BR112015021577B1 - Método para gerar imagens de uma pluralidade de partículas usando um sistema de análise de partícula configurado para hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados e sistema para gerar imagens de uma pluralidade de partículas em uma amostra de fluido de sangue - Google Patents

Método para gerar imagens de uma pluralidade de partículas usando um sistema de análise de partícula configurado para hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados e sistema para gerar imagens de uma pluralidade de partículas em uma amostra de fluido de sangue Download PDF

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Abstract

sistemas e métodos de hematologia. trata-se de aspectos e modalidades da presente revelação que fornecem um agente de alinhamento de organelas intracelulares e/ou de partícula para um analisador de partícula usado para analisar as partículas contidas em uma amostra. em que um agente de alinhamento de organelas intracelulares e/ou de partícula exemplificador inclui uma solução aquosa, um modificador de viscosidade e/ou um tampão. as modalidades também abrangem sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra que contém partículas. as partículas, tais como células de sangue podem ser categorizadas e contadas através de um processador de imagem digital. uma câmera microscópica digital pode ser direcionada, por exemplo, com o uso de determinadas técnicas de focalização, em uma célula de fluxo que define simetricamente uma trajetória de fluxo de estreitamento em que a corrente de amostra flui em uma fita achatada pelos parâmetros de fluxo e viscosidade entre as camadas de fluido de revestimento. as imagens de célula sanguínea podem ser coletadas e analisadas usando processos e sistemas de extensão de faixa dinâmica.

Description

REFERÊNCIAS REMISSIVAS AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para pedido de patente provisório n° U.S. 61/799.152 depositado no dia 15 de março de 2013 e também reivindica prioridade para os Pedidos de Patente nos14/215.834, 14/216.533, 14/216.339, 14/216.811 e 14/217.034 cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência. Este pedido também é relacionado aos Pedidos de Patente Internacional n°s PCT/US2014/030902, PCT/US2014/030928, PCT/US2014/030850, e PCT/US2014/030851 depositados no dia 17 de março de 2014, e PCT/US2014/030939 depositado no dia 18 de março de 2014. O conteúdo de cada um de tais depósitos está aqui incorporado, a título de referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Esta revelação refere-se ao campo de aparelho, sistemas, composições e métodos para análise de partículas, incluindo imageamento de partículas em amostras de fluido, com o uso de dispositivos completa ou parcialmente automatizados para discriminar e quantificar partículas, tais como células de sangue na amostra. A presente revelação também se refere a um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) útil para analisar partículas em uma amostra de um indivíduo, métodos para produzir o líquido e métodos para usar o líquido para detectar e analisar partículas. Composições, sistemas, dispositivos e métodos úteis para conduzir análise de amostra de fluido biológico com base em imagem também são apresentados. As composições, sistemas, dispositivos e métodos da presente revelação também são úteis para detectar, contar e caracterizar partículas em fluidos biológicos, tais como hemácias, reticulócitos, hemácias nucleadas, plaquetas, e para a contagem diferencial de glóbulos brancos com base morfológica e imagem, categorização, subcategorização, caracterização e/ou análise.
[003] A análise de célula de sangue é um dos testes médicos mais comumente realizados para fornecer uma visão geral da situação de saúde de um paciente. Uma amostra sanguínea pode ser extraída do corpo de um paciente e armazenada em um tubo de teste que contém um anticoagulante para evitar a coagulação. Uma amostra de sangue total normalmente compreende três classes principais de células de sangue incluindo hemácias (eritrócitos), glóbulos brancos (leucócitos) e plaquetas (trombócitos). Cada classe pode ser adicionalmente dividida em subclasses de membros. Por exemplo, cinco tipos principais ou subclasses de glóbulos brancos (WBCs) têm diferentes formatos e funções. Os glóbulos brancos podem incluir neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Existem, ainda, subclasses dos tipos de hemácia. Os aparecimentos de partículas em uma amostra podem ser diferentes de acordo com condições patológicas, maturidade de célula e outras causas. As subclasses de hemácia podem incluir reticulócitos e hemácias nucleadas.
[004] Uma contagem de células de sangue que estima a concentração de RBCs, WBCs ou plaquetas pode ser realizada manualmente ou com o uso de um analisador automático. Quando as contagens de célula de sangue são realizadas manualmente, uma gota de sangue é aplicada a uma lâmina para microscópio da espessura de um esfregaço. Tradicionalmente, a examinação manual de um esfregaço seco de sangue com coloração em uma lâmina para microscópio é usada para determinar o número ou quantidades relativas dos cinco tipos de glóbulos brancos. Os corantes e pigmentos histológicos foram usados para a coloração de células ou estruturas celulares. Por exemplo, o corante de Wright é um pigmento histológico que foi usado para a coloração de esfregaços de sangue para a examinação sob uma luz de microscópio. Uma Contagem de Sangue Total (CBC) pode ser obtida com o uso de um analisador automatizado, um tipo que conta a quantidade de partículas ou células diferentes em uma amostra sanguínea com base em impedância ou dispersão dinâmica de luz, conforme as partículas ou células passam através de uma área de detecção ao longo de um pequeno tubo. A CBC automatizada pode empregar instrumentos ou métodos para diferenciar entre diferentes tipos de células que incluem RBCs, WBCs e plaquetas (PLTs), que podem ser contadas separadamente. Por exemplo, uma técnica de contagem que exige um tamanho ou volume mínimo da partícula pode ser usada para contar apenas células grandes. Determinadas células, tais como células anormais no sangue podem não ser contadas ou identificadas corretamente. As células pequenas que se aderem entre si podem ser erroneamente contadas como uma célula grande. Quando suspeita-se de contagens errôneas, a revisão manual dos resultados do instrumento pode ser necessária para verificar e identificar as células.
[005] As técnicas de contagem de células de sangue automatizadas podem envolver citometria de fluxo. A citometria de fluxo envolve fornecer uma trajetória de fluxo estreita e detectar e contar a passagem de células de sangue individuais. Os métodos de citometria de fluxo foram usados para detectar partículas suspensas em um fluido, tais como células em uma amostra sanguínea, e para analisar as partículas quanto ao tipo, dimensão e distribuição de volume da partícula, de modo a inferir a concentração do respectivo tipo de partícula ou volume da partícula na amostra sanguínea. Os exemplos de métodos adequados para analisar as partículas suspensas em um fluido incluem sedimentação, caracterização microscópica, contagem com base em impedância e dispersão dinâmica de luz. Tais ferramentas estão sujeitas a erros de teste. Por outro lado, a caracterização precisa de tipos e de concentração de partículas pode ser crítica em aplicações, tais como no diagnóstico médico.
[006] Em técnicas de contagem com base no imageamento, as imagens de dados de pixel de uma amostra preparada que pode passar através de uma área de visualização são capturadas com o uso de uma lente objetiva de microscopia acoplada a uma câmera digital. Os dados de imagem de pixel podem ser analisados com o uso de técnicas de processamento de dados e, ainda, exibidos em um monitor.
[007] Os aspectos de sistemas de diagnóstico automatizados com células de fluxo são revelados na patente n° U.S. 6.825.926 de Turner et al. e nas patentes n°s U.S. 6.184.978; 6.424.415; e 6.590.646, todas de Kasdan et al., que estão aqui incorporadas, por referência, como se apresentadas completamente neste documento.
[008] Os sistemas automatizados com o uso de dispersão dinâmica de luz ou impedância foram usados para obter uma contagem de sangue total (CBC): A contagem de glóbulos brancos total (WBC), volume celular de hemácias total (distribuição de células vermelhas do sangue), HGB de hemoglobina (a quantidade de hemoglobina no sangue); volume médio de célula (MCV) (volume médio de hemácias); MPV (volume médio de PLT); hematócrito (HCT); MCH (HGB/células vermelhas do sangue) (a quantidade média de hemoglobina por hemácia); e MCHC (HGB/HCT) (a concentração média de hemoglobina nas células). Os processos automatizados ou parcialmente automatizados foram usados para facilitar a contagem diferencial de cinco partes de glóbulos brancos e análises de amostra sanguínea.
[009] Embora tais sistemas e métodos de análise de partícula, juntamente com técnicas relacionadas de diagnóstico médico, possam fornecer benefícios reais aos médicos, clínicos e pacientes, aprimoramentos adicionais ainda são desejáveis. Por exemplo, existe uma necessidade contínua de métodos e composições aprimorados úteis para o alinhamento de organela intracelular e/ou de partícula ao realizar a análise de amostras com base em imagem com o uso de sistemas automatizados. As modalidades da presente invenção fornecem soluções para pelo menos algumas de tais necessidades mais evidentes.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] As modalidades da presente invenção referem-se a aparelho, sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra preparada que contém partículas. Em alguns aspectos, o sistema compreende um analisador que pode ser um analisador visual. Em alguns aspectos, o aparelho contém um analisador visual e um processador. Em um aspecto, esta revelação se refere a um sistema de imageamento de partícula automatizado em que uma amostra líquida que contém partículas de interesse flui através de uma célula de fluxo que tem uma porta de visualização através da qual um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura uma imagem. Em alguns aspectos, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica compreende uma câmera, tal como uma câmera digital. Em um aspecto, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica compreende uma lente objetiva.
[0011] A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido de amostra, tal como uma amostra preparada, e a uma fonte de líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL). O sistema permite a captura de imagens focadas de partículas em uma amostra em fluxo. Em algumas modalidades, as imagens podem ser usadas em processos automatizados de alto rendimento para categorizar e subcategorizar partículas. Um analisador visual exemplificador pode incluir um processador para facilitar a análise automatizada das imagens. Em alguns casos, o analisador visual pode ser usado em métodos desta revelação para fornecer a contagem diferencial de WBC com base em imagem automatizada ou outros protocolos de análise de partícula de amostra sanguínea. Em alguns casos, os métodos desta revelação referem-se à identificação automatizada de anomalias morfológicas para determinar, diagnosticar, prognosticar, prever e/ou apoiar um diagnóstico para determinar se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, afecção, anomalia e/ou infecção e para monitorar se um indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento.
[0012] O PIOAL alinha partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo, o que resulta na otimização de imagem. O PIOAL também auxilia as células esféricas no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos substancialmente paralelos à direção de fluxo. Em algumas modalidades, as plaquetas, reticulócitos, RBCs nucleadas e WBCs, inclusive neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos e WBCs imaturos incluindo blástulas, promielócitos, mielócitos ou metamielócitos são contados e analisados como partículas.
[0013] As modalidades da presente invenção fornecem sistemas, métodos e composições de fluido de revestimento úteis para o alinhamento de organela intracelular e/ou de partícula em células tratadas com composições de agente de contraste de partícula. Tais técnicas superam certas dificuldades associadas aos fluidos de revestimento convencionais usados em citometria de fluxo que podem sofrer com desvantagens para manter a morfologia de célula e/ou não fornecer a captura de imagens otimizadas que permitam a determinação de um ou mais componentes de sangue.
[0014] Em certas modalidades, uma diferença de viscosidade e/ou diferença de velocidade entre uma corrente de amostra em formato de fita e um fluido de revestimento e/ou uma espessura da corrente de amostra em formato de fita, por exemplo, em combinação com um efeito de focalização geométrica fornecido por uma zona de transição da trajetória de fluxo em estreitamento, pode apresentar forças de cisalhamento para agir sobre as partículas enquanto em fluxo, fazendo, assim, com que as partículas se alinhem ou permaneçam em alinhamento ao longo de um processo de imageamento em um analisador visual. Em algumas modalidades, a amostra será acentuada por contraste. Em algumas modalidades, o fluido de revestimento pode compreender até 100% de um agente de viscosidade. Em uma outra modalidade, o fluido de revestimento tem até 60%, em v/v, de um agente de viscosidade. Dependendo dos tipos de agente de viscosidade usados, em algumas modalidades o fluido de revestimento pode compreender um agente de viscosidade que está comercialmente disponível na forma seca a uma concentração de cerca de 5 a 7%, ou mais especificamente, a 6,5% (peso por volume).
[0015] Em outras modalidades, esta revelação se refere a um fluido de revestimento que pode ser usado em análise de partículas com base em imagens em amostras tais como células e outros recursos de partícula em outros fluidos biológicos tais como fluido cerebrospinal e efusões associadas às afecções específicas. As contagens de categoria e/ou subcategoria de célula são descritas para uso em amostras de sangue nesta revelação como exemplos não limitadores do tipo de amostras que podem ser analisadas. Em algumas modalidades, as células presentes em amostras também podem incluir células bacterianas ou fúngicas assim como glóbulos brancos, hemácias ou plaquetas. Em algumas modalidades, as suspensões de partículas obtidas a partir de tecidos ou aspiradas podem ser analisadas.
[0016] Em algumas modalidades, uma corrente de fluido de amostra pode ser injetada através de uma cânula com uma fenda achatada para estabelecer uma trajetória de fluxo com uma largura considerável. O fluido de revestimento pode ser introduzido na célula de fluxo e transportar o fluido de amostra através da área de imageamento, em seguida, em direção a uma descarga. Um fluido de revestimento tem uma viscosidade diferente, por exemplo, superior ao fluido de amostra e, opcionalmente, uma taxa de fluxo diferente no ponto de injeção à corrente de amostra em formato de fita resulta no fluido de amostra de modo a achatar a um formato de fita fina. A fita fina de fluido de amostra é transportada juntamente com o fluido de revestimento, através de uma zona de transição da trajetória de fluxo em estreitamento para passar na frente de uma porta de visualização em que um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e uma fonte de luz estão dispostos para visualizar a corrente de amostra em formato de fita.
[0017] Em uma modalidade, a viscosidade do fluido de revestimento pode ser superior à viscosidade da amostra. A viscosidade do fluido de revestimento, a viscosidade do material de amostra, a taxa de fluxo do fluido de revestimento e a taxa de fluxo do material de amostra são coordenadas, por exemplo, em combinação com um efeito de compressão de fita fornecido por uma zona de transição de estreitamento, para fornecer o fluxo em uma corrente de amostra em formato de fita com características dimensionais predeterminadas, tais como espessura de corrente de amostra em formato de fita vantajosa. A manutenção de uma espessura de corrente de amostra em formato de fita vantajosa fornece, como um exemplo, uma alta porcentagem de células em foco ou componentes celulares em foco.
[0018] As modalidades da presente revelação têm por base, pelo menos em parte, a constatação de que a adição de uma quantidade adequada de um agente de viscosidade no fluido de revestimento aprimora significativamente o alinhamento de partícula/célula em uma célula de fluxo, por exemplo, em uma célula de fluxo que tem uma zona de transição de estreitamento e aumenta os conteúdos intracelulares em foco de células, de modo a resultar em imagens de alta qualidade de células em fluxo em comparação com o uso de um fluido de revestimento convencional não modificado pela viscosidade usado na citometria de fluxo. A adição do agente de viscosidade aumenta as forças de cisalhamento em partículas alongadas não esféricas ou células semelhantes às hemácias (RBCs) que, então, alinham as células em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, o que resulta na otimização de imagem. Para as células semelhantes aos glóbulos brancos (WBCs), isso resulta, ainda, no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos substancialmente paralelos à direção de fluxo. Por exemplo, os glóbulos brancos podem ser compressíveis ou deformáveis em resposta às forças de cisalhamento conferidas pelo agente ou diferencial de viscosidade levando, assim, ao alongamento ou compressão de partícula e alinhamento mediante o cisalhamento.
[0019] O alinhamento de partículas que são menores em diâmetro do que a corrente de fluxo pode ser obtido através do aumento da viscosidade do fluido de revestimento. Isso resulta em um alinhamento aprimorado das partículas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo.
[0020] A espessura de corrente de amostra em formato de fita pode ser afetada pelas viscosidades e taxas de fluxo relativas do fluido de amostra e o fluido de revestimento, por exemplo, em combinação com a geometria da zona de transição de estreitamento da célula de fluxo. A fonte de alimentação da amostra e/ou a fonte de alimentação do fluido de revestimento, por exemplo, que compreendem bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o fluido de revestimento a taxas de fluxo estáveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita, especialmente como uma fita fina pelo menos tão ampla quanto o campo de visualização do dispositivo de imageamento.
[0021] Uma modalidade de fluido de revestimento exemplificadora é usada em uma célula de fluxo para a análise de partícula. Uma amostra é envolta na corrente do fluido de revestimento e passada através da célula de fluxo do dispositivo analisador. Em seguida, as informações da amostra ao passar através da área de detecção são coletadas, de modo a possibilitar que um analisador analise as partículas/células contidas na amostra. O uso do fluido de revestimento em tal analisador permite a categorização e subcategorização e contagem precisas de células e/ou partículas contidas em amostras.
[0022] Conforme usado neste documento, o fluido de revestimento é útil na obtenção de informações em relação ao acompanhamento de células e/ou partículas relacionadas com as mesmas: incluindo, por exemplo; neutrófilo, linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo, plaqueta, reticulócito, células vermelhas do sangue nucleadas, blástula, promielócito, mielócito e/ou um metamielócito.
[0023] A presente revelação fornece composições inovadoras e métodos para o uso das mesmas para conduzir a análise de partícula. Em particular, a presente revelação se refere a um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) usado em um analisador para analisar as partículas em uma amostra. Os termos fluido de revestimento e PIOAL podem ser usados de forma intercambiável ao longo desta revelação. A presente revelação fornece adicionalmente métodos para produzir o PIOAL e métodos para usar o PIOAL para analisar partículas. O PIOAL desta invenção é útil, como um exemplo, em métodos para a categorização e subcategorização automatizadas de partículas em uma amostra.
[0024] Em um aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para gerar imagens de uma pluralidade de partículas com o uso de um sistema de análise de partícula. O sistema pode ser configurado para realizar o hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados. As partículas podem ser incluídas em uma amostra de fluido de sangue que tem uma viscosidade de fluido de amostra. Os métodos exemplificadores podem incluir fazer fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo e o fluido de revestimento pode ter uma viscosidade de fluido de revestimento diferente da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade. Os métodos também podem incluir injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento que flui no interior da célula de fluxo de modo a fornecer uma corrente de fluido de amostra envolta pelo fluido de revestimento. Ademais, os métodos podem incluir fazer fluir a corrente de fluido de amostra e o fluido de revestimento através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo em direção a um local de imageamento, de modo que um efeito de hidrofoco de viscosidade induzidos por uma interação entre o fluido de revestimento e a corrente de fluido de amostra associada à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e a corrente de fluido de amostra associada à redução no tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para fornecer um estado de imageamento- alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas no local de imageamento, enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade de células na corrente de fluido de amostra de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente. Além disso, os métodos podem incluir gerar imagens da pluralidade de partículas no local de imageamento. Em alguns casos, o fluido de revestimento tem como índice de refração n = 1,3330. Em alguns casos, o fluido de revestimento tem um índice de refração que é igual ao índice de refração da água. Em alguns casos, a interação entre o fluido de revestimento e a corrente de fluido de amostra associada à redução no tamanho da trajetória de fluxo contribui para fornecer o estado de imageamento-alvo através da produção de uma força de cisalhamento sobre a pluralidade de partículas. Em alguns casos, o estado de imageamento-alvo inclui uma orientação alvo da uma ou mais partículas-alvo no fluxo em relação ao plano focal de um dispositivo de imageamento usado para capturar imagens no local de imageamento.
[0025] De acordo com algumas modalidades, a trajetória de fluxo no local de imageamento define um plano que é substancialmente paralelo ao plano focal. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a um alinhamento-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, o alinhamento-alvo corresponde a um alinhamento de partícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, o alinhamento-alvo corresponde a um alinhamento de estrutura intrapartícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a uma posição-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo corresponde a uma posição de partícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo corresponde a uma posição de estrutura intrapartícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo é abrangida pelo plano focal. Em alguns casos, a posição-alvo está a uma distância do plano focal, em que a distância corresponde a uma tolerância de posição. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a um alinhamento-alvo em relação ao plano focal e uma posição-alvo em relação ao plano focal. Em alguns casos, o estado de imageamento- alvo corresponde a uma orientação-alvo de uma ou mais estruturas intrapartícula-alvo no fluxo em relação a um plano focal de um dispositivo de imageamento usado para capturar imagens no local de imageamento. Em alguns casos, a trajetória de fluxo no local de imageamento define um plano que é substancialmente paralelo ao plano focal. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a um alinhamento-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, o alinhamento-alvo corresponde a um alinhamento de partícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, o alinhamento-alvo corresponde a um alinhamento de estrutura intrapartícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a uma posição-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo corresponde a uma posição de partícula- alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo corresponde a uma posição de estrutura intrapartícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo é abrangida pelo plano focal. Em alguns casos, a posição-alvo está a uma distância do plano focal, em que a distância corresponde a uma tolerância de posição. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a um alinhamento-alvo em relação ao plano focal e uma posição-alvo em relação ao plano focal. Em alguns casos, o estado de imageamento-alvo corresponde a uma deformação-alvo de uma ou mais partículas-alvo ou de uma ou mais estruturas intrapartícula-alvo.
[0026] De acordo com algumas modalidades, o processo de injetar a amostra de fluido de sangue é realizado através do direcionamento de uma corrente da amostra de fluido de sangue através de uma amostra tubo de injeção com uma velocidade de fluido de amostra. O tubo de injeção pode ter uma porta na trajetória de fluxo. A porta pode definir uma largura, uma espessura e um eixo geométrico de fluxo que se estendem ao longo da trajetória de fluxo. A largura pode ser maior do que a espessura, de modo que a corrente de amostra tenha superfícies principais opostas transversais à trajetória de imageamento adjacente ao local de imageamento. Em alguns casos, o fluido de revestimento que flui ao longo da trajetória de fluxo da célula de fluxo se estende ao longo das superfícies principais da corrente de amostra e tem uma velocidade de fluido de revestimento diferente da velocidade de fluido de amostra. Em alguns casos, uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada às velocidades diferentes, em combinação com a interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada às viscosidades diferentes, fornece o estado de imageamento-alvo. De acordo com algumas modalidades, a pluralidade de partículas pode incluir uma hemácia, um glóbulo branco e/ou uma plaqueta. De acordo com algumas modalidades, a pluralidade de partículas pode incluir uma célula que tem uma estrutura intrapartícula. Em alguns casos, uma estrutura intrapartícula pode ser uma estrutura intracelular, uma organela ou um lóbulo.
[0027] Em algumas modalidades, o fluido de revestimento tem uma viscosidade entre 0,001 e 0,01 Pa.s (1 e 10 centipoise (cP)). Em alguns casos, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto em uma faixa de cerca de 0,0001 a cerca de 0,1 Pa.s (0,1 a cerca de 10 centipoise (cP)). Em alguns casos, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto em uma faixa de cerca de 0,001 a cerca de 0,009 Pa.s (1,0 a cerca de 9,0 centipoise (cP)). Em alguns casos, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto em uma faixa de cerca de 0,001 a cerca de 0,005 (1,0 a cerca de 5,0 centipoise (cP)). Em alguns casos, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto de cerca de 0,003 (3,0 centipoise (cP)). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol, derivado de glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol (diidroxipropano), poli(glicol etilênico), polivinilpirrolidona (PVP), carboximetilcelulose (CMC), polímero(s) solúvel(eis) em água e/ou dextrano. Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol a uma concentração entre cerca de 1 a cerca de 50% (v/v). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol e polivinilpirrolidona (PVP). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol a uma concentração de 5% (v/v) e glicerol e polivinilpirrolidona (PVP) a uma concentração de 1% (peso por volume). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol presente a uma concentração final entre cerca de 3 a cerca de 30% (v/v) sob condições de operação. Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol presente a uma concentração final de cerca de 30 % (v/v) sob condições de operação. Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol presente a uma concentração final de cerca de 6,5 % v/v sob condições de operação. Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol presente a uma concentração final de cerca de 5 % (v/v) e polivinilpirrolidona (PVP) presente a uma concentração de cerca de 1 % (peso por volume) sob condições de operação.
[0028] De acordo com algumas modalidades, a amostra de fluido de sangue no local de imageamento tem uma velocidade linear em uma faixa de 20 a 200 mm/segundo. Em alguns casos, a amostra de fluido de sangue no local de imageamento tem uma velocidade linear em uma faixa de 50 a 150 mm/segundo. Em alguns casos, a amostra de fluido de sangue tem uma espessura de corrente de amostra de até 7 μm e uma largura de corrente de amostra em uma faixa de 500 a 3.000 μm no local de imageamento. Em alguns casos, a amostra de fluido de sangue tem uma espessura de corrente de amostra em uma faixa de 2 a 4 μm e uma largura de corrente de amostra em uma faixa de 1.000 a 2.000 μm no local de imageamento. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui um conjunto de partículas não esféricas, a amostra de fluido de sangue tem uma direção de fluxo no local de imageamento e mais de 75% do conjunto de partículas não esféricas estão alinhadas substancialmente em um plano paralelo à direção de fluxo de modo que uma superfície principal de cada partícula não esférica alinhada esteja paralela ao plano paralelo à direção de fluxo. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui um conjunto de partículas não esféricas, em que a amostra de fluido de sangue tem uma direção de fluxo no local de imageamento e pelo menos 90% do conjunto de partículas não esféricas estão alinhados em 20 graus em relação a um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui estruturas intrapartículas, em que a amostra de fluido de sangue tem uma direção de fluxo no local de imageamento e pelo menos 92% das estruturas intrapartícula estão substancialmente paralelas à direção de fluxo.
[0029] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas para gerar imagens de uma pluralidade de partículas em uma amostra de fluido de sangue que tem uma viscosidade de fluido de amostra. O sistema pode ser configurado para uso com um fluido de revestimento que tem uma viscosidade de fluido de revestimento que difere da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo e um tubo de injeção de fluido de amostra, em que a trajetória de fluxo tem uma redução no tamanho da trajetória de fluxo, uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo da célula de fluxo de modo a transmitir um fluxo do fluido de revestimento ao longo da trajetória de fluxo da célula de fluxo, e uma entrada de amostra de fluido de sangue em comunicação fluida com o tubo de injeção da célula de fluxo de modo a injetar um fluxo da amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento que flui no interior da célula de fluxo, de modo que conforme o fluido de revestimento e o fluido de amostra fluem através da redução no tamanho da trajetória de fluxo e em direção a um local de imageamento, um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e um fluido de amostra associada à redução no tamanho da trajetória de fluxo, forneça um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas no local de imageamento enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade das células na corrente de fluido de amostra de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente. Os sistemas podem incluir, adicionalmente, um dispositivo de imageamento que forma imagens da pluralidade de partículas no local de imageamento.
[0030] De acordo com algumas modalidades, o estado de imageamento-alvo corresponde a uma orientação-alvo de uma ou mais partículas-alvo no fluxo em relação a um plano focal de um dispositivo de imageamento usado para adquirir imagens no local de imageamento. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui um membro selecionado do grupo que consiste em uma hemácia, um glóbulo branco e uma plaqueta. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui uma célula que tem uma estrutura intrapartícula. Uma estrutura intracelular pode ser uma estrutura intracelular, uma organela ou um lóbulo. Em alguns casos, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto em uma faixa de cerca de 0,0001 a cerca de 0,1 Pa.s (0,1 a cerca de 10 centipoise (cP)). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol, um derivado de glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol (diidroxipropano), poli(glicol etilênico), polivinilpirrolidona (PVP), carboximetilcelulose (CMC), polímero(s) solúvel(eis) em água e/ou dextrano. Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol a uma concentração entre cerca de 1 a cerca de 50% (v/v). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol e polivinilpirrolidona (PVP). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol a uma concentração de 5% (v/v) e glicerol e polivinilpirrolidona (PVP) a uma concentração de 1% (peso por volume).
[0031] De acordo com algumas modalidades, a pluralidade de partículas inclui um conjunto de partículas não esféricas, a amostra de fluido de sangue tem uma direção de fluxo no local de imageamento e pelo menos 90% do conjunto de partículas não esféricas estão alinhados a 20 graus em relação a um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a uma orientação de partícula-alvo em relação a um plano focal no local de imageamento. Uma partícula pode ser uma hemácia, um glóbulo branco ou uma plaqueta em algumas modalidades. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a uma orientação de estrutura intrapartícula-alvo em relação a um plano focal no local de imageamento. (por exemplo, a estrutura intrapartícula pode ser uma estrutura intracelular, uma organela ou um lóbulo). Em alguns casos, a trajetória de fluxo no local de imageamento define um plano que é substancialmente paralelo ao plano focal. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a um alinhamento-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, o alinhamento- alvo corresponde a um alinhamento de partícula-alvo em relação a um plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, o alinhamento- alvo corresponde a um alinhamento de estrutura intrapartícula-alvo em relação a um plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a uma posição-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo corresponde a uma posição de partícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo corresponde a uma posição de estrutura intrapartícula-alvo em relação ao plano focal no local de imageamento. Em alguns casos, a posição-alvo é abrangida pelo plano focal. Em alguns casos, a posição-alvo está a uma distância do plano focal, em que a distância corresponde a uma tolerância de posição. Em alguns casos, a orientação-alvo corresponde a um alinhamento-alvo em relação ao plano focal e uma posição-alvo em relação ao plano focal. Em alguns casos, o estado de imageamento- alvo corresponde a uma deformação-alvo no local de imageamento.
[0032] De acordo com algumas modalidades, uma fonte de amostra de fluido de sangue pode ser configurada para fornecer para a amostra de fluido de sangue uma velocidade de fluido de amostra para dentro do fluido de revestimento fluente, de modo que o fluido de revestimento tenha uma velocidade de fluido de revestimento que é diferente da velocidade de fluido de amostra. Em alguns casos, uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada às velocidades diferentes, em combinação com a interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada às viscosidades diferentes, fornece o estado de imageamento-alvo.
[0033] De acordo com algumas modalidades, a trajetória de fluxo da célula de fluxo inclui uma zona com uma alteração no tamanho da trajetória de fluxo e uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada à alteração no tamanho da trajetória de fluxo, em combinação com a interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada às viscosidades diferentes, fornece o estado de imageamento-alvo. Em alguns casos, a interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada à alteração no tamanho da trajetória de fluxo contribui para fornecer o estado de imageamento-alvo através da produção de uma força de compressão de fluido lateral. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui uma hemácia, um glóbulo branco e/ou uma plaqueta. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui uma célula que tem uma estrutura intrapartícula e a estrutura pode ser uma estrutura intracelular, uma organela ou um lóbulo.
[0034] De acordo com algumas modalidades, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto em uma faixa de cerca de 0,0001 a cerca de 0,01 Pa.s (0,1 a cerca de 10 centipoise (cP)). Em alguns casos, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto em uma faixa de cerca de 0,001 a cerca de 0,009 Pa.s (1,0 a cerca de 9,0 centipoise (cP)). Em alguns casos, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto em uma faixa de cerca de 0,001 a cerca de 0,005 (1,0 a cerca de 5,0 centipoise (cP)). Em alguns casos, a diferença predeterminada de viscosidade tem um valor absoluto de cerca de 0,003 Pa.s (3,0 centipoise (cP)). Em alguns casos, o fluido de revestimento inclui um agente de viscosidade que pode incluir glicerol, um derivado de glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol (diidroxipropano), poli(glicol etilênico), polivinilpirrolidona (PVP), carboximetilcelulose (CMC), polímero(s) solúvel(eis) em água e/ou dextrano. Em alguns casos, o fluido de revestimento compreende glicerol a uma concentração entre cerca de 1 a cerca de 50% (v/v).
[0035] De acordo com algumas modalidades, a amostra de fluido de sangue no local de imageamento tem uma velocidade linear em uma faixa de 20 a 200 mm/segundo. Em alguns casos, a amostra de fluido de sangue no local de imageamento tem uma velocidade linear em uma faixa de 50 a 150 mm/segundo. Em alguns casos, a amostra de fluido de sangue tem uma espessura de corrente de amostra de até 7 μm e uma largura de corrente de amostra de mais de 500 μm no local de imageamento. Em alguns casos, a amostra de fluido de sangue tem uma espessura de corrente de amostra em uma faixa de 2 a 4 μm e uma largura de corrente de amostra em uma faixa de 1.000 a 2.000 μm no local de imageamento. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui um conjunto de partículas não esféricas, a amostra de fluido de sangue tem uma direção de fluxo no local de imageamento e pelo menos 90% do conjunto de partículas não esféricas estão alinhadas e/ou posicionadas substancialmente em um plano paralelo à direção de fluxo. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui um conjunto de partículas não esféricas, em que a amostra de fluido de sangue tem uma direção de fluxo no local de imageamento e pelo menos 95% do conjunto de partículas não esféricas estão alinhadas a 20 graus em relação a um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em alguns casos, a pluralidade de partículas inclui estruturas intrapartícula, em que a amostra de fluido de sangue tem uma direção de fluxo no local de imageamento e pelo menos 92% das estruturas intrapartícula são substancialmente paralelas à direção de fluxo.
[0036] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem um líquido de alinhamento de organela intracelular e partícula (PIOAL) para uso em um analisador de hidrofoco geométrico e de viscosidade combinados. O PIOAL pode direcionar um fluxo de um fluido de amostra sanguínea de uma determinada viscosidade que é injetado em uma zona de transição de célula de fluxo estreita do analisador visual, de modo a produzir uma corrente de fluido de amostra envolta pelo PIOAL. O PIOAL pode incluir um fluido que tem uma viscosidade superior à viscosidade do fluido de amostra sanguínea. Um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido de amostra associada à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido de amostra associada à zona de transição de célula de fluxo estreita, é eficaz para fornecer um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas em um local de imageamento do analisador visual enquanto um agente de viscosidade no PIOAL mantém a viabilidade de células na corrente de fluido de amostra de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente. Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol, um derivado de glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol (diidroxipropano), poli(glicol etilênico), polivinilpirrolidona (PVP), carboximetilcelulose (CMC), polímero(s) solúvel(eis) em água e/ou dextrano. Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol a uma concentração entre cerca de 1 a cerca de 50% (v/v). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui polivinilpirrolidona (PVP). Em alguns casos, a polivinilpirrolidona (PVP) está a uma concentração de 1% (peso por volume). Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui, adicionalmente, glicerol. Em alguns casos, o agente de viscosidade do fluido de revestimento inclui glicerol a uma concentração de 5% (v/v) e glicerol e polivinilpirrolidona (PVP) a uma concentração de 1% (peso por volume). Em alguns casos, o PIOAL tem uma viscosidade entre cerca de 0,001 a 0,01 Pa.s (1 a 10 cP).
[0037] Em ainda outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem um líquido de alinhamento de organela intracelular e partícula (PIOAL) para uso em um analisador visual configurado para direcionar o fluxo de uma amostra de uma determinada viscosidade em uma trajetória de fluxo. O PIOAL pode incluir um fluido que tem uma viscosidade superior à viscosidade do fluido da amostra. O PIOAL pode ser eficaz para sustentar o fluxo da amostra e para alinhar as partículas e aumentar o conteúdo em foco de partículas e organelas intracelulares de células que fluem na trajetória de fluxo, por meio do qual as partículas e organelas intracelulares alinhadas das células podem ser imageadas. Em alguns casos, o PIOAL inclui, adicionalmente, um agente de viscosidade. Em alguns casos, o PIOAL inclui, adicionalmente, um tampão, um agente de ajuste de pH, um agente antimicrobiano, um modificador de força iônica, um tensoativo e/ou um agente quelante. Em alguns casos, o líquido de alinhamento de organela intracelular e partícula é isotônico. Em alguns casos, o líquido de alinhamento de organela intracelular e partícula inclui cloreto de sódio. Em alguns casos em que o cloreto de sódio está presente a uma concentração de cerca de 0,9%. Em alguns casos, o pH da amostra de PIOAL está entre cerca de 6,0 a cerca de 8,0 sob condições de operação. Em alguns casos, o pH da mistura de amostra de PIOAL é entre cerca de 6,5 a cerca de 7,5 sob condições de operação. Em alguns casos, o PIOAL inclui um agente de ajuste de pH para ajustar o pH entre cerca de 6,8 a cerca de 7,2 sob condições de operação. Em alguns casos, o líquido PIOAL tem uma viscosidade-alvo entre cerca de 0,001 a 0,01 (1 a 10 centipoise) sob condições de operação.
[0038] Em ainda mais outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem uma solução de estoque de PIOAL concentrado. Em alguns casos, a solução de estoque concentrada pode ser diluída para alcançar a viscosidade-alvo. Em alguns casos, a concentração da solução de estoque está presente a pelo menos cerca de 1,1x para pelo menos cerca de 100x de concentração do PIOAL sob condições de operação. Em alguns casos, 139.
[0039] O PIOAL da reivindicação 127, em que o agente de viscosidade é selecionado de pelo menos um dentre glicerol, derivado de glicerol; PVP, CMC, etilenoglicol; propilenoglicol (diidroxipropano); poli(glicol etilênico); polímero solúvel em água e dextrano. Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui glicerol. Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui glicerol e polivinilpirrolidona (PVP). Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui glicerol e carboximetilcelulose (CMC). Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui glicerol e sulfato de dextrano. Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui um derivado de glicerol. Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui PVP. Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui propilenoglicol (diidroxipropano). Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui poli(glicol etilênico). Em alguns casos, o agente de viscosidade inclui dextrano solúvel em água. Em alguns casos, o glicerol está presente a uma concentração final entre cerca de 1 a cerca de 50% (v/v) sob condições de operação. Em alguns casos, o dito glicerol está presente a uma concentração final entre cerca de 3 a cerca de 30% (v/v) sob condições de operação. Em alguns casos, o dito glicerol está presente a uma concentração final de cerca de 30 % (v/v) sob condições de operação. Em alguns casos, o dito glicerol está presente a uma concentração final de cerca de 6,5 % v/v sob condições de operação. Em alguns casos, o dito glicerol está presente a uma concentração final de cerca de 5 % v/v e a PVP está presente a uma concentração de cerca de 1 %, peso por volume, sob condições de operação. Em alguns casos, a dita PVP está presente a uma concentração final de cerca de 1 %, peso por volume, sob condições de operação. Em alguns casos, as modalidades da presente invenção abrangem kits que incluem um PIOAL conforme revelado neste documento.
[0040] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para analisar uma pluralidade de células em uma amostra de fluido de sangue que tem uma viscosidade de fluido de amostra, em que as células têm superfícies principais opostas. Os métodos exemplificadores podem incluir fazer fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo. O fluido de revestimento pode ter uma viscosidade de fluido de revestimento superior à viscosidade de fluido de amostra. Os métodos também podem incluir injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento que flui no interior da célula de fluxo. A pluralidade de células pode incluir um primeiro subconjunto com superfícies principais orientadas de modo transversal em relação a uma orientação de uma trajetória de imageamento. Os métodos também podem incluir gerar imagens das partículas ao longo da trajetória de imageamento em um local de imageamento enquanto a pluralidade de células inclui um segundo subconjunto com as superfícies principais orientadas de modo transversal em relação à trajetória de imageamento, em que o segundo subconjunto é mais numeroso do que o primeiro subconjunto. Os métodos também podem incluir direcionar a amostra sanguínea fluida e o fluido de revestimento através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo de modo que uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra associada às viscosidades diferentes reorienta pelo menos uma parte da pluralidade de células, de modo que o segundo subconjunto é mais numeroso que o primeiro subconjunto.
[0041] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas para gerar imagens de uma pluralidade de células em uma amostra de fluido de sangue que tem uma viscosidade de fluido de amostra. Os sistemas podem ser configurados para uso com um fluido de revestimento que tem uma viscosidade de fluido de revestimento superior à viscosidade de fluido de amostra, em que as células têm superfícies principais opostas. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo e um tubo de injeção de fluido de amostra, uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo da célula de fluxo de modo a transmitir um fluxo do fluido de revestimento ao longo da trajetória de fluxo da célula de fluxo e uma entrada de amostra de fluido de sangue em comunicação fluida com o tubo de injeção da célula de fluxo de modo a injetar um fluxo da amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento que flui no interior da célula de fluxo, de modo que a pluralidade das células injetadas inclui um primeiro subconjunto com superfícies principais alinhadas transversalmente a uma orientação de uma trajetória de imageamento. Em alguns casos, a trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma zona com uma alteração no tamanho da trajetória de fluxo configurada de modo que uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra sanguínea associada às viscosidades diferentes reoriente pelo menos uma parte das partículas. Os sistemas também podem incluir um dispositivo de imageamento que forma imagens da pluralidade de partículas ao longo da trajetória de imageamento em um local de imageamento enquanto as superfícies principais do segundo subconjunto da pluralidade de células são orientadas de modo transversal em relação à trajetória de imageamento.
[0042] Em um aspecto, esta invenção se refere a um método para gerar imagens de uma partícula que compreende: tratar partículas em uma amostra com o uso das composições de agente de contraste de partícula desta revelação; iluminar a partícula com coloração com luz em um analisador visual que compreende uma célula de fluxo e aparelho de foco automático; obter uma imagem digitalizada da partícula envolta em um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL); e; analisar uma partícula na amostra com base nas informações de imagem. Em algumas modalidades, a partícula é selecionada de pelo menos um dentre neutrófilo, linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo, plaqueta, reticulócito, hemácia nucleada (células vermelhas do sangue), blástula, promielócito, mielócito, metamielócito, hemácia (células vermelhas do sangue), plaqueta, célula, bactérias, matéria particulada, nódulo de célula ou fragmento ou componente celular. Por exemplo, em algumas modalidades, o aparelho pode ser usado para a contagem diferencial de glóbulos brancos (WBC) com base em imagem automatizada, assim como identificação automatizada de anomalias morfológicas úteis na determinação, diagnóstico, prognóstico, previsão e/ou sustentação de um diagnóstico para determinar se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, afecção ou infecção e/ou é responsivo ou não responsivo ao tratamento.
[0043] Em um aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para gerar imagens de partículas com o uso de um sistema de análise de partícula que é configurado para realizar o hidrofoco geométrico e de viscosidade combinados. As partículas podem ser incluídas em um primeiro e segundo fluidos de amostra de uma amostra de fluido de sangue. Os métodos exemplificadores podem incluir fazer fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo do analisador de partícula e o fluido de revestimento pode ter uma viscosidade que é diferente de uma viscosidade da amostra de fluido de sangue. Em alguns casos, o fluido de revestimento tem uma viscosidade de fluido de revestimento que difere da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade e a diferença de viscosidade tem um valor em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade. Os métodos também podem incluir injetar o primeiro fluido de amostra de um tubo de injeção de fluido de amostra no fluido de revestimento que flui no interior da célula de fluxo de modo a fornecer uma corrente de fluido de amostra que tem uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção. A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo de modo que a espessura da corrente de fluido de amostra diminui em relação à espessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um local de captura de imagem. Os métodos podem incluir, adicionalmente, gerar imagens de uma primeira pluralidade das partículas do primeiro fluido de amostra no local de captura de imagem da célula de fluxo e iniciar os transientes de fluido de amostra através da interrupção da injeção do primeiro fluido de amostra no fluido de revestimento que flui e injetar o segundo fluido de amostra no fluido de revestimento fluente. Além disso, os métodos podem incluir gerar imagens de uma segunda pluralidade das partículas do segundo fluido de amostra no local de captura de imagem da célula de fluxo. O imageamento da segunda pluralidade de partículas pode ser realizado substancialmente após os transientes de fluido de amostra e em até 4 segundos após o imageamento da primeira pluralidade das partículas. Em alguns casos, a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo é definida por uma porção proximal de trajetória de fluxo que tem uma espessura proximal e uma porção distal de trajetória de fluxo que tem uma espessura distal menor que a espessura proximal. Uma extremidade a jusante do tubo de injeção de fluido de amostra pode estar posicionada distal em relação à porção proximal de trajetória de fluxo. A diferença de viscosidade entre as amostras de fluido de sangue e revestimento, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, pode ser eficaz para o hidrofoco do primeiro e segundo fluidos de amostra no local de captura de imagem, enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade das células no primeiro e segundo fluidos de amostra de modo a deixar a estrutura e conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente.
[0044] Em alguns métodos, o tubo de injeção pode incluir um volume interno com base em uma razão de um corte transversal de área de fluxo do tubo de injeção para um corte transversal de área de fluxo da célula de fluxo, uma razão do corte transversal de área de fluxo do tubo de injeção para um diâmetro externo da célula de fluxo ou uma razão do corte transversal de área de fluxo do tubo de injeção para um corte transversal de área de fluxo da corrente de amostra. Em alguns casos, a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo pode ser definida por paredes opostas da trajetória de fluxo que formam uma angulação radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo, de modo geral simétrica ao redor de um plano transversal que bissecciona as primeira e segunda espessuras da corrente de fluido de amostra. Em alguns casos, a simetria da diminuição no tamanho da trajetória de fluxo é eficaz para limitar o desalinhamento de orientação de imageamento de hemácias na amostra de fluido de sangue a menos de cerca de 20%. Em alguns casos, a amostra de fluido de sangue inclui partículas esféricas, e um diferencial de viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento é eficaz para alinhar as organelas intracelulares das partículas esféricas em um plano focal no local de captura de imagem da célula de fluxo. Em alguns casos, uma porção distal do tubo de injeção de fluido de amostra é posicionada a uma distância de separação axial do local de captura de imagem e a distância de separação axial tem um valor em uma faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em alguns casos, o tubo de injeção tem um volume interno menor que cerca de 30 μL.
[0045] Em alguns métodos, o tubo de injeção tem uma porção proximal que tem uma primeira área em corte transversal de fluxo e uma porção distal que tem uma segunda área em corte transversal de fluxo e a área em corte transversal de fluxo da porção proximal é maior que 1,5 vez a área em corte transversal de fluxo da porção distal. Em alguns métodos, o tubo de injeção tem uma porção central disposta entre a porção proximal e a porção distal, em que a porção central tem um terceiro corte transversal de fluxo e o terceiro corte transversal de fluxo é maior que o primeiro e segundo cortes transversais de fluxo.
[0046] Em alguns métodos, uma porção distal do tubo de injeção de fluido de amostra inclui uma porta de saída que tem uma altura e uma largura e a altura pode ser menor que a largura. Em alguns casos, a altura é cerca de 150 μm e a largura é cerca de 1350 μm. Em alguns casos, a altura tem um valor em uma faixa de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm e a largura tem um valor em uma faixa de cerca de 500 μm a cerca de 3000 μm.
[0047] Em alguns métodos, uma razão do fluido de revestimento taxa de fluxo para o fluido de taxa de fluxo de amostra é cerca de 70. Em alguns casos, a razão do fluido de revestimento taxa de fluxo para o fluido de taxa de fluxo de amostra é cerca de 200. Em alguns casos, o fluido de revestimento tem uma taxa de fluxo de cerca de 35 μL/s e o fluido de amostra tem uma taxa de fluxo de cerca de 0,5 μL/s. Em alguns casos, o fluido de amostra tem uma velocidade entre cerca de 20 e 200 mm/segundo no local de captura de imagem. Em alguns casos, a velocidade de fluido de revestimento e a velocidade de amostra de fluido podem ser diferentes em uma posição de trajetória de fluxo próxima à porta de saída de tubo de injeção e a velocidade de fluido de revestimento e a velocidade de amostra de fluido podem ser iguais no local de captura de imagem. Em alguns casos, a primeira espessura da corrente de fluido de amostra tem cerca de 150 μm, por exemplo onde o fluido de amostra sai do tubo de injeção. Em alguns casos, a segunda espessura da corrente de fluido de amostra está em uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm, por exemplo, onde a corrente de fluido de amostra flui através do local de captura de imagem. Em alguns casos, a segunda espessura da corrente de fluido de amostra está em uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 4 μm. Em alguns casos, uma razão da primeira espessura da corrente de fluido de amostra para a segunda espessura da corrente de fluido de amostra tem um valor em uma faixa de cerca de 20:1 a cerca de 70:1. Em alguns casos, uma razão da primeira espessura da corrente de fluido de amostra para a segunda espessura da corrente de fluido de amostra tem um valor em uma faixa de cerca de 5:1 a cerca de 200:1. Em alguns casos, uma razão da espessura proximal da porção proximal de trajetória de fluxo para a espessura distal da porção distal de trajetória de fluxo tem um valor de adelgaçamento geométrico selecionado do grupo que consiste em 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 e 200:1. Em alguns casos, a célula de fluxo tem uma razão de compressão mínima de cerca de 50:1 e uma razão de compressão máxima de cerca de 125:1.
[0048] Em alguns métodos, a célula de fluxo é orientada de modo que o fluido de amostra e o fluido de revestimento que fluem no interior da célula de fluxo fluam contra a gravidade. Em alguns casos, a célula de fluxo é orientada de modo que o fluido de amostra e o fluido de revestimento que fluem no interior da célula de fluxo fluam com a gravidade. Os métodos exemplificadores podem, também, incluir remover bolhas do fluido de amostra fluente. Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado em cerca de 1 a 3 segundos após a injeção do primeiro fluido de amostra do tubo de injeção de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente. Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado em menos que 1 segundo após a injeção do primeiro fluido de amostra do tubo de injeção de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente. Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado em cerca de 1,8 segundos após a injeção do primeiro fluido de amostra do tubo de injeção de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente. Em alguns casos, o fluido de amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo em uma faixa de cerca de 2 a 4 segundos. Em alguns casos, o local de captura de imagem tem um campo de visão entre cerca de 150 μm x 150 μm e 400 μm x 400 μm. Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra tem um volume em uma faixa de cerca de 50 a cerca de 150 μL. Em alguns casos, uma porção proximal do tubo de injeção está acoplada a uma porta de amostra de um encaixe de entrada de amostra.
[0049] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas de análise de partícula que realizam o hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue. As partículas podem ser incluídas em um primeiro e segundo fluidos de amostra. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo configurada para transmitir um fluxo do fluido de revestimento. O fluido de revestimento pode ter uma viscosidade que é diferente de uma viscosidade da amostra de fluido de sangue. Em alguns casos, a viscosidade de fluido de revestimento é maior que a amostra de fluido de sangue viscosidade. Em alguns casos, o fluido de revestimento tem uma viscosidade de fluido de revestimento que difere da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade e a diferença de viscosidade tem um valor em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade. Os sistemas podem, também, incluir um sistema de injeção de fluido de amostra em comunicação fluida com a trajetória de fluxo. O sistema de injeção de fluido de amostra pode ser configurado para injetar os fluidos de amostra no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo de modo a fornecer uma corrente de fluido de amostra que tem uma primeira espessura adjacente do tubo de injeção. A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo de modo que a espessura da corrente de fluido de amostra diminui em relação à espessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um local de captura de imagem. Ademais, os sistemas podem incluir um dispositivo de captura de imagem alinhado com o local de captura de imagem de modo a gerar imagens de uma primeira pluralidade das partículas do primeiro fluido de amostra no local de captura de imagem da célula de fluxo. Além disso, os sistemas podem incluir um processador acoplado ao sistema injetor de fluido de amostra e ao dispositivo de captura de imagem. O processador pode ser configurado para interromper uma injeção do primeiro fluido de amostra no fluido de revestimento fluente e injetar o segundo fluido de amostra no fluido de revestimento fluente de modo que os transientes de fluido de amostra sejam iniciados, e para gerar imagens de uma segunda pluralidade das partículas do segundo fluido de amostra no local de captura de imagem da célula de fluxo após os transientes de fluido de amostra e em 4 segundos após o imageamento da primeira pluralidade das partículas. Em sistemas exemplificadores, a diferença de viscosidade entre as amostras de fluido de sangue e revestimento, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para realizar o hidrofoco do primeiro e segundo fluidos de amostra no local de captura de imagem da célula de fluxo, enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade de células no primeiro e segundo fluidos de amostra de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente.
[0050] Em alguns sistemas, o tubo de injeção inclui um volume interno com base em uma razão de um corte transversal de área de fluxo do tubo de injeção para um corte transversal de área de fluxo da célula de fluxo, uma razão do corte transversal de área de fluxo do tubo de injeção para um diâmetro externo da célula de fluxo ou uma razão do corte transversal de área de fluxo do tubo de injeção para um corte transversal de área de fluxo da corrente de amostra. Em alguns casos, a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo é definida por paredes opostas da trajetória de fluxo que formam uma angulação radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo, de modo geral simétrica ao redor de um plano transversal que bissecciona as primeira e segunda espessuras da corrente de fluido de amostra. Em alguns casos, a simetria da diminuição no tamanho da trajetória de fluxo é eficaz para limitar o desalinhamento de orientação de imageamento de hemácias na amostra de fluido de sangue a menos de cerca de 20%. Em alguns casos, uma porção distal do tubo de injeção de fluido de amostra é posicionada a uma distância de separação axial do local de captura de imagem e a distância de separação axial tem um valor em uma faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em alguns casos, o tubo de injeção inclui uma porção proximal que tem uma primeira área em corte transversal de fluxo e uma porção distal que tem uma segunda área em corte transversal de fluxo e a área em corte transversal de fluxo da porção proximal é maior que 1,5 vez a área em corte transversal de fluxo da porção distal. Em alguns casos, o fluido de amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo em uma faixa de cerca de 2 a 4 segundos. Em alguns casos, a célula de fluxo está configurada para receber o fluido de revestimento de uma fonte de fluido de revestimento na trajetória de fluxo em uma primeira direção de fluxo que é perpendicular à segunda direção de fluxo do fluido de revestimento ao longo da trajetória de fluxo no local de imageamento. Em alguns casos, a célula de fluxo inclui um alvo de foco automático para o dispositivo de captura de imagem.
[0051] As modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos para quantificar células ou partículas presentes em uma amostra de fluido de sangue com o uso de técnicas de extensão de faixa de detecção ou dinâmica exemplificadoras.
[0052] Por exemplo, as modalidades exemplificadoras abrangem técnicas para corrigir contagens de partícula imprecisas associadas a pelo menos uma faixa de detecção com base em um parâmetro, tal como o volume da partícula. Operando-se o aparelho conforme descrito na presente revelação, as partículas que estão fora da faixa de detecção em concentração e/ou em volume podem ser detectadas e medidas precisamente.
[0053] Conforme usado neste documento, o termo "limite de detecção"ou "fora da faixa de detecção"associada a um contador de partículas usado nesta revelação será entendido por abranger uma faixa, em que a contagem de partículas é mais precisa e/ou fora em que a contagem de partículas é menos precisa ou até mesmo inoperável. Uma faixa de detecção pode incluir um limite de detecção superior e/ou inferior, tipicamente, expressado como uma concentração máxima ou mínima, porém, também possivelmente expressado como uma frequência máxima ou mínima em que as partículas são contadas em uma determinada tolerância de precisão. Por esse motivo, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos para análise de impedância e célula de fluxo paralelas de amostras de fluido de sangue para a quantificação de contagens de espécies feita em períodos irregulares e/ou abundantes.
[0054] Uma faixa de detecção pode ter por base a concentração, que pode incluir uma concentração local e/ou outro critério ou critérios específicos. Por exemplo, uma partícula tal como uma célula ou fragmento de sangue menos que uma PLT normal (isto é, que tem um diâmetro menor que 2 μm) pode ser difícil de ser detectada e contada com precisão em um contador de partículas. Uma célula anormal maior que um glóbulo branco normal (isto é, que tem um diâmetro maior que 15 μm) pode ser difícil de ser detectada e contada com precisão em um contador de partículas. Além disso, em concentrações elevadas, as RBCs e PLTs podem ser difíceis de ser contadas com precisão. Até mesmo após a diluição, as RBCs e PLTs podem se agregar para formar nódulos, de modo a resultar em leituras falsas de contagens de partícula obtidas com o uso de um contador de partículas. Ademais, é difícil fornecer uma contagem precisa de algumas células de sangue imaturas ou anormais presentes na amostra a baixas concentrações.
[0055] Como um exemplo, usando o aparelho descrito neste documento e a faixa de detecção de medição, o limite de detecção superior para WBCs pode ser estendido até 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 ou 1.000.000 por (volume de unidade) em algumas modalidades. O limite de detecção inferior para PLTs pode ser estendido abaixo de 20.000, 19.000, 18.000, 17.000, 16.000, 15.000, 14.000, 13.000, 12.000, 11.000, 10.000, 9.500, 9.000, 8.500, 8.000, 7.500, 7.000, 6.500, 6.000, 5.500, 5.000, 4.500, 4.000, 3.500, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500 ou 1.000 ou 500 por μL, em algumas modalidades.
[0056] Associadamente, as modalidades exemplificadoras abrangem técnicas para corrigir resultados imprecisos obtidos em um contador de partículas através da diferenciação de diferentes classes (incluindo membros de cada classe) de partículas detectadas em uma canaleta. Conforme descrito neste documento, algumas partículas têm um volume ou morfologia similares e podem ser detectadas em uma canaleta. Por exemplo, aglomerados ou nódulos de PLTs, PLT "gigantes" e RBCs nucleadas podem ser contados como "WBCs" em uma canaleta projetada para detectar WBCs. Além disso, outras espécies tais como células não lisadas, crioglobulina, corpos de heinz e parasita da malária podem ser contadas como "WBCs" para fornecer uma contagem de WBC maior do que existe, de fato, na amostra. De modo similar, a alta concentração de WBCs e PLTs gigantes pode ser contada como "RBCs" e resultar em uma contagem de células vermelhas do sangue superior ao valor real. A presença de hemácias microcíticas, inclusões de hemácia, fragmentos de glóbulo branco, partículas de poeira, hemólise/esquistócitos e até mesmo ruídos eletrônicos/elétricos podem resultar em uma contagem de PLTs superior à real. Por outro lado, células coaguladas e com coloração dentro da mesma classe, ou o conflito de uma classe de células com outra classe pode resultar em uma contagem imprecisa e inferior da classe correspondente de células no contador de partículas.
[0057] Em alguns aspectos dos métodos desta revelação, uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra a uma concentração acima de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas; e uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra em uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em outros aspectos dos métodos desta invenção, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra a uma concentração abaixo de uma faixa detectável aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas e a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra em uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em outros aspectos, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas compreende pelo menos um tipo de células anormais de sangue, células de sangue imaturas, células de sangue em nódulos, células de sangue que têm um diâmetro maior que 15 mícrons e células de sangue que têm um diâmetro menor que 2 mícrons; e a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas compreende glóbulos brancos.
[0058] Operando-se o aparelho conforme descrito nesta revelação, as partículas que são contadas erroneamente como outro tipo de partícula em uma canaleta do contador de partículas podem ser medidas separadamente e precisamente. Os métodos exemplificadores também podem ser usados para determinar uma contagem de partículas ou concentrações de partículas que não podem ser detectadas precisamente no contador de partículas. Tais partículas incluem, mas sem limitações, as partículas fora de faixas de volume normais e/ou partículas presentes em concentrações próximas ou fora das extremidades superior ou inferior de concentrações detectável no contador de partículas. Associadamente, operando-se um aparelho de sistema conforme descrito, que compreende, especificamente, um contador de partículas e um analisador de imagem em combinação com as composições exemplificadoras de agente de contraste de partícula e PIOAL conforme descrito nesta revelação, algumas partículas que podem ser contadas erroneamente como outro tipo de partícula em uma canaleta do contador de partículas podem ser medidas separadamente e precisamente. Os métodos desta invenção podem, ainda, ser usados em alguns casos para determinar a contagem de partículas ou concentrações de partículas que não podem ser detectadas precisamente no contador de partículas. Tais partículas incluem, mas sem limitações, as partículas fora de uma faixa de detecção e/ou partículas presentes em concentrações próximas ou além das extremidades superior e inferior de concentrações detectáveis no contador de partículas. Isso ocorre através da aplicação de informações obtidas através do analisador de imagem.
[0059] Em geral, operando-se um aparelho conforme revelado neste documento, por exemplo, com o uso de composições exemplificadoras de fluidos de agente de contraste de partícula e revestimento PIOAL, análise de uma amostra que contém partículas tais como células de sangue ou outros fragmentos podem ser realizados em faixas de detecção que estão fora da faixa de detecção nominal para um contador de partículas. Associadamente, com o uso de sistemas e composições conforme descrito neste documento, a análise de uma amostra de fluido de sangue pode ser realizada em faixas de detecção estendidas com base em um parâmetro, tal como a concentração ou volume da partícula. As faixas de detecção estendidas podem estar fora da faixa de detecção para um contador de partículas.
[0060] Em algumas modalidades, um sistema ou aparelho pode incluir um contador de partículas. Em outras modalidades, tal contador de partículas tem pelo menos uma faixa de detecção. Em determinados aspectos, o analisador e o processador podem ser configurados para fornecer informações adicionais para corrigir erros de teste associados ao contador de partículas e determinar, adicionalmente, uma contagem precisa de partícula ou concentração de diferentes categorias e/ou subcategorias de partículas na amostra. Considerando-se que as informações estejam disponíveis pelo contador de partículas e o analisador a respeito das contagens, uma ou mais razões e/ou a distribuição ao longo de pelo menos duas das categorias e/ou subcategorias de partículas, então erros nas contagens, na categorização e/ou subcategorização do contador de partículas podem ser corrigidos e as contagens, categorias e/ou subcategorias que não foram inicialmente relatadas pelo contador de partículas podem ser derivadas.
[0061] As modalidades da presente invenção abrangem certas técnicas de focalização que permitem que os sistemas de hematologia e métodos produzam imagens de alta qualidade de partículas que estão presentes em amostras de sangue fluidas. Tais imagens de alta qualidade fornecem a base para alcançar altos níveis de discriminação que são úteis para classificar precisamente as células e permitem o uso de sistemas ópticos que têm uma objetiva de ampliação elevada e abertura numérica elevada. O alinhamento óptico ou técnicas de focalização exemplificadoras facilitam a produção de imagens com alto nível de resolução, com uma profundidade de campo curta que corresponde a uma fita fina de amostra fluida que transporta as partículas.
[0062] Em alguns casos, os sistemas de hematologia podem ser refocados a uma base normal para serem ajustados para alterações na temperatura local e outros fatores. Por exemplo, as técnicas de foco automático, conforme discutidas neste documento podem compensar pela expansão térmica ou outros fatores presentes em um analisador de hematologia, o que altera a distância entre uma objetiva de imageamento e uma célula de fluxo e, portanto, impacta negativamente os resultados de imageamento, por exemplo, através da produção de uma imagem que está fora de foco. As modalidades da presente invenção também abrangem sistemas de foco automático e métodos para instrumentos de hematologia que envolvem focar automaticamente um sistema de imageamento sem a necessidade de um líquido de foco ou solução ou outra intervenção de usuário. Por exemplo, as técnicas exemplificadoras de foco automático podem envolver obter um foco inicial em um alvo fixo em relação à célula de fluxo, em vez de usar técnicas que têm por base a maximização do contraste do indivíduo em si que aparece na imagem.
[0063] Determinadas modalidades da presente invenção têm por base, pelo menos em parte, a observação de que a posição do fluxo no interior da célula de fluxo não é alterada em resposta às flutuações de temperatura e pode envolver focar em um alvo em algum lugar na célula de fluxo e, em seguida, usar um desvio fixo para alcançar um bom foco na corrente de amostra. Tais abordagens podem ser implantadas sem o uso de uma solução de foco que flui através da célula de fluxo e podem ser realizadas automaticamente e de modo completamente transparente para o usuário.
[0064] De acordo com algumas modalidades, esta revelação se refere a um analisador visual para gerar imagens de uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido, em que o aparelho inclui uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL, em que a célula de fluxo define uma trajetória de fluxo interna, em que a célula de fluxo está configurada para direcionar um fluxo de uma corrente de amostra em formato de fita envolta com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo. Uma lente objetiva associada a um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica está disposta em um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita. A distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo é variável através da operação de um acionamento de motor acoplado a um controlador para solucionar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. Um padrão de foco automático ou alvo de imageamento é fornecido em uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o padrão de foco automático está localizado a uma distância predeterminada do plano da corrente de amostra preparada em formato de fita. Uma fonte de luz ilumina a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático. Pelo menos um processador digital está associado ao controlador acoplado para operar o acionamento de motor. O processador também está disposto para analisar a imagem digitalizada. O processador determina uma posição de foco do padrão de foco automático para gerar uma imagem focada e, em seguida, desloca relativamente a objetiva e a célula de fluxo ao longo da distância predeterminada (por exemplo, uma distância de deslocamento) da posição focada, para focar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na corrente de amostra em formato de fita.
[0065] Em um aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue com o uso de um sistema de análise de partícula. O sistema de análise de partícula pode ser configurado para realizar o hidrofoco geométrico. Em alguns casos, o sistema pode ser configurado para realizar o hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados. Em alguns casos, as partículas podem ser incluídas em uma amostra de fluido de sangue que tem uma viscosidade de fluido de amostra. Os métodos exemplificadores podem incluir fazer fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo do sistema de análise de partícula. Em alguns casos, o fluido de revestimento pode ter uma viscosidade de fluido de revestimento que difere da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade. Os métodos também podem incluir injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo de modo que o fluido de amostra de fluido de sangue flui em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo, em que a corrente de fluxo de amostra flui através de uma diminuição em tamanho da trajetória de fluxo e atravessa um eixo geométrico de imageamento. Ademais, os métodos podem incluir focar um dispositivo de captura de imagem através do imageamento de um alvo de imageamento que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Além disso, os métodos podem incluir adquirir uma imagem focada das partículas adequada para a caracterização e contagem de partículas, no interior da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem, em que o dispositivo de captura de imagem é focado na corrente de fluxo de amostra com o uso de uma distância de deslocamento. De acordo com algumas modalidades, uma diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento e a amostra de fluido de sangue, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para realizar o hidrofoco da corrente de fluxo de amostra no eixo geométrico de imageamento enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade de células na corrente de fluxo de amostra de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluxo de amostra para o fluido de revestimento fluente. Em alguns casos, a corrente de fluxo de amostra tem uma espessura no eixo geométrico de imageamento em uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Em alguns casos, a trajetória de fluxo tem uma espessura de cerca de 150 μm no eixo geométrico de imageamento. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado em uma janela de porta de visualização disposta entre a corrente de fluxo de amostra e o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado em uma janela de iluminação e a corrente de fluxo de amostra está disposta entre a janela de iluminação e o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, a distância de deslocamento é zero. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado entre uma janela de iluminação e uma janela de porta de visualização. Em alguns casos, na etapa de captura, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo de amostra através do ajuste de uma distância focal do dispositivo de captura de imagem com base na distância de deslocamento.
[0066] De acordo com algumas modalidades, o processo de captura da imagem focada inclui ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo com o uso da distância de deslocamento. Em alguns casos, ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo inclui mover um componente do dispositivo de captura de imagem. O componente do dispositivo de captura de imagem pode ser uma lente de zoom, um espelho do dispositivo de captura de imagem ou uma montagem que inclui o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo inclui mover a célula de fluxo. Em alguns casos, ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo inclui mover pelo menos um elemento óptico do dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo. Em alguns casos, a distância de deslocamento é uma distância ao longo do eixo geométrico de imageamento entre o alvo de imageamento e a corrente de fluxo de amostra. Em alguns casos, a distância de deslocamento é uma diferença de distância entre uma primeira distância focal entre o dispositivo de captura de imagem e o alvo e uma segunda distância focal entre o dispositivo de captura de imagem e a corrente de fluxo de amostra. Em alguns casos, os métodos incluem uma etapa de foco automático que envolve injetar uma amostra fluida de teste no fluido de revestimento para formar uma corrente de fluxo de amostra de teste no interior da célula de fluxo, obter uma primeira imagem focada do alvo de imageamento com o dispositivo de captura de imagem, de modo que o alvo de imageamento focado e o dispositivo de captura de imagem definem uma primeira distância focal, obtendo uma segunda imagem focada da corrente de fluxo de amostra de teste usando o dispositivo de captura de imagem, de modo que a corrente de fluxo de amostra de teste focada e o dispositivo de captura de imagem definem uma segunda distância focal e obtêm a distância de deslocamento através do cálculo de uma diferença entre a primeira distância focal e a segunda distância focal. Em alguns casos, a amostra fluida de teste é a mesma amostra de fluido de sangue e a corrente de fluxo de amostra de teste é igual à corrente de fluxo de amostra. Em alguns casos, a etapa de foco automático estabelece um plano focal associado ao dispositivo de captura de imagem e o plano focal permanece estacionário em relação ao dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo de amostra com o uso de uma temperatura tal como uma temperatura de fluido de amostra, uma temperatura de fluido de revestimento, uma temperatura de célula de fluxo ou uma temperatura de dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado na corrente de fluxo de amostra com o uso de uma temperatura, tal como uma temperatura de célula de fluxo no local de imageamento, uma temperatura de célula de fluxo em uma localização a montante do local de imageamento e uma temperatura de célula de fluxo em uma localização a jusante do local de imageamento. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado na corrente de fluxo de amostra com o uso de uma taxa de alteração de temperatura, tal como uma taxa de alteração de temperatura de fluido de amostra, uma taxa de alteração de temperatura de fluido de revestimento, uma taxa de alteração de temperatura de célula de fluxo ou uma taxa de alteração de temperatura de dispositivo de captura de imagem.
[0067] De acordo com algumas modalidades, os métodos podem incluir detectar um sinal de reinicialização de foco automático e repetir as etapas de foco automático e captura de imagem em resposta ao sinal de reinicialização de foco automático. Em alguns casos, o sinal de reinicialização de foco automático inclui ou tem por base uma alteração na temperatura, uma diminuição na qualidade de foco, um intervalo de tempo decorrido ou uma entrada de usuário. Em alguns casos, a focalização do dispositivo de captura de imagem na corrente de fluxo de amostra é realizada independentemente de uma temperatura do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o alvo de imageamento inclui uma escala para uso no posicionamento do eixo geométrico de imageamento do dispositivo de captura de imagem em relação à corrente de fluxo de amostra. Em alguns casos, o alvo de imageamento inclui uma íris alinhada em relação ao eixo geométrico de imageamento, de modo que as partículas imageadas estejam dispostas em uma abertura definida pela íris e uma ou mais porções de borda da íris sejam imageadas durante o foco automático. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo de amostra através da implantação de rotação axial do dispositivo de captura de imagem ao redor do eixo geométrico de imageamento, a rotação axial da célula de fluxo ao redor de um eixo geométrico que se estende ao longo o eixo geométrico de imageamento e no campo de visão do dispositivo de imageamento, rotação de ponta do dispositivo de captura de imagem ao redor de um eixo geométrico que se estende ao longo da trajetória de fluxo, rotação de ponta da célula de fluxo ao redor de um eixo geométrico que se estende ao longo e dentro de uma trajetória de fluxo, rotação de inclinação do dispositivo de captura de imagem ao redor de um eixo geométrico que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo geométrico de imageamento e/ou rotação de inclinação da célula de fluxo ao redor de um eixo geométrico que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo geométrico de imageamento e no campo de visão do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo de amostra através da implantação de uma rotação da célula de fluxo, em que a rotação é centralizada no campo de visão do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o foco automático do dispositivo de captura de imagem inclui determinar uma posição de foco ideal dentre uma pluralidade de posições de foco.
[0068] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue. Os métodos exemplificadores podem incluir fazer fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo e injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido de sangue flua em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo. A célula de fluxo pode ter uma temperatura associada. Os métodos também podem incluir focar um dispositivo de captura de imagem ao longo de um eixo geométrico de imageamento na corrente de fluxo para um primeiro estado focal enquanto a temperatura associada à célula de fluxo está em uma primeira temperatura, e capturar uma primeira imagem focada de um primeiro subconjunto das partículas no interior da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no primeiro estado focal. Os métodos podem incluir, adicionalmente, determinar que a temperatura associada à célula de fluxo foi submetida a uma alteração da primeira temperatura para uma segunda temperatura e ajustar automaticamente o foco do dispositivo de captura de imagem a partir do primeiro estado focal para um segundo estado focal em resposta à alteração na temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e o foco desejado. Ademais, os métodos podem incluir capturar uma segunda imagem focada de um segundo subconjunto das partículas no interior da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem em um segundo estado focal. Em alguns casos, ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem envolve ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo com o uso da alteração na temperatura e da relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e o foco desejado. Em alguns casos, ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem envolve ajustar uma distância focal do dispositivo de captura de imagem com o uso da alteração na temperatura e da relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e o foco desejado. Em alguns casos, ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem envolve implantar uma rotação axial do dispositivo de captura de imagem ao redor do eixo geométrico de imageamento, uma rotação axial da célula de fluxo ao redor de um eixo geométrico que se estende ao longo do eixo geométrico de imageamento e no interior do campo de visão do dispositivo de imageamento, uma rotação de ponta do dispositivo de captura de imagem ao redor de um eixo geométrico que se estende ao longo da trajetória de fluxo, uma rotação de ponta da célula de fluxo ao redor de um eixo geométrico que se estende ao longo e no interior da trajetória de fluxo, uma rotação de inclinação do dispositivo de captura de imagem ao redor de um eixo geométrico que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo geométrico de imageamento e/ou uma rotação de inclinação da célula de fluxo ao redor de um eixo geométrico que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo geométrico de imageamento e no interior do campo de visão do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de fluxo de amostra através da implantação de uma rotação da célula de fluxo, em que a rotação é centralizada no campo de visão do dispositivo de captura de imagem.
[0069] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas de análise de partícula que realizam o hidrofoco geométrico ou, em alguns casos, o hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados, para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo geométrico de imageamento através da mesma. A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo. Os sistemas também podem incluir uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo. Ademais, os sistemas podem incluir uma entrada de fluido de sangue em comunicação fluida com o tubo de infecção. A entrada de fluido de sangue pode ser configurada para injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido de sangue flua em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo. Em alguns casos, o fluido de revestimento pode ter uma viscosidade que é maior que uma viscosidade da amostra de fluido de sangue. Além disso, os sistemas podem incluir um dispositivo de captura de imagem, um mecanismo de focalização configurado para definir um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo e um alvo de imageamento que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Em alguns casos, o alvo de imageamento e a corrente de fluxo de amostra podem definir uma distância de deslocamento ao longo do eixo geométrico de imageamento. Ademais, os sistemas podem incluir um processador e um módulo de focalização que tem um código legível por máquina de incorporação de meio tangível executado no processador para operar o mecanismo de focalização para definir o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partículas com o uso da distância de deslocamento. Em alguns casos, uma diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento e a amostra de fluido de sangue, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para realizar o hidrofoco da corrente de fluxo de amostra no eixo geométrico de imageamento enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade de células na corrente de fluxo de amostra de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluxo de amostra para o fluido de revestimento fluente. Em alguns casos, o mecanismo de focalização pode incluir um motor de acionamento configurado para ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado em uma janela de porta de visualização disposta entre a corrente de fluxo de amostra e o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o alvo de imageamento está localizado em uma janela de iluminação e a corrente de fluxo de amostra está disposta entre a janela de iluminação e o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o sistema está configurado para realizar uma etapa de captura que inclui focar o dispositivo de captura de imagem na corrente de fluxo de amostra através do ajuste de uma distância focal do dispositivo de captura de imagem com base na distância de deslocamento. Em alguns casos, o sistema está configurado para realizar uma etapa de captura para obter uma imagem focada através do ajuste de uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo com o uso da distância de deslocamento. Em alguns casos, o sistema está configurado para ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo movimentando-se a célula de fluxo. Em alguns casos, o sistema está configurado para realizar uma etapa de foco automático que inclui injetar uma amostra fluida de teste no fluido de revestimento para formar uma corrente de fluxo de amostra de teste no interior da célula de fluxo, obter uma primeira imagem focada do alvo de imageamento usando o dispositivo de captura de imagem, de modo que o alvo de imageamento focado e o dispositivo de captura de imagem definem uma primeira distância focal, obtendo uma segunda imagem focada da corrente de fluxo de amostra de teste usando o dispositivo de captura de imagem, de modo que a corrente de fluxo de amostra de teste focada e o dispositivo de captura de imagem definem uma segunda distância focal e obtêm a distância de deslocamento através do cálculo de uma diferença entre a primeira distância focal e a segunda distância focal. Em alguns casos, o sistema está configurado para focar o dispositivo de captura de imagem na corrente de fluxo de amostra usando uma temperatura, tal como uma temperatura de fluido de amostra, uma temperatura de fluido de revestimento, uma temperatura de célula de fluxo ou uma temperatura de dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o sistema está configurado para detectar um sinal de reinicialização de foco automático e repetir as etapas de foco automático e captura de imagem em resposta ao sinal de reinicialização de foco automático.
[0070] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo geométrico de imageamento através da mesma, uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo e uma entrada de fluido de sangue em comunicação fluida com o tubo de injeção. A entrada de fluido de sangue pode ser configurada para injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido de sangue flui em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo. Os sistemas também podem incluir um dispositivo de captura de imagem, um mecanismo de focalização configurado para definir um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo, um sensor de temperatura acoplado termicamente à célula de fluxo, um processador e um módulo de focalização. O módulo de focalização pode incluir um código legível por máquina de incorporação de meio tangível executado no processador para operar o mecanismo de focalização para definir o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partículas em resposta a uma alteração na temperatura detectada pelo sensor de temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura e o foco desejado. Em alguns casos, o mecanismo de focalização inclui um motor de acionamento configurado para ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo.
[0071] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para a análise de células em uma amostra de fluido de sangue. Os métodos exemplificadores podem incluir fazer fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo e injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo de modo que o fluido de amostra de fluido de sangue flua em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo mais ampla que uma espessura de corrente de fluxo. A corrente de fluxo de amostra pode ser desviada ao longo de um eixo geométrico de imageamento, de uma janela de imageamento da célula de fluxo por uma primeira distância. Os métodos podem, ainda, incluir focar automaticamente um dispositivo de captura de imagem através do imageamento de um alvo de imageamento afixado à célula de fluxo. O alvo de imageamento pode estar posicionado a uma segunda distância da janela de imageamento ao longo do eixo geométrico de imageamento. Ademais, os métodos podem incluir capturar imagens focadas das células, adequadas para a caracterização e contagem de células, no interior da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode estar focado na corrente de fluxo de amostra com o uso da etapa de foco automático e uma relação conhecida entre a primeira distância e a segunda distância.
[0072] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas para a análise de células em uma amostra de fluido de sangue. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo geométrico de imageamento através da mesma. Os sistemas também podem incluir uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo e uma entrada de fluido de sangue em comunicação fluida com o tubo de infecção. A entrada de fluido de sangue pode ser configurada para injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo, de modo que a amostra de fluido de sangue flui em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo. A corrente de fluxo de amostra pode ser desviada ao longo do eixo geométrico de imageamento a partir da janela de imageamento da célula de fluxo por uma primeira distância. Os sistemas também podem incluir um dispositivo de captura de imagem orientável ao longo do eixo geométrico de imageamento. O dispositivo de captura de imagem pode incluir um mecanismo de focalização. Ademais, os sistemas podem incluir um alvo de imageamento afixado à célula de fluxo. O alvo de imageamento pode estar em uma segunda distância da superfície de janela de imageamento ao longo do eixo geométrico de imageamento. Além disso, os sistemas podem incluir um processador acoplado ao mecanismo de focalização. O processador pode ser configurado para capturar imagens focadas das partículas na corrente de fluxo, suficiente para a caracterização e contagem das células, através da focalização do dispositivo de captura de imagem no alvo e através do uso de uma relação conhecida entre a primeira distância e a segunda distância.
[0073] Em ainda outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas para a análise de células em uma amostra de fluido de sangue. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo geométrico de imageamento através da mesma. Ademais, os sistemas podem incluir uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo e uma entrada de amostra de fluido de sangue em comunicação fluida com o tubo de injeção. A entrada de fluido de amostra pode ser configurada para injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo, de modo que a amostra de fluido de sangue flui em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo. Ademais, os sistemas podem incluir um dispositivo de captura de imagem orientável ao longo do eixo geométrico de imageamento e o dispositivo de captura de imagem pode incluir um mecanismo de focalização. Os sistemas podem, ainda, incluir um sensor de temperatura acoplado termicamente à célula de fluxo e um processador acoplado ao sensor de temperatura e ao mecanismo de focalização. Em alguns casos, o processador está configurado para ajustar foco do dispositivo de captura de imagem, suficiente para a caracterização e contagem das células, em resposta a uma alteração na temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura e o foco desejado.
[0074] De acordo com algumas modalidades, um analisador visual pode incluir uma célula de fluxo acoplada a uma fonte de uma amostra e a uma fonte de um fluido de revestimento. A célula de fluxo pode definir uma trajetória de fluxo interna e pode ser configurada para direcionar um fluxo da amostra envolta com o fluido de revestimento através de uma zona de visualização na célula de fluxo. O analisador pode, também, incluir um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica com uma objetiva em um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita, e uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo pode ser variável durante a operação de um acionamento de motor para solucionar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. O analisador pode, ainda, incluir um padrão de foco automático que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o padrão de foco automático está localizado a uma distância de deslocamento do plano da corrente de amostra em formato de fita. A distância de deslocamento pode ser predeterminada. O analisador pode, ainda, incluir uma fonte de luz configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático. Ademais, o analisador pode incluir pelo menos um processador digital acoplado para operar o acionamento de motor e para analisar a imagem digitalizada. O processador pode ser configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático e para deslocar, relativamente, um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo ao longo da distância de deslocamento da posição focada, por meio da qual o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica se torna focado na corrente de amostra em formato de fita. De acordo com algumas modalidades, o padrão de foco automático inclui formas com tamanho limitado e a distância de deslocamento é suficiente, de modo que as formas sejam, substancialmente, invisíveis na imagem digitalizada quando focalizadas na corrente de amostra em formato de fita. Em alguns casos, o eixo geométrico óptico é, substancialmente, perpendicular em relação à corrente de amostra em formato de fita.
[0075] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para focar um analisador visual para análise de amostra. Os métodos exemplificadores podem incluir focar um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica em um padrão de foco automático fixo em relação a uma célula de fluxo, em que o padrão de foco automático está localizado a uma distância de deslocamento de uma corrente de amostra em formato de fita que é predeterminado, em que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica com uma objetiva em um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita, em que uma distância relativa entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo é variável através da operação de um acionamento de motor, em que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica está configurado para solucionar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. Ademais, os métodos podem incluir operar o acionamento de motor ao longo da distância de deslocamento para focar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na corrente de amostra em formato de fita.
[0076] Em outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para gerar imagens de partículas em uma amostra. Os métodos exemplificadores podem incluir fornecer um analisador visual para uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido, que estabelecem um fluxo que tem seções laminares que têm a viscosidade mais alta e mais baixa no analisador visual. O analisador pode incluir uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL que tem uma viscosidade superior à viscosidade da amostra. A célula de fluxo pode definir uma trajetória de fluxo interna e pode direcionar um fluxo da amostra envolta com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo. O analisador pode, ainda, incluir um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica com uma objetiva em um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita, em que a distância relativa entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo é variável através da operação de um acionamento de motor para solucionar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. O analisador pode inclui, ainda, um padrão de foco automático que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o padrão de foco automático está localizado a uma distância de deslocamento do plano da corrente de amostra em formato de fita que foi predeterminada, uma fonte de luz configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático, pelo menos um processador digital acoplado para operar o acionamento de motor e para analisar a imagem digitalizada, em que o processador está configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático e para deslocar relativamente o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo ao longo da distância de deslocamento da posição focada, por meio da qual o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica se torna focado na corrente de amostra em formato de fita. Em alguns casos, um analisador pode incluir uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL em que a célula de fluxo define uma trajetória de fluxo interna e está configurada para direcionar um fluxo da amostra envolta com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo, um dispositivo de imagem de alta resolução óptica com uma objetiva em um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita, em que uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo é variável através da operação de um acionamento de motor para solucionar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor, em que um padrão de foco automático tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o padrão de foco automático está localizado a uma distância de deslocamento do plano da corrente de amostra em formato de fita que foi predeterminada, uma fonte de luz configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático e pelo menos um processador digital acoplado para operar o acionamento de motor e para analisar a imagem digitalizada, em que o processador está configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático e para deslocar relativamente o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo ao longo da distância de deslocamento da posição focada, por meio da qual o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica se torna focado na corrente de amostra em formato de fita.
[0077] Uma composição de agente de contraste de partícula é revelada para colorir uma amostra de fluido de sangue que é imageada em um sistema automatizado de análise de partícula. A composição de agente de contraste de partícula pode incluir pelo menos um agente de contraste de partícula selecionado do grupo que consiste em Cristal Violeta, Novo Azul de Metileno, Verde de Metila, Eosina Y e Safranina O. A composição de agente de contraste de partícula pode incluir, adicionalmente, um agente de permeabilização selecionado do grupo que consiste em um tensoativo, uma saponina, um sal de amônio quaternário, um tensoativo não iônico, um detergente; e um tensoativo zwiteriônico. A composição de agente de contraste de partícula pode incluir, adicionalmente, um agente fixador selecionado do grupo que consiste em gluteraldeído e formaldeído.
[0078] Em uma modalidade, o agente de permeabilização pode ser uma saponina presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações entre cerca de 50 mg/L e cerca de 750 mg/L sob condições de coloração. O agente fixador pode ser um gluteraldeído presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações em 0,1% ou menos sob condições de coloração.
[0079] Em uma modalidade, o pelo menos um agente de contraste de partícula pode incluir Cristal Violeta, Novo Azul de Metileno e Eosina- Y. A razão da Cristal Violeta para o Novo Azul de Metileno pode ser entre cerca de 1:90 a cerca de 1:110 sob condições de coloração. A Eosina-Y pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 3 μm a cerca de 300 μm sob condições de coloração.
[0080] Em uma modalidade, a Cristal Violeta pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 6 μm a cerca de 10 μm sob condições de coloração. O Novo Azul de Metileno pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 70 μm a cerca de 2,4 mM sob condições de coloração. A Eosina-Y pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 10 μm a cerca de 50 μm sob condições de coloração.
[0081] Em algumas modalidades, a Cristal Violeta tem aproximadamente 90% de pureza ou mais. O Novo Azul de Metileno pode ter aproximadamente 70% de pureza ou mais. A Eosina-Y pode ter aproximadamente 80% de pureza ou mais.
[0082] Em algumas modalidades, a Cristal Violeta está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 7,8 μm sob condições de coloração. O Novo Azul de Metileno está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 735 μm sob condições de coloração. A Eosina-Y pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 27 μm sob condições de coloração. Em algumas modalidades, a composição de agente de contraste de partícula pode inclui adicionalmente componentes de tampão.
[0083] Um método é revelado para tratar partículas de uma amostra de fluido de sangue que serão imageadas com o uso de um sistema automatizado de análise de partícula. O método pode incluir combinar a amostra de fluido de sangue com uma composição de agente de contraste de partícula para obter uma mistura de amostra e incubar a mistura de amostra a uma temperatura entre cerca de 37°Celsius e cerca de 60°Celsius durante menos de 90 segundos. A composição de agente de contraste de partícula inclui pelo menos um agente de contraste de partícula selecionado do grupo que consiste em Cristal Violeta, Novo Azul de Metileno, Verde de Metila, Eosina Y e Safranina O; um agente de permeabilização selecionado do grupo que consiste em um tensoativo, uma saponina, um sal de amônio quaternário, um tensoativo não iônico, um detergente; e um tensoativo zwiteriônico; e um agente fixador selecionado do grupo que consiste em gluteraldeído e formaldeído.
[0084] Em algumas modalidades, o agente de contraste de partícula pode incluir Cristal Violeta e Novo Azul de Metileno em quantidades suficientes para resultar em uma razão do Cristal Violeta para o Novo Azul de Metileno entre cerca de 1:1 a cerca de 1:500 sob condições de coloração. A saponina pode ser incluída em quantidades suficientes para resultar em concentrações entre cerca de 50 mg/L e cerca de 750 mg/L sob condições de coloração. O gluteraldeído pode ser incluído em quantidades suficientes para resultar em concentrações a 0,1% ou menos sob condições de coloração. O método pode incluir a mistura de amostra ao ser incubada durante menos de 60 segundos.
[0085] Em algumas modalidades, a composição de agente de contraste de partícula pode incluir Cristal Violeta presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 6 μm a cerca de 10 μm sob condições de coloração. O Novo Azul de Metileno pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 70 μm a cerca de 2,4 mM sob condições de coloração. A Eosina-Y pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 10 μm a cerca de 50 μm sob condições de coloração. A amostra de fluido de sangue pode ser combinada com a composição de agente de contraste de partícula a uma razão da amostra de fluido de sangue para a composição de agente de contraste de partícula de cerca de 1:2 a cerca de 1:10.
[0086] Em algumas modalidades, o método pode incluir aquecer a mistura de amostra a entre 46 °C e cerca de 49 °C durante entre 40 e 50 segundos.
[0087] Em algumas modalidades, o Cristal Violeta pode ter aproximadamente 90% de pureza ou mais. O Novo Azul de Metileno pode ter aproximadamente 70% de pureza ou mais. A Eosina-Y pode ter aproximadamente 80% de pureza ou mais.
[0088] Em algumas modalidades, o agente de contraste de partícula pode incluir Cristal Violeta presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações em cerca de 7,8 μm sob condições de coloração; O Novo Azul de Metileno presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 735 μm sob condições de coloração; e a Eosina-Y presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 27 μm sob condições de coloração. A composição de agente de contraste de partícula pode incluir, adicionalmente, componentes de tampão. A amostra de fluido de sangue pode ser combinada com a composição de agente de contraste de partícula a uma razão da amostra de fluido de sangue para a composição de agente de contraste de partícula de cerca de 1:3 a cerca de 1:4. A mistura de amostra pode ser aquecida a cerca de 47 °C durante cerca de 45 segundos.
[0089] Os recursos descritos acima e muitos outros recursos e vantagens adicionais das modalidades da presente invenção irão se tornar evidentes e adicionalmente entendidos por referência à descrição detalhada a seguir quando considerada em conjunto com os desenhos anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0090] A Figura 1 é uma ilustração esquemática, parcialmente em seção e não em escala, que mostra aspectos operacionais de uma célula de fluxo exemplificadores e sistema de foco automático e dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para análise de imagem de amostra usando de processamento de imagem digital, de acordo com modalidades da presente invenção.
[0091] As Figuras 1A e 1B mostram uma disposição de banco óptico, de acordo com modalidades da presente invenção.
[0092] A Figura 1C é um diagrama de blocos de um analisador de hematologia, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[0093] A Figura 1D mostra um fluxograma de um processo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[0094] A Figura 1E é um diagrama de blocos simplificado de um sistema de módulo exemplificador, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[0095] A Figura 2 mostra partes de uma célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[0096] As Figuras 3, 3A e 3B mostram aspectos de células de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[0097] A Figura 4 ilustra aspectos de um sistema de analisador, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[0098] A Figura 4A mostra uma célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[0099] As Figuras 4B-1 e 4B-2 mostram aspectos de trajetórias de fluxo de célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00100] As Figuras 4A-1 e 4A-2 ilustram alterações nas dimensões de corrente de amostra, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00101] A Figura 4C representa recursos de uma cânula exemplificadora ou tubo de alimentação de amostra, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00102] A Figura 4D representa um corte transversal longitudinal da cânula, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00103] A Figura 4E ilustra um corte transversal de uma seção achatada distal, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00104] A Figura 4F ilustra um corte transversal de uma seção afunilada central, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00105] A Figura 4G ilustra um corte transversal de uma seção proximal, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00106] A Figura 4C-1 mostra uma cânula ou tubo de alimentação de amostra exemplificadores, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00107] A Figura 4D-1 mostra uma cânula ou tubo de alimentação de amostra exemplificadores, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00108] A Figura 4H mostra uma porção de uma cânula, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00109] As Figuras 4I e 4J representam células de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00110] As Figuras 4K e 4L mostram uma corrente de amostra que flui através de um local de captura de imagem de uma célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00111] As Figuras 4K-1, 4K-2 e 4K-3 mostram o local de imageamento-alvo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00112] A Figura 4L-1 mostra perfis de fluxo parabólico, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00113] As Figuras 4M e 4N mostram aspectos de alinhamento de partícula intracelular, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00114] A Figura 4O mostra uma comparação entre imagens obtidas com o uso de PIOAL em função de imagens obtidas com o uso de um fluido de revestimento não PIOAL, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00115] As Figuras 4P e 4Q mostram uma comparação entre imagens obtidas com o uso de um fluido de revestimento-padrão e fluido de PIOAL exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00116] A Figura 4R mostra um gráfico da porcentagem de células não alinhadas obtidas com o uso de 0% a 30% de glicerol no PIOAL com células de fluxo simétricas vs. assimétricas, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00117] A Figura 5 representa uma linha de tempo que corresponde à injeção de um ou mais fluidos de amostra em uma célula de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00118] As Figuras 5A, 5B, 5C e 5D representam resultados obtidos com o uso de determinadas técnicas de processamento, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00119] A Figura 5E representa resultados de captura de imagem com base em uma técnica de montagem molhada de microscópio tradicional em comparação com uma técnica de célula de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00120] A Figura 6 representa aspectos de um método exemplificador para gerar imagens de uma pluralidade de partículas com o uso de um sistema de análise de partícula configurado para realizar o hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00121] As Figuras 6A e 6B representam características exemplificadoras de corrente de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00122] A Figura 6C representa aspectos de um método exemplificador para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00123] A Figuras 7 e 8 representam aspectos de taxa de deformação de corrente de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00124] A Figura 9A representa um alvo de foco automático exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00125] A Figura 9B mostra uma imagem capturada que inclui porções de um alvo de foco automático, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00126] As Figuras 10 e 11 representam alvos de foco automático exemplificadores, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00127] A Figura 12A representa um alvo de foco automático exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00128] A Figura 12B mostra uma vista de perto da porção central do alvo de foco automático, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00129] As Figuras 13A, 13B e 13C, representam vistas de um sensor de temperatura de célula de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00130] A Figura 13D representa aspectos de técnicas de remoção de bolha de célula de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00131] A Figura 14 é um diagrama de blocos que mostra aspectos adicionais de sistemas e métodos para alcançar uma extensão da faixa de detecção ou dinâmica para a análise de partícula em amostras de sangue, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00132] A Figura 15 mostra um aparelho exemplificador para analisar uma amostra, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00133] A Figura 15A representa aspectos de um contador ou módulo de contagem exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00134] A Figura 16 representa aspectos de sistemas e métodos para medir uma quantidade de um primeiro tipo de célula em uma amostra de fluido de sangue, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00135] A Figura 17 mostra um método para analisar uma amostra que contém partículas, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00136] A Figura 18 ilustra um método exemplificador para determinar a concentração de duas subcategorias de partículas, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00137] As Figuras 19A, 19B, 19C e 19D mostram a detecção de categorias de partículas, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00138] As Figuras 20A e 20B fornecem vistas laterais de cortes transversais que ilustram aspectos de sistemas de imageamento e métodos, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00139] A Figura 20C representa uma vista de extremidade de corte transversal de uma célula de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00140] A Figura 20D mostra uma distância focal do dispositivo de captura de imagem, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00141] A Figura 21 representa uma vista em elevação que mostra modalidades de um padrão de foco automático, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00142] As Figuras 22A e 22B mostram configurações de foco, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00143] A Figura 23 representa aspectos de técnicas de processamento de amostra, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00144] A Figura A1 é um diagrama esquemático da preparação de uma composição de agente de contraste de partícula, de acordo com uma modalidade.
[00145] A Figura A2 é um fluxograma de um processo de coloração rápido de uma etapa, de acordo com uma modalidade.
[00146] A Figura A3 é uma ilustração representativa de glóbulos brancos com coloração selecionados de acordo com o processo de coloração rápido de uma etapa, de acordo com uma modalidade.
[00147] A Figura A4 é uma ilustração representativa de glóbulos brancos selecionados a partir de uma amostra com coloração com uma composição de agente de contraste de partícula, de acordo com uma modalidade.
[00148] A Figura A5 é uma ilustração representativa de células com coloração, de acordo com um Exemplo 1 precoce.
[00149] A Figura A6 é uma ilustração representativa de células com coloração, de acordo com um Exemplo 2 precoce.
[00150] A Figura A7 é uma ilustração representativa de células coloração, de acordo com um Exemplo 3 precoce.
[00151] A Figura A8 é uma ilustração representativa de células coloração, de acordo com um Exemplo 4 precoce.
[00152] A Figura A9 é uma ilustração representativa de células com coloração, de acordo com um exemplo precoce.
[00153] A Figura A10 é uma ilustração representativa de células com coloração, de acordo com um Exemplo 5 precoce.
[00154] A Figura A11 é uma ilustração representativa de células com coloração, de acordo com um Exemplo 6 precoce.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00155] A presente revelação refere-se a um aparelho, sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra que contém partículas. Em uma modalidade, a invenção se refere a um sistema de imageamento de partícula automatizado que compreende um analisador que pode ser, por exemplo, um analisador visual. Em algumas modalidades, o analisador visual pode compreender adicionalmente um processador para facilitar a análise automatizada das imagens.
[00156] De acordo com esta revelação, um sistema que compreende um analisador visual é fornecido para obter imagens de uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido. O sistema pode ser útil, por exemplo, na caracterização de partículas em fluidos biológicos, tal como a detecção e quantificação de eritrócitos, reticulócitos, hemácias nucleadas, plaquetas e glóbulos brancos, incluindo contagem diferencial de glóbulo branco, categorização e subcategorização e análise. Outros usos similares, tais como a caracterização de células de sangue a partir de outros fluidos também são abrangidos pelas modalidades da presente invenção. Tipicamente, a amostra de fluido de sangue é introduzida em um fluido de revestimento fluente e os fluidos de revestimento e de amostra combinados são comprimidos com uma zona de transição da trajetória de fluxo em estreitamento que reduz a espessura do fluxo de fluido em fita de amostra. Por esse motivo, as partículas tais como as células podem ser orientadas e/ou comprimidas na amostra de fluido de sangue pelo fluido de revestimento viscoso circundante, por exemplo, em combinação com um efeito de focalização geométrica fornecido por uma zona de transição de estreitamento. De modo similar, os recursos internos em células de sangue podem ser alinhados e orientados como um resultado de um diferencial de viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento, por exemplo, em combinação com um efeito de focalização geométrica fornecido por uma zona de transição de estreitamento.
[00157] Para facilitar a capacidade, velocidade e eficácia pelas quais as partículas tais como as células são categorizadas e/ou subcategorizadas, é vantajoso fornecer imagens nítidas de alta qualidade das células de sangue para a análise automatizada através do sistema de processamento de dados. De acordo com a presente revelação, uma corrente de amostra preparada está disposta em uma fita fina que tem uma posição estável entre paredes opostas de uma célula de fluxo. O posicionamento da corrente de amostra e seu achatamento, de modo a assumir um formato de fita fina, podem ser alcançados através do fluxo entre camadas de um PIOAL introduzido na célula de fluxo que difere quanto à viscosidade do fluido de amostra e flui através de uma zona de transição de estreitamento simétrica de uma canaleta de fluxo.
Hematologia - Sistema de análise de partícula
[00158] Voltando-se, agora, para os desenhos, a Figura 1 mostra, esquematicamente, uma célula de fluxo exemplificadora 22 para transportar um fluido de amostra através de uma zona de visualização 23 de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 em uma configuração para gerar imagens de partículas microscópicas em uma corrente de fluxo de amostra 32 com o uso de processamento de imagem digital. A célula de fluxo 22 está acoplada a uma fonte 25 de fluido de amostra que pode ter sido submetida a um processamento, tal como o contato com uma composição de agente de contraste de partícula e aquecimento. A célula de fluxo 22 está, ainda, acoplada a uma ou mais fontes 27 de um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL), tal como uma solução de glicerol clara que tem uma viscosidade que é maior que a viscosidade do fluido de amostra.
[00159] O fluido de amostra é injetado através de uma fenda achatada em uma extremidade distal 28 de um tubo de alimentação de amostra 29 e para o interior da célula de fluxo 22 em um ponto em que o fluxo de PIOAL foi substancialmente estabelecido, resultando em um fluxo laminar estável e simétrico do PIOAL acima e abaixo (ou em lados opostos) da corrente de amostra em formato de fita. A amostra e correntes de PIOAL podem ser fornecidas através de bombas de medição de precisão que movem o PIOAL com o fluido de amostra injetado ao longo de uma trajetória de fluxo que se estreita substancialmente. O PIOAL envolve e comprime o fluido de amostra na zona 21, onde a trajetória de fluxo se estreita. Por esse motivo, a diminuição na espessura de trajetória de fluxo na zona 21 pode contribuir para uma focalização geométrica da corrente de amostra 32. A fita de fluido de amostra 32 é envolta e transportada juntamente com o PIOAL a jusante da zona de estreitamento 21, que passa na frente ou, de outro modo, através da zona de visualização 23 do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 onde as imagens são coletadas, por exemplo, com o uso de um CCD 48. O processador 18 pode receber, como entrada, dados de pixel a partir do CCD 48. A fita de fluido de amostra flui juntamente com o PIOAL para uma descarga 33.
[00160] Conforme mostrado neste documento, a zona de estreitamento 21 pode ter uma porção proximal de trajetória de fluxo 21a que tem uma espessura proximal PT e uma porção distal de trajetória de fluxo 21b que tem uma espessura distal DT, de modo que a espessura distal DT seja menor que a espessura proximal PT. O fluido de amostra pode, portanto, ser injetado através da extremidade distal 28 do tubo de amostra 29 em um local que é distal em relação à porção proximal 21a e proximal em relação à porção distal 21b. Por esse motivo, o fluido de amostra pode entrar no envelope de PIOAL, conforme a corrente de PIOAL é comprimida pela zona 21, em que o tubo de injeção de fluido de amostra tem uma porta de saída distal através da qual o fluido de amostra é injetado para dentro do fluido de revestimento fluente, em que a porta de saída distal é delimitada pela diminuição no tamanho da trajetória de fluxo da célula de fluxo.
[00161] O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital 24 com lente objetiva 46 é direcionado ao longo de um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita 32. A distância relativa entre a objetiva 46 e a célula de fluxo 33 é variável através da operação de um acionamento de motor 54, para solucionar e coletar uma imagem digitalizada focada em uma matriz de fotossensor.
[00162] De acordo com algumas modalidades, o sistema pode operar para realizar o hidrofoco da fita de fluido de amostra 32. O termo hidrofoco ou hidrofocar pode se referir a um efeito de focalização que é influenciado por uma diferença de viscosidade entre os fluidos de revestimento e de amostra, uma zona de transição de estreitamento geométrica da célula de fluxo e uma diferença de velocidade entre os fluidos de revestimento e de amostra. Os resultados de fluxo hidrodinâmico a partir da diferença de velocidade entre as correntes de fluido de amostra e de revestimento, que afeta a espessura de fita de fluxo e formato.
[00163] A presente revelação fornece uma técnica para alcançar automaticamente uma posição de trabalho correta do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 para focar na corrente de amostra em formato de fita 32. A estrutura de célula de fluxo 22 pode ser configurada de modo que a corrente de amostra em formato de fita 32 tenha um local fixo e confiável na célula de fluxo que define a trajetória de fluxo de fluido de amostra, em uma fita fina entre camadas de PIOAL, de modo a passar através de uma zona de visualização 23 na célula de fluxo 22. Em determinadas modalidades de célula de fluxo, o corte transversal da trajetória de fluxo para o PIOAL se estreita simetricamente no ponto em que a amostra é inserida através de um orifício achatado tal como um tubo 29 com um lúmen retangular no orifício ou cânula. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área em corte transversal por uma razão de 20:1 ou por uma razão entre 20:1 e 70:1) juntamente com um diferencial de viscosidade entre o PIOAL e os fluidos de amostra e, opcionalmente, uma diferença na velocidade linear do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, coopera para comprimir a corte transversal de amostra em uma razão de cerca de 20:1 a 70:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura de corte transversal pode ser 40:1.
[00164] Em um aspecto, a natureza simétrica da célula de fluxo 22 e a maneira de realizar a injeção do fluido de amostra e PIOAL fornecem uma posição repetível na célula de fluxo 22 para a corrente de amostra em formato de fita 32 entre as duas camadas do PIOAL. Como um resultado, as variações de processo tais como as velocidades lineares específicas da amostra e do PIOAL não tendem a deslocar a corrente de amostra em formato de fita de seu local no fluxo. Em relação à estrutura da célula de fluxo 22, o local da corrente de amostra em formato de fita 32 é estável e repetível.
[00165] Entretanto, as posições relativas da célula de fluxo 22 e do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 do sistema óptico podem estar sujeitas a uma alteração e podem se beneficiar de ajustes de posição ocasionais para manter uma distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e a corrente de amostra em formato de fita 32 fornecendo, assim, uma imagem de foco de qualidade das partículas envelopadas na corrente de amostra em formato de fita 32. De acordo com algumas modalidades, pode haver uma distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e a corrente de amostra em formato de fita 32 para se obter imagens focadas das partículas envelopadas. Os elementos ópticos podem, primeiro, ser posicionados precisamente em relação à célula de fluxo 22 através do foco automático ou outras técnicas para localizar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 à distância ideal ou desejada de um alvo de foco automático 44 com uma posição fixa em relação à célula de fluxo 22. A distância de deslocamento entre o alvo de foco automático 44 e a corrente de amostra em formato de fita 32 é precisamente conhecida, por exemplo, como um resultado de etapas de calibração iniciais. Após o foco automático no alvo de foco automático 44, a célula de fluxo 22 e/ou o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 são, então, deslocados ao longo da distância de deslocamento conhecida entre o alvo de foco automático 44 e a corrente de amostra em formato de fita 32. Como um resultado, a lente objetiva do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 44 é focado precisamente na corrente de amostra em formato de fita 32 que contém as partículas envelopadas.
[00166] As modalidades exemplificadoras da presente invenção envolvem focar automaticamente no alvo de foco ou imageamento 44, que é uma figura de alto contraste que define um local conhecido ao longo do eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital 24. O alvo 44 pode ter uma distância de deslocamento conhecida em relação ao local da corrente de amostra em formato de fita 32. Um algoritmo de medição de contraste pode ser empregado especificamente nos recursos de alvo. Em um exemplo, a posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 pode ser variada ao longo de uma linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital, para encontrar a profundidade ou distância em que uma ou mais amplitudes de diferencial máximo se encontram dentre os valores de luminância de pixel que ocorre ao longo de uma linha de pixels na imagem a qual se sabe que cruza sobre uma borda da figura de contraste. Em alguns casos, o padrão de foco automático não tem variação ao longo da linha paralela ao eixo geométrico óptico, que é, também, a linha ao longo da qual um controle motorizado opera para ajustar a posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 para fornecer a distância de deslocamento registrada.
[00167] De tal maneira, pode não ser necessário focar automaticamente ou depender de um aspecto de conteúdo de imagem que é variável entre diferentes imagens, que tem uma alta definição inferior em relação ao contraste ou que pode estar localizada em algum lugar em uma faixa de posições, como a base para determinar um local de distância para referência. Encontrando-se o local de foco ideal ou desejado no alvo de foco automático 44, as posições relativas da objetiva de dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e a célula de fluxo 22 podem ser deslocadas pela distância de deslocamento registrada para fornecer a posição de foco ideal ou desejada para partículas na corrente de amostra em formato de fita 32.
[00168] De acordo com algumas modalidades, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 pode superar uma imagem da corrente de amostra em formato de fita 32 quando retroiluminada por uma fonte de luz 42 aplicada através de uma abertura de iluminação (janela) 43. Nas modalidades mostradas na Figura 1, o perímetro da abertura de iluminação 43 forma um alvo de foco automático 44. Entretanto, o objetivo é coletar uma imagem focada precisamente da corrente de amostra em formato de fita 32 através de elementos ópticos de dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 46 em uma matriz de elementos fotossensíveis, tais como um dispositivo acoplado por carga integrada.
[00169] O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e seus elementos ópticos 46 são configurados para solucionar uma imagem das partículas na corrente de amostra em formato de fita 32 que está em foco à distância 50, em que a tal distância pode ser um resultado das dimensões do sistema óptico, o formato das lentes e os índices de refração de seus materiais. Em alguns casos, a distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e a corrente de amostra em formato de fita 32 não é alterada. Em outros casos, a distância entre a célula de fluxo 22 e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e seus elementos ópticos 46 pode ser alterada. Mover o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e/ou célula de fluxo 22 de modo que estejam mais próximos ou mais separados entre si (por exemplo, através do ajuste da distância 51 entre o dispositivo de imageamento 24 e a célula de fluxo 22), move o local do ponto de focalização no fim da distância 50 em relação à célula de fluxo.
[00170] De acordo com modalidades da presente invenção, um alvo de foco 44 pode estar localizado a uma distância da corrente de amostra em formato de fita 32, nesse caso, diretamente fixo à célula de fluxo 22 nas bordas da fenda 43 para a luz da fonte de iluminação 42. O alvo de foco 44 é uma distância de deslocamento constante 52 da corrente de amostra em formato de fita 32. Frequentemente, a distância de deslocamento 52 é constante devido ao fato de que o local da corrente de amostra em formato de fita 32 na célula de fluxo permanece constante.
[00171] Um procedimento de foco automático exemplificador envolve ajustar as posições relativas do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e célula de fluxo 22 com o uso de um motor 54 para que chegue ao comprimento focal adequado fazendo, assim, com que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 foque no alvo de foco automático 44. Neste exemplo, o alvo de foco automático 44 está atrás da corrente de amostra em formato de fita 32 na célula de fluxo. Então, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 é movido em direção a ou na direção contrária à célula de fluxo 22 até que os procedimentos de foco automático estabeleçam que a imagem resolvida no fotossensor é uma imagem focada precisamente de alvo de foco automático 44. Em seguida, o motor 54 é operado para deslocar as posições relativas do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e a célula de fluxo 22 para fazer com que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica foque a corrente de amostra em formato de fita 32, mais especificamente através do movimento do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 na direção contrária à célula de fluxo 22, precisamente na amplitude da distância de deslocamento 52. Nessa modalidade exemplificadora, mostra-se que o dispositivo de imageamento 24 é movido pelo motor 54 para atingir uma posição de foco. Em outras modalidades, a célula de fluxo 22 é movida, ou tanto a célula de fluxo 22 quanto o dispositivo de imageamento 24 são movidos, por meios similares para obter imagens focadas.
[00172] Tais direções de movimento seriam, obviamente, invertidas se o alvo de foco 44 estivesse localizado na janela de porta de visualização frontal em vez da janela de iluminação traseira 43. Nesse caso, a distância de deslocamento seria a amplitude entre a corrente de amostra em formato de fita 32 e um alvo 44 na porta de visualização frontal (não mostrada).
[00173] A distância de deslocamento 52, que é igual à distância entre a corrente de amostra em formato de fita 32 e o alvo de foco automático 44 ao longo do eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24, pode ser estabelecida em uma etapa de calibração de fábrica ou estabelecida por um usuário. Tipicamente, quando estabelecida, a distância de deslocamento 52 não é alterada. As variações e vibrações de expansão térmica podem fazer com que a posição exata do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e célula de fluxo 22 variem uma em relação à outra necessitando, assim, da reinicialização do processo de foco automático. Porém, focar automaticamente no alvo 44 fornece uma referência de posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22 e, portanto, fixa em relação à corrente de amostra em formato de fita 32. De modo semelhante, a distância de deslocamento é constante. Portanto, através do foco automático no alvo 44 e do deslocamento do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e da célula de fluxo 22 na amplitude da distância de deslocamento, o resultado é que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica está focado na corrente de amostra em formato de fita 32.
[00174] De acordo com algumas modalidades, o alvo de focalização é fornecido como um círculo de alto contraste estampado ou aplicado ao redor da abertura de iluminação 43. As configurações de alvo de focalização alternativas são discutidas em outra parte deste documento. Quando uma imagem quadrada ou retangular é coletada em foco no alvo 44, um rebordo de alto contraste surge ao redor do centro da iluminação. Buscar a posição em que o maior contraste é obtido na imagem nas bordas internas da fenda foca automaticamente o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica no local de trabalho do alvo 44. De acordo com algumas modalidades, o termo "distância de trabalho" pode se referir à distância entre a objetiva e seu plano focal e o termo "local de trabalho" pode se referir ao plano focal do dispositivo de imageamento. A maior medida de contraste de uma imagem é onde o pixel branco mais brilhante e o pixel preto mais escuro medidos estão adjacentes um ao outro ao longo de uma linha através de uma borda interna. A medida de contraste mais alta pode ser usada para avaliar se o plano focal do dispositivo de imageamento está na posição desejada em relação ao alvo 44. Outras técnicas de foco automático podem, também, ser usadas, tais como técnicas de detecção de borda, segmentação de imagem e integração das diferenças na amplitude entre pixels adjacentes e busca da maior soma de diferenças. Em uma técnica, a soma de diferenças é calculada em três distâncias que abrangem posições de trabalho em ambos os lados do alvo 44 e corresponde aos valores resultantes a uma curva característica, em que a distância ideal está no valor de pico da curva. Associadamente, as técnicas de foco automático exemplificadoras podem envolver coletar imagens da célula de fluxo alvo em diferentes posições e analisar as imagens para encontrar a melhor posição de foco com o uso de uma medição que é maior quando a imagem do alvo é a mais acentuada. Durante uma primeira etapa (grosseira) a técnica de foco automático pode operar para encontrar uma melhor posição preliminar de um conjunto de imagens coletadas a intervalos de 2,5 μm. A partir de tal posição, a técnica de foco automático pode, então, envolver coletar um segundo conjunto de imagens (finas) a intervalos de 0,5 μm e calcular a melhor posição final de foco no alvo.
[00175] Em alguns casos, o alvo de foco (padrão de foco automático) pode estar situado na periferia da área de visualização em que a amostra deve aparecer. É, ainda, possível que o alvo de foco possa ser definido através de formatos contrastantes que estão situados no campo de visão, tal como o representado na Figura 15. Tipicamente, o alvo de foco automático é montado na célula de fluxo ou fixado rigidamente em uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Sob a potência de um motor de posicionamento controlado por um detector responsivo à maximização do contraste da imagem do alvo de foco automático, o aparelho foca automaticamente no alvo em vez da corrente de amostra em formato de fita. Em seguida, através do deslocamento da célula de fluxo e/ou do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica um em relação ao outro, na distância de deslocamento que se sabe que é a distância entre o alvo de foco automático e a corrente de amostra em formato de fita, a posição de trabalho ou o plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é deslocado a partir do alvo de foco automático para a corrente de amostra em formato de fita. Como um resultado, a corrente de amostra em formato de fita aparece em foco na imagem digital coletada.
[00176] A fim de distinguir tipos de partícula através de técnicas de processamento de dados, tais como categorias e/ou subcategorias de hemácias e glóbulos brancos, é vantajoso registrar imagens de pixels microscópicos que têm resolução e clareza suficientes para revelar os aspectos que distinguem uma categoria ou subcategoria das outras. É um objetivo da invenção facilitar as técnicas de foco automático conforme descrito.
[00177] Em uma modalidade prática, o aparelho pode ter por base uma disposição de banco óptico tal como mostrado na Figura 1A e conforme ampliado na Figura 1B, que tem uma fonte de iluminação 42 direcionada sobre uma célula de fluxo 22 montada em um condutor de célula de fluxo ou de cardans 55, de modo a retroiluminar os conteúdos da célula de fluxo 22 em uma imagem obtida através de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24. O condutor 55 é montado em um acionamento de motor de modo a ser precisamente móvel em direção a, e na direção contrária ao dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24. O condutor 55 permite, ainda, um alinhamento preciso da célula de fluxo em relação ao eixo geométrico de visualização óptica do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital, de modo que a corrente de amostra em formato de fita flua em um plano normal em relação ao eixo geométrico de visualização na zona em que a corrente de amostra em formato de fita é imageada, mais especificamente entre a abertura de iluminação 43 e a porta de visualização 57 conforme representado na Figura 1. O alvo de foco 44 pode auxiliar no ajuste do condutor 55, por exemplo, para estabelecer o plano da corrente de amostra em formato de fita normal em relação ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital.
[00178] Por esse motivo, o portador 55 fornece um ajuste linear e angular muito preciso da posição e orientação da célula de fluxo 22, por exemplo, em relação ao dispositivo de captura de imagem 24 ou à objetiva do dispositivo de captura de imagem. Conforme mostrado neste documento, o condutor 55 inclui dois pontos de pivô 55a, 55b para facilitar o ajuste angular do condutor e célula de fluxo em relação ao dispositivo de captura de imagem. Os pontos de pivô de ajuste angular 55a, 55b estão localizados no mesmo plano e centralizados em relação à canaleta de célula de fluxo (por exemplo, no local de captura de imagem). Isso permite o ajuste dos ângulos sem causar nenhuma translação linear da célula de fluxo posição. O condutor 55 pode ser girado ao redor de um eixo geométrico do ponto de pivô 55a ou ao redor de um eixo geométrico do ponto de pivô 55b ou ao redor de ambos os eixos geométricos. Tal rotação pode ser controlada por um processador e um mecanismo de controle de movimento de célula de fluxo, tal como o processador 440 e o mecanismo de controle de célula de fluxo 442 representado na Figura 4.
[00179] Novamente com referência à Figura 1B, pode-se perceber que qualquer um dos dois, ou tanto o dispositivo de captura de imagem 24 quanto o condutor 55 (juntamente com a célula de fluxo 22), pode ser girado ou transladado ao longo de vários eixos geométricos (por exemplo, X, Y, Z) em três dimensões. Por esse motivo, uma técnica exemplificadora para ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem pode incluir implantar uma rotação axial do dispositivo de captura de imagem 24 ao redor do eixo geométrico de imageamento, por exemplo, através do dispositivo de rotação 24 ao redor do eixo geométrico X. O ajuste de foco também pode ser alcançado através da rotação axial da célula de fluxo 22 e/ou do condutor 55 ao redor de um eixo geométrico que se estende ao longo do eixo geométrico de imageamento, por exemplo, ao redor do eixo geométrico X e no interior do campo de visão do dispositivo de imageamento. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir uma rotação de ponta (por exemplo, rotação ao redor do eixo geométrico Y) do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o ajuste de foco pode inclui uma rotação de ponta (por exemplo, rotação ao redor do eixo geométrico Y ou ao redor do ponto de pivô 55a) da célula de fluxo. Conforme representado neste documento, o ponto de pivô 55a corresponde a um eixo geométrico Y que se estende ao longo e para dentro da trajetória de fluxo da célula de fluxo. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir uma rotação de inclinação (por exemplo, rotação ao redor do eixo geométrico Z) do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir uma rotação de inclinação (por exemplo, rotação ao redor do eixo geométrico Z ou ao redor do ponto de pivô 55b) da célula de fluxo. Conforme representado neste documento, o ponto de pivô 55b corresponde a um eixo geométrico Z que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo geométrico de imageamento. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado na corrente de fluxo de amostra através da implantação de uma rotação da célula de fluxo (por exemplo, ao redor do eixo geométrico X), de modo que a rotação seja centralizada no campo de visão do dispositivo de captura de imagem. Os ajustes de rotação tridimensional descritos neste documento podem ser implantados de modo a considerar o deslize posicional em um ou mais componentes do sistema de analisador. Em alguns casos, os ajustes de rotação tridimensional podem ser implantados de modo a considerar as flutuações de temperatura em um ou mais componentes do sistema de analisador. Em alguns casos, o ajuste de um sistema de analisador pode incluir realizar a translação do dispositivo de imageamento 24 ao longo do eixo geométrico X. Em alguns casos, o ajuste de sistema de analisador pode incluir realizar a translação do condutor 55 ou da célula de fluxo 22 ao longo do eixo geométrico X.
[00180] De acordo com algumas modalidades, um analisador visual para obter imagens de uma amostra que contém partículas suspensas em um líquido inclui a célula de fluxo 22 acoplada a uma fonte 25 da amostra e a uma fonte 27 do material de PIOAL, conforme representado na Figura 1. Conforme representado na vista em corte da Figura 3, a célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo interna que se estreita simetricamente na direção de fluxo (da direita para a esquerda na Figura 3 ou do fundo para o topo na Figura 1). A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra envolta com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo, mais especificamente através da porta de visualização 57.
[00181] Novamente com referência à Figura 1, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital 24 com a lente objetiva 46 é direcionado ao longo de um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita 32. A distância relativa entre a objetiva 46 e a célula de fluxo 33 é variável através da operação de um acionamento de motor 54, para solucionar e coletar uma imagem digitalizada focada em uma matriz de fotossensor.
[00182] O padrão de foco automático 44, que tem uma posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22, está localizado a uma distância de deslocamento 52 em relação ao plano da corrente de amostra em formato de fita 32. Na modalidade mostrada, o padrão de foco automático (alvo 44) é aplicado diretamente à célula de fluxo 22 em uma localização que é visível na imagem coletada pelo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24. Em uma outra modalidade, o alvo pode ser transportado em uma parte que está rigidamente fixa na posição em relação à célula de fluxo 22 e a corrente de amostra em formato de fita 32 na mesma, se não estiver aplicada diretamente ao corpo da célula de fluxo de uma maneira integral.
[00183] A fonte de luz 42, que pode ser uma fonte estável ou pode ser um estroboscópio que é piscado de modo sincronizado com a operação do fotossensor do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica, está configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita 32 e também contribui para o contraste do alvo 44. Na modalidade representada, a iluminação é proveniente da retroiluminação.
[00184] A Figura 1C fornece um diagrama de blocos que mostra aspectos adicionais de um analisador de hematologia exemplificador. Conforme mostrado neste documento, o analisador 100c inclui pelo menos um processador digital 18 acoplado para operar o acionamento de motor 54 e para analisar a imagem digitalizada da matriz de fotossensor, conforme coletada em diferentes posições de foco em relação ao padrão-alvo de foco automático 44. O processador 18 está configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático 44, isto é, para focar automaticamente no padrão-alvo de foco automático 44 e estabelecer, assim, uma distância ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e o padrão de foco automático 44. Isso pode ser alcançado através das etapas de processamento de imagem, tal como a aplicação de um algoritmo para avaliar o nível de contraste na imagem em uma primeira distância, que pode ser aplicada à imagem inteira ou pelo menos em uma borda do padrão de foco automático 44. O processador move o motor 54 para outra posição e avalia o contraste em tal posição ou borda e após duas ou mais interações determina uma distância ideal que maximiza a exatidão do foco no padrão de foco automático 44 (ou otimiza a exatidão do foco se for movido para tal posição). O processador depende do espaçamento fixo entre o padrão de foco automático do alvo do foco automático 44 e a corrente de amostra em formato de fita, o processador 18, em seguida, controla o motor 54 para mover o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 para a distância correta para focar na corrente de amostra em formato de fita 32. Mais especificamente, o processador opera o motor para deslocar a distância entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita 32 pela distância de deslocamento 52 (por exemplo, conforme representado na Figura 1) por meio do qual a corrente de amostra em formato de fita é deslocada do padrão-alvo de foco automático 44. Dessa forma, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é focalizado na corrente de amostra em formato de fita.
[00185] O motor 54 pode compreender um motor de passo de engrenagem com uma precisão consideravelmente menor que os recursos de distinção imageados pelo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital, especialmente os aspectos das células de sangue. Desde que a localização do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 seja ajustada para localizar a posição da objetiva óptica na largura da corrente de amostra em formato de fita, a vista da célula/partícula na corrente de amostra em formato de fita estará em foco. Um padrão de foco automático 44 pode estar localizado em uma borda de um campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital e não interfere com a visualização por esse motivo.
[00186] Ademais, quando o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é movido ao longo da distância de deslocamento e o padrão de foco automático sai de foco, os recursos que aparecem em foco são as células de sangue em vez do padrão de foco automático. Na modalidade da Figura 21, por exemplo, o padrão de foco automático é definido por formatos no campo de visão. Os formatos são formas discretas relativamente finas de um tamanho limitado e, portanto, após se moverem pela distância de deslocamento, as formas se tornam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizada na corrente de amostra em formato de fita. Uma distância de deslocamento típica pode ser, por exemplo, de 50 a 100 μm em uma célula de fluxo dimensionada para as aplicações de imageamento de hematologia (célula de sangue). Em algumas modalidades, o recurso de foco automático mantém o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica a 1 μm da distância de foco ideal.
[00187] O contorno interno da célula de fluxo e as taxas de fluxo de PIOAL e a amostra podem ser ajustados de modo que a amostra forme uma corrente em formato de fita. A corrente pode ser aproximadamente tão fina quanto ou até mesmo mais fina do que as partículas que estão envoltas na corrente de amostra em formato de fita. Os glóbulos brancos podem ter um diâmetro de cerca de 10 μm, por exemplo. Fornecendo- se uma corrente de amostra em formato de fita com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em formato de fita é estendida pelo fluido de revestimento ou PIOAL. Surpreendentemente, estender a corrente de amostra em formato de fita ao longo de uma trajetória de fluxo de estreitamento em camadas de PIOAL com uma viscosidade diferente da corrente de amostra em formato de fita, tal como uma viscosidade superior, tende a alinhar, vantajosamente, as partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo e a aplicar forças sobre as células, de modo a aprimorar os conteúdos em foco das estruturas intracelulares das células. O eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 é substancialmente normal (perpendicular) em relação ao plano da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita no ponto de imageamento pode ser, por exemplo, de 20 a 200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser, por exemplo, de 50 a 150 mm/segundo.
[00188] A espessura de corrente de amostra em formato de fita pode ser afetada pelas viscosidades e taxas de fluxo relativas do fluido de amostra e do PIOAL. Novamente com referência à Figura 1, a fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do PIOAL, por exemplo, que compreende bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL a taxas de fluxo controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita 32, mais especificamente como uma fita fina pelo menos tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24.
[00189] Em uma modalidade, a fonte 27 do PIOAL está configurada para fornecer o PIOAL a uma viscosidade predeterminada. Tal viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra e pode ser maior que a viscosidade da amostra. A viscosidade e a densidade do PIOAL, a viscosidade do material de amostra, a taxa de fluxo do PIOAL e a taxa de fluxo do material de amostra são coordenadas para manter a corrente de amostra em formato de fita à distância de deslocamento em relação ao padrão de foco automático e com as características dimensionais predeterminadas, tal como uma espessura de corrente de amostra em formato de fita vantajosa.
[00190] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear superior à amostra e uma viscosidade superior à amostra estendendo, assim, a amostra de modo a formar uma fita achatada. Em alguns casos, a viscosidade de PIOAL pode ser até 0,01 Pa.s (10 centipoise).
[00191] Na modalidade mostrada na Figura 1C, o mesmo processador digital 18 que é usado para analisar a imagem digital de pixel obtida através da matriz de fotossensor também é usado para controlar o motor de foco automático 54. Entretanto, tipicamente, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 não é focado automaticamente para todas as imagens capturadas. O processo de foco automático pode ser alcançado periodicamente (no início do dia ou no início de um turno) ou, por exemplo, quando a temperatura ou outras alterações de processo forem detectadas através dos sensores adequados ou quando a análise de imagem detecta uma necessidade potencial para refocar. Em alguns casos, um processo automatizado de foco automático pode ser realizado em um tempo de duração de cerca de 10 segundos. Em alguns casos, um procedimento de foco automático pode ser realizado antes do processamento de uma prateleira de amostras (por exemplo, 10 amostras por prateleira). É possível, ainda, em outras modalidades, que a análise de imagem de hematologia seja realizada por um processador e ter um processador separado, opcionalmente associado à sua própria matriz de fotossensor, disposto para lidar com as etapas de foco automático para um alvo fixo 44.
[00192] O processador digital 18 pode ser configurado para realizar o foco automático em momentos programados ou em condições programadas ou mediante a demanda do usuário e é configurado, também, para realizar uma categorização e subcategorização com base em imagem das partículas. As partículas exemplificadoras incluem células, glóbulos brancos, hemácias e similares.
[00193] Em uma modalidade, o processador digital 18 da Figura 1 ou Figura 1C está configurado para detectar um sinal de reinicialização de foco automático. O sinal de reinicialização de foco automático pode ser acionado por uma alteração detectada na temperatura, uma diminuição na qualidade de foco conforme discernida através de parâmetros da data de imagem de pixel, passagem do tempo ou entrada de usuário. Vantajosamente, não é necessário recalibrar no sentido de medição da distância de deslocamento 52 representada na Figura 1 para recalibrar. Opcionalmente, o foco automático pode ser programado para recalibrar a determinadas frequências/intervalos entre ciclos para o controle de qualidade e ou para manter o foco.
[00194] A distância de deslocamento 52 varia ligeiramente de uma célula de fluxo para outra, porém, permanece constante para uma determinada célula de fluxo. Como um processo de configuração ao encaixar um analisador de imagem com uma célula de fluxo, a distância de deslocamento é estimada primeiro e, em seguida, durante as etapas de calibração em que os aspectos de foco automático e de imageamento são exercidos, a distância de deslocamento exata para a célula de fluxo é determinada e inserida como uma constante na programação do processador 18.
[00195] Consequentemente, conforme mostrado sob a forma de fluxograma na Figura 1D e com referência ao analisador de hematologia da Figura 1 e/ou da Figura 1C, o processo realizado de acordo com os métodos e o aparelho revelados pode envolver calibrar uma vez ou raramente. A calibração pode incluir a focalização no alvo e contraste 44, a focalização na corrente de amostra em formato de fita 32 e a indicação do deslocamento ao longo do eixo geométrico óptico entre esses dois locais, conforme indicado na etapa 110d. Tal deslocamento pode ser indicado como uma constante. Em seguida, através do controle do motor 54 e da análise dos dados de imagem a partir da matriz de fotossensor, o processador 18 foca automaticamente no alvo 44 e desloca o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e/ou a célula de fluxo 22 um em relação ao outro pela distância de deslocamento indicada, conforme indicado na etapa 120d. A corrente de amostra em formato de fita 32 está, então, em foco e sua imagem pode ser coletada (conforme indicado na etapa 130d) e processada (conforme indicado na etapa 140d) a intervalos regulares, especificamente a intervalos suficientes para coletar vistas adjacentes substancialmente não se sobrepostas das porções da corrente de amostra em formato de fita que passa através da zona de visualização na porta de visualização 57. Quando o auto monitoramento (conforme indicado na etapa 150d) revela uma anomalia de dados ou uma alteração de temperatura que pode ter alterado as posições relativas do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e da célula de fluxo 22 devido às diferenças na expansão térmica, então o foco automático (conforme indicado na etapa 160d) é iniciado, em que após o mesmo, a operação regular é continuada. Por esse motivo, um processo de foco automático pode incluir detectar a sinal de reinicialização de foco automático e repetir as etapas de captura de imagem e foco automático em resposta ao sinal de reinicialização de foco automático. Em algumas modalidades, o sinal de reinicialização de foco automático pode incluir ou ter por base a alteração na temperatura, uma diminuição na qualidade de foco, um intervalo de tempo decorrido ou uma entrada de usuário.
[00196] A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser limitada o suficiente para evitar o embaçamento por movimento da imagem digitalizada no tempo de exposição da imagem da matriz de fotossensor. A fonte de luz pode, opcionalmente, ser uma luz de estroboscópio que é piscada para aplicar uma alta amplitude incidente durante um breve momento. Na medida em que o padrão de foco automático 44 e a imagem estão no mesmo campo de visão, a fonte de luz é configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático simultaneamente. Entretanto, em outras modalidades, os campos de visão para imageamento e para focar automaticamente podem ser diferentes, por exemplo, iluminados e/ou imageados separadamente.
[00197] Os desenvolvimentos da matéria têm aspectos de método assim como de aparelho. Um método para a focalização de um analisador visual compreende focalizar um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24, que pode ser um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital ou o dispositivo de captura de imagem digital, em um padrão de foco automático 44 fixo em relação a uma célula de fluxo 22, em que o padrão de foco automático 44 está localizado a uma distância de deslocamento 52 em relação à corrente de amostra em formato de fita 32. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital 24 tem uma objetiva com um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita 32. Uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo 22 é variada através da operação de um acionamento de motor 54, enquanto a distância ao longo do eixo geométrico óptico entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e o ponto de foco ideal é conhecida. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital é configurado para resolver e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. O acionamento de motor é operado para focar no padrão de foco automático em um processo de foco automático. O acionamento de motor é, então, operado ao longo da distância de deslocamento focando, assim, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na corrente de amostra em formato de fita.
[00198] É possível usar o foco automático no alvo e realizar o deslocamento pela distância de deslocamento para obter uma distância adequada para focar na corrente de amostra em formato de fita. Vantajosamente, entretanto, a realização do foco automático não é necessária ou repetida para cada captura de imagem. Entretanto, o foco automático é iniciado em determinadas condições. Um sinal de reinicialização de foco automático pode ser detectado ou gerado, de modo a levar às etapas de refocalização no padrão de foco automático, operando-se o acionamento de motor ao longo da distância de deslocamento e refocalizando-se o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na corrente de amostra em formato de fita. O sinal de reinicialização de foco automático pode ser gerado pela detecção de uma alteração, por exemplo, na temperatura, uma diminuição na qualidade de foco, a passagem do tempo, outros parâmetros de processo ou entrada de usuário.
[00199] A Figura 1E é um diagrama de blocos simplificado de um sistema de módulo exemplificador que ilustra amplamente como os elementos de sistema individuais para um sistema de módulo 100e podem ser implantados de uma maneira separada ou mais integrada. O sistema de módulo 100e pode ser uma parte de ou estar em conectividade com um sistema de análise de partícula para gerar imagens de partículas em um fluido de amostra sanguínea, de acordo com modalidades da presente invenção. O sistema de módulo 100e é bem adequado para produzir dados ou instruções relacionadas às técnicas de focalização e imageamento, receber entradas relacionadas às técnicas de focalização e imageamento e/ou informações de processamento ou dados relacionados às técnicas de focalização e imageamento, conforme descrito em outra parte deste documento. Em alguns casos, o sistema de módulo 100e inclui elementos de hardware que estão eletricamente acoplados através de um subsistema de barramento 102e, incluindo um ou mais processadores 104e, um ou mais dispositivos de entrada 106e, tais como usuário interface dispositivos de entrada e/ou um ou mais dispositivos de saída 108e tais como dispositivos de saída de interface de usuário. Em alguns casos, o sistema 100e inclui uma interface de rede 110e e/ou uma interface de sistema de imageamento 140e que pode receber sinais de e/ou transmitir sinais para um sistema de imageamento 142e. Em alguns casos, o sistema 100e inclui elementos de software, por exemplo, mostrados neste documento como atualmente localizados em uma memória de trabalho 112e de uma memória 114e, um sistema operacional 116e e/ou outro código 118e, tal como um programa configurado para implantar um ou mais aspectos das técnicas reveladas neste documento.
[00200] Em algumas modalidades, o sistema de módulo 100e pode incluir um subsistema de armazenamento 120e que pode armazenar a programação básica e construtos de dados que fornecem a funcionalidade das várias técnicas reveladas neste documento. Por exemplo, os módulos de software que implantam a funcionalidade de aspectos de método, conforme descrito neste documento, podem ser armazenados no subsistema de armazenamento 120e. Tais módulos de software podem ser executados pelo um ou mais processadores 104e. Em um ambiente distribuído, os módulos de software podem ser armazenados em uma pluralidade de sistemas de computador e executados por processadores da pluralidade de sistemas de computador. O subsistema de armazenamento 120e pode incluir o subsistema de memória 122e e o subsistema de armazenamento de arquivos 128e. O subsistema de memória 122e pode incluir diversas memórias incluindo uma memória de acesso aleatório principal (RAM) 126e para o armazenamento de instruções e dados durante a execução do programa e uma memória somente de leitura (ROM) 124e em que as instruções fixas são armazenadas. O subsistema de armazenamento de arquivos 128e pode fornecer um armazenamento persistente (não volátil) para arquivos de programa e dados e pode incluir meios de armazenamento tangíveis que podem, opcionalmente, incorporar dados de amostra, paciente, tratamento, avaliação ou outros dados. O subsistema de armazenamento de arquivos 128e pode incluir uma unidade de disco rígido, uma unidade de disquete juntamente com os meios removíveis associados, uma unidade de Memória Somente de Leitura de Disco Compacto (CD-ROM), uma unidade óptica, DVD, CD- R, CD RW, memória removível de estado sólido, outros cartuchos ou discos de meios removíveis e similares. Uma ou mais das unidades podem estar localizadas em locais remotos em outros computadores conectados em outros locals acoplados ao sistema de módulo 100e. Em alguns casos, os sistemas podem incluir um meio de armazenamento legível por computador ou outro meio de armazenamento tangível que armazena uma ou mais sequências de instruções que, quando executadas por um ou mais processadores, podem fazer com que o um ou mais processadores realizem qualquer aspecto das técnicas ou métodos revelados neste documento. Um ou mais módulos que implantam a funcionalidade das técnicas reveladas neste documento podem ser armazenados pelo subsistema de armazenamento de arquivos 128e. Em algumas modalidades, o software ou código irá fornecer um protocolo para permitir que o sistema de módulo 100e se comunique com a rede de comunicação 130e. Opcionalmente, essas comunicações podem incluir comunicações por conexão por discagem ou conexão de Internet.
[00201] Observa-se que o sistema 100e pode ser configurado para executar vários aspectos de métodos da presente invenção. Por exemplo, o componente ou módulo de processador 104e pode ser um módulo de controle de microprocessador configurado para receber sinais de parâmetro de temperatura e/ou parâmetros operacionais de célula de fluxo a partir de um dispositivo ou módulo de entrada de sensor 132e, de um dispositivo ou módulo de entrada de interface de usuário 106e e/ou de um sistema de imageamento 142e, opcionalmente, através de uma interface de sistema de imagem 140e e/ou uma interface de rede 110e e uma rede de comunicação 130e. Em alguns casos, o(s) dispositivo(s) de entrada de sensor pode(m) incluir ou ser uma parte de um sistema de análise de partícula que é equipado para obter imagens de amostras de fluido de sangue. Em alguns casos, o(s) dispositivo(s) de entrada de interface de usuário 106e e/ou a interface de rede 110e podem ser configurados para receber sinais de parâmetro de imagem gerados por um sistema de análise de partícula que é equipado para obter parâmetros de imagem. Em alguns casos, o sistema de imageamento 142e pode incluir ou ser uma parte de um sistema de análise de partícula que é equipado para obter parâmetros de imagem relacionados às amostras de fluido de sangue.
[00202] O componente ou módulo de processador 104e pode, ainda, estar configurado para transmitir sinais de parâmetro de análise de partícula ou sinais de parâmetro de imagem opcionalmente processados, de acordo com qualquer uma das técnicas reveladas neste documento, para o dispositivo ou módulo de saída de sensor 136e, para o dispositivo ou módulo de saída de interface de usuário 108e, para o dispositivo ou módulo de interface de rede 110e, para a interface de sistema de imageamento 140e ou qualquer combinação dos mesmos. Cada dos dispositivos ou módulos de acordo com as modalidades da presente invenção pode incluir um ou mais módulos de software em um meio legível por computador que é processado por um processador, ou módulos de hardware, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer dentre uma variedade de plataformas comumente usadas, como Windows, MacIntosh e Unix, juntamente com qualquer dentre uma variedade de linguagens de programação comumente usadas, pode ser usada para implementar modalidades da presente invenção.
[00203] Os dispositivos de entrada de interface de usuário 106e podem incluir, por exemplo, um touchpad, um teclado, dispositivos de apontamento, tais como um mouse, uma trackball, um aparelho de tipo tablet de gráficos, um escaneador, um joystick, uma tela de toque incorporado em um visor, dispositivos de entrada de áudio, tais como sistemas de reconhecimento de voz, microfones e outros tipos de dispositivos de entrada. Os dispositivos de entrada de usuário 106e podem, também, baixar um código executável por computador a partir de meios de armazenamento tangíveis ou da rede de comunicação 130e, em que o código incorpora qualquer um dos métodos ou aspectos do mesmo revelados neste documento. Será entendido que o software do terminal pode ser atualizado de tempos em tempos e baixado para o terminal, conforme for adequado. Em geral, o uso do termo "dispositivo de entrada" se destina a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e de propriedade maneira para inserir informações no sistema de módulo 100e.
[00204] Os dispositivos de saída de interface de usuário 106e podem incluir, por exemplo, um subsistema de exibição, uma impressora, uma máquina de fac-símile ou exibições não visuais, tais como dispositivos de saída de áudio. O subsistema de exibição pode ser um tubo de raios catódicos (TRC), um dispositivo de painel plano, como uma tela de cristal líquido (LCD), um dispositivo de projeção, ou similares. O subsistema de exibição pode também fornecer uma exibição não visual, como através de dispositivos de saída de áudio. Em geral, o uso do termo "dispositivo de saída"destina-se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e proprietários e formas de fornecer informações do sistema de módulo 600 para um usuário.
[00205] O subsistema de barramento 102e fornece um mecanismo para permitir que os vários componentes e subsistemas do sistema de módulo 100e se comuniquem entre si conforme é pretendido ou desejado. Os vários subsistemas e componentes do sistema de módulo 100e não precisam estar na mesma localização física, mas podem ser distribuídos em várias localizações em uma rede distribuída. Embora o subsistema de barramento 102e seja mostrado esquematicamente com um barramento único, as modalidades alternativas do subsistema de barramento podem utilizar múltiplos barramentos.
[00206] A interface de rede 110e pode fornecer uma interface para uma rede externa 130e ou outros dispositivos. A rede de comunicação externa 130e pode ser configurada para realizar comunicações conforme necessário ou desejado com outros participantes. A mesma pode receber, portanto, um pacote eletrônico do sistema de módulo 100e e transmitir quaisquer informações conforme necessário ou desejado de volta para o sistema de módulo 100e. Conforme representado neste documento, a rede de comunicação 130e e/ou a interface de sistema de imageamento 142e pode transmitir informações para ou receber informações a partir de um sistema de imageamento 142e que é equipado para obter imagens ou parâmetros de imagem que correspondem às amostras de fluido de sangue.
[00207] Além de fornecer tais enlaces de comunicações de infraestrutura internos ao sistema, o sistema de rede de comunicações 130e pode, também, fornecer uma conexão com outras redes, tais como a internet e pode compreender um modem com ou sem fio e/ou outro tipo de conexão de realização de interface.
[00208] Ficará aparente ao versado na técnica que variações consideráveis podem ser usadas de acordo com requisitos específicos. Por exemplo, hardware personalizado também poderá ser usado e/ou elementos específicos poderão ser implementados no hardware, software (incluindo software portátil, como applets), ou ambos. Adicionalmente, a conexão com outros dispositivos de computação, como dispositivos de entrada/saída de rede, pode ser usada. O sistema de terminal de módulo 100e em si pode ter tipos variantes, incluindo um terminal de computador, um computador pessoal, um computador portátil, uma estação de trabalho, um computador de rede ou qualquer outro sistema de processamento de dados. Devido à natureza de alterações constantes de computadores e redes, a descrição do sistema de módulo 100e representado na Figura 1E é destinada apenas como um exemplo específico para os propósitos de ilustração de uma ou mais modalidades da presente invenção. Muitas outras configurações do sistema de módulo 100e são possíveis com mais ou menos componentes do que o sistema de módulo representado na Figura 1E. Qualquer um dos módulos ou componentes do sistema de módulo 100e ou quaisquer combinações de tais módulos ou componentes podem ser acoplados a ou integrados em ou, de outro modo, configurados para estarem em conectividade com qualquer uma das modalidades de análise de partícula e/ou de sistema de imageamento reveladas neste documento. Da mesma forma, qualquer um dos componentes de hardware e software discutidos acima podem ser integrados com ou configurados para interfacear com outro sistema de avaliação médica ou de tratamento usado em outros locais.
[00209] Em algumas modalidades, o sistema de módulo 100e pode ser configurado para receber um ou mais parâmetros de imagem de uma amostra de fluido de sangue em um módulo de entrada. Os dados de parâmetro de imagem podem ser transmitidos para um módulo de avaliação em que o diagnóstico ou outros resultados podem ser previstos ou determinados com base na análise dos dados de imagem. Os dados de imagem ou diagnóstico podem ser emitidos para um usuário de sistema através de um módulo de saída. Em alguns casos, o sistema de módulo 100e pode determinar resultados de diagnóstico para uma amostra de fluido de sangue, por exemplo, com o uso de um módulo de diagnóstico. As informações de diagnóstico podem ser emitidas para um usuário de sistema através de um módulo de saída. Opcionalmente, determinados aspectos do diagnóstico podem ser determinados por um dispositivo de saída e transmitidos para um sistema de diagnóstico ou um subdispositivo de um sistema de diagnóstico. Qualquer um, dentre uma variedade de dados relacionados às amostras de fluido de sangue ou aos pacientes de quem as amostras são obtidas, pode ser inserido no sistema de módulo, incluindo idade, peso, sexo, histórico de tratamento, histórico médico e similares. Os parâmetros dos regimes de tratamento ou avaliações diagnósticas podem ser determinados com base nesses dados.
[00210] Associadamente, em alguns casos, um sistema inclui um processador configurado para receber os dados de imagem como uma entrada. Opcionalmente, um processador, meio de armazenamento ou ambos podem ser incorporados em uma máquina de análise de partícula ou hematologia. Em alguns casos, a máquina de hematologia pode gerar dados de imagem ou outras informações para a inserção no processador. Em alguns casos, um processador, um meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado em um computador, e o computador pode estar em comunicação com um aparelho de hematologia. Em alguns casos, um processador, um meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado em um computador, e o computador pode estar em comunicação remota com um aparelho de hematologia através de uma rede.
Célula de fluxo
[00211] Uma modalidade prática da célula de fluxo 22 é adicionalmente representada nas Figuras 2 e 3. Conforme mostrado neste documento, a célula de fluxo 22 pode estar acoplada a uma fonte de amostra 25 e, também, a uma fonte 27 de material de PIOAL. O fluido de amostra é injetado na célula de fluxo 22 através da cânula 29, por exemplo, através de uma porta de saída distal 31 da cânula 29. Tipicamente, o fluido de revestimento PIOAL não está em um estado de fluxo laminar conforme o mesmo se desloca através de uma seção de canaleta curva 41 na célula de fluxo a partir da fonte 27 em direção à zona de visualização 23. Entretanto, a célula de fluxo 22 pode ser configurada de modo que o fluido de revestimento PIOAL esteja ou se torne laminar ou apresente um perfil de velocidade plana, conforme o mesmo flui através da porta de saída distal 31 onde o fluido de amostra é introduzido no fluido de revestimento fluente. O fluido de amostra e o PIOAL podem fluir ao longo da célula de fluxo 22 em uma direção indicada, de modo geral, pela seta A e, em seguida, para fora da célula de fluxo 22 através da descarga 33. A célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo interna 20 que se estreita simetricamente (por exemplo, na zona de transição 21) na direção de fluxo A. A simetria da trajetória de fluxo contribui para um fluxo robusto e centralizado da corrente de amostra. A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra envolta com o PIOAL através de uma zona de visualização 23 na célula de fluxo, mais especificamente atrás da porta de visualização 57. Um padrão de foco automático 44 está associado à porta de visualização 57. Uma célula de fluxo 22 também tem um assento arredondado ou rebaixado 58 que é configurado para admitir ou receber uma objetiva de microscópio (não mostrado).
[00212] De acordo com algumas modalidades, o padrão de foco automático 44 pode ter uma posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22 e que está localizada a uma distância de deslocamento em relação ao plano da corrente de amostra em formato de fita 32. Na modalidade mostrada neste documento, o padrão de foco automático (alvo 44) é aplicado diretamente à célula de fluxo 22 em um local que é visível em uma imagem coletada através da porta de visualização 57 por meio de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica (não mostrado). Uma célula de fluxo 22 pode ser construída a partir de um único pedaço de material. Alternativamente, a célula de fluxo 22 pode ser construída a partir de uma primeira seção ou camada ou uma seção ou camada superior 22a e uma segunda seção ou camada ou uma seção ou camada inferior 22b. Conforme mostrado neste documento, um painel de janela de vidro ou transparente 60 está fixado a ou forma uma parte integral com a primeira seção 22a. O painel 60 pode definir pelo menos uma porção da trajetória de fluxo de amostra no interior da célula de fluxo. A luz da fonte de luz 42 pode se deslocar através de uma abertura ou passagem do padrão de foco automático 44 de modo a iluminar as partículas de amostra que fluem na corrente de fluxo 32.
[00213] Em alguns casos, a espessura do painel 60 pode ter um valor em uma faixa de cerca de 150 μm a cerca de 170 μm. Conforme observado acima, o painel 60 pode definir ou formar uma parte da canaleta de trajetória de fluxo ou revestimento (por exemplo, PIOAL). Usando-se um painel fino 60, é possível colocar a objetiva de microscópio muito próxima à fita de fluido de amostra e, assim, obter imagens altamente ampliadas das partículas que fluem ao longo da trajetória de fluxo.
[00214] A Figura 3A representa aspectos de uma modalidade de célula de fluxo, em que uma distância entre o eixo geométrico de imageamento 355 e a porção da zona de transição distal 316 tem cerca de 8,24 mm. Uma distância entre a porção da zona de transição distal 316 e a porta de saída da cânula 331 tem cerca de 12,54 mm. Uma distância entre a porta de saída da cânula 331 e a entrada de fluido de revestimento 301 tem cerca de 12,7 mm. Uma distância entre a porta de saída da cânula 331 e uma porção da zona de transição proximal 318 tem cerca de 0,73 mm. A Figura 3B representa aspectos de uma modalidade de célula de fluxo em que a porta de saída da cânula foi movida para um local mais distal em relação à zona de transição em comparação à modalidade da Figura 3A. Conforme mostrado neste documento, a extremidade distal da cânula é avançada para dentro da zona de transição de estreitamento da célula de fluxo e uma distância entre o eixo geométrico de imageamento 355 e a porção da zona de transição distal 316 está em uma faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em alguns casos, a distância entre o eixo geométrico de imageamento 355 e a porção da zona de transição distal 316 tem cerca de 21 mm.
[00215] Novamente com referência à Figura 1, o contorno interno da célula de fluxo (por exemplo, na zona de transição 21) e as taxas de fluxo de PIOAL e amostra podem ser ajustados de modo que a amostra forme uma corrente em formato de fita 32. A corrente pode ser aproximadamente tão fina quanto ou até mesmo mais fina do que as partículas que estão envoltas na corrente de amostra em formato de fita. Os glóbulos brancos podem ter um diâmetro de cerca de 10 μm, por exemplo. Fornecendo-se uma corrente de amostra em formato de fita com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em formato de fita é estendida pelo fluido de revestimento ou PIOAL. Surpreendentemente, estender a corrente de amostra em formato de fita ao longo de uma trajetória de fluxo de estreitamento no interior das camadas de PIOAL de viscosidade diferente da corrente de amostra em formato de fita, tal como uma viscosidade superior, tende a alinhar, vantajosamente, as partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo e a aplicar forças sobre as células, de modo a aprimorar os conteúdos em foco das estruturas intracelulares das células. O eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 é substancialmente normal (perpendicular) em relação ao plano da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita no ponto de imageamento pode ser, por exemplo, de 20 a 200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser, por exemplo, de 50 a 150 mm/segundo.
[00216] A espessura de corrente de amostra em formato de fita pode ser afetada pelas viscosidades e taxas de fluxo relativas do fluido de amostra e do PIOAL. A fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do PIOAL, por exemplo, que compreendem bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL a taxas de fluxo controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita 32, mais especificamente como uma fita fina pelo menos tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24.
[00217] Em uma modalidade, a fonte 27 do PIOAL está configurada para fornecer o PIOAL a uma viscosidade predeterminada. Tal viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra e pode ser maior que a viscosidade da amostra. A viscosidade e a densidade do PIOAL, a viscosidade do material de amostra, a taxa de fluxo do PIOAL e a taxa de fluxo do material de amostra são coordenadas para manter a corrente de amostra em formato de fita à distância de deslocamento em relação ao padrão de foco automático e com as características dimensionais predeterminadas, tal como uma espessura de corrente de amostra em formato de fita vantajosa.
[00218] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear superior à amostra e uma viscosidade superior à amostra estendendo, assim, a amostra, de modo a formar uma fita achatada. A viscosidade de PIOAL pode ter até 0,01 Pa.s (10 centipoise).
[00219] Referindo-se, ainda, às Figuras 2 e 3, a trajetória de fluxo interna da célula de fluxo se estreita a jusante do ponto de injeção da corrente de amostra em formato de fita para dentro do PIOAL para produzir uma espessura de corrente de amostra em formato de fita, por exemplo, de até 7 μm e/ou a trajetória de fluxo interna produz uma largura de corrente de amostra em formato de fita de 500 a 3.000 μm. Em modalidades exemplificadoras, conforme representado na Figura 1, a trajetória de fluxo interna da célula de fluxo inicia a zona de transição de estreitamento a montante do ponto de injeção da corrente de amostra para dentro do PIOAL.
[00220] Em uma outra modalidade, a trajetória de fluxo interna se estreita para produzir uma espessura de corrente de amostra em formato de fita de 2 a 4 μm de espessura e/ou a trajetória de fluxo interna resulta na corrente de amostra em formato de fita de 2.000 μm de largura. Tais dimensões são particularmente úteis para a hematologia. A espessura da corrente nesse caso é menor que o diâmetro de algumas partículas, tais como hemácias em seu estado relaxado. Consequentemente, tais partículas podem se tornar reorientadas de modo que sua dimensão mais ampla esteja voltada para o eixo geométrico de imageamento, o que é útil para revelar características de distinção.
[00221] A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser limitada o suficiente para evitar o embaçamento por movimento da imagem digitalizada no tempo de exposição da imagem da matriz de fotossensor. A fonte de luz pode, opcionalmente, ser de uma luz de estroboscópio que é piscada para aplicar uma alta amplitude incidente durante um breve momento. Na medida em que o padrão de foco automático 44 e a imagem estiverem no mesmo campo de visão, a fonte de luz é configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático simultaneamente. Entretanto, em outras modalidades, os campos de visão para imageamento e para foco automático podem ser diferentes, por exemplo, iluminados e/ou imageados separadamente.
[00222] Os desenvolvimentos da matéria têm aspectos de método assim como de aparelho. Um método para a focalização de um analisador visual compreende focalizar um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24, que pode ser um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital ou o dispositivo de captura de imagem digital, em um padrão de foco automático 44 fixo em relação a uma célula de fluxo 22, em que o padrão de foco automático 44 está localizado a uma distância de deslocamento 52 em relação à corrente de amostra em formato de fita 32. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital 24 tem uma objetiva com um eixo geométrico óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita 32. Uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo 22 é variada através da operação de um acionamento de motor 54, enquanto a distância ao longo do eixo geométrico óptico entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e o ponto de foco ideal é conhecida. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital é configurado para resolver e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. O acionamento de motor é operado para focar no padrão de foco automático em um processo de foco automático. O acionamento de motor é, então, operado ao longo da distância de deslocamento focando, assim, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na corrente de amostra em formato de fita.
[00223] O método pode incluir, adicionalmente, conformar a corrente de amostra em formato de fita em um formato de fita. O formato de fita é apresentado de modo que o eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica seja substancialmente perpendicular à corrente de amostra em formato de fita, mais especificamente normal em relação ao plano da corrente em formato de fita.
[00224] A Figura 4 representa aspectos de um sistema 400 para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue. Conforme mostrado neste documento, o sistema 400 inclui um sistema de injeção de fluido de amostra 410, uma célula de fluxo 420 e dispositivo de captura de imagem 430 e um processador 440. A célula de fluxo 420 fornece uma trajetória de fluxo 422 que transmite um fluxo do fluido de revestimento, opcionalmente, em combinação com o fluido de amostra. De acordo com algumas modalidades, o sistema de injeção de fluido de amostra 410 pode incluir ou estar acoplado a uma cânula ou tubo 412. O sistema de injeção de fluido de amostra 410 pode estar em comunicação fluida com a trajetória de fluxo 422 (por exemplo, através da entrada de fluido de amostra 402) e pode ser operada para injetar o fluido de amostra 424 através de uma porta de saída distal 413 da cânula 412 e para dentro do fluido de revestimento fluente 426 no interior da célula de fluxo 420 de modo a fornecer uma corrente de fluido de amostra 428. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, ao ser executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 410 injete o fluido de amostra 424 no fluido de revestimento fluente 426. Conforme mostrado neste documento, o fluido de revestimento 426 pode ser introduzido na célula de fluxo 420 através de um sistema de injeção de fluido de revestimento 450 (por exemplo, através da entrada de fluido de revestimento 401). Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, ao ser executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de revestimento 450 injete o fluido de revestimento 426 na célula de fluxo 420. Conforme representado na Figura 4, a porta de saída distal 413 da cânula 412 pode estar posicionada em um local central ao longo do comprimento da zona de transição de estreitamento 419. Em alguns casos, a porta de saída distal pode estar posicionada de modo mais próximo ao início (porção proximal) da zona de transição 419. Em alguns casos, a porta de saída distal pode estar posicionada mais próxima à extremidade (porção distal) da zona de transição 419. Em alguns casos, a porta de saída distal 413 pode estar posicionada completamente do lado de fora da zona de transição 419, por exemplo, conforme representado na Figura 3A (onde a porta de saída distal 331 está disposta de modo proximal em relação à zona de transição de estreitamento).
[00225] Uma corrente de fluido de amostra 428 tem uma primeira espessura T1 adjacente ao tubo de injeção 412. A trajetória de fluxo 422 da célula de fluxo que tem uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo de modo que a espessura da corrente de fluido de amostra 428 diminui a partir da espessura inicial T1 para uma segunda espessura T2 adjacente a um local de captura de imagem 432. O dispositivo de captura de imagem 430 está alinhado com o local de captura de imagem 432 de modo a gerar imagens de uma primeira pluralidade das partículas do primeiro fluido de amostra no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420.
[00226] O processador 440 está acoplado ao sistema injetor de fluido de amostra 410, ao dispositivo de captura de imagem 430 e, opcionalmente, ao sistema de injeção de fluido de revestimento 450. O processador 440 está configurado para interromper a injeção do primeiro fluido de amostra para dentro do fluido de revestimento fluente 426 e iniciar uma injeção do segundo fluido de amostra para dentro do fluido de revestimento fluente 426 de modo que os transientes de fluido de amostra sejam iniciados. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, ao ser executado pelo processador, está configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 410 injete o segundo fluido de amostra no fluido de revestimento fluente 426 de modo que os transientes de fluido de amostra sejam iniciados.
[00227] Ademais, o processador 440 está configurado para iniciar a captura de uma imagem de uma segunda pluralidade das partículas do segundo fluido de amostra no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420 após os transientes de fluido de amostra e a 4 segundos do imageamento da primeira pluralidade das partículas. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, ao ser executado pelo processador, é configurado para fazer com que o dispositivo de captura de imagem 430 inicie a captura de uma imagem de uma segunda pluralidade das partículas do segundo fluido de amostra no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420 após os transientes de fluido de amostra e a quatro segundos do imageamento da primeira pluralidade das partículas.
[00228] Em algumas modalidades, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, ao ser executado pelo processador, é configurado para fazer com que um mecanismo de controle de movimento de célula de fluxo 442 ajuste a posição da célula de fluxo 420, por exemplo, em relação ao dispositivo de captura de imagem 430. Em algumas modalidades, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, ao ser executado pelo processador, é configurado para fazer com que um mecanismo de controle de movimento de dispositivo de captura de imagem 444 ajuste a posição do dispositivo de captura de imagem 430, por exemplo, em relação à célula de fluxo 420. Os mecanismos de controle de movimento 442 e 444 podem incluir motores, cardans e outros recursos mecânicos que facilitam e produzem movimento na célula de fluxo e dispositivo de captura de imagem, respectivamente. Em alguns casos, o mecanismo de controle de célula de fluxo 442 e/ou mecanismo de controle de dispositivo de captura de imagem 444 podem incluir um controle de motor de passo de alta precisão que fornece uma focalização motorizada e automatizada do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Conforme representado na Figura 1, um processador pode controlar o movimento do dispositivo de captura de imagem 24. De modo similar, conforme representado na Figura 1B, um processador pode controlar o movimento de um condutor de célula de fluxo 55.
[00229] Por esse motivo, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas de análise de partícula que realizam o hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo geométrico de imageamento através da mesma. A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo. Ademais, os sistemas de analisadores podem incluir uma entrada de fluido de revestimento em comunicação fluida com a trajetória de fluxo e uma entrada de fluido de sangue em comunicação fluida com o tubo de injeção. A entrada de fluido de sangue pode ser configurada para injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo de modo que a amostra de fluido de sangue flua em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo. O fluido de revestimento pode ter uma viscosidade que é maior que uma viscosidade da amostra de fluido de sangue. Além disso, o sistema de analisador pode incluir um dispositivo de captura de imagem e um mecanismo de focalização que estabelece um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Ademais, o sistema pode incluir um alvo de imageamento que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o alvo de imageamento e a corrente de fluxo de amostra definem uma distância de deslocamento ao longo do eixo geométrico de imageamento. O sistema pode, ainda, incluir um processador e um módulo de focalização que tem um código legível por máquina de incorporação de meio tangível executado no processador para operar o mecanismo de focalização para estabelecer o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partículas usando a distância de deslocamento. A diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento e a amostra de fluido de sangue, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, pode ser eficaz para realizar o hidrofoco do primeiro e segundo fluidos de amostra no eixo geométrico de imageamento enquanto mantém a viabilidade de células na amostra de fluido de sangue. Em alguns casos, o mecanismo de focalização pode incluir um motor de acionamento configurado para ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo.
[00230] Em alguns casos, um sistema de analisador 400 pode incluir um sensor térmico ou de temperatura 448 que está acoplado termicamente à célula de fluxo 420, conforme representado na Figura 4. Um módulo de focalização, que pode estar associado operacionalmente ao processador, pode incluir um código legível por máquina de incorporação de meio tangível que é executado no processador para operar um mecanismo de focalização (por exemplo, mecanismo de controle de célula de fluxo 442 ou mecanismo de controle de dispositivo de captura de imagem 444), de modo a estabelecer o estado focal ou plano focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partículas, em resposta a uma alteração na temperatura detectada pelo sensor de temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura e um foco desejado.
[00231] Consequentemente, as modalidades da presente invenção abrangem um sistema 400 para gerar imagens de uma pluralidade de partículas em uma amostra de fluido de sangue 424 que tem uma viscosidade de fluido de amostra. O sistema 400 pode ser usado com um fluido de revestimento 426 que tem uma viscosidade de fluido de revestimento que difere da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade. O sistema 400 pode incluir uma célula de fluxo 420 que tem uma trajetória de fluxo 422 e um tubo de injeção de fluido de amostra 412. A trajetória de fluxo 422 pode ter uma redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição de estreitamento. Ademais, o sistema 400 pode incluir uma entrada de fluido de revestimento 401 em comunicação fluida com a trajetória de fluxo 422 da célula de fluxo 420 de modo a transmitir um fluxo do fluido de revestimento ao longo da trajetória de fluxo 422 da célula de fluxo 420. O sistema 400 pode, ainda, incluir uma entrada de amostra de fluido de sangue 402 em comunicação fluida com o tubo de injeção 412 da célula de fluxo 420 de modo a injetar um fluxo ou corrente 428 da amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente 428 no interior da célula de fluxo 420. Por exemplo, o fluido de amostra 424 pode sair da porta de saída distal 423 da cânula 412 em direção a um envelope do fluido de revestimento fluente 426 para formar uma fita de amostra 428 no mesmo.
[00232] Conforme o fluido de revestimento 426, juntamente com a fita de fluido de amostra 428 formada a partir do fluido de amostra 424, flui através de uma redução 419 no tamanho da trajetória de fluxo e em direção a um local de imageamento 432, um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento 426 e o fluido de amostra 424 associada à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento 426 e o fluido de amostra 424 associada à redução no tamanho da trajetória de fluxo, fornece um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas no local de imageamento 432. Conforme mostrado neste documento, o sistema 400 inclui, ainda, um dispositivo de imageamento 430 que forma imagens da pluralidade das partículas no local de imageamento 432.
[00233] Conforme mostrado na modalidade de célula de fluxo representada na Figura 4A, uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo (por exemplo, na zona de transição 419a) pode ser definida por paredes opostas 421a, 423a da trajetória de fluxo 422a. As paredes opostas 421a, 423a podem se angular radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo 422a, de modo genericamente simétrico ao redor de um plano transversal 451a que bissecciona a corrente de fluido de amostra 428a. O plano 451a pode bisseccionar a corrente de amostra 428a onde a corrente de amostra tem uma primeira espessura T1, em uma localização em que a corrente de amostra 428a sai de uma porção distal 427a da cânula ou tubo de injeção de amostra 412a. De modo similar, o plano 451a pode bisseccionar a corrente de amostra 428a onde a corrente de amostra tem uma segunda espessura T2, em uma localização em que a corrente de amostra 428a ultrapassa o local de captura de imagem 432a. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor de cerca de 150 μm e a segunda espessura T2 tem um valor de cerca de 2 μm. Em tais casos, a razão de compressão da corrente de fita de amostra é de 75:1. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor em uma faixa de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm e a segunda espessura T2 tem um valor em uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Conforme o fluido de corrente de amostra flui através da célula de fluxo, a fita se afina conforme acelera e é estendida. Dois recursos da célula de fluxo podem contribuir para afinar a fita de fluido de amostra. Primeiro, uma diferença de velocidade entre o envelope de fluido de revestimento e a fita de fluido de amostra pode ser operada para reduzir a espessura da fita. Segundo, a geometria afunilada da zona de transição pode ser operada para reduzir a espessura da fita. Conforme representado na Figura 4A, a porta de saída distal 413a da cânula 412a pode estar posicionada em um local central ao longo do comprimento da zona de transição de estreitamento 419a. Em alguns casos, a porta de saída distal pode ser posicionada mais próxima do início (porção proximal 415a) da zona de transição 419a. Em alguns casos, a porta de saída distal pode estar posicionada mais próxima da extremidade (porção distal 416a) da zona de transição 419a. Em alguns casos, a porta de saída distal 413a pode estar posicionada completamente do lado de fora da zona de transição 419a, por exemplo conforme representada na Figura 3A (onda a porta de saída distal 331 está disposta de maneira proximal em relação à zona de transição de estreitamento).
[00234] Conforme representado na Figura 4A (assim como nas Figuras 4 e 4B-1), a zona de transição 419a pode ser definida por transições angulares nas porções proximal 415a e distal 416a. Entende- se ainda que a zona de transição 419a pode, em vez disso, apresentar transições lisas ou curvas nas porções proximal 415a e distal 416a, de modo similar às transições lisas ou curvas, conforme representado nas Figuras 1, 3, 3A, 3B e 4B-2).
[00235] Tipicamente, a primeira espessura T1 é muito maior que o tamanho das partículas de amostra e, portanto, as partículas estão contidas completamente no interior da corrente de fita de amostra. Entretanto, a segunda espessura T2 pode ser menor que o tamanho de determinadas partículas de amostra e, por esse motivo, tais partículas podem se estender para fora do fluido de amostra e para dentro do fluido de revestimento circundante. Conforme mostrado na Figura 4A, a corrente de fita de amostra pode fluir, de modo geral, ao longo do mesmo plano em que sai da cânula e se desloca em direção ao local de captura de imagem.
[00236] A célula de fluxo pode, ainda, fornecer uma distância de separação 430a entre a porção de cânula distal 427a e o local de captura de imagem 432a. De acordo com algumas modalidades, a porção distal 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode estar posicionada a uma distância de separação axial 430a em relação ao local de captura de imagem 432a, onde a distância de separação axial 432a tem um valor de cerca de 21 mm. Em alguns casos, a distância de separação axial 430a tem um valor em uma faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm.
[00237] A distância de separação axial 430a entre a porta de saída da cânula e o local de captura de imagem pode impactar o tempo de transição para o fluido de amostra conforme o fluido se desloca da porta de saída para o local de captura de imagem. Por exemplo, uma distância de separação axial relativamente menor 430a pode contribuir para um tempo de transição mais curto e uma distância de separação axial relativamente maior 430a pode contribuir para um tempo de transição mais longo.
[00238] A posição da porta de saída na porção distal de cânula 427a em relação à zona de transição de trajetória de fluxo 419a ou em relação à porção proximal 415a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a, também pode inferir o tempo de transição para o fluido de amostra conforme o fluido se desloca a partir da porta de saída para o local de captura de imagem. Por exemplo, o fluido de revestimento pode ter uma velocidade relativamente mais lenta na porção proximal 415a e uma velocidade relativamente mais rápida em uma localização entre a porção proximal 415a e a porção distal 416a. Por esse motivo, se a porta de saída da cânula na porção distal 427a estiver posicionada na porção proximal 415a, será necessária uma quantidade de tempo maior para que o fluido de amostra alcance o local de captura de imagem, não apenas devido ao fato de que a distância de deslocamento é mais longa, mas também, devido ao fato de que a velocidade inicial do fluido de amostra após o mesmo sair da porta distal de cânula é mais lenta (devido à velocidade de fluido de revestimento mais lenta). Em outras palavras, quanto mais tempo o fluido de amostra está presente na porção mais espessa (por exemplo, perto da porção proximal 415a) da célula de fluxo, mais tempo a amostra leva para alcançar o local de captura de imagem. Por outro lado, se a porta de saída da cânula na porção distal 427a estiver posicionada de modo distal em relação à porção proximal 415a (por exemplo, em um local central entre a porção proximal 415a e a porção distal 416a, conforme representado na Figura 4A), será necessário uma quantidade menor de tempo para que o fluido de amostra alcance o local de captura de imagem, não apenas devido ao fato de que a distância de deslocamento é menor, mas também devido ao fato de que a velocidade inicial do fluido de amostra após o mesmo sair da porta distal de cânula é mais rápida (devido à velocidade de fluido de revestimento mais rápida). Conforme discutido em outra parte deste documento, o fluido de revestimento é acelerado conforme o mesmo flui através da zona de transição 419a, devido à área em corte transversal de estreitamento da zona 419a.
[00239] De acordo com algumas modalidades, com um tempo de transição mais curto, haverá mais tempo disponível para a coleta de imagem no local de captura de imagem. Por exemplo, conforme a duração do tempo de transição da ponta distal de cânula para a área de imageamento diminui, é possível processar mais amostras em uma quantidade de tempo específica e, consequentemente, é possível obter mais imagens em uma quantidade de tempo específica (por exemplo, imagens por minuto).
[00240] Embora existam vantagens associadas ao posicionamento da porta de saída da porção distal de cânula 427a mais próximo ao local de captura de imagem 432a, é desejável, também, manter uma determinada distância entre a porta e o local de captura. Por exemplo, conforme representado na Figura 3, uma objetiva óptica ou lente frontal de um dispositivo de imageamento pode ser posicionada no assento 58 da célula de fluxo 22. Se a porta de saída 31 da cânula estiver muito próxima do assento 58, então, o fluido de amostra pode não ser suficientemente estabilizado após ser injetado no fluido de revestimento de modo a fornecer as propriedades de imageamento desejadas no local de captura de imagem. De modo similar, pode ser desejável manter a região de transição afunilada 21 a uma distância da zona de visualização 23, de modo que a região afunilada não interfira com o posicionamento do assento 58 que recebe a objetiva do dispositivo de captura de imagem.
[00241] Ainda com referência à Figura 4A, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode estar posicionada de modo distal em relação à porção proximal 415a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a. Associadamente, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode estar posicionada de modo proximal em relação à porção distal 416a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a. Por esse motivo, de acordo com algumas modalidades, o fluido de amostra pode ser injetado a partir da cânula de injeção 412a e para dentro da célula de fluxo em um local no interior da zona de transição 419a.
[00242] De acordo com algumas modalidades, a simetria na diminuição do tamanho da trajetória de fluxo (por exemplo, na zona de transição de trajetória de fluxo 419a) opera para limitar o desalinhamento de partícula na amostra de fluido de sangue. Por exemplo, tal simetria pode ser eficaz para limitar o desalinhamento de orientação de imageamento de hemácias na amostra de fluido de sangue para menos que cerca de 20%.
[00243] De acordo com algumas modalidades, os métodos revelados neste documento são operáveis para a taxa de sinalização durante a análise de contagem de sangue para abaixo de 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5% de amostras.
[00244] De acordo com algumas modalidades, o local de captura de imagem 432a tem um campo de visão 433a entre cerca de 150 μm x 150 μm e 400 μm x 400 μm. Em alguns casos, o local de captura de imagem 432a tem um campo de visão 433a de cerca de 275 μm x 275 μm. Em alguns casos, o campo de visão pode ser definido em termos de comprimento vezes a largura. Se for expressado como área de superfície, um campo de visão de 275 μm x 275 μm tem uma área de 75.625 μm2. De acordo com algumas modalidades, o campo de visão pode ser determinado pela objetiva de dispositivo de imageamento e sua ampliação. Em alguns casos, o campo de visão pode corresponder à extensão do campo (área) que é imageado pelos elementos ópticos de coleta (por exemplo, objetiva, lente de tubo e câmera). Em alguns casos, o campo de visão é muito menor que a porta de visualização da área transparente no local de captura de imagem.
[00245] As Figuras 4A-1 e 4A-2 ilustram os efeitos de hidrofocalização na corrente de amostra conforme a mesma se desloca da porta de saída da cânula para o local de captura de imagem. Conforme mostrado na Figura 4A-1, a corrente de amostra pode ter uma altura H(S) de cerca de 150 μm e uma largura L(S) de cerca de 1.350 μm. Ademais, a corrente de revestimento de PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca de 6.000 μm e uma largura L(P) de cerca de 4.000 μm. Após a hidrofocalização, conforme mostrado na Figura 4A-2, a corrente de amostra pode ter uma altura H(S) de cerca de 2 μm e uma largura L(S) de cerca de 1.350 μm. Ademais, a corrente de revestimento de PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca de 150 μm e uma largura L(P) de cerca de 4.000 μm. Em uma modalidade, a área em corte transversal da corrente de revestimento de PIOAL na saída de cânula é 40 vezes maior que a área em corte transversal próxima ao local de captura de imagem.
[00246] De acordo com algumas modalidades, pode ser útil determinar o corte transversal da canaleta de célula de fluxo no local de captura de imagem. O mesmo pode corresponder à altura de corrente de revestimento de PIOAL H(P) de cerca de 150 μm e uma largura L(P) de cerca de 4.000 μm, conforme representado na Figura 4A-2. Pode ser, ainda, útil determinar a taxa de fluxo volumétrica dos fluidos de amostra e de revestimento combinados que fluem continuamente através da célula de fluxo no local de captura de imagem. Quando a área em corte transversal e a taxa de fluxo são conhecidas, é possível determinar a velocidade dos fluidos de amostra e de revestimento combinados no local de captura de imagem.
[00247] De acordo com algumas modalidades, o fluxo dos fluidos de amostra e de revestimento através da célula de fluxo pode ser aproximado através de um modelo de perfil de placa paralela. Associadamente, a taxa de fluxo no centro da corrente de fluido de amostra (por exemplo, conforme representado na Figura 4A-2), pode ser cerca de 1,5 vez a taxa média de fluxo da corrente de fluidos de amostra e de revestimento combinados.
[00248] De acordo com algumas modalidades, a área em corte transversal do fluxo de amostra na saída de cânula (por exemplo, L(S) x H(S) na Figura 4A-1) é 40 vezes maior que a área em corte transversal do fluxo de amostra no local de imageamento (por exemplo, L(S) x H(S) na Figura 4A-2). A taxa de fluxo volumétrica do fluido de revestimento na área de imageamento pode ser cerca de 45 μL/segundo. A taxa de fluxo volumétrica do fluido de amostra na área de imageamento pode ser cerca de 0,232 μL/segundo. Em alguns casos, a área em corte transversal das correntes de revestimento e amostra combinadas no local de imageamento tem 600.000 μm2. Em alguns casos, a velocidade média da corrente de fluxo no local de imageamento é de 75 mm/segundo.
[00249] A taxa de fluxo ou velocidade pode ser determinada como a taxa que resulta em imagens celulares nítidas e focalizadas. As taxas de fluxo e velocidades exemplificadoras foram descobertas com base nas taxas de fluxo das duas amostras que foram observadas para alcançar determinados formatos e características de corrente de fluxo de fita de amostra no local de imageamento. Por exemplo, na taxa de fluxo de cerca de 75 mm/seg (ou em uma faixa de 20 a 200 mm/seg), as células não fluem tão lentas de modo que existam sobreposições de células em imagens consecutivas e as células não fluem tão rápido de modo que efeitos de formação de imagens fantasmas sejam criados (imagem embaçada). Associadamente, evitando-se as taxas de fluxo excessivamente altas, é possível conservar mais reagente e amostra. De acordo com algumas modalidades, uma velocidade linear ideal ou desejada pode ser alcançada alterando-se tanto o fluxo volumétrico (taxa de bombeamento) quanto o formato da cânula.
[00250] A velocidade de fluxo da corrente de amostra através da zona de captura de imagem também pode ser relacionada ao desempenho do dispositivo de captura de imagem em relação à função de célula de fluxo. Por exemplo, se a corrente de amostra fluir demasiadamente rápido, pode ser difícil obter imagens nítidas de partículas contidas na amostra (por exemplo, a velocidade de obturador do dispositivo de captura de imagem pode ser muito baixa produzindo, assim, uma imagem embaçada). De modo similar, se a corrente de amostra fluir muito lentamente, o dispositivo de captura de imagem pode obter imagens consecutivas da mesma partícula (por exemplo, a mesma partícula permanece no quadro de captura durante duas capturas de imagem). Em algumas modalidades, a velocidade da fita de amostra pode ser modulada (por exemplo, ajustando-se qualquer um dentre uma variedade de parâmetros operacionais de célula de fluxo) em relação à taxa de captura de imagem, de modo que haja um fluxo mínimo entre capturas de quadro e, por esse motivo, uma porcentagem elevada da amostra é imageada.
[00251] De acordo com algumas modalidades, o sistema de análise de partícula e componentes associados podem ser configurados de modo que o fluido de revestimento e amostra fluida fluam através da célula de fluxo, o fluido de revestimento possa fluir a uma taxa volumétrica de fluido de revestimento de 45 μL/s e a amostra fluida possa fluir a uma taxa de fluxo volumétrica de amostra fluida de 0,232 μL/s (ou em uma faixa de 0,2 a 0,35 μL/s). Em alguns casos, a razão da taxa de fluxo do fluido de revestimento para a taxa de fluxo do fluido de amostra é de cerca de 200. Em alguns casos, a razão da taxa de fluxo do fluido de revestimento para a taxa de fluxo do fluido de amostra tem um valor em uma faixa de cerca de 70 a 200. Em alguns casos, a razão da taxa de fluxo do fluido de revestimento para a taxa de fluxo do fluido de amostra é de cerca de 193. Em alguns casos, a razão da taxa de fluxo do fluido de revestimento para a taxa de fluxo do fluido de amostra é de cerca de 70. Em alguns casos, uma razão de volume do fluido de revestimento para volume de amostra fluida que flui no interior da célula de fluxo pode ser em uma faixa de 25:1 a 250:1.
[00252] De acordo com algumas modalidades, o sistema e componentes associados podem ser configurados de modo que, conforme o fluido de revestimento e a amostra fluida fluem através da célula de fluxo 420, o fluido de revestimento pode fluir a uma velocidade de fluido de revestimento de 75 mm/seg antes da área de imageamento e a amostra fluida pode fluir a uma velocidade de amostra de fluido de 130 mm/seg antes da área de imageamento. Em alguns casos, uma razão de volume de fluido de revestimento para o volume de amostra fluida que fluem no interior da célula de fluxo pode ser em uma faixa de 100:1 a 200:1.
[00253] Em alguns casos, uma célula de fluxo pode ter uma razão de compressão mínima de cerca de 50:1 e uma razão de compressão máxima de cerca de 125:1. Em alguns casos, a razão de compressão mínima pode ser de cerca de 30:1 ou 20:1. Tal razão de compressão se refere à razão das espessuras de corrente de fluxo H(S):H(S) ao comparar a Figura 4A-1 com a Figura 4A-2. Essa razão de compressão pode ser influenciada por uma combinação de compressão geométrica (por exemplo, a razão das espessuras de fluido de revestimento H(P):H(P) ao comparar a Figura 4A-1 com a Figura 4A-2, que também pode corresponder, de modo geral, às dimensões da zona de transição afunilada de estreitamento da célula de fluxo 419a mostrada na Figura 4A) e uma compressão hidrodinâmica (por exemplo, que também corresponde a uma diferença na velocidade). De acordo com algumas modalidades, a razão de compressão geométrica é de cerca de 40:1.
[00254] A diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, que corresponde à zona de transição, pode ser definida por uma porção proximal de trajetória de fluxo que tem uma altura ou espessura proximal e uma porção distal de trajetória de fluxo que tem uma altura ou espessura distal que é menor que a altura ou espessura proximal. Por exemplo, conforme mostrado nas vistas parciais das Figuras 4B-1 e 4B-2, a zona de transição 419b da trajetória de fluxo pode ter um comprimento C entre uma porção proximal 415b e uma porção distal 416b, onde a porção proximal 415b tem uma altura proximal 417b e a porção distal 416b tem uma altura distal 418b. Conforme representado na Figura 4B-2 e conforme observado em outra parte deste documento, o formato ou contorno da zona de transição pode ser curvo ou liso e, por exemplo, pode ser fornecido no formato de uma curva em S, uma curva sigmoidal ou uma curva tangente. De acordo com algumas modalidades, a altura proximal 417b tem um valor de cerca de 6.000 μm. Em alguns casos, a altura proximal 417b tem um valor em uma faixa de cerca de 3.000 μm a cerca de 8.000 μm. De acordo com algumas modalidades, a altura distal 418b tem um valor de cerca de 150 μm. Em alguns casos, a altura distal 418b tem um valor em uma faixa de cerca de 50 μm a cerca de 400 μm.
[00255] A geometria da zona de transição 419a pode fornecer um primeiro ângulo α1 entre o primeiro contorno de trajetória de fluxo 403b e o plano transversal de bissecção 451b e um segundo ângulo α2 entre o segundo contorno de trajetória de fluxo 404b e o plano transversal de bissecção 451b. Em alguns casos, o ângulo α1 tem cerca de 45 graus e o ângulo α2 tem cerca de 45 graus. Em alguns casos, o ângulo α1 tem um valor em uma faixa de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. Em alguns casos, o ângulo α2 tem um valor em uma faixa de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. De acordo com algumas modalidades, os ângulos α1 e α2 têm o mesmo valor. Os ângulos α1 e α2 podem ser selecionados de modo a manter o fluxo laminar ou minimizar a turbulência do fluido de amostra conforme o mesmo se desloca da porção proximal 415b para a porção distal 416b, que pode, por sua vez, acentuar o alinhamento das partículas no interior da amostra ao longo do plano transversal 451b. Conforme observado acima com referência à Figura 4A, os contornos ou porções distais e proximais da zona de transição podem ser curvos ou lisos em vez de angulados.
[00256] A Figura 4C representa recursos de uma cânula ou tubo de alimentação de amostra 400c exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção, em que a cânula tem um comprimento C. A Figura 4D representa um corte transversal longitudinal de cânula 400d. Conforme mostrado neste documento, a cânula 400d inclui uma seção achatada distal 410d, uma seção afunilada central 420d e uma porção tubular proximal 430d. Conforme representado na Figura 4C-1, uma cânula ou tubo de alimentação de amostra 400c-1 exemplificador pode ter uma porção distal 410c-1 e uma porção proximal 430c-1. Em alguns casos, a porção distal 410c-1 tem um comprimento de cerca de 1,359 mm e uma largura de cerca de 1,43 mm. Em alguns casos, a porta de saída da extremidade distal tem uma largura de saída L(E) de cerca de 1,359 mm. De acordo com algumas modalidades, uma cânula pode ter uma geometria de trajetória de fluxo interna que é diferente do que é representado nas Figuras 4C e 4D. Por exemplo, conforme ilustrado na Figura 4D-1, a cânula 400d-1 não inclui uma seção central afunilada que tem um corte transversal de área de fluxo expandida. Conforme representado na Figura 4D-1, a cânula 400d-1 tem uma seção distal 410d-1, uma seção afunilada central 420d- 1 que tem um diâmetro interno afunilado e uma seção proximal 430d-1. Correspondente com o diâmetro interno afunilado da seção central 420d-1, a área interna de corte transversal de 410d-1 é menor que a área interna de corte transversal de 430d-1.
[00257] Um sistema de hematologia, de acordo com as modalidades da presente invenção, pode processar uma amostra sanguínea que tem um volume de cerca de 150 μL. O volume de sangue aspirado pode ser cerca de 120 a 150 μL. Em alguns casos, o volume de sangue mínimo disponível no tubo de amostra é cerca de 500 μL para um modo de amostragem automático e cerca de 250 μL para um modo de amostragem manual. A cânula ou tubo de injeção 400d mostrada na Figura 4D tem um volume interno de cerca de 13 uLl. De acordo com algumas modalidades, a cânula ou tubo de injeção tem um volume interno menor que cerca de 30 uL.
[00258] A Figura 4E ilustra uma corte transversal de uma seção achatada distal 410e. Conforme mostrado neste documento, a seção distal 410e tem uma largura interna L(I) e uma altura interna H(I), através da qual uma corrente de amostra flui. Ademais, a seção distal 410e tem uma largura externa L(O) e uma altura externa H(O). Conforme representado nas Figuras 4D e 4E consideradas em conjunto, a porção distal 410e do tubo de injeção de fluido de amostra tem uma porta de saída P que tem uma altura H(I) e uma largura L(I), em que a altura H(I) é menor que a largura L(I). De acordo com algumas modalidades, a altura H(I) da porta de saída P da porção distal 410e (ou a altura interna da porção distal 410d) pode ter um valor de cerca de 150 μm. Em alguns casos, a altura H(I) pode ser em uma faixa de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm. De acordo com algumas modalidades, a largura L(I) da porta de saída P da porção distal 410e (ou a largura interna da porção distal 410d) pode ter um valor de cerca de 1.350 μm. Em alguns casos, a largura tem cerca de 1.194 μm. Em alguns casos, a largura L(I) pode ter um valor em uma faixa de cerca de 500 μm a cerca de 3.000 μm. Em alguns casos, a seção achatada distal 410d pode ser produzida através da aplicação de uma força de pinçamento sobre um tubo ou conduto.
[00259] A Figura 4F ilustra um corte transversal de uma seção afunilada central 420f. Conforme mostrado neste documento, a seção afunilada central 420f tem um diâmetro interno D(I) através do qual uma corrente de amostra flui. Ademais, a seção afunilada central 420f tem um diâmetro externo D(O). A Figura 4G ilustra um corte transversal de uma seção proximal 430g. Conforme mostrado neste documento, a seção proximal 430g tem um diâmetro interno D(I) através do qual uma corrente de amostra flui. Ademais, a seção distal 430g tem um diâmetro externo D(O).
[00260] Conforme representado na Figura 4D, o tubo de injeção ou cânula 400d pode ter uma porção proximal 430d que tem uma primeira área em corte transversal de fluxo (por exemplo π*(D/2)2mostrada na Figura 4G), uma porção distal 410d que tem uma segunda área em corte transversal de fluxo (por exemplo, L(I)*H(I) mostrada na Figura 4E) que é menor que a primeira área em corte transversal de fluxo e uma terceira porção 420d disposta entre a porção proximal 430d e a porção distal 410d. A terceira porção 420d pode ter um terceiro corte transversal de fluxo (por exemplo, π*(D/2)2 mostrado na Figura 4F) que é maior que o primeiro e segundo cortes transversais de fluxo. Em alguns casos, o diâmetro externo D(O) da porção proximal 430g tem cerca de 1.067 μm e o diâmetro interno D(I) da porção proximal 430g tem cerca de 813 μm.
[00261] De acordo com algumas modalidades, uma porção proximal de um tubo de injeção pode estar acoplado a uma porta de amostra de um encaixe de entrada de amostra. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 4H, uma porção proximal 405 h de uma cânula 400 h pode ser acoplada diretamente a uma porta de amostra 410 h em uma saída de um encaixe de entrada de amostra 420 h.
[00262] Uma célula de fluxo de um sistema para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue pode ser orientada a qualquer ângulo ou direção desejados em relação à direção da força da gravidade. Por exemplo, uma célula de fluxo pode ser orientada em uma direção ascendente, de modo que o fluido que flui no interior da célula de fluxo (por exemplo, fluido de revestimento, opcionalmente, em combinação com o fluido de amostra) possa se deslocar em uma direção ascendente contra a força da gravidade. De modo semelhante, uma célula de fluxo pode ser orientada em uma direção descendente, de modo que o fluido que flui no interior da célula de fluxo (por exemplo, o fluido de revestimento, opcionalmente, em combinação com fluido de amostra) possa se deslocar em uma direção descendente a favor da força da gravidade. A Figura 4I representa uma célula de fluxo 420i orientada em uma direção ascendente, de modo que o fluido de amostra 424i e o fluido de revestimento 426i que fluem no interior da célula de fluxo 420i fluam contra a gravidade G. A Figura 4J representa uma célula de fluxo 420j orientada em uma direção descendente, de modo que o fluido de amostra 424j e o fluido de revestimento 426j que fluem no interior da célula de fluxo 420j não fluam contra a gravidade G, mas, em vez disso, fluam a favor da gravidade G.
[00263] Conforme mostrado na Figura 4K, uma corrente de fita de amostra R que flui através de um local de captura de imagem 432k de uma célula de fluxo 420k pode ter uma espessura T de cerca de 2 μm. Em alguns casos, a espessura T da corrente de fita de amostra pode ser de até cerca de 3 μm. Tipicamente, as células ou partículas que são menores que a espessura de corrente de amostra serão contidas no interior da fita. Uma hemácia exemplificadora (células vermelhas do sangue) pode estar presente como um disco bicôncavo e pode ter um diâmetro D entre cerca de 6,2 μm e cerca de 8,2 μm. Ademais, uma hemácia exemplificadora pode ter uma espessura máxima T1 entre cerca de 2 μm e cerca de 2,5 μm e uma espessura mínima T2 entre cerca de 0,8 μm e cerca de 1 μm. Em alguns casos, as hemácias podem ter uma espessura de até cerca de 3 μm. As plaquetas humanas exemplificadoras podem variar de tamanho e podem, ainda, ter uma espessura ou diâmetro de cerca de 2 μm. Embora não esteja mostrada em escala neste documento, a célula de fluxo pode definir uma espessura de trajetória de fluxo F que tem um valor de cerca de 150 μm no local de captura de imagem. Em alguns casos, a espessura de trajetória de fluxo F tem um valor entre 50 μm e 400 μm. Tal espessura de trajetória de fluxo F pode, ainda, corresponder à altura distal 418b da porção distal 461b representada nas Figuras 4B-1 e 4B-2.
[00264] Conforme mostrado na Figura 4K, a razão da espessura T da corrente de fluido de amostra para a espessura da partícula (hemácia) é de cerca de 1:1. De acordo com algumas modalidades, uma razão da espessura T da corrente de fluido de amostra no local de captura de imagem para um tamanho de uma das partículas está em uma faixa de 0,25 a 25. Em alguns casos, a espessura T pode ter um valor em uma faixa de 0,5 μm a 5 μm. Um diferencial de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra pode ser selecionado de modo a alcançar um posicionamento desejado da fita corrente de amostra no interior da célula de fluxo.
[00265] As diferenças de viscosidade entre o fluido da fita de amostra R e o fluido de revestimento pode operar para alinhar ou orientar as partículas na corrente de amostra, por exemplo, hemácias, ao longo da direção do fluxo. Quando alinhado de tal forma, conforme mostrado na Figura 4K, o dispositivo de imageamento ou câmera pode obter imagens das hemácias de modo que as mesmas pareçam arredondadas, devido ao fato de que a superfície principal da célula de sangue está voltada em direção à câmera. Dessa forma, a hemácia assume um alinhamento que apresenta uma baixa resistência em relação ao fluxo. Por esse motivo, as características de viscosidade relativas do fluido de revestimento e do fluido de amostra podem contribuir para uma porcentagem ou quantidade elevadas de hemácias voltadas para a câmera acentuando, assim, a capacidade de avaliação do sistema de análise de partícula.
[00266] De acordo com algumas modalidades, as características de viscosidade do fluido de revestimento operam para limitar o desalinhamento de partícula na amostra de fluido de sangue. Por exemplo, os diferenciais de viscosidade podem ser eficazes para limitar o desalinhamento de orientação de imageamento de hemácias na amostra de fluido de sangue a menos de cerca de 10%. Ou seja, 90 ou mais hemácias dentre 100 hemácias em uma amostra podem estar alinhadas, de modo que suas superfícies principais estejam voltadas para o dispositivo de imageamento. Uma zona de transição de estreitamento simétrica pode fornecer um valor de 20%. Conforme discutido em outra parte deste documento, por exemplo, com referência à Figura 4R, é possível comparar os resultados de alinhamento obtidos através de uma configuração de analisador que envolve uma célula de fluxo que tem uma zona de transição de célula de fluxo estreita simétrica e um fluido de revestimento viscoso para resultados de alinhamento obtidos através de uma configuração de analisador que envolve uma célula de fluxo que tem uma zona de transição de célula de fluxo estreita simétrica sem o uso de um fluido de revestimento viscoso. O uso de um fluido de revestimento viscoso pode reduzir a porcentagem de células desalinhadas. De acordo com algumas modalidades, o fluido de revestimento tem um índice de refração similar ao da água (isto é, n = 1,3330). Em alguns casos, o fluido de revestimento tem um teor de água de cerca de 89%. Além dos efeitos de alinhamento observados como um resultado do diferencial de viscosidade, os efeitos de alinhamento também são observados como um resultado de uma zona de transição afunilada bilateral. Em alguns casos, observa-se que uma zona de transição afunilada bilateral (isto é, simétrica) é duas vezes mais eficaz para alinhar partículas em comparação com um modelo de zona de transição afunilada assimétrica.
[00267] O alinhamento eficaz das hemácias pode contribuir para aprimorar o diagnóstico. Em alguns casos, o formato das hemácias imageadas pode ser usado para determinar se um paciente daquela amostra obtida tem uma afecção ou doença fisiológicas específicas. Por exemplo, os pacientes com doença de célula falciforme apresentam células de sangue que têm um formato anormal (isto é, no formato de uma foice). Por esse motivo, obtendo-se imagens de alta qualidade de hemácias alinhadas, é possível garantir um diganóstico exato. Outras variações de formato em hemácias, por exemplo, hemácias que têm uma área periférica delgada e uma área central achatada grande, devido às quais a hemácia aparenta ter o perfil de um pneu de bicicleta, podem ser imageadas de modo eficaz com o uso das técnicas de alinhamento instantâneo. De modo similar, as hemácias que têm uma porção central pequena e uma área periférica espessa, devido às quais a hemácia aparenta ter o perfil de um pneu de caminhão, podem ser imageadas para propósitos de diagnóstico. As técnicas de imageamento aprimoradas reveladas neste documento também são úteis para avaliar outras características de hemácia, tais como teor de hemoglobina, teor de ferro e similares.
[00268] Sem se limitar a nenhuma teoria específica, acredita-se que um diferencial de viscosidade entre a viscosidade do fluido de revestimento e a viscosidade do fluido de amostra produz um perfil parabólico modificado, em que o perfil é, de modo geral, parabólico e tem um relevo central que corresponde a uma área central do fluxo em que a aceleração é aumentada e o relevo central contribui par ao alinhamento de partículas de amostra ou organelas intrapartícula. De acordo com algumas modalidades, a diferença de velocidade entre o revestimento e a fita de amostra e a diferença de viscosidade geram forças de cisalhamento para aumentar o alinhamento das organelas ou partículas intracelulares. Os aspectos exemplificadores do perfil parabólico de fluido de revestimento são discutidos no Pedido de Patente copendente n° U.S. , cujo conteúdo está ora incorporado a título de referência.
[00269] Os glóbulos brancos são tipicamente maiores que as hemácias e plaquetas. Por exemplo, os neutrófilos e eosinófilos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 10 μm e cerca de 12 μm. Os basófilos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Os linfócitos exemplificadores (pequenos) podem ter um diâmetro entre cerca de 7 μm e cerca de 8 μm e os linfócitos exemplificadores (grandes) podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Os monócitos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 20 μm. A configuração do sistema de análise de partícula, incluindo a interação entre o fluido de revestimento e a fita de amostra fluida à medida que passam através da célula de fluxo, pode operar para comprimir os glóbulos brancos conforme os mesmos se deslocam através do local de captura de imagem 432l, conforme indicado na Figura 4L. Por esse motivo, por exemplo, uma porção central do glóbulo branco (WBC) pode estar posicionada no interior da fita de fluido de amostra R e as porções periféricas do glóbulo branco podem estar posicionadas no fluido de revestimento. Por esse motivo, conforme o glóbulo branco é transportado através da célula de fluxo pela fita os lados do glóbulo branco podem ser estender para dentro do fluido de revestimento. Os valores numéricos ou faixas para a espessura T da corrente de fita de amostra R e a espessura F da trajetória de fluxo, conforme discutido acima em relação à Figura 4K, são aplicáveis de modo similar à Figura 4L.
[00270] De acordo com algumas modalidades, as diferenças de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra podem operar para alinhar as organelas ou outros recursos intracelulares que estão presentes nas células, tais como os glóbulos brancos. Sem se limitar a nenhuma teoria específica, acredita-se que as forças de cisalhamento associadas ao diferencial de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra podem agir sobre os glóbulos brancos de modo a alinhar os recursos intracelulares. Em alguns casos, as forças de cisalhamento associadas aos diferenciais de velocidade entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra podem contribuir para tal alinhamento. Esses efeitos de alinhamento podem, ainda, ser impactados por um diferencial de tamanho entre as partículas e a fita de fluido de amostra. Por exemplo, onde as porções das partículas se estendem para fora da fita de fluido de amostra e para dentro do fluido de revestimento circundante, as forças de cisalhamento associadas à diferença na viscosidade podem ter um efeito acentuado no alinhamento de recurso intracelular.
[00271] Conforme representado na Figura 4L, as porções de uma célula, tal como um glóbulo branco podem se estender para dentro do fluido de revestimento. As modalidades da presente invenção abrangem as composições de fluido de revestimento que não lisam ou fragmentam a célula ou, de outro modo, danificam a integridade da membrana celular externa, quando a célula é exposta ao fluido de revestimento. Um agente de viscosidade no fluido de revestimento pode ser operado para manter a viabilidade das células na corrente de fluido de amostra, de modo a deixar a estrutura (por exemplo, formato) e o conteúdo (por exemplo, núcleo) das células intactos quando a membrana ou parede de célula atravessa uma interface entre a fita de fluido de amostra e o envelope de fluido de revestimento ou, de outro modo, se estende da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente.
[00272] Frequentemente, existem forças de compressão que agem sobre as células ou partículas, conforme as mesmas fluem no interior da fita de fluido de amostra ao longo da célula de fluxo. Por esse motivo, as células podem entrar em contato com o fluido de revestimento enquanto as células estão em um estado comprimido ou são, de outro modo, submetidas às forças de compressão como um resultado de uma zona de transição de estreitamento. O agente de viscosidade do fluido de revestimento pode operar para proteger as células comprimidas para que não sejam fragmentadas ou destruídas quando emergem da fita fina de fluido de amostra e se tornam expostas ao fluido de revestimento viscoso, pelo menos até que as células alcancem o local de captura de imagem. Por esse motivo, a composição de agente de viscosidade do fluido de revestimento pode operar como um protetor celular, enquanto também acentua o alinhamento das partículas ou conteúdo intrapartícula.
[00273] Com referência às Figuras 4K e 4L, em alguns casos, as porções da célula ou partícula podem se estender para fora da fita fina de fluido de amostra R e para dentro do fluido de revestimento circundante. Conforme discutido no Pedido de Patente copendente n° U.S. , o fluido de revestimento pode conter protetores celulares que inibem ou evitam que o fluido de revestimento rompa ou lise as células ou partículas. Por exemplo, o fluido de revestimento pode conter protetores celulares que preservam a integridade estrutural das paredes de célula conforme as células são expostas ao ambiente químico do fluido de revestimento. De modo similar, os protetores celulares podem, ainda, operar para preservar a integridade estrutural das paredes de célula conforme as células experimentam quaisquer forças de cisalhamento induzidas pela geometria da célula de fluxo e uma diferença na velocidade e/ou viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento. Associadamente, os protetores podem proteger as células ou partículas contra forças resultantes a partir da diferença na velocidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento. Dessa forma, as células mantêm sua viabilidade conforme alcançam o local de captura de imagem.
[00274] As forças de cisalhamento podem ser significativas na interface entre a fita de fluido de amostra e o envelope de fluido de revestimento. De acordo com algumas modalidades, o fluxo no interior da trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ser caracterizado por um perfil de fluxo parabólico. A Figura 4L-1 representa aspectos exemplificadores do perfil de fluxo parabólico 400l-1a e 400l-1b. O perfil parabólico 400l-1a no painel superior é um perfil de velocidade típico encontrado em fluxos no interior de determinadas modalidades de célula de fluxo da presente invenção (por exemplo, onde há pouco ou nenhum diferencial de viscosidade entre um fluido de corrente de fluxo de amostra que está envolto no interior de uma corrente de fluxo de fluido de revestimento). Conforme pode ser percebido, uma velocidade linear superior é observada no meio da corrente de fluido e velocidades lineares inferiores são observadas próximas à parede de célula de fluxo. O perfil 400l-1a também pode ser observado na corrente de fluido com uma ligeira diferença de viscosidade entre os fluidos de revestimento e de amostra. Em um caso em que há um alto diferencial de viscosidade entre o revestimento e as correntes de fluido, um relevo central é observado, conforme mostrado no perfil 400l-1b, em que está localizada uma área central com velocidades lineares amplificadas. De acordo com algumas modalidades, as partículas que têm um tamanho suficientemente grande serão submetidas a uma determinada quantidade de força de cisalhamento, até mesmo onde tais partículas estão completamente contidas no interior de uma única fase de fluido (isto é, tanto no interior do envelope de fluido de revestimento quanto, alternativamente, no interior da fita de fluido de amostra).
[00275] Em alguns casos, a velocidade do fluido de revestimento pode ser diferente da velocidade do fluido de amostra. Por exemplo, o fluido de revestimento pode se deslocar a 80 mm/segundo e o fluido de amostra pode se deslocar a 60 mm/segundo. Por esse motivo, em alguns casos, o fluido de amostra sai da porta de cânula distal a uma velocidade de fluido de amostra que é ainda mais lenta que a velocidade de fluido de revestimento do envelope circundante. Por esse motivo, o fluido de revestimento pode operar para arrastar o fluido de amostra ao longo da trajetória de fluxo da cânula acelerando, assim, o fluido de amostra e reduzindo a espessura da fita de fluido de amostra. A fita de fluido de amostra mantém o volume e massa gerais, de modo que conforme se desloca mais rápido, se torna mais fina. De acordo com algumas modalidades, tanto o fluido de revestimento quanto o fluido de amostra têm uma velocidade entre cerca de 20 e 200 mm/segundo no local de captura de imagem.
[00276] Tipicamente, a velocidade do fluido de amostra aumenta conforme o fluido de amostra se desloca da porta de saída da cânula para o local de captura de imagem. Em alguns casos, a velocidade do fluido de amostra no local de captura de imagem tem 40 vezes a velocidade do fluido de amostra, conforme ela sai da porta da cânula na porção distal de cânula. De acordo com algumas modalidades, a diminuição na área em corte transversal da fita de amostra é linear em relação ao aumento na velocidade. De acordo com algumas modalidades, se a velocidade de revestimento na saída de cânula é maior que a velocidade de fita de amostra isso também irá aumentar a velocidade final da fita de amostra na área de imageamento.
[00277] O fluido de revestimento pode operar para aplicar forças de cisalhamento significativas sobre a fita de fluido de amostra e sobre partículas no interior da fita de fluido de amostra. Algumas forças são paralelas em relação à direção de fluxo e as partículas também podem encontrar forças que são perpendiculares em relação à direção de fluxo. Frequentemente, conforme o fluido de revestimento e o fluido de amostra atingem o local ou a zona de captura de imagem, os fluidos de revestimento e de amostra se deslocam à mesma velocidade ou a velocidades próximas. Por esse motivo, o contorno ou interface entre os fluidos de revestimento e de amostra, conforme passam pelo local de captura de imagem, podem apresentar forças de cisalhamento inferiores em comparação com o contorno ou interface na porta de saída da cânula distal ou na zona de transição afunilada. Por exemplo, na zona de transição afunilada, o contorno ou interface entre o envelope de fluido de revestimento e a fita de fluido de amostra podem estar em transição, de modo que a fita de amostra que é inicialmente mais lenta e mais espessa se torna mais rápida e mais fina e as partículas no fluido de amostra se tornam mais alinhadas. Em outras palavras, as forças de cisalhamento podem ser proeminentes na zona de transição afunilada e podem se dissipar em direção ao local de captura de imagem. As forças de cisalhamento no local de captura de imagem podem ser representadas por um perfil parabólico e podem ser muito inferiores em relação às forças de cisalhamento na zona de transição afunilada. Por esse motivo, as células ou partículas podem experimentar forças de cisalhamento superiores conforme passam através da zona de transição e as forças de cisalhamento inferiores e conforme passam através do local de captura de imagem. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre os fluidos de revestimento e de amostra podem colocar as hemácias em alinhamento e, portanto, em foco. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre os fluidos de revestimento e de amostra pode colocar as organelas de glóbulos brancos em alinhamento e, portanto, em foco. Associadamente, resultados melhorados de imageamento podem ser obtidos para componentes celulares e de organela que estão alinhados e colocados em foco, resultantes do estreitamento geométrico da corrente e da diferença de velocidade entre os fluidos de revestimento e de amostra.
[00278] Conforme observado em outra parte deste documento e com referência às Figuras 4K e 4L, conforme o fluido de revestimento e o fluido de amostra R fluem através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição de uma célula de fluxo e em direção a um local de imageamento 432k ou 432l, um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R associada a uma diferença de viscosidade entre a viscosidade de fluido de revestimento e a viscosidade de fluido de amostra, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R associada à redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição, fornece um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas no local de imageamento 432k ou 432l.
[00279] Em alguns casos, o estado de imageamento-alvo é uma orientação-alvo em relação a um plano focal F no local de imageamento. Por exemplo, conforme representado na Figura 4K-1, a partícula (células vermelhas do sangue) pode ser deslocada a uma distância em relação ao plano focal F. Em alguns casos, a orientação-alvo envolve uma orientação de partícula-alvo em relação ao plano focal F no local de imageamento 432k-1. A partícula pode ser uma célula de sangue, tal como uma hemácia, um glóbulo branco ou uma plaqueta. Conforme mostrado neste documento, a trajetória de fluxo no local de imageamento 432k-1 pode definir um plano P que é substancialmente paralelo a ou coplanar em relação ao plano focal F. Em alguns casos, uma porção da partícula pode estar posicionada ao longo do plano focal F, contudo, a porção central da partícula pode, de outro modo, ser desviada do plano focal F. Em alguns casos, a orientação-alvo envolve uma posição-alvo em relação ao plano focal F no local de imageamento 432k-1. Por exemplo, a posição-alvo pode envolver posicionar a partícula de modo que pelo menos uma porção da partícula esteja disposta ao longo do plano focal F. Em alguns casos, a posição-alvo pode envolver posicionar a partícula de modo que uma distância entre a partícula e o plano focal F não exceda um determinado limiar. Em alguns casos, a posição-alvo envolve uma posição de partícula-alvo que é relacionada ao plano focal F no local de imageamento 432k-1. Em alguns casos, a posição-alvo está no plano focal F ou mais próximo do que a distância D em relação ao plano focal F, em que a distância D corresponde a uma tolerância de posição. Um diferencial de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra pode ser selecionado de modo a alcançar um posicionamento desejado da fita corrente de amostra no interior da célula de fluxo (por exemplo, em relação ao plano P e/ou plano focal F da trajetória de fluxo). Em alguns casos, o diferencial de viscosidade pode ser selecionado de modo a atingir uma posição de partícula-alvo que está na tolerância de posição D ou menos.
[00280] Em alguns casos, o plano focal F tem uma espessura ou profundidade de campo conforme indicado na Figura 4K-2 e a partícula (células vermelhas do sangue) tem um estado de imageamento-alvo em relação à espessura de plano focal. Por exemplo, a posição-alvo para a partícula pode estar no plano focal F ou pelo menos parcialmente no plano focal F. Em alguns casos, um dispositivo de imageamento ou câmera de alta resolução óptica pode ter uma profundidade de campo ou espessura de plano focal de cerca de 7 μm. Em alguns casos, a profundidade de campo ou espessura de plano focal tem um valor com uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Em alguns casos, a profundidade do campo da câmera é similar ou igual à da espessura de fita de amostra no local de captura de imagem.
[00281] Em alguns casos, a orientação-alvo pode envolver um alinhamento-alvo em relação ao plano focal F no local de imageamento. Por exemplo, o alinhamento-alvo pode indicar que um plano definido pela partícula está alinhado com o plano focal F, para não exceder um determinado ângulo α em relação ao plano focal F no local de captura de imagem 432k-3, conforme mostrado na Figura 4K-3. Em alguns casos, o estado de imageamento-alvo pode envolver uma limitação na quantidade ou porcentagem de partículas desalinhadas em uma amostra. Por exemplo, uma diferença na viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R pode ser eficaz para limitar o desalinhamento de orientação de imageamento de hemácias na amostra de fluido de sangue para menos que cerca de 10%. Ou seja, 90 ou mais hemácias dentre 100 hemácias em uma amostra podem ser alinhadas, de modo que suas superfícies principais estejam voltadas em direção ao dispositivo de imageamento (conforme representado nas Figuras 4K-1 e 4K-2) ou de modo que o alinhamento de tais 90 ou mais RBCs esteja a 20 graus em relação ao plano substancialmente paralelo à direção de fluxo (por exemplo, o ângulo α de alinhamento de células vermelhas do sangue é 20 graus ou menos). Conforme discutido em outra parte deste documento, em alguns casos pelo menos 92% das partículas não esféricas, tais como as RBCs podem estar alinhadas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo. Em alguns casos, pelo menos entre 75% e 95% das partículas não esféricas, tais como as RBCs podem estar substancialmente alinhadas, mais especificamente a 20 graus de um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo (por exemplo, o ângulo α de alinhamento é de 20 graus ou menos). De acordo com algumas modalidades, 90% ou mais de determinadas partículas (por exemplo, hemácias e/ou plaquetas) podem ser orientadas de modo transversal em relação ao eixo geométrico de imageamento do dispositivo de imageamento.
[00282] Em alguns casos, as modalidades da presente invenção incluem composições para uso com um sistema de hematologia, conforme descrito neste documento, tal como um fluido de revestimento ou líquido de alinhamento de organela intracelular e partícula (PIOAL). Tais fluidos de revestimento ou PIOALs são adequados ao uso em um analisador visual de hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados. O PIOAL pode operar para direcionar ou facilitar o fluxo de um fluido de amostra sanguínea de uma determinada viscosidade através de uma zona de transição de célula de fluxo estreita do analisador visual. O PIOAL pode incluir um fluido que tem uma viscosidade superior à viscosidade do fluido da amostra. Um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido de amostra associada à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido de amostra associada à zona de transição de célula de fluxo estreita, pode ser eficaz para fornecer um estado de imageamento- alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas em um local de imageamento do analisador visual, enquanto mantém a viabilidade das células no fluido de amostra sanguínea.
[00283] A Figura 4M representa um neutrófilo 400 m exemplificador (um tipo de glóbulo branco) que tem organelas internas, tais como lóbulos 410m. Como um resultado do diferencial de viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento, as organelas internas podem se alinhar no interior da célula, conforme indicado pela Figura 4N. Por esse motivo, as organelas intracelulares podem ser imageadas eficazmente com um dispositivo de captura de imagem 430m, sem que as organelas se sobreponham uma à outra. Ou seja, em vez de os lóbulos serem empilhados um sobre o outro, conforme representado na Figura 4M, quando visualizados a partir do eixo geométrico de imageamento ou óptico do dispositivo de captura de imagem os lóbulos estão alinhados e assentados lado a lado, conforme representado na Figura 4N. Por esse motivo, os lóbulos podem ser visualizados nas imagens capturadas mais eficazmente. O alinhamento interno de organelas é um resultado surpreendente e inesperado do diferencial de viscosidade entre os fluidos de amostra e de revestimento. Consequentemente, os resultados melhorados de imageamento que correspondem ao alinhamento de células e célula em foco são alcançados com o uso dos recursos de diferencial de viscosidade, fluxo hidrodinâmico e compressão geométrica.
[00284] Conforme observado em outra parte deste documento e com referência às Figuras 4M e 4N, conforme o fluido de revestimento e o fluido de amostra R fluem através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição de uma célula de fluxo e em direção a um local de imageamento de um dispositivo de captura de imagem 430m ou 430n, um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R associado a uma diferença de viscosidade entre a viscosidade de fluido de revestimento e a viscosidade de fluido de amostra, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R associado à redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição, fornece um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas no local de imageamento. De acordo com algumas modalidades, o estado de imageamento-alvo pode corresponder a uma distribuição de estados de imageamento.
[00285] Em alguns casos, o estado de imageamento-alvo pode envolver uma orientação de estrutura intrapartícula-alvo (por exemplo, alinhamento e/ou posição) em relação a um plano focal no local de imageamento. Por exemplo, conforme representado na Figura 4N, as estruturas internas 410 m (por exemplo, estrutura intracelular, organela, lóbulo ou similares) podem ser orientadas em relação ao plano focal F. Em alguns casos, o alinhamento-alvo envolve um alinhamento de estrutura intrapartícula-alvo em relação a um plano focal F no local de imageamento similar à relação de alinhamento de partícula representada na Figura 4K-3. Em alguns casos, a posição-alvo envolve uma posição de estrutura intrapartícula-alvo em relação a um plano focal no local de imageamento similar à relação de posição de partícula representada na Figura 4K-1. Em alguns casos, a orientação-alvo da estrutura intrapartícula pode incluir tanto um alinhamento-alvo em relação ao plano focal quanto, também, uma posição-alvo em relação ao plano focal. Em alguns casos, o estado de imageamento-alvo pode envolver uma deformação-alvo no local de imageamento. Por exemplo, conforme representado na Figura 4N, a partícula 400 m tem um formato comprimido em comparação com o formato de partícula representado na Figura 4M. Por esse motivo, pode-se perceber que a operação da célula de fluxo pode produzir um efeito de compressão lateral sobre os formatos de partícula. Associadamente, os recursos intrapartícula podem ser orientados posicional ou direcionalmente (por exemplo, alinhados em relação ao plano focal F e/ou plano de fluxo de fita), conforme a partícula em si é comprimida no formato. De acordo com algumas modalidades, uma diferença de velocidade entre os fluidos de revestimento e de amostra pode produzir atrito na corrente de fluxo e uma diferença de viscosidade entre os fluidos de revestimento e de amostra podem amplificar tal atrito hidrodinâmico.
Exemplos
[00286] Qualquer uma dentre uma variedade de técnicas de hematologia ou análise de partícula de sangue pode ser realizada com o uso de imagens de fluido de amostra que fluem através da célula de fluxo. Frequentemente, a análise de imagem pode envolver determinar certos parâmetros de célula ou partícula ou medir, detectar ou avaliar determinados recursos de célula ou partícula. Por exemplo, a análise de imagem pode envolver avaliar o tamanho de célula ou partícula, recursos de núcleo de célula, recursos de citoplasma de célula, recursos de organela intracelular e similares. Associadamente, as técnicas de análise podem abranger determinados métodos de contagem ou classificação ou teste de diagnóstico incluindo diferenciais de glóbulos brancos (WBC). Em alguns casos, as imagens obtidas com o uso da célula de fluxo podem sustentar um teste diferencial de WBC de 5 partes. Em alguns casos, as imagens obtidas com o uso da célula de fluxo podem sustentar um teste diferencial de WBC de 9 partes. Associadamente, com referência à Figura 4, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, ao ser executado pelo processador, está configurado para fazer com que o sistema 400 diferencie tipos diferentes de células com base em imagens obtidas através do dispositivo de captura de imagem. Por exemplo, as técnicas de diagnóstico ou de teste podem ser usadas para diferenciar várias células (por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, metamielócitos, mielócitos, promielócitos e blástulas).
[00287] Os exemplos fornecidos neste documento têm, apenas, o propósito de ilustração e a invenção não se limita a tais exemplos; em vez disso, abrange todas as variações que são evidentes como um resultado do ensinamento fornecido neste documento.
[00288] Antes dos experimentos descritos neste documento, não havia um protocolo publicado que permitisse o desenvolvimento e os métodos de uso que compreendem PIOAL para alinhar partículas e reposicionar o conteúdo intracelular, conforme revelado neste documento. Isso é útil para a análise com base em imagem e categorização e subcategorização de diferenciais de partículas em amostras de fluido corporal (por exemplo, sangue). Os métodos e composições revelados neste documento podem, opcionalmente, colorir e/ou lisar partículas de uma maneira adequada para alcançar a coloração de glóbulo branco, coloração de reticulócito e coloração de plaqueta que imita as células com corante de Wright visualizadas em um único esfregaço de sangue completo.
[00289] As composições exemplificadoras descritas neste documento permitem que a coloração ocorra em uma diluição de sangue para reagente relativamente baixa e a coloração pode ocorrer rapidamente (por exemplo, em 30 seg). Se for desejado, o método exemplificador pode empregar o uso de um tensoativo em combinação com calor para poder lisar hemácias. As formulações exemplificadoras podem ser modificadas para manter a integridade de células vermelhas do sangue e ainda alcançar a eficácia de coloração de WBC, retículo e de plaqueta.
[00290] Os aspectos e modalidades da presente revelação têm por base a surpreendente e inesperada constatação de que determinadas composições de PIOAL têm propriedades inesperadas no alinhamento de células e reposicionamento de estruturas intracelulares quando usados para realizar uma análise de partícula/célula com base em imagem.
[00291] A título de exemplo, diversas formulações de PIOAL exemplificadoras e métodos para uso das mesmas foram desenvolvidas. A seguir estão alguns exemplos de formulações de PIOAL com as propriedades desejadas.
[00292] A Figura 4O mostra uma comparação entre imagens obtidas com o uso de PIOAL em função de imagens obtidas com o uso de um fluido de revestimento não PIOAL. O uso de PIOAL resultou em conteúdos celulares mais em foco, tais como lóbulos, citoplasma e/ou grânulo. Nesse exemplo, um PIOAL que compreende um agente de viscosidade (cerca de 30% de glicerol) foi usado para processar a amostra. O pH foi ajustado a um pH de cerca de 6,8 a 7,2 e a mistura de amostra se tornou isotônica (0,9% de cloreto de sódio). Os resultados mostrados neste documento demonstram a eficácia de um PIOAL exemplificador usado em um analisador de imagem para alinhar células e organelas intracelulares.
[00293] As Figuras 4P e 4Q mostram uma comparação entre imagens obtidas com o uso de um fluido de revestimento-padrão (painéis superior e inferior da Figura P) em função de imagens obtidas com o uso de um fluido de PIOAL exemplificador (painéis superior e inferior da Figura 4Q). Conforme mostrado neste documento, o uso de PIOAL resultou em um alinhamento de células vermelhas do sangue aprimorado, por exemplo, orientando as superfícies principais das hemácias de modo que estejam voltadas em direção à câmera ou dispositivo de imageamento. A amostra foi analisada com o uso de um protocolo de focalização de instrumento (em um alvo 44 exemplificador conforme representado na Figura 1) e o alvo foi colocado em foco através de um analisador visual. O sistema de focalização foi, então, compensado pela distância de deslocamento 52, resultando no fato de que as partículas na corrente de amostra em formato de fita estão em foco. A amostra sanguínea foi anteriormente diluída com o uso de um diluente de amostra. A amostra fluiu através de uma cânula e ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo gerando, assim, uma corrente de amostra em formato de fita (por exemplo, 2 mícrons de espessura) que fica entre duas camadas de PIOAL ou revestimento- padrão (em controles). O analisador visual gera, então, imagens focadas das partículas na corrente de amostra em formato de fita (por exemplo, a cerca de 60 quadros por segundo) para serem usadas para a análise. A amostra sanguínea é obtida a partir de um indivíduo e processada para análise pelo analisador de sangue. As imagens de RBCs em uma célula de fluxo são capturadas enquanto a amostra é processada com o uso de um fluido de revestimento-padrão ou um PIOAL. As porcentagens relativas demonstram um aprimoramento significativo na quantidade de RBCs alinhadas, com base nos dados de imageamento (por exemplo, 4P e 4Q). O resultado demonstrou que o PIOAL foi eficaz para aumentar a porcentagem de alinhamento de células vermelhas do sangue durante o fluxo na corrente de amostra em formato de fita com o uso do instrumento de focalização/protocolos, conforme descrito neste documento.
[00294] Observa-se, ainda, que a implantação de PIOAL resulta no alinhamento aprimorado com base no uso de níveis crescentes de glicerol (gly) em células de fluxo simétricas e assimétricas.
[00295] O gráfico na Figura 4R mostra a porcentagem de células não alinhadas obtidas com o uso de 0% a 30% de glicerol no PIOAL com células de fluxo simétricas vs. assimétricas. O uso de 30% de glicerol no PIOAL e uma célula de fluxo simétrica resulta na redução da porcentagem de células desalinhadas para apenas 8%. Observa-se que sem o glicerol no PIOAL e com uma célula assimétrica, a porcentagem de células desalinhadas aumentou para 87%. Por esse motivo, tal gráfico demonstra o efeito da porcentagem de glicerol e geometria da célula de fluxo no alinhamento da partícula (por exemplo, células vermelhas do sangue). A adição de glicerol diminui a porcentagem de células vermelhas do sangue desalinhadas com o uso de geometria da célula de fluxo, tanto simétrica quanto assimétrica. A porcentagem (%) de RBCs não alinhadas foi reduzida de 87% para 15% nas células assimétricas e de 46% para 8% nas células simétricas. Dessa forma, o gráfico fornece uma comparação entre os resultados de desalinhamento (8%) obtidos através de uma configuração de analisador que envolve uma célula de fluxo que tem uma zona de transição de célula de fluxo estreita simétrica e um fluido de revestimento viscoso, e resultados de desalinhamento (46%) obtidos a partir de uma configuração de analisador que envolve uma célula de fluxo que tem uma zona de transição de célula de fluxo estreita simétrica sem o uso de um fluido de revestimento viscoso.
[00296] Tais resultados fornecem evidência quanto à constatação surpreendente e inesperada de que determinadas composições de PIOAL têm propriedades inesperadas no alinhamento de células e reposicionamento de estruturas intracelulares quando usadas para realizar uma análise de partícula/célula com base em imagem.
[00297] A título de exemplo, diversas formulações de PIOAL exemplificadoras e métodos para uso das mesmas foram desenvolvidos. A seguir estão alguns exemplos de formulações de PIOAL com as propriedades desejadas. O PIOAL compreende um diluente e pelo menos um agente de modificação de viscosidade.
[00298] A formulação A de PIOAL exemplificadora inclui uma solução de glicerol de 30% (v/v) que tem 300 mL de glicerol e QS (quantidade suficiente ou para elevar o volume final) para 1 L com um diluente que contém 9,84 g de sulfato de sódio, 4,07 g de cloreto de sódio, 0,11 g de HCl de Procaína, 0,68 g de fosfato de potássio monobásico, 0,71 g de fosfato de sódio dibásico e 1,86 g de EDTA dissódico. A mistura inicial foi seguida de QS para 1 L com água desionizada enquanto ajustou-se o pH para 7,2 com hidróxido de sódio.
[00299] A formulação B de PIOAL exemplificadora inclui uma solução de glicerol de 6,5% (v/v) que tem 65 mL de glicerol e QS para 1 L com um diluente exemplificador adequado que contém 9,84 g de sulfato de sódio, 4,07 g de cloreto de sódio, 0,11 g de HCl de Procaína, 0,68 g de fosfato de potássio monobásico, 0,71 g de fosfato de sódio dibásico e 1,86 g de EDTA dissódico. A mistura inicial foi seguida de QS para 1 L com água desionizada enquanto ajustou-se o pH para 7,2 com hidróxido de sódio.
[00300] A formulação C de PIOAL exemplificadora inclui uma solução de glicerol de 5% (v/v) com 1% de PVP (peso por volume) em tampão que tem 50 mL de glicerol, 10 g de PVP (peso molecular: 360.000), 1 pacote de pó de STF da Sigma, a um pH de 7,4 (solução salina tamponada com fosfato 0,01 M; cloreto de sódio 0,138 M; cloreto de potássio 0,0027 M) e QS para 1 L com água desionizada.
[00301] A formulação D de PIOAL exemplificadora inclui uma solução de PVP de 1,6% (peso por volume) que tem 16 g de PVP (peso molecular: 360.000) e 1 pacote de pó de STF da Sigma, a um pH de 7,4 (solução salina tamponada com fosfato 0,01 M; cloreto de sódio 0,138 M; cloreto de potássio 0,0027 M) e QS para 1L com água desionizada. Rendimento
[00302] A Figura 5 representa uma linha de tempo 500 que corresponde à injeção do um ou mais fluidos de amostra em uma célula de fluxo. Conforme mostrado neste documento, a injeção de um primeiro fluido de amostra pode ser iniciada em uma célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 510. Em seguida, as partículas do primeiro fluido de amostra podem ser imageadas na célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 515. De acordo com algumas modalidades, o primeiro fluido de amostra pode ter um volume em uma faixa de cerca de 5 μL a cerca de 150 μLl. Em alguns casos, o fluxo é de 0,232 μL/seg (ou em uma faixa de 0,2 μL/seg a 0,35 μL/seg) na área de imageamento. Para 20 segundos de imageamento, o valor de fluxo pode estar em uma faixa de 5 μL a 15 μL. A injeção do primeiro fluido de amostra pode ser interrompida, conforme indicado pela etapa 520 e a injeção de um segundo fluido de amostra pode ser iniciado na célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 530. Os transientes de fluido de amostra podem ser iniciados, conforme indicado pela etapa 535, como um resultado da interrupção da injeção do primeiro fluido de amostra e a inicialização da injeção do segundo fluido de amostra. Subsequentemente, os transientes de fluido de amostra na célula de fluxo podem se dissipar, conforme indicado pela etapa 445. As partículas do segundo fluido de amostra podem ser imageadas na célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 550. A injeção do segundo fluido de amostra pode ser interrompida, conforme indicado pela etapa 560. Em alguns casos, os procedimentos de injeção e fluxo são realizados a temperaturas em uma faixa de cerca de 18 °C a cerca de 40 °C.
[00303] Tipicamente, a corrente do fluido de revestimento ainda flui no interior da célula de fluxo conforme a amostra é injetada e conforme a injeção é interrompida. Por esse motivo, de acordo com algumas modalidades, um fluxo contínuo de fluido de revestimento é mantido enquanto as injeções de fluido de amostra são pulsadas no revestimento fluente. O fluxo contínuo do fluido de revestimento pode contribuir para a preservação de um formato de fita no fluido de amostra conforme o fluido de amostra flui ao longo da célula de fluxo.
[00304] De acordo com algumas modalidades, a captura de imagem associada à etapa 550 pode ser realizada em até quatro segundos da captura de imagem associada à etapa 515. De acordo com algumas modalidades, o tempo entre as injeções do primeiro e do segundo fluido de amostra (por exemplo, entre as etapas 510 e 530) é de cerca de 30 segundos. Associadamente, de acordo com algumas modalidades, o tempo entre a inicialização do imageamento do primeiro e segundo fluidos de amostra (por exemplo, entre a inicialização da etapa 515 e a inicialização da etapa 550) é de cerca de 30 segundos. Dessa forma, é possível processar 120 fluidos de amostra por hora. Em alguns casos, um dispositivo de captura de imagem opera a uma taxa de quadros de 180 quadros por segundo (FPS) produzindo, assim, múltiplas imagens consecutivas ou quadros únicos a uma alta frequência ou taxa. Conforme mostrado neste documento, a duração de uma etapa de imageamento (por exemplo, 515 ou 550) pode ser de 15 segundos produzindo, assim, 2.700 imagens por fluido de amostra.
[00305] Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado em cerca de 1 a 3 segundos após a injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido de amostra do tubo de injeção de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente. Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado em menos de 1 segundo após a injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido de amostra a partir do tubo de injeção de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente. A injeção da amostra para a célula de fluxo pode ser um processo de duas etapas. De acordo com esta modalidade, uma primeira etapa é um impulso de alta velocidade que limpa todo o diluente da cânula e após o impulso inicial, a taxa de fluxo da amostra é reduzida significativamente. O tempo de transição pode ser definido como o tempo que a amostra (por exemplo, uma célula) leva para se deslocar da saída de cânula para a área de imageamento sob as condições de fluxo de imageamento (taxa de fluxo de amostra mais lenta). Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado e cerca de 1,8 segundo a partir da injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido de amostra a partir do tubo de injeção de fluido de amostra para o interior do fluido de revestimento fluente. Em alguns casos, o fluido de amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo (por exemplo, a partir de uma porta de saída da cânula para um local de captura de imagem) em uma faixa de cerca de 2 a 4 segundos.
[00306] De acordo com algumas modalidades, leva cerca de 5 segundos para que o fluxo se estabilize ou se desloque de uma porta de saída distal da cânula para a área de imageamento. Em alguns casos, um período de duração de captura de imagem pode ser de cerca de 20 segundos.
[00307] Um sistema de hematologia, de acordo com as modalidades da presente invenção, pode processar uma amostra sanguínea que tem um volume de cerca de 150 μL. O volume de sangue aspirado pode ser de cerca de 120 a 150 μL. Em alguns casos, o volume de sangue mínimo disponível no tubo de amostra é de cerca de 500 μL para um modo de amostragem automático e cerca de 250 μL para um modo de amostragem manual. A cânula ou tubo de injeção 400d mostrada na Figura 4D tem um volume interno de cerca de 13 ul. De acordo com algumas modalidades, a cânula ou tubo de injeção tem um volume interno menor que cerca de 30 ul. O volume de amostra sanguínea é eficaz para purgar a cânula antes de iniciar a coleta de imagem e, assim, poder evitar extensos períodos de tempo em que o fluxo de amostra não está estável. Por exemplo, o uso de uma cânula que tem um volume interno de cerca de 13 uL pode corresponder a um período de instabilidade de fluxo de amostra de cerca de 2 a 3 segundos. De acordo com algumas modalidades, o volume interno de cânula pode não impactar a estabilidade de fluxo de amostra. De acordo com algumas modalidades, o volume interno de cânula pode impactar a estabilidade de concentração de célula na fita de amostra em si se o impulso de amostra de alta velocidade inicial for insuficiente para substituir todo o diluente no interior da cânula. Associadamente, a cânula pode ser limpa entre amostras em uma pequena quantidade de tempo com o uso de uma pequena quantidade de diluente. Dessa forma, é possível alcançar um fluxo de amostra estável que facilita a captura de uma imagem de alta qualidade e, ao mesmo tempo, alcançar um rendimento elevado com uma baixa persistência de resíduos. De acordo com algumas modalidades, uma cânula com um alto volume interno pode exigir um impulso de alta velocidade inicial de alto volume de amostra para limpar todo o diluente nas linhas e cânula. As modalidades da presente invenção abrangem a implantação de volumes de cânula internos inferiores, que são adequados para as aplicações hematológicas em que os volumes de amostra disponíveis são baixos e em que um impulso de volume inferior pode ser atingido em uma quantidade menor de tempo.
[00308] De acordo com algumas modalidades, os sistemas de hematologia podem ser configurados para limitar a contaminação cruzada de amostra sequencial e transiente de modo a acelerar a captura de imagem de amostras de fluido de sangue.
Estrutura celular, conteúdo e alinhamento
[00309] De acordo com algumas modalidades, para atingir a coloração e a visualização de glóbulos brancos, é útil lisar hemácias na amostra e permeabilizar os glóbulos brancos de modo a permitir que o pigmento seja incorporado aos glóbulos brancos. É frequentemente desejável obter uma coloração dos glóbulos brancos com pouca ou nenhuma alteração na morfologia das células. Ademais, é frequentemente desejável obter propriedades de coloração que se assemelham a um corante de Wright. Além disso, é frequentemente desejável obter um alto alinhamento de hemácias (por exemplo, alvo >90%).
[00310] A Figura 5A representa resultados obtidos usando uma formulação de pigmento que não inclui glutaraldeído. Observou-se que as células se deterioraram como um resultado de forças de cisalhamento encontradas na célula de fluxo. Embora uma boa coloração do núcleo tenha sido obtida, o núcleo em si parece deformado e a membrana celular parece danificada. Resumidamente, quando imageada, a célula parece estar destruída devido à ruptura do conteúdo e estrutura celulares.
[00311] A Figura 5B representa resultados de WBC obtidos com o uso de uma formulação de pigmento que inclui glutaraldeído. Conforme mostrado neste documento, as membranas celulares estão intactas e as células são arredondadas. Por esse motivo, observou-se que a versão do pigmento que não usa gluteraldeído (por exemplo, mostrado na Figura 5A) resultou em WBCs enfraquecidos. Embora os WBCs estejam mais intactos na Figura 5B, as porções de núcleo estão danificadas.
[00312] O fluido de revestimento (PIOAL) usado para obter as imagens da Figura 5B inclui 30% de glicerol. Por outro lado, o fluido de revestimento (PIOAL) usado para obter as imagens da Figura 5C inclui 6,5% de glicerol. A concentração inferior de glicerol resultou em uma melhor morfologia, com o núcleo principalmente inalterado. Por esse motivo, observou-se que a membrana celular na Figura 5C está ainda mais intacta do que a membrana celular na Figura 5B. A concentração inferior de glicerol na Figura 5C pode operar para reduzir a diferença de viscosidade reduzindo, assim, a força de cisalhamento. Se uma força de cisalhamento estiver presente, a força pode destruir as membranas celulares. O glicerol pode ter algumas propriedades que são incompatíveis com as células e, portanto, uma concentração superior de glicerol também pode destruir as membranas celulares. Por esse motivo, é possível concluir que os danos ao núcleo representados na Figura 5A podem ser o resultado dos 30% de glicerol no fluido de revestimento.
[00313] Entretanto, quando a concentração de glicerol foi rebaixada para 6,5% conforme representado na Figura 5C observou-se que o alinhamento das hemácias no fluido de amostra diminuiu.
[00314] Várias formulações alternativas de PIOAL foram usadas em uma tentativa de obter alinhamento aprimorado em hemácias, porém, tais formulações alternativas não forneceram resultados satisfatórios. Por exemplo, diversos acentuadores de viscosidade diferentes foram testados, porém, muitos deles exibiram um comportamento similar à formulação de glicerol superior a 30%, de modo que os conteúdos de célula foram danificados.
[00315] Constatou-se que através do uso de polivinilpirrolidona (PVP) e 5% de glicerol como um componente de agente de viscosidade, foi possível obter um fluido de revestimento que tem uma viscosidade compatível com a viscosidade da formulação de glicerol a 30% (e, por esse motivo, os resultados aprimorados de alinhamento foram alcançados) sem os efeitos negativos de destruir o núcleo. A Figura 5D representa resultados obtidos com o uso de um PIOAL com 5% de glicerol e 1% de PVP. Por esse motivo, pode-se perceber que o agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade de células na corrente de fluido de amostra, de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos, por exemplo, quando as células fluem através da célula de fluxo e são expostas ao fluido de revestimento fluente. De acordo com algumas modalidades, a porcentagem de concentração de glicerol é expressada em termos de (v/v) e a porcentagem de concentração de PVP é expressada em termos de (peso por volume).
[00316] A Figura 5E representa resultados de captura de imagem com base em uma técnica de montagem molhada de microscópio tradicional (coluna esquerda) em comparação com uma técnica de célula de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção (coluna direita). O procedimento de montagem molhada pode ser considerado como um padrão-alvo para clareza e qualidade de imagem. Observou-se que as técnicas que envolvem fluidos de revestimento e célula de fluxo projetados conforme revelado neste documento foram eficazes para alcançar a clareza e qualidade de imagem equivalentes à do procedimento de montagem molhada.
[00317] De acordo com algumas modalidades, uma fita de corrente de fluxo pode se dividir quando o diferencial de viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento excedem um determinado limiar. De acordo com algumas modalidades, uma divisão de fita de corrente de fluxo foi observada ao usar um fluido de revestimento que contém glicerol a 60%.
Métodos
[00318] A Figura 6 representa aspectos de um método exemplificador 600 para gerar imagens de uma pluralidade de partículas usando um sistema de análise de partícula configurado para realizar o hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados, de acordo com modalidades da presente invenção. As partículas podem ser incluídas em uma amostra de fluido de sangue 610 que tem uma viscosidade de fluido de amostra. Conforme mostrado neste documento, o método pode incluir fazer fluir um fluido de revestimento 620 ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 630. O fluido de revestimento 620 pode ter uma viscosidade de fluido de revestimento que difere da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade. O método pode, ainda, incluir injetar a amostra de fluido de sangue 610 no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 630, de modo a fornecer uma corrente de fluido de amostra envolta pelo fluido de revestimento. Ademais, os métodos podem incluir fazer fluir a corrente de fluido de amostra e o fluido de revestimento através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo em direção a um local de imageamento conforme indicado pela etapa 640. Conforme a corrente de fluidos de amostra e de revestimento passa através da redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição de estreitamento, um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e a corrente de fluido de amostra associado à diferença de viscosidade (conforme representado na etapa 650), em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e a corrente de fluido de amostra associado à redução no tamanho da trajetória de fluxo (conforme representado na etapa 660), é eficaz para fornecer um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas no local de imageamento enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade de células na corrente de fluido de amostra de modo a deixar a estrutura e conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente conforme representado pela etapa 670. Os métodos podem, ainda, incluir gerar imagens da pluralidade de partículas no local de imageamento, conforme representado pela etapa 680.
[00319] As Figuras 6A e 6B representam características de corrente de fluxo exemplificadoras relacionadas à força de cisalhamento, compressão lateral, orientação, diferencial de viscosidade, movimento relativo entre fluidos de revestimento e de amostra e similares.
[00320] A Figura 6C representa aspectos de um método exemplificador 6000 para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue, de acordo com modalidades da presente invenção. Conforme mostrado neste documento, a amostra sanguínea 6010 inclui partículas e pode ser dividida em porções em um ou mais fluidos de amostra, tais como um primeiro fluido de amostra 6012 que contém partículas e um segundo fluido de amostra 6014 que contém partículas. O método pode incluir fazer fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 6020. Ademais, o método pode incluir injetar o primeiro fluido de amostra 6012 de um tubo de injeção de fluido de amostra para um fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 6030, de modo a fornecer uma corrente de fluido de amostra que tem uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção. A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, de modo que uma espessura da corrente de fluido de amostra diminui da espessura inicial para uma segunda espessura adjacente e relação a um local de captura de imagem. O método 6000 pode incluir, adicionalmente, gerar imagens de uma primeira pluralidade das partículas a partir do primeiro fluido de amostra no local de captura de imagem da célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 6040.
[00321] O método 6000 pode, ainda, incluir inicializar transientes de fluido de amostra. Por exemplo, os transientes de fluido de amostra podem ser inicializados através da interrupção da injeção do primeiro fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente e através da injeção do segundo fluido de amostra para o fluido de revestimento fluente conforme indicado pela etapa 6050. Ademais, o método 6000 pode incluir gerar imagens de uma segunda pluralidade das partículas do segundo fluido de amostra no local de captura de imagem da célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 6060. De acordo com algumas modalidades, o imageamento da segunda pluralidade de partículas pode ser realizado substancialmente após os transientes de fluido de amostra e em até 4 segundos após o imageamento da primeira pluralidade das partículas.
Taxa de deformação de cisalhamento
[00322] As Figuras 7 e 8 representam aspectos de valores de taxa de deformação de cisalhamento para determinadas condições de fluxo em uma célula de fluxo, de acordo com modalidades da presente invenção. Em cada um de tais desenhos, um fluido de revestimento de 30% de glicerol é usado. Em alguns casos, a viscosidade pode ter um valor de 2,45 x 10-3. Um valor de estresse de cisalhamento pode ser igual ao produto obtido multiplicando-se um valor de viscosidade por um valor de taxa de deformação. Em relação à Figura 7, a amostra pode ter uma taxa de fluxo de 0,3 μLl/seg e o fluido de revestimento pode ter uma taxa de fluxo de 21 μL/seg. Em relação à Figura 8, a amostra pode ter uma taxa de fluxo de 1 μLl/seg e o fluido de revestimento pode ter uma taxa de fluxo de 70 μL/seg. Em cada uma de tais Figuras, pode-se perceber que o fluxo apresenta um valor de esforço inferior em direção ao centro (C) e um valor de esforço superior em direção à periferia (P). Tais valores de esforço podem corresponder a uma configuração de célula assimétrica de fluxo em algumas modalidades.
[00323] Conforme representado na Figura 7, de acordo com algumas modalidades, a taxa de deformação inferior em direção à porção de centro (C) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 500 (1/s) ou inferior e a taxa de deformação superior em direção à periferia (P) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 3.000 (1/s) ou superior. Conforme representado na Figura 8, de acordo com algumas modalidades, a taxa de deformação inferior em direção à porção de centro (C) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 1.000 (1/s) ou inferior e a taxa de deformação superior em direção à periferia (P) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 9.000 (1/s) ou superior.
[00324] Por esse motivo, pode ser percebido que as taxas inferiores de fluido de amostra e de revestimento (por exemplo, Figura 7) correspondem às taxas de esforço inferiores e taxas de fluido de amostra e de revestimento superiores (por exemplo, Figura 8) correspondem às taxas de esforço superiores. Entende-se que as modalidades da presente invenção abrangem o uso de amostra e/ou fluidos de revestimento que correspondem a vários valores de viscosidade, vários valores de taxa de deformação e/ou vários valores de estresse de cisalhamento.
Alvo de foco automático
[00325] O PIOAL pode ser introduzido em uma célula de fluxo e transportar a amostra através da área de imageamento, em seguida, em direção à descarga. A corrente de fluido de amostra pode ser injetada através de uma cânula com uma fenda achatada para estabelecer uma trajetória de fluxo com uma largura considerável. Por exemplo, o PIOAL pode ter uma viscosidade relativamente superior em relação ao fluido de amostra, densidade adequada e as taxas de fluxo no ponto de injeção da amostra são de modo que o fluido de amostra esteja achatado em um formato de fita fina. A fita de fluido de amostra é transportada juntamente com o PIOAL para passar na frente de uma porta de visualização em que um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e uma fonte de luz estão dispostos para visualizar a corrente de amostra em formato de fita.
[00326] A corrente de amostra em formato de fita é transportada juntamente com o PIOAL para passar na frente de uma porta de visualização em que um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e uma fonte de luz (por exemplo, UV, visível ou IV) estão dispostos para visualizar a corrente de amostra em formato de fita. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a fonte de luz podem ser colocados em lados opostos da célula de fluxo para obter imagens retroiluminadas das partículas, tais como as células de sangue. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura imagens de dados de pixel da amostra através de uma porta de visualização na célula de fluxo. Por exemplo, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura imagens a uma taxa de repetição consistente com a velocidade do fluxo de amostra, de modo que as seções da corrente de amostra em formato de fita sejam imageadas sem espaçamentos ou sobreposições substanciais.
[00327] As modalidades da presente invenção fornecem diversos recursos únicos estruturais e funcionais implantados no design e operação de um sistema para coletar imagens de uma corrente de amostra em formato de fita que flui através de uma célula de fluxo. As modalidades exemplificadoras são configuradas para obter imagens suficientemente focadas das partículas, com uma clareza e resolução suficientes para revelar os diferentes recursos das várias partículas, tais como as células de sangue, que permitem que os tipos de partícula e/ou de célula sejam distinguidos uns dos outros.
[00328] Para colocar a corrente de amostra em formato de fita em foco, a distância entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita pode ser estabelecida, de modo que a corrente de amostra em formato de fita esteja a uma distância desejada (por exemplo, a distância de focalização) em relação ao dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ao longo do eixo geométrico óptico.
[00329] Uma distância de focalização é uma característica das lentes do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica usadas para resolver a imagem em uma matriz de fotossensor, mais especificamente definida pelo material, formato e dimensões dos elementos de lente e sua configuração e colocação ao longo do eixo geométrico óptico. As dimensões da área da amostra que é imageada e a profundidade de campo que está em foco na amostra são determinadas pela configuração de lente.
[00330] Os ajustes de abertura e ajustes de zoom são possíveis, porém, para os propósitos de simplicidade, determinados exemplos nesta revelação são de modo que a focalização do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica nas partículas na corrente de amostra em formato de fita exige, simplesmente, posicionar relativamente o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita na célula de fluxo a uma distância correta, mais especificamente a distância que resolve uma imagem focada na matriz de fotossensor (por exemplo, uma matriz de dispositivo acoplada por carga) de partículas na corrente de amostra em formato de fita. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode incluir uma câmera que grava ou transmite imagens imóveis ou imagens de vídeo para exibição e/ou processamento e/ou transmissão.
[00331] Em um aspecto, a natureza simétrica da célula de fluxo e a maneira de injeção do fluido de amostra e PIOAL fornecem uma posição repetível na célula de fluxo para a corrente de amostra em formato de fita no PIOAL. Entretanto, as posições relativas da célula de fluxo e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica são submetidos à alteração e exigem ajustes de posição ocasionais para manter a distância ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita fornecendo, assim, uma imagem de foco de qualidade.
[00332] As modalidades da presente invenção abrangem sistemas de analisador visual automatizado e métodos para sangue e/ou outros fluidos biológicos que incorporam um dispositivo/aparelho de foco automático para fornecer imagens confiavelmente focadas da amostra através do estabelecimento muito preciso da distância entre a corrente de amostra em formato de fita e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em um aspecto, as modalidades do sistema de foco automático reveladas neste documento podem estabelecer muito precisamente a distância entre a corrente de amostra em formato de fita e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e capturar as imagens confiavelmente focadas da amostra. Em algumas modalidades, os algoritmos são usados para estabelecer a distância que atinge bons resultados de foco.
[00333] É um objetivo empregar uma célula de fluxo que fornece uma posição estável e altamente repetível para uma corrente de amostra em formato de fita envolta em um fluxo de PIOAL, em combinação com um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e dispositivo/aparelho de foco automático que mantém a distância ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita fornecendo, assim, uma imagem focada de qualidade.
[00334] Tal aparelho e métodos são revelados e reivindicados neste documento. Uma célula de fluxo simétrica é fornecida, em que constatou-se que a mesma produz uma posição de corrente de amostra repetível em formato de fita no interior da célula de fluxo. Focalizar envolve estabelecer uma posição relativa precisamente correta do dispositivo de imagem de alta resolução óptica em relação à corrente de amostra em formato de fita, de modo a manter o foco na corrente de amostra em formato de fita.
[00335] Vantajosamente, a célula de fluxo e/ou o dispositivo de imagem de alta resolução óptica podem ser movidos um em relação ao outro em um processo de foco automático com o uso de um padrão de foco automático tal como um padrão de alto contraste ou alvo de focalização similar, de preferência, um alvo plano com recursos fortemente contrastantes, tais como bordas, em que o padrão de foco automático está fixo na posição em relação à célula de fluxo e usado como uma matéria de focalização em vez da amostra em si. A corrente de amostra em formato de fita é uma fita fina a uma distância fixa do padrão de foco automático ao longo da linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. A distância de deslocamento entre o padrão de foco automático e a posição da corrente de amostra em formato de fita é uma distância constante, que é determinada inicialmente e programada no procedimento de foco automático. A técnica exemplificadora posteriormente compreende focar automaticamente no padrão de foco automático, em seguida deslocar o dispositivo de imagem de alta resolução óptica e/ou célula de fluxo um em relação ao outro pela distância predeterminada conhecida e constante, mediante o qual a distância entre o dispositivo de imagem de alta resolução óptica e o local da corrente de amostra em formato de fita é a distância ideal para fornecer uma imagem focada de qualidade da corrente de amostra em formato de fita. Por exemplo, primeiro, um algoritmo de foco automático foca a posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica no padrão de foco automático localizado a uma distância fixa em relação à corrente de amostra em formato de fita. Após focalizar no padrão de foco automático, o processador opera o acionamento de motor ao longo da distância fixa de modo a colocar, portanto, a corrente de amostra em formato de fita em foco do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica.
[00336] Um dispositivo exemplificador de imagem de alta resolução óptica compreende uma lente objetiva e um sensor de imagem de pixel associado que pode capturar uma imagem que revela as partículas a uma ampliação e resolução suficientes para fornecer detalhes suficientes para resolver recursos visuais das partículas. Em certas modalidades, a ampliação é superior por um fator de pelo menos 2x (fornecendo, assim, uma área de imagem de 2x por cada imagem obtida) gerando, assim, informações mais detalhadas para cada partícula em comparação com os analisadores de hematologia tradicionais.
[00337] A trajetória de fluxo de PIOAL pode ser disposta simetricamente de modo que as quantidades iguais de PIOAL fluam acima e abaixo da corrente de amostra em formato de fita que se estende e localiza a corrente de amostra em formato de fita como uma fita fina a uma distância fixa do padrão de foco automático ao longo da linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em uma modalidade, o padrão de foco automático compreende um rebordo opaco ao redor de uma fenda que admite luz a partir de uma fonte de iluminação traseira e a distância do padrão de foco automático está pronta e não ambiguamente alojada através dos controles de foco automático. Em seguida, a corrente de amostra em formato de fita é colocada em foco através do deslocamento do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica em relação à célula de fluxo ao longo da distância predeterminada e a distância de deslocamento constante. Não há uma necessidade de focar automaticamente de maneira direta no conteúdo de imagem da amostra, embora o foco automático adicional seja possível.
[00338] Uma configuração de focalização automatizada inclui um acionamento de motor que ajusta a posição relativa da célula de fluxo e um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ao longo do eixo geométrico óptico responsivo aos sinais de controle de um processador que avalia uma ou mais medidas de qualidade de foco ao longo de uma faixa de distâncias e busca uma distância ideal. Por exemplo, o processador pode avaliar uma medida de contraste e operar o acionamento de motor para focar automaticamente. Em uma operação normal, o processador opera o acionamento de motor para focar automaticamente no alvo e, em seguida, ajusta a distância entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo pelo deslocamento registrado do alvo para colocar a corrente de amostra em formato de fita em foco. Contanto que o dispositivo continue a mover a corrente de amostra em formato de fita no mesmo sentido e a expansão térmica ou fatores similares que possam causar confusão não surjam, a imagem da corrente de amostra em formato de fita irá permanecer em foco.
[00339] Um processo de configuração ou calibração preliminares podem ser usados para determinar e registrar a distância de deslocamento entre o alvo e a posição da corrente de amostra em formato de fita na célula de fluxo. A distância exata de deslocamento que pode diferir ligeiramente para diferentes células de fluxo é estabelecida através de testes preliminares, tais como focar automaticamente de modo alternativo no alvo e em uma corrente de amostra em formato de fita de teste diversas vezes, e registrar o resultado médio como uma constante associada à célula de fluxo.
[00340] Consequentemente, uma amostra a ser imageada, tal como uma amostra sanguínea preparada ou outro tipo de amostra, é direcionada ao longo de uma trajetória de fluxo definida através de uma zona de visualização em uma célula de fluxo. A trajetória de fluxo de PIOAL é, preferencialmente, simétrica e a amostra é injetada no centro do fluxo de PIOAL com que a amostra é envelopada. As taxas de fluxo e características de viscosidade e densidade da amostra e o material de revestimento, tal como um PIOAL, juntamente com o contorno da célula de fluxo, cooperam de modo a conformar a corrente de amostra em formato de fita em uma fita achatada que flui consistentemente através da zona de visualização em uma posição repetível.
[00341] A amostra pode ser imageada por um componente de câmera do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e imagens digitais coletadas para serem analisadas por processos de análise de imagem pelo menos parcialmente automatizados, incluindo um processo de foco automático conforme descrito neste documento.
[00342] Um objetivo é distinguir, categorizar, subcategorizar e/ou contar partículas, tais como células de sangue em amostras de sangue assim como outras amostras biológicas descritas neste documento, que podem ser associadas a afecções específicas. Em um aspecto, as composições de agente de contraste de partícula desta revelação podem ser combinadas com um analisador visual, tal como o analisador descrito neste documento em um método para fornecer imagens focadas surpreendentemente de alta qualidade de células em fluxo. As células podem ser capturadas e processadas automaticamente.
[00343] As imagens permitem uma imagem automatizada com base em contagem diferencial de WBC, assim como a identificação automatizada de anomalias morfológicas úteis na determinação, diagnóstico, prognóstico, previsão e/ou sustentação de um diagnóstico para determinar se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, afecção, anomalia e/ou infecção e/ou para determinar ou monitorar se o indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento. As contagens de categoria de célula e/ou subcategoria em amostras de sangue são usadas nesta revelação como exemplos não limitadores dos tipos de fluidos que podem ser analisados.
[00344] Em um aspecto, os analisadores de imagem para uso com as composições desta invenção podem capturar imagens confiavelmente focadas da amostra através do estabelecimento muito preciso da distância entre a corrente de amostra em formato de fita e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica do sistema óptico. Em algumas modalidades, os analisadores visuais podem ser usados em combinação com as composições desta invenção e algoritmos para estabelecer a dita distância que pode atingir bons resultados de foco. A amostra está disposta na célula de fluxo e iluminada para possibilitar a visualização através de uma porta de visualização. As células ou partículas individuais aparecem claramente na imagem de dados de pixel com detalhes de recursos suficientes para revelar atributos que são, em seguida, comparados e contrastados com parâmetros conhecidos por distinguir categorias e subcategorias de células umas das outras.
[00345] É um objetivo empregar uma célula de fluxo em combinação com as composições exemplificadoras de agente de contraste de partícula descritas neste documento e um PIOAL exemplificador que fornece imagens de qualidade ideal e detalhes para o reconhecimento de partícula. Além disso, o PIOAL e o aparelho fornecem uma posição estável e altamente repetível para uma corrente de amostra em formato de fita envelopada em um fluxo de PIOAL. Isso, em combinação com um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e o dispositivo/aparelho de foco automático que mantém a distância ideal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica em relação à corrente de amostra em formato de fita fornece uma imagem focada de qualidade.
Alvo de foco automático
[00346] Novamente com referência à Figura 1, os sistemas de imageamento de partícula podem incluir um padrão de foco automático ou alvo 44 que é fixo em relação à célula de fluxo 22. O alvo de foco automático 44 pode ser usado para alcançar imagens focadas de partículas de fluido de sangue que flui através da célula de fluxo.
[00347] A Figura 9A representa um alvo de foco automático 900 exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção. Conforme mostrado neste documento, o alvo 900 inclui uma banda anular opaca 910 e uma abertura ou centro transparente 920. Durante a operação, o dispositivo de imageamento foca na banda 910 e captura a imagem através da abertura. Conforme discutido em outra parte deste documento e no Pedido de Patente copendente n° U.S. , um processo de captura de imagem pode envolver, primeiro, focalizar (ou focalizar automaticamente) na banda 910 e, em seguida, ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a corrente de fluido de amostra antes de obter a imagem através da abertura 920. Consequentemente, a banda 910 pode apresentar um alvo sobre o qual um sistema de foco automático do dispositivo de captura de imagem pode detectar e focar, e determinadas porções do alvo (por exemplo, bordas ou segmentos) podem ser incluídas na imagem. Em alguns casos, o alvo pode ser fornecido como um disco de cromo que tem uma abertura central. Um alvo exemplificador pode ser dotado de um microfuro central, que tem um diâmetro de cerca de 0,5 mm, que está colado ou fixo à célula de fluxo. O tamanho do microfuro central ou abertura 920 pode ser selecionado de modo que apenas quatro porções de borda 930 da banda anular opaca 910 estejam visíveis na imagem capturada 940, conforme ilustrado na Figura 9B. Por esse motivo, a banda anular 910 não interfere com a captura de imagens de célula (por exemplo, a luz pode passar através da abertura 920 de modo a iluminar as partículas de amostra e o campo de visão é, substancialmente, desimpedido pela banda anular). Dessa forma, a banda 910 aparece apenas nos cantos da imagem.
[00348] A Figura 10 representa um alvo de foco automático 1000 exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção. O alvo 1000 inclui uma banda ou rebordo 1010 e uma abertura central 1020. A Figura 11 mostra outro alvo de foco automático 1100 exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção. O alvo 1100 inclui uma banda ou rebordo 1110 e uma abertura central 1120. De acordo com algumas modalidades, o alvo de foco automático 1100 fornece uma imagem que tem 50 pixels de preto no topo e no fundo. Em alguns casos, o alvo de foco automático 1100 fornece um desvio de foco de célula de fluxo (FCFO) de cerca de 65,3 μm. Os aspectos do FCFO são, adicionalmente, discutidos no Pedido de Patente copendente n° U.S. , cujo conteúdo está incorporado neste documento a título de referência.
[00349] A Figura 12A representa um alvo de foco automático 1200 exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção. O alvo 1200 é apresentado como um design de caixa de correio e inclui um primeiro rebordo ou rebordo superior 1210 e um segundo rebordo ou rebordo inferior 1220. O alvo 1200 inclui, ainda, uma abertura ou passagem transparente 1230 entre o primeiro e segundo rebordos. De acordo com algumas modalidades, o alvo tem um diâmetro de cerca de 4 mm e a altura da caixa de correio é de 265 μm. Em alguns casos, os rebordos superior e inferior podem estar presentes como meios círculos e podem ser produzidos com um metal depositado, tal como óxido de cromo ou algum outro material opaco.
[00350] A Figura 12B mostra uma vista de perto da porção central do alvo de foco automático 1200. Conforme mostrado neste documento, em que o primeiro rebordo 1210 inclui uma escala numérica negativa/positiva, com um valor de zero centralizado. O segundo rebordo 1220 inclui uma escala similar. Em alguns casos, os incrementos da escala são de 100 μm. De acordo com algumas modalidades, as escalas podem ser usadas para facilitar o posicionamento da célula de fluxo de modo que o campo de visão do dispositivo de imageamento ou câmera possa ser centralizado na corrente de amostra. Conforme mostrado neste documento, a corrente de amostra 1240 flui em uma direção perpendicular às escalas do primeiro e segundo rebordos. Como uma parte de um protocolo de focalização, o dispositivo de captura de imagem pode operar para focar nos números ou outros caracteres ou objetos imageáveis presentes nos rebordos 1210 e 1220.
[00351] As modalidades da presente invenção abrangem técnicas para solucionar o deslize térmico associado ao uso do sistema de análise de partícula, por meio do qual tais efeitos térmicos podem, de outro modo, compreender a qualidade das imagens obtidas com o dispositivo de imageamento. A Figura 13A representa uma vista lateral parcial de uma célula de fluxo 1320 que tem um sensor térmico 1370, um refletor 1380 e um alvo de foco automático 1344. Durante a operação de um sistema de análise de partícula, os efeitos térmicos podem fazer com que a corrente de amostra deslize lentamente para fora do foco do dispositivo de imageamento. Por exemplo, os efeitos térmicos podem ser causados pela expansão térmica da célula de fluxo através de calor irradiado proveniente da lâmpada. Ademais, os efeitos térmicos podem ser causados pela expansão térmica da montagem de célula de fluxo e a montagem de banco óptico (OBA) através de aquecimento de condução e de radiação. Em algumas modalidades, determinados componentes da OBA podem se expandir, o que pode contribuir para erros de focalização. Por exemplo, tais componentes podem incluir placas de metal que mantêm a câmera 24 junta, uma placa de metal que retém ou está conectada à célula de fluxo ou uma placa de metal que retém tanto a célula de fluxo quanto a câmera 24 juntas. A Figura 13B representa uma vista em perspectiva parcial da célula de fluxo 1320 que tem o sensor térmico 1370 e o alvo de foco automático 1344. Ademais, a Figura 13C representa outra vista em perspectiva da célula de fluxo 1320 que tem um sensor térmico 1370, o refletor 1380 e o alvo de foco automático 1344.
[00352] A Figura 13B representa uma vista em perspectiva parcial da célula de fluxo 1320 que tem o sensor térmico 1370 e o foco automático ou alvo de imageamento 1344. De acordo com algumas modalidades da presente invenção, um dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado na corrente de fluxo de amostra com o uso de uma temperatura que é detectada através de um sensor térmico associado ao analisador. Por exemplo, a temperatura pode corresponder a uma temperatura de fluido de amostra, uma temperatura de fluido de revestimento, uma temperatura de célula de fluxo ou uma temperatura de dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, a temperatura é uma temperatura no local de imageamento de uma célula de fluxo. Em alguns casos, a temperatura é uma temperatura em um local a jusante do local de imageamento. Em alguns casos, a temperatura é uma temperatura em um local a montante do local de imageamento. De acordo com algumas modalidades da presente invenção, um dispositivo de captura de imagem pode ser focado na corrente de fluxo de amostra com o uso de uma taxa de alteração de temperatura associada ao analisador. Por exemplo, a taxa de alteração de temperatura corresponde a uma taxa de alteração de temperatura de fluido de amostra, uma taxa de alteração de temperatura de fluido de revestimento, uma taxa de alteração de temperatura de célula de fluxo ou uma taxa de alteração de temperatura de dispositivo de captura de imagem.
[00353] A Figura 13C representa outra vista em perspectiva da célula de fluxo 1320 que tem um sensor térmico 1370, um refletor 1380 e foco automático ou alvo de imageamento 1344. O refletor 1380 pode operar para reduzir ou limitar a quantidade de calor absorvida pela célula de fluxo 1320. Por exemplo, o refletor 1380 pode bloquear o calor irradiado por uma lâmpada de flash 1342, conforme indicado na Figura 13A. Por esse motivo, o refletor 1380 pode minimizar o impacto térmico da lâmpada. O refletor 1342 pode, ainda, reduzir o ofuscamento e a dispersão de luz gerada pela lâmpada resultando, assim, na qualidade de imagem aprimorada. O sensor térmico 1370 está posicionado próximo à canaleta de fluxo de fluido e adjacente ao local de captura de imagem, de modo que as leituras de temperatura precisas possam ser obtidas. As informações a partir do sensor de temperatura podem ser usadas para focar o dispositivo de captura de imagem na corrente de fita de fluido de amostra. As técnicas de foco automático exemplificadoras reveladas neste documento podem ter por base as flutuações de temperatura que ocorrem no interior de determinados elementos do analisador.
[00354] Conforme representado na Figura 13D, uma célula de fluxo 1320d pode incluir uma trajetória de fluxo 1322d que tem uma porta ou ventilação 1301d através da qual as bolhas 1302d podem ser liberadas ou removidas. Conforme representado neste documento, um tubo 1303d, através do qual o vácuo pode ser aplicado, pode ser colocado em contato com a porta 1301d de modo a retirar as bolhas 1302d da corrente de fluxo. Tal mecanismo de remoção de bolhas é adequado para remover bolhas do fluido que flui no interior da célula de fluxo e pode operar para evitar que bolhas ou microbolhas sejam abrigadas ou presas dentro da célula de fluxo.
[00355] De acordo com algumas modalidades, um método para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue pode incluir fazer fluir um fluido de revestimento ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo e injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente no interior da célula de fluxo, de modo que a amostra de fluido de sangue flua em uma corrente de fluxo de amostra com uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo, de modo que a célula de fluxo tenha uma temperatura associada. Ademais, o método pode incluir focalizar um dispositivo de captura de imagem, ao longo de um eixo geométrico de imageamento, na corrente de fluxo a um primeiro estado focal enquanto a temperatura associada à célula de fluxo está a uma primeira temperatura e adquirir uma primeira imagem focada de um primeiro subconjunto das partículas no interior da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no primeiro estado focal. Além disso, o método pode incluir determinar que a temperatura associada à célula de fluxo foi submetida a uma alteração da primeira temperatura para uma segunda temperatura e ajustar automaticamente o foco do dispositivo de captura de imagem do primeiro estado focal para um segundo estado focal em resposta à alteração na temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e foco desejado. Ademais, o método pode incluir adquirir uma segunda imagem focada de um segundo subconjunto das partículas no interior da corrente de fluxo com o dispositivo de captura de imagem no segundo estado focal.
[00356] Em alguns casos, o processo de ajuste do foco do dispositivo de captura de imagem inclui ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo com o uso da alteração na temperatura e a relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e o foco desejado. Em alguns casos, o processo de ajustar do foco do dispositivo de captura de imagem inclui ajustar uma distância focal do dispositivo de captura de imagem com o uso da alteração na temperatura e a relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e o foco desejado.
Extensão de faixa dinâmica
[00357] A Figura 14 é um diagrama de blocos que mostra aspectos adicionais de sistemas e métodos para alcançar uma extensão da faixa de detecção ou dinâmica para a análise de partícula em amostras de sangue, de acordo com modalidades da presente invenção. Conforme representado neste documento, pelo menos um processador digital 18 está acoplado para operar o acionamento de motor 54 e para analisar a imagem digitalizada a partir da matriz de fotossensor, conforme coletada em diferentes posições de foco em relação ao padrão-alvo de foco automático 44. O processador 18 está configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático 44, isto é, para focar automaticamente no padrão-alvo de foco automático 44 e estabelecer, assim, uma distância ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e o padrão de foco automático 44. Isso pode ser alcançado através das etapas de processamento de imagem, tal como a aplicação de um algoritmo para avaliar o nível de contraste na imagem em uma primeira distância, que pode ser aplicada à imagem inteira ou pelo menos em uma borda do padrão de foco automático 44. O processador move o motor 54 para outra posição e avalia o contraste em tal posição ou borda e após duas ou mais interações determina uma distância ideal que maximiza a exatidão do foco no padrão de foco automático 44 (ou otimiza a exatidão do foco se for movido para tal posição). O processador depende do espaçamento fixo entre o padrão de foco automático do alvo do foco automático 44 e a corrente de amostra em formato de fita, o processador 18, em seguida, controla o motor 54 para mover o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 para a distância correta para focar na corrente de amostra em formato de fita 32. Mais especificamente, o processador opera o motor para deslocar a distância entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita 32 pela distância de deslocamento 52 (consulte a Figura 1) através da qual a corrente de amostra em formato de fita é deslocada do padrão-alvo de foco automático 44. Dessa forma, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é focalizado na corrente de amostra em formato de fita.
[00358] De acordo com algumas modalidades, o analisador visual 17 é um analisador exemplificador 17 da Figura 1. O analisador visual 17 pode compreender pelo menos uma célula de fluxo 22 e pelo menos um dispositivo de imageamento 24, tal como um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica que tem um sensor de imageamento, tal como uma câmera digital. O analisador visual 17 pode, ainda, compreender um injetor de amostra 29. O injetor de amostra 29 está configurado para fornecer a amostra 12 dentro de pelo menos uma célula de fluxo 22. Uma célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo de PIOAL interna que se estreita, por exemplo, simetricamente na direção de fluxo. Uma célula de fluxo 22 está configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra através de uma zona de visualização na célula de fluxo 22.
[00359] A Figura 14 ilustra o foco automático e outro aspecto do imageamento digital, conforme descrito. Tais técnicas podem ser empregadas em conjunto com o aparelho de célula de sangue que não tem por base o imageamento ou, talvez, seja menos relacionado à imagem do que as modalidades descritas, tais como os contadores de célula de sangue Coulter, também conhecidos como citômetros de fluxo. Tais contadores são conhecidos por detectar e contar células de sangue e partículas em fluidos, porém, normalmente não através de imageamento. Em um contador desse tipo, uma célula de fluxo é disposta para transportar um fluxo de partículas envolto em um fluido. A célula de fluxo se estreita para forçar partículas na trajetória de fluxo em uma fila única. Um par de eletrodos ou outros detectores que abrangem a trajetória de fluxo produzem uma contagem através da detecção de uma alteração pulsada na impedância elétrica ou obstrução de uma trajetória de luz entre uma fonte de luz e um detector de fotos quando as células passam.
[00360] Os citômetros de fluxo são vantajosos devido ao fato de que uma grande quantidade de células ou outras partículas podem ser contadas, muito maior que a quantidade de células que podem ser imageadas praticamente em um contador visual. Porém, os citômetros de fluxo não são tão eficazes para distinguir entre células com base no tipo ou para possibilitar distinções entre células normais e anormais ou que distinguem células agrupadas, tais como nódulos de plaqueta, de células de sangue distintas. Operando-se um analisador, por exemplo, o analisador visual, conforme descrito, através de uma quantidade estatisticamente significativa de quadros de imagem de uma corrente de amostra em formato de fita, uma distribuição ou razão proporcional de tipos de célula de sangue pode ser medida. As razões proporcionais determinadas a partir de um analisador visual ou uma função das mesmas,são aplicadas às contagens de célula de sangue e as grandes quantidades de células de sangue contadas através do citômetro, embora com menos discriminação ou nenhuma discriminação quanto ao tipo de célula, para fornecer uma contagem de sangue total precisa que explora as vantagens peculiares de ambos os tipos de analisadores.
[00361] De acordo com algumas modalidades, as contagens de partícula podem ser inferidas através da aplicação de um algoritmo, por exemplo, um algoritmo com base em uma razão proporcional de contagens de partícula. A Figura 14 ilustra um aparelho exemplificador adaptado à análise de sangue. Em algumas modalidades, o contador de partículas 15 e o analisador visual 17 podem estar conectados em série além de paralelos. O contador de partículas 15, pode ser, por exemplo, um contador de célula de sangue Coulter, que detecta e conta células de sangue e partículas em fluidos. Em um contador desse tipo, uma trajetória de fluxo (não mostrada) está disposta para transportar um fluxo de partículas envoltas em um fluido. A trajetória de fluxo se estreita para forçar as partículas na trajetória de fluxo para uma fila única. Um par de eletrodos ou outros detectores que abrangem a trajetória de fluxo produz uma contagem através da detecção de uma alteração pulsada na impedância elétrica ou obstrução de uma trajetória de luz entre uma fonte de luz e um detector de fotos quando as células passam. O contador de partículas 15 está configurado para contar uma grande quantidade de células ou outras partículas. Porém, o contador de partículas 15 pode não ter a capacidade para distinguir entre membros em subcategorias de células e/ou para distinguir entre células normais e anormais ou para distinguir células agrupadas tais como nódulos de plaqueta de células de sangue distintas.
[00362] O analisador visual 17 pode, ainda, compreender pelo menos uma câmara de contato 25 configurada para fornecer pelo menos um produto químico que compreende pelo menos um dentre um diluente, um agente de permeabilização, um agente de contraste eficaz para gerar distinções visuais para a categorização e/ou subcategorização de partículas. Por exemplo, conforme mostrado com referência às Figuras 1 e 14, a amostra de contato é introduzida na célula de fluxo através do injetor de amostra 29 e um reagente de alinhamento de revestimento ou organela intracelular é introduzido a partir de um injetor 27. Um diluente pode ser usado para diluir a amostra a uma concentração adequada. Um agente de contraste e/ou agente de permeabilização é usado para gerar distinções visuais para categorizar e/ou subcategorizar partículas. O PIOAL é usado para alinhar determinados tipos de células ou estruturas celulares em uma direção para um melhor imageamento. Em algumas modalidades, o pelo menos um produto químico pode ser aplicado para entrar em contato com uma amostra primeiro e, em seguida, a amostra tratada é fornecida no analisador visual 17. O tratamento da amostra com a adição de pelo menos um produto químico pode ser realizado à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, tal tratamento pode ser realizado a uma temperatura tal como 10, 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 °C. O tratamento a uma temperatura selecionada pode ser conduzido em um incubador que é separado do analisador visual 17 ou em um analisador visual 17 que tem a temperatura controlada.
[00363] Em algumas modalidades, o analisador visual pode ter um injetor de agente de contraste para colocar a amostra em contato com um agente de contraste e/ou agente de permeabilização ou tensoativo. Em outras modalidades, a amostra pode ser colocada em contato com o agente de contraste, de modo a permeabilizar o agente antes da injeção no analisador visual. Em outras modalidades, o analisador visual que contém elementos de aquecimento para aquecer a amostra enquanto está em contato com o agente de contraste e/ou agente de permeabilização, a uma temperatura controlada durante um tempo controlado. O analisador visual pode, ainda, ter um elemento de resfriamento para resfriar a mistura de amostra após a etapa de aquecimento. As composições de agente de contraste e métodos exemplificadores que podem ser usados para processar amostras de fluido de sangue estão revelados no Pedido de Patente copendente n° U.S. , cujo conteúdo encontra-se incorporado neste documento a título de referência.
[00364] Operando-se o analisador visual 17 conforme descrito, através de uma quantidade estatisticamente significativa de quadros de imagem de uma corrente de amostra em formato de fita, uma razão proporcional de células em categorias e/ou subcategorias de célula pode ser determinada através do processador 18. As razões proporcionais determinadas a partir do analisador visual 17 são aplicadas às contagens de célula de sangue e as quantidades maiores de células de sangue contadas pelo contador de partículas 15, embora tenha menos discriminação ou nenhuma discriminação quanto aos membros em uma categoria e/ou subcategoria de célula, para fornecer uma contagem de sangue total precisa que explora as vantagens peculiares tanto do contador de partículas 15 quanto do analisador visual 17.
[00365] Além de fornecer resultados precisos, o aparelho que compreende um contador de partículas 15 e um analisador visual 17 oferece vantagens significativas para aprimorar a velocidade de análise. Na Figura 14, os resultados precisos da contagem de diferentes células de sangue podem ser emitidos através do visor 63. Durante um processo de análise, um operador pode interagir com o processador 18 através de um terminal 65. Anteriormente, de cerca de 25% até cerca de 30% dos resultados foram revisados manualmente através da produção de lâminas com um agente de contraste, as quais foram examinadas sob um microscópio por um operador. Em comparação, um método exemplificador com o uso dos aparelhos desta invenção compreende um CBC em um contador de partículas e categoriza e/ou subcategoriza as células de sangue de acordo com algumas modalidades. Operando-se o aparelho conforme descrito nesta revelação, as imagens podem ser revisadas no analisador visual e as amostras irão exigir uma revisão manual menos frequente.
[00366] O motor 54 pode compreender um motor de passo de engrenagem com uma precisão consideravelmente menor que os recursos de distinção imageados pelo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital, especialmente os aspectos das células de sangue. Desde que a localização do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 seja ajustada para localizar a posição da objetiva óptica na largura da corrente de amostra em formato de fita, a vista da célula/partícula na corrente de amostra em formato de fita estará em foco. O padrão de foco automático pode estar localizado em uma borda de um campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital e não interfere com a visualização por tal motivo.
[00367] Ademais, quando o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é movido ao longo da distância de deslocamento e o padrão de foco automático sai de foco, os recursos que aparecem em foco são as células de sangue em vez do padrão de foco automático. De acordo com algumas modalidades, o padrão de foco automático pode ser definido por formatos no campo de visão. Os formatos são formas discretas relativamente finas de um tamanho limitado e, portanto, após se moverem pela distância de deslocamento, as formas se tornam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizada na corrente de amostra em formato de fita. Uma distância de deslocamento típica pode ser, por exemplo, de 50 a 100 μm em uma célula de fluxo dimensionada para as aplicações de imageamento de hematologia (célula de sangue). Em algumas modalidades, o recurso de foco automático mantém o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica a 1 μm da distância de foco ideal.
[00368] O contorno interno da célula de fluxo e as taxas de fluxo de PIOAL e amostra podem ser ajustados de modo que a amostra forme uma corrente em formato de fita. A corrente pode ser aproximadamente tão fina quanto, ou até mesmo mais fina do que as partículas que estão envoltas na corrente de amostra em formato de fita. Os glóbulos brancos podem ter um diâmetro de cerca de 10 μm, por exemplo. Fornecendo- se uma corrente de amostra em formato de fita com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em formato de fita é estendida pelo fluido de revestimento ou PIOAL. Surpreendentemente, estender a corrente de amostra em formato de fita ao longo de uma trajetória de fluxo de estreitamento em camadas de PIOAL com uma viscosidade diferente da corrente de amostra em formato de fita, tal como uma viscosidade superior, tende a alinhar, vantajosamente, as partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo e a aplicar forças sobre as células, de modo a aprimorar os conteúdos em foco das estruturas intracelulares das células. O eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 é substancialmente normal (perpendicular) em relação ao plano da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita no ponto de imageamento pode ser, por exemplo, de 20 a 200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser, por exemplo, de 50 a 150 mm/segundo.
[00369] A espessura de corrente de amostra em formato de fita pode ser afetada pelas viscosidades e taxas de fluxo relativas do fluido de amostra e do PIOAL. A fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do PIOAL, por exemplo, que compreendem bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL a taxas de fluxo controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita 32, mais especificamente como uma fita fina pelo menos tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24.
[00370] Em uma modalidade, a fonte 27 do PIOAL está configurada para fornecer o PIOAL a uma viscosidade predeterminada. Tal viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra e pode ser maior que a viscosidade da amostra. A viscosidade e a densidade do PIOAL, a viscosidade do material de amostra, a taxa de fluxo do PIOAL e a taxa de fluxo do material de amostra são coordenadas para manter a corrente de amostra em formato de fita na distância de deslocamento em relação ao padrão de foco automático e com as características dimensionais predeterminadas, tal como uma espessura de corrente de amostra em formato de fita vantajosa.
[00371] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear superior à amostra e uma viscosidade superior à amostra estendendo, assim, a amostra de modo a formar uma fita achatada. A viscosidade de PIOAL pode ter até 0,01 Pa.s (10 centipoise).
[00372] Na modalidade representada na Figura 14, o mesmo processador digital 18 que é usado para analisar a imagem digital de pixel obtida a partir da matriz de fotossensor também é usado para controlar o motor de foco automático 54. Entretanto, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 não é focado automaticamente para todas as imagens capturadas. O processo de foco automático pode ser alcançado periodicamente ou, por exemplo, quando as alterações de temperatura ou outras alterações de processo são detectadas pelos sensores adequados ou quando a análise de imagem detecta uma necessidade potencial para refocalizar. É possível, ainda, em outras modalidades, ter a análise de imagem de hematologia realizada por um processador e ter um processador separado, opcionalmente associado à sua própria matriz de fotossensor, disposto para lidar com as etapas de foco automático para um alvo fixo 44.
[00373] Na Figura 14, o pelo menos um dito processador digital 18 está configurado para focar automaticamente em momentos programados ou em condições programadas ou sob demanda de usuário e, é também configurado para realizar a categorização e subcategorização com base em imagens das partículas. As partículas exemplificadoras incluem células, glóbulos brancos, hemácias e similares.
[00374] Em uma modalidade, o pelo menos um dito processador digital 18 está configurado para detectar um sinal de reinicialização de foco automático. O sinal de reinicialização de foco automático pode ser acionado através de uma alteração detectada na temperatura, uma diminuição na qualidade de foco conforme discernido pelos parâmetros da data de imagem de pixel, passagem do tempo ou entrada de usuário. Vantajosamente, não é necessário recalibrar no sentido de medição da distância de deslocamento 52 para recalibrar. Opcionalmente, o foco automático pode ser programado para recalibrar a determinadas frequências/intervalos entre ciclos para o controle de qualidade e ou para manter o foco.
[00375] A distância de deslocamento 52 varia ligeiramente de uma célula de fluxo para outra, porém, permanece constante para uma determinada célula de fluxo. Como um processo de configuração, ao encaixar um analisador de imagem com uma célula de fluxo, a distância de deslocamento é estimada primeiro e, em seguida, durante as etapas de calibração em que os aspectos de foco automático e de imageamento são exercidos, a distância de deslocamento exata para a célula de fluxo é determinada e inserida como uma constante na programação do processador 18.
[00376] Referindo-se à Figura 15, um aparelho exemplificador 10 para analisar uma amostra 12 que contém partículas inclui um contador de partículas 15 que tem pelo menos uma faixa de detecção, um analisador 17 e um processador 18, de acordo com algumas modalidades. O diagrama de blocos da Figura 15 tem o propósito de ilustração. O contador de partículas 15, o analisador 17 e o processador 18 podem estar ou não conectados um ao outro. Em algumas modalidades, o processador pode estar acoplado ao analisador e/ou contador de partículas. Em outras modalidades, o processador pode ser um componente do analisador e/ou contador de partículas.
[00377] O contador de partículas 15 compreende pelo menos uma canaleta e está configurado para fornecer uma contagem de partículas para pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas. Em algumas modalidades, um contador de partículas 15 compreende pelo menos duas canaletas para diferentes categorias e/ou subcategorias de partículas. Em algumas modalidades, as partículas são contadas através da detecção da impedância elétrica ou dispersão de luz da amostra. Um exemplo de um contador de partículas 15 adequado inclui, mas sem limitações, um citômetro de fluxo. Em algumas modalidades, a detecção pode ocorrer em cada uma de uma pluralidade de canaletas responsivas a diferentes propriedades físicas, tanto simultaneamente quanto sequencialmente.
[00378] O analisador 17 está configurado para diferenciar diferentes categorias e/ou subcategorias e membros correspondentes de cada categoria e/ou subcategoria de partículas. Os exemplos de um analisador 17 adequado incluem, mas sem limitações, um analisador visual, uma câmera digital ou qualquer outro analisador de dados de pixel que possa capturar dados de pixel e seja programado para discriminar dentre atributos representados em um arquivo de pixel. O processador 18 e o analisador 17 estão configurados para aplicar um algoritmo, tal como determinar uma razão proporcional das contagens de duas categorias ou duas subcategorias correspondentes de partículas e aplicar tal razão proporcional à contagem de partículas de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas obtidas em pelo menos uma canaleta do contador de partículas 15. Após a análise de dados, o processador 18 fornece, na saída 20, uma medida precisa da concentração de cada categoria e cada subcategoria correspondente de partículas na amostra 12.
[00379] Em algumas modalidades, na amostra 12, pelo menos uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas podem estar presentes a uma concentração fora de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas, enquanto pelo menos uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente a uma concentração em uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria das partículas. A concentração da segunda categoria e/ou subcategoria de partículas é determinada no contador de partículas 15. Uma razão proporcional da primeira categoria e/ou subcategoria para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas é determinada no analisador 17. A concentração de partículas na primeira categoria e/ou subcategoria é calculada no processador 18, pelo menos em parte, através da aplicação de tal razão proporcional à concentração da segunda categoria e/ou subcategoria de partículas.
[00380] Em algumas modalidades, uma categoria e/ou subcategoria de partículas detectada na pelo menos uma canaleta do contador de partículas 15 pode compreender pelo menos duas classes de partículas. E cada classe de partículas pode compreender uma pluralidade de subclasses. O contador de partículas 15 é configurado para detectar uma pluralidade de partículas que satisfazem um ou mais critérios de seleção, por exemplo, com base em uma faixa de tamanho predeterminada e para fornecer uma contagem de partículas da mesma. Os critérios de seleção abrangem membros de pelo menos duas classes de partículas. O analisador 17 e o processador 18 são programados para distinguir dentre os membros das pelo menos duas categorias e/ou subcategorias das partículas. Uma distribuição de cada um dos membros através de pelo menos duas categorias e/ou subcategorias é determinada no processador 18. O processador 18 usa tal distribuição para corrigir a contagem de partículas para os membros de pelo menos uma das pelo menos duas categorias e/ou subcategorias obtidas no contador de partículas 15.
[00381] Mais especificamente, o aparelho 10 pode ser usado para identificar e quantificar diferentes células de sangue incluindo RBCs, WBCs, PLTs e outras células de sangue, células fetais ou células bacterianas, partículas virais, parasitas, cistos, incluindo cistos parasíticos, cristais ou fragmentos dos mesmos ou outros fragmentos de célula em uma amostra.
[00382] A Figura 15A representa aspectos de um contador ou módulo de contagem 1500a exemplificador, de acordo com modalidades da presente invenção. Tais contadores podem operar para controlar ou executar várias funções mecânicas assim como funções de medição eletrônica e fotométrica para contagem de células de WBC, células vermelhas do sangue e PLT e medições de hemoglobina. Os contadores exemplificadores podem ser usados para preparar as amostras para a análise de CBC e para gerar medições de parâmetros de CBC através de montagens de banho de abertura (por exemplo, banho de WBC 1510a e banho de células vermelhas do sangue 1520a). De acordo com algumas modalidades, o contador 15 da Figura 15 pode ser representado pelo contador 1500a da Figura 15A. De modo similar, de acordo com algumas modalidades, o contador 15 da Figura 14 pode ser representado pelo contador 1500a da Figura 15A. De acordo com algumas modalidades, o contador 722 da Figura 16 pode ser representado pelo contador 1500a da Figura 15A.
[00383] Os elementos celulares do sangue (por exemplo, hemácias, glóbulos brancos e plaquetas) podem ser contados com o uso de métodos de impedância elétrica. Por exemplo, uma amostra de sangue total aspirada pode ser dividida em duas alíquotas e misturada com um diluente isotônico. A primeira diluição pode ser entregue ao banho de abertura de células vermelhas do sangue 1520a e a segunda pode ser entregue ao banho de abertura de WBC 1510a. Na câmara de hemácias, as hemácias e plaquetas podem ser contadas e discriminadas por impedância elétrica, à medida que as células atravessam as aberturas sensoras. Por exemplo, partículas entre 2 e 20 fL podem ser contadas como plaquetas, e as maiores que 36 fL podem ser contadas como hemácias. Para o processamento da câmara de glóbulos brancos, um reagente de lise de hemácias pode ser adicionado à alíquota de diluição de glóbulos brancos para lisar as hemácias e liberar hemoglobina, e, então, os glóbulos brancos podem ser contados pela impedância nas aberturas sensoras do banho de glóbulos brancos. Em alguns casos, os banhos podem incluir múltiplas aberturas. Assim, por exemplo, uma contagem de células sanguíneas usada em uma técnica de enumeração de células sanguínea pode ser obtida com o uso de um banho em aberturas triplas de hemácias.
[00384] Uma técnica exemplificadora de preparação de amostra de hemograma pode incluir dois processos, coleta da amostra e posicionamento da amostra. A captura de amostra pode ocorrer quando 165 uL de amostra de paciente é aspirada e direcionada para uma Válvula de Amostragem de Sangue (BSV). A BSV pode operar para direcionar volumes específicos da amostra de paciente com os reagentes de processamento para entrega aos dois banhos de abertura tripla. A amostra de paciente e os reagentes de processamento podem ser entregues ao fundo dos banhos de abertura a um ângulo que, com um design arredondado, permitem que a amostra e os reagentes misturem minuciosamente sem apresentar bolhas de mistura. A amostra pode então ser preparada para medição e análise. De acordo com algumas modalidades, no banho de WBC, 6,0 mL (± 1,0%) de diluente e 28 uL de amostra podem ser combinados com 1,08 mL (± 1,0%) de lisado de célula de DxH para uma diluição final de 1:251. De acordo com algumas modalidades, no banho de células vermelhas do sangue, 10 mL (± 1,0%) de diluente e 1,6 uL de amostra podem ser combinados para uma diluição final de 1:6250. Após a amostra de paciente e reagentes ser misturada, o vácuo e a corrente de abertura podem ser aplicados às aberturas para as medições de contagem de células e volume de célula. As contagens de hemácias e plaquetas podem também incluir a aplicação de fluxo de arraste para evitar a recirculação de células perto da abertura. Em certas modalidades, a captura de dados para os hemácias e as plaquetas pode ser de 20 segundos no máximo e para os glóbulos brancos de 10 segundos no máximo. Em certas modalidades, todos os pulsos analógicos gerados pelos conjuntos de abertura podem ser ampliados por um cartão "pré- amp" e, então, enviados a um cartão analisador condicionador de sinal de hemograma para a conversão de analógico para digital e extração de parâmetros. De acordo com algumas modalidades, um sistema pode ser usado para medir múltiplos parâmetros para cada evento celular e um processo de extração de parâmetro digital pode ser usado para fornecer medições digitais, tais como tempo, volume (atributos de pulso incluindo amplitude e largura de pulso), contagem e taxa de contagem e tempo de espera. Tais medições podem ser usadas para edição de pulso, correção de coincidência, votação de contagem, geração de histogramas para WBC, células vermelhas do sangue e PLT, votação de histograma, análise de padrão e correção de interface e similares.
[00385] A Figura 16 representa aspectos de sistemas e métodos para medir uma quantidade de um primeiro tipo de célula em uma amostra de fluido de sangue, em que a amostra inclui, ainda, um segundo tipo de célula, de acordo com modalidades da presente invenção. Conforme mostrado neste documento, o método 700 pode incluir obter um primeiro volume da amostra 720 e um segundo volume da amostra 730 a partir da amostra de fluido de sangue 710. Conforme indicado na etapa 724, o método pode incluir determinar uma população do segundo tipo de célula no primeiro volume 720 da amostra através do fluxo do primeiro volume através de um contador de célula de hematologia 722. Frequentemente, o contador de célula 722 é adequado para contar precisamente as células quando há uma quantidade suficiente de um tipo eletricamente discernível de célula na amostra e não quando a quantidade de tipos de célula excede um determinado limite ou limiar. Os contadores de células podem ser usados para contar hemácias ou a quantidade total de outros componentes (por exemplo, componentes grandes) em uma amostra sanguínea em uma pequena quantidade de tempo. Em alguns casos, os contadores de célula podem encontrar desafios ao discriminar entre glóbulos brancos e outros componentes (por exemplo, componentes grandes) no sangue, ou dos quais possam haver diversas espécies diferentes, porém, com uma quantidade relativamente pequena de cada um.
[00386] Ademais, o método 700 pode incluir capturar imagens de uma primeira quantidade das células de primeiro tipo e uma segunda quantidade dos segundos tipos de célula, conforme indicado pela etapa 732, injetando-se o segundo volume 730 da amostra em um fluido de revestimento que flui no interior de uma célula de fluxo de modo a fornecer uma corrente de amostra que tem uma espessura e uma largura maior que a espessura, em que as imagens capturadas são capturadas ao longo de uma trajetória de imagem que atravessa a espessura da corrente de amostra. Em alguns casos, a captura de imagem 732 pode ser realizada com o uso de um analisador 17, conforme representado na Figura 14 e/ou na Figura 15. Em alguns casos, os analisadores podem discriminar com eficácia entre glóbulos brancos, plaquetas gigantes e outros componentes grandes na amostra de fluido de sangue. Entretanto, podem haver desafios ao usar tais analisadores para obter uma contagem de partículas completa em uma amostra. Ademais, em alguns casos, pode não ser desejável usar o analisador para obter determinadas contagens (por exemplo, uma contagem de todas as hemácias) devido ao fato de que tais procedimentos de contagem podem, ainda, envolver realizar, também, uma caracterização das partículas, além de obter a contagem. De acordo com algumas modalidades, o analisador é usado para obter imagens para apenas uma porcentagem ou porção da amostra que é processada através do analisador.
[00387] Conforme representado na Figura 16, o método 700 pode incluir determinar uma razão da primeira quantidade do primeiro tipo de célula 734 para a segunda quantidade do segundo tipo de célula 736 com o uso das imagens capturadas conforme indicado na etapa 738. Os métodos incluem, ainda, calcular uma medida de quantidade de célula do primeiro tipo de célula na amostra com o uso da razão 738 e da população do segundo tipo de célula 724 conforme indicado na etapa 740.
[00388] De acordo com algumas modalidades, a medida de quantidade de célula calculada na etapa 740 é uma concentração de célula para o primeiro tipo de célula na amostra de fluido de sangue 710. Em alguns casos, a medida de quantidade de célula calculada na etapa 740 é uma contagem de células para o primeiro tipo de célula na amostra de fluido de sangue 710. Em alguns casos, o contador de células 722 tem uma primeira exatidão associada à contagem do primeiro tipo de célula e uma segunda exatidão associada à contagem do segundo tipo de célula, em que a segunda exatidão é superior ou maior que a primeira exatidão. Em alguns casos, (consulte, por exemplo, as Figuras 19A e 19B) o contador de célula de hematologia 722 tem uma faixa de exatidão desejada e a faixa de exatidão desejada se estende entre uma população mínima de células no primeiro volume 720 e uma população máxima de células no primeiro volume 720, em que a população do segundo tipo de célula no volume determinada na etapa 724 está na faixa de exatidão desejada e em que a medida de quantidade de célula do primeiro tipo de célula da amostra calculada na etapa 740 está fora da faixa de exatidão desejada.
[00389] Conforme representado adicionalmente na Figura 16 (e ainda com referência às Figuras 19A e 19B), os métodos podem incluir determinar, opcionalmente, uma população do primeiro tipo de célula 726 no primeiro volume da amostra como um resultado de fluir o primeiro volume através do contador de célula de hematologia 722. A população determinada do primeiro tipo de célula 726 no primeiro volume pode ser acima ou abaixo de uma faixa de exatidão desejada para o primeiro tipo de célula e pode, também, ser diferente da medida de quantidade de célula do primeiro tipo de célula conforme calculada na etapa 740. Em alguns casos, (por exemplo, a Figura 19A), a população determinada do primeiro tipo de célula 726 é zero. Em alguns casos, (por exemplo, a Figura 19B), a população determinada do primeiro tipo de célula 726 é maior que zero.
[00390] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o contador de célula de hematologia 722 pode incluir um mecanismo de sensor que detecta uma alteração na impedância elétrica em resposta a um segundo tipo célula que flui através do contador de células. De acordo com algumas modalidades, o contador de célula de hematologia 722 inclui um mecanismo de sensor que detecta uma obstrução de uma trajetória de luz em resposta a um segundo tipo célula que flui através do contador de células.
[00391] Em alguns casos, o contador de célula de hematologia 722 tem um limite de concentração detectável mínimo e um limite de concentração detectável máximo para o primeiro tipo de célula e um limite de concentração detectável mínimo e um limite de concentração detectável máximo para o segundo tipo de célula. A população determinada do segundo tipo de célula 724 pode ter por base um parâmetro de concentração detectado para o segundo tipo de célula que é acima de um limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de célula. O primeiro tipo de célula pode estar presente a uma concentração que é tanto abaixo do limite mínimo quanto acima do limite máximo para o primeiro tipo de célula.
[00392] Em alguns casos, o contador de célula de hematologia 722 tem um limite de volume detectável mínimo e um limite de volume detectável máximo para o primeiro tipo de célula e um limite de volume detectável mínimo e um limite de volume detectável máximo para o segundo tipo de célula. A população determinada do segundo tipo de célula 724 pode ter por base um parâmetro de volume detectado para o segundo tipo de célula que é acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de célula. O primeiro tipo de célula pode estar presente em um parâmetro de volume que é tanto abaixo do limite mínimo quanto acima do limite máximo para o primeiro tipo de célula.
[00393] Em alguns casos, o contador de célula de hematologia 722 tem um limite de tamanho detectável mínimo e um limite de tamanho detectável máximo para o primeiro tipo de célula e um limite de tamanho detectável mínimo e um tamanho de volume detectável máximo para o segundo tipo de célula. A população determinada do segundo tipo de célula 724 pode ter por base um parâmetro de tamanho detectável para o segundo tipo de célula que é acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de célula. O primeiro tipo de célula pode estar presente em um parâmetro de tamanho que é tanto abaixo do limite mínimo quanto acima do limite máximo para o primeiro tipo de célula.
[00394] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, (consulte as Figuras 13b e 13c), a determinação da população do segundo tipo de célula 724 no primeiro volume da amostra inclui agrupar as células do primeiro tipo de célula e as células do segundo tipo de célula. Em alguns casos, os métodos podem, ainda, incluir calcular uma medida de quantidade de célula do segundo tipo de célula na amostra com o uso da razão e da população do segundo tipo de célula. Em alguns casos (por exemplo, conforme representado na Figura 19D), a determinação da população do segundo tipo de célula 724 no primeiro volume da amostra inclui agrupar as células do primeiro tipo de célula e as células do segundo tipo de célula e determinar uma população do primeiro tipo de célula 726 no primeiro volume da amostra que tem como um resultado fluir o primeiro volume através do contador de célula de hematologia 722. A medida de quantidade de célula do primeiro tipo de célula na amostra conforme, calculada na etapa 740, pode usar a razão 738, a população do segundo tipo de célula 724 e a população do primeiro tipo de célula 726.
[00395] Em outros aspectos, por exemplo, conforme representado na Figura 17 e/ou nas Figuras 19A e 19B, um método é fornecido para analisar uma amostra que contém partículas. Em tal método, uma amostra é fornecida em um contador de partículas que tem limites de detecção, conforme indicado na etapa 72 no método 70 da Figura 17. Pelo menos uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas pode estar presente na amostra a uma concentração fora de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas e pelo menos uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro da faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. A concentração da segunda categoria e/ou subcategoria de partículas na amostra é determinada no contador de partículas, conforme indicado na etapa 74. A amostra também é fornecida em um analisador para determinar uma razão proporcional da primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas, conforme indicado na etapa 76. A concentração de partículas na primeira categoria e/ou subcategoria pode ser, então, calculada pelo menos em parte aplicando-se a razão proporcional à concentração da segunda categoria e/ou subcategoria de partículas conforme indicado na etapa 78. A Figura 19A mostra a detecção de partículas em uma amostra abaixo da faixa de detecção e a Figura 19B mostra a detecção de partículas presentes na amostra acima da faixa de detecção.
[00396] A Figura 17 ilustra, portanto, um método exemplificador 70 para determinar a concentração da primeira categoria de partículas que estão presentes em uma amostra a uma concentração fora de uma faixa de detecção em um contador de partículas, de acordo com algumas modalidades. Na etapa 72, também com referência às Figuras 15 e 17, uma amostra 12 é fornecida em um contador de partículas 15 que tem pelo menos uma faixa de detecção. A amostra 12 inclui partículas que podem ser dispersas em um fluido. Em algumas modalidades, a primeira categoria de partículas está presente na amostra a uma concentração acima de um limite superior de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria de partículas. A segunda categoria de partículas está presente na amostra em uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria de partículas. Por exemplo, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas pode incluir WBCs. A segunda categoria de partículas pode incluir plaquetas.
[00397] Em algumas modalidades, a primeira categoria de partículas está presente na amostra a uma concentração abaixo de um limite inferior de uma faixa detectável aplicável à primeira categoria de partículas. A segunda categoria de partículas está presente na amostra em uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria de partículas. Por exemplo, a primeira categoria de partículas compreende plaquetas. A segunda categoria de partículas compreende glóbulos brancos.
[00398] Na etapa 74 da Figura 17, a concentração da segunda categoria de partículas na amostra 12 é determinada no contador de partículas 15. O contador de partículas pode compreender pelo menos uma canaleta. A segunda categoria de partículas é medida em uma das canaletas em algumas modalidades. O contador de partículas pode compreender pelo menos duas canaletas em algumas modalidades. A primeira categoria de partículas pode ser contada em outra canaleta, se a concentração estiver em uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria de partículas.
[00399] Na etapa 76 da Figura 17, a amostra 12 é fornecida em um analisador, tal como um analisador visual 17 (por exemplo, conforme representado nas Figuras 14 ou 15), para determinar uma razão proporcional da primeira categoria de partículas para a segunda categoria de partículas. Em algumas modalidades, o analisador visual 17 compreende uma célula de fluxo 22 conectada a um dispositivo de imageamento conforme descrito acima. A razão proporcional da primeira categoria de partículas para a segunda categoria de partículas pode ser determinada de acordo com o método descrito neste documento. Por exemplo, pelo menos um produto químico que inclui pelo menos um dentre um diluente, um agente de permeabilização e um agente de contraste pode ser introduzido na amostra. Os produtos químicos exemplificadores, composições, agentes de contraste e composições relacionadas que podem ser usados para processar amostras de fluido de sangue são discutidos no Pedido de Patente copendente n° U.S. , cujo conteúdo encontra-se incorporado neste documento a título de referência. O agente de contraste pode ser eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam as primeiras categorias e/ou subcategorias e as segundas categorias e/ou subcategorias de partículas. A amostra preparada 12B representada na Figura 14 pode ser aplicada a pelo menos uma célula de fluxo 22 em algumas modalidades. As imagens de partículas da amostra preparada 12B são capturadas. Uma análise de imagem é realizada pelo analisador que pode ser um analisador visual 17 e/ou processador 18. Uma razão proporcional da primeira categoria de partículas para a segunda categoria de partículas é, então, determinada analisando-se a pluralidade de imagens da corrente de amostra em formato de fita.
[00400] Na etapa 78 da Figura 17, a concentração de partículas na primeira categoria pode ser, então, calculada pelo processador 18 (por exemplo, conforme representado na Figura 15), pelo menos em parte aplicando-se a razão proporcional à concentração da segunda categoria de partículas.
[00401] A presente revelação fornece, ainda, métodos para analisar uma amostra que contém partículas. A Figura 18 ilustra um método exemplificador 80 para determinar a concentração de duas subcategorias de partículas, em que tais partículas não podem ser distinguidas pelo contador de partículas de acordo com algumas modalidades. Na etapa 82, uma amostra (por exemplo, a amostra 12 da Figura 15) é fornecida em um contador de partículas (por exemplo, o contador de partículas 15 da Figura 15), que tem critérios de detecção que são satisfeitos por pelo menos duas categorias ou subcategorias de partículas, as quais deseja-se que sejam distinguidas. Os resultados do contador de partículas abrangem tais categorias ou subcategorias em uma única contagem na etapa 84 da Figura 18.
[00402] Na etapa 86, a amostra é fornecida no analisador (tal como um analisador visual) para determinar uma razão proporcional da primeira categoria ou subcategoria de partículas para a segunda categoria ou subcategoria de partículas. Em algumas modalidades, por exemplo, conforme representado nas Figuras 14 e/ou 15, um analisador visual 17 inclui uma célula de fluxo 22 conectada a um dispositivo de imageamento.
[00403] A razão proporcional da primeira categoria ou subcategoria de partículas para a segunda categoria ou subcategoria de partículas pode ser determinada de acordo com os métodos descritos neste documento. Pelo menos um produto químico que compreender pelo menos um dentre um diluente, um agente de permeabilização e um agente de contraste é introduzido na amostra. O agente de contraste é eficaz para gerar distinções visuais para a categorização e subcategorização de partículas que diferencia a primeira categoria ou subcategoria da segunda categoria ou subcategoria de partículas. Conforme representado na Figura 14, a amostra preparada 12B pode ser aplicada a pelo menos uma célula de fluxo 22 em algumas modalidades. As imagens de partículas da amostra preparada 12B são capturadas. Uma análise de imagem é realizada pelo analisador visual e/ou processador 18. Uma razão proporcional da pelo menos primeira subcategoria de partículas para a segunda subcategoria de partículas é, então, determinada analisando-se a pluralidade de imagens.
[00404] Na etapa 88 da Figura 18, a concentração de partículas na primeira categoria ou subcategoria pode ser, então, calculada pelo processador 18, conforme representado nas Figuras 14 ou 15, pelo menos em parte, aplicando-se a razão proporcional à única contagem (por exemplo, a etapa 84 da Figura 18) obtida a partir do contador de partículas.
[00405] Em algumas modalidades, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra a uma concentração acima de um limite superior de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra na faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Por exemplo, a primeira categoria de partículas compreende glóbulos brancos. A segunda categoria de partículas compreende plaquetas. Conforme ilustrado na Figura 19B, a contagem de partículas do analisador desta revelação pode ser usada para corrigir as contagens de partícula imprecisas associadas a pelo menos uma faixa de detecção usada pelo contador de partículas, tais como a concentração de partículas, volume e/ou tamanho. Operando- se o aparelho conforme descrito na presente revelação, as partículas presentes em quantidades acima do limite superior da faixa de detecção podem ser detectadas e medidas precisamente.
[00406] Em algumas modalidades, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra abaixo de um limite inferior de uma faixa detectável de alguns parâmetros, por exemplo, a concentração, aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas conforme ilustrado na Figura 19A. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra na faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Conforme ilustrado na Figura 19A, a razão proporcional de contagens de partícula nas duas categorias e/ou subcategorias do analisador desta revelação pode ser usada para corrigir contagens imprecisas do contador de partículas para pelo menos uma categoria e/ou subcategoria. Operando-se o aparelho conforme descrito na presente revelação, as partículas presentes abaixo da faixa de limite de detecção que não são detectadas pelo contador de partículas, podem ser medidas precisamente.
[00407] Conforme mostrado na Figura 19A, o contador de partículas fornece uma contagem de partículas para a categoria 2. O analisador fornece uma razão proporcional de contagens de partícula para as categorias 1 e 2. Multiplicando-se a razão proporcional pela contagem de partículas para a categoria 2, o processo chega à contagem de partículas para a categoria 1. A primeira categoria e/ou subcategoria de partículas pode compreender, por exemplo, plaquetas. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas compreendem glóbulos brancos. De acordo com algumas modalidades, os sistemas de extensões de faixa de detecção ou dinâmica e método revelados neste documento podem ser usados para obter contagens de plaquetas precisas quando a quantidade de plaquetas contidas na amostra é baixa.
[00408] Em algumas modalidades, o analisador inclui um dispositivo de imageamento e uma célula de fluxo conectados ao dispositivo de imageamento para determinar uma razão proporcional da primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Pelo menos um dentre um diluente, um agente de permeabilização, um agente de contraste é introduzido à amostra. O pelo menos um produto químico é eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam as primeira e segunda categorias e/ou subcategorias de partículas. Em uma etapa para determinar tal razão proporcional, a amostra é aplicada a pelo menos uma célula de fluxo presente em algumas modalidades. Uma pluralidade de imagens de partículas da amostra são capturadas para fornecer uma estimativa estatisticamente significativa de uma contagem ou razão proporcional. Uma razão proporcional da pelo menos primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas é, então, determinada contando-se as partículas em cada uma das primeira e segunda categorias e/ou subcategorias de partículas.
[00409] Em outro aspecto, conforme representado na Figura 18 e/ou na Figura 19D, um método 80 para analisar uma amostra que contém partículas é fornecida para corrigir a contagem de partículas obtida em um contador de partículas. Por exemplo, os resultados do analisador, por exemplo, a contagem relativa, desta revelação podem ser usados para obter contagens de partículas precisas de categorias e/ou subcategorias de partículas que não podem ser diferenciadas pelo critério ou critérios de detecção usados pelo contador de partículas sozinho.
[00410] Em uma outra modalidade mostrada na Figura 19C, o contador pode fornecer uma contagem substancialmente precisa para uma pluralidade de partículas. A pluralidade de partículas abrange membros de pelo menos duas subcategorias, porém, a contagem não faz distinção entre as subcategorias. Uma distribuição de cada um dos membros das pelo menos duas subcategorias pode ser determinada em um analisador. A distribuição das subcategorias é a razão proporcional das contagens das respectivas subcategorias para o total. Um processador é programado para distinguir os membros das pelo menos duas subcategorias. Com o uso da distribuição do analisador e da contagem total de partículas a partir do contador de partículas, por exemplo, conforme representado na Figura 19C, a contagem de partículas para os membros de pelo menos uma das pelo menos duas subcategorias pode, então, ser determinada pelo processador com o uso da distribuição de cada um dos membros.
[00411] De acordo com algumas modalidades, conforme representado na Figura 19D, a amostra pode ter duas categorias de partículas presentes. Em tal contexto, as categorias podem ser construídas de modo a incluir a possibilidade de múltiplas categorias e/ou múltiplas subcategorias. Operando-se o aparelho conforme descrito nesta revelação, pode-se realizar a correção na contagem de partículas em que pelo menos alguns dos membros de pelo menos uma categoria de partículas adicionais está categorizada ou subcategorizada incorretamente, pelo contador de partículas, como membros de uma primeira categoria de partículas. Em tal método, a contagem para uma pluralidade de partículas pode ser determinada com o uso de uma faixa predeterminada, por exemplo, tamanho e/ou faixa de volume para fornecer contagens de partícula das mesmas em um contador de partículas. A faixa predeterminada agrupa os membros de uma primeira categoria de partículas e pelo menos alguns membros de pelo menos uma segunda categoria de partículas na contagem de partículas. As partículas na uma ou mais categorias ou subcategorias que são contadas incorretamente como outra categoria de partícula em uma canaleta do aparelho podem ser medidas separadamente e precisamente com o uso do analisador configurado para distinguir uma distribuição das partículas ao longo da primeira categoria de partículas e a pelo menos uma segunda categoria de partículas na amostra. A distribuição das categorias e/ou subcategorias é a razão proporcional das contagens das respectivas categorias e/ou subcategorias para o total. O processador, em seguida, usa a distribuição para calcular a contagem de partículas para os membros da primeira categoria e a pelo menos uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em tais modalidades, conforme ilustrado na Figura 19D, o aparelho e os métodos desta revelação e da contagem de partículas em cada categoria e/ou subcategoria podem ser corrigidos.
[00412] Conforme mostrado na Figura 19D, o contador de partículas pode fornecer uma contagem total substancialmente precisa que compreende duas categorias. Tal contagem pode incluir contagens supostas para as categorias 1 e 2. Entretanto, a contagem suposta é imprecisa no sentido em que o contador de partículas classificou erroneamente pelo menos um membro da categoria 2 com a categoria 1. O analisador fornece uma distribuição de contagens de partícula com base em uma amostra menor que a usada no contador de partículas para as categorias 1 e 2, porém, o analisador produz uma distribuição precisa. O processador usa tais informações para chegar a uma contagem precisa para ambas as categorias. Esse mesmo processo pode ser usado para amostras que contêm mais de duas categorias e/ou subcategorias de partículas.
[00413] Por exemplo, os membros de diferentes categorias ou subcategorias de partículas com tamanho ou morfologia similares podem não ser precisamente categorizados ou subcategorizados pelo contador de partículas. Por exemplo, agregados de PLTs, PLT "gigantes", nódulos, múltiplas plaquetas e RBCs nucleadas podem ser contadas erroneamente como WBCs, de modo a resultar em uma contagem de WBC superior ao que, de fato, existe na amostra. Como outro exemplo, as hemácias microcíticas, fragmentos de célula, artefatos e até mesmo um ruído eletrônico podem ser contados erroneamente como plaquetas, de modo a resultar em uma contagem erroneamente alta de PLTs.
[00414] Em algumas modalidades, o analisador é um analisador visual que compreende um dispositivo de imageamento e uma célula de fluxo. Como um exemplo, pelo menos um produto químico que compreende pelo menos um dentre um diluente, um agente de permeabilização, um agente de contraste é introduzido na amostra. O pelo menos um produto químico é eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam a primeira categoria e/ou subcategoria e a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em uma etapa para determinar tal distribuição, a amostra é aplicada a pelo menos uma célula de fluxo presente em algumas modalidades.
[00415] Em uma etapa para determinar uma distribuição de cada um dos membros de pelo menos duas categorias e/ou subcategorias de partículas, pelo menos uma parte da amostra é aplicada na pelo menos uma célula de fluxo. O pelo menos um produto químico é eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam os membros das categorias e/ou subcategorias de partículas. Uma pluralidade de imageamentos de partículas da amostra é capturada. Uma pluralidade de imagens de partículas da amostra é capturada para fornecer uma estimativa estatisticamente significativa de uma contagem ou razão proporcional. Uma razão proporcional da pelo menos primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas é, então, determinada contando-se as partículas em cada uma das primeira e segunda categorias e/ou subcategorias de partículas.
[00416] Uma razão proporcional dos membros de cada uma das duas ou mais subcategorias de partículas em uma categoria e/ou subcategoria de partículas e/ou uma razão proporcional dos membros de uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para os membros de pelo menos uma outra categoria e/ou subcategoria de partículas pode ser determinada com base na pluralidade de imagens de partículas da amostra. Um valor de contagem ou de concentração para cada categoria e/ou subcategoria de partículas pode, então, ser calculado, estimado, inferido e/ou derivado. Como um exemplo, a concentração de subcategorias de partículas pode ser determinada com base na razão proporcional de cada subcategoria de partículas do analisador e a contagem da quantidade total de partículas na categoria do contador de partículas. Em algumas modalidades, os membros das pelo menos duas subcategorias compreendem pelo menos um tipo de partículas selecionadas dentre um grupo que consiste em subcategorias de glóbulos brancos, plaquetas e hemácias.
[00417] Consequentemente, em algumas modalidades, o método compreende, adicionalmente, determinar uma razão proporcional da contagem de partículas em uma categoria e/ou subcategoria de partículas presentes a uma concentração fora de uma faixa de detecção aplicável a uma categoria de partículas do contador de partículas em função da contagem de partículas em uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas que está em uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partícula com base na pluralidade de imagens de partículas da amostra a partir do analisador e/ou processador. A concentração na amostra da categoria e/ou subcategoria de partículas fora da faixa de detecção do contador de partículas pode ser, então, determinada aplicando-se a razão proporcional à contagem de partículas obtida no contador de partículas. Por exemplo, em algumas modalidades, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra a uma concentração acima de um limite superior da faixa de limite de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra na faixa de detecção do contador de partículas (abaixo de um limite superior e acima do limite inferior da faixa de detecção) aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Como outro exemplo, onde o critério ou critérios de detecção usados pelo contador de partículas categoriza erroneamente as partículas através do agrupamento de partículas de uma primeira categoria e/ou subcategoria com partículas de pelo menos uma segunda categoria e/ou subcategoria, a contagem de partículas para as primeira e segunda categorias e/ou subcategorias pode ser corrigida a partir de razões proporcionais das partículas determinadas a partir da pluralidade de imagens das partículas da amostra do analisador visual e/ou processador.
[00418] A faixa de detecção de medição pode ser limitada em um contador de partículas 15 individual na Figura 15. Por exemplo, o limite de detecção superior para WBCs pode ser menor que 100.000 a 200.000 por μL em um contador de partículas 15. O limite de detecção inferior para PLTs pode ser superior a 10.000 por μL. Com o uso do aparelho descrito neste documento, a faixa de detecção de medição eficaz pode ser estendida, por exemplo, o limite de detecção superior para WBCs pode ser estendido até cerca de 300.000, 350.000, 400.000, 410.000, 420.000, 430.000, 440.000, 450.000, 460.000, 470.000, 480.000, 490.000, 500.000, 510.000, 520.000, 530.000, 540.000, 550.000, 560.000, 570.000, 580.000, 590.000, 600.000, 610.000, 620.000, 630.000, 640.000, 650.000, 660.000, 670.000, 680.000, 690.000, 700.000, 710.000, 720.000, 730.000, 740.000, 750.000, 760.000, 770.000, 780.000, 790.000, 800.000, 810.000, 820.000, 830.000, 840.000, 850.000, 860.000, 870.000, 880.000, 890.000, 900.000, 910.000, 920.000, 930.000, 940.000, 950.000, 960.000, 970.000, 980.000, 990.000, ou 1.000.000, 1.000.000, 1.010.000, 1.020.000, 1.030.000, 1.040.000, 1.050.000, 1.060.000, 1.070.000, 1.080.000, 1.090.000, 1.100.000, 1.110.000, 1.120.000, 1.130.000, 1.140.000, 1.150.000, 1.160.000, 1.170.000, 1.180.000 ou cerca de 1.190.000 células por μL ou qualquer faixa entre quaisquer dois de tais valores em algumas modalidades. O limite de detecção inferior para PLTs pode ser estendido descendentemente até 10.000, 9.500, 9.000, 8.500, 8.000, 7.500, 7.000, 6.500, 6.000, 5.500, 5.000, 4.500, 4.000, 3.500, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500 ou 1.000 ou 500, 400, 300, 200 ou 100 células por μL em algumas modalidades.
[00419] O analisador compreende, preferencialmente, um analisador visual 17 é operável para determinar uma razão proporcional da primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em tal modalidade, a razão proporcional conforme descrito acima pode ser determinada através da análise da pluralidade de imagens de partículas na amostra obtidas no analisador visual 17.
[00420] O analisador visual 17 pode ser configurado para introduzir na amostra pelo menos um produto químico que compreende pelo menos um dentre um diluente, um agente de permeabilização e/ou um agente de contraste para gerar distinções visuais para a categorização e subcategorização de partículas. Tais distinções visuais diferenciam os membros das pelo menos duas categorias. As imagens de partículas da amostra são capturadas. O analisador visual 17 e o processador 18 são configurados para determinar uma razão proporcional de cada categoria ou subcategoria de partículas através da discriminação dentre as imagens de partículas da amostra. A concentração de cada categoria ou subcategoria de partículas é, então, calculada. Por exemplo, os resultados precisos de WBCs, PLTs e NRBCs gigantes podem ser determinados. Em um contador de partículas, devido ao tamanho ou morfologia similares, as PLTs e NRBc gigantes são contadas com o WBCs. Operando-se o aparelho conforme descrito, a contagem de partículas ou concentração de PLTs e nRBCs gigantes pode ser relatada precisamente.
[00421] Em algumas modalidades, a amostra pode compreender partículas cujo tamanho esteja fora de uma faixa de tamanho de detecção do contador de partículas 15. O analisador visual 17 e o processador 18 estão configurados para detectar as partículas e determinar uma razão proporcional das partículas fora de uma faixa de tamanho de detecção para as partículas na faixa de tamanho de detecção do contador de partículas 15, com base nas imagens de partículas da amostra. A concentração da categoria e subcategoria de partículas fora da faixa de tamanho de detecção do contador de partículas 15 pode ser, então, calculada.
[00422] De modo geral, os métodos para analisar uma amostra que contém partículas são fornecidos para corrigir a contagem de partículas obtida em um contador de partículas. Um método exemplificador pode ser usado para diferenciar diferentes categorias de partículas, inclusive as subcategorias correspondentes, que pertencem à mesma categoria e/ou subcategoria de partículas no contador de partículas 15, por exemplo, conforme representado nas Figuras 14 e 15. O método pode ser usado para corrigir as contagens de partícula obtidas no contador de partículas 15. Em algumas modalidades, por exemplo, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas compreende um ou mais tipos de células anormais de sangue, células de sangue imaturas, células de sangue em nódulos ou células de sangue dimensionadas de modo anômalo. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas compreende glóbulos brancos. Operando-se o aparelho conforme descrito neste documento, as partículas em subcategorias podem ser distinguidas pelo analisador e as contagens de categorias e/ou subcategorias de partículas obtidas a partir do contador de partículas podem ser corrigidas.
[00423] Uma amostra ou porção das mesmas é fornecida no contador de partículas 15 para detectar partículas e fornecer contagens de partículas com base em um ou mais critérios de seleção que podem abranger subcategorias de pelo menos duas categorias de partículas. Por exemplo, a categoria de WBC errônea do contador de partículas pode conter, também, uma pequena quantidade de PLTs e NRBCs gigantes. Tal categoria do contador de partículas pode compreender adicionalmente subcategorias de glóbulos brancos que não podem ser distinguidas pelo contador de partículas. Outra porção da amostra pode, ainda, ser analisada no analisador visual conforme descrito abaixo, para resolver tais categorizações errôneas e/ou subcategorizar as subcategorias de WBC não distinguidas.
[00424] A distribuição de cada uma dentre as pelo menos duas subcategorias ou categorias pode ser determinada no analisador 17 conforme representado na Figura 14. Tal distribuição pode ser apresentada em uma razão numérica, razão proporcional e/ou outra função das contagens relativas. Em algumas modalidades, tal distribuição pode ser determinada de acordo com os métodos revelados neste documento em um analisador visual 17 que compreende uma célula de fluxo 22 e um dispositivo de imageamento 24. Conforme descrito, a amostra 12A, que pode ser uma porção de uma amostra, é aplicada à pelo menos uma célula de fluxo 22. Pelo menos um produto químico que compreende pelo menos um dentre um diluente, um agente de permeabilização, um agente de contraste é introduzido na amostra 12A. O pelo menos um produto químico que compreende pelo menos um dentre um diluente, um agente de permeabilização e/ou um agente de contraste é eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam as pelo menos duas categorias de partículas e diferenciam as pelo menos duas subcategorias da pelo menos uma categoria de partículas. Uma pluralidade de imagens de partículas da amostra 12B é capturada. Uma análise de imagem é realizada no analisador visual 17 e/ou processador 18.
[00425] Em algumas modalidades, o processador 18 é programado para distinguir os membros das pelo menos duas categorias e/ou subcategorias. Uma razão proporcional da contagem de partículas em cada uma das pelo menos duas subcategorias ou categorias de partículas pode ser determinada com base na pluralidade de imagens de partículas da amostra. A contagem de partículas para as subcategorias de pelo menos uma das pelo menos duas categorias obtidas a partir do contador de partículas 15 pode, então, ser corrigida no processador 18 com o uso da distribuição de cada uma das subcategorias. A concentração de cada subcategoria de partículas pode ser calculada no processador 18 com base na razão proporcional de cada subcategoria de partículas e na contagem de partículas da categoria de partículas obtida a partir do contador de partículas.
[00426] Os métodos revelados neste documento podem ser, ainda, usados para diferenciar um ou mais tipos de partículas fora de uma faixa de detecção no contador de partículas 15, de acordo com algumas modalidades. Por exemplo, tais partículas podem ser células de sangue ou outros fragmentos que são demasiadamente grandes ou demasiadamente pequenos para serem detectados no contador de partículas 15. No analisador visual 17, uma razão proporcional das contagens de um tipo de partícula fora de uma faixa de detecção no contador de partículas para outro tipo de partícula na faixa de detecção do contador de partículas pode ser determinada com base na pluralidade de imagens das partículas da amostra. A concentração do tipo de partículas fora da faixa de detecção na amostra pode ser, então, determinada aplicando-se, pelo menos em parte, a razão proporcional à contagem de partículas obtida no contador de partículas 15.
Imagens focadas
[00427] As Figuras 20A e 20B fornecem vistas laterais de cortes transversais que ilustram aspectos de sistemas de imageamento e métodos, de acordo com modalidades da presente invenção. Com referência à Figura 20A, um sistema de análise de partícula 1400a, tal como um analisador de hematologia pode ser configurado para realizar o hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados, por exemplo, com o uso das técnicas de célula de fluxo e de fluido de revestimento viscoso, tais como os descritos nos Pedidos de Patente copendentes n° U.S. , cujos conteúdos encontram-se incorporados neste documento a título de referência. Um método exemplificador para gerar imagens de partículas em uma amostra de fluido de sangue com o uso do sistema de análise de partícula pode incluir fazer fluir um fluido de revestimento 1410a ao longo de uma trajetória de fluxo 1420a de uma célula de fluxo 1430a do sistema de análise de partícula. A trajetória de fluxo 1420a pode ser definida, pelo menos em parte, por paredes de célula de fluxo opostas 1422a, 1424a da célula de fluxo. O fluido de revestimento 1410a pode ter uma viscosidade que é diferente de uma viscosidade da amostra de fluido de sangue. O método de imageamento pode incluir, adicionalmente, injetar a amostra de fluido de sangue no fluido de revestimento fluente 1410a no interior da célula de fluxo 1430a de modo que o fluido de amostra de fluido de sangue flua em uma corrente de fluxo de amostra 1440a. A corrente de fluxo de amostra 1440a pode ter uma largura de corrente de fluxo maior que uma espessura de corrente de fluxo. A corrente de fluxo de amostra 1440a pode, ainda, fluir através de uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo e atravessar um eixo geométrico de imageamento 1450a. Na ilustração da Figura 20A, a direção de fluxo é da esquerda para a direita.
[00428] Adicionalmente, o método de imageamento pode incluir focar um dispositivo de captura de imagem 1460a através do imageamento de um alvo de imageamento 1470a que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo 1430a. Por exemplo, conforme representado neste documento, o alvo de imageamento 1470a pode ter uma posição fixa em relação a uma janela de iluminação 1480a da célula de fluxo. Em alguns casos, o alvo de imageamento 1470a pode ser embutido ou fixo sobre a janela 1480a. Os métodos podem, ainda, incluir capturar uma imagem focada das partículas do fluido de amostra (por exemplo, a partícula 1490a disposta pelo menos parcialmente na corrente de fluxo 1440a) com o dispositivo de captura de imagem 1460a. A imagem focada é adequada para a caracterização e contagem de partículas.
[00429] O dispositivo de captura de imagem 1460a pode ser focado na corrente de fluxo de amostra 1440a com o uso de uma distância de deslocamento. Por exemplo, a distância de deslocamento pode corresponder a uma distância D entre a corrente de fluxo de amostra 1440a e o alvo de imageamento 1470a. A diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento 1410a e a amostra de fluido de sangue, em combinação com a diminuição no tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para realizar o hidrofoco do fluido de amostra na corrente de fluxo de amostra 1440a no eixo geométrico de imageamento 1450a enquanto mantém a viabilidade de células na amostra de fluido de sangue. Por exemplo, um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento 1410a e a corrente de fluido de amostra 1440a associada à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento 1410a e a corrente de fluido de amostra 1440a associada à redução no tamanho da trajetória de fluxo, pode ser eficaz para fornecer um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte das partículas de amostra fluida no eixo geométrico de imageamento 1450a enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento 1410a mantém a viabilidade de células na corrente de fluido de amostra 1440a, de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem a partir da corrente de fluido de amostra 1440a para o fluido de revestimento fluente 1410a.
[00430] Conforme o dispositivo de captura de imagem 1460a é focado na corrente de fluxo de amostra 1440a com o uso da distância de deslocamento, o dispositivo de captura de imagem 1460a pode obter imagens de partículas ou células na corrente de fluxo de amostra 1440a no eixo geométrico de imageamento 1450a ou em um local de captura de imagem associado ao eixo geométrico de imageamento 1450a. Em alguns casos, as partículas podem ser iluminadas com uma fonte de iluminação ou lâmpada 1426a. As imagens da corrente de fluxo de amostra 1440a podem ser obtidas conforme as partículas atingem o eixo geométrico de imageamento 1450a, conforme as partículas atravessam o eixo geométrico de imageamento 1450a e/ou conforme as partículas fluem na direção contrária ao eixo geométrico de imageamento 1450a.
[00431] A Figura 20B representa aspectos de uma configuração de célula de fluxo alternativa, em que o alvo de imageamento 1470b tem uma posição fixa em relação a uma janela de porta de visualização 1482b da célula de fluxo 1430b. Por exemplo, o alvo de imageamento 1470b pode estar embutido ou fixo sobre a janela 1482b. Conforme mostrado neste documento, o método de imageamento pode incluir focar um dispositivo de captura de imagem 1460b através do imageamento de um alvo de imageamento 1470b que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo 1430b. Ademais, o dispositivo de captura de imagem 1460b pode ser focado na corrente de fluxo de amostra 1440b com o uso de uma distância de deslocamento. Por exemplo, a distância de deslocamento pode corresponder a uma distância D entre a corrente de fluxo de amostra 1440b e o alvo de imageamento 1470b.
[00432] A Figura 20C representa uma vista de extremidade de corte transversal de uma célula de fluxo 1430c que ilustra vários locais de colocação alternativos para um alvo de foco automático ou alvo de imageamento. Por exemplo, um alvo de imageamento 1472c pode estar localizado em uma janela de porta de visualização 1482c da célula de fluxo 1430c. Opcionalmente, um alvo de imageamento 1474c pode estar localizado em uma janela de iluminação 1480c da célula de fluxo 1430c. Ademais, opcionalmente, um alvo de imageamento 1476c pode estar localizado em uma parede lateral de célula de fluxo (por exemplo, 1432c e/ou 1434c). O dispositivo de captura de imagem 1460c pode ser focado em uma corrente de fluxo de amostra 1440c que é envolta em um fluido de revestimento 1410c com o uso da distância de deslocamento. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D1 ao longo do eixo geométrico de imageamento 1450c entre a corrente de fluxo de amostra 1440c (ou um plano central 1441c definido pela corrente de fluxo 1440c) e o alvo de imageamento da janela da porta de visualização 1472c. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D2 ao longo do eixo geométrico de imageamento entre a corrente de fluxo de amostra 1440a (ou o plano central 1441c) e o alvo de imageamento da janela de iluminação 1476c. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D3 ao longo do eixo geométrico de imageamento entre a corrente de fluxo de amostra 1440a (ou o plano central 1441c) e o alvo de imageamento da parede lateral da célula de fluxo 1474c. Em alguns casos, a distância D3 tem um valor maior que zero. Em alguns casos, a distância D3 tem um valor de zero; Ou seja, onde a corrente de fluxo de amostra 1440a (ou o plano central 1441c) é coplanar em relação ao alvo de imageamento 1474c. Em alguns casos, é possível definir uma distância de deslocamento que não é calculada com base na distância D1, na distância D2 ou na distância D3. Por exemplo, uma distância de deslocamento pode ser um número ou valor predeterminado que é fornecido por um fabricante de célula de fluxo ou analisador de hematologia.
[00433] De acordo com algumas modalidades, a corrente de fluxo de amostra 1440c pode ter uma espessura T1 no eixo geométrico de imageamento em uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Em alguns casos, a trajetória de fluxo ou o fluido de revestimento 1410c pode ter uma espessura T2 de cerca de 150 μm no eixo geométrico de imageamento. Conforme mostrado neste documento, um alvo de imageamento 1472c pode estar localizado em uma janela de porta de visualização 1482c disposta entre a corrente de fluxo de amostra 1440c e o dispositivo de captura de imagem 1460c. Em alguns casos, um alvo de imageamento (por exemplo, 1474c) pode estar localizado entre uma janela de iluminação 1480c e uma janela de porta de visualização 1482c. Conforme discutido em outra parte deste documento, o processo de captura de uma imagem focada pode incluir ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem 1460c e a célula de fluxo 1430c com o uso da distância de deslocamento. Em alguns casos, conforme discutido em outra parte deste documento, o processo de capturar uma imagem focada pode incluir ajustar uma distância focal do dispositivo de captura de imagem 1460c com o uso da distância de deslocamento. Em alguns casos, o processo de capturar uma imagem focada pode incluir ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem 1460c e a célula de fluxo 1430c e o processo de ajustar a distância inclui mover a célula de fluxo 1430c, por exemplo, para uma posição mais próxima do dispositivo de captura de imagem 1460c ou para uma posição mais distante do dispositivo de captura de imagem 1460c.
[00434] Conforme representado na Figura 20D, uma primeira distância focal do dispositivo de captura de imagem 1460d pode corresponder a uma distância D1 (por exemplo, ao longo do eixo geométrico de imageamento 1450d) entre o dispositivo de captura de imagem 1460d e o alvo de imageamento 1470d e uma segunda distância focal do dispositivo de captura de imagem 1460d pode corresponder a uma distância D2 (por exemplo, ao longo do eixo geométrico de imageamento 1450d) entre o dispositivo de captura de imagem 1460d e a corrente de fluxo de amostra 1440d (ou um plano central definido pela corrente de fluxo de amostra). Em alguns casos, o alvo de imageamento pode estar localizado em outro local na célula de fluxo, por exemplo, conforme representado na Figura 20C. De acordo com algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a uma diferença de distância entre a primeira distância focal (ou distância D1) e a segunda distância focal (ou distância D2). O dispositivo de captura de imagem 1460d pode ser focalizado na corrente de fluxo de amostra 1440d com o uso de tal distância de deslocamento (por exemplo, a diferença entre D1 e D2).
[00435] A Figura 21 representa uma vista em elevação que mostra as modalidades de um padrão de foco automático (ou alvo de imageamento) que, por exemplo, pode estar localizado em janelas ou orifícios de iluminação, em uma janela ou portal de visualização ou em outro local da célula de fluxo. O alvo pode desvanecer conforme a distância ou posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é movida em relação à corrente de amostra em formato de fita. Conforme representado nas Figuras 9 a 12B, um alvo de foco (padrão de foco automático) ou imageamento pode estar situado na periferia da área de visualização em que a amostra deve surgir. Novamente com referência à Figura 21, pode-se perceber que também é possível que o alvo de foco pode ser definido por formatos contrastantes que estão situados no campo de visão.
[00436] Quando o dispositivo de imageamento está em foco no padrão de foco automático (alvo) (painel B na Figura 21), os formatos, conforme imageados pelo dispositivo, são bem definidos e podem ser usados para o foco automático, conforme descrito neste documento, mais especificamente para buscar a distância entre o alvo e o dispositivo de imageamento em que os formatos produzem o maior contraste na amplitude entre pixels adjacentes localizados ao longo de linhas que cruzam sobre os formatos, tais como as linhas mostradas como pontas de setas. A configuração de foco representada no painel B corresponde a uma configuração de foco análoga representada na Figura 22A. Conforme ilustrado na Figura 22A, o plano focal do dispositivo de captura de imagem é alinhado com o alvo de foco automático e, por esse motivo, o dispositivo de captura de imagem está em uma posição para obter imagens nítidas do alvo de foco automático.
[00437] Novamente com referência à Figura 21, quando o local de trabalho (por exemplo, plano focal de dispositivo de imageamento) é movido na direção contrária ao padrão de foco automático (mostrado nos painéis A e C, mostrados na esquerda e direita do padrão de foco automático na Figura 21), por exemplo, ajustando-se a distância de trabalho da objetiva ou a distância entre a objetiva e seu plano focal, os formatos do alvo de foco, então, saem de foco, e na posição em que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é focalizado na corrente de amostra em formato de fita, os formatos de alvo de foco não são mais discerníveis (consulte o painel D na Figura 21). A configuração de foco representada no painel D pode corresponder a uma configuração análoga de foco representada na Figura 22B. Conforme ilustrado na Figura 22B, o plano focal do dispositivo de captura de imagem é alinhado com a corrente de fluido de amostra e, por esse motivo, o dispositivo de captura de imagem está na posição para obter imagens nítidas de partículas na corrente de fluxo de amostra. O plano focal da Figura 22A é separado do plano focal da Figura 22B por uma distância D. Conforme mostrado na Figura 22B, movendo-se o dispositivo de captura de imagem uma distância D, é possível mover, também, o plano focal por uma distância D e, portanto, mover o plano focal do alvo de foco automático para a corrente de fluxo de amostra. Em alguns casos, o plano focal pode ser movido do alvo de foco automático para a corrente de fluxo de amostra ajustando-se internamente a distância focal do dispositivo de captura de imagem enquanto mantém-se o dispositivo de captura de imagem em uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Em alguns casos, o plano focal pode ser movido do alvo de foco automático para a corrente de fluxo de amostra ajustando-se internamente a distância focal do dispositivo de captura de imagem em combinação com o ajuste da posição do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Os formatos de foco automático podem ser fornecidos em qualquer local que esteja à vista e esteja fixo em relação à célula de fluxo, tal como na abertura de iluminação ou janela ou na parte frontal ou traseira da porta de visualização ou janela através da qual o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é direcionado ou em um acessório fixado à fotocélula para reter um alvo na posição para ser imageado.
[00438] De acordo com algumas modalidades, quando o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é movido ao longo da distância de deslocamento e o padrão de foco automático sai de foco, os recursos que aparecem em foco são as células de sangue em vez do padrão de foco automático. Na modalidade da Figura 21, o padrão de foco automático é definido por formatos no campo de visão. Os formatos são formas discretas relativamente finas de um tamanho limitado e, portanto, após se moverem pela distância de deslocamento, as formas se tornam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizada na corrente de amostra em formato de fita. Uma distância de deslocamento típica pode ser, por exemplo, de 50 a 100 μm em uma célula de fluxo dimensionada para as aplicações de imageamento de hematologia (célula de sangue). Em algumas modalidades, o recurso de foco automático mantém o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica a 1 μm da distância de foco ideal.
[00439] Consequentemente, os recursos descritos na Figura 21 fornecem uma técnica exemplificadora para determinar uma distância de deslocamento. Por exemplo, um método para determinar uma distância de deslocamento pode incluir um processo de foco automático que envolve injetar uma amostra fluida de teste em um fluido de revestimento para formar uma corrente de fluxo de amostra de teste em uma célula de fluxo e obter uma primeira imagem focada do alvo de imageamento com o uso de um dispositivo de captura de imagem. A primeira imagem focada pode corresponder ao painel B na Figura 21, onde o alvo de imageamento focado e o dispositivo de captura de imagem definem uma primeira distância focal. Conforme representado neste documento, o plano focal ou a distância de trabalho/localização do dispositivo de captura de imagem está posicionada no alvo de imageamento. O processo de foco automático pode incluir, ainda, obter uma segunda imagem focada da corrente de fluxo de amostra de teste com o uso do dispositivo de captura de imagem. A segunda imagem focada pode corresponder ao painel D na Figura 21, onde a corrente de fluxo de amostra de teste focada e o dispositivo de captura de imagem definem uma segunda distância focal. Conforme representado neste documento, o plano focal ou a distância de trabalho/localização do dispositivo de captura de imagem está posicionada no alvo de imageamento. Os processos de foco automático podem incluir, adicionalmente, obter a distância de deslocamento através do cálculo de uma diferença entre a primeira distância focal e a segunda distância focal. Em alguns casos, a amostra fluida de teste é igual à amostra de fluido de sangue e a corrente de fluxo de amostra de teste é igual à corrente de fluxo de amostra. Em alguns casos, o processo de foco automático estabelece um plano focal associado ao dispositivo de captura de imagem e o plano focal permanece estacionário em relação ao dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o processo de foco automático do dispositivo de captura de imagem inclui determinar uma posição de foco ideal dentre uma pluralidade de posições de foco.
[00440] De acordo com algumas modalidades, o dispositivo de captura de imagem pode estar focalizado na corrente de fluxo de amostra sem o uso de dados de temperatura. Por exemplo, um processo de focalização do dispositivo de captura de imagem na corrente de fluxo de amostra pode ser realizado independentemente de uma temperatura do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, um alvo de imageamento pode incluir uma escala (por exemplo, conforme representado na Figura 12B) para usar no posicionamento do eixo geométrico de imageamento do dispositivo de captura de imagem em relação à corrente de fluxo de amostra. Em alguns casos, o alvo de imageamento pode incluir uma íris alinhada em relação ao eixo geométrico de imageamento, de modo que as partículas imageadas estejam dispostas em uma abertura definida pela íris e uma ou mais porções de borda da íris sejam imageadas durante o foco automático.
[00441] Nas modalidades exemplificadoras, as técnicas de foco automático podem posicionar a célula de fluxo a ± 1 μm em relação à posição de foco ideal da corrente de amostra. Em alguns casos, as modalidades abrangem técnicas de foco automático que podem focar automaticamente o sistema de imageamento sem a necessidade de um líquido ou solução de foco separada ou nenhuma intervenção de usuário. As técnicas de foco automático exemplificadoras podem, ainda, ser consideradas como causas mecânicas de desempenho de focalização sub-ideal, tal como deslize ou expansão térmica que pode gerar flutuações na distância entre a objetiva de dispositivo de imageamento e a célula de fluxo. Em alguns casos, observou-se que a localização do fluxo de amostra na célula de fluxo pode ser muito estável e independente de temperatura. Por esse motivo, as técnicas de imageamento exemplificadoras podem envolver focar em um alvo de imageamento na célula de fluxo e usar um desvio fixo para alcançar o foco ideal na corrente de amostra.
[00442] De acordo com algumas modalidades, a objetiva de microscópio que é usada em um sistema de imageamento tem uma abertura numérica de 0,75, que resulta em uma profundidade de campo teórica (DoF) de ± 0,5 μm. Em determinados testes experimentais, observou-se que uma boa qualidade de imagem pode ser obtida s ± 1,25 μm do ponto focal ideal. Observa-se, ainda, que uma profundidade de campo prática ou experimental pode ser diferente da profundidade de campo teórica. Por exemplo, em determinados testes experimentais observou-se que a profundidade de campo foi de cerca de 2,5 a 3 μm. Com base em determinados estudos experimentais, foi determinado que o desempenho de foco automático para posicionar a célula de fluxo a ± 1,25 μm pode garantir uma boa qualidade de imagem. Em algumas modalidades, um sistema de foco automático pode operar para posicionar a célula de fluxo a ± 1 μm em relação a uma posição de foco ideal da corrente de amostra. Em determinados testes experimentais, foi observado que as técnicas de foco automático, conforme reveladas neste documento, podem localizar repetidamente um alvo em uma célula de fluxo com um desvio padrão menor que 0,3 μm. Em alguns casos, os ciclos de teste de sistema de foco automático demonstraram uma excelente repetitividade (desvio padrão < 0,23 μm) e puderam determinar a posição de foco da corrente de amostra a <0,6 μm em relação a uma posição métrica otimizada que está em uma tolerância de posição de ± 1 μm. Os ciclos de teste de foco automático adicionais em uma variedade de condições de temperatura exibiram, também, um excelente desempenho de posicionamento (por exemplo, posicionamento de célula de fluxo em uma tolerância exigida de ± 1 μm e posição de foco ideal). Esse grau de exatidão em um sistema de analisador automatizado é bem adequado para se obter imagens de alta qualidade de partículas consistentemente e confiavelmente a partir de uma amostra de fluido de sangue que flui em uma corrente de fluxo em fita fina, conforme revelado em outra parte deste documento, ao longo de uma faixa de temperatura operacional que corresponde às condições normais de laboratório.
[00443] A Figura 23 representa aspectos de métodos de processamento de amostra 2300, de acordo com modalidades da presente invenção. Conforme mostrado neste documento, os métodos de processamento de amostra podem incluir aspirar uma amostra para dentro de uma válvula de cisalhamento, conforme indicado pela etapa 2305. Essa etapa pode ser realizada através de um módulo de CBC. Os métodos podem, ainda, incluir dispensar amostra e reagente em uma câmara de reação conforme representado na etapa 2310. Essa etapa pode ser realizada através de um módulo de CBC e um primeiro sistema de fluidos (por exemplo, Fluidos BBL1). Ademais, os métodos podem incluir incubar a mistura de reação durante uma duração de tempo desejada a uma temperatura desejada (por exemplo, durante 40 segundos a 47,5 °C), conforme indicado pela etapa 2315. Os métodos podem, ainda, incluir dispensar um reagente de arrefecimento brusco na câmara de reação conforme indicado pela etapa 2320, aspirar a mistura de reação para o interior da seção de preparação de imageamento conforme indicado pela etapa 2325 e submeter ao cisalhamento as interfaces de ar/líquido e impulsionar a amostra para o interior da célula de fluxo conforme indicado pela etapa 2330. De acordo com algumas modalidades, as etapas 2315, 2320, 2325 e 2330 podem ser realizadas por um sistema de fluidos (por exemplo, Fluidos BBL). De acordo com algumas modalidades, os métodos podem incluir coletar imagens, conforme indicado na etapa 2335. Por exemplo, um processo de coleta de imageamento pode incluir coletar de 5.000 a 7.000 quadros e as imagens podem ser armazenadas em um arquivo de vídeo. Em alguns casos, a etapa 2335 pode ser realizada por um sistema de vídeo (por exemplo, Vídeo BBL). Além disso, os métodos podem incluir realizar uma extração de emplastro para cada quadro, de modo a gerar uma coleção de imagens conforme indicado pela etapa 2340, gerar um diferencial de 5 partes ou outro arquivo de resultado de diagnóstico conforme indicado pela etapa 2345 e classificar cada emplastro/célula, conforme indicado pela etapa 2350. Em alguns casos, as etapas 2340, 2345 e 2350 podem ser realizadas com processamento offline com o uso de um software de hematologia de reconhecimento de partícula automatizado (APR).
[00444] O PIOAL tem uma viscosidade e densidade adequadas e as taxas de fluxo no ponto de introdução na célula de fluxo da amostra são de tal modo que o fluido de amostra é achatado em uma fita fina. A corrente de amostra em formato de fita é transportada juntamente com o PIOAL para passar na frente de uma porta de visualização em que uma lente objetiva e uma fonte de luz estão dispostas para permitir a visualização da corrente de amostra em formato de fita. O fluido de amostra é introduzido, por exemplo, injetado em um ponto em que a trajetória de fluxo do PIOAL se estreita simetricamente. Como um resultado, a corrente de fluido de amostra é achatada e estendida em um formato de fita fina. Um PIOAL desta revelação pode ser usado como o fluido de revestimento com qualquer analisador visual desta revelação. Em uma modalidade, o PIOAL pode ser introduzido em uma extremidade da célula de fluxo para transportar o fluido de amostra em direção à descarga.
[00445] A dimensão da corrente de amostra em formato de fita na zona de visualização é afetada pelo adelgaçamento geométrico da trajetória de fluxo de PIOAL e velocidade diferencial linear do fluido de amostra e PIOAL, o que resulta no adelgaçamento e estiramento da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear diferencial inicial da amostra para o PIOAL pode variar na faixa de 0,5:1 a 5:1. O corte transversal da trajetória de fluxo de PIOAL pode ser afinado reduzindo-se a profundidade por um fator de cerca de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 ou 200:1. Em uma modalidade, o adelgaçamento geométrico é de 40:1. Em uma modalidade, o adelgaçamento geométrico é de 30:1. Os fatores considerados são o tempo de trânsito através da célula de fluxo, a taxa desejada de rendimento de amostra, alcançar uma espessura de corrente de amostra em formato de fita comparável com o tamanho de partícula, obter o alinhamento das partículas e organelas, alcançar a focalização do conteúdo das partículas, equilibrar a pressão, fluxo e viscosidade em limites operacionais, otimizar a espessura de corrente de amostra em formato de fita, obter uma velocidade linear desejada, considerações de capacidade de fabricação e volumes de amostra e PIOAL necessários.
[00446] O comprimento e volume da cânula e o achatamento do corte transversal podem ser selecionados para reduzir o período de instabilidade de fluxo de amostra aumentando, assim, o rendimento. Em algumas modalidades, o período da instabilidade de fluxo pode ser menos que cerca de 3, 2,75, 2,5, 2,25, 2, 1,75, 1,5, 1,25 ou menos que cerca de 1 segundo. Um volume menor de cânula também pode reduzir o tempo e volume de diluente necessário para limpar a cânula entre ciclos de amostra. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito através da célula de fluxo é de 1, 2, 3 ou 4 segundos ou qualquer faixa entre quaisquer dois de tais tempos. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito pode ser menor que 4, 3 ou 2 segundos.
[00447] As viscosidades e as taxas de fluxo do fluido de amostra e o PIOAL e o contorno da célula de fluxo estão dispostos de modo que o fluxo de PIOAL achate e estenda o fluxo de amostra em uma fita achatada consistentemente ao longo da zona de visualização em uma localização confiável que corresponde a um local de captura de imagem. A corrente de fluido de amostra pode ser comprimida a aproximadamente 2 a 3 μm na espessura de fluxo de fluido. Diversos tipos de célula de sangue têm diâmetros maiores que a espessura de corrente. As forças de cisalhamento na direção paralela à direção do fluxo causam um aumento de uma projeção de imagem das partículas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e/ou fazem com que as estruturas intrapartícula, por exemplo, estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos, sejam posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas para que sejam substancialmente paralelas à direção de fluxo. A profundidade de campo de dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é de até 7 μm, por exemplo, 1 a 4 μm.
[00448] O corte transversal de fluxo do PIOAL, com a corrente de amostra em formato de fita transportada em conjunto, é constante ao longo da zona de visualização na frente de uma porta de visualização através da qual a lente objetiva é direcionada. A lente objetiva pode ser o componente objetivo de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital. A corrente de amostra em formato de fita segue uma trajetória através da zona de visualização em uma posição conhecida e repetível no interior da célula de fluxo, por exemplo, a uma distância conhecida e repetível de duas paredes da célula de fluxo, de modo a ser descarregada a jusante.
[00449] As informações ópticas das partículas na amostra são detectadas por uma seção de detecção no analisador, quando a corrente de amostra em formato de fita é transportada através da zona de visualização na frente da porta de visualização gerando, assim, dados das partículas/células contidas na amostra. O uso de tal analisador permite a captura, processamento, categorização e subcategorização e contagem de células e/ou partículas contidas nas amostras. O líquido PIOAL pode ser preparado através da adição de agente de modificação de viscosidade, agente tampão, agente de ajuste de pH, agente antimicrobiano, modificador de força iônica, tensoativo e/ou um agente quelante. Os componentes e/ou recursos funcionais exemplificadores do analisador na presente revelação podem incluir, por exemplo, a capacidade para adquirir e/ou processar dados de análise de imagem, processamento de coloração de amostra, processamento de imagem e/ou identificação de imagem de partícula, contagem e/ou categorização e subcategorização de partículas.
[00450] Em uma modalidade, esta revelação teve por base a surpreendente e inesperada constatação de que a adição de uma quantidade adequada de um agente de viscosidade no PIOAL aprimora significativamente o alinhamento de partícula/células em uma célula de fluxo, de modo a levar a uma porcentagem mais alta de células alinhadas ou componentes celulares em foco e imagens de alta qualidade de células e/ou partículas em fluxo. Um diferencial de viscosidade em combinação com um efeito de focalização geométrica de uma zona de transição de estreitamento pode alcançar um alinhamento e resultados de foco aprimorados. A adição do agente de viscosidade aumenta as forças de cisalhamento sobre as células como as RBCs, o que aprimora o alinhamento das células em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo, o que resulta na otimização de imagem. Isso resulta, ainda, no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas intrapartículas, tais como estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos substancialmente paralelos em relação à direção de fluxo, o que resulta na otimização de imagem. O agente de viscosidade reduz, ainda, o desalinhamento de células, de modo geral, mas não limitado às células que têm um diâmetro menor que a corrente de fluxo.
[00451] O alinhamento das células que têm um diâmetro menor que a corrente de fluxo, por exemplo, as hemácias, pode ser obtido através, por exemplo, do aumento da viscosidade do PIOAL ou através do aumento da razão de velocidade de fluxo. Isso resulta no alinhamento das RBCs paralelas em relação à direção do fluxo e ao plano focal FP (por exemplo, conforme representado na Figura 4K). Em algumas modalidades, uma redução no alinhamento de células vermelhas do sangue e/ou aumento no alinhamento de células vermelhas do sangue são alcançados mediante o aumento de viscosidade do PIOAL.
[00452] A espessura de corrente de amostra em formato de fita pode ser afetada pelas viscosidades e taxas de fluxo relativas do fluido de amostra e do PIOAL. A fonte da amostra e/ou a fonte do PIOAL, por exemplo, que compreendem bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL a taxas de fluxo controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita, mais especificamente como uma fita fina pelo menos tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital.
[00453] O corte transversal de fluxo do PIOAL, com a corrente de amostra em formato de fita transportada, é constante ao longo de uma zona de visualização na frente de uma porta de visualização através da qual o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é direcionado. A corrente de amostra em formato de fita segue uma trajetória através da zona de visualização a uma distância conhecida e repetível das paredes tanto dianteira quanto traseira da célula de fluxo, ao ser descarregada a jusante das mesmas.
[00454] A presente revelação fornece uma técnica para alcançar automaticamente uma posição de trabalho correta do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para focalizar na corrente de amostra em formato de fita. A estrutura de célula de fluxo é configurada de modo que a corrente de amostra em formato de fita tem um local fixo e repetível entre as paredes da célula de fluxo que definem a trajetória de fluxo do fluido de amostra, em uma fita fina entre camadas de PIOAL, que passa através de uma zona de visualização na célula de fluxo. Nas modalidades de célula de fluxo reveladas, por exemplo, nas Figuras 1 a 4G, o corte transversal da trajetória de fluxo para o PIOAL pode se estreitar simetricamente em uma zona de transição e uma amostra pode ser inserida através de um orifício achatado, tal como um tubo com um lúmen retangular no orifício. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área em corte transversal em uma razão de 20:1 a 40:1) e também devido a uma velocidade linear opcionalmente maior do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, cooperam para achatar o corte transversal de amostra em uma razão de cerca de 20:1 a 70:1. De acordo com algumas modalidades, a razão pode ser em uma faixa de 10:1 a 100:1, em uma faixa de 50:1 a 100:1, em uma faixa de 70:1 a 80:1. De acordo com algumas modalidades, a razão é de 75:1. Eficazmente, devido à combinação da taxa de fluxo, viscosidade e geometria, a amostra forma uma fita fina. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área em corte transversal em uma razão de 40:1 ou em uma razão entre 20:1 a 70:1) e uma diferença na velocidade linear do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, cooperam para comprimir o corte transversal de amostra em uma razão de cerca de 20:1 a 70:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura de corte transversal pode ser 40:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura de corte transversal pode ser 30:1.
[00455] Como um resultado, as variações de processo, tais como as velocidades lineares específicas da amostra e do PIOAL não tendem a deslocar a corrente de amostra em formato de fita de sua localização no fluxo. Em relação à estrutura da célula de fluxo, a localização da corrente de amostra em formato de fita é estável e repetível.
[00456] Em outro aspecto, esta invenção se refere a um kit que compreende as composições de agente de contraste de partícula desta invenção. O kit pode conter, também, instruções sobre o uso da composição de agente de contraste de partícula, de acordo com qualquer um dos métodos descritos neste documento. O kit pode incluir, ainda, um líquido de alinhamento de organela e/ou partícula intracelular (PIOAL). O kit pode conter, também, um meio de armazenamento programável e software relacionado para a identificação de partículas com base em imagem, tais como neutrófilos, linfócitos, monócito, eosinófilos, basófilos, plaquetas, reticulócitos, RBCs nucleadas, blástulas, promielócitos, mielócitos, metamielócitos, bactérias, fungos, protistas, protozoários ou parasitas. O kit pode compreender também um ou mais tampões, que podem incluir tampões isotônicos e/ou diluentes. O kit e ou tampão pode compreender adicionalmente um tensoativo, um agente de ajuste de pH e/ou um agente antimicrobiano. Em outras modalidades, o kit pode compreender também uma solução de limpeza ou purgação. O kit pode compreender, também, padrões para os controles positivo e negativo. Em algumas modalidades, o padrão pode compreender um reagente de célula com coloração padrão. O kit pode compreender também materiais descartáveis, tais como micropipetas, pontas ou tubos descartáveis para transferir os componentes do kit. O kit pode conter qualquer um ou qualquer combinação de dois ou mais de tais componentes de kit.
[00457] A discriminação de células de sangue em uma amostra sanguínea é uma aplicação exemplificadora para a qual as modalidades da presente invenção são particularmente bem adequadas. A amostra é preparada através de técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica como uma corrente de amostra em formato de fita fina para ser imageada periodicamente, enquanto a corrente de amostra em formato de fita flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (tais como células de sangue) podem ser distinguidas umas da outras, categorizadas, subcategorizadas e contadas com o uso de técnicas de processamento programado de dados de imagem de pixel, tanto exclusivamente de modo automático quanto com assistência humana limitada para identificar e contar as células ou partículas. Além das imagens de célula, que podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de recursos não comuns ou críticos de partículas, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria específicas da célula ou partícula distinguida nas imagens de amostra registradas.
[00458] As contagens das partículas diferentes encontradas em cada imagem podem ser processadas adicionalmente, por exemplo, usadas para acumular razões estatisticamente significativas e precisas de células de cada categoria e/ou subcategoria distinguida na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual pode ser diluída, porém, as proporções das células em cada categoria e/ou subcategoria são representadas na amostra diluída, especificamente após diversas imagens serem processadas.
[00459] O aparelho, composições e métodos revelados neste documento são úteis para discriminar e quantificar células em amostras com base em distinções visuais. A amostra pode ser uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra fluida corporal que compreende glóbulos brancos, incluindo, sem limitação, sangue, soro, medula óssea, fluido de lavagem, efusões, exsudatos, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal e fluido amniótico. Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, por exemplo, uma amostra de biópsia que foi tratada para produzir uma suspensão celular. A amostra pode, também, ser uma suspensão obtida a partir do tratamento de uma amostra fecal. Uma amostra pode, ainda, ser uma amostra de laboratório ou de linha de produção que compreende partículas, tais como uma amostra de cultura celular. O termo amostra pode ser usado para se referir a uma amostra obtida a partir de um paciente ou laboratório ou qualquer fração, porção ou alíquota dos mesmos. A amostra pode ser diluída, dividida em porções ou colorida em alguns processos.
[00460] Em um aspecto, os sistemas, as composições e métodos desta revelação fornecem imagens de qualidade surpreendentemente alta de células em um fluxo. Em um aspecto, o analisador visual pode ser usado em métodos desta revelação para fornecer uma contagem diferencial de WBC com base em imagem automatizada. Em certas modalidades, os métodos desta revelação se referem à identificação automatizada de distinções visuais, incluindo recursos morfológicos e/ou anomalias para determinar, diagnosticar, prognosticar, prever e/ou sustentar um diagnóstico para determinar se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, afecção, anomalia e/ou infecção e/ou ser responsivo ou não responsivo ao tratamento. O sistema pode compreender adicionalmente o contador de partículas em algumas modalidades. As aplicações incluem categorizar e/ou subcategorizar e contar células em uma amostra fluida, tal como uma amostra sanguínea. Outros usos similares para contar tipos adicionais de partículas e/ou partículas em outras amostras de fluido também são previstos. O sistema, composições e métodos desta invenção podem ser usados para categorização e subcategorização em tempo real e visualização de imagens com o uso de qualquer algoritmo automatizado de reconhecimento de partícula adequado. As imagens capturadas para cada amostra podem ser armazenadas para serem visualizadas em uma date posterior.
[00461] Em outro aspecto, o aparelho, composições e métodos desta invenção fornecem categorização e subcategorização e sinalização de célula com base em imagem supreendentemente mais precisas, o que reduz a taxa de revisão manual em comparação com a taxa de revisão manual ao usar os analisadores automatizados atuais. Os sistemas, composições e métodos reduzem a taxa de revisão manual e permitem que a revisão manual seja realizada no instrumento. Além disso, os sistemas, composições e métodos desta revelação também reduzem a porcentagem de amostras sinalizadas durante a análise automatizada que exigem revisão manual.
[00462] A presente revelação refere-se adicionalmente a sistemas, métodos e composições para combinar um contador de contagem de sangue total (CBC) com um analisador, tal como um analisador visual, para obter uma CBC e uma contagem diferencial de glóbulos brancos expandida com base em imagem e uma contagem de plaqueta expandida com base em imagem estendendo, assim, a faixa de detecção eficaz para contar as plaquetas.
[00463] Consequentemente, em algumas modalidades, a presente revelação fornece um aparelho e um método para analisar uma amostra que contém partículas, por exemplo, células de sangue. De acordo com esta revelação, um analisador visual é fornecido para obter imagens de uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido. Em algumas modalidades, o analisador visual compreende uma célula de fluxo e um componente de foco automático, em que uma amostra líquida que contém partículas de interesse é forçada a fluir através de uma célula de fluxo que tem uma porta de visualização através da qual uma câmera acoplada a uma lente objetiva captura imagens digitais de partículas. As técnicas de foco automático exemplificadoras que podem ser implantadas com o uso de modalidades da presente invenção são reveladas no Pedido de Patente copendente n° U.S. , cujo conteúdo está incorporado neste documento a título de referência. A célula de fluxo está acoplada a uma fonte de fluido de amostra, tal como uma amostra sanguínea diluída e/ou tratada ou outra amostra fluida corporal, conforme descrito neste documento, e a uma fonte de um fluido de revestimento transparente ou líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL).
[00464] Em uma modalidade, o aparelho compreende, ainda, um contador de partículas que tem pelo menos uma faixa de detecção, assim como um analisador e um processador. O analisador e o processador são configurados para fornecer informações adicionais para corrigir os erros de contagem, categorização e subcategorização associados ao contador de partículas e determinar, adicionalmente, a contagem de partículas precisa ou a concentração precisa de diferentes categorias e/ou subcategorias de partículas na amostra.
[00465] A presente revelação fornece métodos e composições úteis para o alinhamento de organelas intracelulares e/ou de partícula na condução de análise de amostra com base em imagem. Em algumas modalidades, esta revelação refere-se a métodos e composições para contagem combinada e sistema de imageamento com capacidade para realizar uma contagem de sangue total (CBC) e um diferencial de glóbulos brancos (WBC) expandido com base em imagem que pode identificar e contar tipos de célula, tais como WBCs, RBCs e/ou plaquetas, incluindo, por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, reticulócitos, RBCs nucleadas, blástulas, promielócitos, mielócitos ou metamielócitos e para fornecer informações com base em imagem para as contagens e morfologias de WBC, contagens e morfologias de hemácia (células vermelhas do sangue) e contagens e morfologias de plaqueta (PLT).
[00466] Em outras modalidades, esta revelação refere-se a um PIOAL que pode ser usados na análise de partículas com base em imagens, conforme descrito neste documento. A contagem de categorias e/ou subcategorias de células nas amostras de sangue é usada nesta revelação como exemplos não limitadores dos tipos de amostras que podem ser analisados. Em algumas modalidades, células presente nas amostras podem, também, incluir células bacterianas ou fúngicas, assim como glóbulos brancos, hemácias e/ou plaquetas. Em algumas modalidades, as suspensões de partícula obtidas a partir de tecidos ou aspirados podem ser analisadas.
[00467] A discriminação de células de sangue em uma amostra sanguínea é uma aplicação exemplificadora para a qual a matéria é particularmente bem adequada. A amostra é preparada através de técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica como uma corrente de amostra em formato de fita a ser imageada periodicamente, enquanto a amostra flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (tais como as células de sangue) podem ser distinguidas umas das outras, categorizadas, subcategorizadas e/ou contadas com o uso de técnicas de processamento programado de dados de imagem de pixel, tanto exclusivamente de modo automático quanto com a assistência humana limitada para identificar e contar células ou partículas. Além das imagens de célula, que podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de recursos não comuns ou críticos, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria específica de célula ou partícula distinguidas nas imagens de amostras registradas. As contagens das diferentes partículas encontradas em cada imagem podem ser adicionalmente processadas, por exemplo, usadas para acumular as razões proporcionais estatisticamente significativas e precisas ou funções das mesmas, de células de cada categoria e/ou subcategoria distinguida na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual também pode ser altamente diluída, porém, as proporções de células em cada categoria e/ou subcategoria são representadas na distribuição para a amostra diluída, particularmente após diversas imagens serem processadas.
[00468] Em alguns aspectos, as amostras são apresentadas, imageadas e analisadas de uma maneira automatizada. No caso de amostras de sangue, a amostra pode ser substancialmente diluída com um diluente ou solução salina adequados, o que reduz a extensão em que a visualização de algumas células pode ser ocultada por outras células na amostra não diluída ou menos diluída. As células podem ser tratadas com agentes que acentuam o contraste de alguns aspectos da célula, por exemplo, com o uso de agentes de permeabilização para produzir pigmentos permeáveis nas membranas celulares e histológicas para aderir a e revelar recursos, tais como grânulos e o núcleo. Em algumas modalidades, pode ser desejável colorir uma alíquota da amostra para contar e caracterizar as partículas que incluem reticulócitos, hemácias nucleadas e plaquetas e para a caracterização e análise de diferencial de glóbulos brancos. Em outras modalidades, as amostras que contêm hemácias podem ser diluídas antes da introdução à célula de fluxo e imageamento.
[00469] De acordo com algumas modalidades, os detalhes de aparelho de preparação de amostra e métodos para diluição de amostra, permeabilização e coloração histológica, em geral, são obtidos com o uso de bombas e válvulas de precisão operadas por um ou mais controladores programáveis e não são fundamentais para esta revelação. Os exemplos podem ser encontrados em patentes atribuídas à Internacional Remote Imaging Systems, Inc., tal como o documento n° U.S. 7.319.907, que se refere a controles programáveis. De modo semelhante, as técnicas para distinguir dentre determinadas categorias e/ou subcategorias de células através de seus atributos, tais como tamanho relativo e cor, podem ser encontradas no documento U.S. 5.436.978 relacionado a glóbulos brancos. As revelações de tais patentes estão aqui incorporadas, por referência. De acordo com algumas modalidades, as técnicas de preparação de amostra podem incluir coloração, lisagem, permeabilização e outras modalidades de processamento, tais como as descritas no Pedido de Patente copendente n° U.S. , cujo teor está incorporado neste documento, a título de referência.
[00470] O termo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode incluir dispositivos que podem obter imagens de partículas com distinções visuais suficientes para diferenciar recursos morfológicos e/ou alterações. Os dispositivos de imageamento de alta resolução óptica exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução óptica de 1 μm ou inferior que incluem, por exemplo, 0,4 a 0,5 μm, tais como, por exemplo, 0,46 μm.
[00471] Em algumas modalidades, as imagens obtidas em qualquer uma das composições e/ou métodos desta invenção podem ser imagens digitalizadas. Em algumas modalidades, as imagens obtidas são imagens de microscopia. Em certas modalidades, as imagens podem ser obtidas manualmente. Em outras modalidades, pelo menos uma parte do procedimento para obter as imagens é automatizada. Em algumas modalidades, as imagens podem ser obtidas com o uso de um analisador visual que compreende uma célula de fluxo, um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital, opcionalmente, com um recurso de foco automático.
[00472] Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas aos componentes citosólicos, núcleo de célula e/ou componentes nucleares da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas ao componente granular e/ou outros recursos morfológicos da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas aos componentes citosólicos, nucleares e/ou granulares da célula. As imagens e/ou recursos granulares e/ou nucleares são determinantes para a categorização e subcategorização de célula, tanto independentemente quanto em combinação uma com a outra.
[00473] Em um aspecto dos métodos desta invenção, as células colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partícula e/ou imageadas são hemácias nucleadas. Em ainda outro aspecto, os métodos desta invenção se referem a um método para realizar a categorização e subcategorização de hemácia com base em imagem que compreendem: a) gerar imagens de uma porção das hemácias; e b) determinar a morfologia das hemácias imageadas. Conforme usado neste documento, as hemácias (células vermelhas do sangue) podem incluir, por exemplo, hemácias normais ou anômalas, reticulócitos, hemácias nucleadas e /ou células infectadas com malária. Em algumas modalidades, o imageamento é realizado com o uso do aparelho desta revelação, tal como um aparelho que compreende um contador de partículas, um analisador visual e um processador.
[00474] Conforme usada neste documento, uma contagem de sangue total (CBC) exemplificadora pode incluir um painel de teste tipicamente solicitado por um médico ou outro profissional médico que fornece informações sobre as partículas e/ou células na amostra sanguínea de um paciente. As células exemplificadoras que circulam na corrente sanguínea podem ser divididas, em geral, em três tipos: incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, glóbulos brancos (por exemplo, leucócitos), hemácias (por exemplo, eritrócitos) e plaquetas (por exemplo, trombócitos).
[00475] Conforme usado neste documento, contagens anormalmente altas ou baixas podem indicar a presença de uma doença, distúrbio e/ou afecção. Dessa forma, uma CBC é um dos testes de sangue comumente realizados no medicamento, devido ao fato de que o mesmo pode fornecer uma visão geral da situação geral da saúde de um paciente. Consequentemente, uma CBC é realizada rotineiramente durante examinações físicas anuais.
[00476] Conforme usado neste documento, tipicamente, um flebotomista coleta a amostra sanguínea do indivíduo, o sangue é, em geral, extraído para dentro de um tubo de teste que contém, tipicamente, um anticoagulante (por exemplo, EDTA, por vezes, citrato) para impedir que o mesmo coagule. A amostra é, então, transportada para um laboratório. Algumas vezes, a amostra é retirada a partir de uma punctura no dedo com o uso de uma pepita da Pasteur para o processamento imediato através de um contador automatizado. Em uma modalidade, a imagem de partícula é capturada enquanto a partícula está envolta em um fluido de revestimento ou PIOAL. Em certas modalidades, a amostra sanguínea pode ser visualizada em uma lâmina preparada com uma amostra do sangue do paciente sob um microscópio (uma película de sangue ou esfregaço periférico). Em certas modalidades, a contagem de sangue total é realizada através de um analisador automatizado.
[00477] Conforme usado neste documento, em geral, os analisadores de sangue podem aspirar uma quantidade muito pequena do espécime através de uma tubulação estreita. Os sensores podem detectar a contagem e/ou a quantidade de células que passam através da tubulação e podem identificar o tipo de célula. Os sensores exemplificadores podem incluir detectores de luz (por exemplo, visível, UV ou IV) e/ou impedância elétrica. Os parâmetros de detecção exemplificadores podem incluir tamanho, volume e/ou recursos celulares. Em certas modalidades, os sensores podem detectar luz visível e luz não visível em um espectro do comprimento de onda na faixa de cerca de 200 nm a cerca de 10.000 nm. Em certas modalidades, os sensores podem detectar um comprimento de onda entre cerca de 380 nm e cerca de 760 nm.
[00478] Conforme usado neste documento, os dados/parâmetros de uma contagem de sangue podem incluir, por exemplo, hemácias totais; hemoglobina - a quantidade da hemoglobina no sangue; hematócrito ou volume de célula embalado (PCV); volume corpuscular médio (MCV) - o volume médio de hemácias (anemia é classificada como microcítica ou macrocítica à base de possibilidade desse valor estar acima ou abaixo da faixa normal esperada. Outras condições que podem afetar o MCV incluem a talassemia, reticulocitose e alcoolismo); hemoglobina corpuscular média (MCH) - a quantidade média de hemoglobina por hemácia, em picogramas; concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC) - a concentração média de hemoglobina nas células; amplitude de distribuição de hemácias (RDW) - a variação no volume celular da população de células vermelhas do sangue; glóbulos brancos totais; granulócitos de neutrófilos (pode indicar infecção por bactéria, tipicamente aumentado em infecções virais agudas). Devido à aparência segmentada do núcleo, os neutrófilos são, por vezes, chamados de "segs". O núcleo de neutrófilos menos maduros não é segmentado, mas tem um formato de banda ou alongado. Neutrófilos menos maduros — aqueles que foram recentemente liberados da medula óssea para a corrente sanguínea — são conhecidos com "bandas". Outros dados/parâmetros para uma contagem de sangue podem incluir, também, por exemplo, linfócitos (por exemplo, aumentados com algumas infecções virais, tais como febre glandular e em leucemia linfocítica crônica (CLL) ou diminuídos pela infecção de HIV); monócitos (podem estar aumentados na infecção por bactéria, tuberculose, malária, febre maculosa das Montanhas Rochosas, leucemia monocítica, colite ulcerativa crônica e enterite regional; granulócitos de eosinófilo (por exemplo, aumentados em infecções parasíticas, asma ou reação alérgica); granulócitos de basófilo (por exemplo, aumentados em afecções relacionadas à medula óssea, tais como leucemia ou linfoma.
[00479] Conforme usado neste documento, os dados/parâmetros de uma contagem de sangue podem incluir, também, por exemplo, dados associados às plaquetas, incluindo números de plaquetas, informações sobre seu tamanho e a faixa de tamanhos no sangue; volume médio de plaqueta (MPV) - uma medição do tamanho médio de plaquetas.
[00480] Em outro aspecto dos métodos desta invenção, as células colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partícula e/ou imageadas são células anômalas, tais como células infectadas com malária, linfócitos atípicos. Em alguns aspectos desta invenção, as células são células anormais que podem ser usadas para identificar, prever, diagnosticar, prognosticar ou sustentar um diagnóstico de uma afecção, doença, infecção e/ou síndrome.
[00481] Em outro aspecto dos métodos desta invenção, as células são plaquetas.
[00482] Exceto quando for expressamente indicado em contrário, entende-se que as referências a "partícula"ou "partículas"realizadas nesta revelação abrangem qualquer objeto distinto ou formado disperso em um fluido. Conforme usado neste documento, "partícula"pode incluir todos os componentes mensuráveis e detectáveis (por exemplo, através de imagem e/ou outros parâmetros mensuráveis) em fluidos biológicos. As partículas são de qualquer material, qualquer formato e qualquer tamanho. Em determinadas modalidades, as partículas podem compreender células. Os exemplos de partículas incluem, mas sem limitações, células, incluindo células de sangue, células fetais, epiteliais, células estaminais, células de tumor ou bactérias, parasitas ou fragmentos de qualquer um dos anteriormente mencionados ou outros fragmentos em um fluido biológico. As células sanguíneas podem ser qualquer célula de sangue, incluindo quaisquer células normais ou anormais, maduras ou imaturas que existem, potencialmente, em um fluido biológico, por exemplo, hemácias (RBCs), glóbulos brancos (WBCs), plaquetas (PLTs) e outras células. Os membros incluem, também, células imaturas ou anormais. Os WBCs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos, promielócitos e blástulas. Além de RBCs maduras, os membros de RBCs podem incluir RBCs nucleadas (NRBCs) e reticulócitos. As PLTs podem incluir PLTs "gigantes" e nódulos de PLT. As células sanguíneas e elementos formados são adicionalmente descritos em outra parte desta revelação.
[00483] As partículas exemplificadoras podem incluir elementos formados em amostras de fluido biológico que incluem, por exemplo, partículas esféricas e não esféricas. Em certas modalidades, as partículas podem compreender componentes não esféricos. A projeção de imagem de componentes não esféricos pode ser maximizada no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em certas modalidades, as partículas não esféricas estão alinhadas no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica (alinhadas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo). Em algumas modalidades, as plaquetas, reticulócitos, RBCs nucleadas e WBCs, inclusive neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos e WBCs imaturos inclusive blástulas, promielócitos, mielócitos ou metamielócitos são contadas e analisadas como partículas.
[00484] Conforme usado neste documento, os parâmetros de partícula detectáveis e mensuráveis podem incluir, por exemplo, índices visuais e/ou não baseados em imagem de tamanho, formato, simetria, contorno e/ou outras características.
[00485] Em uma outra modalidade, esta revelação se refere a um método para gerar imagens de partículas com o uso, por exemplo, dos kits desta invenção em métodos que compreendem, por exemplo: 1) iluminar as partículas com luz em um analisador visual; 2) obter uma imagem digitalizada de partículas de amostra envoltas em um PIOAL; e 3) analisar as amostras que contêm partícula com base nas informações de imagem. Em outras modalidades, o método pode compreender adicionalmente colocar a amostra que contém partículas em contato com uma composição de agente de contraste de partícula antes de iluminar a amostra tratada.
[00486] Em uma modalidade, as partículas analisadas compreedem pelo menos uma dentre uma partícula esférica, uma partícula não esférica ou ambas. Em uma outra modalidade, as partículas compreendem pelo menos uma partícula esférica. Ainda em outra modalidade, as partículas compreendem pelo menos uma partícula não esférica. Em uma outra modalidade, uma projeção de imagem das partículas não esféricas ou partículas que têm componentes não esféricos é maximizada em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo. As partículas podem ser, por exemplo, WBCs, RBCs e/ou plaquetas. Em uma modalidade, pelo menos 50% das partículas não esféricas estão alinhadas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo. Em outro aspecto, o uso dos PIOALs desta invenção em uma célula de fluxo permite que pelo menos 90% das partículas não esféricas sejam alinhadas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo.
[00487] O fluxo das células menores que a espessura da corrente de amostra em formato de fita envoltas em PIOAL resulta no alinhamento paralelo de tais células em relação à direção do fluxo. Em uma modalidade desta revelação, pelo menos 92% das partículas não esféricas estão alinhadas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo. Em ainda outra modalidade, pelo menos 90% das partículas não esféricas estão alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em uma outra modalidade, pelo menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou pelo menos 95% das partículas estão substancialmente alinhadas, mais especificamente a 20 graus em relação a um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em uma outra modalidade, a porcentagem de partículas não esféricas e/ou partículas esféricas que estão alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo pode ser qualquer faixa entre quaisquer duas das porcentagens mencionadas, por exemplo, pelo menos 75 a 85%, 75 a 80% e outras faixas, tais como 75 a 92%.
[00488] As forças de cisalhamento na direção paralela à direção do fluxo como um resultado do fluxo das células maiores na amostra envolta no PIOAL, tais como WBCs, resulta no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas nucleares, estruturas citosólicas ou grânulos ou outros componentes ou estruturas intracelulares mais próximos de um plano paralelo em relação à direção do fluxo.
[00489] Em uma modalidade, as partículas não esféricas compreendem hemácias. Em outro aspecto desta invenção, as partículas esféricas compreendem glóbulos brancos ou hemácias nucleadas.
[00490] Em uma modalidade dos métodos desta invenção, as partículas são partículas não esféricas. Em uma modalidade, as partículas analisadas compreedem pelo menos uma dentre uma partícula esférica, uma partícula não esférica ou ambas. Em uma outra modalidade, as partículas compreendem pelo menos uma partícula esférica. Ainda em outra modalidade, as partículas compreendem pelo menos uma partícula não esférica. Em uma outra modalidade, uma projeção de imagem das partículas não esféricas ou partículas que têm componentes não esféricos é maximizada em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo. As partículas podem ser, por exemplo, RBCs, incluindo reticulócitos e RBCs nucleadas, plaquetas e/ou WBC, incluindo um neutrófilo, linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo ou WBC imaturo, incluindo uma blástula, promielócito, mielócito ou metamielócito. Em uma modalidade, pelo menos 50% das partículas não esféricas estão alinhadas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo. Em outro aspecto, o uso dos PIOALs desta invenção em uma célula de fluxo permite que pelo menos 90% das partículas não esféricas sejam alinhadas em um plano substancialmente paralelo em relação à direção de fluxo.
[00491] Em uma modalidade desta revelação, o corte transversal de imagem compreende pelo menos um dentre uma estrutura nuclear diferencialmente colorida, estrutura citosólica diferencialmente colorida ou grânulos diferencialmente coloridos em um WBC, incluindo um neutrófilo, linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo ou WBC imaturo incluindo uma blástula, promielócito, mielócito ou metamielócito. Em uma outra modalidade, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou pelo menos 95% das partículas esféricas e/ou partículas não esféricas têm estruturas nucleares, estruturas citosólicas ou grânulos no plano focal ou profundidade de campo do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica.
[00492] Em algumas modalidades dos métodos desta invenção, as informações de imagem são o corte transversal de imagem de uma partícula. Em alguns aspectos, o corte transversal de imagem compreende pelo menos um dentre uma estrutura nuclear diferencialmente colorida, uma estrutura citosólica diferencialmente colorida ou grânulos diferencialmente coloridos em um WBC, incluindo um neutrófilo, linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo ou WBC imaturo, incluindo uma blástula, promielócito, mielócito ou metamielócito.
[00493] Em uma modalidade, os métodos desta invenção fornecem imagens de qualidade surpreendentemente alta de células com uma alta porcentagem de partículas e conteúdo de partícula em foco no fluxo, que são úteis para obter diferenciais automatizados de WBC com base em imagem, assim como identificação automatizada de anomalias morfológicas úteis para determinar, diagnosticar, prognosticar, prever ou sustentar um diagnóstico para determinar se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, afecção, anomalia ou infecção e/ou ser responsivo ou não responsivo ao tratamento.
[00494] Em outro aspecto, as composições e métodos desta invenção fornecem uma categorização e subcategorização e sinalização mais precisas de célula com base em imagem que reduzem amplamente a taxa de revisão manual em comparação com os analisadores atuais.
[00495] Conforme usado neste documento, os glóbulos brancos (WBC) exemplificadores podem incluir, por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, granulócitos imaturos incluindo metamielócitos, mielócitos, promielócitos e blástulas e glóbulos brancos anormais. Conforme usado neste documento, as hemácias (células vermelhas do sangue) podem incluir, por exemplo, hemácias normais e anormais, reticulócitos e hemácias nucleadas.
[00496] Conforme usado neste documento, o agente de viscosidade pode incluir agentes de viscosidade ou modificadores de viscosidade. Um agente/modificador de viscosidade exemplificador tem uma viscosidade característica que é diferente da viscosidade da amostra de modo que, quando o PIOAL e o agente de viscosidade são misturados, a viscosidade do PIOAL é alterada ou e/ou aumentada para maximizar o alinhamento das partículas. Em certas modalidades, a diferença de viscosidade e/ou uma diferença de velocidade entre a corrente de amostra em formato de fita e o PIOAL pode introduzir forças de cisalhamento para agir sobre as partículas enquanto em fluxo, reduzindo, assim, o desalinhamento e/ou fazendo com que as partículas se alinhem.
[00497] Conforme usado neste documento, as composições de agente de contraste de partícula podem ser adaptadas para uso em combinação com um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) em um analisador visual para analisar partículas em uma amostra de um indivíduo. O PIOAL exemplificador é útil, como um exemplo, em métodos para reconhecimento automático de diferentes tipos de partículas em uma amostra de um indivíduo.
[00498] Em outro aspecto, as células podem ser envoltas no PIOAL quando as imagens são obtidas. Os líquidos de alinhamento de organela intracelular exemplificadores adequados estão descritos neste documento.
[00499] Em uma modalidade, esta revelação se refere a um PIOAL para uso em um analisador visual. Em certas modalidades, o PIOAL pode compreender pelo menos um dentre um tampão; um agente de ajuste de pH; um tampão; um agente/modificador de viscosidade; modificador de força iônica, um tensoativo, um agente quelante e/ou um agente antimicrobiano.
[00500] Em um aspecto, o PIOAL pode compreender dois ou mais agentes/modificadores de viscosidade.
[00501] Em um aspecto, o PIOAL desta invenção pode ter uma viscosidade entre cerca de 0,001 a cerca de 0,01 Pa.s (1 a cerca de 10 centipoise). Em uma modalidade, o PIOAL desta invenção pode compreender um agente/modificador de viscosidade. Em uma modalidade, o PIOAL compreende até 100% de um agente de viscosidade.
[00502] Conforme usado neste documento, o agente de viscosidade e/ou modificador de viscosidade podem incluir qualquer substância adequada para alcançar uma viscosidade de cerca de 0,001 a cerca de 0,01 Pa.s (1 a cerca de 10 centipoise), com características ópticas, incluindo clareza óptica, adequadas para uso em um sistema de imageamento. De modo geral, o agente ou modificador de viscosidade é não tóxico, biocompatível e deixa a estrutura celular e os conteúdos substancialmente intactos. O agente de viscosidade e/ou modificador de viscosidade pode compreender pelo menos um dentre glicerol; derivado de glicerol; etilenoglicol; propileno glicol (diidroxipropano); poli(glicol etilênico); polímero solúvel em água e/ou dextrano. Em um aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser glicerol. Como um exemplo, em um aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser um derivado de glicerol. Como um exemplo, em um aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser polivinilpirrolidona (PVP). Como outro exemplo, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser etilenoglicol. Como outro exemplo, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser propilenoglicol (diidroxipropano). Como outro exemplo, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser poli(glicol etilênico). Como outro exemplo, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser polímero solúvel em água ou dextrano. Em outros aspectos, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode compreender dois ou mais dentre glicerol, derivado de glicerol; etilenoglicol; propilenoglicol (diidroxipropano); polivinilpirrolidona (PVP); poli(glicol etilênico); polímero solúvel em água ou dextrano. O agente de viscosidade/agentes de modificação de viscosidade podem incluir qualquer agente adequado para fornecer uma viscosidade de cerca de 0,001 a cerca de 0,01 (1 a cerca de 10 centipoise), com características ópticas que incluem clareza óptica, adequada para usar em um sistema de imageamento.
[00503] Conforme usado neste documento, outros agentes/modificadores de viscosidade exemplificadores podem incluir, por exemplo, hidrocoloides naturais (e derivados), tais como acácia, tragacanto, ácido algínico, carragena, goma de alfarrobeira, goma guar, goma de xantana, goma arábica, goma guar, gelatina, celulose, alginatos, amidos, açúcares, dextranos; gelatina; açúcares (e derivados), tais como dextrose, frutose; polidextrose; dextranos; polidextranos; sacarídeos; e polissacarídeos; hidrocoloides semissintéticos (e derivados), tais como glicerol, metilcelulose, hidróxi etil amido (heta-amido), carbóxi metil celulose de sódio, hidroxietilcelulose, hidróxi-propil-metil celulose, polivinilpirrolidona (PVP); hidrocoloides sintéticos (e derivados), tais como poli(álcool vinílico) (PVA) e/ou Carbopol®. Outros agentes/modificadores de viscosidade compatíveis com células também são considerados úteis para este propósito.
[00504] Em outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser glicerol presente em uma concentração de cerca de 1 a cerca de 50% (v/v) do PIOAL. Como um exemplo, em uma modalidade, o agente/modificador de viscosidade pode estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 5,0% a cerca de 8,0% (v/v). Em outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade pode estar presente a uma concentração de cerca de 6,5% (v/v). Em uma modalidade, o agente/modificador de viscosidade é glicerol presente a uma concentração de cerca de 6,5% (v/v).
[00505] Em ainda outra modalidade, o PIOAL pode compreender um agente/modificador de viscosidade de glicerol presente a uma concentração de cerca de 30% (v/v).
[00506] Em outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser PVP presente a uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 2,5% (peso por volume). Como um exemplo, em uma modalidade, o PVP agente/modificador de viscosidade pode estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 1,0 a cerca de 1,6 % (peso por volume). Em uma modalidade, o PVP está presente a uma concentração de cerca de 1,0% (peso por volume).
[00507] Em outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser PVP e glicerol. Como um exemplo, em uma modalidade, o glicerol pode estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 5% (v/v) em combinação com cerca de 1% (peso por volume) de PVP.
[00508] Em uma modalidade, o PIOAL desta invenção pode ser usado em um analisador visual para gerar imagens de partículas. Em um aspecto, o analisador visual compreende uma célula de fluxo com uma trajetória de fluxo simétrica e um componente de foco automático.
[00509] Um agente de viscosidade e/ou agentes de ajuste/modificação de viscosidade, tal como o glicerol, podem ser incluídos no PIOAL. O agente de viscosidade ou o agente de modificação de viscosidade quando introduzido, pode ajustar adequadamente a viscosidade do PIOAL à faixa desejada. Qualquer agente de viscosidade adequado pode ser usado, o que aumenta suficientemente a viscosidade do PIOAL, que tem características ópticas adequadas para permitir imageamento de alta qualidade de células em fluxo. O PIOAL terá uma viscosidade adequada para alinhar células e/ou estruturas celulares em um único plano que é substancialmente paralelo em relação à direção do fluxo, aumentando, assim, em parte, os conteúdos em foco das partículas.
[00510] O PIOAL pode ser usado com qualquer analisador desta revelação.
[00511] Conforme usado neste documento, o termo "gliceróis"abrange glicerol e um derivado de glicerol (doravante chamado de derivado de glicerol). Os exemplos de um derivado de glicerol incluem tioglicerol, poliglicerol e similares. Os exemplos utilizáveis de poliglicerol podem incluir diglicerol, POLIGLICERINA n° 310 (Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.), POLIGLICERINA n° 750 (Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.), POLIGLICERINA n° 500 (Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) e similares.
[00512] Em uma outra modalidade, o PIOAL desta revelação compreende, adicionalmente, um agente de ajuste de pH. Em um aspecto, o pH final do PIOAL e/ou da amostra está entre cerca de 6,0 a cerca de 8,0. Em outro aspecto, o pH final do PIOAL e/ou da amostra está entre cerca de 6,6 a cerca de 7,4. Em um aspecto, o pH final do PIOAL pode ser o mesmo pH da amostra preparada 12B (com referência à Figura 8).
[00513] Os agentes de ajuste de pH exemplificadores podem incluir, por exemplo, ácidos (os exemplos incluem ácidos orgânicos e ácidos minerais), bases (os exemplos incluem bases orgânicas e hidróxidos de metais alcalinos e metais alcalinos terrosos). Os ácidos orgânicos exemplificadores podem incluir os ácidos acético, lático, fórmico, cítrico, oxálico e úrico. Os ácidos minerais exemplificadores podem incluir, por exemplo, ácidos clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bórico, fluorídrico, bromídrico e perclórico. As bases orgânicas exemplificadoras podem incluir, por exemplo, piridina, metilamina, imidazol, benzimidazol, histidina, fosfazeno e hidróxidos de cátions. Os hidróxidos exemplificadores de metal alcalino e metais alcalinoterrosos podem incluir, por exemplo, hidróxido de potássio (KOH), hidróxido de bário (Ba(OH)2), hidróxido de césio (CsOH), hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de estrôncio (Sr(OH)2), hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), hidróxido de lítio (LiOH) e hidróxido de rubídio (RbOH).
[00514] Em algumas modalidades, com o uso de um tampão, o pH do PIOAL é, de preferência, mantido de cerca de 6,0 a cerca de 8,5, com mais preferência, de cerca de 7,0 a cerca de 8,0. Em algumas modalidades, é preferencial adicionar um agente tampão ao PIOAL para ajustar o pH do PIOAL. Qualquer agente ou agentes tampão adequados podem ser usados, contanto que o agente ou agentes ajustem o pH do PIOAL à faixa adequada. Os exemplos de tal agente tampão incluem STF, tampões Good's (especificamente, tris-tampão, sulfonato de éster metílico, bis-tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, tricina, bicina, TAPS e similares), hidrogenofosfato dissódico, di-hidrogênio fosfato de sódio, fosfato de potássio monobásico, HCl de sódio veronal, colidina- HCl, ácido tris(hidróxi metila)aminometano-maleico, HCl tris(hidróxi metila)aminometano, que podem ser usados sozinhos ou em combinação.
[00515] Em uma outra modalidade, o PIOAL desta invenção compreende um modificador de força iônica para ajustar a força iônica da formulação resultante. Os modificadores exemplificadores de força iônica podem incluir sulfatos, pirossulfatos, fosfatos, pirofosfatos (por exemplos, pirofosfato de potássio), citratos, cacodilatos de Li+, Na+, K+, Mg++ Ca++ Cl- Br- HCO-3 ou outros sais adequados Em uma modalidade, o PIOAL pode ser isotônico.
[00516] Os tensoativos podem ser adicionados ao PIOAL. Os tipos de tensoativos não são particularmente limitados, contanto que sejam compatíveis com outros componentes do PIOAL e compatíveis com a corrente de amostra em formato de fita e as partículas na amostra. Os tensoativos podem incluir, por exemplo, tensoativos catiônicos, aniônicos, não iônicos e anfolíticos. Os tensoativos exemplificadores podem incluir tensoativos do tipo éter polioxietileno alquílico, tensoativos do tipo de éter polioxietileno alquilfenílico, (por exemplo, NISSAN NONION NS-240 (NOF CORPORATION, marca registrada)), tensoativos do tipo de éster polioxietilenossorbitano alquílico (por exemplo, RHEODOL TW-0120 (Kao Corporation, marca registrada)), copolímeros poliol (por exemplo, PLURÔNICO F-127, F-123, F-109, F- 87, F-86, F-68, T-1107, T-1102 (BASF Corporation, marca registrada)), MEGA-8, monocaprato de sacarose, desoxi-BIGCHAP, n-octil-β-D- tioglucosídeo, n-nonil-β-D-tiomaltosideo, n-heptil-β-D-tioglucosideo, n- octil-β-D-tioglucosideo, CHAPS, CHAPSO e similares podem ser usados. Outros tensoativos podem incluir Triton-X-100 e Tween 20 a concentrações compatíveis com a amostra e a corrente de amostra em formato de fita.
[00517] A concentração do tensoativo no PIOAL é, de preferência, o nível de concentração em que as partículas, tais como as células na amostra, não são afetadas e/ou permanecem substancialmente intactas. Especificamente, a concentração é, de preferência, de 5 a 5.000 mg/L, com mais preferência, de 100 a 3.000 mg/L.
[00518] Quando as partículas contidas na amostra são analisadas com o analisador, os sais amorfos, tais como o fosfato de amônio, fosfato de magnésio, carbonato de cálcio podem ser precipitados na amostra. Os agentes quelantes podem ser adicionados ao PIOAL para dissolver tais sais amorfos. A adição de agentes quelantes possibilita não apenas a dissolução de sais amorfos, mas também, a inibição da oxidação do PIOAL. Os exemplos úteis de um agente quelante incluem sais de EDTA, CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, metil-EDTA, NTA, NTP, NTPO, EDDPO e similares. A concentração do agente quelante no PIOAL é preferencial na faixa de 0,05 a 5 g/L.
[00519] Em uma outra modalidade, o PIOAL pode compreender adicionalmente um ou mais agentes antimicrobianos. Em alguns aspectos, o agente antimicrobiano pode ser, por exemplo, substâncias que têm atividade fungicida (agentes fungicidas) e/ou substâncias que têm atividade bactericida (agentes bactericidas). Em certas modalidades, os agentes antimicrobianos adequados podem incluir, por exemplo, parabenos, isotiazolinona, fenólicos, conservantes ácidos, compostos halogenados, quartênios e álcool. Os parabenos exemplificadores podem incluir Parabenos e sais de Parabeno. As isotiazolinonas podem incluir metil cloro isotiazolinona, metil isotiazolinona, benzisotiazolinona ProClin 150, ProClin 200, ProClin 300 e ProClin 950. Os tipos de fenólico exemplificadores podem incluir fenoxietanol, álcool benzílico e álcool fenetílico. Os conservantes ácidos exemplificadores podem incluir ácido desidroacético, ácido benzoico, ácido ascórbico, ácido salicílico, ácido fórmico, ácido propiônico. Os compostos halogenados podem incluir 2-bromo-2-nitropropano-1, 3- diol, cloroacetamida, clorobutanol, cloroxilenol, clorfenesina, álcool di- clorobenzílico, butilcarbamato iodopropinílico, glutaronitrila metil-di- bromo. Os quatérnios exemplificadores podem incluir cloreto de benzalcônio, cloreto de benzalcônio, clorexidina, diisetionato de hexamidina e biguanido poliaminopropílico. Os álcoois exemplificadores podem incluir álcool etílico e álcool isopropílico. Os exemplos dos mesmos incluem agentes antimicrobianos de triazina, agentes bactericidas de tiazol (por exemplo, benzisotiazolona etc.), piritiona, agentes bactericidas de piridina (por exemplo, 1-hidróxi piridina-2- tiossódio etc.), 2-fenoxietanol e similares. Especificamente, Proxel GXL (Avecia), TOMICIDE S (API Corporation) e similares podem ser usados. Os agentes bactericidas e/ou agentes fungicidas ajudam a aprimorar a estabilidade do PIOAL.
[00520] Em uma modalidade, a concentração do agente antimicrobiano pode ser de 0,01% a 0,5% (peso por volume). A concentração pode ser de 0,03 a 0,05% (peso por volume).
[00521] A amostra que é submetida à análise usando o analisador com o PIOAL na modalidade não é particularmente limitada. Amostras obtidas a partir do organismo vivo (amostras biológicas) normalmente são usadas. Alternativamente, tais amostras podem ser diluídas, purificadas, colocadas em contato com um agente de contraste ou similares para o uso. Especificamente, os exemplos de tal amostra podem incluir sangue, sêmen, líquido cefalorraquidiano e similares. As amostras podem, também, incluir suspensões de partícula derivadas de amostras de tecido. O PIOAL na modalidade é adequadamente usado quando as partículas (hemácia, glóbulos brancos, bactérias, etc.) são analisadas.
[00522] O PIOAL desta invenção pode ser usado em um analisador visual que forma imagens de partículas. Em um aspecto, o analisador visual compreende uma célula de fluxo que pode manter o fluxo de uma corrente de amostra em formato de fita com características dimensionais predeterminadas, tais como uma espessura de corrente de amostra em formato de fita vantajosa. Em algumas modalidades, a célula de fluxo pode ter uma trajetória de fluxo simétrica e ser usada em combinação com um componente de foco automático.
[00523] Esta revelação refere-se a um método para gerar imagens de uma partícula que compreende: 1) colocar a amostra em contato com uma composição de agente de contraste de partícula; 2) iluminar a partícula preparada; 3) obter uma imagem digitalizada da partícula em uma corrente de amostra em formato de fita envolta em um PIOAL; e; 4) analisar as informações de imagem para categorizar ou subcategorizar as partículas. Em algumas modalidades, a partícula pode ser pelo menos uma dentre, um WBC, células vermelhas do sangue e/ou plaqueta, incluindo, por exemplo, um neutrófilo, linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo, reticulócito, células vermelhas do sangue nucleadas, blástula, promielócito, mielócito ou metamielócito, célula, bactérias, parasitas, matéria particulada, nódulo de célula, componente celular e granulócito imaturo. Em algumas modalidades, as plaquetas, reticulócitos, RBCs nucleadas e WBCs, incluindo neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos e WBCs imaturos incluindo blástulas, promielócitos, mielócitos ou metamielócitos são contados e analisados com base nas informações de imagem de partícula.
[00524] Em algumas modalidades, o analisador visual compreende uma célula de fluxo com uma trajetória de fluxo simétrica ou uma assimétrica e um componente de foco automático.
[00525] Em um aspecto geral, o PIOAL exemplificador e métodos de uso do mesmo são úteis quando empregados em combinação com um analisador automatizado encontrado em laboratórios de pesquisa e/ou médicos. Os analisadores automatizados exemplificadores são instrumentos projetados para medir diferentes elementos formados e/ou outras características em diversas amostras biológicas, rapidamente incluindo, por exemplo, amostras de fluido de corpo humano, com mínima assistência humana. Os analisadores automatizados exemplificadores podem incluir, por exemplo, analisadores de hematologia e/ou contadores de célula que podem realizar, por exemplo, a determinação da contagem de sangue total (CBC). Os analisadores exemplificadores podem processar amostras individualmente, em bateladas ou continuamente.
[00526] Em um aspecto, o analisador/sistema exemplificador compreende um contador automatizado de partículas configurado para detectar uma pluralidade de partículas que satisfazem um ou mais critérios de seleção e para fornecer uma contagem de partículas das mesmas, em que os critérios de seleção abrangem membros de pelo menos duas categorias dentre as ditas partículas. Um analisador, que pode compreender um processador, que pode incluir componentes do contador, é programado para distinguir as partículas das pelo menos duas categorias. Uma distribuição de cada uma das partículas é determinada com o uso do analisador. O processador usa a distribuição para corrigir a contagem de partículas para os membros de pelo menos uma das pelo menos duas categorias e/ou subcategorias. Em algumas modalidades, o contador de partículas compreende pelo menos uma canaleta configurada para fornecer a contagem de partículas da pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas com base em uma faixa predeterminada com base no volume, tamanho, formato e/ou outro critério. Por exemplo, os membros da pelo menos uma categoria e/ou subcategoria compreendem pelo menos um tipo de partícula selecionada dentre um grupo que consiste em subcategorias de glóbulos brancos (WBCs), hemácias (RBCs), plaquetas gigantes (PLTs) e hemácias nucleadas (NRBCs). Em um contador de partículas, devido ao tamanho similar ou outra característica medida, as células, tais como PLTs e NRBCs gigantes podem ser contadas como WBCs. Operando- se o aparelho conforme descrito neste documento, a contagem de partículas ou concentração de PLTs e NRBCs gigantes pode ser medida precisamente.
[00527] A amostra pode ser uma amostra biológica isolada e/ou preparada que inclui, por exemplo, uma amostra fluida corporal, um sangue, soro, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal, saliva, fluido seminal, lágrimas, suor, leite, fluido amniótico, fluido de lavagem, aspirado de medula óssea, efusões, exsudatos ou outra amostra obtida a partir de um indivíduo (por exemplo, amostra de biópsia que foi tratada para produzir uma suspensão celular ou uma amostra de laboratório ou de linha de produção que compreende partículas). Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, por exemplo, uma amostra de biópsia que foi tratada para produzir uma suspensão celular. A amostra pode, também, ser uma suspensão obtida a partir do tratamento de uma amostra fecal. Uma amostra pode, ainda, ser uma amostra de laboratório, química, industrial ou de linha de produção que compreende partículas, tal como uma amostra de cultura celular. O termo amostra pode ser usado para se referir a uma amostra obtida a partir de um paciente ou laboratório ou qualquer fração, porção ou alíquota dos mesmos. A amostra pode ser diluída, dividida em porções ou tratada com um agente de contraste em alguns processos.
[00528] Os métodos revelados neste documento são aplicáveis às amostras de uma ampla faixa de organismos, incluindo mamíferos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos), cavalos, vacas ou outros tipos de gado, cães, gatos ou outros mamíferos mantidos como animais de estimação, ratos, camundongos ou outros animais de laboratório; pássaros, por exemplo, galinhas; répteis, por exemplo, jacarés; peixe, por exemplo, salmão e outras espécie criadas; e anfíbios.
[00529] As amostras podem ser obtidas através de qualquer método convencional, por exemplo, excreção, extração, colheita, aspiração ou uma biópsia. A amostra pode ser de um indivíduo considerado saudável, por exemplo, uma amostra coletada como uma parte de uma examinação física de rotina. A amostra pode, também, ser de um indivíduo que tem, que corre o risco de, ou que se suspeita que tenha um distúrbio. O distúrbio pode ser o resultado de uma doença, uma anomalia genética, uma infecção, uma lesão ou de causas desconhecidas. Alternativamente ou além disso, os métodos podem ser úteis para monitorar um indivíduo durante o curso de tratamento para um distúrbio. Onde há sinais de não resposta ao tratamento e/ou terapia, um clínico pode escolher um agente alternativo ou adicional. Dependendo da condição do indivíduo e do distúrbio específico, se houver, as amostras podem ser coletadas uma vez (ou duas vezes, três vezes, etc.) diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente.
[00530] As partículas podem variar dependendo da amostra. As partículas podem ser células biológicas, por exemplo, células de sangue, células fetais, células estaminais, células de tumor ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, as partículas podem ser um agente infeccioso, por exemplo, um vírus ou bactéria.
[00531] Entende-se que as referências feitas às "células de sangue" nesta revelação abrangem quaisquer células normais ou anormais, maduras ou imaturas que existam potencialmente em um fluido biológico, por exemplo, hemácias (RBCs), glóbulos brancos (WBCs), plaquetas (PLTs) e outras células. Em geral, as RBCs, PLTs e WBCs normais têm um diâmetro de partícula na faixa de 6 a 8 μm, 2 a 3 μm e 8 a 15 μm, respectivamente. As RBCs, PLTs e WBCs normais estão presentes em amostras de sangue total de pacientes normais em uma faixa de concentração aproximada de 3,9 a 5,7 x 1012 células/L, 1,4 a 4,5 x 1011 células/L, 3,5-11 x 109 células/L, respectivamente. Consulte, Barbara J. Bain, Blood Cells, A Practical Guide, 4a. Edição, Blackwell Publishing, 2007, 34 a 36.
[00532] Entende-se que a referência a um "elemento formado" abrange elementos não fluidos presentes em amostras de fluido biológico. Os elementos formados incluem, por exemplo, classes de células de sangue com base em classificação científica ou função fisiológica incluindo eritrócitos (RBCs), leucócitos (WBCs) e plaquetas (PLTs), nódulos de WBC, subclasses de leucócitos, que incluem linfócitos maduros e leucócitos imaturos, tais como monócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos. Os "elementos formados" para uso neste documento também irão incluir partículas tais como microrganismos, bactérias, fungos, parasitas ou fragmentos dos mesmos ou outros fragmentos de célula. Os membros principais de WBCs incluem, mas sem limitações, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Os membros incluem, também, células imaturas ou anormais. Por exemplo, os WBCs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos, promielócitos. Além de RBCs maduras, os membros de RBCs podem incluir RBCs nucleadas (NRBCs) e reticulócitos. As PLTs podem incluir PLTs normais e PLTs "gigantes" cujo tamanho é próximo ao de WBCs normais. Entende-se que a referência feita nesta revelação a um "membro" ou "membros" de uma categoria e/ou subcategoria de partículas abrange partículas individuais em uma categoria ou subcategoria de partículas.
[00533] Exceto quando expressamente indicado de outro modo, entende-se que a referência feita a uma "categoria" de partículas nesta revelação abrange um grupo de partículas detectadas com o uso de pelo menos um critério de detecção medido, detectado ou derivado, tais como tamanho, formato, textura ou cor. Em algumas modalidades, os membros de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas contadas pelo aparelho desta revelação serão do mesmo tipo do elemento formado.
[00534] Tais partículas podem ser detectadas em uma "canaleta". Entende-se que a referência feita nesta revelação a uma "canaleta" abrange uma porção do contador de partículas que compreende um detector acoplado a uma fonte de sinal, que fornece uma saída que varia com uma maior ou menor detecção de partículas que satisfazem pelo menos um critério de detecção de canaleta. Por exemplo, um critério de detecção de canaleta pode ter por base o tamanho ou volume das partículas. Em algumas modalidades, a quantidade de canaletas em um contador de partículas é uma (1). Em algumas outras modalidades, a quantidade das canaletas em um contador de partículas é duas ou mais.
[00535] Uma categoria e/ou subcategoria de partículas detectadas em uma canaleta do contador de partículas pode compreender diferentes classes e subclasses de partículas e membros agrupados de partículas em duas ou mais subclasses. Entende-se que a referência feita nesta revelação a uma "categoria" de partículas abrange um agrupamento de partículas que corresponde aos critérios medidos, detectados ou derivados de tal tamanho, formato, textura ou cor. Em algumas modalidades, os membros de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas contadas pelo aparelho desta revelação serão do mesmo tipo do elemento formado.
[00536] Conforme usado neste documento, o "alinhamento" pode ser caracterizado em parte pelo alinhamento de partículas esféricas e/ou partículas não esféricas. Por exemplo, as partículas tais como as partículas não esféricas podem ser alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em certas modalidades, o alinhamento das partículas não esféricas, que é caracterizado pela orientação das partículas, aumenta uma projeção de imagem das partículas não esféricas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. As partículas, tais como as partículas esféricas, podem ter um aumento na quantidade dos conteúdos de intrapartícula em foco das partículas e células que é eficaz para gerar as distinções visuais para a categorização e subcategorização de partículas. As estruturas intrapartícula das partículas, tais como as partículas esféricas, podem ser posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas de modo a estarem substancialmente paralelas em relação à direção de fluxo. Por exemplo, as estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos podem, ainda, ser posicionados, reposicionados e/ou melhor posicionados de modo a estarem substancialmente paralelos em relação à direção de fluxo.
[00537] Entende-se que a referência feita nesta revelação à "classe" de partículas abrange um grupo de partículas com base na classificação científica. Por exemplo, três classes principais de células de sangue existem em uma amostra de sangue total, incluindo RBCs, WBCs e PLTs.
[00538] Entende-se que a referência feita nesta revelação a "membro" ou "membros" de partículas abrange partículas em uma categoria ou subcategoria de partículas. Por exemplo, cada categoria de células de sangue pode ser adicionalmente dividida em subcategorias ou membros. Os membros principais de WBCs incluem, mas sem limitações, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Os membros incluem, também, células imaturas ou anormais. Por exemplo, os WBCs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos e promielócitos. Além de RBCs maduras, os membros de RBCs podem incluir RBCs nucleadas (NRBCs) e reticulócitos. As PLTs podem incluir PLTs normais e PLTs "gigantes" cujo tamanho é próximo ao de WBCs normais.
[00539] Entende-se que uma referência às "células imaturas" abrangem células em um determinado estágio de desenvolvimento, por exemplo, no interior da medula óssea ou logo após a liberação da medula óssea, mas antes do desenvolvimento completo, de modo a se tornarem uma célula madura.
[00540] Entende-se que a referência feita às "células anormais" abrange células com características morfológicas irregulares ou células associadas a uma determinada doença ou afecção ou irregularidades associadas que podem, em alguns casos, estar associadas a determinadas doenças ou afecções. Os exemplos de uma determinada doença incluem, mas sem limitações, eritrocitose, policitemia, anemia, eritoblastopenia, leucocitose, leucopenia, linfocitose, linfocitopenia, granulocitose, granulocitopenia ou agranulocitose, neutrofilia, neutropenia, eosinofilia, eosinopenia, basofilia, basopenia, trombocitose, trombocitopenia e pancitopenia. Uma classe de células pode aumentar ou diminuir na corrente sanguínea. Em algumas afecções, as células anormais muito maiores que os glóbulos brancos normais existem em uma pequena concentração em uma amostra sanguínea. As variações de tamanho, formato, cor e/ou estruturas intracelulares podem estar associadas a determinadas doenças ou afecções.
[00541] Entende-se que a referência feita nesta revelação à "contagem" de partículas ou "contagem de partículas"abrange as quantidades de partículas obtidas a partir de uma canaleta de um contador de partículas. Entende-se que a referência feita nesta revelação à "concentração"de uma classe ou um membro de partículas significa diversas partículas por volume de unidade (por exemplo, por litro) ou por amostra de um volume conhecido. Por exemplo, um contador de partículas pode fornecer contagens ou concentrações ou outras funções com base em contagem para as categorias de partículas, enquanto um analisador visual pode fornecer contagens, concentrações, razões ou outros parâmetros com base em concentração para cada categoria ou subcategoria de partículas.
[00542] Entende-se que a referência feita nesta revelação à "razão"abrange qualquer razão quantitativa e/ou razão proporcional de duas categorias/subcategorias, classes ou membros de partículas. Os exemplos de tal razão incluem, mas sem limitações, uma razão por concentração, peso e/ou por quantidades de partículas. Tipicamente, a razão está relacionada à fração numérica da contagem de uma categoria, classe ou membro através da contagem de outra categoria, classe ou membro de tal tipo. Em algumas modalidades, as determinações usando contagens ponderadas ou contagens ponderadas e/ou razões proporcionais também podem ser realizadas.
[00543] Por esse motivo, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos híbridos, por exemplo, que combinam contagem de célula eletrônica e técnicas de imageamento de célula fotográfica, por exemplo, para analisar células que possam ser difíceis para distinguir eletricamente ou para analisar células presentes em quantidades que tornam difícil de obter uma contagem eletrônica precisa das mesmas.
[00544] A presente revelação refere-se, também, a uma composição de agente de contraste de partícula surpreendente e inesperada para gerar, rapidamente, as distinções visuais em uma amostra. A composição de agente de contraste de partícula pode ser especificamente útil em sistemas de citometria de fluxo automatizados. A composição de agente de contraste de partícula é compreendida de uma combinação de um agente de contraste de partícula, um agente de permeabilização e um agente fixador. Em uma modalidade, a composição de agente de contraste de partícula é uma mistura de Cristal Violeta, Novo Azul de Metileno, Saponina e Gluteraldeído. Em uma modalidade que é surpreendentemente eficaz, sob condições de coloração, o Cristal Violeta está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 7,8 μm, o Novo Azul de Metileno está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 735 μm, a Saponina está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações entre cerca de 50 mg/L e cerca de 750 mg/L, a composição inclui, adicionalmente, Eosina-Y presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 27 μm e um gluteraldeído está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações em 0,1% ou abaixo de 0,1%.
[00545] Tais exemplos ilustrativos são fornecidos para apresentar ao leitor, a matéria geral discutida neste documento e não se destinam a limitar o escopo dos conceitos revelados. As seguintes seções descrevem vários recursos e exemplos adicionais com referência aos desenhos em que os numerais semelhantes indicam elementos semelhantes e as descrições direcionais são usadas para descrever as modalidades ilustrativas, porém, como as modalidades ilustrativas, não devem ser usadas para limitar a presente revelação. Os elementos incluídos nas ilustrações neste documento podem ter sido desenhados fora de escala.
[00546] A composição de agente de contraste de partícula da invenção, quando aplicada a uma amostra de fluido de sangue, gera a coloração de células em tal amostra similar ao de um esfregaço de sangue tratado com um corante de esfregaço de sangue padrão e, em particular, similar a uma coloração de esfregaço de sangue com corante de Wright. O corante de Wright é um pigmento histológico que facilita a diferenciação de tipos de célula de sangue (por exemplo, WBC). A mesma é usada, principalmente, para a coloração dos esfregaços periféricos de sangue e aspirados de medula óssea que são examinados sob uma luz de microscópio. Na citogenética a mesma é usada para a coloração de cromossomos para facilitar o diagnóstico de síndromes e doenças. Existem colorações relacionadas conhecidas como o corante de Wright tamponado, o corante de Wright-Giemsa e o corante de Wright-Giemsa tamponado. Devido ao fato de que o processo de coloração de Wright envolve o solvente de álcool, tal processo de coloração é destrutivo para as células viáveis e não gera células substancialmente intactas. O corante May-Grünwald, que produz uma coloração mais intensa, também tem um tempo maior de desempenho.
[00547] Os aspectos e modalidades da presente invenção têm por base a surpreendente e inesperada constatação de que determinadas composições de agente de contraste de partícula, incluindo por exemplo, composições de corante/coloração e/ou combinações das mesmas, têm propriedades inesperadas e eficácia quando usadas para realizar a análise automatizada de amostra com base em imagem, tal como a análise de sangue.
[00548] As composições e o método revelados neste documento podem ser usados com muitos tipos diferentes de sistemas de imageamento de hematologia. Em particular, as composições e métodos descritos neste documento podem ser usados com uma análise de amostra com base em imagem, tal como uma análise de célula de fluxo. Um exemplo de tal análise de célula de fluxo pode incluir métodos tradicionais conhecidos de citometria de fluxo. Adicionalmente, as composições e métodos descritos neste documento podem ser vantajosamente usados com os sistemas de análise de célula de fluxo e métodos descritos resumidamente abaixo e descritos adicionalmente nos pedidos codepositados intitulados "Flowcell Systems And Methods For Particle Analysis In Blood Samples", Pedido n° __/___,___, depositado no dia 17 de março de 2014 e "Hematology Systems and Methods", Pedido n° PCT , depositado no dia 17 de março de 2014, ambos os quais estão aqui incorporados, por referência.
[00549] COMPOSIÇÃO DE AGENTE DE CONTRASTE DE PARTÍCULA
[00550] A Figura A1 é um diagrama esquemático da preparação de uma composição de agente de contraste de partícula, de acordo com uma modalidade. No bloco 208, um agente de contraste de partícula 202, um agente de permeabilização 204 e um agente fixador 206 são combinados para criar a composição de agente de contraste de partícula 210. Em uma modalidade, o agente de contraste de partícula 202, o agente de permeabilização 204 e o agente fixador 206 são combinados ao mesmo tempo. Em outras modalidades, um dentre os agente de contraste de partícula 202, agente de permeabilização 204 e agente fixador 206 é combinado com outro dentre os agente de contraste de partícula 202, agente de permeabilização 204 e agente fixador 206, que é, então, combinado com o último dentre os agente de contraste de partícula 202, agente de permeabilização 204 e agente fixador 206 em qualquer ordem. A combinação no bloco 208 pode ser realizada em qualquer ordem e de qualquer maneira adequada.
[00551] Em modalidades alternativas, um dentre o agente de permeabilização 204 e o agente fixador 206 não é incluído na composição de agente de contraste de partícula 210. Ainda em modalidades adicionais, os materiais adicionais são combinados no bloco 208 como uma parte da composição de agente de contraste de partícula 210, conforme descrito em maiores detalhes abaixo.
[00552] A composição de agente de contraste de partícula 210 pode ser fornecida como uma parte de um kit. A composição de agente de contraste de partícula 210 pode ser fornecida já preparada ou como um ou mais componentes que devem ser combinados.
Agente de contraste de partícula
[00553] O agente de contraste de partícula 202 pode ser qualquer agente de contraste que pode produzir distinções visíveis, tais como as similares a um corante de Wright. Os exemplos de tais agentes de contraste incluem Azul Alciano e Azul Alciano 86 (PAS, mucossubstâncias neutras e ácidas); Vermelho Alizarina S; Vermelho Allura AC (corante vermelho azoico n° 40); Azul Anilina (cilia intensificada com ácido oxálico); Auramina O; Azura B; Azura C; Marrom Bismarck; Azul Brilhante FCF (azul de Comassie); Azul cresil brilhante; Verde brilhante; Carmim (corante nuclear vermelho composto por Ácido carmínico e Alume de potássio); Vermelho congo; Preto clorosol E (preto de núcleo, cinza cito, rosa glicogênio); Acetato de violeta cresil; Vermelho Darrow; Eosina azulada; Eritrosina B (corante vermelho n° 3); Eosina etílica; Verde Rápido FCF (corante verde n° 3); Fucsina básica- (núcleos e flagelos); Fluoresceína- (Mercurocromo); Giemsa- esfregaços periféricos de sangue; Hematoxilina de Harris- corante nuclear regressivo; Índigo carmim (corante azul n° 2); Verde Janus B (mitocôndria); Corante de Jenner - (esfregaços periféricos de sangue); Verde Claro SF amarelado; MacNeal- (corante de sangue tetracromo); Verde de malaquita; Laranja metílico; Amarelo de Martius; Hematoxilina de Mayer - corante nuclear progressiva; Violeta metílica 2B; Prata metenamina - ácido periódico; Violeta de metileno; May Grunwald- corante hematológico; MTT- corante de formazan; Mucicarmin - corante de tumor primário; Vermelho neutro; Nigrosina; Azul Nilo A; Vermelho Rápido nuclear I.C. 60760; NaftalAS; Azul de nitro-tetrazólio - corante de formazan rápido; Laranja G; Laranja II; Orceína; Corante de Papanicolaou EAS- corante citoplásmico brilhante; Pararosanilin; Pararosanalina; Ácido periódico de Schiff - (PAS, corante de carboidrato específico); Filoxina B; Protargol S; Pironina B; Pironina Y; Resazurina; Romanowsky-Giemsa; Rosa de bengala; Safranina O; Preto do Sudão B; Sudão III- (com grânulos mieloides de corantes alfa-naftol); Sudão IV- corantes de triglicerídeos; Tartrazina- (corante azo Amarelo n° 5); Corantes de tionina- metacromatina; Tetrazólio trifenílico; TTC- corante vermelho de Formazan; Azul de toluidina O; corante de Wright - (fixador, tampão e pigmento para esfregaços de sangue convencionais); e Wright Giemsa.
[00554] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados na composição de agente de contraste de partícula 210, conforme descrito em maiores detalhes neste documento, com o uso de um agente de contraste de partícula 202 que inclui pelo menos um dentre Cristal Violeta, Novo Azul de Metileno, Safranina O, Eosina Y e Verde de Metila. O agente de contraste de partícula 202 é adicionado em uma quantidade eficaz para a coloração de células viáveis e/ou substancialmente intactas para a categorização e subcategorização com base em imagem. O agente de contraste de partícula 202 pode ser qualquer combinação de dois ou mais dos agentes de contraste de partícula supracitados. O agente de contraste de partícula 202 pode ser selecionado para obter de maneira eficaz as imagens com coloração "semelhante a Wright" de células vitais e/ou substancialmente intactas.
[00555] Em uma modalidade, o agente de contraste de partícula 202 inclui Cristal Violeta. O Cristal Violeta pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar de cerca de 1 μm a cerca de 100 μm sob condições de coloração. Conforme usado neste documento, o termo "sob condições de coloração" se refere a quando o componente é misturado com a amostra. O Cristal Violeta pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar de cerca de 6 μm a cerca de 10 μm sob condições de coloração. O Cristal Violeta pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 7,8 μm sob condições de coloração. O Cristal Violeta pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar aproximadamente 7,8 μm sob condições de coloração. O Cristal Violeta pode ser purificado a pelo menos 90% de pureza. O Cristal Violeta pode ser purificado para pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% de pureza. O Cristal Violeta pode ser purificado para pelo menos 99% de pureza. O agente de contraste de partícula 202 pode ser apenas Cristal Violeta ou pode ser Cristal Violeta combinado com um ou mais agentes de contraste de partícula adicionais.
[00556] Em uma modalidade, o agente de contraste de partícula 202 inclui Novo Azul de Metileno. O Novo Azul de Metileno pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar de cerca de 70 μm a cerca de 2,4 mM sob condições de coloração. O Novo Azul de Metileno pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar de cerca de 500 μm a cerca de 950 μm sob condições de coloração. O Novo Azul de Metileno pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 735 μm sob condições de coloração. O Novo Azul de Metileno pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar aproximadamente 735 μm sob condições de coloração. O Novo Azul de Metileno pode ser purificado a pelo menos 70% de pureza. O Novo Azul de Metileno pode ser purificado a pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza. O Novo Azul de Metileno pode ser purificado a pelo menos 100% de pureza.
[00557] Em algumas modalidades, os resultados surpreendentemente eficazes são alcançados quando o agente de contraste de partícula 202 inclui tanto Cristal Violeta quanto Novo Azul de Metileno. A razão de Cristal Violeta para Novo Azul de Metileno pode ser de cerca de 1:1 a cerca de 1:500 (molar/molar). A razão de Cristal Violeta para Novo Azul de Metileno pode ser de cerca de 1:50 a cerca de 1:160 (molar/molar). A razão de Cristal Violeta para Novo Azul de Metileno pode ser de cerca de 1:90 a cerca de 1:110 (molar/molar).
[00558] Em uma modalidade, o agente de contraste de partícula 202 inclui Eosina Y. A Eosina Y pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar de cerca de 3 μm a cerca de 300 μm sob condições de coloração. A Eosina Y pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar de cerca de 10 μm a cerca de 50 μm sob condições de coloração. A Eosina Y pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 27 μm sob condições de coloração. A Eosina Y pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar aproximadamente 27 μm sob condições de coloração. A Eosina Y pode ser purificada a pelo menos 80% de pureza. A Eosina Y pode ser purificada a pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza. A Eosina Y pode ser purificada a pelo menos 100% de pureza.
[00559] Em algumas modalidades, os resultados surpreendentemente eficazes são alcançados quando o agente de contraste de partícula 202 é uma combinação de Cristal Violeta, Novo Azul de Metileno e Eosina Y, em que cada um tem qualquer combinação de concentrações e purezas, conforme descrito acima. Em algumas modalidades, o agente de contraste de partícula 202 é, especificamente, o Cristal Violeta presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 7,8 μm, o Novo Azul de Metileno presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 735 μm e Eosina Y presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 27 μm. Em algumas modalidades, o agente de contraste de partícula 202 é, especificamente, pelo menos 99% de pureza, Cristal Violeta presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 7,8 μm, pelo menos 99% de pureza, Novo Azul de Metileno presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 735 μm e pelo menos 99% de pureza, Eosina Y presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 27 μm.
[00560] Em uma modalidade, o agente de contraste de partícula 202 inclui Safranina O. A Safranina O pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar de cerca de 1 μm a cerca de 100 μm sob condições de coloração. A Safranina O pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar de cerca de 3 μm a cerca de 30 μm sob condições de coloração. A Safranina O pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 9 μm sob condições de coloração. A Safranina O pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar aproximadamente 9 μm sob condições de coloração. A Safranina O pode ser purificada a pelo menos 80% de pureza. A Safranina O pode ser purificada a pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza. A Safranina O pode ser purificada a pelo menos 100% de pureza.
[00561] Em uma modalidade, o agente de contraste de partícula 202 inclui Verde de Metila. O Verde de Metila pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 0,1 g/L sob condições de coloração. O Verde de Metila pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar aproximadamente 0,1 g/L sob condições de coloração. O Verde de Metila pode ser purificado a pelo menos 80% de pureza. O Verde de Metila pode ser purificado a pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza. O Verde de Metila pode ser purificado a pelo menos 100% de pureza.
[00562] Em algumas modalidades, o agente de contraste de partícula 202 inclui uma ou mais dentre Cristal Violeta, Novo Azul de Metileno, Safranina O, Eosina Y e Verde de Metila em quantidades eficazes para gerar distinções visuais em partículas, por exemplo, acentuando-se os recursos de conteúdo intracelular de partículas em uma amostra quando apresentada para o imageamento. O agente de contraste de partícula 202 pode estar presente em quantidades suficientes para acentuar e/ou colorir as estruturas subcelulares de neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos, assim como reticulócitos, hemácias nucleadas, plaquetas, blástula, promielócito, mielócito, metamielócito ou fragmentos de célula. As distinções visuais ou visualizáveis podem incluir qualquer partícula ou recursos intrapartícula que possam ser visualizáveis ou, de outro modo, detectáveis com o uso de qualquer fonte de luz (por exemplo, UV, visível, IV).
[00563] Em modalidades em que a composição de agente de contraste de partícula 210 inclui dois ou mais agentes de contraste de partícula 202, as quantidades de cada um dos agentes de contraste de partícula 202 podem ser ajustadas adequadamente, dependendo da possibilidade de os agentes de contraste de partícula 202 terem efeitos independentes, de competição e/ou de intensificação sobre a geração de distinções visuais para a categorização e subcategorização de partículas.
Agente de permeabilização
[00564] Em algumas modalidades, o agente de permeabilização 204 pode incluir um tensoativo. Em algumas modalidades, o agente de permeabilização 204 pode incluir uma saponina. Em modalidades alternativas, o agente de permeabilização 204 pode incluir pelo menos um dentre um sal de amônio quaternário, um tensoativo não iônico e um tensoativo zwiteriônico. O agente de permeabilização pode alterar a permeabilidade de uma célula para aumentar a acessibilidade do agente de contraste de partícula 202 aos conteúdos intracelulares. O agente de permeabilização pode ser selecionado e incluído em quantidades suficientes para possibilitar um processo de coloração rápido de uma etapa.
[00565] Os exemplos de um tensoativo não iônico podem incluir (1) éteres de polioxietileno alquílicos ou arílicos (polietoxilatos), incluindo hidrófobos alifáticos de cadeia linear eterificados ao poli(glicol etilênico) ou etanol polioxietileno, por exemplo, Brij® 35; (2) hidrófobos alifáticos/aromáticos de cadeia ramificada (por exemplo, octil fenol) eterificados ao poli(glicol etilênico), por exemplo, Triton X®-100; (3) hidrófobos alifáticos/aromáticos de cadeia linear (por exemplo, n- nonilfenol) eterificados a poli(glicol etilênico), por exemplo, Igepal® C0897; e (4) hidrófobos alifáticos de cadeia linear (por exemplo, ácido carboxílico) esterificados a poli(glicol etilênico), por exemplo, Myrj® 53 e outros. Os exemplos de tensoativos de éteres de polioxietileno não iônico alquílicos ou arílicos (polietoxilatos) podem incluir éter laurílico de polioxietileno(4) (Brij® 30); éter laurílico de polioxietileno(23) (Brij® 35); éter cetílico de polioxietileno(2) (Brij® 52); éter cetílico de polioxietileno(20) (Brij® 58); éter estearílico de polioxietileno(2) (Brij® 72); éter estearílico de polioxietileno(10) (Brij® 76); éter estearílico de polioxietileno(20) (Brij® 78); éter oleílico de polioxietileno(2) (Brij® 92); éter oleílico de polioxietileno(10) (Brij® 96); éter oleílico de polioxietileno(20) (Brij® 98); éter estearílico de polioxietileno(21) (Brij® 721); éter estearílico de polioxietileno(100) (Brij® 700); e outros. Os exemplos adicionais de tensoativos não iônicos podem incluir Triton X®- 100 (não reduzido ou reduzido), Triton®X-114 não reduzido ou reduzido), Triton X®-165 e Triton X®-305 (não reduzido e reduzido) e outros.
[00566] Em uma modalidade, o agente de permeabilização 204 pode incluir Brij® 35 em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 0,10 g/L a cerca de 0,20 g/L sob condições de coloração. O Brij® 35 pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 0,10 g/L a cerca de 0,16 g/L sob condições de coloração. O Brij® 35 pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 0,012 g/L a cerca de 0,14 g/L.
[00567] Os exemplos de tensoativos zwiteriônicos podem incluir TDAPS (tetradecil dimetil amonio propanossulfonato), CHAPSO (3-[(3- colamidopropil) di-metilamônio]-2-hidróxi-1-propanossulfonato), óxidos de N, N-dimetil N-alquila que têm de cerca de 12 a cerca de 16 átomos de carbono, óxido de dimetilamina N-laurílico (LO), DDAPS (N-dodecil- N, N-dimetila-3-amônio-1-propanossulfonato) e outros.
[00568] Em algumas modalidades, o agente de permeabilização 204 inclui um agente suficiente para lisar hemácias. Em algumas modalidades, o agente de permeabilização 204 inclui um agente suficiente para lisar hemácias diferentes de reticulócitos ou hemácias nucleadas. Em algumas modalidades, o agente de permeabilização 204 inclui um agente suficiente para lisar hemácias enquanto os glóbulos brancos, reticulócitos, hemácias nucleadas, plaquetas e outras células permanecem substancialmente intactos. Em algumas modalidades, o agente de permeabilização 204 produz os membros e/ou membranas nucleares de glóbulos brancos, reticulócitos, hemácias nucleadas e/ou plaquetas mais permeáveis e/ou porosos para facilitar o acesso do agente de contraste de partícula 202.
[00569] Em algumas modalidades, o agente de permeabilização 204 é selecionado de modo que possa criar, rapidamente, os poros ou fendas necessários para permitir que o agente de contraste de partícula 202 entre nas células na amostra.
[00570] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados em algumas modalidades da composição de agente de contraste de partícula 210 usando um agente de permeabilização 204 que inclui 5PD- Lítico disponível junto à Clinical Diagnostic Solutions (CDS) em Ft. Lauderdale, Flórida, EUA O 5PD-Lítico inclui saponina. O 5PD-Lítico está, de modo geral, descrito na patente n° U.S. 6.632.676, incorporada neste documento a título de referência.
[00571] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados em algumas modalidades da composição de agente de contraste de partícula 210 usando um agente de permeabilização 204 que inclui uma saponina presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 10 mg/L a cerca de 1.000 mg/L sob condições de coloração. Em algumas modalidades, a saponina está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 50 mg/L a cerca de 750 mg/L. Em algumas modalidades, a saponina pode ser um éter de saponina quaternário substituído por amônio.
Agente fixador
[00572] Em algumas modalidades, o agente fixador 206 pode ser selecionado para garantir que os glóbulos brancos não se decomponham durante a coloração e imageamento. Em algumas modalidades, o agente fixador 206 pode garantir que outras células e estruturas de célula não se decomponham. Os exemplos de agentes fixadores podem incluir gluteraldeído; formaldeído; agentes de reticulação; picrato de amônia em solução salina isotônica (por exemplo, para a coloração de azul de metileno); álcool etílico; metanol (por exemplo, à temperatura ambiente, - 20°C ou -70°C); Susa de Heidenhain - HgCh, Ácido tricloroacético de NaCl, formalina; De Bouin - ácido pícrico, Formalina, ácido acético; Duboseq-Brasil - Bouinas com 80% de EtOH; Carnoy’s - EtOH, clorofórmio, ácido acético; De Zenker - HgCl2, K2CrO7, NaSO4.H2O; acetocarmina; De Gatensby - Ácido crômico, tetróxido de ósmio, NaCl; De Baker - Formalina, CaCl2,; De Smith - K2Cr2O7, formalina, ácido acético; Verde de metila de 1%, ácido acético de 1%; Fenol, formalina, glicerol, Violeta Genciana; Schaudin - HgCl2, EtOH, ácido acético; De Champy - Ácido crômico, K2CrO7, OsO4; De Fleming - Ácido crômico, OsO4, ácido acético; Prata-Formol - Formaldeído, AgNO3; Fixador de Tecido de Streck - Bronopol, diazolidinil ureia, ZnSO4.7H2O, citrato de sódio; 1% imidazolidinil ureia em STF; Glioxal: Glyofix, Prefer, Safefix, Histochoice; Glidante- Hidantoina; Dimetilol ureia; Hidroximetilglicinato de sódio; Karnovsky; Cloreto mercúrico (B-5); De Hollande; e outros. Além disso, o fixador exemplificador adequado pode incluir qualquer um dos seguintes, tanto sozinho quanto em combinação.
[00573] Em algumas modalidades, o agente fixador 206 pode ser um agente oxidante, um mercurial, um picrato, um fixador de efeito de proteção de solvente orgânico mediado por tampão de ácido HEPES- glutâmico (HOPE) ou um conservante solúvel em água. Os exemplos de agentes oxidantes incluem dicromato de potássio, ácido crômico, permanganato de potássio e outros. Os exemplos de mercurial incluem B-5, fixado de Zernker e outros. Os exemplos de conservantes solúveis em água incluem parabeno metílico, propilparabeno, dimetilol ureia, óxido de 2-piridinetiol-1, ácido ascórbico, sorbato de potássio e outros.
[00574] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados em algumas modalidades da composição de agente de contraste de partícula 210 usando um agente fixador 206 que inclui pelo menos um dentre gluteraldeído e formaldeído.
[00575] Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados com o uso de um agente fixador 206 que inclui gluteraldeído a 0,1%, em peso, ou menos.
Componentes adicionais
[00576] Em algumas modalidades, os componentes adicionais opcionais 212 podem ser opcionalmente combinados no bloco 208 na composição de agente de contraste de partícula 210. Os exemplos de componentes adicionais 212 podem incluir componentes de tampão, agentes de modificação de viscosidade, um agente antimicrobiano, um agente de ajuste osmótico, um modificador de força iônica, um tensoativo, um agente quelante e outros. Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados quando a composição de agente de contraste de partícula 210 inclui uma solução salina tamponada com fosfato.
[00577] Os agentes de modificação de viscosidade exemplificadores incluem hidrocoloides naturais (e derivados), tais como carragena, goma de alfarrobeira, goma guar e gelatina; açúcares (e derivados), tais como dextrose, frutose; polidextrose; dextranos; polidextranos; sacarídeos; e polissacarídeos; hidrocoloides semissintéticos (e derivados), tais como metilcelulose, carboximetilcelulose; Hidrocoloides sintéticos (e derivados), tais como Carbopol®; e Argilas (e derivados), tais como Bentonita e Veegum®.
Processo de coloração rápido em uma etapa
[00578] A Figura A2 é um fluxograma de um processo de coloração rápido em uma etapa 300, de acordo com uma modalidade. Embora o processo de coloração rápido em uma etapa 300 possa conter diversas subetapas, o termo "em uma etapa" é usado para identificar que a amostra não precisa ser introduzida em múltiplas soluções diferentes durante o processo de coloração. A composição de agente de contraste de partícula 210 é preparada no bloco 302, conforme descrito acima com referência à Figura A1. Opcionalmente, em algumas modalidades, os componentes, tais como quaisquer agentes de contraste de partícula 202, podem ser purificados no bloco 306. Purificar os agentes de contraste de partícula 202 pode reduzir o nível de precipitados formados mediante o contato com uma amostra reduzindo, assim, o plano de fundo e aprimorando os resultados de análise de amostra sanguínea com base em imagem com uma necessidade diminuída de revisão adicional de imagens ou lâminas ou microscopia preparada manualmente.
[00579] No bloco 308, a composição de agente de contraste de partícula 210 é combinada com a amostra. A composição de agente de contraste de partícula 210 pode ser combinada com a amostra de qualquer maneira adequada, incluindo uma mistura. A combinação no bloco 308 pode incluir diluir a amostra com uma certa quantidade de composição de agente de contraste de partícula 210. A amostra pode ser diluída com a composição de agente de contraste de partícula 210. A quantidade de diluição pode ser selecionada para fornecer uma quantidade ideal de células por quadro durante uma análise com base em imagem. A quantidade de diluição pode ser selecionada para fornecer uma quantidade ideal de glóbulos brancos por quadro durante uma análise com base em imagem. A quantidade de diluição pode ser, de outro modo, selecionada para fornecer um volume ideal para qualquer outra análise que não se baseia em imagem.
[00580] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados em algumas modalidades da composição de agente de contraste de partícula 210 com o uso de uma razão da composição de agente de contraste de partícula 210 para a amostra de cerca de 2:1 a cerca de 20:1. A razão da composição de agente de contraste de partícula 210 para a amostra pode ser de cerca de 3:1 a cerca de 10:1. A razão da composição de agente de contraste de partícula 210 para a amostra pode ser de cerca de 3:1 a cerca de 4:1. A razão da composição de agente de contraste de partícula 210 para a amostra pode ser de cerca de 3:1 ou cerca de 4:1. Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados com o uso de uma razão da composição de agente de contraste de partícula 210 para a amostra em aproximadamente 3:1 ou aproximadamente 4:1.
[00581] Resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados com o uso de um agente de contraste de partícula com 40 mL de 5PD-Lítico e 50 mL de Solução Salina Tamponada com Fosfato com uma razão de diluição de 10:1 da composição de agente de contraste de partícula 210 para a amostra. Resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados com o uso de um agente de contraste de partícula com 40 mL de 5PD-Lítico, saponina extra e 40 mL de Solução Salina Tamponada com Fosfato com uma razão de diluição de 5:1 da composição de agente de contraste de partícula 210 para a amostra. Resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados com o uso de um agente de contraste de partícula com 40 mL de 5PD-Lítico, saponina extra e 36 mL de Solução Salina Tamponada com Fosfato com uma razão de diluição de 4:1 da composição de agente de contraste de partícula 210 para a amostra.
[00582] Em algumas modalidades, a amostra é combinada com a composição de agente de contraste de partícula 210 a temperaturas elevadas, tal como qualquer uma das temperaturas descritas abaixo com referência à incubação.
[00583] Conforme usado neste documento, a amostra e a composição de agente de contraste de partícula 210 combinadas é chamada de mistura de amostra.
[00584] No bloco 310, a mistura de amostra é incubada durante uma determinada quantidade de tempo a uma determinada temperatura. A incubação pode aumentar a permeabilidade das células ou suas estruturas internas, de modo a permitir que o agente de contraste de partícula 202 infiltre melhor nas células ou estruturas celulares. O tempo e a temperatura de incubação podem ser selecionados para possibilitar que a composição de agente de contraste de partícula 210 adequadamente penetre, fixe e proporcione coloração à amostra. O tempo e a temperatura de incubação podem ser selecionados para garantir o lisamento de hemácias enquanto mantêm os glóbulos brancos, plaquetas e hemácias nucleadas substancialmente intactos.
[00585] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados em algumas modalidades da composição de agente de contraste de partícula 210 com a incubação da mistura de amostra a temperaturas de cerca de 37 °C e cerca de 60 °C, durante cerca de 1 a 60 segundos. A mistura de amostra pode ser aquecida até temperaturas de cerca de 46 °C e cerca de 49 °C. A mistura de amostra pode ser incubada entre 40 e 50 segundos. A mistura de amostra pode ser incubada por até uma hora. Em algumas modalidades, os resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados através da incubação da mistura de amostra a cerca de 48 °C durante cerca de 45 segundos. Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados através da incubação da mistura de amostra a cerca de 47 °C durante cerca de 45 segundos.
[00586] Em algumas modalidades, a combinação no bloco 308 e a incubação no bloco 310 são concluídas, aproximadamente, na mesma quantidade de tempo ou menos tempo do que é necessário para que uma mistura de amostra seja processada no equipamento de imageamento e para que as linhas do equipamento de imageamento sejam purgadas e/ou limpas. Dessa forma, uma primeira mistura de amostra pode ser imageada enquanto uma segunda mistura de amostra é combinada e incubada. Quando a primeira mistura de amostra tiver sido imageada e o equipamento de imageamento tiver sido limpo, a segunda mistura de amostra pode ser imediatamente imageada.
[00587] Em modalidades alternativas, a combinação no bloco 308 e a incubação no bloco 310 são concluídas em menos de duas vezes o tempo necessário para que uma mistura de amostra seja processada no equipamento de imageamento e para que as linhas do equipamento de imageamento sejam purgadas e/ou limpas. Dessa forma, enquanto uma primeira mistura de amostra é imageada, uma segunda mistura de amostra pode estar pronta para ser imageada e uma terceira mistura de amostra e uma quarta mistura de amostra pode estar no processo de combinação e incubação. Quando a primeira mistura de amostra tiver sido imageada e o equipamento de imageamento tiver sido limpo, a segunda mistura de amostra pode ser imediatamente imageada. A terceira mistura de amostra pode estar próxima de finalizar sua combinação e incubação e a quarta mistura de amostra pode estar, ainda, na etapa de combinação e incubação. Quando a segunda mistura de amostra tiver sido imageada e o equipamento de imageamento tiver sido limpo, a terceira mistura de amostra pode ser imediatamente imageada, enquanto a quarta mistura de amostra inicia a finalização da combinação e incubação e uma quinta mistura de amostra inicia a combinação e incubação. O processo pode continuar indefinidamente a continuamente gerar imagens de misturas de amostra.
[00588] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados através de uma combinação de determinadas modalidades da composição de agente de contraste de partícula 210, determinadas maneiras de combinar a composição de agente de contraste de partícula 210 com a amostra, e determinadas maneiras de incubar a mistura de amostra.
[00589] Especificamente, resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados com o uso de uma composição de agente de contraste de partícula 210 incluindo 90% de pureza ou mais de Cristal Violeta a cerca de 7,8 μm sob condições de coloração, 70% de pureza ou mais de Novo Azul de Metileno a cerca de 735 μm sob condições de coloração, 80% de pureza ou mais de Eosina-Y a cerca de 27 μm sob condições de coloração, saponina pré-tratada de cerca de 50 mg/L a cerca de 750 mg/L sob condições de coloração e gluteraldeído a cerca de 0,1% ou menos sob condições de coloração; onde o agente de contraste de partícula 210 é combinado coma amostra a uma razão de agente de contraste de partícula 210 para amostra de cerca de 3:1 e cerca de 4:1; e onde a mistura de amostra resultante é incubada a cerca de 48 °C durante cerca de 45 segundos.
[00590] Determinadas composições de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração eficazes possibilitam que as imagens com coloração "semelhante a Wright" de células vitais e/ou substancialmente intactas sejam obtidas de modo eficaz com um analisador visual automatizado com o uso de corantes em um sistema de solvente que não tem base em álcool. Determinadas composições de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração eficazes possibilitam a coloração rápida de amostras, de modo que vários componentes celulares, lóbulos nucleares e estruturas granulares sejam nitidamente distinguíveis. Determinadas composições de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração eficazes são adequados para a coloração supravital. Determinadas composições de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração eficazes geram distinções visuais para a categorização e subcategorização de partículas. Determinadas composições de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração eficazes são eficazes para intensificar os recursos de conteúdo intracelular de partículas em um soro, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido sinovial, fluido seminal, fluido peritoneal, fluido amniótico, fluido de lavagem, fluido de aspiração de medula óssea, efusões, exsudatos ou amostras de sangue. Determinadas composições eficientes de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração são eficazes para colorir neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, plaquetas, reticulócitos, hemácias nucleadas, blástulas, promielócitos, mielócitos, metamielócitos, cilindros hemáticos, bactérias, epiteliais e/ou parasitas. Determinadas composições eficientes de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração são eficazes para gerar distinções visuais para a categorização e subcategorização de partículas, por exemplo, para fornecer uma coloração diferencial de grânulos primário e secundário em células, de modo a auxiliar na subcategorização de granulócitos imaturos e sua determinação de idade com base na coloração diferencial ou intensificação de grânulos primário e secundário. Determinadas composições eficientes de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração são eficazes para gerar distinções visuais para contar e caracterizar hemácias, reticulócitos, hemácias nucleadas e plaquetas, assim como para a contagem diferencial de glóbulo branco e caracterização e análise de glóbulos brancos. Determinadas composições eficientes de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração são eficazes para gerar distinções visuais em células vitais e/ou células viáveis e/ou células com estruturas que permanecem substancialmente intactas. Determinadas composições eficientes de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração são eficazes para colorir estruturas subcelulares de neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos, assim como reticulócitos, hemácias nucleadas, plaquetas, blástula, promielócito, mielócito, metamielócito ou fragmentos de célula.
[00591] A coloração rápida viabilizada por determinadas composições de agente de contraste de partícula 210 e procedimentos de coloração eficazes descritos neste documento podem ser usados com procedimentos de imageamento e/ou análise automatizados ou semiautomatizados.
[00592] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados com determinadas modalidades da composição de agente de contraste de partícula 210 que compreendem agentes de contraste de partícula em um sistema de solvente que não tem base em álcool que podem, pela primeira vez segundo os inventores, gerar imagens de coloração "semelhante a Wright" de células vitais e/ou substancialmente intactas que podem revelar vários componentes celulares, lóbulos nucleares e estruturas granulares e tornar tais recursos de partícula e/ou recursos celulares visualmente distintos.
[00593] Através de esforços e experimentos não triviais, constatou- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados ao usar uma composição de agente de contraste de partícula 210 composta conforme mencionado na Tabela A1, em que o Reagente de Coloração Operacional é produzido através da mistura de 40 mL de Novo Azul de Metila e 5 mL do Cristal Violeta. Tabela A1
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[00594] A Figura A3 é uma ilustração representativa de glóbulos brancos selecionados de uma amostra com coloração com a composição de agente de contraste de partícula 210 estabelecida na Tabela A1 e com coloração, usando os procedimentos de coloração rápidos de uma etapa, estabelecidos acima. Os glóbulos brancos estão intactos e mostram características de coloração de um corante de Wright. Os vários tipos de glóbulos brancos (por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, etc) são visualmente diferenciáveis.
[00595] Em algumas modalidades, os recursos de coloração de células pelas composições de agente de contraste de partícula desta revelação estão mencionados na Tabela A2. Tabela A2
Figure img0003
Figure img0004
[00596] Em certas modalidades, a composição de coloração/corante é formulada para a estabilidade, facilidade de armazenamento, eliminação e/ou toxicidade limitada.
[00597] A Figura A4 é uma ilustração representativa de glóbulos brancos selecionados dentre uma amostra colorida com a composição de agente de contraste de partícula 210 de acordo com uma modalidade, incluindo células imageadas através de imageamento de montagem molhada manual e imageamento de fluxo automático.
Experimento precoce
[00598] Conforme descrito com referência aos exemplos abaixo, diversas composições de coloração e métodos foram testados e modificados para resultar nas modalidades reveladas acima.
[00599] Em um Exemplo precoce 1, houve um método de coloração de duas etapas em que uma amostra e uma modalidade precoce de uma composição de agente de contraste de partícula foram combinadas e incubadas durante 40 segundos a 47,5 °C e, em seguida, um reagente de arrefecimento brusco foi aplicado à mistura de amostra. A composição de agente de contraste de partícula incluiu Coulter LH Series Dilutent, Coulter Lyse S III diff Lytic Reagent, Coulter LH Series Pak Reagent Kit, and Coulter LH Series RETIC PAK Reagent Kit. Os resultados são visualizados na Figura A5.
[00600] Em um Exemplo precoce 2, após o Exemplo 1, o método de coloração de duas etapas do Exemplo 1 foi substituído por um método de coloração de uma etapa. Os resultados aprimorados de Basófilos são visualizados na Figura A6 em comparação com os resultados do Exemplo 1.
[00601] Em um Exemplo precoce 3, uma composição de agente de contraste de partícula sem incluir gluteraldeído resultou em glóbulos brancos enfraquecidos que poderiam se romper devido às forças de cisalhamento na célula de fluxo. As imagens dos resultados do Exemplo 3 que mostram membranas danificadas são mostradas na Figura A7.
[00602] Em um Exemplo precoce 4, após o Exemplo 3, o gluteraldeído foi adicionado à composição de agente de contraste de partícula. As membranas de glóbulo branco estavam mais intactas no Exemplo 4, porém, as membranas do núcleo ainda estavam danificadas. Após realizar ajustes ao PIOAL para reduzir o teor de glicerol, a morfologia dos glóbulos brancos foram, em maior parte, inalteradas durante o imageamento, conforme mostrado na Figura A8.
[00603] Em exemplos precoces com colorações de dois corantes usando composições de agente de contraste de partícula de Novo Azul de Metileno e Cristal Violeta, a maior parte dos tipos de célula estavam bem distinguíveis, exceto pelos eosinófilos, que estavam, de certa forma, inconsistentes e nem sempre fáceis de distinguir dos neutrófilos, conforme mostrado na Figura A9. Nos Exemplos 5 e 6 subsequentes, um terceiro agente de contraste de partícula foi adicionado à composição de agente de contraste de partícula.
[00604] No Exemplo 5, o Verde de Metila foi adicionado à composição de agente de contraste de partícula. O verde de metila auxiliou na melhor coloração dos eosinófilos, porém, o núcleo das células não é mais colorido com a cor púrpura desejada, mas com azul. A Figura A10 representa as imagens dos neutrófilos do Exemplo 5 com núcleos coloridos de azul, mas com detalhes granulares perdidos.
[00605] No Exemplo 6, a Eosina-Y foi usada em vez do Verde de Metila como um terceiro agente de contraste de partícula na composição de agente de contraste de partícula. A Eosina-y reteve uma coloração púrpura do núcleo e as colorações de grânulos consistentemente com um brilho ligeiramente laranja, conforme é percebido na Figura A11.
[00606] Através do experimento mencionado acima e do experimento adicional, determinou-se que as modalidades reveladas e as modalidades reivindicadas fornecem resultados preferenciais.
[00607] Cada um dos cálculos ou operações aqui descritos pode ser feito com o uso de um computador ou outro processador que tenha hardware, software e/ou firmware. As várias etapas do método podem ser realizadas por módulos, e os módulos podem compreender qualquer uma dentre uma ampla variedade de hardware e/ou software de processamento de dados digitais e/ou analógicos dispostos para executar as etapas do método aqui descritas. Os módulos compreendem opcionalmente hardware de processamento de dados adaptado para executar uma ou mais dessas etapas tendo código de programação de máquina adequado associado ao mesmo, os módulos de duas ou mais etapas (ou porções de duas ou mais etapas) sendo integrados a uma única placa de processador ou separados em diferentes placas de processador em qualquer uma dentre uma ampla variedade de arquiteturas de processamento integrado e/ou distribuído. Esses métodos e sistemas com frequência usarão um meio tangível incluindo código legível por máquina com instruções para executar as etapas do método descrito acima. Os meios tangíveis adequados podem compreender uma memória (incluindo uma memória volátil e/ou uma memória não-volátil), um meio de armazenamento (como uma gravação magnética em um disquete, um disco rígido, uma fita, ou similares; em uma memória óptica, como um CD, um CD-R/W, um CD- ROM, um DVD ou similares; ou qualquer outro meio de armazenamento digital ou analógico), ou similares.
[00608] Todas as patentes, publicações de patente, pedidos de patente, artigos de jornal, livros, referências técnicas e similares discutidos na presente revelação estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[00609] Diferentes disposições dos componentes representadas nos desenhos ou descritas acima, assim como os componentes e etapas não mostrados ou descritos, são possíveis. De modo similar, alguns recursos e subcombinações são úteis e podem ser empregados sem referência a outros recursos e subcombinações. As modalidades da invenção foram descritas para propósitos ilustrativos e não restritivos, e modalidades alternativas ficarão aparentes aos leitores desta patente. Em certos casos, as etapas do método ou operações podem ser realizadas ou executadas em diferentes ordens, ou as operações poderão ser incluídas, deletadas ou modificadas. Pode ser entendido que, em determinados aspectos da invenção, um único componente pode ser substituído por múltiplos componentes, e múltiplos componentes podem ser substituídos por um único componente, para fornecer um elemento ou estrutura ou para executar uma determinada função ou funções. Exceto onde essa substituição não é operacional para praticar certas modalidades da invenção, essa substituição é considerada dentro do escopo da invenção. Consequentemente, a presente invenção não se limita às modalidades descritas acima ou mostradas nos desenhos, e várias modalidades e modificações podem ser feitas sem que se afaste do escopo das reivindicações abaixo.

Claims (6)

1. Método para gerar imagens de uma pluralidade de partículas usando um sistema de análise de partícula configurado para hidrofoco de viscosidade e geométrico combinados, em que as partículas incluídas em uma amostra de fluido de sangue (25) têm uma viscosidade de fluido de amostra, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: fazer fluir um fluido de revestimento (426) ao longo de uma trajetória de fluxo (422) de uma célula de fluxo (22, 420), em que o fluido de revestimento (426) tem uma viscosidade de fluido de revestimento diferente da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade; injetar a amostra de fluido de sangue (25) através de uma porta de saída (P, 331, 413) no fluido de revestimento (426) fluente no interior da célula de fluxo (22, 420) de modo a fornecer uma corrente de fluido de amostra (32, 428) envolta pelo fluido de revestimento (426), em que: a porta de saída (P, 331, 413) tem uma altura (H(I)) e uma largura (W(I)), e a altura (H(I)) é inferior à largura (W(I)); fazer fluir a corrente de fluido de amostra (32, 428) e o fluido de revestimento (426) através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo (21, 419) em direção a um local de imageamento (432), de modo que o efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento (426) e a corrente de fluido de amostra (32, 428) associada à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento (426) e a corrente de fluido de amostra (32, 428) associada com a redução no tamanho da trajetória de fluxo, seja eficaz para fornecer um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas no local de imageamento (432) enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade de células na corrente de fluido de amostra, de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido de amostra (32, 428) para o fluido de revestimento (426) fluente; e formar uma corrente de amostra em formato de fita (32, 428) no local de imageamento (432); e gerar imagens da pluralidade de partículas no local de imageamento (432).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a corrente de amostra em formato de laço (32, 428) tem uma espessura na faixa de 2 μm a 10 μm, e a corrente de amostra em formato de laço (32, 428) tem uma largura na faixa de 500 μm a 3.000 μm.
3. Sistema para gerar imagens de uma pluralidade de partículas em uma amostra de fluido de sangue (25) que tem uma viscosidade de fluido de amostra, em que o sistema para uso com um fluido de revestimento (426) tem uma viscosidade de fluido de revestimento diferente da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa predeterminada de diferença de viscosidade, em que o sistema é caracterizado pelo fato de que compreende: uma célula de fluxo (22, 420) que tem uma trajetória de fluxo e um tubo de injeção de fluido de amostra (29, 412, 400d), em que a trajetória de fluxo (420) tem uma redução de tamanho da trajetória de fluxo (21, 419); o tubo de injeção de fluido de amostra (29, 412, 400d) tem uma extremidade a jusante (427a) que define uma porta de saída (P, 331, 431), a porta de saída (P, 331, 431) tem uma altura (H(I)) e uma largura (W(I)), e a altura (H(I)) é inferior à largura (W(I)); uma entrada de fluido de revestimento (401) em comunicação fluida com a trajetória de fluxo (422) da célula de fluxo (22, 420), de modo a transmitir um fluxo do fluido de revestimento (426) ao longo da trajetória de fluxo (422) da célula de fluxo (22, 420); uma entrada de amostra de fluido de sangue (402) em comunicação fluida com o tubo de injeção (29, 412, 400d) da célula de fluxo, de modo a injetar um fluxo da amostra de fluido de sangue (32, 428) no fluido de revestimento (426) fluente no interior da célula de fluxo (22, 420), de tal modo que o fluido de revestimento e o fluido de amostra fluam através da redução de tamanho da trajetória de fluxo (21, 419) e em direção a um local de imageamento (432), em que um efeito de hidrofoco de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento (426) e o fluido de amostra (32, 428) associado à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidrofoco geométrico induzido por uma interação entre o fluido de revestimento (426) e o fluido de amostra (32, 428) associado à redução no tamanho da trajetória de fluxo, fornece um estado de imageamento-alvo em pelo menos uma parte da pluralidade de partículas no local de imageamento enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento mantém a viabilidade de células na corrente de fluido de amostra, de modo a deixar a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento (426) fluente; e um dispositivo de imageamento (24) que realiza o imageamento da pluralidade de partículas no local de imageamento (432).
4. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que: a altura (H(I)) está em uma faixa de 50 μm a 250 μm, e a largura (W(I)) está em uma faixa de 500 μm a 3.000 μm.
5. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido de sangue (25) forma uma corrente de amostra em formato de laço (32, 428) no local de imageamento (432).
6. Sistema de análise de partícula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a corrente de amostra (32, 428) tem formato de laço na trajetória de imagem.
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