa, trazendo assim a corrente de amostra em forma de fita para o foco do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução.

[00071] Um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução exemplificador compreende uma lente objetiva e sensor de imagem de pixel associado, capaz de capturar uma imagem que revela as partículas em ampliação e resolução suficientes para fornecer detalhes suficientes para apresentar os elementos visuais das partículas. Em certas modalidades, a ampliação é maior por um fator de pelo menos 2x (fornecendo assim uma área de imagem 2x por cada imagem feita), gerando assim informação mais detalhada para cada partícula em comparação com as análises de urina tradicionais.

[00072] A trajetória de fluxo de PIOAL pode ser disposta simetricamente tal que quantidades iguais de PIOAL fluam acima e abaixo da corrente de amostra em forma de fita que se estica e localiza a corrente de amostra em forma de fita como uma fita fina a uma distância fixa a partir do padrão de foco automático ao longo da linha paralela ao eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução. Em uma modalidade o padrão de foco automático compreende uma margem opaca em torno de uma abertura de admissão de luz a partir de uma fonte de iluminação traseira e a distância do padrão de foco automático é prontamente e inequivocamente visada pelos controles de foco automático. Então, a corrente de amostra em forma de fita é trazida para o foco pelo deslocamento do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução em relação à célula de fluxo ao longo da distância de deslocamento constante e predeterminada. Não há necessidade do foco automático diretamente sobre o conteúdo de imagem da amostra, embora foco automático adicional seja concebível.

[00073] Uma configuração de focalização automatizada inclui um motor de acionamento que ajusta a posição relativa da célula de fluxo e um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ao longo do eixo óptico, responsivo aos sinais de controle de um processador que avalia uma ou mais medições de qualidade de foco sobre uma faixa de distâncias e procura uma distância ideal. Por exemplo, o processador pode avaliar uma medição do contraste e operar o motor de acionamento para foco automático. Na operação normal o processador opera o motor de acionamento para a focalização automática ao alvo e depois ajusta a distância entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a célula de fluxo pelo deslocamento registrado a partir do alvo para trazer a corrente de amostra em forma de fita para o foco. Contanto que o dispositivo continue a mover acorrente de amostra em forma de fita do mesmo modo, e a expansão térmica ou fatores de confusão similares não surjam, a imagem da corrente de amostra em forma de fita permanecerá em foco.

[00074] Um processo de ajuste ou calibração preliminar pode ser usado para determinar e registrar a distância de deslocamento entre o alvo e a posição da corrente de amostra em forma de fita na célula de fluxo. A distância de deslocamento exata, que pode diferir levemente para diferentes células de fluxo, é estabelecida pelo teste preliminar, tal como focalizando-se automaticamente alternativamente no alvo e em uma corrente de amostra em forma de fita de teste várias vezes, e registrando-se o resultado médio como uma constante associada com a célula de fluxo.

[00075] Consequentemente, a amostra a ser imageada, como uma amostra preparada de sangue ou outro tipo de amostra, é direcionada ao longo de uma trajetória de fluxo definida através de uma zona de visualização em uma célula de fluxo. A trajetória de fluxo de PIOAL de preferência é simétrica e a amostra é injetada no centro do fluxo de PIOAL, com o qual a amostra é envelopada. As vazões e características de viscosidade e densidade da amostra e o material do revestimento como um PIOAL, junto com o contorno da célula de fluxo, cooperam de modo a formar a corrente de amostra em forma de fita em uma fita plana que flui de forma consistente através da zona de visualização em uma posição repetível.

[00076] A amostra pode ser imageada por um componente de câmera do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e as imagens digitais coletadas a serem analisadas por processos de análise de imagem pelo menos parcialmente automatizados, incluindo um processo de foco automático conforme descrito aqui.

[00077] Um objeto é distinguir, categorizar, subcategorizar e/ou contar as partículas como células do sangue nas amostras sanguíneas assim como outras amostras biológicas conforme descrito aqui, que podem ser associadas com condições particulares. Em um aspecto, as composições do agente de contraste da partícula desta descrição podem ser combinadas com um analisador visual como o analisador descrito aqui em um método para fornecer, surpreendentemente, imagens focalizadas de alta qualidade das células no fluxo. As células podem ser automaticamente capturadas e processadas.

[00078] As imagens levam em conta a contagem diferencial de WBC com base em imagem automatizada, assim como identificação automatizada das anormalidades morfológicas úteis na determinação, diagnóstico, prognóstico, previsão, e/ou suporte de um diagnóstico de se um indivíduo é saudável ou tem uma doença, condição, anormalidade e/ou infecção e/ou para determinar ou monitorar se o indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento. As contagens de categoria e/ou subcategoria de célula nas amostras sanguíneas são usadas nesta descrição como exemplos não limitadores do tipo de fluidos que podem ser analisados.

[00079] Em um aspecto, os analisadores de imagem para uso com as composições desta invenção podem capturar imagens da amostra focalizadas confiavelmente pelo ajuste muito preciso da distância entre a corrente de amostra em forma de fita e o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução do sistema óptico. Em algumas modalidades, os analisadores visuais podem ser usados em combinação com as composições desta invenção e algoritmos para estabelecer a referida distância que pode conseguir bons resultados de foco. A amostra está disposta na célula de fluxo e iluminada para permitir a visualização através de uma porta de visualização. As células ou partículas individuais aparecem claramente nas imagens de dados de pixel capturadas, com detalhe de recurso suficiente para revelar atributos que são então comparados e contrastados com parâmetros conhecidos por distinguir categorias e subcategorias de células umas das outras.

[00080] É um objeto empregar uma célula de fluxo em combinação com as composições do agente de contraste da partícula exemplificadoras descritas aqui, e um PIOAL exemplificador, que fornece imagens de qualidade ideal e detalhe para o reconhecimento de partícula. Além disso, o PIOAL e o aparelho que fornece uma posição estável e altamente repetível para uma corrente de amostra em forma de fita envelopada em um fluxo de PIOAL. Isto, em combinação com um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e dispositivo/aparelho de foco automático que mantém a distância ideal entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a corrente de amostra em forma de fita, fornece uma imagem focalizada de qualidade.

[00081] Em certos aspectos, o analisador e o processador podem ser configurados para fornecer informações adicionais para corrigir erros de categorização associados com o contador de partícula, e ainda determinar a contagem de partícula precisa ou concentração de diferentes categorias e/ou subcategorias das partículas e os membros em cada categoria, ou em cada subcategoria das partículas na amostra.

[00082] De acordo com esta descrição, um sistema compreendendo um analisador visual é fornecido para obter imagens de uma amostra compreendendo partículas suspensas em um líquido. O sistema pode ser útil, por exemplo, na caracterização das partículas nos fluidos biológicos, como detectar e quantificar eritrócitos, reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas, e leucócitos, incluindo contagem diferencial de leucócitos, categorização e subcategorização e análises. Outros usos similares como a caracterização das células do sangue a partir de outros fluidos também são contemplados.

[00083] A discriminação das células do sangue em uma amostra sanguínea é uma aplicação exemplificadora para a qual o assunto é particularmente bem adequado. A amostra é preparada por técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução como uma corrente da amostra em forma de fita fina a ser imageada periodicamente enquanto a corrente de amostra em forma de fita flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (como células do sangue) podem ser distinguidas umas das outras, categorizadas, subcategorizadas, e contadas, usando técnicas de processamento programado de dados da imagem de pixel, ou exclusivamente automaticamente ou com assistência humana limitada, para identificar e contar as células ou partículas. Além das imagens da célula, que podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de recursos não comuns ou críticos das partículas, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria particular da célula ou partícula distinguida nas imagens das amostras registradas.

[00084] As contagens das diferentes partículas encontradas em cada imagem podem ser processadas, por exemplo usadas para acumular razões de células significativas precisa e estatisticamente de cada categoria e/ou subcategoria distinguida na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual pode ser diluída, mas as proporções das células em cada categoria e/ou subcategoria são representadas na amostra diluída, particularmente após um número de imagens ter sido processado.

[00085] Os aparelhos e métodos apresentados na presente invenção são úteis na discriminação e quantificação das células nas amostras com base em distinções visuais. A amostra pode ser uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de fluido corpóreo compreendendo leucócitos, incluindo mas não se limitando a, sangue, soro, medula óssea, fluido de lavagem, efusões, exsudatos, fluido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal, e fluido amniótico. Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, ex., uma amostra de biópsia que foi tratada para produzir uma suspensão de células. A amostra também pode ser uma suspensão obtida a partir do tratamento de uma amostra fecal. Uma amostra também pode ser uma amostra de laboratório ou linhas de produção compreendendo partículas, como uma amostra de cultura celular. O termo amostra pode ser usado para se referir a uma amostra obtida de um paciente ou laboratório ou qualquer fração, porção ou alíquota da mesma. A amostra pode ser diluída, dividida em porções, ou tingidas em alguns processos.

[00086] Em um aspecto, os sistemas, composições e métodos desta descrição fornecem surpreendentemente imagens de alta qualidade das células em um fluxo. Em um aspecto, o analisador visual pode ser usado em métodos desta descrição para fornecer contagem diferencial de WBC com base na imagem automatizada. Em certas modalidades, os métodos desta descrição referem-se à identificação automatizada das distinções visuais, incluindo recursos e/ou anormalidades morfológicas para determinação, diagnóstico, prognóstico, previsão, e/ou suporte de um diagnóstico de se um indivíduo é saudável ou tem uma doença, condição, anormalidade e/ou infecção e/ou é responsivo ou não responsivo ao tratamento. O sistema pode ainda compreender um contador de partícula em algumas modalidades. Aplicações incluem categorizar e/ou subcategorizar, e contar as células em uma amostra de fluido, como uma amostra sanguínea. Outros usos similares para contar tipos adicionais das partículas e/ou partículas em outras amostras de fluido também são contemplados. O sistema, composições, e métodos desta invenção podem ser usados para a categorização e subcategorização em tempo real e visualização das imagens usando qualquer algoritmo de reconhecimento de partícula automatizado adequado. As imagens capturadas para cada amostra podem ser armazenadas para serem vistas em uma data posterior.

[00087] Em outro aspecto, os aparelhos, composições, e métodos desta invenção fornecem surpreendentemente categorização e subcategorização da célula com base na imagem mais exatas e sinalização que reduz a taxa de análise manual em comparação com a taxa de análise manual quanto há o uso dos analisadores automáticos de corrente. Os sistemas, composições, e métodos reduzem a taxa de análise manual e permitem que a análise manual seja realizada no instrumento. Além disso, os sistemas, composições, e métodos desta descrição também reduzem o percentual das amostras marcadas durante a análise automatizada como necessitando de análise manual.

[00088] A presente descrição refere-se ainda aos sistemas, métodos e composições para combinar um contador de contagem de sangue completa (CBC) com um analisador, como um analisador visual, a fim de obter uma CBC e uma contagem de célula do leucócito expandida com base na imagem e uma contagem de plaqueta expandida com base na imagem, estendendo assim a faixa de detecção efetiva para contagem de plaquetas.

[00089] Consequentemente, em algumas modalidades, a presente descrição fornece um aparelho e um método para analisar uma amostra contendo partículas, por exemplo, células do sangue. De acordo com esta descrição, um analisador visual é fornecido para obter imagens de uma amostra compreendendo partículas suspensas em um líquido. Em algumas modalidades, o analisador visual compreende uma célula de fluxo e um componente de foco automático, no qual uma amostra líquida contendo as partículas de interesse é forçada a fluir através de uma célula de fluxo tendo uma porta de visualização através da qual uma câmera acoplada a uma lente objetiva captura imagens digitais das partículas. A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido da amostra, como uma amostra sanguínea diluída e/ou tratada ou outra amostra de fluido corporal conforme descrito aqui, e a uma fonte de um fluido de revestimento transparente, ou líquido de alinhamento de organela de partícula e/ou intracelular (PIOAL).

[00090] Em uma modalidade, os aparelhos também compreendem um contador de partícula tendo pelo menos uma faixa de detecção, assim como um analisador, e um processador. O analisador e o processador são configurados para fornecer informações adicionais para corrigir erros de contagem, categorização e subcategorização associados com o contador de partícula, e ainda determinar a contagem de partícula precisa ou concentração de diferentes categorias e/ou subcategorias das partículas na amostra.

[00091] A presente descrição fornece métodos e composições úteis para o alinhamento de organela de partícula e/ou intracelular ne realização das análises de amostra com base na imagem. Em algumas modalidades, esta descrição refere-se aos métodos e composições para contagem combinada e sistema de formação de imagens com a capacidade de realizar uma contagem de sangue completa (CBC) e um diferencial de leucócito expandido com base na imagem (WBC) capaz de identificar e contar tipos de célula, como WBCs, RBCs, e/ou plaquetas, incluindo, por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, reticulócitos, RBCs nucleados, blastos, promielócitos, mielócitos ou metamielócitos, e para fornecer informação com base na imagem para contagens de WBC e morfologias, contagens de eritrócitos (RBC) e morfologias e contagens de plaqueta (PLT) e morfologias.

[00092] Em outras modalidades, esta descrição refere-se a um PIOAL que pode ser usado nas análises com base na imagem das partículas conforme descrito aqui. A contagem de categoria e/ou subcategoria de célula nas amostras sanguíneas é usada nesta descrição como exemplos não limitadores do tipo de amostras que podem ser analisadas. Em algumas modalidades, as células presentes nas amostras também podem incluir células bacterianas ou fúngicas assim como leucócitos, eritrócitos e/ou plaquetas. Em algumas modalidades, as suspensões de partícula obtidas dos tecidos ou aspirados podem ser analisadas.

[00093] A discriminação das células do sangue em uma amostra sanguínea é uma aplicação exemplificadora para a qual o assunto é particularmente bem adequado. A amostra é preparada por técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução como uma corrente da amostra em forma de fita a ser imageada periodicamente enquanto a amostra flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (como células do sangue) podem ser distinguidas umas das outras, categorizadas, subcategorizadas, e/ou contadas, usando técnicas de processamento programado de dados da imagem de pixel, ou exclusivamente automaticamente ou com assistência humana limitada, para identificar e contar as células ou partículas. Além das imagens da célula, que podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de recursos não comuns ou críticos, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria particular da célula ou partícula distinguida nas imagens da amostra registradas. As contagens das diferentes partículas encontradas em cada imagem podem ser ainda processadas, por exemplo, usadas para acumular razões proporcionais precisas e estatisticamente significativas de cada categoria e/ou subcategoria distinguida na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual também pode ser altamente diluída, mas as proporções das células em cada categoria e/ou subcategoria são representadas na distribuição para a amostra diluída, particularmente após um número de imagens ter sido processado.

[00094] Em alguns aspectos, as amostras são apresentadas, imageadas e analisadas de uma maneira automatizada. No caso das amostras sanguíneas, a amostra pode ser substancialmente diluída com água ou solução salina, que reduz a extensão à qual a vista de algumas células pode ser ocultada por outras células em uma amostra não diluída ou menos diluída. As células podem ser tratadas com agentes que melhoram o contraste de alguns aspectos de célula, por exemplo, usando agentes de permeabilização para tornar as membranas celulares permeáveis, e colorações histológicas para aderir em e para revelar recursos, como grânulos e o núcleo. Em algumas modalidades pode ser desejável tingir uma alíquota da amostra para contar e caracterizar as partículas que incluem reticulócitos, eritrócitos nucleados, e plaquetas, e para diferencial, caracterização e análise de leucócito. Em outras modalidades, as amostras contendo eritrócitos podem ser diluídas antes da introdução na célula de fluxo e formação da imagem.

[00095] As características do aparelhos de preparação da amostra e métodos para a diluição da amostra, permeabilização e coloração histológica, geralmente são executadas por meio de bombas de precisão e válvulas operadas por um ou mais controladores programáveis, e não são centrais para esta descrição. Exemplos podem ser encontrados nas patentes atribuídas ao International Remote Imaging Systems, Inc., como US 7.319.907, a respeito de controles programáveis. De modo semelhante, as técnicas para distinguir dentre determinadas categorias e/ou subcategorias de célula por seus atributos como tamanho relativo e cor podem ser encontradas na US 5.436.978 em conexão com leucócitos. As revelações destas patentes estão aqui incorporadas a título de referência.

[00096] Para facilitar a capacidade, velocidade e eficácia pela qual as partículas como as células são categorizadas e/ou subcategorizadas, é vantajoso fornecer imagens de alta qualidade limpas das células do sangue para análise automatizada pelo sistema de processamento de dados. De acordo com a presente descrição, uma corrente da amostra preparada está disposta em uma fita fina tendo uma posição estável entre paredes opostas de uma célula de fluxo. O posicionamento da corrente da amostra e seu aplainamento em um formato de fita fina podem ser atingidos pelo fluxo entre as camadas de um PIOAL introduzido na célula de fluxo que diferes em viscosidade a partir do fluido da amostra e é fluída através de um canal de fluxo simétrico.

[00097] O PIOAL tem uma viscosidade e densidade adequadas, e vazões no ponto de introdução para a célula de fluxo da amostra são tais que o fluido da amostra se afina em uma fita fina. A corrente de amostra em forma de fita é carregada juntamente com o PIOAL, para passar em frente a uma porta de visualização onde uma lente objetiva e uma fonte de luz são dispostas para visualizar a corrente de amostra em forma de fita. O fluido da amostra é introduzido, por exemplo, injetado em um ponto onde a trajetória de fluxo do PIOAL se afina simetricamente. Como um resultado, a corrente de fluido da amostra é achatada e esticada em uma fita fina. Um PIOAL desta descrição pode ser usado como o fluido de revestimento com qualquer analisador visual desta descrição. Em uma modalidade, o PIOAL pode ser introduzido em uma extremidade da célula de fluxo para carregar ao longo do fluido da amostra em direção à descarga.

[00098] A dimensão da corrente de amostra em forma de fita na zona de visualização é afetada pelo adelgaçamento geométrico da trajetória de fluxo do PIOAL e velocidade linear diferencial do fluido da amostra e PIOAL resultando no adelgaçamento e estiramento da corrente de amostra em forma de fita. A velocidade linear diferencial inicial da amostra para o PIOAL pode variar de 0,5:1 a 5:1. A seção transversal da trajetória de fluxo de PIOAL pode ser afinada pela redução da profundidade por um fator de cerca de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, ou 200:1. Em uma modalidade, o adelgaçamento geométrico é 40:1. Em uma modalidade, o adelgaçamento geométrico é 30:1. Fatores levados em conta são o tempo de trânsito através da célula de fluxo, a taxa desejada de produtividade da amostra, obtenção de uma espessura da corrente de amostra em forma de fita comparável ao tamanho de partícula, obtenção do alinhamento das partículas e organelas, obtenção do conteúdo de foco das partículas, equilíbrio da pressão, fluxo, e viscosidade dentro de limites operacionais, otimização da espessura da corrente de amostra em forma de fita, obtenção de uma velocidade linear desejada, considerações sobre industrialização, e volumes da amostra e PIOAL necessários.

[00099] O comprimento e volume da cânula e a achatamento da seção transversal podem ser selecionados para reduzir o período da instabilidade do fluxo da amostra, aumentando assim a velocidade. Em algumas modalidades o período de instabilidade do fluxo pode ser menor que cerca de 3, 2,75, 2,5, 2,25, 2, 1,75, 1,5 1,25, ou menor que cerca de 1 segundo. Um volume de cânula menor pode também reduzir o tempo e volume do diluente necessário para limpar a cânula entre as execuções da amostra. Em algumas modalidades o tempo de trânsito através da célula de fluxo é 1, 2, 3, ou 4 segundos, ou qualquer faixa entre qualquer dos dois desses tempos. Em algumas modalidades o tempo de trânsito pode ser menor que 4, 3 ou 2 segundos.

[000100] As viscosidades e as vazões do fluido da amostra e o PIOAL e o contorno da célula de fluxo são dispostos de modo que o fluxo de PIOAL achata e estica o fluxo da amostra em uma fita plana consistentemente através da zona de visualização em um local confiável. A corrente de fluxo da amostra pode ser comprimida para aproximadamente 2 a 3 μm na espessura do fluxo de fluido. Vários tipos de célula sanguínea têm diâmetros maiores que a espessura da corrente. Forças de desvio na direção paralela à direção do fluxo causam um aumento de uma projeção de imagem das partículas sob condições de formação da imagem no plano focal do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e/ou fazem com que as estruturas intrapartícula, por exemplo, estruturas, organelas ou lóbulos intracelulares, sejam posicionadas, reposicionadas, e/ou melhor posicionadas para estarem substancialmente paralelas à direção do fluxo. A profundidade do campo do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é até 7 μm, por exemplo, 1 a 4 μm.

[000101] A seção transversal do fluxo de PIOAL, com a corrente de amostra em forma de fita carregada junto, é constante através de uma zona de visualização em frente a uma porta de visualização através da qual a lente objetiva é direcionada. A lente objetiva pode ser o componente de objetiva de um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou dispositivo de captura de imagem digital. A corrente de amostra em forma de fita segue uma trajetória através da zona de visualização em uma posição conhecida e repetível dentro da célula de fluxo, por exemplo, a uma distância conhecida e repetível a partir de duas paredes da célula de fluxo, sendo descarregada a jusante.

[000102] As informações ópticas das partículas na amostra são detectadas por uma seção de detecção no analisador, quando a corrente de amostra em forma de fita é carregada através da zona de visualização em frente à porta de visualização, gerando assim dados a partir das partículas/células contidas na amostra. O uso deste analisador permite a captura, processamento, categorização e subcategorização e contagem das células e/ou partículas contidas nas amostras. O líquido PIOAL pode ser preparado pela adição de agente modificador de viscosidade, agente tampão, agente de ajuste de pH, agente antimicrobiano, modificador de força iônica, tensoativo, e/ou um agente quelante. Componentes e/ou recursos funcionais exemplificadores do analisador na presente descrição podem incluir, por exemplo, a capacidade de adquirir e/ou processar dados a partir da análise de imagens, processamento de tingimento da amostra, processamento da imagem, e/ou identificação da imagem da partícula, contagem, e/ou categorização e subcategorização.

[000103] Em uma modalidade esta descrição tem por base a surpreendente e inesperada descoberta de que a adição de uma quantidade adequada de um agente de viscosidade no PIOAL melhora significativamente o alinhamento da partícula/célula em uma célula de fluxo, levando a uma maior porcentagem de células ou componentes celulares em foco, e imagens de qualidade mais alta de células e/ou partículas no fluxo. A adição do agente de viscosidade aumenta as forças de cisalhamento nas células como RBCs, o que melhora o alinhamento das células em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo, o que resulta na otimização da imagem. Isto também resulta no posicionamento, reposicionamento, e/ou melhor posicionamento das estruturas intrapartícula como estruturas, organelas ou lóbulos intracelulares substancialmente paralelos à direção do fluxo, o que resulta na otimização da imagem. O agente de viscosidade também reduz o desalinhamento das células, geralmente, mas não se limitando às células que são menores em diâmetro do que a corrente de fluxo.

[000104] O alinhamento das células que são menores em diâmetro do que a corrente de fluxo, por exemplo, eritrócitos podem ser obtidos, por exemplo, pelo aumento da viscosidade de PIOAL, ou pelo aumento da razão de velocidade de fluxo. Isto resulta no alinhamento das RBCs paralelas à direção do fluxo. Em algumas modalidades, uma redução no desalinhamento de RBC e/ou aumento no alinhamento de RBC é atingido pelo aumento da viscosidade de PIOAL.

[000105] A espessura da corrente de amostra em forma de fita pode ser afetada pelas viscosidades relativas e vazões do fluido da amostra e o PIOAL. A fonte da amostra e/ou a fonte de PIOAL, por exemplo, compreendendo bombas de deslocamento de precisão, pode ser configurada para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em vazões controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em forma de fita, ou seja, como uma fita fina pelo menos tão larga quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou do dispositivo de captura de imagem digital.

[000106] A seção transversal do fluxo de PIOAL, com a corrente de amostra em forma de fita carregada junto, é constante através de uma zona de visualização em frente a uma porta de visualização através da qual o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é direcionado. A corrente de amostra em forma de fita segue uma trajetória através da zona de visualização a uma distância conhecida e repetível ou a partir da frente ou traseira das paredes da célula de fluxo sendo descarregada a jusante daquela.

[000107] Em algumas modalidades, as imagens obtidas em qualquer uma das composições e/ou métodos desta invenção podem ser imagens digitalizadas. Em algumas modalidades, as imagens obtidas são imagens de microscopia. Em certas modalidades, as imagens podem ser obtidas manualmente. Em outras modalidades, pelo menos parte do procedimento para obter as imagens é automatizado. Em algumas modalidades, as imagens podem ser obtidas usando um analisador visual compreendendo uma célula de fluxo, um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagem digital, opcionalmente com um recurso de foco automático.

[000108] Em uma modalidade, as imagens fornecem informações com relação à citosólica, núcleo da célula e/ou componentes nucleares da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações com relação ao componente granular e/ou outros recursos morfológicos da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações com relação à citosólica, núcleo da célula e/ou componentes granulares da célula. As imagens e/ou elementos granulares e/ou nucleares são determinantes para a categorização e subcategorização da célula ambas independentemente ou em combinação um com o outro.

[000109] Em um aspecto dos métodos desta invenção, as células que entraram em contato com composição de agente de contraste de partícula e/ou imageadas são eritrócitos nucleados. Ainda em outro aspecto, os métodos desta invenção referem-se a um método para realizar a categorização e subcategorização de imagem a base de eritrócitos compreendendo: a) formação da imagem de uma porção de eritrócitos; e b) determinação da morfologia dos eritrócitos imageados. Como usado aqui, eritrócitos (RBC) podem incluir, por exemplo, eritrócitos normais ou anormais, reticulócitos, eritrócitos nucleados, e/ou células infectadas por malária. Em algumas modalidades, a formação da imagem é realizada usando os aparelhos desta descrição como aparelhos compreendendo um contador de partícula, um analisador visual e um processador.

[000110] Como usado aqui, uma contagem de sangue completa (CBC) exemplificadora pode incluir um painel de teste normalmente solicitado por um médico ou outro profissional de saúde que fornece informações sobre as partículas e/ou células em uma amostra sanguínea do paciente. Células exemplificadoras que circulam na corrente sanguínea podem ser geralmente divididas em três tipos: incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, glóbulos brancos (por exemplo, leucócitos), glóbulos vermelhos (por exemplo, eritrócitos), e plaquetas (por exemplo, trombócitos).

[000111] Como usado aqui, contagens anormalmente altas ou baixas podem indicar a presença de doença, distúrbio e /ou condição. Dessa forma, uma CBC é um dos testes sanguíneos comumente realizados, já que ele pode fornecer uma visão geral de um estado de saúde do paciente. Consequentemente, uma CBC é rotineiramente realizada durantes exames físicos anuais.

[000112] Como usado aqui, tipicamente um flebotomista coleta a amostra de sangue de um indivíduo, o sangue é geralmente coletado em um tubo de ensaio contendo tipicamente um anticoagulante (por exemplo, EDTA, às vezes citrato) para impedir que ele coagule. A amostra é então transportada para um laboratório. Às vezes a amostra é retirada de uma punctura no dedo usando uma pipeta de Pasteur para processamento imediato por um contador automatizado. Em uma modalidade, a imagem da partícula é adquirida enquanto a partícula é envelopada em um fluido de revestimento ou PIOAL. Em certas modalidades, a amostra sanguínea pode ser vista em uma lâmina preparada com uma amostra do sangue do paciente sob um microscópio (um filme de sangue, ou esfregaço periférico). Em certas modalidades, a contagem de sangue completa é realizada por um analisador automático.

[000113] Como usado aqui, em geral, analisadores de sangue podem aspirar uma quantidade muito pequena do espécime através da tubulação estreita. Sensores podem detectar a contagem e/ou o número de células que passam através da tubulação, e podem identificar o tipo de célula. Sensores exemplificadores podem incluir detectores de luz (por exemplo, visível, UV ou IR) e/ou impedância elétrica. Parâmetros de detecção exemplificadores podem incluir tamanho, volume, e/ou recursos celulares. Em certas modalidades, os sensores podem detectar luz visível e não visível em um espectro de comprimento de onda que varia de cerca de 200 nm a cerca de 10000 nm. Em certas modalidades, os sensores podem detectar um comprimento de onda de entre cerca de entre 380 nm e cerca de 760 nm.

[000114] Como usado aqui, dados/parâmetros de uma contagem sanguínea podem incluir, por exemplo, eritrócitos totais; hemoglobina - a quantidade de hemoglobina no sangue; hematócrito ou volume de célula empacotado (PCV); volume corpuscular médio (MCV) - o volume médio dos eritrócitos (anemia é classificada como microcítica ou macrocítica com base em se este volume está acima ou abaixo da faixa normal esperada. Outras condições que podem afetar o MCV incluem talassemia, reticulocitose e alcoolismo); hemoglobina corpuscular média (MCH) - a quantidade média de hemoglobina por eritrócitos, em picogramas; concentração média de hemoglobina corpuscular (MCHC) - a concentração média de hemoglobina nas células; largura da distribuição das células vermelhas do sangue (RDW) - a variação no volume celular da população de RBC; leucócitos totais; granulócitos neutrófilos (pode indicar infecção bacteriana, tipicamente aumentados em infecções virais agudas). Devido à aparência segmentada do núcleo, os neutrófilos são muitas vezes chamados de "segs". O núcleo dos neutrófilos menos maduros não é segmentado, mas tem uma banda ou formato alongado. Os neutrófilos menos maduros — aqueles que foram recentemente liberados a partir da medula óssea na corrente sanguínea — são conhecidos como "bandas". Outros dados/parâmetros para uma contagem sanguínea também podem incluir, por exemplo, linfócitos (por exemplo, aumentados com algumas infecções virais como febre glandular, e na leucemia linfocítica crônica (CLL), ou diminuídos pela infecção por HIV); monócitos (podem estar aumentados na infecção bacteriana, tuberculose, malária, febre maculosa das Montanhas Rochosas, leucemia monocítica, colite ulcerativa crônica e enterite regional; granulócitos eosinófilos (por exemplo, aumentados em infecções parasíticas, asma, ou reação alérgica); granulócitos basófilos (por exemplo, aumentados em condições relacionadas com a medula óssea, como leucemia ou linfoma.

[000115] Para uso na presente invenção, os dados/parâmetros de uma contagem de sangue também podem incluir, por exemplo, os dados associados com plaquetas, incluindo números de plaquetas, informações sobre o seu tamanho e a faixa de tamanhos no sangue; volume médio das plaquetas (MPV) - uma medição do tamanho médio das plaquetas.

[000116] Em um outro aspecto dos métodos da presente invenção, as células colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e/ou imageadas são células anormais, como as células infectadas com malária, linfócitos atípicos. Em alguns aspectos desta invenção, as células são células anormais que podem ser usadas para identificar, prever, diagnosticar, prognosticar ou suportar um diagnóstico de uma condição, doença, infecção e/ou síndrome.

[000117] Em outro aspecto dos métodos desta invenção, as células são plaquetas.

[000118] A menos que expressamente indicado de outro modo, as referências a "partícula" ou "partículas" feitas na presente descrição serão compreendidas para englobar qualquer objeto formado ou discreto disperso em um fluido. Como usado aqui, "partícula" pode incluir todos os componentes mensuráveis e detectáveis (por exemplo, pela imagem e/ou outros parâmetros mensuráveis) nos fluidos biológicos. As partículas são de qualquer material, qualquer formato e qualquer tamanho. Em certas modalidades, as partículas podem compreender células. Exemplos de partículas incluem, mas não se limitam a, células, incluindo células do sangue, células fetais, epiteliais, células tronco, células tumorais, ou bactérias, parasitas, ou fragmentos de qualquer dos anteriores ou outros fragmentos em um fluido biológico. As células do sangue podem ser qualquer célula sanguínea, incluindo quaisquer células normais ou anormais, maduras ou imaturas que potencialmente existem em um fluido biológico, por exemplo, eritrócitos (RBCs), leucócitos (WBCs), plaquetas (PLTs) e outras células. Os membros também incluem células imaturas ou anormais. WBCs imaturas podem incluir metamielócitos, mielócitos, pro-mielócitos e blastos. Além das RBCs maduras, membros de RBCs podem incluir RBCs nucleadas (NRBCs) e reticulócitos. PLTs podem incluir PLTs "gigantes" e aglomerações de PLT. As células do sangue e elementos formados são ainda descritos em outro lugar nesta descrição.

[000119] Partículas exemplificadoras podem incluir elementos formados em amostras de fluido biológico, incluindo por exemplo, partículas esféricas e não esféricas. Em certas modalidades, as partículas podem compreender componentes não esféricos. A projeção da imagem dos componentes não esféricos pode ser maximizada no plano focal do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução. Em certas modalidades, as partículas não esféricas são alinhadas no plano focal do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução (alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo). Em algumas modalidades, plaquetas, reticulócitos, RBCs nucleados, e WBCs, incluindo neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, e WBCs imaturos incluindo blastos, promielócitos, mielócitos ou metamielócitos são contados e analisados como partículas.

[000120] Como usado aqui, parâmetros de partícula detectáveis e mensuráveis podem incluir, por exemplo, índices baseados no visual e/ou não imagem de tamanho, formato, simetria, contorno e/ou outras características.

[000121] A amostra pode ser uma amostra biológica isolada e/ou preparada, incluindo por exemplo, uma amostra de fluido corpóreo, uma sangue, soro, fluido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal, saliva, fluido seminal, lágrimas, suor, leite, fluido amniótico, fluido de lavagem, aspirado de medula óssea, efusões, exsudatos, ou outra amostra obtida a partir de um indivíduo (por exemplo, amostra de biópsia que foi tratada para produzir uma suspensão de células, ou uma amostra de laboratório ou linhas de produção compreendendo partículas). Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, por exemplo, uma amostra de biópsia que foi tratada para produzir uma suspensão de células. A amostra também pode ser uma suspensão obtida a partir do tratamento de uma amostra fecal. Uma amostra também pode ser uma amostra laboratorial, química, industrial ou linha de produção compreendendo partículas, como uma amostra de cultura celular. O termo amostra pode ser usado para se referir a uma amostra obtida de um paciente ou laboratório ou qualquer fração, porção ou alíquota da mesma. A amostra pode ser diluída, dividida em porções, ou tratada com um agente de contraste em alguns processos.

[000122] Os métodos apresentados na presente invenção são aplicáveis às amostras de uma ampla faixa de organismos, incluindo mamíferos, por exemplo, humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos), cavalos, vacas ou outro gado, cães, gatos ou outros mamíferos criados como animais de estimação, ratos, camundongos, ou outros animais de laboratório; pássaros, por exemplo, galinhas; répteis, por exemplo, jacarés; peixes, por exemplo, salmão e outras espécies de cultura; e anfíbios.

[000123] As amostras podem ser obtidas por qualquer método convencional, por exemplo, excreção, retirada, coleta, aspirado, ou uma biópsia. A amostra pode ser de um indivíduo considerado saudável, por exemplo, uma amostra coletada como parte de um exame físico de rotina. A amostra também pode ser de um indivíduo que tem, que está em risco de, ou que é suspeito de ter um distúrbio. O distúrbio pode ser o resultado de uma doença, uma anormalidade genética, uma infecção, uma lesão ou causas não conhecidas. Alternativamente ou além disso, os métodos podem ser úteis para monitorar um indivíduo durante o curso de tratamento para um distúrbio. Onde há sinais de falta de capacidade de resposta ao tratamento e/ou terapia, um médico pode escolher um agente alternativo ou adjunto. Dependendo da condição do indivíduo e o distúrbio particular, se houver, as amostras podem ser coletadas uma vez (ou duas vezes, três vezes, etc.) diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente.

[000124] As partículas podem variar dependendo da amostra. As partículas podem ser células biológicas, por exemplo, células do sangue, células fetais, células tronco, células tumorais ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades as partículas podem ser um agente infeccioso, por exemplo, um vírus ou bactéria.

[000125] Referência às "células do sangue" feita nesta descrição serão compreendidas por englobar quaisquer células normais ou anormais, maduras ou imaturas que potencialmente existem em um fluido biológico, por exemplo, eritrócitos (RBCs), leucócitos (WBCs), plaquetas (PLTs) e outras células. Em geral, RBCs, PLTs, e WBCs normais tem um diâmetro de partícula na faixa de 6-8 μm, 2-3 μm, e 8-15 μm, respectivamente. RBCs, PLTs e WBCs normais estão presentes em amostras de sangue totais de pacientes normais em uma faixa de concentração apropriada de 3,9-5,7 x 1012 células/L, 1,4-4,5 x 1011 células/L, 3,5-11 x 109 células/L, respectivamente. Consulte, Barbara J. Bain, Blood Cells, A Practical Guide, 4a Edição, Blackwell Publishing, 2007, 34-36.

[000126] Referência a um "elemento formado" será compreendida por englobar elementos não fluidos presentes em amostras de fluido biológico. Os elementos formados incluem, por exemplo, classes de células do sangue com base na classificação científica ou função fisiológica incluindo eritrócitos (RBCs), leucócitos (WBCs) e plaquetas (PLTs), aglomerações de WBC, subclasses de leucócitos, que inclui linfócitos maduros, e leucócitos imaturos como monócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos. "Elementos formados" para uso na presente invenção também incluirão partículas como microrganismos, bactérias, fungos, parasitas, ou fragmentos dos mesmos ou outros fragmentos de célula. Membros principais de WBCs incluem, mas não se limitam a, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, e basófilos. Os membros também incluem células imaturas ou anormais. Por exemplo, WBCs imaturas podem incluir metamielócitos, mielócitos, pro-mielócitos e blastos. Além das RBCs maduras, membros de RBCs podem incluir RBCs nucleadas (NRBCs) e reticulócitos. PLTs podem incluir PLTs regulares, e PLTs "gigantes" cujo tamanho está próximo daquele de WBCs regulares. Referência a um "membro" ou "membros" de uma categoria e/ou subcategoria de partículas feitas nesta descrição será compreendida por englobar partículas individuais dentro de uma categoria ou subcategoria das partículas.

[000127] A menos que expressamente indicado o contrário, referência a uma "categoria" de partículas feita nesta descrição será compreendida por englobar um grupo das partículas detectadas usando pelo menos um critério de detecção medido, detectado ou derivado como tamanho, formato, textura ou cor. Em algumas modalidades os membros de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria das partículas contadas pelos aparelhos desta descrição serão o mesmo tipo do elemento formado.

[000128] Tais partículas podem ser detectadas em um "canal." Referência ao "canal" feita nesta descrição será compreendida por englobar uma porção do contador de partícula compreendendo um detector acoplado a uma fonte de sinal, fornecendo uma saída que varia com maior ou menor detecção das partículas que satisfazem pelo menos um critério de detecção de canal. Por exemplo, um critério de detecção de canal pode ser baseado no tamanho ou volume das partículas. Em algumas modalidades, o número de canais em um contador de partícula é um. Em algumas outras modalidades, o número de canais em um contador de partícula é dois ou mais.

[000129] Uma categoria e/ou subcategoria das partículas detectadas em um canal do contador de partícula pode compreender diferentes classes e subclasses de partículas, e membros agrupados das partículas em duas ou mais subclasses. Referência a uma "categoria" das partículas feita nesta descrição será compreendida por englobar um agrupamento de partículas correspondente aos critérios medidos, detectados ou derivados como tamanho, formato, textura ou cor. Em algumas modalidades os membros de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria das partículas contadas pelos aparelhos desta descrição serão o mesmo tipo do elemento formado.

[000130] Como usado aqui, o termo dispositivo de imageamento óptico de alta resolução pode incluir dispositivos que são capazes de obter imagens de partículas com distinções visuais suficientes para diferenciar características e/ou mudanças morfológicas. Dispositivos de imageamento óptico de alta resolução exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução óptica de 1 μm ou menos, incluindo por exemplo, 0,4 a 0,5 um, como por exemplo, 0,46 μm.

[000131] Como usado aqui, as composições do agente de contraste da partícula podem ser adaptadas para uso em combinação com um líquido de alinhamento de organela de partícula e/ou intracelular (PIOAL) em um analisador visual para analisar as partículas em uma amostra de um indivíduo. O PIOAL exemplificador é útil, como um exemplo, em métodos para reconhecimento automatizado de diferentes tipos de partículas em uma amostra de um indivíduo.

[000132] Em outro aspecto, as células podem ser envelopadas em PIOAL quando as imagens são obtidas. Líquidos de alinhamento de organela intracelular exemplificadores adequados são descritos aqui.

[000133] Como usado aqui, "alinhamento" pode ser caracterizado em parte pelo alinhamento de partículas esféricas e /ou não esféricas. Por exemplo, partículas como partículas não esféricas podem ser alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo. Em certas modalidades, o alinhamento das partículas não esféricas é caracterizado pela orientação do aumento das partículas em uma projeção da imagem das partículas não esféricas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução. As partículas como partículas esféricas podem ter um aumento na quantidade dos conteúdos intrapartícula em foco das partículas e células que é eficaz para gerar distinções visuais para a categorização e subcategorização da partícula. As estruturas intrapartícula das partículas como partículas esféricas podem ser posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas para serem substancialmente paralelas à direção do fluxo. Por exemplo, estruturas, organelas ou lóbulos intracelulares também podem ser posicionados, reposicionados, e/ou melhor posicionados para estarem substancialmente paralelos à direção do fluxo.

[000134] Referência a uma "classe" das partículas feita nesta descrição será compreendida por englobar um grupo de partículas com base na classificação científica. Por exemplo, três classes principais de células do sangue existem em uma amostra sanguínea total, incluindo RBCs, WBCs e PLTs.

[000135] Referência a um "membro" ou "membros" das partículas feitas nesta descrição será compreendida por englobar partículas em uma categoria ou subcategoria de partículas. Por exemplo, cada categoria de células do sangue pode ser ainda dividida em subcategorias ou membros. Membros principais de WBCs incluem, mas não se limitam a, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, e basófilos. Os membros também incluem células imaturas ou anormais. Por exemplo, WBCs imaturas podem incluir metamielócitos, mielócitos, pro-mielócitos e blastos. Além das RBCs maduras, membros de RBCs podem incluir RBCs nucleadas (NRBCs) e reticulócitos. PLTs podem incluir PLTs regulares, e PLTs "gigantes" cujo tamanho está próximo daquele de WBCs regulares.

[000136] Referência às "células imaturas" serão compreendidas por englobar células em um determinado estágio de desenvolvimento, por exemplo, dentro da medula óssea ou logo após a liberação a partir da medula óssea mas antes do desenvolvimento completo em uma célula madura.

[000137] Referência às "células anormais" serão compreendidas por englobar células com características morfológicas irregulares ou células associada com uma determinada doença ou condição, ou irregularidades associadas que podem em alguns casos ser associadas com determinadas doenças ou condições. Exemplos de certas doenças incluem, mas não se limitam a, eritrocitose, policitemia, anemia, eritroblastopenia, leucocitose, leucopenia, linfocitose, linfocitopenia, granulocitose, granulocitopenia ou agranulocitose, neutrofilia, neutropenia, eosinofilia, osteopenia, basofilia, basopenia, trombocitose, trombocitopenia e pancitopenia. Uma classe de células pode aumentar ou diminuir na corrente sanguínea. Em algumas condições, células anormais muito maiores que células brancas regulares existem em uma pequena concentração em uma amostra sanguínea. Variações no tamanho, formato, cor, e/ou estruturas intracelulares podem ser associadas com certas doenças ou condições.

[000138] Referência à "contagem" das partículas ou "contagem de partícula" feita nesta descrição serão compreendidas por englobar os números das partículas obtidos a partir de um canal de um contador de partícula. Referência à "concentração" de uma classe ou um membro das partículas feita nesta descrição será compreendida por significar os números das partículas por volume unitário (por exemplo, por litro) ou por amostra de um volume conhecido. Por exemplo, um contador de partículas pode fornecer contagens ou concentrações ou outra função a base de contagem para categorias das partículas, embora um analisador visual possa fornecer contagens, concentrações, razões ou outros parâmetros baseados na concentração para cada categoria ou subcategoria das partículas.

[000139] Referência à "razão" feita nesta descrição será compreendida por englobam qualquer razão quantitativa e/ou proporcional de duas categorias/subcategorias, classes ou membros das partículas. Exemplos de tal razão incluem, mas não se limitam a, uma razão pela concentração, peso, e/ou por números das partículas. Tipicamente a razão refere-se à fração numérica da contagem de uma categoria, classe ou membro sobre a contagem de outra dessas categorias, classes ou membros. Em algumas modalidades, determinações que usam contagens ponderadas ou razões ponderadas e/ou proporcionais também podem ser feitas.

Hematologia - Sistema de análise de partícula

[000140] Agora com relação aos desenhos, a Figura 1 mostra esquematicamente uma célula de fluxo exemplificadora 22 para transportar um fluido da amostra através de uma zona de visualização 23 de um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 em uma configuração para o imageamento de partículas microscópicas em uma corrente de fluxo de amostra 32 usando processamento de imagem digital. A célula de fluxo 22 é acoplada a uma fonte 25 de fluido da amostra que pode ser submetida a processamento, como contato com uma composição de agente de contraste de partícula e aquecimento. A célula de fluxo 22 também é acoplada a uma ou mais fontes 27 de um líquido de alinhamento de organela de partícula e/ou intracelular (PIOAL), como uma solução de glicerol transparente tendo uma viscosidade que é maior do que a viscosidade do fluido da amostra.

[000141] O fluido da amostra é injetado através de uma abertura achatada em uma extremidade distal 28 de um tubo de alimentação da amostra 29, e para o interior da célula de fluxo 22 em um ponto onde o fluxo de PIOAL foi substancialmente estabelecido resultando em um fluxo laminar estável e simétrico do PIOAL acima e abaixo (ou em lados opostos) da corrente de amostra em forma de fita. As correntes da amostra e PIOAL podem ser fornecidas por bombas de medição de precisão que movem o PIOAL com o fluido da amostra injetado ao longo de uma trajetória de fluxo que se estreita substancialmente. O PIOAL envelopa e comprime o fluido da amostra na zona 21 onde a trajetória de fluxo se afina. Por isso, a diminuição na espessura da trajetória de fluxo na zona 21 pode contribuir para uma focalização geométrica da corrente da amostra 32. A fita do fluido da amostra 32 é envelopada e transportada junto com o PIOAL a jusante da zona de estreitamento 21, passando em frente, ou de outro modo através da zona de visualização 23 do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 onde as imagens são coletadas, por exemplo, usando um CCD 48. O processador 18 pode receber, como entrada, dados de pixel do CCD 48. A fita do fluido da amostra flui junto com o PIOAL para uma descarga 33.

[000142] Como mostrado aqui, a zona de estreitamento 21 pode ter uma porção de trajetória de fluxo proximal 21a tendo uma espessura proximal PT e uma porção de trajetória de fluxo distal 21b tendo uma espessura distal DT, de modo que a espessura distal DT é menor do que a espessura proximal PT. O fluido da amostra pode, portanto, ser injetado através da extremidade distal 28 do tubo da amostra 29 em um local que é distal à porção proximal 21a e proximal à porção distal 21b. Portanto, o fluido da amostra pode entrar no envelope de PIOAL na medida em que a corrente de PIOAL é comprimida pela zona 21, sendo que o tubo de injeção do fluido da amostra tem uma porta de saída distal através da qual o fluido da amostra é injetado no fluido de revestimento que está fluindo, a porta de saída distal delimitada pela diminuição no tamanho da trajetória de fluxo da célula de fluxo.

[000143] O dispositivo de imageamento óptico de alta resolução digital 24 com lente objetiva 46 é direcionado ao longo de um eixo óptico que cruza a corrente de amostra em forma de fita 32. A distância relativa entre a objetiva 46 e a célula de fluxo 33 é variável pela operação de um motor de acionamento 54, para apresentar e coletar uma imagem digitalizada focalizada em uma matriz de fotossensor.

[000144] A presente descrição fornece uma técnica para atingir automaticamente uma posição de trabalho correta do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 para focalização na corrente de amostra em forma de fita 32. A estrutura da célula de fluxo 22 pode ser configurada de modo que a corrente de amostra em forma de fita 32 tem um local fixo e confiável dentro da célula de fluxo que define a trajetória de fluxo do fluido da amostra, em uma fita fina entre as camadas de PIOAL, passando através de uma zona de visualização 23 na célula de fluxo 22. Em certas modalidades da célula de fluxo, a seção transversal da trajetória de fluxo para o PIOAL se estreita simetricamente no ponto no qual a amostra é inserida através de um orifício achatado como um tubo 29 com um lúmen retangular no orifício, ou cânula. A trajetória de fluxo estreitada (por exemplo, estreitamento geometricamente na área de seção transversal por uma razão de 20:1, ou por uma razão entre 20:1 a 70:1) junto com uma viscosidade diferencial entre o PIOAL e fluidos da amostra, e opcionalmente, uma diferença na velocidade linear do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, cooperam para comprimir a seção transversal da amostra por uma razão de cerca de 20:1 a 70:1. Em algumas modalidades a razão da espessura da seção transversal pode ser 40:1.

[000145] Em um aspecto, a natureza simétrica da célula de fluxo 22 e a maneira de injeção do fluido da amostra e PIOAL fornecem uma posição repetível dentro da célula de fluxo 22 para a corrente de amostra em forma de fita 32 entre duas camadas de PIOAL. Como resultado, variações do processo como as velocidades lineares específicas da amostra e o PIOAL; não tendem a deslocar a corrente de amostra em forma de fita a partir de seu local no fluxo. Em relação à estrutura da célula de fluxo 22, o local da corrente de amostra em forma de fita 32 é estável e repetível.

[000146] Entretanto, as posições relativas da célula de fluxo 22 e do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 do sistema óptico podem ser submetidas à mudança e podem se beneficiar de ajustes de posição ocasionais para manter uma distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e a corrente de amostra em forma de fita 32, fornecendo assim uma imagem de foco de qualidade das partículas envelopadas na corrente de amostra em forma de fita 32. De acordo com algumas modalidades, pode haver uma distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e a corrente de amostra em forma de fita 32 para obter imagens focalizadas das partículas envelopadas. Os elementos ópticos podem primeiro ser posicionados precisamente em relação à célula de fluxo 22 pelo foco automático ou outras técnicas para localizar o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 na distância ideal ou desejada a partir de um alvo de foco automático 44 com uma posição fixa em relação à célula de fluxo 22. A distância de deslocamento entre um alvo de foco automático 44 e a corrente de amostra em forma de fita 32 é conhecida precisamente, por exemplo, como resultado das etapas de calibração iniciais. Após focalizar automaticamente o alvo do foco automático 44, a célula de fluxo 22 e/ou dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 é então deslocado ao longo da distância de deslocamento conhecida entre um alvo de foco automático 44 e a corrente de amostra em forma de fita 32. Como resultado, a lente objetiva do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 44 é focalizada precisamente na corrente de amostra em forma de fita 32 contendo as partículas envelopadas.

[000147] Modalidades exemplificadoras da presente invenção envolvem foco automático no foco ou alvo de imageamento 44, que é uma figura de alto contraste definindo um local conhecido ao longo do eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagem digital 24. O alvo 44 pode ter uma distância de deslocamento conhecida em relação ao local da corrente de amostra em forma de fita 32. Um algoritmo de medição de contraste pode ser empregado especificamente sobre os recursos do alvo. Em um exemplo, a posição do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 pode ser variada ao longo de uma linha paralela ao eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagem digital, para encontrar a profundidade ou distância na qual uma ou mais amplitudes diferenciais máximas são encontradas dentre os valores de luminância de pixel que ocorrem ao longo de uma linha de pixels na imagem que é conhecida por atravessar uma borda da figura de contraste. Em alguns casos, o padrão de foco automático não tem variação ao longo da linha paralela ao eixo óptico, que é também a linha ao longo da qual um controle motorizado opera para ajustar a posição do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 para fornecer a distância de deslocamento registrada.

[000148] Deste modo, pode não ser necessário focalizar automaticamente ou depender de um aspecto de conteúdo de imagem que é variável entre diferentes imagens, que é menos altamente definido de modo a contrastar, ou que deve estar localizado em outro lugar em uma gama de posições, como a base para determinar um local de distância para referência. Tendo encontrado o local do foco ideal ou desejado no alvo de foco automático 44, as posições relativas da objetiva do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e a célula de fluxo 22 podem ser deslocadas pela distância de deslocamento registrada para fornecer uma posição de foco ideal ou desejada para partículas na corrente de amostra em forma de fita 32.

[000149] De acordo com algumas modalidades, o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 pode apresentar uma imagem da corrente de amostra em forma de fita 32 como retroiluminada por uma fonte de luz 42 aplicada através de uma abertura de iluminação (janela) 43. Nas modalidades mostradas na Figura 1, o perímetro da abertura de iluminação 43 forma um alvo de foco automático 44. Entretanto o objetivo é coletar uma imagem precisamente focalizada da corrente de amostra em forma de fita 32 através dos elementos ópticos do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 46 em um arranjo de elementos fotossensíveis, como um dispositivo de acoplamento de carga integrado.

[000150] O dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e seus elementos ópticos 46 são configurados para apresentar uma imagem das partículas na corrente de amostra em forma de fita 32 que está no foco na distância 50, cuja distância pode ser um resultado das dimensões do sistema óptico, do formato das lentes, e dos índices de refração de seus materiais. Em alguns casos, a distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e a corrente de amostra em forma de fita 32 não muda. Em outros casos, a distância entre a célula de fluxo 22 e o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e seus elementos ópticos 46 pode ser mudada. O movimento do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e/ou célula de fluxo 22 mais para perto ou ainda mais longe, um em relação ao outro (por exemplo, pelo ajuste da distância 51 entre um dispositivo de formação de imagem 24 e a célula de fluxo 22), move a localização de um ponto de focalização no final da distância 50 em relação à célula de fluxo.

[000151] De acordo com as modalidades da presente invenção, um alvo de foco 44 pode estar localizado a uma distância a partir da corrente de amostra em forma de fita 32, neste caso fixo diretamente à célula de fluxo 22 nas bordas da abertura 43 para luz a partir da fonte de iluminação 42. O alvo de foco 44 está a uma distância constante de deslocamento 52 a partir da corrente de amostra em forma de fita 32. Frequentemente, a distância de deslocamento 52 é constante porque o local da corrente de amostra em forma de fita 32 na célula de fluxo permanece constante.

[000152] Um procedimento exemplificador de foco automático envolve ajustar as posições relativas do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e da célula de fluxo 22 usando um motor 54 para chegar ao comprimento focal adequado fazendo assim com que o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 foque no alvo de foco automático 44. Neste exemplo, o alvo de foco automático 44 está atrás da corrente de amostra em forma de fita 32 na célula de fluxo. Então o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 é movido na direção ou na direção contrária da célula de fluxo 22 até procedimentos de foco automático estabelecerem que a imagem resolvida no fotossensor é uma imagem precisamente focalizada do alvo de foco automático 44. Então o motor 54 é operado para deslocar as posições relativas do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e da célula de fluxo 22 para fazer com que o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução foque na corrente de amostra em forma de fita 32, ou seja, pelo movimento do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 na direção contrária a partir da célula de fluxo 22, precisamente pela amplitude da distância de deslocamento 52. Nesta modalidade exemplificadora, o dispositivo de formação de imagem 24 é mostrado para ser movido pelo motor 54 para chegar a uma posição de foco. Em outras modalidades, a célula de fluxo 22 é movida ou ambas as células de fluxo 22 e o dispositivo de formação de imagem 24 são movidos por meios similares para obter imagens focalizadas.

[000153] Estas direções de movimento seriam, evidentemente, invertidas se o alvo de foco 44 estivesse localizado na janela de porta de visualização frontal em oposição à janela de iluminação traseira 43. Neste caso, a distância de deslocamento seria a amplitude entre a corrente de amostra em forma de fita 32 e um alvo 44 na porta de visualização frontal (não mostrada).

[000154] A distância de deslocamento 52, que é igual à distância entre a corrente de amostra em forma de fita 32 e alvo de foco automático 44 ao longo do eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24, pode ser estabelecida em uma etapa de calibração de fábrica ou estabelecida por um usuário. Tipicamente, quando estabelecida, a distância de deslocamento 52 não muda. Variações e vibrações de expansão térmica podem fazer com que a posição precisa do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e da célula de fluxo 22 variem uma em relação à outra, necessitando assim da reinicialização do processo de foco automático. Mas o foco automático sobre o alvo 44 fornece uma referência de posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22 e então fixa em relação à corrente de amostra em forma de fita 32. De modo semelhante, a distância de deslocamento é constante. Portanto, mediante o foco automático sobre o alvo 44 e deslocamento do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e da célula de fluxo 22 pela amplitude da distância de deslocamento, o resultado é o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução sendo focalizado sobre a corrente de amostra em forma de fita 32.

[000155] De acordo com algumas modalidades, o alvo de focalização é fornecido como um círculo de alto contraste impresso ou aplicado ao redor da abertura de iluminação 43. Configurações de alvo de focalização alternativas são discutidas em outro lugar na presente invenção. Quando uma imagem quadrada ou retangular é coletada no foco sobre o alvo 44, uma margem de alto contraste aparece ao redor do centro de iluminação. Procurando a posição na qual o contraste mais alto é obtido na imagem nas bordas internas da abertura automaticamente focalizada sobre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução no local de trabalho do alvo 44. De acordo com algumas modalidades, o termo "distância de trabalho" pode se referir à distância entre a objetiva e seu plano focal e o termo "local de trabalho" pode se referir ao plano focal do dispositivo de imageamento. A medida do contraste mais alto de uma imagem está onde os pixels medidos branco mais claros e preto mais escuros estão adjacentes um ao outro ao longo de uma linha através de uma borda interna. A medida de contraste mais alto pode ser usada para avaliar se o plano focal do dispositivo de imageamento está na posição desejada em relação ao alvo 44. Outras técnicas de focalização automática também podem ser usadas, tais como técnicas de detecção de borda, segmentação da imagem, e integração das diferenças na amplitude entre pixels adjacentes e busca da soma mais alta das diferenças. Em uma técnica, a soma das diferenças é calculada em três distâncias que englobam posições de trabalho em ambos os lados do alvo 44 e combinando os valores resultantes a uma curva característica, sendo que a distância ideal é no valor pico na curva. Correlativamente, as técnicas de foco automático exemplificadoras podem envolver coletar imagens do alvo da célula de fluxo em diferentes posições e analisa as imagens para descobrir a melhor posição de foco usando uma métrica que é maior quando a imagem do alvo é mais nítida. Durante a primeira etapa (grosseira) a técnica de foco automático pode funcionar para encontrar uma melhor posição preliminar a partir de um conjunto de imagens coletado em intervalos de 2,5 μm. A partir daquela posição a técnica de foco automático pode então envolver coletar um segundo conjunto de imagens (finas) em intervalos de 0,5 μm, e calcular a melhor posição de foco final sobre o alvo.

[000156] Em alguns casos, o alvo de foco (padrão de foco automático) pode residir na periferia da área de visão na qual a amostra deve aparecer. Também é possível que o alvo de foco possa ser definido pelos formatos contrastantes que residem no campo de vista, como aquele ilustrado na Figura 15. Tipicamente, o alvo de foco automático é montado na célula de fluxo ou fixado rigidamente na posição fixa em relação à célula de fluxo. Sob a energia de um mecanismo de posicionamento controlado por um detector responsivo à maximização do contraste da imagem do alvo de foco automático, o aparelho foca automaticamente sobre o alvo em oposição à corrente de amostra em forma de fita. Então pelo deslocamento da célula de fluxo e/ou o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução em relação um ao outro, pela distância de deslocamento conhecida por ser a distância entre o alvo de foco automático e a corrente de amostra em forma de fita, a posição de trabalho ou o plano focal do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é deslocado a partir do alvo de foco automático para a corrente de amostra em forma de fita. Como resultado, a corrente de amostra em forma de fita aparece no foco na imagem digital coletada.

[000157] A fim de distinguir tipos de partícula pelas técnicas de processamento de dados, como categorias e/ou subcategorias de eritrócitos e leucócitos, é vantajoso registrar imagens de pixel microscópicas que têm resolução e clareza suficientes para revelar os aspectos que distinguem uma categoria ou subcategoria das outras. É um objetivo da invenção facilitar as técnicas de foco automático conforme descrito.

[000158] Em uma modalidade prática, o aparelho pode ser baseado em uma disposição de banco óptico, conforme mostrado na Figura 1A e ampliado na Figura 1B, tendo uma fonte de iluminação 42 direcionada sobre uma célula de fluxo 22 montada em um carreador suspenso por cardans ou de célula de fluxo 55, retroiluminando os conteúdos da célula de fluxo 22 em uma imagem obtida por um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24. O carreador 55 é montado sobre um motor de acionamento de modo a ser precisamente móvel em direção e na direção contrária do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24. O carreador 55 também permite um alinhamento preciso da célula de fluxo em relação ao eixo de visualização óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagem digital, de modo que a corrente de amostra em forma de fita flui em um plano normal ao eixo de visualização na zona onde a corrente de amostra em forma de fita é imageada, ou seja, entre a abertura de iluminação 43 e porta de visualização 57 como ilustrado na Figura 1. O alvo de foco 44 pode auxiliar no ajuste do carreador 55, por exemplo, para estabelecer o plano da corrente de amostra em forma de fita normal ao eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagem digital.

[000159] Por isso, o carreador 55 estabelece o ajuste linear e angular muito preciso da posição e orientação da célula de fluxo 22, por exemplo, em relação ao dispositivo de captura de imagem 24 ou a objetiva do dispositivo de captura de imagem. Como mostrado aqui, o carreador 55 inclui dois pontos de pivô 55a, 55b para facilitar o ajuste angular do carreador e célula de fluxo em relação ao dispositivo de captura de imagem. Pontos de pivô de ajuste angular 55a, 55b estão localizados no mesmo plano e centralizados para o canal da célula de fluxo (por exemplo, no local de captura de imagem). Isto permite o ajuste dos ângulos sem causar qualquer translação linear da posição da célula de fluxo. O carreador 55 pode ser girado ao redor de um eixo do ponto de pivô 55a ou ao redor de um eixo do ponto de pivô 55b, ou ao redor de ambos os eixos. Tal rotação pode ser controlada por um processador e um mecanismo de controle de movimento de célula de fluxo, como o processador 440 e mecanismo de controle de célula de fluxo 442 ilustrado na Figura 4.

[000160] Voltando a fazer referência à Figura 1B, pode ser visto que ou um ou outro ou ambos dispositivo de captura de imagem 24 e o carreador 55 (junto com a célula de fluxo 22) pode ser girado ou transladado ao longo de vários eixos (por exemplo, X, Y, Z) em três dimensões. Por isso, uma técnica exemplificadora para ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem pode incluir implementar a rotação axial do dispositivo de captura de imagem 24 ao redor do eixo de imageamento, por exemplo pelo dispositivo de rotação 24 ao redor do eixo X. O ajuste de foco também pode ser conseguido pela rotação axial da célula de fluxo 22 e/ou carreador 55 ao redor de um eixo que se estende ao longo eixo de imageamento, por exemplo, ao redor do eixo X, e dentro do campo de vista do dispositivo de imageamento. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir a rotação da ponta (por exemplo, rotação ao redor do eixo Y) do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir a rotação da ponta (por exemplo, rotação ao redor do eixo Y, ou ao redor do ponto de pivô 55a) da célula de fluxo. Como mostrado aqui, o ponto de pivô 55a corresponde a um eixo Y que se estende ao longo e dentro da trajetória de fluxo da célula de fluxo. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir a rotação de inclinação (por exemplo, rotação ao redor do eixo Z) do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir a rotação de inclinação (por exemplo, rotação ao redor do eixo Z, ou ao redor do ponto de pivô 55b) da célula de fluxo. Como mostrado aqui, o ponto de pivô 55b corresponde a um eixo Z que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo de imageamento. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra pela implementação de uma rotação da célula de fluxo (por exemplo, ao redor do eixo X), de modo que a rotação é centralizada no campo de visão do dispositivo de captura de imagem. Os ajustes rotacionais tridimensionais descritos aqui podem ser implementados de modo a levar em conta o desvio de posição em um ou mais componentes do sistema analisador. Em alguns casos, os ajustes rotacionais tridimensionais podem ser implementados de modo a levar em conta flutuações de temperatura em um ou mais componentes do sistema analisador. Em alguns casos, o ajuste de um sistema analisador pode incluir transladar o dispositivo de formação de imagem 24 ao longo do eixo X. Em alguns casos, o ajuste do sistema analisador pode incluir transladar o carreador 55 ou célula de fluxo 22 ao longo do eixo X.

[000161] De acordo com algumas modalidades, um analisador visual para obter imagens de uma amostra contendo partículas suspensas em um líquido inclui célula de fluxo 22, acoplada a uma fonte 25 da amostra e a uma fonte 27 do material de PIOAL como ilustrado na Figura 1. Como visto na vista da seção da Figura 3, a célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo interna que se estreita simetricamente na direção do fluxo (direita para esquerda na Figura 3 ou de baixo para cima na Figura 1). A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo, ou seja, atrás da porta de visualização 57.

[000162] Com referência novamente à FIG. 1, o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução digital 24 com lente objetiva 46 é direcionado ao longo de um eixo óptico que cruza a corrente de amostra em forma de fita 32. A distância relativa entre a objetiva 46 e a célula de fluxo 33 é variável por operação de uma unidade de motor 54, para apresentar e coletar uma imagem digitalizada focalizada em uma matriz de fotodetector.

[000163] O padrão de foco automático 44, tendo uma posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22, é localizado a uma distância de deslocamento 52 a partir do plano da corrente de amostra em forma de fita 32. Na modalidade mostrada, o padrão de foco automático (alvo 44) é aplicado diretamente à célula de fluxo 22 em um local que é visível na imagem coletada pelo dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24. Em outra modalidade, o alvo pode ser carreado como uma parte que é rigidamente fixa na posição em relação à célula de fluxo 22 e a corrente de amostra em forma de fita 32 nela, se não aplicado diretamente ao corpo da célula de fluxo de uma maneira integral.

[000164] A fonte de luz 42, que pode ser uma fonte estacionária ou pode ser um estrobo que é piscado no tempo com a operação do fotossensor do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é configurada para iluminar a corrente de amostra em forma de fita 32 e também para contribuir para o contraste do alvo 44. Na modalidade representada, a iluminação é a partir de retroiluminação.

[000165] A Figura 1C fornece uma diagrama de blocos mostrando aspectos adicionais de um analisador para hematologia exemplificador. Como mostrado aqui, o analisador 100c inclui pelo menos um processador digital 18 acoplado para operar o motor de acionamento 54 e para analisar a imagem digitalizada a partir da matriz do fotossensor como coletado em diferentes posições de foco em relação ao alvo padrão de foco automático 44. O processador 18 é configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático 44, isto é, para focar automaticamente sobre o padrão de foco automático alvo 44 e assim estabelecer uma distância ideal entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e o padrão de foco automático 44. Isto pode ser conseguido pelas etapas de processamento da imagem como aplicando um algoritmo para avaliar o nível de contraste na imagem em uma primeira distância, que pode ser aplicado à imagem inteira ou pelo menos em uma borda do padrão de foco automático 44. O processador move o motor 54 para outra posição e avalia o contraste naquela posição ou borda, e após duas ou mais iterações determina uma distância ideal que maximiza a exatidão do foco no padrão de foco automático 44 (ou otimizaria a exatidão do foco se movido para aquela posição). O processador depende do espaçamento fixo entre o padrão de foco automático alvo do foco automático 44 e a corrente de amostra em forma de fita, o processador 18 controla então o motor 54 para mover o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 para a distância correta para focalizar na corrente de amostra em forma de fita 32. Mais particularmente, o processador opera o motor para deslocar a distância entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a corrente de amostra em forma de fita 32 pela distância de deslocamento 52 (por exemplo, como ilustrado na Figura 1) pela qual a corrente de amostra em forma de fita é deslocada a partir do alvo padrão de foco automático 44. Deste modo, o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é focalizado na corrente de amostra em forma de fita.

[000166] O motor 54 pode compreender um motor de passo orientado com precisão um pouco menor do que as características distintivas imageadas pelo dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou pelo dispositivo de captura de imagem digital, especialmente aspectos das células do sangue. Desde que o local do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 seja ajustado para localizar a posição da objetiva óptica dentro da largura da corrente de amostra em forma de fita, a vista da célula/partícula na corrente de amostra em forma de fita está em foco. Um padrão de foco automático 44 pode estar localizado em uma borda de um campo de visão do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou do dispositivo de captura de imagem digital, e não interfere na visualização.

[000167] Ademais, quando o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é movido ao longo da distância de deslocamento e o padrão de foco automático fica fora de foco, os elementos que aparecem em foco são as células do sangue em oposição ao padrão de foco automático. Na modalidade da Figura 15, por exemplo, o padrão de foco automático é definido por formatos no campo de visão. Os formatos são relativamente formas discretas finas de um tamanho limitado, e, portanto, após se moverem pela distância de deslocamento, as formas se tornam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizadas sobre a corrente de amostra em forma de fita. Uma distância de deslocamento típica pode ser, por exemplo, 50 a 100 μm em uma célula de fluxo dimensionada para aplicações de formação da imagem em hematologia (célula sanguínea). Em algumas modalidades, os recursos de foco automático mantem o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução dentro de 1 μm da distância de foco ideal.

[000168] O contorno interno da célula de fluxo e o PIOAL e vazões da amostra podem ser ajustados de modo que a amostra é formada em uma corrente em forma de fita. A corrente pode ser aproximadamente tão fina quanto ou ainda mais fina que as partículas que são envelopadas na corrente de amostra em forma de fita. Os leucócitos podem ter um diâmetro em torno de 10 μm, por exemplo. Fornecendo uma corrente de amostra em forma de fita com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em forma de fita é estendida pelo fluido de revestimento, ou PIOAL. Surpreendentemente, o estiramento da corrente de amostra em forma de fita ao longo de uma trajetória de fluxo estreitada dentro das camadas de PIOAL de viscosidade diferente da corrente de amostra em forma de fita, como maior viscosidade, tende, vantajosamente, a alinhar as partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo, e aplicar forças sobre as células, melhorando os conteúdos em foco das estruturas intracelulares das células. O eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 é substancialmente normal (perpendicular) ao plano da corrente de amostra em forma de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em forma de fita no ponto de formação da imagem pode ser, por exemplo, 20-200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente de amostra em forma de fita pode ser, por exemplo, 50 a 150 mm/segundo.

[000169] A espessura da corrente de amostra em forma de fita pode ser afetada pelas viscosidades relativas e vazões do fluido da amostra e o PIOAL. Voltando a fazer referência à Figura 1, a fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do PIOAL, por exemplo, compreendendo bombas de deslocamento de precisão, pode ser configurada para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em vazões controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em forma de fita 32, especificamente, como uma fita fina pelo menos tão larga quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24.

[000170] Em uma modalidade, A fonte 27 do PIOAL é configurada para fornecer um PIOAL a uma viscosidade predeterminada. Essa viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra, e pode ser maior do que a viscosidade da amostra. A viscosidade e densidade do PIOAL, a viscosidade do material da amostra, a vazão do PIOAL e a vazão do material da amostra são coordenadas para manter a corrente de amostra em forma de fita na distância de deslocamento a partir do padrão de foco automático, e com características dimensionais predeterminadas, como uma espessura vantajosa da corrente de amostra em forma de fita.

[000171] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear maior do que a amostra e uma viscosidade maior do que a amostra, estirando assim a amostra para a fita plana. Em alguns casos a viscosidade do PIOAL pode ser até 10 centipoise.

[000172] Na modalidade mostrada na Figura 1C, o mesmo processador digital 18 que é usado para analisar a imagem digital de pixel obtida a partir da matriz do fotossensor também é usada para controlar o motor de foco automático 54. Entretanto, tipicamente o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 não é focalizado automaticamente para cada imagem capturada. O processo de foco automático pode ser realizado periodicamente (no início do dia ou no início de um turno) ou, por exemplo, quando a temperatura ou outras mudanças do processo são detectadas por sensores apropriados, ou quando a análise da imagem detecta uma necessidade potencial por refocalização. Em alguns casos, um processo de foco automático automatizado pode ser realizado dentro de uma duração de tempo de cerca de 10 segundos. Em alguns casos, um procedimento de foco automático pode ser realizado antes do processamento de uma prateleira de amostras (por exemplo, 10 amostras por prateleira). Também é possível em outras modalidades ter a análise de imagens de hematologia conseguida por um processador e para ter um processador separado, opcionalmente associado com sua própria matriz do fotossensor, disposta para manejar as etapas do foco automático para um alvo fixo 44.

[000173] O processador digital 18 pode ser configurado para focar automaticamente nos tempos programados ou em condições programadas ou na demanda do usuário, e também é realizado para realizar a categorização e subcategorização baseada na imagem das partículas. Partículas exemplificadoras incluem células, leucócitos, eritrócitos e similares.

[000174] Em uma modalidade, o processador digital 18 da Figura 1 ou Figura 1C é configurado para detectar um sinal de reiniciação de foco automático. O sinal de reiniciação de foco automático pode ser disparado por uma mudança detectada na temperatura, uma diminuição na qualidade do foco como distinguido pelos parâmetros dos dados de imagem de pixel, passagem de tempo, ou entrada do usuário. Vantajosamente, não é necessário recalibrar no sentido de medir a distância de deslocamento 52 ilustrada na Figura 1 para recalibrar. Opcionalmente, o foco automático pode ser programado para recalibrar em certas frequências/intervalos entre as execuções para controle de qualidade e ou para manter o foco.

[000175] A distância de deslocamento 52 varia levemente de uma célula de fluxo para outra, mas permanece constante para uma dada célula de fluxo. Como um processo de configuração quando se junta um analisador de imagem com uma célula de fluxo, a distância de deslocamento é primeiro estimada e, em seguida, durante as etapas de calibração, em que os aspectos de focalização automática e de imageamento são exercidos, a distância de deslocamento exata para a célula de fluxo é determinada e introduzida como uma constante na programação do processador 18.

[000176] Consequentemente, como mostrado na forma de fluxograma na Figura 1D, e com referência ao analisador para hematologia da Figura 1 e/ou Figura 1C, o processo realizado de acordo com os métodos e aparelhos revelados pode envolver a calibração uma vez ou raramente. A calibração pode incluir a focalização no alvo de contraste 44, focalização na corrente de amostra em forma de fita 32, e observação do deslocamento ao longo do eixo óptico entre estes dois locais, como indicado na etapa 110d. Este deslocamento pode ser observado como uma constante. Depois disso, pelo controle do motor 54 e análise dos dados de imagem da matriz do fotossensor, o processador 18 focaliza automaticamente o alvo 44 e desloca o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e/ou célula de fluxo 22 um em relação ao outro pela distância de deslocamento observada, como indicado na etapa 120d. A corrente de amostra em forma de fita 32 está então em foco e sua imagem pode ser coletada (como indicado na etapa 130d) e processada (como indicado na etapa 140d) em intervalos regulares, especialmente em intervalos suficientes para coletar vistas adjacentes substancialmente não sobrepostas das porções da corrente de amostra em forma de fita que passam através da zona de visualização na porta de visualização 57. Quando o automonitoramento (como indicado na etapa 150d) revela uma anomalia de dados ou uma mudança de temperatura que deve ter posições relativas alteradas do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e da célula de fluxo 22 devido às diferenças na expansão térmica, então o foco automático (no indicado na etapa 160d) é iniciado, depois do que a operação regular recomeça. Por isso, um processo de focalização automática pode incluir detectar um sinal de reiniciação de foco automático, e repetir as etapas de focalização automática e aquisição de imagem em resposta ao sinal de reiniciação de foco automático. Em algumas modalidades, o sinal de reiniciação de foco automático pode incluir ou ser baseado em uma mudança na temperatura, uma diminuição na qualidade do foco, um intervalo de tempo decorrido ou uma entrada do usuário.

[000177] A velocidade linear da corrente de amostra em forma de fita pode ser limitada suficientemente para evitar o embaçamento do movimento da imagem digitalizada no tempo de exposição da imagem da matriz do fotossensor. A fonte de luz pode opcionalmente ser uma luz estroboscópica que é piscada para aplicar alta amplitude incidente por um breve momento. Visto que o padrão de foco automático 44 e a imagem estão no mesmo campo de visão, a fonte de luz é configurada para iluminar a corrente de amostra em forma de fita e o padrão de foco automático simultaneamente. Entretanto, em outras modalidades, o campo de visão para a formação da imagem e para foco automático pode ser diferente, por exemplo, iluminado e/ou imageado separadamente.

[000178] Os desenvolvimentos do assunto tem método, bem como aspectos de aparelho. Um método de focalização de um analisador visual compreende a focalização de um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24, que pode ser um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução digital ou o dispositivo de captura de imagem digital, em um padrão de foco automático 44 fixo em relação a uma célula de fluxo 22, sendo que o padrão de foco automático 44 está localizado a uma distância de deslocamento 52 a partir de uma corrente de amostra em forma de fita 32. O dispositivo de imageamento óptico de alta resolução digital 24 tem uma objetiva com um eixo óptico que cruza a corrente de amostra em forma de fita 32. Uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo 22 é variada pela operação de um motor de acionamento 54, ao passo que a distância ao longo do eixo óptico entre um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e o ponto do foco ideal é conhecida. O dispositivo de imageamento óptico de alta resolução digital é configurado para apresentar e coletar a imagem digitalizada em uma matriz do fotossensor. O motor de acionamento é operado para focar no padrão de foco automático em um processo de foco automático. O motor de acionamento então é operado ao longo da distância de deslocamento, focalizando assim o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução sobre a corrente de amostra em forma de fita.

[000179] É possível usar a focalização automática no alvo e deslocamento pela distância de deslocamento para obter uma distância adequada para a focalização na corrente de amostra em forma de fita. Vantajosamente, entretanto, a focalização automática não é necessária ou repetida para cada captura de imagem. Entretanto, o foco automático é iniciado em certas condições. Um sinal de reiniciação de foco automático pode ser detectado ou gerado, levando as etapas de refocalização no padrão de foco automático, operação do motor de acionamento ao longo da distância de deslocamento, e refocalização do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução na corrente de amostra em forma de fita. O sinal de reiniciação de foco automático pode ser a causa pela detecção de uma mudança, por exemplo, na temperatura, uma diminuição na qualidade do foco, a passagem de tempo, outros parâmetros de processo ou entrada do usuário.

[000180] A Figura 1E é um diagrama de blocos simplificado de um sistema de módulo exemplificador que ilustra amplamente como elementos de sistema individuais para um sistema de módulo 100e podem ser implementados de uma maneira separada ou mais integrada. O sistema de módulo 100e pode fazer parte de ou pode estar em conectividade com um sistema de análise de partícula para o imageamento de partículas em um fluido de amostra sanguínea, de acordo com as modalidades da presente invenção. O sistema de módulo 100e é bem adequado para produzir dados ou instruções relacionadas às técnicas de focalização e formação de imagem, recebendo entrada relacionada às técnicas de focalização e formação de imagem, e/ou informação de processamento ou dados relacionados às técnicas de focalização e formação de imagem, conforme descrito em outro lugar aqui. Em alguns casos, o sistema de módulo 100e inclui elementos de hardware que são acoplados eletricamente através de um subsistema de barramento 102e, incluindo um ou mais processadores 104e, um ou mais dispositivos de entrada 106e, como dispositivos de entrada da interface de usuário, e/ou um ou mais dispositivos de saída 108e, como dispositivos de saída da interface de usuário. Em alguns casos, o sistema 100e inclui uma interface de rede 110e, e/ou uma interface de sistema de formação de imagem 140e que pode receber sinais partir de e/ou transmitir sinais para um sistema de formação de imagem 142e. Em alguns casos, o sistema 100e inclui elementos de software, por exemplo, mostrados aqui como sendo localizados presentemente dentro de uma memória operacional 112e de uma memória 114e, um sistema operacional 116e e/ou outro código 118e, como um programa configurado para implementar um ou mais aspectos das técnicas apresentadas na presente invenção.

[000181] Em algumas modalidades, o sistema de módulo 100e pode incluir um subsistema de armazenamento 120e que pode armazenar a programação básica e constructos de dados que fornecem a funcionalidade das várias técnicas apresentadas na presente invenção. Por exemplo, os módulos de software implementando a funcionalidade dos aspectos do método, conforme descrito aqui, podem ser armazenados no subsistema de armazenamento 120e. Esses módulos de software podem ser executados por um ou mais processadores 104e. Em um ambiente distribuído, os módulos de software podem ser armazenados sobre uma pluralidade de sistemas de computador e executados pelos processadores da pluralidade de sistemas de computador. O subsistema de armazenamento 120e pode incluir o subsistema de memória 122e e subsistema de armazenamento de arquivo 128e. O subsistema de memória 122e pode incluir inúmeras memórias incluindo uma memória de acesso aleatório (RAM) 126e principal para armazenamento das instruções e dados durante a execução do programa e uma memória somente leitura (ROM) 124e na qual as instruções fixas são armazenadas. O subsistema de armazenamento de arquivo 128e pode fornecer armazenamento persistente (não volátil) para arquivos de programa e dados e pode incluir meios de armazenamento tangíveis que podem, opcionalmente, incluir dados da amostra, do paciente, do tratamento, de avaliação, entre outros. O subsistema de armazenamento de arquivo 128e pode incluir uma unidade de disco rígido, uma unidade de disco flexível (disquete) juntamente com meios associados removíveis, uma unidade de Disco Compacto de Memória Somente de Leitura (CD-ROM), uma unidade ótica, DVD, CD-R, CD RW, memória removível de estado sólido, outros cartuchos ou discos de meios removíveis e similares. Uma ou mais dentre as unidades podem estar situadas em locais remotos em outros computadores conectados em outros sítios acoplados ao sistema de módulo 100e. Em alguns casos, os sistemas podem incluir um meio de armazenamento legível por computador ou outro meio de armazenamento tangível que armazena uma ou mais sequências de instruções que, quando executadas por um ou mais processadores, podem fazer com que um ou mais processadores executem qualquer aspecto das técnicas ou métodos aqui descritos. Um ou mais módulos implementando a funcionalidade das técnicas apresentadas na presente invenção podem ser armazenados pelo subsistema de armazenamento de arquivo 128e. Em algumas modalidades, o software ou código fornecerá o protocolo para permitir que o sistema de módulo 100e se comunique com a rede de comunicação 130e. Opcionalmente, tais comunicações podem incluir comunicações por conexão de internet ou dial-up.

[000182] Deve ser entendido que o sistema 100e pode ser configurado para realizar vários aspectos dos métodos da presente invenção. Por exemplo, o componente do processador ou módulo 104e pode ser um módulo de controle de microprocessador configurado para receber sinais de parâmetro de temperatura e/ou parâmetros operacionais da célula de fluxo a partir de um dispositivo ou módulo de entrada do sensor 132e, a partir de um dispositivo ou módulo de entrada de interface de usuário 106e, e/ou a partir de um sistema de formação de imagem 142e, opcionalmente, através da interface do sistema de formação de imagem 140e e/ou uma interface de rede 110e e uma rede de comunicação 130e. Em alguns casos, o dispositivo(s) de entrada do sensor pode incluir ou ser parte de um sistema de análise de partícula que é equipado para obter imagens das amostras de fluido do sangue. Em alguns casos, dispositivo(s) de entrada da interface de usuário 106e e/ou interface de rede 110e podem ser configurados para receber sinais de parâmetro de imagem gerados por um sistema de análise de partícula que é equipado para obter parâmetros de imagem. Em alguns casos, o sistema de formação de imagens 142e pode incluir ou ser parte de um sistema de análise de partícula que é equipado para obter parâmetros de imagem relacionados às amostras de fluido sanguíneo.

[000183] O módulo ou componente de processador 104e também pode ser configurado para transmitir sinais de parâmetro de análise de partícula ou sinais de parâmetro de imagem, opcionalmente, processados de acordo com qualquer uma das técnicas aqui descritas, para o módulo ou dispositivo de saída de sensor 136e, para o módulo ou dispositivo de saída da interface de usuário 108e, para o módulo ou dispositivo de interface de rede 110e, para a interface do sistema de formação de imagem 140e, ou qualquer combinação dos mesmos. Cada um dos dispositivos ou módulos de acordo com modalidades da presente invenção pode incluir um ou mais módulos de software em um meio legível por computador que é processado por um processador, ou módulos de hardware, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer uma de uma variedade de plataformas comumente usadas, como janelas, Macintosh e Unix, juntamente com qualquer uma de uma variedade de linguagens de programação comumente usadas, pode ser usada para implantar as modalidades da presente invenção.

[000184] Os dispositivos de entrada de interface de usuário 106e podem incluir, por exemplo, um elemento sensível ao toque, um teclado, dispositivos apontadores, como um mouse, uma trackball, uma tablet de gráficos, um digitalizador, um joystick, uma tela sensível ao toque incorporada a uma tela, dispositivos de entrada de áudio, como sistemas de reconhecimento de voz, microfones, e outros tipos de dispositivos de entrada. Os dispositivos de entrada de usuário 106e podem também baixar um código executável por computador a partir de um meio de armazenamento tangível ou a partir de uma rede de comunicação 130e, em que o código inclui qualquer dos métodos ou aspectos dos mesmos apresentados na presente invenção. Será apreciado que o software terminal pode ser atualizado de tempos em tempos e transferido para o terminal, conforme apropriado. Em geral, o uso do termo "dispositivo de entrada" destina-se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e proprietários e formas de inserir as informações em um sistema de módulo 100e.

[000185] Os dispositivos de saída de interface de usuário 106e podem incluir, por exemplo, um subsistema de exibição, uma impressora, um aparelho de fax, ou telas não visuais, como os dispositivos de saída de áudio. O subsistema de exibição pode ser um tubo de raios catódicos (CRT), um dispositivo de painel plano como uma tela de cristal líquido (LCD), um dispositivo de projeção, ou similares. O subsistema de exibição pode também fornecer uma tela não visual como por meio de dispositivos de saída de áudio. Em geral, o uso do termo "dispositivo de saída" destina-se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e proprietários e formas de fornecer informações do sistema de módulo 600 para um usuário.

[000186] O subsistema de barramento 102e fornece um mecanismo para deixar os vários componentes e subsistemas do sistema de módulo 100e se comunicarem uns com os outros, conforme intencionado ou desejado. Os vários componentes e subsistemas do sistema de módulo 100e não precisam estar no mesmo local físico, mas podem ser distribuídos em vários locais dentro de uma rede distribuída. Embora o subsistema de barramento 102e seja mostrado esquematicamente como um único barramento, modalidades alternativas do subsistema de barramento podem utilizar múltiplos barramentos.

[000187] A interface de rede 110e pode fornecer uma interface para uma rede externa 130e ou outros dispositivos. A rede de comunicação externa 130e pode ser configurada para efetuar comunicações, conforme necessário ou desejado, com terceiros. Esta pode, assim, receber um pacote eletrônico do sistema de módulo 100e e transmitir qualquer informação conforme necessário ou desejado de volta para o sistema de módulo 100e. Como mostrado aqui, a rede de comunicação 130e e/ou sistema de formação de imagens interface 142e pode transmitir informações para ou receber informações a partir de um sistema de formação de imagens 142e que é equipado para obter imagens ou parâmetros de imagem correspondentes às amostras do fluido do sangue.

[000188] Além de fornecer essa infraestrutura aos links de comunicações internos ao sistema, o sistema de rede de comunicações 130e também pode fornecer uma conexão com outras redes, como a Internet, e pode compreender uma conexão com fio, sem fio, por modem e/ou por outro tipo de interface.

[000189] Será evidente para o versado na técnica que variações substanciais podem ser usadas de acordo com os requisitos específicos. Por exemplo, o hardware personalizado pode também ser usado e/ou elementos particulares podem ser implantados em hardware, software (incluindo software portátil, como applets), ou ambos. Além disso, a conexão com outros dispositivos de computação, como os dispositivos de entrada/saída de rede podem ser usados. O sistema terminal de módulo 100e em si pode ser de vários tipos, incluindo um terminal de computador, um computador pessoal, um computador portátil, uma estação de trabalho, um computador de rede, ou qualquer outro sistema de processamento de dados. Devido à natureza variável dos computadores e redes, a descrição do sistema de módulo 100e ilustrada na Figura 1E serve apenas como um exemplo específico para propósitos de ilustrar uma ou mais modalidades da presente invenção. Várias outras configurações do sistema de módulo 100e são possíveis tendo mais ou menos componentes que o sistema de módulo representado na Figura 1E. Qualquer um dos componentes ou módulos do sistema de módulo 100e, ou quaisquer combinações destes componentes ou módulos podem ser acoplados com, ou integrados em, ou de outro modo, configurados para estarem em, conectividade com qualquer uma das modalidades do sistema de análise de partícula e/ou de formação de imagem aqui descritas. De um modo semelhante, qualquer um dos componentes de hardware e de software discutidos acima pode ser integrado com, ou configurado para interagir com, outros sistemas de tratamento ou avaliação médica usados em outros locais.

[000190] Em algumas modalidades, o sistema de módulo 100e pode ser configurado para receber um ou mais parâmetros de imagem de uma amostra de fluido do sangue em um módulo de entrada. Os dados de parâmetro de imagem podem ser transmitidos para um módulo de avaliação onde o diagnóstico ou outros resultados podem ser previstos ou determinados com base na análise dos dados de imagem. Os dados de imagem ou diagnóstico podem ser fornecidos para um usuário do sistema através de um módulo de saída. Em alguns casos, o sistema de módulo 100e pode determinar resultados de diagnóstico para uma amostra de fluido sanguíneo, por exemplo, pelo uso de um módulo de diagnóstico. A informação de diagnóstico pode ser fornecida para um usuário do sistema através de um módulo de saída. Opcionalmente, determinados aspectos do diagnóstico podem ser determinados por um dispositivo de saída, e transmitidos para um sistema de diagnóstico ou um subdispositivo de um sistema de diagnóstico. Qualquer de uma variedade de dados relacionados às amostras de fluido sanguíneo ou pacientes de quem as amostras são obtidas pode ser inserida no sistema de módulo, incluindo idade, peso, sexo, histórico de tratamento, histórico médico, e similares. Os parâmetros dos regimes de tratamento ou avaliações de diagnóstico podem ser determinados com base em tais dados.

[000191] De um modo semelhante, em alguns casos, um sistema inclui um processador configurado para receber os dados da imagem como entrada. Opcionalmente, um processador, meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado dentro de um aparelho de hematologia ou de análise de partícula. Em alguns casos, a máquina de hematologia pode gerar os dados da imagem ou outras informações para a entrada no processador. Em alguns casos, um processador, um meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado dentro de um computador, e o computador pode estar em comunicação com uma máquina de hematologia. Em alguns casos, um processador, um meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado dentro de um computador, e o computador pode estar em comunicação remota com uma máquina de hematologia através de uma rede. Célula de fluxo

[000192] A modalidade prática da célula de fluxo 22 é adicionalmente ilustrada nas Figuras 2 e 3. Como mostrado aqui, a célula de fluxo 22 pode ser acoplada com uma fonte de amostra 25 e também a uma fonte 27 de material de PIOAL. O fluido da amostra é injetado na célula de fluxo 22 através da cânula 29, por exemplo, através de uma porta de saída distal 31 da cânula 29. Tipicamente, o fluido de revestimento de PIOAL não está em um estado de fluxo laminar enquanto ele se desloca através de uma seção de canal curvo 41 na célula de fluxo a partir da fonte 27 em direção à zona de visualização 23. Entretanto, a célula de fluxo 22 pode ser configurada de modo que o fluido de revestimento de PIOAL é ou se torna laminar, ou apresenta um perfil de velocidade plano, na medida em que flui após a porta de saída distal 31 onde o fluido da amostra é introduzido no fluido de revestimento que está fluindo. O fluido da amostra e o PIOAL podem fluir ao longo da célula de fluxo 22 em uma direção geralmente indicada pela seta A, e depois para fora da célula de fluxo 22 através da descarga 33. A célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo interna 20 que se estreita simetricamente (por exemplo, na zona de transição 21) na direção do fluxo A. A simetria da trajetória de fluxo contribui para um fluxo robusto e centralizado da corrente da amostra. A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização 23 na célula de fluxo, ou seja, atrás da porta de visualização 57. Um padrão de foco automático 44 está associado com a porta de visualização 57. A célula de fluxo 22 também tem um assento arredondado e rebaixado 58 que é configurado para aceitar ou receber uma objetiva de microscópio (não mostrado).

[000193] De acordo com algumas modalidades, o padrão de foco automático 44 pode ter uma posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22, e que é localizada a uma distância de deslocamento a partir do plano da corrente de amostra em forma de fita 32. Na modalidade mostrada aqui, o padrão de foco automático (alvo 44) é aplicado diretamente à célula de fluxo 22 em um local que é visível em uma imagem coletada através da porta de visualização 57 por um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução (não mostrado). A célula de fluxo 22 pode ser construída de uma primeira ou seção superior ou camada 22a e uma segunda ou seção inferior ou camada 22b. Como mostrado aqui, uma vidraça de janela de vidro ou transparente 60 é fixa à ou integral com a primeira seção 22a. A vidraça 60 pode definir pelo menos uma porção da amostra trajetória de fluxo dentro da célula de fluxo. A luz da fonte de luz 42 pode viajar através de uma abertura ou passagem do padrão de foco automático 44 de modo a iluminar as partículas de amostra fluindo dentro da corrente de fluxo 32.

[000194] Em alguns casos, a espessura do painel 60 pode ter um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 150 μm a cerca de 170 μm. Como observado acima, o painel 60 pode definir ou formar parte da trajetória de fluxo ou canal de revestimento (por exemplo, PIAOL). Ao usar um painel delgado 60, é possível colocar a objetiva do microscópio muito perto da fita de fluido da amostra e, consequentemente, obter imagens altamente ampliadas de partículas que fluem ao longo da trajetória de fluxo.

[000195] A Figura 3A ilustra aspectos de uma modalidade de célula de fluxo, onde uma distância entre o eixo de imageamento 355 e a porção da zona de transição distal 316 é cerca de 8,24 mm. A distância entre a porção da zona de transição distal 316 e a porta de saída da cânula 331 é cerca de 12,54 mm. A distância entre a porta de saída da cânula 331 e a entrada de fluido de revestimento 301 é cerca de 12,7 mm. A distância entre a porta de saída da cânula 331 e uma porção da zona de transição proximal 318 é cerca de 0,73 mm. A Figura 3B ilustra aspectos de uma modalidade de célula de fluxo onde a porta de saída da cânula foi movida para um local mais distal em relação à zona de transição, em comparação com a modalidade da Figura 3A. Como mostrado aqui, a extremidade distal da cânula é avançada dentro da zona de transição estreitada da célula de fluxo, e uma distância entre o eixo de imageamento 355 e a porção da zona de transição distal 316 está dentro de uma faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em algum caso, a distância entre o eixo de imageamento 355 e a porção da zona de transição distal 316 é cerca de 21 mm.

[000196] Voltando a fazer referência à Figura 1, o contorno interno da célula de fluxo (por exemplo, na zona de transição 21) e as vazões do PIOAL e da amostra podem ser ajustadas de modo que a amostra é formada em uma corrente em forma de fita 32. A corrente pode ser aproximadamente tão fina quanto ou ainda mais fina que as partículas que são envelopadas na corrente de amostra em forma de fita. Os leucócitos podem ter um diâmetro em torno de 10 μm, por exemplo. Fornecendo uma corrente de amostra em forma de fita com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em forma de fita é estendida pelo fluido de revestimento, ou PIOAL. Supreendentemente o estiramento da corrente de amostra em forma de fita ao longo de uma trajetória de fluxo estreitada dentro das camadas de PIOAL de viscosidade diferente da corrente de amostra em forma de fita, como viscosidade maior, vantajosamente tende a alinhar as partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo, e aplicar forças sobre as células, melhorando os conteúdos em foco das estruturas intracelulares das células. O eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 é substancialmente normal (perpendicular) ao plano da corrente de amostra em forma de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em forma de fita no ponto de formação da imagem pode ser, por exemplo, 20-200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente de amostra em forma de fita pode ser, por exemplo, 50 a 150 mm/segundo.

[000197] A espessura da corrente de amostra em forma de fita pode ser afetada pelas viscosidades relativas e vazões do fluido da amostra e o PIOAL. A fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do PIOAL, por exemplo, compreendendo bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em vazões controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita 32, isto é, como uma fita delgada, pelo menos, tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24.

[000198] Em uma modalidade, A fonte 27 do PIOAL é configurada para fornecer um PIOAL a uma viscosidade predeterminada. Essa viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra, e pode ser maior do que a viscosidade da amostra. A viscosidade e densidade do PIOAL, a viscosidade do material da amostra, a vazão do PIOAL e a vazão do material da amostra são coordenadas para manter a corrente de amostra em forma de fita na distância de deslocamento a partir do padrão de foco automático, e com características dimensionais predeterminadas, como uma espessura vantajosa da corrente de amostra em forma de fita.

[000199] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear maior do que a amostra e uma viscosidade maior do que a amostra, estirando assim a amostra para a fita plana. A viscosidade do PIOAL pode ser até 10 centipoise.

[000200] Com referência também às Figuras 2 e 3, a trajetória de fluxo interna da célula de fluxo se estreita a jusante do ponto de injeção da corrente de amostra em forma de fita para o interior do PIOAL, para produzir a espessura da corrente de amostra em forma de fita, por exemplo, até 7 μm, e/ou a trajetória de fluxo interna produz a largura da corrente de amostra em forma de fita de 500 - 3.000 μm. Nas modalidades exemplificadoras, como ilustrado na Figura 1, a trajetória de fluxo interna da célula de fluxo começa uma zona de transição estreitada a montante do ponto de injeção da corrente da amostra para dentro do PIOAL.

[000201] Em outra modalidade a trajetória de fluxo interna se estreita para produzir uma espessura da corrente de amostra em forma de fita de 2 - 4 μm em espessura, e/ou a trajetória de fluxo interna resulta na corrente de amostra em forma de fita de 2000 μm em largura. Estas dimensões são particularmente úteis para hematologia. A espessura da corrente neste caso é menor do que o diâmetro de algumas partículas, como eritrócitos em seu estado relaxado. Consequentemente, aquelas partículas podem se torna reorientadas para ficar de frente a sua mais ampla dimensão para o eixo de imageamento, o que é útil na descrição de características de distinção.

[000202] A velocidade linear da corrente de amostra em forma de fita pode ser limitada suficientemente para evitar o embaçamento do movimento da imagem digitalizada no tempo de exposição da imagem da matriz do fotossensor. A fonte de luz pode opcionalmente ser uma luz estroboscópica que é piscada para aplicar alta amplitude incidente por um breve momento. Visto que o padrão de foco automático 44 e a imagem estão no mesmo campo de visão, a fonte de luz é configurada para iluminar a corrente de amostra em forma de fita e o padrão de foco automático simultaneamente. Entretanto, em outras modalidades, o campo de visão para formação da imagem e para foco automático pode ser diferente, por exemplo, iluminado e/ou imageado separadamente.

[000203] Os desenvolvimentos do assunto tem método, bem como aspectos de aparelho. Um método de focalização de um analisador visual compreende a focalização de um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24, que pode ser um dispositivo digital de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagens digital, em um padrão de foco automático 44 fixo em relação a uma célula de fluxo 22, sendo que o padrão de foco automático 44 está localizado a uma distância de deslocamento 52 a partir de uma corrente de amostra em formato de fita 32. O dispositivo digital de imageamento óptico de alta resolução 24 tem uma objetiva com um eixo óptico, que cruza a corrente de amostra em formato de fita 32. Uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo 22 é variada pela operação de uma unidade de motor 54, enquanto que a distância ao longo do eixo óptico entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e o ponto de focagem ótimo é conhecida. O dispositivo digital de imageamento óptico de alta resolução é configurado para apresentar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotodetector. O motor de acionamento é operado para focar no padrão de foco automático em um processo de foco automático. O motor de acionamento então é operado ao longo da distância de deslocamento, focalizando assim o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução na corrente de amostra em forma de fita.

[000204] O método pode ainda incluir a formação da corrente de amostra em forma de fita em um formato de fita. O formato de fita é apresentado de modo que o eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução seja substancialmente perpendicular à corrente de amostra em forma de fita, ou seja normal ao plano da corrente em forma de fita.

[000205] A Figura 4 ilustra aspectos do um sistema 400 para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo. Como mostrado aqui, o sistema 400 inclui um sistema de injeção de fluido da amostra 410, uma célula de fluxo 420, e dispositivo de captura de imagem 430, e um processador 440. A célula de fluxo 420 fornece uma trajetória de fluxo 422 que transmite um fluxo do fluido de revestimento, opcionalmente em combinação com o fluido da amostra. De acordo com algumas modalidades, o sistema de injeção de fluido da amostra 410 pode incluir ou ser acoplado com uma cânula ou tubo 412. O sistema de injeção de fluido da amostra 410 pode estar em comunicação fluida com a trajetória de fluxo 422, e pode funcionar para injetar fluido da amostra 424 através de uma porta de saída distal 413 da cânula 412 e dentro de um fluido de revestimento fluindo 426 dentro da célula de fluxo 420 de modo a fornecer uma corrente de fluxo da amostra 428. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido da amostra 410 injete fluido da amostra 424 no fluido de revestimento que está fluindo 426. Como mostrado aqui, o fluido de revestimento 426 pode ser introduzido na célula de fluxo 420 por um sistema de injeção de fluido de revestimento 450. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido da amostra 450 injete fluido de revestimento 426 na célula de fluxo 420.

[000206] A corrente de fluxo da amostra 428 tem uma primeira espessura T1 adjacente ao tubo de injeção 412. A trajetória de fluxo 422 da célula de fluxo tendo uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo de modo que a espessura da corrente de fluxo da amostra 428 diminui a partir da espessura inicial T1 para uma segunda espessura T2 adjacente a um local de captura de imagem 432. O dispositivo de captura de imagem 430 está alinhado com o local de captura de imagem 432 de modo a fazer a imagem de uma primeira pluralidade das partículas a partir do primeiro fluido da amostra no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420.

[000207] O processador 440 é acoplado com o sistema injetor do fluido da amostra 410, o dispositivo de captura de imagem 430, e opcionalmente o sistema de injeção de fluido de revestimento 450. O processador 440 é configurado para interromper a injeção do primeiro fluido da amostra para o interior do fluido de revestimento que está fluindo 426 e iniciar a injeção do segundo fluido da amostra para o interior do fluido de revestimento que está fluindo 426 tal que o fluido da amostra passar são iniciados. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 410 injete o segundo fluido de amostra para o fluido de revestimento que flui 426 de modo que os transientes de fluido de amostra são iniciados.

[000208] Ainda, o processador 440 é configurado para iniciar a captura de uma imagem de uma segunda pluralidade das partículas a partir do segundo fluido da amostra no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420 após o fluido da amostra passar e dentro de 4 segundos da formação da imagem da primeira pluralidade de partículas. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o dispositivo de captura de imagem 430 inicie a captura de uma imagem da segunda pluralidade de partículas a partir do segundo fluido da amostra no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420 após o fluido da amostra passar e dentro de quatro segundos da formação da imagem da primeira pluralidade de partículas.

[000209] Em algumas modalidades, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que um mecanismo de controle de movimento de célula de fluxo 442 ajuste a posição da célula de fluxo 420, por exemplo em relação ao dispositivo de captura de imagem 430. Em algumas modalidades, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que um mecanismo de controle de movimento do dispositivo de captura de imagem 444 ajuste a posição do dispositivo de captura de imagem 430, por exemplo, em relação à célula de fluxo 420. Os mecanismos de controle de movimento 442, 444 podem incluir motores, suspensões por cardans, e outros recursos mecânicos que facilitam e produzem movimento na célula de fluxo e dispositivo de captura de imagem, respectivamente. Em alguns casos, o mecanismo de controle de célula de fluxo 442 e/ou mecanismo de controle do dispositivo de captura de imagem 444 pode incluir um controle de motor de passo de alta precisão que fornece focalização motorizada e automatizada do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Como ilustrado na Figura 1, um processador pode controlar o movimento do dispositivo de captura de imagem 24. De modo similar, como ilustrado na Figura 1B, um processador pode controlar o movimento de um carreador de célula de fluxo 55.

[000210] Por isso, as modalidades da presente invenção englobam sistemas de análise de partícula que realizam a hidrofocalização de viscosidade e geométrica combinada e hidrofocalização geométrica para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo. Sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo tendo uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo de imageamento através da mesma. A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo. Adicionalmente, sistemas analisadores podem incluir uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo, e uma entrada da amostra de fluido sanguíneo em comunicação fluida com o tubo de injeção. A entrada de fluido do sangue pode ser configurada para injetar a amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido sanguíneo flui em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo. O fluido de revestimento pode ter uma viscosidade que é maior do que uma viscosidade da amostra de fluido sanguíneo. Aliás, o sistema analisador pode incluir um dispositivo de captura de imagem, e um mecanismo de focalização que define um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Adicionalmente, o sistema pode incluir um alvo de imageamento tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo, onde o alvo de imageamento e corrente de fluxo da amostra define uma distância de deslocamento ao longo do eixo de imageamento. O sistema também podem incluir um processador, e um módulo de focalização tendo um meio tangível que incorpora código legível por máquina executado no processador para operar o mecanismo de focalização para definir o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partícula usando a distância de deslocamento. A diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento e a amostra de fluido sanguíneo, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, pode ser eficaz para hidrofocar o primeiro e segundo fluido das amostras no eixo de imageamento enquanto retém a viabilidade das células na amostra de fluido sanguíneo. Em alguns casos, o mecanismo de focalização pode incluir um motor de acionamento configurado para ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo.

[000211] Em alguns casos, um sistema analisador 400 pode incluir uma temperatura ou sensor térmico 448 que é termicamente acoplado à célula de fluxo 420, como ilustrado na Figura 4. Um módulo de focalização, que pode ser operacionalmente associado com o processador, pode incluir um meio tangível que incorpora o código legível por máquina que é executado no processador para operar um mecanismo de focalização (por exemplo, mecanismo de controle de célula de fluxo 442 ou mecanismo de controle do dispositivo de captura de imagem 444) de modo a definir o estado focal ou plano focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partícula, em resposta a uma mudança na temperatura detectada pelo sensor de temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura e um foco desejado.

[000212] Como mostrado na modalidade de célula de fluxo ilustrada na Figura 4A, uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo (por exemplo, na zona de transição 419a) pode ser definida pelas paredes opostas 421a, 423a da trajetória de fluxo 422a. As paredes opostas 421a, 423a podem angular radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo 422a, geralmente simétrica ao redor de um plano transversal 451a que bisecciona a corrente de fluxo da amostra 428a. O plano 451a pode biseccionar a corrente da amostra 428a onde a corrente da amostra tem uma primeira espessura T1, em um local onde a corrente da amostra 428a sai de uma porção distal 427a da cânula ou tubo de injeção da amostra 412a. De modo similar, o plano 451a pode biseccionar a corrente da amostra 428a onde a corrente da amostra tem uma segunda espessura T2, em um local onde a corrente da amostra 428a passa o local de captura de imagem 432a. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor de cerca de 150 μm e a segunda espessura T2 tem um valor de cerca de 2 μm. Em tais casos, a razão de compressão da corrente de fita da amostra é 75:1. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm e a segunda espessura T2 tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Na medida em que a corrente de fluido da amostra flui através da célula de fluxo, a fita se afina na medida que acelera e é esticada. Dois recursos da célula de fluxo podem contribuir para o adelgaçamento da fita do fluido da amostra. Primeiro, uma diferença de velocidade entre um envelope do fluido de revestimento e a fita do fluido da amostra pode operar para reduzir a espessura da fita. Segundo, a geometria afunilada da zona de transição pode operar para reduzir a espessura da fita.

[000213] Tipicamente, a primeira espessura T1 é muito maior do que o tamanho das partículas de amostra, e Por isso as partículas são contidas inteiramente dentro da corrente de fita da amostra. Entretanto, a segunda espessura T2 pode ser menor do que o tamanho de certas partículas de amostra, e Por isso essas partículas podem se estender para fora do fluido da amostra e para dentro do fluido de revestimento circundante. Como mostrado na Figura 4A, a corrente de fita da amostra pode fluir geralmente ao longo do mesmo plano na medida em que ela sai da cânula e viaja em direção ao local de captura de imagem.

[000214] A célula de fluxo também pode fornecer uma distância de separação 430a entre uma porção da cânula distal 427a e o local de captura de imagem 432a. De acordo com algumas modalidades, a porção distal 427a do tubo de injeção do fluido da amostra 412a pode ser posicionada em uma distância de separação axial 430a a partir do local de captura de imagem 432a, onde a distância de separação axial 432a tem um valor de cerca de 21 mm. Em alguns casos, a distância de separação axial 430a tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm.

[000215] A distância de separação axial 430a entre a porta de saída da cânula e local de captura de imagem pode afetar o tempo de transição para o fluido da amostra na medida em que o fluido viaja da porta de saída para o local de captura de imagem. Por exemplo, uma distância de separação axial relativamente mais curta 430a pode contribuir para um tempo de transição mais curto, e uma distância de separação axial relativamente mais longa 430a pode contribuir para um tempo de transição mais longo.

[000216] A posição da porta de saída na porção distal da cânula 427a em relação à zona de transição da trajetória de fluxo 419a, ou em relação à porção proximal 415a da zona de transição da trajetória de fluxo 419a, também pode influenciar o tempo de transição para o fluido da amostra na medida em que o fluido viaja a partir da porta de saída para o local de captura de imagem. Por exemplo, o fluido de revestimento pode ter uma velocidade relativamente mais lenta na porção proximal 415a, e uma velocidade relativamente mais rápida em um local entre a porção proximal 415a e a porção distal 416a. Consequentemente, se a porta de saída da cânula na porção distal 427a está posicionada na porção proximal 415a, vai demorar um longo período de tempo para o fluido da amostra alcançar o local de captura de imagem, não apenas porque a distância de viagem é mais longa, mas também porque a velocidade inicial do fluido de amostra após o mesmo sair da porta distal da cânula é mais lenta (devido à velocidade do fluido de revestimento mais lenta). Dito de outra forma, quanto mais longo o fluido da amostra está presente na porção mais espessa (por exemplo, porção proximal próxima 415a) da célula de fluxo, mais tempo leva para a amostra alcançar o local de captura de imagem. Reciprocamente, se a porta de saída da cânula na porção distal 427a é posicionada distal à porção proximal 415a (por exemplo, em um local central entre a porção proximal 415a e porção distal 416a, como ilustrado na Figura 4A), levará uma quantidade de tempo mais curta para o fluido da amostra alcançar o local de captura de imagem, não somente porque a distância de viagem é mais curta, mas também porque a velocidade inicial do fluido da amostra após ela sair da porta distal da cânula é mais rápida (devido à velocidade do fluido de revestimento mais rápida). Como discutido em outro lugar na presente invenção, o fluido de revestimento é acelerado na medida em que flui através da zona de transição 419a, devido do estreitamento da área de seção transversal da zona 419a.

[000217] De acordo com algumas modalidades, com um tempo de transição mais curto, mais tempo está disponível para a coleta de imagem no local de captura de imagem. Por exemplo, na medida em que a duração do tempo de transição a partir da ponta distal da cânula para a área de formação de imagem diminui, é possível processar mais amostras em uma quantidade específica de tempo, e correlativamente é possível obter mais imagens em uma quantidade de tempo específica (por exemplo, imagens por minuto).

[000218] Embora haja vantagens associadas com o posicionamento da porta de saída da porção distal da cânula 427a mais perto do local de captura de imagem 432a, também é desejável manter uma certa distância entre a porta e o local de captura. Por exemplo, como ilustrado na Figura 3, uma objetiva óptica ou lente frontal de um dispositivo de formação de imagem pode ser posicionado no assento 58 da célula de fluxo 22. Se a porta de saída 31 da cânula está muito próxima ao assento 58, então o fluido da amostra pode não estar estabilizado o suficiente após ser injetado para o interior do fluido de revestimento de modo a fornecer as propriedades de formação de imagem desejadas no local de captura de imagem. De modo similar, pode ser desejável manter a região de transição afunilada 21 e uma distância a partir da zona de visualização 23, de modo que a região afunilada não interfira com o posicionamento do assento 58 que recebe a objetiva do dispositivo de captura de imagem.

[000219] Continuando a referência à Figura 4A, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção do fluido da amostra 412a pode ser posicionada distal a uma porção proximal 415a da zona de transição da trajetória de fluxo 419a. Correlativamente, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção do fluido da amostra 412a pode ser posicionada proximal a uma porção distal 416a da zona de transição da trajetória de fluxo 419a. Por isso, de acordo com algumas modalidades, o fluido da amostra pode ser injetado a partir da cânula de injeção 412a e para o interior da célula de fluxo em um local dentro da zona de transição 419a.

[000220] De acordo com algumas modalidades, a simetria na diminuição no tamanho da trajetória de fluxo (por exemplo, na zona de transição da trajetória de fluxo 419a) opera para limitar o desalinhamento da partícula na amostra de fluido sanguíneo. Por exemplo, tal simetria pode ser eficaz para limitar o desalinhamento da orientação da formação de imagem de eritrócitos na amostra de fluido sanguíneo para menos de cerca de 20%.

[000221] De acordo com algumas modalidades, os métodos apresentados na presente invenção são operacionais para marcar a taxa durante a análise de contagem sanguínea para abaixo de 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5% das amostras.

[000222] De acordo com algumas modalidades, o local de captura de imagem 432a tem um campo de visão 433a dentre cerca de 150 μm x 150 μm e 400 μm x 400 μm. Em alguns casos, o local de captura de imagem 432a tem um campo de visão 433a de cerca de 275 μm x 275 μm. Em alguns casos, o campo de visão pode ser definido em termos de comprimento vezes largura. Se expressado como área de superfície, um campo de visão de 275 μm x 275 μm tem uma área de 75.625 μm2. De acordo com algumas modalidades, o campo de visão pode ser determinado pela objetiva do dispositivo de formação de imagem e sua ampliação. Em alguns casos, o campo de visão pode corresponder à extensão do campo (área) que é imageado pelos elementos ópticos de coleta (por exemplo, objetiva, lentes de tubo, e câmera). Em alguns casos, o campo de visão é muito menor do que a porta de visualização da área transparente no local de captura de imagem.

[000223] As Figuras 4A-1 e 4A-2 ilustram os efeitos da hidrofocalização na corrente da amostra na medida que ela viaja da porta de saída da cânula para o local de captura de imagem. Como mostrado na Figura 4A- 1, a corrente da amostra pode ter uma altura H(S) de cerca de 150 μm e uma largura W(S) de cerca de 1350 μm. Além disso, o fluxo de revestimento de PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca de 6000 μm e uma largura W(P) de cerca de 4000 μm. Após a hidrofocalização, conforme mostrado na Figura 4A-2, a corrente de amostra pode ter uma altura H(S) de cerca 2 μm e uma largura W(S) de cerca 1350 μm. Adicionalmente, a corrente de revestimento de PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca 150 μm e uma largura W(P) de cerca 4000 μm. Em uma modalidade, a área da seção transversal da corrente de revestimento de PIOAL na saída da cânula é de 40 vezes maior que a área da seção transversal perto do local de captura de imagem.

[000224] De acordo com algumas modalidades, pode ser útil determinar a seção transversal do canal da célula de fluxo no local de captura de imagem. Isto pode corresponder à altura da corrente de revestimento de H(P) de cerca 150 μm e uma largura W(P) de cerca 4000 μm conforme representado na Figura 4A-2. Também pode ser útil determinar a vazão volumétrica da amostra combinada e fluido de revestimento entrando através da célula de fluxo no local de captura de imagem. Quando a área de seção transversal e a vazão são conhecidas, é possível determinar a velocidade da amostra combinada e fluido de revestimento no local de captura de imagem.

[000225] De acordo com algumas modalidades, o fluxo da amostra e os fluidos de revestimento através da célula de fluxo podem ser aproximados por um modelo de perfil de placas paralelas. De modo semelhante, a vazão no centro da corrente de fluido de amostra (por exemplo, conforme representado na Figura 4A-2), pode ser cerca de 1,5 vezes a vazão média da corrente de fluido de revestimento e amostra combinadas.

[000226] De acordo com algumas modalidades, a área de seção transversal do fluxo da amostra na saída da cânula (por exemplo, W(S) x H(S) na Figura 4A-1) é 40 vezes maior do que a área de seção transversal do fluxo da amostra no local de imageamento (por exemplo, W(S) x H(S) na Figura 4A-2). A vazão volumétrica do fluido de revestimento na área de formação de imagem pode ser cerca de 45 μL/segundo. A vazão volumétrica do fluido da amostra na área de formação de imagem pode ser cerca de 0,232 μL/segundo. Em alguns casos, a área da seção transversal das correntes de amostra e de revestimento combinadas no local de imageamento é 600.000 μm2. Em alguns casos, a velocidade da corrente de fluxo média no local de imageamento é 75 mm/segundo.

[000227] A vazão ou velocidade pode ser determinada como a taxa que resulta em imagens celulares limpas e focalizadas. As vazões e velocidades exemplificadoras onde descobertas com base nas vazões das duas amostras que foram observadas para atingir certos formatos ou características da fita da corrente de fluxo da amostra no local de imageamento. Por exemplo, na vazão de cerca de 75 mm/seg (ou dentro de uma faixa de 20 a 200 mm/seg), as células não fluem muito lentamente de modo a haver sobreposições de células em imagens consecutivas, e as células não fluem rápido demais de modo que a criar efeitos de formação de imagens fantasma (imagem embaçada). Correlativamente, evitando vazões excessivamente altas, é possível conservar mais reagente e amostra. De acordo com algumas modalidades, uma velocidade ideal ou linear desejada pode ser conseguida ou pela mudança do fluxo volumétrico (taxa de bomba) ou o formato da cânula.

[000228] A velocidade de fluxo da corrente de amostra, através da zona de captura de imagem pode também estar relacionada com o desempenho do dispositivo de captura de imagem em relação à função da célula de fluxo. Por exemplo, se a corrente de amostra flui muito rapidamente, pode ser difícil a obtenção de imagens transparentes de partículas contidas na amostra (por exemplo, a velocidade do obturador do dispositivo de captura de imagem pode ser muito baixa, produzindo, assim, uma imagem embaçada). De modo similar, se a corrente da amostra está fluindo muito lentamente, o dispositivo de captura de imagem pode obter imagens consecutivas da mesma partícula (por exemplo, a mesma partícula permanece no quadro de captura durante duas capturas de imagem). Em algumas modalidades, a velocidade da fita da amostra pode ser modulada (por exemplo, por ajuste de qualquer de uma variedade de parâmetros operacionais da célula de fluxo) em relação à taxa de captura de imagem, de modo que haja um fluxo mínimo entre as capturas da estrutura e, consequentemente, uma elevada porcentagem da amostra é imageada.

[000229] De acordo com algumas modalidades, o sistema de análise de partícula e componentes associados podem ser configurados de modo que o fluido de revestimento e amostra de fluido fluam através da célula de fluxo, o fluido de revestimento pode fluir a uma taxa volumétrica de fluido de revestimento de 45 μL/s e a amostra de fluido pode fluir a uma vazão volumétrica de amostra de fluido de 0,232 μL/s (ou dentro de uma faixa de 0,2 a 0,35 μL/s). Em alguns casos, a razão da vazão do fluido de revestimento para a vazão do fluido da amostra é cerca de 200. Em alguns casos, a razão da vazão do fluido de revestimento para a vazão do fluido da amostra tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 70 a 200. Em alguns casos, a razão da vazão do fluido de revestimento para a vazão do fluido da amostra é cerca de 193. Em alguns casos, a razão da vazão do fluido de revestimento para a vazão do fluido da amostra é cerca de 70. Em alguns casos, uma razão do volume de fluido de revestimento para o volume da amostra de fluido que flui dentro da célula de fluxo pode estar dentro de uma faixa de 25:1 a 250:1.

[000230] De acordo com algumas modalidades, o sistema e componentes associados podem ser configurados de modo que o fluido de revestimento e amostra de fluido fluam através da célula de fluxo 420, o fluido de revestimento pode fluir em uma velocidade de fluido de revestimento de 75 mm/seg antes da área de formação de imagem e a amostra de fluido pode fluir a uma velocidade de amostra de fluido de 130 mm/seg antes da área de formação de imagem. Em alguns casos, uma razão do volume de fluido de revestimento para o volume da amostra de fluido fluindo dentro da célula de fluxo pode estar dentro de uma faixa de 100:1 a 200:1.

[000231] Em alguns casos, uma célula de fluxo pode ter uma razão de compressão mínima de cerca de 50:1 e uma razão de compressão máxima de cerca de 125:1. Em alguns casos, a razão de compressão mínima pode ser cerca de 30:1 ou 20:1. Esta razão de compressão refere-se à razão da espessura da corrente de fluxo H(S):H(S) na comparação da Figura 4A-1 com a Figura 4A-2. Esta razão de compressão pode ser influenciada por uma combinação de compressão geométrica (por exemplo, a razão das espessuras do fluido de revestimento H(P):H(P) ao comparar a Figura 4A-1 à Figura 4A-2, que também pode corresponder geralmente às dimensões da zona de transição afunilada de estreitamento da célula de fluxo 419a mostrada na Figura 4A) e uma compressão hidrodinâmica (por exemplo, também correspondendo a uma diferença na velocidade). De acordo com algumas modalidades, a razão de compressão geométrica é cerca de 40:1.

[000232] A diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, correspondente à zona de transição, pode ser definido por uma porção de trajetória de fluxo proximal tendo uma espessura ou altura proximal, e uma porção de trajetória de fluxo distal tendo uma espessura ou altura distal que é menor do que a espessura proximal ou altura. Por exemplo, como mostrado na vista parcial da Figura 4B, a zona de transição 419b da trajetória de fluxo pode ter um comprimento L entre uma porção proximal 415b e uma porção distal 416b, onde a porção proximal 415b tem uma altura proximal 417b, e a porção distal 416b tem uma altura distal 418b. Como observado em outro lugar na presente invenção, o formato ou contorno da zona de transição pode ser curvado ou liso, e, por exemplo, pode ser fornecido no formato de uma curva S- ou uma curva tangente. De acordo com algumas modalidades, a altura proximal 417b tem um valor de cerca de 6000 μm. Em alguns casos, a altura proximal 417b tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 3000 μm a cerca de 8000 μm. De acordo com algumas modalidades, a altura distal 418b tem um valor de cerca de 150 μm. Em alguns casos, a altura distal 418b tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 50 μm a cerca de 400 μm.

[000233] A geometria da zona de transição 419a pode fornecer um primeiro ângulo α1 entre o primeiro contorno da trajetória de fluxo 403b e o plano transversal de bisecção 451b, e um segundo ângulo α2 entre o segundo contorno da trajetória de fluxo 404b e o plano transversal de bisecção 451b. Em alguns casos, o ângulo α1 é cerca de 45 graus e ângulo α2 é cerca de 45 graus. Em alguns casos, o ângulo α1 tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. Em alguns casos, o ângulo α2 tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. De acordo com algumas modalidades, os ângulos α1 e α2 tem o mesmo valor. Os ângulos α1 e α2 podem ser selecionados de modo a manter o fluxo laminar ou minimizar a turbulência do fluido da amostra na medida em que viaja da porção proximal 415b para a porção distal 416b, que, por sua vez, pode melhorar o alinhamento das partículas dentro da amostra ao longo do plano transversal 451b. Conforme observado acima com referência à Figura 4A, os contornos distais e proximais ou porções da zona de transição podem ser curvados ou lisos, ao invés de angulados.

[000234] Como mostrado na Figura 4K, uma fita de corrente da amostra R que flui através de um local de captura de imagem 432k de uma célula de fluxo 420k pode ter uma espessura T de cerca de 2 μm. Em alguns casos, a espessura T da fita da corrente da amostra pode ser até cerca de 3 μm. Tipicamente, as células ou partículas que são menores do que a espessura da corrente da amostra estarão contidas dentro da fita. Um eritrócito exemplificador (RBC) pode ser apresentado como um disco bicôncavo e pode ter um diâmetro D de entre cerca de 6,2 μm e cerca de 8,2 μm. Adicionalmente, um eritrócito exemplificador pode ter uma espessura máxima T1 de entre cerca de 2 μm e cerca de 2,5 μm e uma espessura mínima T2 de entre cerca de 0,8 μm e cerca de 1 μm. Em alguns casos, os eritrócitos podem ter uma espessura de até cerca de 3 μm. Plaquetas humanas exemplificadoras podem variar em tamanho, e também podem ter uma espessura ou diâmetro de cerca de 2 μm. Embora não mostrada em escala aqui, a célula de fluxo pode definir uma espessura de trajetória de fluxo H tendo um valor de cerca de 150 μm, no local de captura de imagem. Em alguns casos, a espessura da trajetória de fluxo F tem um valor entre 50 μm e 400 μm. Esta espessura da trajetória de fluxo F também pode corresponder à altura distal 418b da porção distal 461b ilustrada na Figura 4B.

[000235] Como mostrado na Figura 4K, a razão da espessura T da corrente de fluxo da amostra para a espessura da partícula (eritrócitos) é cerca de 1:1. De acordo com algumas modalidades, uma razão da espessura T da corrente de fluxo da amostra no local de captura de imagem para um tamanho de uma das partículas está dentro de uma faixa de 0,25 a 25. Em alguns casos, a espessura T pode ter um valor dentro de uma faixa de 0,5 μm a 5 μm. Um diferencial de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra pode ser selecionado de modo a conseguir um posicionamento desejado da corrente da amostra da fita dentro da célula de fluxo.

[000236] Como discutido em outro lugar na presente invenção, assim como no pedido de patente copendente U.S. N°. , diferenças de viscosidade entre o fluido da fita da amostra R e o fluido de revestimento podem operar para alinhar ou orientar as partículas na corrente da amostra, por exemplo eritrócitos, ao longo da direção do fluxo. Quando assim alinhado, como mostrado na Figura 4K, o dispositivo de formação de imagem ou câmera pode obter imagens dos eritrócitos tal que aparecem redondos, porque a superfície principal da célula de sangue está voltada para a câmera. Deste modo, os eritrócitos assumem um alinhamento que apresenta uma baixa resistência em relação ao fluxo. Por isso, as características de viscosidade relativas do fluido de revestimento e o fluido da amostra podem contribuir para uma alta porcentagem ou número de eritrócitos voltados em direção à câmera, aumentando assim a capacidade de avaliação do sistema de análise de partícula.

[000237] De acordo com algumas modalidades, as características de viscosidade do fluido de revestimento funcionam para limitar o desalinhamento da partícula na amostra de fluido sanguíneo. Por exemplo, diferenciais de viscosidade podem ser eficazes para limitar o desalinhamento da orientação da formação de imagem de eritrócitos na amostra de fluido sanguíneo para menos de cerca de 10%. Ou seja, 90 ou mais eritrócitos de 100 eritrócitos em uma amostra podem estar alinhados de modo que suas superfícies maiores ficam de frente para o dispositivo de formação de imagem. Uma zona de transição estreitada simétrica pode fornecer um valor de 20%. De acordo com algumas modalidades, o fluido de revestimento tem um índice de refração similar àquele da água (isto é n=1,3330). Em alguns casos, o fluido de revestimento tem um conteúdo de água de cerca de 89%. Além dos efeitos de alinhamento observados como resultado do diferencial de viscosidade, efeitos de alinhamento também são observados como resultado de uma zona de transição afunilada bilateral. Em alguns casos, observa-se que uma zona de transição afunilada bilateral (isto é, simétrica) é duas vezes mais eficaz no alinhamento das partículas em comparação com um design de zona de transição afunilada assimétrica.

[000238] O alinhamento eficiente dos eritrócitos pode contribuir para o diagnóstico melhorado. Em alguns casos, o formato dos eritrócitos imageados pode ser usado para determinar se um paciente do qual a amostra é obtida tem uma doença ou condição fisiológica particular. Por exemplo, os pacientes com a doença das células falciformes apresentam as células do sangue tendo um formato anormal (isto é, no formato de uma foice). Por isso, pela obtenção das imagens de alta qualidade dos eritrócitos alinhados, é possível garantir um diagnóstico preciso. Outras variações de formato nos eritrócitos, por exemplo, eritrócitos tendo área periférica fina e uma grande área central plana, de modo que os eritrócitos parecem ter o perfil de um pneu de bicicleta, podem efetivamente ser imageados usando técnicas de alinhamento instantâneas. De modo similar, os eritrócitos tendo uma pequena porção central, e uma área periférica espessa, de modo que os eritrócitos parecem ter o perfil de um pneu de caminhão, podem ser imageados para fins de diagnóstico. As técnicas de formação de imagem aprimoradas apresentadas na presente invenção também são úteis para avaliar outras características de eritrócito, como teor de hemoglobina, teor de ferro, e similares.

[000239] Sem se ater a qualquer teoria em particular, acredita-se que um diferencial de viscosidade entre a viscosidade do fluido de revestimento e a viscosidade da fluido da amostra produz um perfil parabólico modificado, sendo que o perfil é geralmente parabólico e tem um impacto central correspondente a uma área central do fluxo onde a aceleração é aumentada, e o impacto central contribui para o alinhamento das partículas da amostra ou organelas intrapartícula. De acordo com algumas modalidades, a diferença de velocidade entre a fita da amostra e de revestimento e a diferença de viscosidade geram forças de cisalhamento para aumentar o alinhamento das organelas ou partículas intracelulares. Aspectos exemplificadores do perfil parabólico do fluido de revestimento são discutidos no pedido de patente copendente US N°. ,o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência.

[000240] Os leucócitos são tipicamente maiores do que eritrócitos e plaquetas. Por exemplo, neutrófilos e eosinófilos exemplificadores podem ter um diâmetro de entre cerca de 10 μm e cerca de 12 μm. Basófilos exemplificadores podem ter um diâmetro de entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Linfócitos (pequenos) exemplificadores podem ter um diâmetro de entre cerca de 7 μm e cerca de 8 μm, e linfócitos exemplificadores (grandes) podem ter um diâmetro de entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Monócitos exemplificadores podem ter um diâmetro de entre cerca de 12 μm e cerca de 20 μm. A configuração do sistema de análise de partícula, incluindo interação entre o fluido de revestimento e a fita da amostra de fluido à medida que passam através da célula de fluxo, pode funcionar para comprimir os leucócitos na medida em que eles viajam através do local de captura de imagem 432l, como indicado na Figura 4L. Por isso, por exemplo, uma porção central do leucócito (WBC) pode ser posicionada dentro da fita do fluido da amostra R, e porções periféricas do leucócito podem ser posicionadas dentro do fluido de revestimento. Por isso, como o leucócito é transportado através da célula de fluxo pela fita, os lados do leucócito podem se estender para o interior do fluido de revestimento. Os valores ou faixas numéricas para a espessura T da corrente da fita da amostra R, e a espessura F da trajetória de fluxo como discutido acima com relação à Figura 4K são, de modo similar aplicáveis à Figura 4L.

[000241] De acordo com algumas modalidades, diferenças de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra podem funcionar para alinhar as organelas ou outros recursos intracelulares que estão presentes dentro das células como leucócitos. Sem ser vinculado a qualquer teoria particular, acredita-se que forças de cisalhamento associadas com o diferencial de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra podem agir sobre os leucócitos de modo alinhar os recursos intracelulares. Em alguns casos, as forças de cisalhamento associadas com diferenciais de velocidade entre o fluido de revestimento e fluido da amostra podem contribuir para tal alinhamento. Estes efeitos de alinhamento também podem ser afetados por um diferencial de tamanho entre as partículas e a fita do fluido da amostra. Por exemplo, onde as porções das partículas se estender fora da fita do fluido da amostra e para o interior do fluido de revestimento circundante, forças de cisalhamento associadas com a diferença na viscosidade podem ter um efeito pronunciado no alinhamento do recurso intracelular.

[000242] Como ilustrado na Figura 4L, porções de uma célula como um leucócito podem se estender para o interior do fluido de revestimento. As modalidades da presente invenção abrangem composições de fluido revestimento que não fragmentam ou lisam a célula, ou de outro modo, comprometem a integridade da membrana celular externa, quando a célula é exposta ao fluido de revestimento. Um agente de viscosidade no fluido de revestimento pode funcionar para manter a viabilidade das células na corrente de fluxo da amostra, de modo a deixar a estrutura (por exemplo, formato) e o teor (por exemplo, núcleo) das células intactos quando a membrana ou parede celular atravessa uma interface entre a fita do fluido da amostra e o envelope do fluido de revestimento ou se estende de outra forma a partir da corrente de fluxo da amostra para o interior do fluido de revestimento que está fluindo.

[000243] Frequentemente, há forças de compressão agindo sobre as células ou partículas na medida em que fluem dentro da fita do fluido da amostra ao longo da célula de fluxo. Por isso, as células podem entrar em contato com o fluido de revestimento enquanto as células estão em um estado comprimido ou são de outra forma submetidas às forças de compressão como resultado de uma zona de transição estreitada. O agente de viscosidade do fluido de revestimento pode funcionar para proteger as células comprimidas de serem trituradas ou destruídas quando elas emergem a partir da fita do fluido da amostra fina e se tornam expostas ao fluido de revestimento viscoso, pelo menos até as células alcançarem o local de captura de imagem. Por isso, a composição do agente de viscosidade do fluido de revestimento pode funcionar como um protetor celular, enquanto também melhoram o alinhamento do teor das partículas ou intrapartícula.

[000244] Com referência às Figuras 4K e 4L, em alguns casos as porções da célula ou partícula podem se estender para fora da fita do fluido da amostra fina R e para o interior do fluido de revestimento circundante. Como discutido no pedido de patente copendente U.S. N°. , o fluido de revestimento pode conter protetores celulares que inibem ou evitam que o fluido de revestimento rompa ou lise as células ou partículas. Por exemplo, o fluido de revestimento pode conter protetores celulares que preservam a integridade estrutural das paredes celulares na medida em que as células são expostas ao ambiente químico do fluido de revestimento. De modo similar, os protetores celulares também podem funcionar para preservar a integridade estrutural das paredes celulares na medida em que as células experimentam quaisquer forças de cisalhamento induzidas pela geometria da célula de fluxo, e uma diferença na velocidade e/ou viscosidade entre o fluido da amostra e o fluido de revestimento. Correlativamente, os protetores podem proteger as células ou partículas das forças resultantes da diferença na velocidade entre a fluido da amostra e fluido de revestimento. Deste modo, as células mantêm sua viabilidade na medida em que alcançam o local de captura de imagem.

[000245] As forças de cisalhamento podem ser significativas na interface entre a fita do fluido da amostra e o envelope do fluido de revestimento. De acordo com algumas modalidades, o fluxo dentro da trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ser caracterizado por um perfil de fluxo parabólico. De acordo com algumas modalidades, as partículas que são suficientemente grandes em tamanho serão submetidas a alguma quantidade de força de cisalhamento, mesmo onde tais partículas estão completamente contidas dentro de uma fase de fluido único (isto é ou dentro do envelope do fluido de revestimento, ou alternativamente dentro da fita do fluido da amostra).

[000246] Em alguns casos, a velocidade do fluido de revestimento pode ser diferente da velocidade do fluido da amostra. Por exemplo, o fluido de revestimento pode estar viajando a 80 mm/segundo e o fluido da amostra pode estar viajando a 60 mm/segundo. Por isso, em alguns casos, o fluido da amostra sai da porta da cânula distal em uma velocidade do fluido da amostra que é mais lenta do que a velocidade do fluido de revestimento do envelope circundante. Por isso, o fluido de revestimento pode funcionar para arrastar o fluido da amostra ao longo da trajetória de fluxo da cânula, acelerando assim o fluido da amostra e reduzindo a espessura da fita do fluido da amostra. A fita do fluido da amostra mantém o volume e massa totais, de modo que ela viaje mais rápido e se torne mais fina. De acordo com algumas modalidades, ambos o fluido de revestimento e o fluido da amostra tem uma velocidade de entre cerca de 20 e 200 mm/segundos no local de captura de imagem.

[000247] Tipicamente, a velocidade do fluido da amostra aumenta na medida que o fluido da amostra viaja a partir da porta de saída da cânula para o local de captura de imagem. Em alguns casos, a velocidade do fluido da amostra no local de captura de imagem é 40 vezes a velocidade do fluido da amostra na medida em que sai da porta da cânula na porção distal da cânula. De acordo com algumas modalidades, a diminuição na área de seção transversal da fita da amostra é linear para o aumento na velocidade. De acordo com algumas modalidades, se a velocidade de revestimento na saída de cânula é maior que a velocidade da fita da amostra isto também aumentará a velocidade final da fita de amostra na área de imageamento.

[000248] O fluido de revestimento pode funcionar para aplicar forças de cisalhamento significativas sobre a fita do fluido da amostra e sobre as partículas dentro da fita do fluido da amostra. Algumas forças são paralelas à direção do fluxo, e partículas também podem encontrar forças que são perpendiculares à direção do fluxo. Frequentemente, na medida em que o fluido de revestimento e o fluido de amostra se aproximam do local ou zona de captura de imagem, os fluidos de amostra e de revestimento viajam na, ou perto da mesma velocidade. Consequentemente, o contorno ou interface entre os fluidos de amostra e de revestimento à medida que passam pelo local de captura de imagem, podem apresentar forças de cisalhamento inferiores, em comparação com o contorno ou interface na porta de saída de cânula distal ou na zona de transição afunilada. Por exemplo, na zona de transição afunilada, o contorno ou interface entre o envelope de fluido de revestimento e a fita de fluido amostra pode estar em transição, de tal modo que a fita de amostra que é inicialmente mais lenta e mais espessa torna-se mais rápida e mais delgada, e as partículas no fluido de amostra tornam-se mais alinhadas. Dito de outra maneira, as forças de cisalhamento podem ser proeminentes na zona de transição afunilada, e podem dissipar-se para o local de captura de imagem. As forças de cisalhamento no local de captura de imagem podem ser representadas por um perfil parabólico, e pode ser muito inferior às forças de cisalhamento na zona de transição afunilada. Por isso, células ou partículas podem experimentar forças de cisalhamento mais altas à medida que passam através da zona de transição, e forças de cisalhamento menores à medida que passam através do local de captura de imagem. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre os fluidos de amostra e de revestimento pode colocar as células vermelhas do sangue em alinhamento e, assim, em foco. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre os fluidos de amostra e de revestimento pode colocar as organelas das células brancas do sangue em alinhamento e, assim, em foco. De modo semelhante, resultados aprimorados de imageamento podem ser obtidos para componentes celulares e organelas que são alinhados e trazidos para o foco, resultantes do estreitamento geométrico da corrente e a diferença de velocidade entre os fluidos de revestimento e de amostra.

[000249] Como observado em outro lugar na presente invenção, e com referência às Figuras 4K e 4L, na medida que o fluido de revestimento e o fluido da amostra R fluem através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição de uma célula de fluxo, e em direção a um local de formação da imagem 432k ou 432l, um efeito de hidrofocalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra R associada com uma diferença de viscosidade entre a viscosidade do fluido de revestimento e a viscosidade do fluido da amostra, em combinação com um efeito de hidrofocalização geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra R associados com a redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição, fornece um estado de formação da imagem alvo em pelo menos alguma da pluralidade das partículas no local de imageamento 432k ou 432l.

[000250] Em alguns casos, o estado de formação de imagem alvo é uma orientação de alvo em relação a um plano focal F no local de imageamento. Por exemplo, como ilustrado na Figura 4K-1, a partícula (RBC) pode ser deslocada a uma distância a partir do plano focal F. Em alguns casos, a orientação de alvo envolve uma orientação de partícula alvo em relação ao plano focal F no local de imageamento 432k-1. A partícula pode ser uma célula sanguínea, como um eritrócito, um leucócito, ou uma plaqueta. Como mostrado aqui, a trajetória de fluxo no local de imageamento 432k-1 pode definir um plano P que é substancialmente paralelo a ou coplanar ao plano focal F. Em alguns casos, uma porção da partícula pode ser posicionada ao longo do plano focal F, ainda a porção central da partícula pode de outra forma ser deslocada a partir do plano focal F. Em alguns casos, a orientação de alvo envolve uma posição alvo em relação ao plano focal F no local de imageamento 432k-1. Por exemplo, a posição alvo pode envolver o posicionamento da partícula de modo que pelo menos uma porção da partícula seja disposta ao longo do plano focal F. Em alguns casos, a posição alvo pode envolver o posicionamento da partícula de modo que uma distância entre a partícula e o plano focal F não excede um certo limiar. Em alguns casos, a posição alvo envolve uma posição de partícula alvo que é em relação ao plano focal F no local de imageamento 432k-1. Em alguns casos, a posição alvo está a ou menos de uma distância D a partir do plano focal F, onde a distância D corresponde a uma tolerância de posição. Um diferencial de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra pode ser selecionado de modo a conseguir um posicionamento desejado da corrente da amostra da fita dentro da célula de fluxo (por exemplo, em relação ao plano da trajetória de fluxo P e/ou plano focal F). Em alguns casos, o diferencial de viscosidade pode ser selecionado de modo a conseguir uma posição de partícula alvo que está em ou menos do que a tolerância de posição D.

[000251] Em alguns casos, o plano focal F tem uma espessura ou profundidade de campo como indicado na Figura 4K-2, e a partícula (RBC) tem um estado de formação de imagem alvo em relação à espessura do plano focal. Por exemplo, a posição alvo para a partícula pode estar dentro do plano focal F ou pelo menos parcialmente dentro do plano focal F. Em alguns casos um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou câmera pode ter uma profundidade de campo ou espessura de plano focal de cerca de 7 μm. Em alguns casos, a profundidade de campo ou espessura de plano focal tem um valor com uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Em alguns casos, a profundidade do campo da câmera é similar ou igual à espessura da fita da amostra no local de captura de imagem.

[000252] Em alguns casos, a orientação de alvo pode envolver um alinhamento de alvo em relação ao plano focal F no local de imageamento. Por exemplo, o alinhamento de alvo pode indicar que um plano definido pela partícula está alinhado com o plano focal F, para não exceder um certo ângulo α em relação ao plano focal F no local de captura de imagem 432k-3 como mostrado na Figura 4K-3. Em alguns casos, o estado de formação de imagem alvo pode envolver uma limitação no número ou porcentagem de partículas desalinhadas em uma amostra. Por exemplo, uma diferença na viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra R pode ser eficaz para limitar o desalinhamento da orientação da formação de imagem de eritrócitos na amostra de fluido sanguíneo para menos de cerca de 10%. Ou seja, 90 ou mais eritrócitos de 100 eritrócitos em uma amostra podem ser alinhados de modo que suas superfícies maiores ficam de frente para o dispositivo de formação de imagem (como ilustrado nas Figuras 4K-1 e 4K-2) ou de modo que o alinhamento desses 90 ou mais RBCs está dentro de 20 graus a partir de um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo (por exemplo, ângulo de alinhamento de RBC α é 20 graus ou menos). Como discutido em outro lugar na presente invenção, em alguns casos pelo menos 92% das partículas não esféricas como RBCs podem ser alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo. Em alguns casos, pelo menos entre 75% e 95% das partículas não esféricas como RBCs podem ser substancialmente alinhadas, ou seja, dentro de 20 graus a partir de um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo (por exemplo, o ângulo de alinhamento α é 20 graus ou menos). De acordo com algumas modalidades, 90% ou mais de determinadas partículas (por exemplo, eritrócitos e/ou plaquetas) podem ser orientadas transversais ao eixo de imageamento do dispositivo de imageamento.

[000253] Em alguns casos, as modalidades da presente invenção incluem composições para uso com um sistema de hematologia conforme descrito aqui, como um fluido de revestimento ou partícula e líquido de alinhamento de organela intracelular (PIOAL). Tais fluidos de revestimento ou PIOALs são adequados para uso em um analisador visual combinado de hidrofocalização geométrica e viscosidade. O PIOAL pode funcionar para direcionar ou facilitar o fluxo de um fluido de amostra sanguínea de uma dada viscosidade através de um estreitamento da zona de transição da célula de fluxo do analisador visual. O PIOAL pode incluir um fluido tendo uma viscosidade maior do que a viscosidade da amostra. Um efeito de hidrofocalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido da amostra associado com a diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofocalização geométrico induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido da amostra associada com o estreitamento da zona de transição da célula de fluxo, pode ser eficaz para fornecer um estado de formação de imagem alvo em pelo menos alguma da pluralidade de partículas em um local de formação da imagem do analisador visual enquanto mantém a viabilidade das células no fluido de amostra sanguínea.

[000254] A Figura 4M ilustra um neutrófilo exemplificador 400m (um tipo de leucócito) que tem organelas internas como lóbulos 410m. Como resultado do diferencial de viscosidade entre o fluido da amostra e o fluido de revestimento, as organelas internas podem se alinhar dentro da célula, como indicado pela Figura 4N. Por isso, as organelas intracelulares podem ser eficazmente imageadas com um dispositivo de captura de imagem 430m, sem as organelas se sobrepondo umas às outras. Ou seja, ao invés dos lóbulos sendo empilhados uns sobre os outros como ilustrado na Figura 4M, quando vistos a partir da formação da imagem ou eixo óptico do dispositivo de captura de imagem os lóbulos estão alinhados e assentados lado a lado como ilustrado na Figura 4N. Por isso, os lóbulos podem ser visualizados na imagem capturada mais eficazmente. O alinhamento interno da organela é um resultado surpreendente e inesperado do diferencial de viscosidade entre os fluidos de amostra e de revestimento. Consequentemente, resultados aprimorados de imageamento correspondentes ao alinhamento de célula e em foco são conseguidos usando o diferencial de viscosidade, fluxo hidrodinâmico, e recursos de compressão geométrica.

[000255] Como observado em outro lugar na presente invenção, e com referência às Figuras 4M e 4N, na medida que o fluido de revestimento e o fluido da amostra R fluem através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição de uma célula de fluxo, e em direção a um local de formação da imagem de um dispositivo de formação de imagem 430m ou 430n, um efeito de hidrofocalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra R associado com uma diferença de viscosidade entre a viscosidade do fluido de revestimento e a viscosidade do fluido da amostra, em combinação com um efeito de hidrofocalização geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra R associado com a redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição, fornece um estado de formação da imagem alvo em pelo menos alguma da pluralidade das partículas no local de imageamento. De acordo com algumas modalidades, o estado de formação de imagem alvo pode corresponder a uma distribuição de estados de formação de imagem.

[000256] Em alguns casos, o estado de formação de imagem alvo pode envolver uma orientação de estrutura de intrapartícula alvo (por exemplo, alinhamento e/ou posição) em relação a um plano focal no local de imageamento. Por exemplo, como ilustrado na Figura 4N, as estruturas internas 410 m (por exemplo, estrutura intracelular, organela, lóbulo, ou similares) podem ser orientadas em relação ao plano focal F. Em alguns casos, o alinhamento de alvo envolve um alinhamento de estrutura intrapartícula alvo em relação a um plano focal F no local de imageamento, similar à relação do alinhamento de partícula ilustrada na Figura 4K-3. Em alguns casos, o alinhamento de alvo envolve um alinhamento de estrutura intrapartícula alvo em relação a um plano focal no local de imageamento, similar à relação de posição de partícula ilustrada na Figura 4K-1. Em alguns casos, a orientação de alvo da estrutura de intrapartícula pode incluir tanto um alinhamento de alvo em relação ao plano focal quanto também uma posição alvo em relação ao plano focal. Em alguns casos, o estado de formação de imagem alvo pode envolver uma deformação de alvo no local de imageamento. Por exemplo, como ilustrado na Figura 4N, a partícula 400m tem um formato comprimido em comparação com o formato de partícula ilustrado na Figura 4M. Por isso, pode ser visto que a operação da célula de fluxo pode produzir um efeito de compressão lateral nos formatos de partícula. De modo semelhante, os recursos intrapartículas podem ser posicionalmente ou direcionalmente orientados (por exemplo, alinhados com respeito ao plano focal F e/ou plano do fluxo da fita) na medida em que a partícula em si é compactada no formato. De acordo com algumas modalidades, uma diferença de velocidade entre os fluidos de revestimento e de amostra pode produzir atrito no interior da corrente de fluxo, e uma diferença de viscosidade entre os fluidos de revestimento e de amostra pode amplificar o atrito hidrodinâmico.

[000257] Qualquer um de uma variedade de técnicas de análise de partículas de hematologia ou do sangue pode ser realizada usando imagens do fluido de amostra que flui através da célula de fluxo. Frequentemente, a análise de imagem pode envolver determinar certos parâmetros de célula ou partícula, ou medir, detectar, ou avaliar certos recursos de célula ou partícula. Por exemplo, a análise de imagem pode envolver a avaliação do tamanho da célula ou partícula, recursos de núcleo da célula, recursos de citoplasma da célula, recursos de organela intracelular, e similares. De modo semelhante, as técnicas de análise podem abranger certos métodos de contagem ou de classificação ou testes de diagnóstico, incluindo diferenciais de células brancas do sangue (WBC). Em alguns casos, as imagens obtidas usando a célula de fluxo podem suportar um teste diferencial de WBC em 5 partes. Em alguns casos, as imagens obtidas usando a célula de fluxo podem suportar um teste diferencial de WBC em 9 partes. De modo semelhante, com referência à Figura 4, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema 400 diferencie diferentes tipos de células com base nas imagens obtidas a partir do dispositivo de captura de imagem. Por exemplo, as técnicas de teste ou de diagnóstico podem ser usadas para diferenciar várias células (por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, metamielócitos, mielócitos, promielócitos e blastos). Métodos

[000258] A Figura 5 ilustra aspectos de um método exemplificador 500 para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo, de acordo com as modalidades da presente invenção. O método 500 pode incluir injetar uma amostra de fluido sanguíneo em uma trajetória de fluxo da célula de fluxo, como indicado pela etapa 510. O método também pode incluir focar um dispositivo de captura de imagem pelo imageamento de um alvo de imageamento tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo, como indicado pela etapa 520. Adicionalmente, o método pode incluir adquirir uma imagem focalizada das partículas, como indicado pela etapa 530. A imagem focalizada pode ser adequada para a caracterização e contagem de partícula, dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem, sendo que o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo da amostra usando uma distância de deslocamento. A Figura 6 ilustra aspectos de um método exemplificador para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo. Como mostrado aqui, o método 600 pode fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo como indicado pela etapa 610, injetar a amostra de fluido no interior do fluido de revestimento que flui dentro da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido flua em uma corrente de fluxo da amostra como indicado pela etapa 620, focalizar um dispositivo de captura de imagem na corrente de fluxo para um primeiro estado focal enquanto a temperatura associada com a célula de fluxo está em uma primeira temperatura como indicado pela etapa 630, adquirir uma primeira imagem focalizada de um primeiro subconjunto de partículas dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no primeiro estado focal como indicado pela etapa 640, determinar que a temperatura associada com a célula de fluxo sofreu uma mudança a partir da primeira temperatura para uma segunda temperatura como indicado pela etapa 650, ajustar automaticamente o foco do dispositivo de captura de imagem a partir do primeiro estado focal para um segundo estado focal em resposta à mudança na temperatura e a relação conhecida entre a temperatura da célula de fluxo e foco desejado como indicado pela etapa 660, e adquirir uma segunda imagem focalizada de um segundo subconjunto das partículas dentro do corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no segundo estado focal como indicado pela etapa 670.

Taxa de esforço de cisalhamento

[000259] As Figuras 7 e 8 ilustram aspectos de valores de taxa de esforço de cisalhamento para certas condições de fluxo em uma célula de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção. Em cada um destes desenhos, um fluido de revestimento de glicerol a 30% é usado. Em alguns casos, a viscosidade pode ter um valor de 2,45 x 10-3. Um valor de tensão de cisalhamento pode ser igual ao produto obtido pela multiplicação de um valor de viscosidade por um valor da taxa de esforço. Com relação à Figura 7, a amostra pode ter uma vazão de 0,3 μL/seg e o fluido de revestimento pode ter uma vazão de 21 μL/seg. Com relação à Figura 8, a amostra pode ter uma vazão de 1 μL/seg e o fluido de revestimento pode ter uma vazão de 70 μL/seg. Em cada uma dessas figuras, pode ser visto que o fluxo apresenta um valor de tensão inferior em direção ao centro (C) e um valor de esforço maior em direção à periferia (P). Tais valores de esforço podem corresponder a uma configuração de célula de fluxo assimétrica, em algumas modalidades.

[000260] Como ilustrado na Figura 7, de acordo com algumas modalidades, a taxa de esforço inferior em direção à porção central (C) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 500 (1/s) ou menos e a taxa de esforço maior em direção à periferia (P) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 3000 (1/s) ou maior. Como ilustrado na Figura 8, de acordo com algumas modalidades, a taxa de esforço inferior em direção à porção central (C) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 1000 (1/s) ou menos e a taxa de esforço maior em direção à periferia (P) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 9000 (1/s) ou maior.

[000261] Por isso, pode ser visto que taxas de fluido de revestimento e de amostra inferiores (por exemplo, a Figura 7) correspondem a taxas de esforço inferiores, e taxas de fluido de amostra e de revestimento maiores (por exemplo, a Figura 8) correspondem a taxas de esforço maiores. Compreende-se que as modalidades da presente invenção englobam o uso dos fluidos de amostra e/ou revestimento correspondentes aos vários valores de viscosidade, vários valores de taxas de esforço, e/ou vários valores de tensão de cisalhamento.

Alvo de foco automático

[000262] Voltando a fazer referência à Figura 1, sistemas de formação de imagem da partícula podem incluir um padrão de foco automático ou alvo de imageamento 44 que é fixo em relação à célula de fluxo 22. O alvo de foco automático 44 pode ser usado para conseguir imagens focalizadas das partículas do fluido sanguíneo que fluem através da célula de fluxo.

[000263] A Figura 9A ilustra um alvo de foco automático exemplificador 900 de acordo com as modalidades da presente invenção. Como mostrado aqui, o alvo 900 inclui uma banda anular opaca ou íris 910 e um centro ou abertura transparente 920. Em funcionamento, o dispositivo de formação de imagem foca na banda 910, e captura a imagem através da abertura. Como discutido em outro lugar na presente invenção, um processo de captura de imagem pode envolver primeiro a focalização (ou autofocalização) na banda 910, e então o ajuste da distância entre o dispositivo de captura de imagem e a corrente de fluxo da amostra antes de se obter a imagem através da abertura 920. Consequentemente, a banda 910 pode apresentar um alvo sobre o qual um sistema de foco automático do dispositivo de captura de imagem pode detectar e focar sobre, e certas porções do alvo (por exemplo, bordas ou segmentos) podem ser incluídas na imagem. Em alguns casos, o alvo pode ser fornecido como um disco cromado tendo uma abertura central. Um alvo exemplificador pode ser dotado de um orifício central, tendo um diâmetro de cerca de 0,5 mm, que é colado ou fixo à célula de fluxo. O tamanho do orifício central ou abertura 920 pode ser selecionado de modo que somente quatro porções de borda 930 da banda anular opaca 910 são visíveis na imagem capturada 940, como ilustrado na Figura 9B. Por isso, a banda anular 910 não interfere com a captura das imagens da célula (por exemplo, a luz pode passar através da abertura 920 de modo a iluminar as partículas de amostra, e o campo de visão é substancialmente desimpedido por uma banda anular). Deste modo, a banda 910 aparece somente nos cantos da imagem.

[000264] A Figura 10 ilustra um alvo de foco automático ou formação de imagem exemplificador 1000 de acordo com as modalidades da presente invenção. O alvo 1000 inclui uma banda ou margem 1010 e uma abertura central 1020. A banda ou íris 1010 pode ser opaca, e a abertura 1020 pode ser transparente. A Figura 11 mostra outro alvo de foco automático exemplificador 1100 de acordo com as modalidades da presente invenção. O alvo 1100 inclui uma banda ou margem 1110 e uma abertura central 1120. A banda ou íris 1110 pode ser opaca, e a abertura 1120 pode ser transparente. De acordo com algumas modalidades, o alvo de foco automático 1100 fornece uma imagem tendo 50 pixels de preto na parte de cima e na parte de baixo. Em alguns casos, o alvo de foco automático 1100 fornece um deslocamento de foco da célula de fluxo (FCFO) de cerca de 65,3 μm.

[000265] A Figura 12A ilustra um alvo de foco automático exemplificador 1200 de acordo com as modalidades da presente invenção. O alvo 1200 é apresentado como um design de caixa de correio, e inclui uma primeira ou margem superior 1210 e uma segunda ou margem inferior 1220. O alvo 1200 também inclui uma abertura ou passagem transparente 1230 entre as primeira e segunda margens. De acordo com algumas modalidades, o alvo tem um diâmetro de cerca de 4 mm, e a altura da caixa de correio é 265 μm. Em alguns casos, as margens superiores e inferiores podem estar presentes como meios círculos, e podem ser produzidas com um metal depositado como óxido de cromo ou algum outro material opaco.

[000266] A Figura 12B mostra uma vista de perto da porção central do alvo de foco automático 1200. Como mostrado aqui, a primeira margem 1210 inclui uma escala numérica negativa/positiva, com um valor de zero centralizado. A segunda margem 1220 inclui uma escala similar. Em alguns casos, os aumentos na escala são de 100 μm. De acordo com algumas modalidades, as escalas podem ser usadas para facilitar o posicionamento da célula de fluxo de modo que o campo de visão do dispositivo de imageamento ou câmera possa ser centralizado na corrente da amostra. Como mostrado aqui, a corrente da amostra 1240 flui em uma direção perpendicular às escalas das primeira e segunda margens. Como parte de um protocolo de focalização, o dispositivo de captura de imagem pode funcionar para focar nos números ou outros caracteres ou objetos imageáveis presentes nas margens 1210, 1220.

[000267] As modalidades da presente invenção englobam técnicas para solucionar o desvio térmico associado com o uso do sistema de análise de partículas, de modo que tais efeitos térmicos possam de outra forma comprometer a qualidade das imagens obtidas com o dispositivo de formação de imagens. A Figura 13A ilustra uma vista lateral parcial de uma célula de fluxo 1320 tendo um sensor térmico 1370, um refletor 1380, e um alvo de foco automático 1344. Durante a operação de um sistema de análise de partícula, efeitos térmicos podem fazer com que a corrente da amostra desvie lentamente do foco do dispositivo de imageamento. Por exemplo, efeitos térmicos podem ser causados pela expansão térmica da célula de fluxo através do calor radiado vindo da lâmpada. Adicionalmente, efeitos térmicos podem ser causados pela expansão térmica da célula de fluxo e conjunto de banco óptico (OBA) através do aquecimento condutor e radiativo. Em algumas modalidades, certos componentes de OBA podem expandir, os quais podem contribuir para erros de focalização. Por exemplo, tais componentes podem incluir placas de metal que mantém a câmera 24 junta, uma placa de metal que mantém ou é conectada à célula de fluxo, ou uma placas de metal que mantém ambas a célula de fluxo e câmera 24 juntas. A Figura 13B ilustra uma vista em perspectiva parcial da célula de fluxo 1320 tendo sensor térmico 1370 e alvo de foco automático 1344. Adicionalmente, a Figura 13C ilustra outra vista em perspectiva da célula de fluxo 1320 tendo um sensor térmico 1370, refletor 1380, e alvo de foco automático 1344.

[000268] A Figura 13B ilustra uma vista em perspectiva parcial da célula de fluxo 1320 tendo sensor térmico 1370 e alvo de foco automático 1344. De acordo com algumas modalidades da presente invenção, um dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra usando uma temperatura que é detectada por um sensor térmico associado com o analisador. Por exemplo, a temperatura pode corresponder a uma temperatura do fluido da amostra, uma temperatura do fluido de revestimento, uma temperatura da célula de fluxo, ou um dispositivo de captura de imagem temperatura. Em alguns casos, a temperatura é uma temperatura no local de imageamento de uma célula de fluxo. Em alguns casos, a temperatura é uma temperatura em um local a jusante do local de imageamento. Em alguns casos, a temperatura é uma temperatura em um local a montante do local de imageamento. De acordo com algumas modalidades da presente invenção, um dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra usando uma taxa de temperatura da mudança associada com o analisador. Por exemplo, a taxa de temperatura da mudança corresponde a uma taxa de mudança da temperatura do fluido da amostra, uma taxa de mudança da temperatura do fluido de revestimento, uma taxa de mudança de temperatura da célula de fluxo, ou uma taxa de mudança de temperatura do dispositivo de captura de imagem.

[000269] A Figura 13C ilustra outra vista em perspectiva da célula de fluxo 1320 tendo um sensor térmico 1370, refletor 1380, e alvo de foco automático 1344. O refletor 1380 pode operar para reduzir ou limitar a quantidade de calor absorvida pela célula de fluxo 1320. Por exemplo, o refletor 1380 pode bloquear o calor radiado por uma lâmpada de flash 1342 como indicado na Figura 13A. Por isso, o refletor 1380 pode minimizar o impacto térmico da lâmpada. O refletor 1342 também pode reduzir o ofuscamento e espalhamento de luz gerados pela lâmpada, resultando assim na qualidade de imagem aprimorada. O sensor térmico 1370 é posicionado próximo ao canal de fluxo de fluido e adjacente ao local de captura de imagem, de modo que leituras de temperatura precisas podem ser obtidas. A informação a partir do sensor de temperatura pode ser usada para focar o dispositivo de captura de imagem na corrente de fita do fluido da amostra. Técnicas de focalização automática exemplificadoras apresentadas na presente invenção podem ser baseadas nas flutuações de temperatura que ocorrem dentro de certos elementos do analisador.

[000270] De acordo com algumas modalidades, um método para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo pode incluir o fluxo de um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, e injeção da amostra de fluido sanguíneo no fluido de revestimento fluindo dentro da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido sanguíneo flua em uma corrente de fluxo da amostra com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo, de modo que a célula de fluxo tenha uma temperatura associada. Adicionalmente, o método pode incluir focar um dispositivo de captura de imagem, ao longo de um eixo de imageamento, sobre a corrente de fluxo para um primeiro estado focal enquanto a temperatura associada com a célula de fluxo está em uma primeira temperatura, e adquirir uma primeira imagem focalizada de um primeiro subconjunto das partículas dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no primeiro estado focal. Aliás, o método pode incluir determinar que a temperatura associada com a célula de fluxo sofreu uma mudança a partir da primeira temperatura para uma segunda temperatura, e automaticamente ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem a partir do primeiro estado focal para um segundo estado focal em resposta à mudança na temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura da célula de fluxo e foco desejado. Ainda adicionalmente, o método pode incluir adquirir uma segunda imagem focalizada de um segundo subconjunto das partículas dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no segundo estado focal.

[000271] Em alguns casos, o processo para ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem inclui ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo usando a mudança na temperatura e a relação conhecida entre a temperatura da célula de fluxo e foco desejado. Em alguns casos, o processo para ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem inclui ajustar uma distância focal do dispositivo de captura de imagem usando a mudança na temperatura e a relação conhecida entre temperatura da célula de fluxo e foco desejado.

Imagens focalizadas

[000272] As Figura 14A e 14B fornecem vistas laterais de seção transversal que ilustram aspectos dos sistemas e métodos de formação de imagem, de acordo com as modalidades da presente invenção. Com referência à Figura 14A, um sistema de análise de partícula 1400a como um analisador para hematologia pode ser configurado para viscosidade combinada e hidrofocalização geométrica, por exemplo, usando técnicas de célula de fluxo e fluido de revestimento viscoso como aquelas descritas nos pedidos de patente copendentes US , os conteúdos dos quais estão incorporados aqui a título de referência. Um método exemplificador para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo usando o sistema de análise de partículas pode incluir o fluxo de um fluido de revestimento 1410a ao longo de uma trajetória de fluxo 1420a de uma célula de fluxo 1430a do sistema de análise de partículas. A trajetória de fluxo 1420a pode ser definida pelo menos em parte pelas paredes da célula de fluxo opostas 1422a, 1424a da célula de fluxo. O fluido de revestimento 1410a pode ter uma viscosidade que é diferente de uma viscosidade da amostra de fluido sanguíneo. O método de formação da imagem pode incluir ainda injetar a amostra de fluido sanguíneo para o interior do fluido de revestimento que está fluindo 1410a dentro da célula de fluxo 1430a de modo que o líquido da amostra de fluido sanguíneo flui em uma corrente de fluxo da amostra 1440a. A corrente de fluxo da amostra 1440a pode ter uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo. A corrente de fluxo da amostra 1440a também pode fluir através de uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo e atravessar um eixo de imageamento 1450a. Na ilustração da Figura 14A, a direção do fluxo é da esquerda para a direita.

[000273] Adicionalmente, o método de formação de imagem pode incluir focar um dispositivo de captura de imagem 1460a pelo imageamento de um alvo de imageamento 1470a tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo 1430a. Por exemplo, como mostrado aqui, o alvo de imageamento 1470a pode ter uma posição fixa em relação a uma janela de iluminação 1480a da célula de fluxo. Em alguns casos, o alvo de imageamento 1470a pode ser incorporado dentro ou fixo sobre a janela 1480a. Os métodos também podem incluir adquirir uma imagem focalizada das partículas do fluido da amostra (por exemplo, partícula 1490a, disposta pelo menos parcialmente dentro da corrente de fluxo 1440a) com o dispositivo de captura de imagem 1460a. A imagem focalizada é adequada para a caracterização e contagem de partículas.

[000274] O dispositivo de captura de imagem 1460a pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra 1440a usando uma distância de deslocamento. Por exemplo, a distância de deslocamento pode corresponder a uma distância D entre a corrente de fluxo da amostra 1440a e o alvo de imageamento 1470a. A diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento 1410a e a amostra de fluido sanguíneo, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, pode ser eficaz para hidrofocalizar o fluido da amostra na corrente de fluxo da amostra 1440a no eixo de imageamento 1450a enquanto retém a viabilidade das células na amostra de fluido sanguíneo. Por exemplo, um efeito de hidrofocalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento 1410a e a corrente de fluxo da amostra 1440a associada com a diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofocalização geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento 1410a e a corrente de fluxo da amostra 1440a associada com a redução no tamanho da trajetória de fluxo, pode ser eficaz para fornecer um estado de formação de imagem alvo em pelo menos algumas das partículas da amostra de fluido no eixo de imageamento 1450a enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento 1410a mantém a viabilidade das células na corrente de fluxo da amostra 1440a deixando a estrutura e o teor das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluxo da amostra 1440a para o interior do fluido de revestimento que está fluindo 1410a.

[000275] Como o dispositivo de captura de imagem 1460a é focalizado na corrente de fluxo da amostra 1440a usando a distância de deslocamento, o dispositivo de captura de imagem 1460a pode obter imagens das partículas ou células dentro da corrente de fluxo da amostra 1440a no eixo de imageamento 1450a, ou em um local de captura de imagem associado com o eixo de imageamento 1450a. Em alguns casos, as partículas podem ser iluminadas com uma fonte de iluminação ou lâmpada 1426a. As imagens da corrente de fluxo da amostra 1440a podem ser obtidas na medida em que as partículas se aproximam do eixo de imageamento 1450a, à medida que as partículas atravessam o eixo de imageamento 1450a, e/ou à medida que as partículas fluem na direção contrária a partir do eixo de imageamento 1450a.

[000276] A Figura 14B ilustra aspectos de uma configuração de célula de fluxo alternativa, onde o alvo de imageamento 1470b tem uma posição fixa em relação a uma janela da porta de visualização 1482b da célula de fluxo 1430b. Por exemplo, em alguns casos, o alvo de imageamento 1470b pode ser incorporado dentro ou fixo sobre a janela 1482b. Como mostrado aqui, o método de formação de imagem pode incluir focar um dispositivo de captura de imagem 1460b pelo imageamento de um alvo de imageamento 1470b tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo 1430b. Adicionalmente, o dispositivo de captura de imagem 1460b pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra 1440b usando uma distância de deslocamento. Por exemplo, a distância de deslocamento pode corresponder a uma distância D entre a corrente de fluxo da amostra 1440b e o alvo de imageamento 1470b.

[000277] A Figura 14C ilustra uma vista da extremidade da seção transversal de uma célula de fluxo 1430c, ilustrando vários locais de colocação alternativa para um foco automático ou alvo de imageamento. Por exemplo, um alvo de imageamento 1472c pode estar localizado em uma janela de porta de visualização 1482c da célula de fluxo 1430c. Opcionalmente, um alvo de imageamento 1474c pode estar localizado em uma janela de iluminação 1480c da célula de fluxo 1430c. Adicionalmente opcionalmente, um alvo de imageamento 1476c pode estar localizado em uma parede lateral da célula de fluxo (por exemplo, 1432c e/ou 1434c). O dispositivo de captura de imagem 1460c pode ser focalizado em uma corrente de fluxo de amostra 1440c, que é envelopada dentro de um fluido de revestimento 1410c, usando a distância de deslocamento. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D1 ao longo do eixo de imageamento 1450c entre a corrente de fluxo da amostra 1440c (ou um plano central 1441c definido pela corrente de fluxo 1440c) e o alvo de imageamento da janela de porta de visualização 1472c. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D2 ao longo do eixo de imageamento entre a corrente de fluxo da amostra 1440a (ou o plano central 1441c) e a janela de iluminação alvo de imageamento 1476c. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D3 ao longo do eixo de imageamento entre a corrente de fluxo da amostra 1440a (ou o plano central 1441c) e o alvo de imageamento da parede lateral da célula de fluxo 1474c. Em alguns casos, a distância D3 tem um valor maior que zero. Em alguns casos, a distância D3 tem um valor de zero; Ou seja, onde a corrente de fluxo da amostra 1440a (ou o plano central 1441c) é coplanar com o alvo de imageamento 1474c. Em alguns casos, é possível definir uma distância de deslocamento que não é calculada com base na distância D1, distância D2, ou distância D3. Por exemplo, uma distância de deslocamento pode ser um número ou valor predeterminado que é fornecido por uma fabricante de célula de fluxo ou analisador para hematologia.

[000278] De acordo com algumas modalidades, a corrente de fluxo da amostra 1440c pode ter uma espessura T1 no eixo de imageamento dentro de uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Em alguns casos, a trajetória de fluxo ou o fluido de revestimento 1410c pode ter uma espessura T2 de cerca de 150 μm no eixo de imageamento. Como mostrado aqui, um alvo de imageamento 1472c pode estar localizado em uma janela de porta de visualização 1482c disposta entre a corrente de fluxo da amostra 1440c e o dispositivo de captura de imagem 1460c. Em alguns casos, um alvo de imageamento (por exemplo, 1474c) pode estar localizado entre uma janela de iluminação 1480c e uma janela de porta de visualização 1482c. Como discutido em outro lugar na presente invenção, o processo para adquirir uma imagem focalizada pode incluir ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem 1460c e a célula de fluxo 1430c usando a distância de deslocamento. Em alguns casos, como discutido em outro lugar na presente invenção, o processo para adquirir uma imagem focalizada pode incluir ajustar uma distância focal do dispositivo de captura de imagem 1460c usando a distância de deslocamento. Em alguns casos, o processo para adquirir uma imagem focalizada pode incluir ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem 1460c e a célula de fluxo 1430c, e o processo para ajustar a distância inclui mover a célula de fluxo 1430c, por exemplo, para uma posição mais próxima ao dispositivo de captura de imagem 1460c, ou para uma posição mais distante do dispositivo de captura de imagem 1460c.

[000279] Como ilustrado na Figura 14D, uma primeira distância focal do dispositivo de captura de imagem 1460d pode corresponder a uma distância D1 (por exemplo, ao longo do eixo de imageamento 1450d) entre o dispositivo de captura de imagem 1460d e o alvo de imageamento 1470d, e uma segunda distância focal do dispositivo de captura de imagem 1460d pode corresponder a uma distância D2 (por exemplo, ao longo do eixo de imageamento 1450d) entre o dispositivo de captura de imagem 1460d e a corrente do fluxo da amostra 1440d (ou um plano central definido pela corrente do fluxo da amostra). Em alguns casos, o alvo de imageamento pode estar localizado em outro lugar na célula de fluxo, por exemplo, como ilustrado na Figura 14C. De acordo com algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a uma diferença de distância entre a primeira distância focal (ou distância D1) e a segunda distância focal (ou distância D2). O dispositivo de captura de imagem 1460d pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra 1440d usando esta distância de deslocamento (por exemplo, diferença entre D1 e D2).

[000280] A Figura 15 ilustra uma vista em elevação mostrando as modalidades de um padrão de foco automático (ou alvo de imageamento), que por exemplo pode estar localizado nos orifícios ou janela de iluminação, em um portal ou janela de visualização, ou em outro local da célula de fluxo. O alvo pode sumir na medida em que a distância ou posição do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é movida em relação à corrente de amostra em forma de fita. Como ilustrado nas Figuras 9-12B, uma formação da imagem ou alvo de foco (padrão de foco automático) pode residir na periferia da área de visão na qual a amostra deve aparecer. Voltando a fazer referência à Figura 15, pode ser visto que também é possível que o alvo de foco possa ser definido pelos formatos contrastantes que residem no campo de vista.

[000281] Quando o dispositivo de formação de imagem está em foco sobre o padrão de foco automático (alvo) (painel B na Figura 15), os formatos como imageados pelo dispositivo são bem definidos e podem ser usados para foco automático conforme descrito aqui, ou seja para buscar a distância entre o alvo e o dispositivo de formação de imagem na qual os formatos produzem o contraste mais alto na amplitude entre pixels adjacentes localizados ao longo das linhas que cruzam os formatos, como as linhas mostradas como cabeças de seta. A configuração do foco ilustrada no painel B corresponde a uma configuração de foco análoga ilustrada na Figura 16A. Como ilustrado na Figura 16A, o plano focal do dispositivo de captura de imagem está alinhado com o alvo de foco automático, e por isso o dispositivo de captura de imagem está em uma posição para obter imagens agudas do alvo de foco automático.

[000282] Voltando a fazer referência à Figura 15, quando o local de trabalho (por exemplo, plano focal do dispositivo de formação de imagem) é movido na direção contrária ao padrão de foco automático (mostrado nos painéis A e C, mostrado a esquerda e a direita do padrão de foco automático na Figura 15), por exemplo, pelo ajuste da distância de trabalho da objetiva ou da distância entre a objetiva e seu plano focal, os formatos do alvo de foco agora saem de foco, e na posição onde o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é focalizado na corrente de amostra em forma de fita, os formatos do alvo de foco já não são mais discerníveis (consulte o painel D na Figura 15). A configuração do foco ilustrado no painel D pode corresponder a uma configuração de foco análoga ilustrada na Figura 16B. Como ilustrado na Figura 16B, o plano focal do dispositivo de captura de imagem está alinhado com a corrente de fluxo da amostra, e por isso o dispositivo de captura de imagem está em uma posição para obter imagens agudas das partículas na corrente de fluxo da amostra. O plano focal da Figura 16A é separado do plano focal da Figura 16B por uma distância D. Como mostrado na Figura 16B, pelo movimento do dispositivo de captura de imagem uma distância D é possível para mover também o plano focal a uma distância D, e por isso move o plano focal a partir do alvo de foco automático para a corrente de fluxo da amostra. Em alguns casos, o plano focal pode ser movido do alvo de foco automático para a corrente de fluxo da amostra pelo ajuste internamente da distância focal do dispositivo de captura de imagem enquanto mantém o dispositivo de captura de imagem em uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Em alguns casos, o plano focal pode ser movido do alvo de foco automático para a corrente de fluxo da amostra pelo ajuste internamente da distância focal do dispositivo de captura de imagem em combinação com o ajuste da posição do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Os formatos do foco automático podem ser fornecidos em qualquer local que está dentro da vista e é fixo em relação à célula de fluxo, tal como na abertura de iluminação ou janela, ou na frente ou atrás da porta de visualização ou janela através da qual o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é direcionado, ou em um acessório fixo à fotocélula para manter um alvo na posição a ser imageada.

[000283] De acordo com algumas modalidades, quando o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é movido ao longo da distância de deslocamento e o padrão de foco automático sai de foco, os elementos que aparecem em foco são as células do sangue em oposição ao padrão de foco automático. Na modalidade da Figura 15, o padrão de foco automático é definido por formatos no campo de visão. Os formatos são relativamente formas discretas finas de um tamanho limitado, e, portanto, após se moverem pela distância de deslocamento, as formas se tornam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizadas sobre a corrente de amostra em forma de fita. Uma distância de deslocamento típica pode ser, por exemplo, 50 a 100 μm em uma célula de fluxo dimensionada para aplicações de formação da imagem em hematologia (célula sanguínea). Em algumas modalidades, o recurso de foco automático mantém o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução dentro de 1 μm da distância de foco ideal.

[000284] Consequentemente, os recursos descritos na Figura 15 fornecem uma técnica exemplificadora para determinar uma distância de deslocamento. Por exemplo, um método para determinar uma distância de deslocamento pode incluir um processo de focalização automática que envolve injetar uma amostra de fluido de teste em um fluido de revestimento para formar uma corrente de fluxo da amostra de teste dentro de uma célula de fluxo, e obter uma primeira imagem focalizada do alvo de imageamento usando um dispositivo de captura de imagem. A primeira imagem focalizada pode corresponder ao painel B na Figura 15, onde o alvo de imageamento focalizado e o dispositivo de captura de imagem definem uma primeira distância focal. Como mostrado aqui, o plano focal ou distância/local de trabalho do dispositivo de captura de imagem é posicionado no alvo de imageamento. O processo de focalização automática também pode incluir obter uma segunda imagem focalizada da corrente de fluxo da amostra de teste usando o dispositivo de captura de imagem. A segunda imagem focalizada pode corresponder ao painel D na Figura 15, onde a corrente de fluxo da amostra de teste focalizada e o dispositivo de captura de imagem definem uma segunda distância focal. Como mostrado aqui, o plano focal ou distância/local de trabalho do dispositivo de captura de imagem é posicionado no alvo de imageamento. O processo de foco automático pode adicionalmente incluir obter uma distância de deslocamento pelo cálculo de uma diferença entre a primeira distância focal e a segunda distância focal. Em alguns casos, a amostra de fluido de teste é a mesma amostra de fluido sanguíneo e a corrente de fluxo da amostra de teste é a mesma que a corrente de fluxo da amostra. Em alguns casos, o processo de focalização automática estabelece um plano focal associado com o dispositivo de captura de imagem, e o plano focal permanece estacionário em relação ao dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o processo para foco automático do dispositivo de captura de imagem inclui determinar uma posição de foco ideal a partir de uma pluralidade de posições de foco.

[000285] De acordo com algumas modalidades, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado sobre a corrente de fluxo da amostra sem usar dados de temperatura. Por exemplo, um processo de focar o dispositivo de captura de imagem na corrente de fluxo da amostra pode ser realizado independentemente de uma temperatura do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, um alvo de imageamento pode incluir uma escala (por exemplo, como ilustrado na Figura 12B) para uso no posicionamento do eixo de imageamento do dispositivo de captura de imagem em relação à corrente de fluxo da amostra. Em alguns casos, o alvo de imageamento inclui uma íris alinhada em relação ao eixo de imageamento, de modo que as partículas da imagem são dispostas dentro de uma abertura definida pela íris, e uma ou mais porções de borda da íris são imageadas durante a focalização automática.

[000286] Nas modalidades exemplificadoras, técnicas de foco automático podem posicionar a célula de fluxo para dentro de ±1 μm a partir de uma posição focal ideal da corrente da amostra. Em alguns casos, as modalidades englobam técnicas de foco automático que podem automaticamente focar o sistema de formação de imagens sem a necessidade de um líquido ou solução de focalização separado ou qualquer intervenção do usuário. Técnicas de foco automático exemplificadoras também podem levar em conta causas mecânicas do desempenho de focalização sub ideal, como desvio ou expansão térmica que podem causar flutuações na distância entre a objetiva do dispositivo de imageamento e a célula de fluxo. Em alguns casos, observou-se que o local da amostra fluxo dentro da célula de fluxo pode ser muito estável e independente da temperatura. Por isso, as técnicas de formação da imagem exemplificadoras podem envolver a focalização sobre um alvo de imageamento na célula de fluxo, e usando um deslocamento fixo para conseguir o foco ideal na corrente da amostra.

[000287] De acordo com algumas modalidades, a objetiva do microscópio que é usado em um sistema de formação de imagem tem uma abertura numérica de 0,75, resultando em uma profundidade de campo teórica (DoF) de ± 0,5 μm. Em certos testes experimentais, observou-se que a boa qualidade da imagem poderia ser obtida a ±1,25 μm de um ponto focal ideal. Também observou-se que uma profundidade de campo prática ou experimental poderia ser diferente da profundidade de campo teórica. Por exemplo, em certos testes experimentais observou-se que a profundidade de campo estava em torno de 2,5 a 3 μm. Com base em certos estudos experimentais, foi constatado que o desempenho do foco automático para posicionamento da célula de fluxo dentro de ±1,25 μm poderia garantir boa qualidade da imagem. Em algumas modalidades, um sistema de foco automático pode funcionar para posicionar a célula de fluxo dentro de ±1 μm a partir de uma posição de foco ideal da corrente da amostra. Em certos testes experimentais, observou-se que as técnicas de focalização automática reveladas aqui podem localizar repetidamente um alvo em uma célula de fluxo com um desvio padrão de menos de 0,3 μm. Em alguns casos, as execuções do sistema de focalização automática de teste demonstraram excelente repetitividade (desvio padrão < 0,23 μm) e foram capazes de determinar a posição de foco da corrente da amostra dentro de <0,6 μm a partir de uma posição métrica otimizada que está dentro de uma tolerância de posição de ±1 μm. Execuções de testes de focalização automática em uma variedade de condições de temperatura também exibem excelente desempenho de posicionamento (por exemplo, posicionamento da célula de fluxo dentro de uma tolerância necessária de ± 1 μm e uma posição de foco ideal). Este grau de exatidão em um sistema de analisador automático é bem adequado para consistentemente e confiavelmente obter imagens de alta qualidade das partículas a partir de uma amostra de fluido sanguíneo fluindo em uma corrente de fluxo de fita fina como revelado em outro lugar aqui, sobre uma faixa de temperatura operacional correspondente às condições de laboratório padrão.

[000288] Cada dos cálculos ou operações aqui descritos pode ser feito com o uso de um computador ou outro processador que tenha hardware, software e/ou firmware. As várias etapas do método podem ser realizadas por módulos, e os módulos podem compreender qualquer uma dentre uma ampla variedade de hardware e/ou software de processamento de dados digitais e/ou analógicos dispostos para executar as etapas do método aqui descritas. Os módulos compreendem opcionalmente hardware de processamento de dados adaptado para executar uma ou mais dessas etapas tendo código de programação de máquina adequado associado ao mesmo, os módulos de duas ou mais etapas (ou porções de duas ou mais etapas) sendo integrados a uma única placa de processador ou separados em diferentes placas de processador em qualquer uma dentre uma ampla variedade de arquiteturas de processamento integrado e/ou distribuído. Esses métodos e sistemas com frequência usarão um meio tangível incluindo código legível por máquina com instruções para executar as etapas do método descrito acima. Os meios tangíveis adequados podem compreender uma memória (incluindo uma memória volátil e/ou uma memória não volátil), um meio de armazenamento (como uma gravação magnética em um disquete, um disco rígido, uma fita, ou similares; em uma memória óptica, como um CD, um CD-R/W, um CD-ROM, um DVD ou similares; ou qualquer outro meio de armazenamento digital ou analógico), ou similares.

[000289] Todas as patentes, publicações de patente, pedidos de patente, artigos de jornal, livros, referências técnicas e similares discutidos na presente descrição estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

[000290] As diferentes disposições dos componentes representados nos desenhos e descritos acima, bem como os componentes e etapas não mostrados ou descritos são possíveis. De modo similar, algumas características e subcombinações são úteis e podem ser usadas sem referência a outras características e subcombinações. As modalidades da invenção foram descritas para fins ilustrativos e não restritivos, e as modalidades alternativas serão evidentes para os leitores desta patente. Em certos casos, as etapas do método ou operações podem ser realizadas ou executadas em diferentes ordens, ou as operações poderão ser incluídas, deletadas ou modificadas. Pode ser entendido que, em determinados aspectos da invenção, um único componente pode ser substituído por múltiplos componentes, e múltiplos componentes podem ser substituídos por um único componente, para fornecer um elemento ou estrutura ou para executar uma determinada função ou funções. Exceto onde essa substituição não é operacional para praticar certas modalidades da invenção, essa substituição é considerada dentro do escopo da invenção. Consequentemente, a presente invenção não está limitada às modalidades acima descritas ou representadas nos desenhos, e várias modalidades e modificações podem ser feitas sem que se afaste do escopo das reivindicações abaixo.

Claims

1. Método para imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo (25) usando um sistema de análise de partícula configurado para a hidrofocalização geométrica, as partículas incluídas na amostra de fluido sanguíneo tendo uma viscosidade fluida da amostra, o método compreendendo: injetar a amostra de fluido sanguíneo (25) em uma trajetória de fluxo (422) da célula de fluxo (22, 33, 420) de modo que o líquido da amostra de fluido sanguíneo (25) flua em uma corrente de fluxo da amostra (32, 428) com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo, a corrente de fluxo da amostra fluindo através de uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo (21, 419a) e atravessando um eixo de imageamento (1450a); focalizar um dispositivo de captura de imagem (430) pelo imageamento de um alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c), em que o dispositivo de captura de imagem (430) tem um campo de visão e o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo (22, 33, 420) no campo de visão; e adquirir uma imagem focalizada das partículas, adequada para a caracterização e contagem de partículas, dentro da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem (430), sendo que o dispositivo de captura de imagem (24, 430) é focalizado na corrente de fluxo da amostra usando uma distância de deslocamento (52), caracterizado pelo fato de que o alvo do imageamento não é colocado dentro da corrente de fluxo da amostra e que a distância de deslocamento tem um valor maior que zero.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda o fluxo de um fluido de revestimento (426) ao longo da trajetória de fluxo (422) da célula de fluxo (22, 33, 420), sendo que o sistema de análise de partícula é configurado para viscosidade combinada e hidrofocalização geométrica, sendo que o fluido de revestimento (426) tem uma viscosidade do fluido de revestimento que difere da viscosidade fluida da amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa de diferença de viscosidade predeterminada, e sendo que a diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento (426) e amostra de fluido sanguíneo (25), em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo (21, 419a), é eficaz para hidrofocalizar a corrente de fluxo da amostra (32, 428) no eixo de imageamento (1450a), enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade das células na corrente de fluxo da amostra (32, 428) deixando a estrutura e teor das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluxo da amostra (32, 428) para dentro do fluido de revestimento que está fluindo (426).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c) está localizado em uma janela de porta de visualização (1482c) disposta entre a corrente de fluxo da amostra (32, 428) e o dispositivo de captura de imagem (24, 430), ou em que o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) é localizado entre uma janela de iluminação (1480c) e uma janela de porta de visualização (1482c), ou em que o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) compreende uma escala para uso no posicionamento do eixo de imageamento (1450a) do dispositivo de captura de imagem (430) em relação à corrente de fluxo da amostra (32, 428), ou em que o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) compreende uma íris (1010) alinhada em relação ao eixo de imageamento (1450a), de modo que as partículas imageadas são dispostas dentro de uma abertura (920) definida pela íris (1010), e uma ou mais porções de borda da íris (1010) são imageadas durante a focalização automática.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a aquisição da imagem focalizada compreende ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 33, 420) usando a distância de deslocamento (52).

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ajuste da distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 33, 420) compreende mover um componente do dispositivo de captura de imagem (24, 430) ou, e sendo que o componente compreende um membro selecionado a partir do grupo consistindo em uma lente de aumento e um conjunto compreendendo o dispositivo de captura de imagem (24, 430), ou. em que o ajuste da distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 420) compreende mover a célula de fluxo (22, 420), ou em que o ajuste da distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 420) compreende mover pelo menos um elemento óptico do dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 420).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a distância de deslocamento (52) é uma distância ao longo do eixo de imageamento (1450a) entre o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) e a corrente de fluxo da amostra (32, 428).

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda focalização automática, sendo que a etapa de focalização automática compreende: injetar uma amostra de fluido de teste (25) no fluido de revestimento (426) para formar uma corrente de fluxo da amostra de teste (32, 428) dentro da célula de fluxo (22, 33, 420); obter uma primeira imagem focalizada do alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) usando o dispositivo de captura de imagem (24, 430), o alvo de imageamento focalizado (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) e o dispositivo de captura de imagem (24, 430) definindo uma primeira distância focal (D1); obter uma segunda imagem focalizada da corrente de fluxo da amostra de teste (32, 428) usando o dispositivo de captura de imagem (24, 430), a corrente de fluxo da amostra de teste focalizada (32, 428) e o dispositivo de captura de imagem (24, 430) definindo uma segunda distância focal (D2); e obter a distância de deslocamento (52) pelo cálculo de uma diferença entre a primeira distância focal (D1) e a segunda distância focal (D2).

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender ainda: detectar um sinal de reiniciação de foco automático; repetir as etapas de focalização automática de aquisição de imagem em resposta ao sinal de reiniciação de foco automático.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o sinal de reiniciação de foco automático compreende um membro selecionado a partir do grupo consistindo em uma mudança na temperatura, uma diminuição na qualidade do foco, um intervalo de tempo decorrido, ou uma entrada do usuário.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de captura de imagem (24, 430) é focalizado na corrente de fluxo da amostra (32, 428) pela implementação de um ajuste rotacional entre a célula de fluxo (22, 33, 420) e o dispositivo de captura de imagem (24, 430).

11. Sistema de análise de partícula que realiza a hidrofocalização geométrica para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido sanguíneo, o sistema compreende: uma célula de fluxo (22, 33, 420) tendo uma trajetória de fluxo (422) com um tubo de injeção (29, 412) e uma janela de imageamento com um eixo de imageamento (1450a) através da mesma, a trajetória de fluxo (422) da célula de fluxo (22, 33, 420) tendo uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo; uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo (422); uma entrada de fluido do sangue em comunicação fluida com um tubo de injeção (29, 412), a entrada de fluido do sangue configurada para injetar a amostra de fluido sanguíneo (25) no fluido de revestimento que flui (426) para dentro da célula de fluxo (22, 33, 420) de modo que a amostra de fluido sanguíneo (25) flua em uma corrente de fluxo da amostra (32, 428) com uma largura de corrente de fluxo maior do que uma espessura de corrente de fluxo; um dispositivo de captura de imagem (24, 430); um mecanismo de focalização configurado para definir um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo (22, 33, 420); um alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo (22, 33, 420), quando a corrente de fluxo da amostra (32, 428) flui, o alvo de imageamento (44, 4000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) e a corrente de fluxo da amostra (32, 428) definindo uma distância de deslocamento (52) ao longo do eixo de imageamento (1450a); e um processador (440) para definir o estado focal do dispositivo de captura de imagem (430), adequado para a caracterização e contagem de partícula, usando a distância de deslocamento (52), caracterizado pelo fato de que o alvo do imageamento não é colocado dentro da corrente de fluxo de amostra e que a distância de deslocamento tem um valor maior que zero.

12. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sistema de análise de partícula é configurado para viscosidade combinada e hidrofocalização geométrica, sendo que o fluido de revestimento (426) tem uma viscosidade do fluido de revestimento que difere da viscosidade fluida da amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa de diferença de viscosidade predeterminada, e sendo que a diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento (426) e a amostra de fluido sanguíneo (25), em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para hidrofocalizar a corrente de fluxo da amostra (32, 428) no eixo de imageamento (1450a) enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade das células na corrente de fluxo da amostra (32, 428) deixando a estrutura e teor das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluxo da amostra (32, 428) para o fluido de revestimento que está fluindo (426).

13. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de focalização compreende um motor de acionamento (54) configurado para ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 420).

14. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) está localizado em uma janela de porta de visualização (1482c) disposta entre a corrente de fluxo da amostra (32, 428) e o dispositivo de captura de imagem (24, 430), ou em que o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 472c, 1474c) está localizado entre uma janela de iluminação (1480c) e uma janela de porta de visualização (1482c).

15. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sistema é configurado para adquirir a imagem focalizada pelo ajuste de uma distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 33, 420) usando a distância de deslocamento (52).

16. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sistema configurado para ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 33, 420) pelo movimento de um componente do dispositivo de captura de imagem (24, 430), e sendo que o componente compreende um membro selecionado a partir do grupo consistindo em uma lente de aumento, um espelho do dispositivo de captura de imagem, e um conjunto compreendendo o dispositivo de captura de imagem (24, 430), ou em que o sistema está configurado para ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 33, 420) movendo a célula de fluxo (22, 33, 420), ou em que o sistema está configurado para ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 33, 420) movendo pelo menos um elemento óptico do dispositivo de captura de imagem (24, 430) e a célula de fluxo (22, 33, 420).

17. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a distância de deslocamento (52) é uma distância ao longo do eixo de imageamento (1450a) entre o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) e a corrente de fluxo da amostra (32, 428).

18. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sistema é configurado para realizar uma etapa de focalização automática que inclui injetar uma amostra de fluido de teste (25) dentro do fluido de revestimento (426) para formar uma corrente de fluxo da amostra de teste (32, 428) dentro da célula de fluxo (22, 33, 420), obter uma primeira imagem focalizada do alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) usando o dispositivo de captura de imagem (24, 430), onde o alvo de imageamento focalizado (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) e o dispositivo de captura de imagem (24, 430) definem uma primeira distância focal (D1), obter uma segunda imagem focalizada da corrente de fluxo da amostra de teste (32, 428) usando o dispositivo de captura de imagem (24, 430), onde a corrente de fluxo da amostra de teste focalizada (32, 428) e o dispositivo de captura de imagem (24, 430) definem uma segunda distância focal (D2), e obter a distância de deslocamento (52) pelo cálculo de uma diferença entre a primeira distância focal (D1) e a segunda distância focal (D2).

19. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sistema é configurado para detectar um sinal de reiniciação de foco automático, e para repetir as etapas de focalização automática de aquisição de imagem em resposta ao sinal de reiniciação de foco automático.

20. Sistema, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o sinal de reiniciação de foco automático compreende um membro selecionado a partir do grupo consistindo em uma mudança na temperatura, uma diminuição na qualidade do foco, um intervalo de tempo decorrido, ou uma entrada do usuário.

21. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) compreende uma escala para uso no posicionamento do eixo de imageamento (1450a) do dispositivo de captura de imagem (24, 430) em relação à corrente de fluxo da amostra (32, 428), ou em que o alvo de imageamento (44, 1000, 1344, 1470, 1472c, 1474c) compreende uma íris (1010) alinhada em relação ao eixo de imageamento, de modo que as partículas da imagem são dispostas dentro de uma abertura (910) definida pela íris (1010), e uma ou mais porções de borda da íris (1010) são imageadas durante a focalização automática.

22. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sistema é configurado para focalizar o dispositivo de captura de imagem (24, 430) sobre a corrente de fluxo da amostra (32, 428) pela implementação de um ajuste rotacional entre a célula de fluxo (22, 33, 420) e o dispositivo de captura de imagem (24, 430).