KR20150129709A - 혈액학 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 태양들 및 실시 형태들은 샘플 중에 함유된 입자들을 분석하는 데 사용되는 입자 분석기를 위한 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬제(particle and/or intracellular organelle alignment agent)를 제공한다. 예시적인 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬제는 수용액, 점도 개질제, 및/또는 완충제를 포함한다. 실시 형태들은 또한 입자들을 함유하는 샘플을 분석하기 위한 시스템, 조성물, 및 방법을 포함한다. 혈구와 같은 입자들은 디지털 이미지 프로세서에 의해 범주화 및 카운팅될 수 있다. 디지털 현미경 카메라는, 예를 들어 소정의 포커싱 기술을 사용하여, 샘플 스트림이 시스 유체의 층들 사이의 유동 및 점도 파라미터들에 의해 편평화된 리본 내를 유동하는 대칭 협소화 유로를 한정하는 플로우셀 내로 지향될 수 있다. 혈구 이미지들은 동적 범위 확대 과정 및 시스템을 사용하여 수집 및 분석될 수 있다.

Description

혈액학 시스템 및 방법{HEMATOLOGY SYSTEMS AND METHODS}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/799,152호에 대해 비잠정적이고 그에 대한 우선권의 이득을 주장하며, 이 출원의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 출원은 또한 미국 특허 출원 제14/215,834호, 제14/216,533호, 제14/216,339호, 제14/216,811호 및 제14/217,034호와 국제 특허 출원 제 호(플로우셀, 오토포커스, 시스 유체, 동적 범위, 조영제(flowcell , autofocus, sheath fluid, dynamic range, contrast agent)와 관련되며, 이들 모두는 2014년 3월 17일에 출원된 것이다. 각각의 이들 출원의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 입자들의 분석을 위한 장치, 시스템, 조성물, 및 방법의 분야에 관한 것으로, 이는 전체 또는 부분 자동화 디바이스를 사용하여, 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하여, 샘플 중의 혈구들과 같은 입자들을 구별하고 정량화하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 대상체로부터의 샘플 중의 입자들을 분석하는 데 유용한 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(particle and/or intracellular organelle alignment liquid, PIOAL), 그 액체를 생성하기 위한 방법, 및 입자들을 검출하고 분석하기 위해 그 액체를 사용하기 위한 방법에 관한 것이다. 이미지-기반 생물학적 유체 샘플의 분석을 수행하는 데 유용한 조성물, 시스템, 디바이스 및 방법이 또한 개시된다. 본 발명의 조성물, 시스템, 디바이스, 및 방법은 또한 생물학적 유체 중의 입자들, 예컨대 적혈구, 망상적혈구(reticulocyte), 유핵 적혈구, 혈소판을 검출하고, 카운팅하고, 특성화하는 데, 그리고 이미지 및 형태학-기반 백혈구 감별 카운팅(differential counting), 범주화, 하위범주화, 특성화 및/또는 분석에 유용하다.
혈구 분석은 환자의 건강 상태의 개관을 제공하기 위해 가장 일반적으로 수행되는 의학적 검사들 중 하나이다. 혈액 샘플이 환자의 신체로부터 채취되고, 혈병형성(clotting)을 방지하기 위해 항응고제를 함유하는 시험관 내에 저장될 수 있다. 전혈 샘플은 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함한 3가지 주요 부류의 혈구들을 통상 포함한다. 각각의 부류는 구성원들의 하위부류들로 추가로 세분될 수 있다. 예를 들어, 백혈구(WBC)의 5가지 주요 유형 또는 하위부류는 상이한 형상 및 기능을 갖는다. 백혈구는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구를 포함할 수 있다. 또한, 적혈구 유형들의 하위부류들이 있다. 샘플 중의 입자의 외관은 병리학적 상태, 세포 성숙 및 다른 원인들에 따라 상이할 수 있다. 적혈구의 하위부류들은 망상적혈구 및 유핵 적혈구를 포함할 수 있다.
RBC, WBC 또는 혈소판의 농도를 평가하는 혈구 카운트(blood cell count)는 수동으로 또는 자동 분석기를 사용하여 행해질 수 있다. 혈구 카운트가 수동으로 행해지는 경우, 혈액 한 방울을 박층 도말(thin smear)로서 현미경 슬라이드에 적용한다. 전통적으로, 5가지 유형의 백혈구의 수 또는 상대량을 결정하기 위해 현미경 슬라이드 상에서의 혈액의 건조된 염색 도말의 수동 검사가 사용되어 왔다. 세포 또는 세포 구조를 염색하기 위해 조직학적 염료(dye) 및 염색제(stain)가 사용되어 왔다. 예를 들어, 라이트 염색제(Wright's stain)는 광학 현미경 하에서의 검사를 위한 혈액 도말을 염색하는 데 사용되어 온 조직학적 염색제이다. 자동화 분석기를 사용하여 온혈구 카운트(Complete Blood Count, CBC)가 얻어질 수 있는데, 이러한 자동화 분석기의 하나의 유형은 혈액 샘플 중의 상이한 입자들 또는 세포들이 소형 관을 따라 감지 영역(sensing area)을 통과함에 따라 임피던스 또는 동적 광 산란에 기초하여 이러한 입자들 또는 세포들의 수를 카운팅한다. 자동화 CBC는 RBC, WBC 및 혈소판(PLT)을 포함한 세포들의 상이한 유형들 사이를 감별하기 위하여 기기 또는 방법을 사용할 수 있으며, 이때 이들 세포는 별개로 카운팅될 수 있다. 예를 들어, 대세포(large cell)만을 카운팅하기 위하여 최소 입자 크기 또는 부피를 필요로 하는 카운팅 기술이 사용될 수 있다. 혈액 중의 비정상 세포와 같은 소정의 세포가 올바르게 카운팅되지 않거나 식별되지 않을 수 있다. 서로에게 부착되는 소세포들이 대세포로서 잘못 카운팅될 수 있다. 잘못된 카운트가 의심되는 경우에는, 세포를 입증 및 식별하기 위하여 기기의 결과에 대해 수작업으로 재검토하는 것을 필요로 할 수 있다.
자동화 혈구 카운팅 기술은 유세포분석(flow cytometry)을 포함할 수 있다. 유세포분석은 좁은 유로를 제공하는 것, 및 개별 혈구들의 통과를 감지 및 카운팅하는 것을 포함한다. 유세포분석 방법은 유체 중에 현탁된 입자들, 예컨대 혈액 샘플 중의 세포들을 검출하는 데, 그리고 이러한 입자들을 입자 유형, 치수, 및 부피 분포에 대해 분석하여 혈액 샘플 중의 각각의 입자 유형 또는 입자 부피의 농도를 추론하도록 하는 데 사용되어 왔다. 유체 중에 현탁된 입자들을 분석하기에 적합한 방법의 예에는 침강, 현미경적 특성화(microscopic characterization), 임피던스에 기초한 카운팅, 및 동적 광 산란이 포함된다. 이들 툴(tool)은 검사 오류가 일어나기 쉽다. 다른 한편으로, 입자의 농도 및 유형의 정확한 특성화는 의학적 진단과 같은 응용에서 결정적일 수 있다.
이미징에 기초한 카운팅 기술에서는, 관찰 영역(viewing area)을 통과하는 중일 수 있는 준비된 샘플의 픽셀 데이터 이미지가, 디지털 카메라에 커플링된 현미경 대물 렌즈를 사용하여 캡처링된다. 픽셀 이미지 데이터는 데이터 처리 기술을 사용하여 분석되고, 또한 모니터 상에 표시될 수 있다.
플로우셀(flowcell)에 의한 자동화 진단 시스템의 태양들이, 터너(Turner) 등에게 허여된 미국 특허 제6,825,926호 및 모두가 카스단(Kasdan) 등에게 허여된 미국 특허 제6,184,978호; 제6,424,415호; 및 제6,590,646호에 개시되어 있으며, 이들은 마치 본 명세서에 완전히 기술된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
동적 광 산란 또는 임피던스를 사용하는 자동화 시스템이 온혈구 카운트(CBC), 즉 전체 백혈구 카운트(WBC), 적혈구의 전체 세포 부피(RBC 분포), 헤모글로빈 HGB(혈액 중의 헤모글로빈의 양); 평균 세포 부피(MCV)(적혈구의 평균 부피); MPV(평균 PLT 부피); 적혈구용적률(HCT); MCH(HGB/RBC)(적혈구당 헤모글로빈의 평균량); 및 MCHC(HGB/HCT)(세포 중의 헤모글로빈의 평균 농도)를 얻는 데 사용되어 왔다. 백혈구 5종 감별 카운팅 및 혈액 샘플 분석을 가능하게 하기 위하여 자동화 공정 또는 부분 자동화 공정이 사용되어 왔다.
그러한 현재 알려진 입자 분석 시스템 및 방법은, 관련 의학적 진단 기술과 함께, 의사, 임상의, 및 환자에게 현실적인 이점을 제공할 수 있기는 하지만, 한층 더한 개선이 요망된다. 예를 들어, 자동화 시스템을 사용하여 이미지-기반 샘플 분석을 수행할 때 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬에 유용한 개선된 방법 및 조성물에 대한 지속적인 필요성이 있다. 본 발명의 실시 형태들은 이들 미해결된 요구 중 적어도 일부에 대한 해결책을 제공한다.
본 발명의 실시 형태들은 입자들을 함유하는 준비된 샘플을 분석하기 위한 장치, 시스템, 조성물, 및 방법에 관한 것이다. 일부 태양에서, 본 시스템은 시각적 분석기일 수 있는 분석기를 포함한다. 일부 태양에서, 본 장치는 시각적 분석기 및 프로세서를 포함한다. 일 태양에서, 본 발명은 자동화 입자 이미징 시스템에 관한 것으로, 본 시스템에서는 관심 대상인 입자들을 함유하는 액체 샘플이 관찰구(viewport)를 갖는 플로우셀을 통해 유동되게 하며, 관찰구를 통해 광학 고분해능 이미징 디바이스가 이미지를 캡처링한다. 일부 태양에서, 광학 고분해능 이미징 디바이스는 카메라, 예컨대 디지털 카메라를 포함한다. 일 태양에서, 광학 고분해능 이미징 디바이스는 대물 렌즈를 포함한다.
플로우셀은 샘플 유체, 예컨대 준비된 샘플의 공급원에, 그리고 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL)의 공급원에 커플링된다. 본 시스템은 유동 중인 샘플 중의 입자들의 포커싱된 이미지의 캡처를 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 입자들을 범주화 및 하위범주화하기 위한 자동화 고처리량 과정에서 사용될 수 있다. 예시적인 시각적 분석기는 이미지의 자동화 분석을 가능하게 하기 위하여 프로세서를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 시각적 분석기는 자동화 이미지-기반 WBC 감별 카운팅 또는 다른 혈액 샘플 입자 분석 프로토콜을 제공하기 위하여 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 대상체가 건강한지 또는 질병, 질환, 비정상 및/또는 감염을 갖는지를 결정, 진단, 예후, 예측, 및/또는 그러한지의 진단을 지원하기 위한, 그리고 대상체가 치료에 반응성인지 또는 비반응성인지를 모니터링하기 위한 형태학적 비정상의 자동화 식별에 관한 것이다.
PIOAL은 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 비구형 입자들을 정렬시키는데, 이는 결과적으로 이미지 최적화를 가져온다. PIOAL은 또한 유동 방향에 사실상 평행한 세포내 구조, 세포소기관 또는 엽의 위치설정, 위치재설정, 및/또는 더 우수한 위치설정에 있어서 구형 세포들을 지원한다. 일부 실시 형태에서, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 RBC, 및 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 및 미성숙 WBC - 아세포(blast), 전골수세포, 골수세포, 또는 후골수세포를 포함함 - 를 포함한 WBC가 입자들로서 카운팅되고 분석된다.
본 발명의 실시 형태들은 입자 조영제 조성물로 처리된 세포들 내에서의 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬에 유용한 시스템, 방법, 및 시스 유체(sheath fluid) 조성물을 제공한다. 그러한 기술은 하나 이상의 혈액 성분들의 결정을 가능하게 하는 최적화 이미지의 캡처를 제공하지 않고/않거나 세포 형태를 유지한다는 불리한 점이 문제가 될 수 있는 유세포분석에 사용되는 종래의 시스 유체와 관련된 소정의 어려움을 극복한다.
소정 실시 형태에서, 리본형 샘플 스트림과 시스 유체 사이의 점도 차이 및/또는 속도 차이 및/또는 리본형 샘플 스트림의 두께는, 예를 들어 협소화(narrowing) 유로 전이 구역에 의해 제공되는 기하학적 포커싱 효과(geometric focusing effect)와 조합하여, 전단력을 도입하여 유동 중인 입자들 상에 작용하고, 그럼으로써 입자들이 시각적 분석기에서 이미징 과정 전체에 걸쳐 정렬되게 하거나 정렬 상태로 유지되게 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 대비(contrast)가 향상될 것이다. 일부 실시 형태에서, 시스 유체는 최대 100%의 점도제를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 시스 유체는 최대 60% v/v의 점도제를 갖는다. 사용되는 점도제의 유형에 따라, 일부 실시 형태에서, 시스 유체는 약 5 내지 7%, 또는 더 구체적으로는 6.5% (w/v)의 농도로 존재하는 건조 형태로 구매가능한 점도제를 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 특정 질환과 관련된 침출물 및 뇌척수액과 같은 다른 생물학적 유체 중의 세포들 및 다른 입자 특징부(feature)들과 같은 샘플 중의 입자들의 이미지-기반 분석에 사용될 수 있는 시스 유체에 관한 것이다. 세포 범주 및/또는 하위범주는, 분석될 수 있는 샘플들의 종류의 비제한적인 예로서 본 발명에서 혈액 샘플에서의 사용에 대해 기술된 바와 같이 카운팅된다. 일부 실시 형태에서, 샘플 중에 존재하는 세포들은 또한 백혈구, 적혈구 또는 혈소판뿐만 아니라 세균성 또는 진균성 세포들도 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조직 또는 흡인물로부터 얻어진 입자 현탁액이 분석될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상당한 폭을 갖는 유로를 확립하도록, 납작한 개구부를 갖는 캐뉼러(cannula)를 통해 샘플 유체 스트림이 주입될 수 있다. 시스 유체는 플로우셀 내로 도입될 수 있으며, 샘플 유체를 이미징 영역을 따라 그를 통해, 그리고 이어서 배출구를 향해 운반한다. 시스 유체는 샘플 유체와 상이한 점도, 예를 들어 그보다 더 높은 점도를 가지며, 선택적으로, 리본형 샘플 스트림으로의 주입 지점에서의 상이한 유량(flow rate)은 샘플 유체를 박형 리본 형상으로 편평화되게 한다. 샘플 유체의 박형 리본은, 시스 유체와 함께, 협소화 유로 전이 구역을 통해 운반되어서 관찰구의 전방을 지나가는데, 이때 관찰구에는 광학 고분해능 이미징 디바이스 및 광원이 리본형 샘플 스트림을 관찰하도록 배열되어 있다.
일 실시 형태에서, 시스 유체의 점도는 샘플의 점도보다 더 높을 수 있다. 시스 유체의 점도, 샘플 재료의 점도, 시스 유체의 유량 및 샘플 재료의 유량은, 예를 들어 협소화 전이 구역에 의해 제공되는 리본 압축 효과와 조합하여, 리본형 샘플 스트림에서의 유동에 사전결정된 치수 특성들, 예컨대 유리한 리본형 샘플 스트림 두께를 제공하도록 조정된다. 유리한 리본형 샘플 스트림 두께를 유지하는 것은, 일 예로서, 인-포커스(in-focus) 세포들 또는 인-포커스 세포 성분들의 높은 백분율을 제공한다.
본 발명의 실시 형태들은 시스 유체 중에의 적합한 양의 점도제의 첨가가 플로우셀 내에서의, 예를 들어 협소화 전이 구역을 갖는 플로우셀 내에서의 입자/세포 정렬을 상당히 개선하고, 세포들의 인-포커스 세포내 내용물을 증가시켜, 그 결과 유세포분석에서 사용되는 점도-비개질된 종래의 시스 유체의 사용과 비교하여 유동 중인 세포들의 더 높은 품질의 이미지를 생성한다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 점도제의 첨가는 적혈구(RBC)와 같은 세장형(elongate) 또는 비구형 입자들 또는 세포들 상에서의 전단력을 증가시키고, 이어서 이는 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 세포들을 정렬시키며, 이는 결과적으로 이미지 최적화를 가져온다. 백혈구(WBC)와 같은 세포들의 경우, 이는 또한, 유동 방향에 사실상 평행한 세포내 구조, 세포소기관 또는 엽(lobe)의 위치설정, 위치재설정, 및/또는 더 우수한 위치설정을 가져온다. 예를 들어, 백혈구는 감별 또는 점도제에 의해 부여된 전단력에 반응하여 압축가능하거나 변형가능할 수 있으며, 이에 따라 전단 하에서 입자 신장 또는 압축 및 정렬로 이어질 수 있다.
시스 유체의 점도를 증가시킴으로써, 유동 스트림보다 직경이 더 작은 입자들의 정렬이 얻어질 수 있다. 이는 유동 방향에 사실상 팽행한 평면 내에 이러한 입자들의 개선된 정렬을 가져온다.
리본형 샘플 스트림 두께는, 예를 들어 플로우셀의 협소화 전이 구역의 기하학적 형태와 조합하여, 샘플 유체 및 시스 유체의 상대 점도 및 유량에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 정밀 변위 펌프를 포함하는 샘플의 공급원 및/또는 시스 유체의 공급원은 리본형 샘플 스트림의 치수를 최적화하기에 안정한 유량으로, 즉 적어도 이미징 디바이스의 시야(field of view)만큼 넓은 박형 리본으로서 샘플 및/또는 시스 유체를 제공하도록 구성될 수 있다.
예시적인 시스 유체 실시 형태가 입자 분석을 위한 플로우셀에서 사용된다. 샘플은 시스 유체의 스트림 내에 봉입(envelope)되고, 분석기 디바이스의 플로우셀을 통과하게 된다. 이어서, 검출 영역을 통과할 때 샘플로부터 정보가 수집되어서, 분석기가 샘플 중에 함유된 입자들/세포들을 분석할 수 있게 된다. 그러한 분석기 상에서의 시스 유체의 사용은 샘플 중에 함유된 세포들 및/또는 입자들의 정확한 범주화 및 하위범주화와 카운팅을 가능하게 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 시스 유체는 그와 관련된 하기의 세포들 및/또는 입자들에 관한 정보를 얻는 데 유용하며, 이에는, 예를 들어 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 RBC, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 및/또는 후골수세포가 포함된다.
본 발명은 입자 분석을 수행하기 위한 신규한 조성물 및 그의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 샘플 중의 입자들을 분석하기 위한 분석기에서 사용되는 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL)에 관한 것이다. 용어 시스 유체와 PIOAL은 본 명세서 전체에 걸쳐 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 PIOAL을 생성하기 위한 방법 및 입자들을 분석하기 위해 PIOAL을 사용하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 PIOAL은, 일 예로서, 샘플 중의 입자들의 자동화 범주화 및 하위범주화를 위한 방법에 유용하다.
일 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 입자 분석 시스템을 사용하여 복수의 입자들을 이미징하기 위한 방법을 포함한다. 본 시스템은 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱(combined viscosity and geometric hydrofocusing)을 위해 구성될 수 있다. 입자들은 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중에 포함될 수 있다. 예시적인 방법은 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체를 유동시키는 단계를 포함할 수 있으며, 시스 유체는 사전결정된 점도 차이 범위 내의 일정 점도 차이만큼 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 가질 수 있다. 방법은 또한 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 혈액 유체 샘플을 주입하여, 시스 유체에 의해 봉입된 샘플 유체 스트림을 제공하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 방법은 샘플 유체 스트림 및 시스 유체를 유로 크기의 감소부를 통해 이미징 영역을 향해 유동시켜, 점도 차이와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 스트림 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과가, 유로 크기의 감소부와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 스트림 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 샘플 유체 스트림 내의 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하는 데 효과적이도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 더욱이, 방법은 이미징 영역에서 복수의 입자들을 이미징하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 시스 유체는 굴절률 n = 1.3330을 갖는다. 일부 경우에, 시스 유체는 물의 굴절률과 동일한 굴절률을 갖는다. 일부 경우에, 유로 크기의 감소부와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 스트림 사이의 상호작용은 복수의 입자 상에 전단력을 생성함으로써 표적 이미징 상태를 제공하는 데 기여한다. 일부 경우에, 표적 이미징 상태는 이미징 영역에서 이미지를 획득하는 데 사용되는 이미징 디바이스의 초점 평면에 대한 유동 중인 하나 이상의 표적 입자들의 표적 배향을 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, 이미징 영역에서의 유로는 초점 평면에 사실상 평행한 평면을 한정한다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 정렬은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 정렬은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 초점 평면 내에 있다. 일부 경우에, 표적 위치는 초점 평면으로부터 일정 거리에 있으며, 이러한 거리는 위치 공차(positional tolerance)에 상응한다. 일부 경우에, 표적 배향은 초점 평면에 대한 표적 정렬 및 초점 평면에 대한 표적 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 이미징 상태는 이미징 영역에서 이미지를 획득하는 데 사용되는 이미징 디바이스의 초점 평면에 대한 유동 중인 하나 이상의 표적 입자내 구조들의 표적 배향에 상응한다. 일부 경우에, 이미징 영역에서의 유로는 초점 평면에 사실상 평행한 평면을 한정한다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 정렬은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 정렬은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 초점 평면 내에 있다. 일부 경우에, 표적 위치는 초점 평면으로부터 일정 거리에 있으며, 이러한 거리는 위치 공차에 상응한다. 일부 경우에, 표적 배향은 초점 평면에 대한 표적 정렬 및 초점 평면에 대한 표적 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 이미징 상태는 하나 이상의 표적 입자들 또는 하나 이상의 표적 입자내 구조들의 표적 변형에 상응한다.
일부 실시 형태에 따르면, 혈액 유체 샘플을 주입하는 과정은 혈액 유체 샘플의 스트림을 샘플 유체 속도로 샘플 주입관을 통해 지향시킴으로써 수행된다. 주입관은 유로 내에 포트를 가질 수 있다. 이러한 포트는 유로를 따라 연장되는 유동 축, 두께 및 폭을 한정할 수 있다. 샘플 스트림이 이미징 영역에 인접한 이미징 경로에 대해 횡방향인 대향하는 주 표면들을 갖도록 폭이 두께보다 더 클 수 있다. 일부 경우에, 플로우셀의 유로를 따라 유동하는 시스 유체는 샘플 스트림의 주 표면들을 따라 연장되고, 샘플 유체 속도와 상이한 시스 유체 속도를 갖는다. 일부 경우에, 상이한 속도와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용은, 상이한 점도와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용과 조합하여, 표적 이미징 상태를 제공한다. 일부 실시 형태에 따르면, 복수의 입자들은 적혈구, 백혈구, 및/또는 혈소판을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 복수의 입자들은 입자내 구조를 갖는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 입자내 구조는 세포내 구조, 세포소기관, 또는 엽일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 시스 유체는 점도가 1 내지 10 센티푸아즈(cP)이다. 일부 경우에, 사전결정된 점도 차이는 약 0.1 내지 약 10 센티푸아즈(cP) 범위의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 사전결정된 점도 차이는 약 1.0 내지 약 9.0 센티푸아즈(cP) 범위의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 사전결정된 점도 차이는 약 1.0 내지 약 5.0 센티푸아즈(cP) 범위의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 사전결정된 점도 차이는 약 3.0 센티푸아즈(cP)의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제에는 글리세롤, 글리세롤 유도체, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 수용성 중합체(들), 및/또는 덱스트란이 포함된다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 약 1 내지 약 50% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 글리세롤 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 5% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤, 및 1% (w/v)의 농도로 존재하는 글리세롤 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 작동 조건 하에서 약 3 내지 약 30% (v/v)의 최종 농도로 존재하는 글리세롤을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 작동 조건 하에서 약 30% (v/v)의 최종 농도로 존재하는 글리세롤을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 작동 조건 하에서 약 6.5% v/v의 최종 농도로 존재하는 글리세롤을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 작동 조건 하에서 약 5% (v/v)의 최종 농도로 존재하는 글리세롤 및 약 1% (w/v)의 농도로 존재하는 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, 이미징 영역에서의 혈액 유체 샘플은 20 내지 200 mm/sec 범위의 선속도(linear velocity)를 갖는다. 일부 경우에, 이미징 영역에서의 혈액 유체 샘플은 50 내지 150 mm/sec 범위의 선속도를 갖는다. 일부 경우에, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 최대 7 μm의 샘플 스트림 두께 및 500 내지 3000 μm 범위의 샘플 스트림 폭을 갖는다. 일부 경우에, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 2 내지 4 μm 범위의 샘플 스트림 두께 및 1000 내지 2000 μm 범위의 샘플 스트림 폭을 갖는다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 비구형 입자들의 세트를 포함하고, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 유동 방향을 가지며, 비구형 입자들의 세트의 75% 초과가 유동 방향에 평행한 평면 내에 사실상 정렬되어, 각각의 정렬된 비구형 입자의 주 표면이 유동 방향에 평행한 평면에 평행하도록 된다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 비구형 입자들의 세트를 포함하고, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 유동 방향을 가지며, 비구형 입자들의 세트의 90% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면으로부터 20도 이내에 정렬된다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 입자내 구조들을 포함하고, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 유동 방향을 가지며, 입자내 구조들의 92% 이상이 유동 방향에 사실상 평행하다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중의 복수의 입자들을 이미징하기 위한 시스템을 포함한다. 본 시스템은 사전결정된 점도 차이 범위 내의 일정 점도 차이만큼 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 갖는 시스 유체와 함께 사용하도록 구성될 수 있다. 예시적인 시스템은, 유로 - 유로는 유로 크기의 감소부를 구비함 - 및 샘플 유체 주입관을 갖는 플로우셀, 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체의 유동을 전송하도록 하기 위해 플로우셀의 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구, 및 시스 유체 및 샘플 유체가 유로 크기의 감소부를 통해 이미징 영역을 향해 유동함에 따라, 점도 차이와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과가, 유로 크기의 감소부와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 샘플 유체 스트림 내의 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하도록, 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 혈액 유체 샘플의 유동을 주입하도록 하기 위해 플로우셀의 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 샘플 입구를 포함할 수 있다. 시스템은 이미징 영역에서 복수의 입자들을 이미징하는 이미징 디바이스를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 표적 이미징 상태는 이미징 영역에서 이미지를 획득하는 데 사용되는 이미징 디바이스의 초점 평면에 대한 유동 중인 하나 이상의 표적 입자들의 표적 배향에 상응한다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 적혈구, 백혈구, 및 혈소판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원을 포함한다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 입자내 구조를 갖는 세포를 포함한다. 세포내 구조는 세포내 구조, 세포소기관, 또는 엽일 수 있다. 일부 경우에, 사전결정된 점도 차이는 약 0.1 내지 약 10 센티푸아즈(cP) 범위의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제에는 글리세롤, 글리세롤 유도체, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 수용성 중합체(들), 및/또는 덱스트란이 포함된다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 약 1 내지 약 50% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 글리세롤 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 5% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤, 및 1% (w/v)의 농도로 존재하는 글리세롤 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, 복수의 입자들은 비구형 입자들의 세트를 포함하고, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 유동 방향을 가지며, 비구형 입자들의 세트의 90% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면으로부터 20도 이내에 정렬된다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자 배향에 상응한다. 일부 실시 형태에서, 입자는 적혈구, 백혈구, 또는 혈소판일 수 있다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 배향에 상응한다. (예를 들어, 입자내 구조는 세포내 구조, 세포소기관, 또는 엽일 수 있다). 일부 경우에, 이미징 영역에서의 유로는 초점 평면에 사실상 평행한 평면을 한정한다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 정렬은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 정렬은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 정렬에 상응한다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 위치는 초점 평면 내에 있다. 일부 경우에, 표적 위치는 초점 평면으로부터 일정 거리에 있으며, 이러한 거리는 위치 공차에 상응한다. 일부 경우에, 표적 배향은 초점 평면에 대한 표적 정렬 및 초점 평면에 대한 표적 위치에 상응한다. 일부 경우에, 표적 이미징 상태는 이미징 영역에서의 표적 변형에 상응한다.
일부 실시 형태에 따르면, 혈액 유체 샘플 공급원은 샘플 유체 속도를 갖는 혈액 유체 샘플을 유동하는 시스 유체 내로 제공하도록 구성될 수 있는데, 이때 시스 유체는 샘플 유체 속도와 상이한 시스 유체 속도를 갖도록 한다. 일부 경우에, 상이한 속도와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용은, 상이한 점도와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용과 조합하여, 표적 이미징 상태를 제공한다.
일부 실시 형태에 따르면, 플로우셀의 유로는 유로 크기의 변화를 갖는 구역을 포함하며, 유로 크기의 변화와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용은, 상이한 점도와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용과 조합하여, 표적 이미징 상태를 제공한다. 일부 경우에, 유로 크기의 변화와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용은 측방향 유체 압축력을 생성함으로써 표적 이미징 상태를 제공하는 데 기여한다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 적혈구, 백혈구, 및/또는 혈소판을 포함한다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 입자내 구조를 갖는 세포를 포함하며, 이러한 구조는 세포내 구조, 세포소기관, 또는 엽일 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 사전결정된 점도 차이는 약 0.1 내지 약 10 센티푸아즈(cP) 범위의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 사전결정된 점도 차이는 약 1.0 내지 약 9.0 센티푸아즈(cP) 범위의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 사전결정된 점도 차이는 약 1.0 내지 약 5.0 센티푸아즈(cP) 범위의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 사전결정된 점도 차이는 약 3.0 센티푸아즈(cP)의 절대값을 갖는다. 일부 경우에, 시스 유체는 글리세롤, 글리세롤 유도체, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 수용성 중합체(들), 및/또는 덱스트란을 포함할 수 있는 점도제를 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체는 약 1 내지 약 50% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤을 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, 이미징 영역에서의 혈액 유체 샘플은 20 내지 200 mm/sec 범위의 선속도를 갖는다. 일부 경우에, 이미징 영역에서의 혈액 유체 샘플은 50 내지 150 mm/sec 범위의 선속도를 갖는다. 일부 경우에, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 최대 7 μm의 샘플 스트림 두께 및 500 μm 초과의 샘플 스트림 폭을 갖는다. 일부 경우에, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 2 내지 4 μm 범위의 샘플 스트림 두께 및 1000 내지 2000 μm 범위의 샘플 스트림 폭을 갖는다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 비구형 입자들의 세트를 포함하고, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 유동 방향을 가지며, 비구형 입자들의 세트의 90% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬되고/되거나 위치된다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 비구형 입자들의 세트를 포함하고, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 유동 방향을 가지며, 비구형 입자들의 세트의 95% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면으로부터 20도 이내에 정렬된다. 일부 경우에, 복수의 입자들은 입자내 구조들을 포함하고, 혈액 유체 샘플은 이미징 영역에서 유동 방향을 가지며, 입자내 구조들의 92% 이상이 유동 방향에 사실상 평행하다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱 분석기에서 사용하기 위한 입자 및 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL)를 포함한다. PIOAL은 시각적 분석기의 협소화 플로우셀 전이 구역 내로 주입되는 주어진 점도의 혈액 샘플 유체의 유동을 지향시켜 PIOAL에 의해 봉입된 샘플 유체 스트림을 생성하도록 할 수 있다. PIOAL은 혈액 샘플 유체의 점도보다 더 높은 점도를 갖는 유체를 포함할 수 있다. 점도 차이와 관련된 PIOAL 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과는, 협소화 플로우셀 전이 구역과 관련된 PIOAL 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 샘플 유체 스트림 내의 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, PIOAL 내의 점도제가 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 시각적 분석기의 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하는 데 효과적이다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제에는 글리세롤, 글리세롤 유도체, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 수용성 중합체(들), 및/또는 덱스트란이 포함된다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 약 1 내지 약 50% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤을 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. 일부 경우에, 폴리비닐피롤리돈(PVP)은 1% (w/v)의 농도로 존재한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 글리세롤을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 시스 유체의 점도제는 5% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤, 및 1% (w/v)의 농도로 존재하는 글리세롤 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. 일부 경우에, PIOAL은 점도가 약 1 내지 10 cP이다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 유로 내에서 주어진 점도의 샘플의 유동을 지향시키도록 구성된 시각적 분석기에서 사용하기 위한 입자 및 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL)를 포함한다. PIOAL은 샘플의 점도보다 더 높은 점도를 갖는 유체를 포함할 수 있다. PIOAL은, 샘플의 유동을 지지하고, 입자들을 정렬하여 유로 내에서 유동하는 세포들의 입자들 및 세포내 세포소기관들의 인-포커스 내용물을 증가시킴으로써, 세포들의 정렬된 입자들 및 세포내 세포소기관들이 이미징될 수 있게 하는 데 효과적일 수 있다. 일부 경우에, PIOAL은 점도제를 추가로 포함한다. 일부 경우에, PIOAL은 완충제, pH 조정제, 항미생물제, 이온 강도 개질제, 계면활성제, 및/또는 킬레이트화제를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 입자 및 세포내 세포소기관 정렬 액체는 등장성(isotonic)이다. 일부 경우에, 입자 및 세포내 세포소기관 정렬 액체는 염화나트륨을 포함한다. 일부 경우에, 염화나트륨은 약 0.9%의 농도로 존재한다. 일부 경우에, PIOAL 샘플의 pH는 작동 조건 하에서 약 6.0 내지 약 8.0이다. 일부 경우에, PIOAL 샘플 혼합물의 pH는 작동 조건 하에서 약 6.5 내지 약 7.5이다. 일부 경우에, PIOAL은 작동 조건 하에서 pH가 약 6.8 내지 약 7.2에 있도록 조정하기 위한 pH 조정제를 포함한다. 일부 경우에, PIOAL 액체의 목표 점도는 작동 조건 하에서 약 1 내지 10 센티푸아즈이다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 농축된 PIOAL의 스톡 용액(stock solution)을 포함한다. 일부 경우에, 농축된 스톡 용액은 목표 점도를 달성하도록 희석될 수 있다. 일부 경우에, 스톡 용액의 농도는 작동 조건 하에서 PIOAL의 약 1.1x 이상 내지 약 100x 이상의 농도로 존재한다. 일부 경우에, 점도제는 글리세롤, 글리세롤 유도체; PVP, CMC, 에틸렌 글리콜; 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판); 폴리에틸렌 글리콜; 수용성 중합체 및 덱스트란 중 적어도 하나로부터 선택된다. 일부 경우에, 점도제는 글리세롤을 포함한다. 일부 경우에, 점도제는 글리세롤 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. 일부 경우에, 점도제는 글리세롤 및 카르복시메틸셀룰로스(CMC)를 포함한다. 일부 경우에, 점도제는 글리세롤 및 덱스트란 설페이트를 포함한다. 일부 경우에, 점도제는 글리세롤 유도체를 포함한다. 일부 경우에, 점도제 PVP를 포함한다. 일부 경우에, 점도제는 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판)을 포함한다. 일부 경우에, 점도제는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 경우에, 점도제는 수용성 덱스트란을 포함한다. 일부 경우에, 글리세롤은 작동 조건 하에서 약 1 내지 약 50% (v/v)의 최종 농도로 존재한다. 일부 경우에, 상기 글리세롤은 작동 조건 하에서 약 3 내지 약 30% (v/v)의 최종 농도로 존재한다. 일부 경우에, 상기 글리세롤은 작동 조건 하에서 약 30% (v/v)의 최종 농도로 존재한다. 일부 경우에, 상기 글리세롤은 작동 조건 하에서 약 6.5% v/v의 최종 농도로 존재한다. 일부 경우에, 상기 글리세롤은 작동 조건 하에서 약 5% v/v의 최종 농도로 존재하고, PVP는 약 1% w/v의 농도로 존재한다. 일부 경우에, 상기 PVP는 작동 조건 하에서 약 1% w/v의 최종 농도로 존재한다. 일부 경우에, 본 발명의 실시 형태들은 본 명세서에 개시된 바와 같은 PIOAL을 포함하는 키트(kit)를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중의 복수의 세포들을 분석하기 위한 방법을 포함하는데, 이러한 세포들은 대향하는 주 표면들을 갖는다. 예시적인 방법은 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체를 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 시스 유체는 샘플 유체 점도보다 더 높은 시스 유체 점도를 가질 수 있다. 방법은 또한 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 혈액 유체 샘플을 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 세포들은 이미징 경로의 배향에 대해 횡방향으로 배향되는 주 표면들을 갖는 제1 하위세트를 포함할 수 있다. 방법은 또한 이미징 영역에서 이미징 경로를 따라 입자들을 이미징하는 단계를 포함할 수 있는데, 이미징하는 동안에 복수의 세포들은 이미징 경로에 대해 횡방향으로 배향되는 주 표면들을 갖는 제2 하위세트를 포함하며, 제2 하위세트는 제1 하위세트보다 더 많다. 방법은 또한, 상이한 점도와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용이 복수의 세포들 중 적어도 일부를 재배향시켜 제2 하위세트가 제1 하위세트보다 더 많아지도록, 유로 크기의 감소부를 통해 혈액 유체 샘플 및 시스 유체를 지향시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중의 복수의 세포들을 이미징하기 위한 시스템을 포함한다. 시스템은 샘플 유체 점도보다 더 높은 시스 유체 점도를 갖는 시스 유체와 함께 사용하도록 구성될 수 있으며, 이때 세포들은 대향하는 주 표면들을 갖는다. 예시적인 시스템은, 유로 및 샘플 유체 주입관을 갖는 플로우셀, 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체의 유동을 전송하도록 하기 위해 플로우셀의 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구, 및 복수의 주입된 세포들이 이미징 경로의 배향에 대해 횡방향으로 정렬되는 주 표면들을 갖는 제1 하위세트를 포함하도록, 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 혈액 유체 샘플의 유동을 주입하도록 하기 위해 플로우셀의 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 샘플 입구를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 플로우셀의 유로는 상이한 점도와 관련된 시스 유체와 혈액 샘플 유체 사이의 상호작용이 입자들 중 적어도 일부를 재배향시키도록 구성된 유로 크기의 변화를 갖는 구역을 가질 수 있다. 시스템은 또한 이미징 영역에서 이미징 경로를 따라 복수의 입자들을 이미징하는 이미징 디바이스를 포함할 수 있으며, 이미징하는 동안에 복수의 세포들의 제2 하위세트의 주 표면들은 이미징 경로에 대해 횡방향으로 배향된다.
일 태양에서, 본 발명은 입자를 이미징하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 방법은 본 발명의 입자 조영제 조성물을 사용하여 샘플 중의 입자들을 처리하는 단계; 염색된 입자를 플로우셀 및 오토포커스 장치를 포함하는 시각적 분석기 내에서 광으로 조명하는 단계; 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL) 내에 봉입된 입자의 디지털화 이미지를 얻는 단계; 및 이미지 정보에 기초하여 샘플 중의 입자를 분석하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 입자는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 적혈구(RBC), 아세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 적혈구(RBC), 혈소판, 세포, 세균, 미립자 물질, 세포 응괴(cell clump), 또는 세포 단편 또는 성분 중 적어도 하나로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 본 장치는 자동화 이미지-기반 백혈구(WBC) 감별 카운팅뿐만 아니라, 대상체가 건강한지 또는 질병, 질환, 또는 감염을 갖는지, 그리고/또는 치료에 반응성인지 또는 비반응성인지를 결정, 진단, 예후, 예측, 및/또는 그러한지의 진단을 지원하는 데 유용한 형태학적 비정상의 자동화 식별에도 사용될 수 있다.
일 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 위해 구성된 입자 분석 시스템을 사용하여 입자들을 이미징하기 위한 방법을 포함한다. 입자들은 혈액 유체 샘플의 제1 및 제2 샘플 유체 중에 포함될 수 있다. 예시적인 방법에는 입자 분석기의 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체를 유동시키는 단계를 포함할 수 있으며, 시스 유체는 혈액 유체 샘플의 점도와 상이한 점도를 가질 수 있다. 일부 경우에, 시스 유체는 점도 차이만큼 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 가지며, 이러한 점도 차이는 사전결정된 점도 차이 범위의 값을 갖는다. 방법은 또한 제1 샘플 유체를 샘플 유체 주입관으로부터 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여, 주입관에 인접하여 제1 두께를 갖는 샘플 유체 스트림을 제공하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 플로우셀의 유로는, 샘플 유체 스트림의 두께가 초기 두께로부터 이미지 캡처 영역에 인접하여 제2 두께로 감소되도록 한 유로 크기의 감소부를 가질 수 있다. 방법은 플로우셀의 이미지 캡처 영역에서 제1 샘플 유체로부터의 제1 복수의 입자들을 이미징하는 단계, 및 유동하는 시스 유체 내로의 제1 샘플 유체의 주입을 종료하고 유동하는 시스 유체 내로 제2 샘플 유체를 주입함으로써 샘플 유체 과도상태(transient)를 개시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 방법은 플로우셀의 이미지 캡처 영역에서 제2 샘플 유체로부터의 제2 복수의 입자들을 이미징하는 단계를 포함할 수 있다. 제2 복수의 입자들의 이미징은 사실상 샘플 유체 과도상태 후에 그리고 제1 복수의 입자들을 이미징하고 나서 4초 이내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 유로 크기의 감소부는, 근위 두께를 갖는 근위 유로 부분, 및 근위 두께보다 더 작은 원위 두께를 갖는 원위 유로 부분에 의해 한정된다. 샘플 유체 주입관의 하류 단부가 근위 유로 부분에 대해 원위에 위치될 수 있다. 시스 유체와 혈액 유체 샘플 사이의 점도 차이는, 유로 크기의 감소부와 조합하여, 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 제1 및 제2 샘플 유체 중의 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 이미지 캡처 영역에서 제1 및 제2 샘플 유체를 하이드로포커싱하기에 효과적일 수 있다.
일부 방법에서, 주입관은, 주입관의 유동 영역 단면 대 플로우셀의 유동 영역 단면의 비, 주입관의 유동 영역 단면 대 플로우셀의 외경의 비, 또는 주입관의 유동 영역 단면 대 샘플 스트림의 유동 영역 단면의 비에 기초한 내부 부피를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유로 크기의 감소부는, 샘플 유체 스트림의 제1 및 제2 두께를 이등분하는 횡방향 평면(transverse plane) 주위에서 대체로 대칭인 유로를 따라 반경방향으로 내향으로 경사지는 유로의 대향되는 벽들에 의해 한정될 수 있다. 일부 경우에, 유로 크기의 감소부에서의 대칭이 혈액 유체 샘플 내에서의 적혈구 이미징 배향 오정렬을 약 20% 미만으로 제한하는 데 효과적이다. 일부 경우에, 혈액 유체 샘플은 구형 입자들을 포함하고, 샘플 유체와 시스 유체 사이의 점도 차이가 플로우셀의 이미지 캡처 영역에서 초점 평면 내에 구형 입자들의 세포내 세포소기관들을 정렬시키기에 효과적이다. 일부 경우에, 샘플 유체 주입관의 원위 부분이 이미지 캡처 영역으로부터 축상 분리 거리에 위치되며, 축상 분리 거리는 약 16 mm 내지 약 26 mm 범위의 값을 갖는다. 일부 경우에, 주입관은 약 30 μL 미만의 내부 부피를 갖는다.
일부 방법에서, 주입관은 제1 유동 단면적을 갖는 근위 부분 및 제2 유동 단면적을 갖는 원위 부분을 가지며, 근위 부분의 유동 단면적은 원위 부분의 유동 단면적보다 1.5배 더 크다. 일부 방법에서, 주입관은 근위 부분과 원위 부분 사이에 배치된 중심 부분을 가지며, 중심 부분은 제3 유동 단면을 가지며, 제3 유동 단면은 제1 및 제2 유동 단면보다 더 크다.
일부 방법에서, 샘플 유체 주입관의 원위 부분은 높이 및 폭을 갖는 출구를 포함하며, 높이는 폭보다 더 작을 수 있다. 일부 경우에, 높이는 약 150 μm이고, 폭은 약 1350 μm이다. 일부 경우에, 높이는 약 50 μm 내지 약 250 μm 범위의 값을 갖고, 폭은 약 500 μm 내지 약 3000 μm 범위의 값을 갖는다.
일부 방법에서, 시스 유체 유량 대 샘플 유체 유량의 비는 약 70이다. 일부 경우에, 시스 유체 유량 대 샘플 유체 유량의 비는 약 200이다. 일부 경우에, 시스 유체는 약 35 μL/s의 유량을 갖고, 샘플 유체는 약 0.5 μL/s의 유량을 갖는다. 일부 경우에, 샘플 유체는 이미지 캡처 영역에서 약 20 내지 200 mm/sec의 속도를 갖는다. 일부 경우에, 시스 유체 속도와 유체 샘플 속도는 주입관 출구 부근의 유로 위치에서 상이할 수 있고, 시스 유체 속도와 유체 샘플 속도는 이미지 캡처 영역에서 동일할 수 있다. 일부 경우에, 샘플 유체 스트림의 제1 두께는 약 150 μm인데, 예를 들어 샘플 유체가 주입관을 빠져나가는 경우에 그러하다. 일부 경우에, 샘플 유체 스트림의 제2 두께는 약 2 μm 내지 약 10 μm의 범위인데, 예를 들어 샘플 유체 스트림이 이미지 캡처 영역을 통해 유동하는 경우에 그러하다. 일부 경우에, 샘플 유체 스트림의 제2 두께는 약 2 μm 내지 약 4 μm의 범위이다. 일부 경우에, 샘플 유체 스트림의 제1 두께 대 샘플 유체 스트림의 제2 두께의 비가 약 20:1 내지 약 70:1 범위의 값을 갖는다. 일부 경우에, 샘플 유체 스트림의 제1 두께 대 샘플 유체 스트림의 제2 두께의 비가 약 5:1 내지 약 200:1 범위의 값을 갖는다. 일부 경우에, 근위 유로 부분의 근위 두께 대 원위 유로 부분의 원위 두께의 비가 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 및 200:1로 이루어진 군으로부터 선택되는 기하학적 박형화 값(geometric thinning value)을 갖는다. 일부 경우에, 플로우셀은 약 50:1의 최소 압축비 및 약 125:1의 최대 압축비를 갖는다.
일부 방법에서, 플로우셀은, 플로우셀 내에서 유동하는 시스 유체 및 샘플 유체가 중력에 대항하여 유동하도록 배향된다. 일부 경우에, 플로우셀은, 플로우셀 내에서 유동하는 시스 유체 및 샘플 유체가 중력에 따라 유동하도록 배향된다. 예시적인 방법은 또한 유동하는 샘플 유체로부터 버블을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 제1 샘플 유체는, 샘플 유체 주입관으로부터 유동하는 시스 유체 내로의 제1 샘플 유체의 주입 후, 약 1 내지 3초 이내에 안정화 상태에 도달한다. 일부 경우에, 제1 샘플 유체는, 샘플 유체 주입관으로부터 유동하는 시스 유체 내로의 제1 샘플 유체의 주입 후, 1 초 미만 이내에 안정화 상태에 도달한다. 일부 경우에, 제1 샘플 유체는, 샘플 유체 주입관으로부터 유동하는 시스 유체 내로 제1 샘플 유체를 주입하고 나서, 약 1.8초 이내에 안정화 상태에 도달한다. 일부 경우에, 샘플 유체는 플로우셀을 통과하는 수송 시간이 약 2 내지 4초의 범위이다. 일부 경우에, 이미지 캡처 영역은 약 150 μm × 150 μm 내지 400 μm × 400 μm의 시야를 갖는다. 일부 경우에, 제1 샘플 유체는 약 50 내지 약 150 μL 범위의 부피를 갖는다. 일부 경우에, 주입관의 근위 부분은 샘플 입구 피팅(sample inlet fitting)의 샘플 포트에 커플링된다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 수행하는 입자 분석 시스템을 포함한다. 입자들은 제1 및 제2 샘플 유체 중에 포함될 수 있다. 예시적인 시스템은 시스 유체의 유동을 전송하도록 구성된 유로를 갖는 플로우셀을 포함할 수 있다. 시스 유체는 혈액 유체 샘플의 점도와 상이한 점도를 가질 수 있다. 일부 경우에, 시스 유체 점도는 혈액 유체 샘플 점도보다 더 크다. 일부 경우에, 시스 유체는 점도 차이만큼 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 가지며, 이러한 점도 차이는 사전결정된 점도 차이 범위의 값을 갖는다. 시스템은 또한 유로와 유체 연통하는 샘플 유체 주입 시스템을 포함할 수 있다. 샘플 유체 주입 시스템은 샘플 유체를 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여, 주입관에 인접하여 제1 두께를 갖는 샘플 유체 스트림을 제공하도록 구성될 수 있다. 플로우셀의 유로는, 샘플 유체 스트림의 두께가 초기 두께로부터 이미지 캡처 영역에 인접하여 제2 두께로 감소되도록 한 유로 크기의 감소부를 가질 수 있다. 또한, 시스템은 플로우셀의 이미지 캡처 영역에서 제1 샘플 유체로부터의 제1 복수의 입자들을 이미징하도록 하기 위해 이미지 캡처 영역과 정렬된 이미지 캡처 디바이스를 포함할 수 있다. 더욱이, 시스템은 샘플 유체 주입기 시스템 및 이미지 캡처 디바이스와 커플링된 프로세서를 포함할 수 있다. 프로세서는, 유동하는 시스 유체 내로의 제1 샘플 유체의 주입을 종료하고 유동하는 시스 유체 내로 제2 샘플 유체를 주입하여 샘플 유체 과도상태가 개시되도록 하고, 샘플 유체 과도상태 후에 그리고 제1 복수의 입자들을 이미징하고 나서 4초 이내에 플로우셀의 이미지 캡처 영역에서 제2 샘플 유체로부터의 제2 복수의 입자들을 이미징하도록 구성될 수 있다. 예시적인 시스템에서, 시스 유체와 혈액 유체 샘플 사이의 점도 차이는, 유로 크기의 감소부와 조합하여, 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 제1 및 제2 샘플 유체 중의 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 플로우셀의 이미지 캡처 영역에서 제1 및 제2 샘플 유체를 하이드로포커싱하기에 효과적이다.
일부 시스템에서, 주입관은, 주입관의 유동 영역 단면 대 플로우셀의 유동 영역 단면의 비, 주입관의 유동 영역 단면 대 플로우셀의 외경의 비, 또는 주입관의 유동 영역 단면 대 샘플 스트림의 유동 영역 단면의 비에 기초한 내부 부피를 포함한다. 일부 경우에, 유로 크기의 감소부는, 샘플 유체 스트림의 제1 및 제2 두께를 이등분하는 횡방향 평면 주위에서 대체로 대칭인 유로를 따라 반경방향으로 내향으로 경사지는 유로의 대향되는 벽들에 의해 한정된다. 일부 경우에, 유로 크기의 감소부에서의 대칭이 혈액 유체 샘플 내에서의 적혈구 이미징 배향 오정렬을 약 20% 미만으로 제한하는 데 효과적이다. 일부 경우에, 샘플 유체 주입관의 원위 부분이 이미지 캡처 영역으로부터 축상 분리 거리에 위치되며, 축상 분리 거리는 약 16 mm 내지 약 26 mm 범위의 값을 갖는다. 일부 경우에, 주입관은 제1 유동 단면적을 갖는 근위 부분 및 제2 유동 단면적을 갖는 원위 부분을 포함하며, 근위 부분의 유동 단면적은 원위 부분의 유동 단면적보다 1.5배 더 크다. 일부 경우에, 샘플 유체는 플로우셀을 통과하는 수송 시간이 약 2 내지 4초의 범위이다. 일부 경우에, 플로우셀은, 이미징 영역에서 유로를 따르는 시스 유체의 제2 유동 방향에 직각인 제1 유동 방향으로, 시스 유체를 시스 유체 공급원으로부터 유로 내로 받아들이도록 구성된다. 일부 경우에, 플로우셀은 이미지 캡처 디바이스를 위한 오토포커스 표적을 포함한다.
본 발명의 실시 형태들은, 예시적인 동적 또는 검출 범위 확대 기술을 사용하여, 혈액 유체 샘플 중에 존재하는 세포들 또는 입자들을 정량화하기 위한 시스템 및 방법을 포함한다.
예를 들어, 예시적인 실시 형태들은, 입자 부피와 같은 파라미터에 기초하여, 적어도 하나의 검출 범위와 관련된 부정확한 입자 카운트를 정정하기 위한 기술을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 작동시킴으로써, 농도에 대해 그리고/또는 부피 기준으로 검출 범위 밖에 있는 입자들이 정확하게 검출 및 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 명세서에 나타낸 입자 카운터와 관련된 용어 "검출 한계" 또는 "검출 범위의 밖"은 일정 범위를 포함하며, 이러한 범위 내에서 입자 카운트는 더 정확하고/하거나 이러한 범위 밖에서 입자 카운트는 덜 정확하거나 심지어 실시불가능한 것으로 이해될 것이다. 검출 범위는 검출 상한 및/또는 검출 하한을 포함할 수 있으며, 이들은 전형적으로는 최대 또는 최소 농도로 표현되지만, 또한 가능하게는 입자들이 주어진 정확도 공차 내에서 카운팅되는 최대 또는 최소 빈도수로도 표현된다. 따라서, 본 발명의 실시 형태들은 희박한 종 및/또는 방대한 종의 카운트를 정량화하기 위한 혈액 유체 샘플의 평행 플로우셀 및 임피던스 분석을 위한 시스템 및 방법을 포함한다.
검출 범위는 농도를 기준으로 할 수 있으며, 이에는 국소 농도, 및/또는 다른 명시된 기준 또는 기준들이 포함될 수 있다. 예를 들어, 정상 PLT(즉, 직경이 2 μm 미만인 PLT)보다 더 작은 혈구 또는 단편과 같은 입자는 입자 카운터에서 정확하게 검출 및 카운팅하기가 어려울 수 있다. 정상 백혈구(즉, 직경이 15 μm 초과인 백혈구)보다 더 큰 비정상 세포는 입자 카운터에서 정확하게 검출 및 카운팅하기가 어려울 수 있다. 게다가, 높은 농도에서, RBC 및 PLT는 정확하게 카운팅하기가 어려울 수 있다. 희석 후에도, RBC 및 PLT는 응집되어 응괴(clump)를 형성할 수 있으며, 그 결과 입자 카운터를 사용하여 얻어진 입자 카운트의 잘못된 판독을 가져올 수 있다. 더욱이, 낮은 농도로 샘플 중에 존재하는 일부 미성숙 또는 비정상 혈구들의 정확한 카운트를 제공하기가 어렵다.
일 예로서, 본 명세서에 기재된 장치를 사용함으로써, 측정의 검출 범위, WBC에 대한 검출 상한은 일부 실시 형태에서 (단위 부피)당 최대 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 또는 1,000,000으로 확대될 수 있다. PLT에 대한 검출 하한은 일부 실시 형태에서 μl당 20,000, 19,000, 18,000, 17,000, 16,000, 15,000, 14,000, 13,000, 12,000, 11,000, 10,000, 9,500, 9,000, 8,500, 8,000, 7,500, 7,000, 6,500, 6,000, 5,500, 5,000, 4,500, 4,000, 3,500, 3,000, 2,500, 2,000, 1,500 또는 1,000, 또는 500 미만으로 확대될 수 있다.
이와 관련하여, 예시적인 실시 형태들은 하나의 채널 내에서 검출되는 입자들의 상이한 부류들(각각의 부류의 구성원들을 포함함)을 감별함으로써 입자 카운터에서 얻어진 부정확한 결과를 정정하기 위한 기술을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 입자들은 유사한 부피 또는 형태를 가지며, 하나의 채널 내에서 검출될 수 있다. 예를 들어, "거대(giant)" PLT, PLT 응집체(aggregate) 또는 응괴, 및 유핵 RBC는 WBC를 검출하도록 설계된 하나의 채널 내에서 "WBC"로서 카운팅될 수 있다. 게다가, 비용해(unlysed) 세포, 저온글로불린(cryoglobulin), 하인즈 소체(heinz body), 및 말라리아 기생충과 같은 다른 종들이 "WBC"로 카운팅되어, 샘플 중에 실제로 존재하는 것보다 더 높은 WBC 카운트를 제공할 수 있다. 유사하게, 높은 농도의 WBC 및 거대 PLT는 "RBC"로 카운팅될 수 있으며, 그 결과 RBC 카운트가 실제값보다 더 높아지게 된다. 소구성(microcytic) 적혈구, 적혈구 봉입체, 백혈구 단편, 먼지 입자, 용혈/분열적혈구(Schistocyte), 및 심지어 전자/전기 노이즈(noise)의 존재는 실제보다 더 높은 PLT의 카운트를 가져올 수 있다. 다른 한편으로, 동일한 부류 내의 혈병형성 및 압좌(smudge) 세포들, 또는 한 부류의 세포들과 다른 한 부류의 세포들의 혼돈(confusion)은 입자 카운터 상에서의 상응하는 부류의 세포들의 부정확하고 더 낮은 카운트를 가져올 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 태양에서, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위를 초과하는 농도로 샘플 중에 존재하고; 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 내에서 샘플 중에 존재한다. 본 발명의 방법의 다른 태양들에서, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출가능한 범위 미만의 농도로 샘플 중에 존재하고, 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 내에서 샘플 중에 존재한다. 다른 태양들에서, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주는 비정상 혈구, 미성숙 혈구, 응괴된 혈구, 직경이 15 마이크로미터보다 더 큰 혈구, 및 직경이 2 마이크로미터보다 더 작은 혈구 중 적어도 하나의 유형을 포함하고, 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주는 백혈구를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 작동시킴으로써, 입자 카운터의 하나의 채널 내에서 다른 유형의 입자로 잘못 카운팅된 입자들이 별도로 그리고 정확하게 측정될 수 있다. 예시적인 방법은 또한 입자 카운터 상에서 정확하게 검출될 수 없는 입자들의 농도 또는 입자 카운트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 입자들에는 입자 카운터 상에서 검출가능한 농도의 상한 또는 하한 부근 또는 밖의 농도로 존재하는 입자들 및/또는 정상 부피 범위 밖에 있는 입자들이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이와 관련하여, 기재된 바와 같은 시스템 장치, 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예시적인 입자 조영제 조성물 및 PIOAL과 조합된 이미지 분석기 및 입자 카운터를 포함하는 시스템 장치를 작동시킴으로써, 입자 카운터의 하나의 채널 내에서 다른 유형의 입자로서 잘못 카운팅될 수 있는 일부 입자들이 별도로 그리고 정확하게 측정될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 일부 경우에 입자 카운터 상에서 정확하게 검출될 수 없는 입자들의 농도 또는 입자 카운트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 입자들에는 입자 카운터 상에서 검출가능한 농도의 상한 또는 하한 부근 또는 밖의 농도로 존재하는 입자들 및/또는 검출 범위 밖에 있는 입자들이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이는 이미지 분석기로부터 얻어진 정보를 적용시킴으로써 행해진다.
전체적으로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 장치, 예를 들어 예시적인 입자 조영제 조성물 및 PIOAL 시스 유체를 사용하는 장치를 작동시킴으로써, 혈구 또는 다른 단편과 같은 입자들을 함유하는 샘플의 분석이, 입자 카운터에 대해 정상 검출 범위 밖에 있는 검출 범위 내에서 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 시스템 및 조성물을 사용하여, 농도 또는 입자 부피와 같은 파라미터에 기초하여 확대된 검출 범위 내에서 혈액 유체 샘플의 분석이 수행될 수 있다. 확대된 검출 범위는 입자 카운터에 대한 검출 범위 밖에 있을 수 있다.
일부 실시 형태에서, 시스템 또는 장치는 입자 카운터를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 이러한 입자 카운터는 적어도 하나의 검출 범위를 갖는다. 소정 태양에서, 분석기 및 프로세서는 입자 카운터와 관련된 검사 오류를 정정하기 위한 추가 정보를 제공하도록 구성되고, 샘플 중의 입자들의 상이한 범주들 및/또는 하위범주들의 정확한 입자 카운트 또는 농도를 추가로 결정할 수 있다. 입자들의 범주들 및/또는 하위범주들 중 적어도 2개에 걸친 분포, 하나 이상의 비, 및/또는 카운트에 대한 정보가 입자 카운터 및 분석기로부터 입수가능하다면, 이때에는 입자 카운터로부터의 카운트, 범주화 및/또는 하위범주화에서의 오류가 정정될 수 있고, 입자 카운터에 의해 초기에 기록되지 않았던 카운트, 범주 및/또는 하위범주가 도출될 수 있다.
본 발명의 실시 형태들은 혈액학 시스템 및 방법이 유체 혈액 샘플 중에 존재하는 입자들의 고품질 이미지를 생성할 수 있게 하는 소정의 포커싱 기술들을 포함한다. 그러한 고품질 이미지는 세포들을 정확하게 분류하는 데 유용한 높은 수준의 구별을 달성하기 위한 기초를 제공하며, 이는 높은 배율 및 높은 개구수(numerical aperture)의 대물 렌즈를 갖는 광학 시스템의 사용을 허용한다. 예시적인 광학 정렬 또는 포커싱 기술들은 입자들을 운반하는 유체 샘플의 박형 리본에 상응하는 짧은 피사계 심도와 함께, 높은 수준의 분해능을 갖는 이미지의 생성을 가능하게 한다.
일부 경우에, 혈액학 시스템은 국부 온도 및 다른 인자들의 변화를 조절하기 위해 정기적으로 재포커싱될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 논의된 바와 같은 오토포커스 기술들은 혈액 분석기 내에 존재하는 열 팽창, 또는 이미징 대물 렌즈와 플로우셀 사이의 거리를 변화시키고 그에 따라 예를 들어 포커스를 벗어난 이미지를 생성함으로써 이미징 결과들에 부정적인 영향을 주는 다른 인자들을 보상할 수 있다. 본 발명의 실시 형태들은 또한, 포커싱 액체나 용액 또는 다른 사용자 간섭의 필요 없이 이미징 시스템을 자동으로 포커싱하는 것을 수반하는 혈액학 기기들을 위한 오토포커스 시스템 및 방법을 포함한다. 예를 들어, 예시적인 오토포커스 기술들은 이미지에 나타나는 대상체 자체의 대비를 최대화하는 것에 기초하는 기술들을 사용하기보다는 오히려, 플로우셀에 대해 고정된 표적 상에 초기 포커스를 얻는 것을 수반할 수 있다.
본 발명의 소정 실시 형태들은 플로우셀 내의 스트림 위치가 온도 변동에 반응하여 변화되지 않는다는 관찰에 적어도 부분적으로 기초하며, 플로우셀의 어딘가에서 표적 상에 포커싱하고 이어서 고정된 오프셋을 사용하여 샘플 스트림 상에 양호한 포커스를 달성하는 것을 수반할 수 있다. 그러한 접근법은 플로우셀을 통해 유동되는 포커싱 용액의 사용 없이 구현될 수 있고, 사용자에게 자동으로 그리고 전체적으로 투명하게 수행될 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 본 발명은 액체 중에 현탁된 입자들을 포함하는 샘플을 이미징하기 위한 시각적 분석기에 관한 것으로, 그 분석기 장치는 샘플의 공급원 및 PIOAL의 공급원에 커플링되는 플로우셀을 포함하고, 여기서 플로우셀은 내부 유로를 한정하고, 플로우셀은 PIOAL로 봉입된 리본형 샘플 스트림의 유동을 플로우셀 내의 관찰 구역을 통해 지향시키도록 구성된다. 광학 고분해능 이미징 디바이스와 관련된 대물 렌즈는 리본형 샘플 스트림과 교차하는 광학 축 상에 배치된다. 대물 렌즈와 플로우셀 사이의 상대 거리는 광센서 어레이 상에 디지털화 이미지를 분해 및 수집하기 위하여, 제어기에 커플링된 모터 드라이브의 작동에 의해 변동가능하다. 오토포커스 패턴 또는 이미징 표적은 플로우셀에 대해 고정된 위치에 제공되는데, 오토포커스 패턴은 준비된 리본형 샘플 스트림의 평면으로부터의 사전결정된 거리에 위치된다. 광원은 리본형 샘플 스트림 및 오토포커스 패턴을 조명한다. 적어도 하나의 디지털 프로세서는 모터 드라이브를 작동시키도록 커플링된 제어기와 관련된다. 프로세서는 또한 디지털화 이미지를 분석하도록 배열된다. 프로세서는 오토포커스 패턴의 포커스 위치를 결정하여 포커싱된 이미지를 생성하고, 이어서 포커싱된 위치로부터 사전결정된 거리(예컨대, 변위 거리)에 걸쳐 대물 렌즈 및 플로우셀을 상대적으로 변위시켜 리본형 샘플 스트림 상에 광학 고분해능 이미징 디바이스를 포커싱한다.
일 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 입자 분석 시스템을 사용하여 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 방법을 포함한다. 입자 분석 시스템은 기하학적 하이드로포커싱을 위해 구성될 수 있다. 일부 경우에, 본 시스템은 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 위해 구성될 수 있다. 일부 경우에, 입자들은 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중에 포함될 수 있다. 예시적인 방법은 입자 분석 시스템의 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체를 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 시스 유체는 사전결정된 점도 차이 범위 내의 일정 점도 차이만큼 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 가질 수 있다. 방법은 또한, 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 - 샘플 유동 스트림은 유로 크기의 감소부를 통해 유동하고 이미징 축을 횡단함 - 내를 유동하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 방법은 플로우셀에 대해 고정된 위치를 갖는 이미징 표적을 이미징함으로써 이미지 캡처 디바이스를 포커싱하는 단계를 포함할 수 있다. 더욱이, 방법은 변위 거리를 이용하여 샘플 유동 스트림 상에 포커싱되는 이미지 캡처 디바이스로 유동 스트림 내의, 입자 특성화 및 카운팅에 적합한, 입자들의 포커싱된 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 시스 유체와 혈액 유체 샘플 사이의 점도 차이는, 유로 크기의 감소부와 조합하여, 세포들이 샘플 유동 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 샘플 유동 스트림 중의 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 이미징 축에서 샘플 유동 스트림을 하이드로포커싱하기에 효과적이다. 일부 경우에, 샘플 유동 스트림은 이미징 축에서 약 2 μm 내지 약 10 μm 범위의 두께를 갖는다. 일부 경우에, 유로는 이미징 축에서 약 150 μm의 두께를 갖는다. 일부 경우에, 이미징 표적은 샘플 유동 스트림과 이미지 캡처 디바이스 사이에 배치된 관찰구 창 상에 위치된다. 일부 경우에, 이미징 표적은 조명 창 상에 위치되고, 샘플 유동 스트림은 조명 창과 이미지 캡처 디바이스 사이에 배치된다. 일부 경우에, 변위 거리는 0이다. 일부 경우에, 이미징 표적은 조명 창과 관찰구 창 사이에 위치된다. 일부 경우에, 상기 획득하는 단계에서, 이미지 캡처 디바이스는 변위 거리에 기초하여 이미지 캡처 디바이스의 초점 거리를 조절함으로써 샘플 유동 스트림 상에 포커싱된다.
일부 실시 형태에 따르면, 포커싱된 이미지를 획득하는 과정은 변위 거리를 이용하여 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하는 단계는 이미지 캡처 디바이스의 구성요소를 이동시키는 단계를 포함한다. 이미지 캡처 디바이스의 구성요소는 줌 렌즈, 이미지 캡처 디바이스의 미러, 또는 이미지 캡처 디바이스를 포함하는 조립체일 수 있다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하는 단계는 플로우셀을 이동시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하는 단계는 적어도 이미지 캡처 디바이스의 광학 요소 및 플로우셀을 이동시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 변위 거리는 이미징 표적과 샘플 유동 스트림 사이의 이미징 축을 따르는 거리이다. 일부 경우에, 변위 거리는 이미지 캡처 디바이스와 표적 사이의 제1 초점 거리와 이미지 캡처 디바이스와 샘플 유동 스트림 사이의 제2 초점 거리 간의 거리 차이이다. 일부 경우에, 방법은 테스트 유체 샘플을 시스 유체 내로 주입하여 플로우셀 내에 테스트 샘플 유동 스트림을 형성하는 단계, 포커싱된 이미징 표적 및 이미지 캡처 디바이스가 제1 초점 거리를 한정하도록 이미지 캡처 디바이스를 사용하여 이미징 표적의 제1 포커싱된 이미지를 얻는 단계, 포커싱된 테스트 샘플 유동 스트림 및 이미지 캡처 디바이스가 제2 초점 거리를 한정하도록 이미지 캡처 디바이스를 사용하여 테스트 샘플 유동 스트림의 제2 포커싱된 이미지를 얻는 단계, 및 제1 초점 거리와 제2 초점 거리 사이의 차이를 계산함으로써 변위 거리를 얻는 단계를 수반하는 오토포커싱하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 테스트 유체 샘플은 동일한 혈액 유체 샘플이고, 테스트 샘플 유동 스트림은 샘플 유동 스트림과 동일하다. 일부 경우에, 오토포커싱하는 단계는 이미지 캡처 디바이스와 관련된 초점 평면을 확립하고, 초점 평면은 이미지 캡처 디바이스에 대해 고정된 채로 유지된다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스는 샘플 유체 온도, 시스 유체 온도, 플로우셀 온도, 또는 이미지 캡처 디바이스 온도와 같은 온도를 사용하여 샘플 유동 스트림 상에 포커싱된다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스는 이미징 영역에서의 플로우셀 온도, 이미징 영역의 상류 위치에서의 플로우셀 온도, 및 이미징 영역의 하류 위치에서의 플로우셀 온도와 같은 온도를 사용하여 샘플 유동 스트림 상에 포커싱될 수 있다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스는 샘플 유체 온도 변화율, 시스 유체 온도 변화율, 플로우셀 온도 변화율, 또는 이미지 캡처 디바이스 온도 변화율과 같은 온도 변화율을 사용하여 샘플 유동 스트림 상에 포커싱될 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 방법은 오토포커스 재개시 신호를 검출하는 단계, 및 오토포커스 재개시 신호에 응답하여 오토포커싱하는 단계 및 이미지를 획득하는 단계를 반복하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 오토포커스 재개시 신호는 온도 변화, 포커스 품질의 감소, 경과된 시간 간격, 또는 사용자 입력을 포함하거나 또는 그들에 기초한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스를 샘플 유동 스트림 상에 포커싱하는 것은 이미지 캡처 디바이스의 온도와는 독립적으로 수행된다. 일부 경우에, 이미징 표적은 샘플 유동 스트림에 대해 이미지 캡처 디바이스의 이미징 축을 위치설정하는 데 사용하기 위한 스케일을 포함한다. 일부 경우에, 이미징 표적은 이미징 축에 대해 정렬된 아이리스(iris)를 포함하여서, 이미징된 입자들이 아이리스에 의해 한정된 개구 내에 배치되고 아이리스의 하나 이상의 에지 부분들이 오토포커싱 동안 이미징되게 한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스는 이미징 축을 중심으로 하는 이미지 캡처 디바이스의 축방향 회전, 이미징 축을 따라 연장되는 축을 중심으로 하는 그리고 이미징 디바이스의 시야 내에서의 플로우셀의 축방향 회전, 유로를 따라 연장되는 축을 중심으로 하는 이미지 캡처 디바이스의 팁 회전(tip rotation), 유로를 따라 연장되는 축을 중심으로 하는 그리고 유로 내에서의 플로우셀의 팁 회전, 유로를 횡단하는 축 및 이미징 축을 중심으로 하는 이미지 캡처 디바이스의 틸트 회전(tilt rotation), 및/또는 유로를 횡단하는 축 및 이미징 축을 중심으로 하는 그리고 이미지 캡처 디바이스의 시야 내에서의 플로우셀의 틸트 회전을 구현함으로써 샘플 유동 스트림 상에 포커싱된다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스는 플로우셀의 회전을 구현함으로써 샘플 유동 스트림 상에 포커싱되고, 그 회전 중심이 이미지 캡처 디바이스의 시야에 맞추어진다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스의 오토포커싱은 복수의 포커스 위치 중에서 최적의 포커스 위치를 결정하는 것을 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 방법을 포함한다. 예시적인 방법은 시스 유체를 플로우셀의 유로를 따라 유동시키는 단계, 및 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 플로우셀은 관련된 온도를 가질 수 있다. 방법은 또한, 플로우셀과 관련된 온도가 제1 온도에 있는 동안 이미지 캡처 디바이스를 이미징 축을 따라 유동 스트림 상에 제1 초점 상태로 포커싱하는 단계, 및 제1 초점 상태에 있는 이미지 캡처 디바이스로 유동 스트림 내의 입자들의 제1 하위세트의 제1 포커싱된 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 플로우셀과 관련된 온도가 제1 온도로부터 제2 온도로의 변화를 겪는 것을 판정하는 단계, 및 온도의 변화 및 플로우셀 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계에 응답하여 제1 초점 상태로부터 제2 초점 상태로 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 자동으로 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 게다가, 방법은 제2 초점 상태에 있는 이미지 캡처 디바이스로 유동 스트림 내의 입자들의 제2 하위세트의 제2 포커싱된 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 조절하는 단계는 온도의 변화 및 플로우셀 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계를 사용하여 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하는 단계를 수반한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 조절하는 단계는 온도의 변화 및 플로우셀 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계를 사용하여 이미지 캡처 디바이스의 초점 거리를 조절하는 단계를 수반한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 조절하는 단계는 이미징 축을 중심으로 하는 이미지 캡처 디바이스의 축방향 회전, 이미징 축을 따라 연장되는 축을 중심으로 하는 그리고 이미징 디바이스의 시야 내에서의 플로우셀의 축방향 회전, 유로를 따라 연장되는 축을 중심으로 하는 이미지 캡처 디바이스의 팁 회전, 유로를 따라 연장되는 축을 중심으로 하는 그리고 유로 내에서의 플로우셀의 팁 회전, 유로를 횡단하는 축 및 이미징 축을 중심으로 하는 이미지 캡처 디바이스의 틸트 회전, 및/또는 유로를 횡단하는 축 및 이미징 축을 중심으로 하는 그리고 이미지 캡처 디바이스의 시야 내에서의 플로우셀의 틸트 회전을 구현하는 단계를 수반한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스는 플로우셀의 회전을 구현함으로써 샘플 유동 스트림 상에 포커싱되고, 그 회전 중심이 이미지 캡처 디바이스의 시야에 맞추어진다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위해, 기하학적 하이드로포커싱, 또는 일부 경우에 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 수행하는 입자 분석 시스템을 포함한다. 예시적인 시스템은 주입관을 갖는 유로 및 이미징 축이 통과하는 이미징 창을 구비한 플로우셀을 포함할 수 있다. 플로우셀의 유로는 유로 크기의 감소부를 가질 수 있다. 시스템은 또한 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구를 포함할 수 있다. 게다가, 시스템은 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 입구를 포함할 수 있다. 혈액 유체 입구는 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 시스 유체는 혈액 유체 샘플의 점도보다 더 큰 점도를 가질 수 있다. 더욱이, 시스템은 이미지 캡처 디바이스, 플로우셀에 대해 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태를 설정하도록 구성된 포커싱 메커니즘, 및 플로우셀에 대해 고정된 위치를 갖는 이미징 표적을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이미징 표적과 샘플 유동 스트림은 이미징 축을 따르는 변위 거리를 한정할 수 있다. 또한, 시스템은 프로세서 및 포커싱 모듈을 포함할 수 있는데, 포커싱 모듈은 변위 거리를 이용하여, 입자 특성화 및 카운팅에 적합한 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태를 설정하도록 포커싱 메커니즘을 작동하기 위해 프로세서 상에 실행되는 기계 판독가능 코드를 구현하는 유형적 매체를 갖는다. 일부 경우에, 시스 유체와 혈액 유체 샘플 사이의 점도 차이는, 유로 크기의 감소부와 조합하여, 세포들이 샘플 유동 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 샘플 유동 스트림 중의 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 이미징 축에서 샘플 유동 스트림을 하이드로포커싱하기에 효과적이다. 일부 경우에, 포커싱 메커니즘은 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하도록 구성된 드라이브 모터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이미징 표적은 샘플 유동 스트림과 이미지 캡처 디바이스 사이에 배치된 관찰구 창 상에 위치된다. 일부 경우에, 이미징 표적은 조명 창 상에 위치되고, 샘플 유동 스트림은 조명 창과 이미지 캡처 디바이스 사이에 배치된다. 일부 경우에, 시스템은 변위 거리에 기초하여 이미지 캡처 디바이스의 초점 거리를 조절함으로써 이미지 캡처 디바이스를 샘플 유동 스트림 상에 포커싱하는 단계를 포함하는 획득하는 단계를 수행하도록 구성된다. 일부 경우에, 시스템은 변위 거리를 이용하여 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절함으로써 포커싱된 이미지를 얻기 위한 획득하는 단계를 수행하도록 구성된다. 일부 경우에, 시스템은 플로우셀을 이동시킴으로써 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하도록 구성된다. 일부 경우에, 시스템은 테스트 유체 샘플을 시스 유체 내로 주입하여 플로우셀 내에 테스트 샘플 유동 스트림을 형성하는 단계, 포커싱된 이미징 표적 및 이미지 캡처 디바이스가 제1 초점 거리를 한정하도록 이미지 캡처 디바이스를 사용하여 이미징 표적의 제1 포커싱된 이미지를 얻는 단계, 포커싱된 테스트 샘플 유동 스트림 및 이미지 캡처 디바이스가 제2 초점 거리를 한정하도록 이미지 캡처 디바이스를 사용하여 테스트 샘플 유동 스트림의 제2 포커싱된 이미지를 얻는 단계, 및 제1 초점 거리와 제2 초점 거리 사이의 차이를 계산함으로써 변위 거리를 얻는 단계를 포함하는 오토포커싱하는 단계를 수행하도록 구성된다. 일부 경우에, 시스템은 샘플 유체 온도, 시스 유체 온도, 플로우셀 온도, 또는 이미지 캡처 디바이스 온도와 같은 온도를 사용하여 이미지 캡처 디바이스를 샘플 유동 스트림 상에 포커싱하도록 구성된다. 일부 경우에, 시스템은 오토포커스 재개시 신호를 검출하도록, 그리고 오토포커스 재개시 신호에 응답하여 오토포커싱하는 단계 및 이미지를 획득하는 단계를 반복하도록 구성된다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 시스템을 포함한다. 예시적인 시스템은, 주입관을 갖는 유로 및 이미징 축이 통과하는 이미징 창을 구비한 플로우셀, 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구, 및 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 입구를 포함할 수 있다. 혈액 유체 입구는 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 구성될 수 있다. 시스템은 또한 이미지 캡처 디바이스, 플로우셀에 대해 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태를 설정하도록 구성된 포커싱 메커니즘, 플로우셀에 열적으로 커플링된 온도 센서, 프로세서, 및 포커싱 모듈을 포함할 수 있다. 포커싱 모듈은, 온도 센서에 의해 감지된 온도의 변화 및 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계에 응답하여, 입자 특성화 및 카운팅에 적합한 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태를 설정하도록 포커싱 메커니즘을 작동하기 위해 프로세서 상에서 실행되는 기계 판독가능 코드를 구현하는 유형적 매체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 포커싱 메커니즘은 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하도록 구성된 드라이브 모터를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 혈액 유체 샘플 중의 세포들의 분석을 위한 방법을 포함한다. 예시적인 방법은 시스 유체를 플로우셀의 유로를 따라 유동시키는 단계, 및 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플 유동 스트림은 이미징 축을 따라 플로우셀의 이미징 창으로부터 제1 거리만큼 오프셋될 수 있다. 방법은 또한 플로우셀에 부착된 이미징 표적을 이미징함으로써 이미지 캡처 디바이스를 오토포커싱하는 단계를 포함할 수 있다. 이미징 표적은 이미징 축을 따르는 이미징 창으로부터의 제2 거리에 위치될 수 있다. 게다가, 방법은 이미지 캡처 디바이스로 유동 스트림 내의, 세포 특성화 및 카운팅에 적합한 세포들의 포커싱된 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스는 오토포커싱하는 단계 및 제1 거리와 제2 거리 사이의 기지의 관계를 사용하여 샘플 유동 스트림 상에 포커싱될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 혈액 유체 샘플 중의 세포들의 분석을 위한 시스템을 포함한다. 예시적인 시스템은 주입관을 갖는 유로 및 이미징 축이 통과하는 이미징 창을 구비한 플로우셀을 포함할 수 있다. 시스템은 또한 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구, 및 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 입구를 포함할 수 있다. 혈액 유체 입구는 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 구성될 수 있다. 샘플 유동 스트림은 이미징 축을 따라 플로우셀의 이미징 창으로부터 제1 거리만큼 오프셋될 수 있다. 시스템은 또한 이미징 축을 따라 배향가능한 이미지 캡처 디바이스를 포함할 수 있다. 이미지 캡처 디바이스는 포커싱 메커니즘을 포함할 수 있다. 게다가, 시스템은 플로우셀에 부착되는 이미징 표적을 포함할 수 있다. 이미징 표적은 이미징 축을 따르는 이미징 창 표면으로부터의 제2 거리에 있을 수 있다. 더욱이, 시스템은 포커싱 메커니즘에 커플링된 프로세서를 포함할 수 있다. 프로세서는 이미지 캡처 디바이스를 표적 상에 포커싱함으로써 그리고 제1 거리와 제2 거리 사이의 기지의 관계를 사용함으로써, 세포들의 특성화 및 카운팅을 위해 충분한, 유동 스트림 내의 입자들의 포커싱된 이미지를 획득하도록 구성될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 혈액 유체 샘플 중의 세포들의 분석을 위한 시스템을 포함한다. 예시적인 시스템은 주입관을 갖는 유로 및 이미징 축이 통과하는 이미징 창을 구비한 플로우셀을 포함할 수 있다. 또한, 시스템은 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구, 및 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 샘플 입구를 포함할 수 있다. 샘플 유체 입구는 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 구성될 수 있다. 더욱이, 시스템은 이미징 축을 따라 배향가능한 이미지 캡처 디바이스를 포함할 수 있는데, 이미지 캡처 디바이스는 포커싱 메커니즘을 포함할 수 있다. 시스템은 또한 플로우셀에 열적으로 커플링된 온도 센서, 및 온도 센서와 포커싱 메커니즘에 커플링된 프로세서를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 프로세서는 온도의 변화 및 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계에 응답하여, 세포들의 특성화 및 카운팅을 위해 충분한 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 조절하도록 구성된다.
일부 실시 형태에 따르면, 시각적 분석기는 샘플의 공급원 및 시스 유체의 공급원에 커플링되는 플로우셀을 포함할 수 있다. 플로우셀은 내부 유로를 한정할 수 있고, 시스 유체로 봉입된 샘플의 유동을 플로우셀 내의 관찰 구역을 통해 지향시키도록 구성될 수 있다. 분석기는 또한 리본형 샘플 스트림과 교차하는 광학 축 상에 대물 렌즈를 갖는 광학 고분해능 이미징 디바이스를 포함할 수 있는데, 대물 렌즈와 플로우셀 사이의 상대 거리는 광센서 어레이 상에 디지털화 이미지를 분해하고 수집하기 위해 모터 드라이브의 작동에 의해 가변될 수 있다. 분석기는 또한 플로우셀에 대해 고정된 위치를 갖는 오토포커스 패턴을 포함할 수 있는데, 오토포커스 패턴은 리본형 샘플 스트림의 평면으로부터의 변위 거리에 위치된다. 변위 거리는 사전결정될 수 있다. 분석기는 또한 리본형 샘플 스트림 및 오토포커스 패턴을 조명하도록 구성된 광원을 포함할 수 있다. 게다가, 분석기는 모터 드라이브를 작동시키도록 그리고 디지털화 이미지를 분석하도록 커플링되는 적어도 하나의 디지털 프로세서를 포함할 수 있다. 프로세서는 오토포커스 패턴의 포커스 위치를 결정하도록, 그리고 포커싱된 위치로부터 변위 거리에 걸쳐 광학 고분해능 이미징 디바이스 및 플로우셀을 상대적으로 변위시켜 그에 의해 리본형 샘플 스트림 상에 광학 고분해능 이미징 디바이스가 포커싱되게 하도록 구성될 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 오토포커스 패턴은 제한된 크기를 갖는 형태들을 포함하고, 변위 거리는 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱될 때, 형태들이 디지털화 이미지에서 사실상 비가시적이게 되기에 충분하다. 일부 경우에, 광학 축은 리본형 샘플 스트림에 사실상 직각이다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 샘플 분석을 위해 시각적 분석기를 포커싱하는 방법을 포함한다. 예시적인 방법은 플로우셀에 대해 고정된 오토포커스 패턴 상에 광학 고분해능 이미징 디바이스를 포커싱하는 단계를 포함할 수 있는데, 오토포커스 패턴은 사전결정되는 리본형 샘플 스트림으로부터의 변위 거리에 위치되고, 광학 고분해능 이미징 디바이스는 리본형 샘플 스트림과 교차하는 광학 축 상에 대물 렌즈를 갖고, 광학 고분해능 이미징 디바이스와 플로우셀 사이의 상대 거리는 모터 드라이브의 작동에 의해 가변될 수 있고, 광학 고분해능 이미징 디바이스는 광센서 어레이 상에 디지털화 이미지를 분해하고 수집하도록 구성된다. 또한, 방법은 모터 드라이브를 변위 거리에 걸쳐 작동시켜서 광학 고분해능 이미징 디바이스를 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱하도록 하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명의 실시 형태들은 샘플 중의 입자들을 이미징하는 방법을 포함한다. 예시적인 방법은 액체 중에 현탁된 입자들을 함유하는 샘플을 위한 시각적 분석기를 제공하여, 시각적 분석기에서 보다 높은 그리고 보다 낮은 점도로 되는 층류 섹션들을 갖는 유동을 확립하는 단계를 포함할 수 있다. 분석기는 샘플의 공급원 및 샘플의 점도보다 더 높은 점도를 갖는 PIOAL의 공급원에 커플링되는 플로우셀을 포함할 수 있다. 플로우셀은 내부 유로를 한정할 수 있고, PIOAL로 봉입된 샘플의 유동을 플로우셀 내의 관찰 구역을 통해 지향시킬 수 있다. 분석기는 또한 리본형 샘플 스트림과 교차하는 광학 축 상에 대물 렌즈를 갖는 광학 고분해능 이미징 디바이스를 포함할 수 있는데, 광학 고분해능 이미징 디바이스와 플로우셀 사이의 상대 거리는 광센서 어레이 상에 디지털화 이미지를 분해하고 수집하기 위해 모터 드라이브의 작동에 의해 가변될 수 있다. 분석기는 또한, 플로우셀에 대해 고정된 위치를 갖는 오토포커스 패턴 - 오토포커스 패턴은 사전결정되어 있는 리본형 샘플 스트림의 평면으로부터의 변위 거리에 위치됨-, 리본형 샘플 스트림과 오토포커스 패턴을 조명하도록 구성된 광원, 및 모터 드라이브를 작동시키고 디지털화 이미지를 분석하기 위해 커플링된 적어도 하나의 디지털 프로세서를 포함할 수 있는데, 여기서 프로세서는 오토포커스 패턴의 포커스 위치를 결정하도록, 그리고 포커싱된 위치로부터의 변위 거리에 걸쳐 광학 고분해능 이미징 디바이스와 플로우셀을 상대적으로 변위시켜 그에 의해 리본형 샘플 스트림 상에 광학 고분해능 이미징 디바이스가 포커싱되게 하도록 구성된다. 일부 경우에, 분석기는 샘플의 공급원 및 PIOAL의 공급원에 커플링되는 플로우셀 - 플로우셀은 내부 유로를 한정하고, PIOAL로 봉입된 샘플의 유동을 플로우셀 내의 관찰 구역을 통해 지향시키도록 구성됨 -, 리본형 샘플 스트림과 교차하는 광학 축 상에 대물 렌즈를 갖는 광학 고분해능 이미지 디바이스 - 대물 렌즈와 플로우셀 사이의 상대 거리는 광센서 어레이 상에 디지털화 이미지를 분해 및 수집하기 위해 모터 드라이브의 작동에 의해 가변적일 수 있음 -, 플로우셀에 대해 고정된 위치를 갖는 오토포커스 패턴 - 오토포커스 패턴은 사전결정되어 있는 리본형 샘플 스트림의 평면으로부터의 변위 거리에 위치됨 -, 리본형 샘플 스트림과 오토포커스 패턴을 조명하도록 구성된 광원, 및 모터 드라이브를 작동시키고 디지털화 이미지를 분석하기 위해 커플링된 적어도 하나의 디지털 프로세서를 포함할 수 있는데, 여기서 프로세서는 오토포커스 패턴의 포커스 위치를 결정하도록, 그리고 포커싱된 위치로부터의 변위 거리에 걸쳐 광학 고분해능 이미징 디바이스와 플로우셀을 상대적으로 변위시켜 그에 의해 리본형 샘플 스트림 상에 광학 고분해능 이미징 디바이스가 포커싱되게 하도록 구성된다.
자동화 입자 분석 시스템에서 이미징되는 혈액 유체 샘플을 염색하기 위한 입자 조영제 조성물이 개시된다. 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet), 뉴 메틸렌 블루(New Methylene Blue), 메틸 그린(Methyl Green), 에오신(Eosin) Y, 및 사프라닌(Safranin) O로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 입자 조영제를 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 계면활성제(surfactant), 사포닌, 4차 암모늄 염, 비이온성 계면활성제, 표면활성제(detergent), 및 쯔비터이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 투과화제를 추가로 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 글루테르알데하이드 및 포름알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 고정제를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 투과화제는 염색 조건 하에서 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 사포닌일 수 있다. 고정제는 염색 조건 하에서 0.1% 이하의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 글루테르알데하이드일 수 있다.
일 실시 형태에서, 적어도 하나의 입자 조영제는 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 및 에오신-Y를 포함할 수 있다. 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비는 염색 조건 하에서 약 1:90 내지 약 1:110일 수 있다. 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 3 μM 내지 약 300 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
일 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 6 μM 내지 약 10 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 70 μM 내지 약 2.4 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 10 μM 내지 약 50 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 대략 90% 순도 이상이다. 뉴 메틸렌 블루는 대략 70% 순도 이상일 수 있다. 에오신-Y는 대략 80% 순도 이상일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 7.8 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 735 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 27 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 완충제 성분을 추가로 포함할 수 있다.
자동화 입자 분석 시스템을 사용하여 이미징될 혈액 유체 샘플의 입자를 처리하는 방법이 개시된다. 본 방법은 혈액 유체 샘플을 입자 조영제 조성물과 배합하여 샘플 혼합물을 얻는 단계 및 90초 미만 동안 약 37℃ 내지 약 60℃의 온도에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 메틸 그린, 에오신 Y, 및 사프라닌 O로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 입자 조영제; 계면활성제, 사포닌, 4차 암모늄 염, 비이온성 계면활성제, 표면활성제, 및 쯔비터이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 투과화제; 및 글루테르알데하이드 및 포름알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 고정제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제는 염색 조건 하에서 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비가 약 1:1 내지 약 1:500이 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛 뉴 메틸렌 블루를 포함할 수 있다. 사포닌은 염색 조건 하에서 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 글루테르알데하이드는 염색 조건 하에서 0.1% 이하의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 본 방법은 샘플 혼합물을 60초 미만 동안 인큐베이팅하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 염색 조건 하에서 약 6 μM 내지 약 10 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛을 포함할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 70 μM 내지 약 2.4 mM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신-Y는 염색 조건 하에서 약 10 μM 내지 약 50 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 혈액 유체 샘플은 입자 조영제 조성물과 약 1:2 내지 약 1:10의 혈액 유체 샘플 대 입자 조영제 조성물의 비로 배합될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 샘플 혼합물을 40 내지 50초 동안 46℃ 내지 약 49℃로 가열하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 크리스탈 바이올렛은 대략 90% 순도 이상일 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 대략 70% 순도 이상일 수 있다. 에오신-Y는 대략 80% 순도 이상일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제는 염색 조건 하에서 약 7.8 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛; 염색 조건 하에서 약 735 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 뉴 메틸렌 블루; 및 염색 조건 하에서 약 27 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 에오신-Y를 포함할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 완충제 성분을 추가로 포함할 수 있다. 혈액 유체 샘플은 입자 조영제 조성물과 약 1:3 내지 약 1:4의 혈액 유체 샘플 대 입자 조영제 조성물의 비로 배합될 수 있다. 샘플 혼합물은 약 45초 동안 약 47℃로 가열될 수 있다.
본 발명의 실시 형태의 전술된 특징 및 부수하는 이점과 많은 다른 특징 및 부수하는 이점이, 첨부된 도면과 함께 고려할 때 하기의 상세한 설명을 참고함으로써 명백해지고 한층 더 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 실시 형태들에 따른 디지털 이미지 처리를 사용하는 샘플 이미지 분석을 위한, 예시적인 플로우셀, 오토포커스 시스템 및 광학 고분해능 이미징 디바이스의 작동상의 태양들을 도시하는, 비축척 부분 단면 개략도이다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 실시 형태들에 따른 광학 벤치 배열을 도시한다.
도 1c는 본 발명의 실시 형태들에 따른 혈액 분석기의 블록 다이어그램이다.
도 1d는 본 발명의 실시 형태들에 따른 과정의 흐름도(flowchart)를 도시한다.
도 1e는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 모듈 시스템의 단순화된 블록 다이어그램이다.
도 2는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀의 부분들을 도시한다.
도 3, 도 3a, 및 도 3b는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀의 태양을 도시한다.
도 4는 본 발명의 실시 형태들에 따른 분석기 시스템의 태양들을 도시한다.
도 4a는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀을 도시한다.
도 4b-1 및 도 4b-2는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀 유로의 양상들을 도시한다.
도 4a-1 및 도 4a-2는 본 발명의 실시 형태들에 따른 샘플 스트림 치수의 변화들을 예시한다.
도 4c는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 캐뉼러 또는 샘플 공급관의 특징부를 도시한다.
도 4d는 본 발명의 실시 형태들에 따른 캐뉼러의 종단면을 도시한다.
도 4e는 본 발명의 실시 형태들에 따른 납작한 원위 섹션의 횡단면을 예시한다.
도 4f는 본 발명의 실시 형태들에 따른 테이퍼진 중심 섹션의 횡단면을 예시한다.
도 4g는 본 발명의 실시 형태들에 따른 근위 섹션의 횡단면을 예시한다.
도 4c-1은 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 캐뉼러 또는 샘플 공급관을 도시한다.
도 4d-1은 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 캐뉼러 또는 샘플 공급관을 도시한다.
도 4h는 본 발명의 실시 형태들에 따른 캐뉼러의 일부분을 도시한다.
도 4i 및 도 4j는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀들을 도시한다.
도 4k 및 도 4l은 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀의 이미지 캡처 영역을 통해 유동하는 샘플 스트림을 도시한다.
도 4k-1, 도 4k-2, 및 도 4k-3은 본 발명의 실시 형태들에 따른 표적 이미징 영역을 도시한다.
도 4l-1은 본 발명의 실시 형태들에 따른 포물선 유동 프로파일들을 도시한다.
도 4m 및 도 4n은 본 발명의 실시 형태들에 따른 세포내 입자 정렬의 양상들을 도시한다.
도 4o는 본 발명의 실시 형태들에 따른 PIOAL을 사용하여 얻어진 이미지 대 비 PIOAL 시스 유체를 사용하여 얻어진 이미지의 비교를 보여준다.
도 4p 및 도 4q는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 PIOAL 유체를 사용하여 얻어진 이미지와 표준 시스 유체를 사용하여 얻어진 이미지의 비교를 보여준다.
도 4r은 본 발명의 실시 형태들에 따른, 대칭 대 비대칭 플로우셀과 함께 PIOAL 중 0% 내지 30% 글리세롤을 사용하여 얻어진 미정렬 세포들의 백분율의 차트를 보여준다.
도 5는 본 발명의 실시 형태들에 따른, 플로우셀 내에서의 하나 이상의 샘플 유체의 주입에 상응하는 타임라인(timeline)을 도시한다.
도 5a, 도 5b, 도 5c, 및 도 5d는 본 발명의 실시 형태들에 따른 소정의 처리 기술들을 사용하여 얻어진 결과들을 도시한다.
도 5e는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀 기술과 비교하여 전통적인 현미경 습식 마운트(wet mount) 기술에 기초한 이미지 캡처 결과를 도시한다.
도 6은 본 발명의 실시 형태들에 따른 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 위해 구성된 입자 분석 시스템을 사용하여 복수의 입자들을 이미징하기 위한 예시적인 방법의 태양들을 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 유동 스트림 특성을 도시한다.
도 6c는 본 발명의 실시 형태들에 따른, 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 예시적인 방법의 태양들을 도시한다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 실시 형태들에 따른 유동 스트림 변형 속도(strain rate)의 양상들을 도시한다.
도 9a는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 오토포커스 표적을 도시한다.
도 9b는 본 발명의 실시 형태들에 따른 오토포커스 표적의 부분들을 포함하는 캡처링된 이미지를 도시한다.
도 10 및 도 11은 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 오토포커스 표적들을 도시한다.
도 12a는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 오토포커스 표적을 도시한다.
도 12b는 본 발명의 실시 형태들에 따른 오토포커스 표적의 중심 부분의 확대도를 도시한다.
도 13a, 도 13b, 및 도 13c는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀 온도 센서의 도면들을 도시한다.
도 13d는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀 버블 제거 기술의 태양들을 도시한다.
도 14는 본 발명의 실시 형태들에 따른, 혈액 샘플에서의 입자 분석을 위한 동적 또는 검출 범위 확대를 달성하기 위한 시스템 및 방법의 추가 태양들을 보여주는 블록 다이어그램이다.
도 15는 본 발명의 실시 형태들에 따른, 샘플을 분석하기 위한 예시적인 장치를 도시한다.
도 15a는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 카운터 또는 카운팅 모듈의 태양들을 도시한다.
도 16은 본 발명의 실시 형태들에 따른, 혈액 유체 샘플 중의 제1 세포 유형의 양을 측정하기 위한 시스템 및 방법의 태양들을 도시한다.
도 17은 본 발명의 실시 형태들에 따른, 입자들을 함유하는 샘플을 분석하기 위한 방법을 도시한다.
도 18은 본 발명의 실시 형태들에 따른, 입자들의 2개의 하위범주의 농도를 결정하는 예시적인 방법을 예시한다.
도 19a, 도 19b, 도 19c, 및 도 19d는 본 발명의 실시 형태들에 따른 입자들의 범주들의 검출을 도시한다.
도 20a 및 도 20b는 본 발명의 실시 형태들에 따른, 이미징 시스템 및 방법의 태양들을 예시하는 측단면도를 제공한다.
도 20c는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀의 단부 단면도를 도시한다.
도 20d는 본 발명의 실시 형태들에 따른 이미지 캡처 디바이스의 초점 거리를 도시한다.
도 21은 본 발명의 실시 형태들에 따른 오토포커스 패턴의 실시 형태들을 보여주는 입면도를 도시한다.
도 22a 및 도 22b는 본 발명의 실시 형태들에 따른 포커스 구성들을 도시한다.
도 23은 본 발명의 실시 형태들에 따른 샘플 처리 기술의 태양들을 도시한다.
도 24는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물의 제조의 개략도이다.
도 25는 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정의 흐름도이다.
도 26은 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정에 따라 염색된 선택된 백혈구들의 대표적인 예시이다.
도 27은 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물로 염색된 샘플로부터 선택된 백혈구들의 대표적인 예시이다.
도 28은 초기 실시예 1에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 29는 초기 실시예 2에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 30은 초기 실시예 3에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 31은 초기 실시예 4에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 32는 초기 실시예에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 33은 초기 실시예 5에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
도 34는 초기 실시예 6에 따른 염색된 세포들의 대표적인 예시이다.
본 발명은 입자들을 함유하는 샘플을 분석하기 위한 장치, 시스템, 조성물, 및 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은, 예를 들어 시각적 분석기일 수 있는 분석기를 포함하는 자동화 입자 이미징 시스템에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 시각적 분석기는 이미지의 자동화 분석을 가능하게 하기 위하여 프로세서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 액체 중에 현탁된 입자들을 포함하는 샘플의 이미지를 얻기 위한, 시각적 분석기를 포함하는 시스템이 제공된다. 본 시스템은, 예를 들어 생물학적 유체 중의 입자들을 특성화하는 데, 예컨대 적혈구, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 혈소판, 및 백혈구를 검출 및 정량화하는 데 유용할 수 있으며, 이에는 백혈구 감별 카운팅, 범주화 및 하위범주화 및 분석이 포함된다. 다른 유체들로부터 혈구들을 특성화하는 것과 같은 다른 유사한 용도가 또한 본 발명의 실시 형태들에 의해 포함된다. 전형적으로, 혈액 유체 샘플은 유동하는 시스 유체 내로 도입되고, 조합된 시스 및 샘플 유체는, 샘플 리본 유체 유동의 두께를 감소시키는 협소화 유로 전이 구역에 의해 압축된다. 따라서, 세포들과 같은 입자들은, 예를 들어 협소화 전이 구역에 의해 제공되는 기하학적 포커싱 효과와 조합하여, 주위의 점성 시스 유체에 의해 혈액 유체 샘플 내에서 배향 및/또는 압축될 수 있다. 유사하게, 혈구들 내의 내부 특징부들은, 예를 들어 협소화 전이 구역에 의해 제공되는 기하학적 포커싱 효과와 조합하여, 샘플 유체와 시스 유체 사이의 점도 차이의 결과로서 정렬 및 배향될 수 있다.
세포들과 같은 입자들을 범주화 및/또는 하위범주화하는 수단인 용량, 속도 및 유효성을 촉진하기 위하여, 데이터 처리 시스템에 의한 자동화 분석을 위하여 혈구들의 선명한 고품질 이미지를 제공하는 것이 유리하다. 본 발명에 따르면, 준비된 샘플 스트림이 플로우셀의 대향하는 벽들 사이에서 안정한 위치를 갖는 박형 리본으로 배열된다. 샘플 스트림의 위치설정 및 박형 리본 형상으로의 그의 편평화는, 샘플 유체와 점도가 상이하고 유동 채널의 대칭 협소화 전이 구역을 통해 유동되는, 플로우셀 내로 도입된 PIOAL의 층들 사이에서의 유동에 의해 달성될 수 있다.
혈액학 - 입자 분석 시스템
이제 도면을 참고하면, 도 1은 디지털 이미지 처리를 사용하여 샘플 유동 스트림(32) 중의 현미경적 입자를 이미징하기 위한 구성에서 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 관찰 구역(23)을 통해 샘플 유체를 수송하기 위한 예시적인 플로우셀(22)을 개략적으로 도시한다. 플로우셀(22)은 샘플 유체의 공급원(25)에 커플링되는데, 이러한 샘플 유체는 처리, 예컨대 입자 조영제 조성물과의 접촉 및 가열을 거쳤을 수 있다. 플로우셀(22)은 또한 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL), 예컨대 샘플 유체의 점도보다 더 큰 점도를 갖는 투명 글리세롤 용액의 하나 이상의 공급원(27)에 커플링된다.
샘플 유체는, 샘플 공급관(29)의 원위 단부(28)에서 납작한 개구부를 통해, 그리고 PIOAL 유동이 사실상 확립된 지점에서 플로우셀(22)의 내부 내로 주입되어서, 리본형 샘플 스트림의 위 및 아래에서(또는 대향하는 면들 상에서) PIOAL의 안정하고 대칭인 층류가 생성되게 된다. 샘플 스트림 및 PIOAL 스트림은, 사실상 협소화되는 유로를 따라, 주입된 샘플 유체와 함께 PIOAL을 이동시키는 정밀 계량 펌프들에 의해 공급될 수 있다. PIOAL은 유로가 협소화되는 구역(21)에서 샘플 유체를 봉입 및 압축한다. 따라서, 구역(21)에서의 유로 두께의 감소는 샘플 스트림(32)의 기하학적 포커싱에 기여할 수 있다. 샘플 유체 리본(32)은 협소화 구역(21)의 하류에서 PIOAL에 의해 봉입되고 그와 함께 운반되어, 예를 들어 CCD(48)를 사용하여 이미지가 수집되는 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 전방에서, 또는 아니면 관찰 구역(23)을 통해 통과한다. 프로세서(18)는 입력으로서 CCD(48)로부터 픽셀 데이터를 받아들일 수 있다. 샘플 유체 리본은 PIOAL과 함께 배출구(33)로 유동한다.
여기에 나타낸 바와 같이, 협소화 구역(21)은, 원위 두께 DT가 근위 두께 PT보다 더 작도록, 근위 두께 PT를 갖는 근위 유로 부분(21a) 및 원위 두께 DT를 갖는 원위 유로 부분(21b)을 가질 수 있다. 따라서, 샘플 유체는 근위 부분(21a)에 대해 원위이고 원위 부분(21b)에 대해 근위인 위치에서 샘플관(29)의 원위 단부(28)를 통해 주입될 수 있다. 따라서, 샘플 유체는 PIOAL 스트림이 구역(21)에 의해 압축됨에 따라 PIOAL 봉입물로 진입될 수 있으며, 이때 구역(21)에서 샘플 유체 주입관은 원위 출구를 가지며, 이를 통해 샘플 유체가 유동하는 시스 유체 내로 주입되고, 이러한 원위 출구는 플로우셀의 유로 크기의 감소에 의해 경계 지어진다.
대물 렌즈(46)를 갖는 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 리본형 샘플 스트림(32)과 교차하는 광학 축을 따라 지향된다. 대물 렌즈(46)와 플로우셀(33) 사이의 상대 거리는 광센서 어레이 상의 포커싱된 디지털화 이미지를 분해 및 수집하기 위하여 모터 드라이브(54)의 작동에 의해 변동가능하다.
일부 실시 형태에 따르면, 시스템은 샘플 유체 리본(32)을 하이드로포커싱하도록 작동될 수 있다. 용어 "하이드로포커스" 또는 "하이드로포커싱"은 시스 유체와 샘플 유체 사이의 점도 차이, 플로우셀의 기하학적 협소화 전이 구역, 및 시스 유체와 샘플 유체 사이의 속도 차이에 의해 영향을 받는 포커싱 효과를 지칭할 수 있다. 유체역학적 유동이 샘플 유체 스트림과 시스 유체 스트림 사이의 속도 차이로부터 생성되며, 이는 유동 리본 두께 및 형상에 영향을 준다.
본 발명은 리본형 샘플 스트림(32) 상에 포커싱하기 위한 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 올바른 작동 위치를 자동으로 달성하기 위한 기술을 제공한다. 플로우셀 구조(22)는, 리본형 샘플 스트림(32)이, PIOAL의 층들 사이에 박형 리본으로, 샘플 유체의 유로를 한정하는 플로우셀 내에 고정되고 신뢰할 수 있는 위치를 가져서, 플로우셀(22) 내의 관찰 구역(23)을 통과하도록 구성될 수 있다. 소정의 플로우셀 실시 형태에서, PIOAL에 대한 유로의 단면은 오리피스에서 직사각형 루멘을 갖는 관(29) 또는 캐뉼러와 같은 납작한 오리피스를 통해 샘플이 삽입되는 지점에서 대칭적으로 협소화된다. PIOAL과 샘플 유체 사이의 차별적인 점도와 함께 (예를 들어, 단면적이 20:1의 비로, 또는 20:1 내지 70:1의 비로 기하학적으로 협소화되는) 협소화 유로, 및, 선택적으로, 샘플의 유동과 비교하여 PIOAL의 선속도의 차이는 약 20:1 내지 70:1의 비로 샘플 단면을 압축하도록 협동한다. 일부 실시 형태에서, 단면 두께 비는 40:1일 수 있다.
일 태양에서, 플로우셀(22)의 대칭적 성질과 샘플 유체 및 PIOAL의 주입 방식은 PIOAL의 2개의 층들 사이의 리본형 샘플 스트림(32)에 대해 플로우셀(22) 내에 반복가능한 위치를 제공한다. 결과적으로, 샘플 및 PIOAL의 특정 선속도와 같은 처리 변동은; 리본형 샘플 스트림을 유동 중에 그의 위치로부터 변위시키려는 경향이 없다. 플로우셀(22)의 구조에 대하여, 리본형 샘플 스트림(32)의 위치는 안정하고 반복가능하다.
그러나, 플로우셀(22)과 광학 시스템의 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 상대 위치는, 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)와 리본형 샘플 스트림(32) 사이에 최적의 또는 원하는 거리를 유지하기 위해 변경될 수 있고 이따금씩의 위치 조절로부터 이익을 얻을 수 있어서, 그에 따라 리본형 샘플 스트림(32) 내의 봉입된 입자들의 소정 품질의 포커스 이미지를 제공할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 봉입된 입자들의 포커싱된 이미지를 얻기 위해 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)와 리본형 샘플 스트림(32) 사이에 최적의 또는 원하는 거리가 존재할 수 있다. 광학 장치가 먼저 오토포커스 또는 다른 기술들에 의해 플로우셀(22)에 대해 정확하게 위치설정되어, 플로우셀(22)에 대해 고정된 위치를 갖는 오토포커스 표적(44)으로부터 최적의 또는 원하는 거리에 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)를 위치시킬 수 있다. 오토포커스 표적(44)과 리본형 샘플 스트림(32) 사이의 변위 거리는 예를 들어 초기 교정 단계들의 결과로서 정확하게 알려져 있다. 오토포커스 표적(44)에 대한 오토포커싱 후에, 이어서, 플로우셀(22) 및/또는 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 오토포커스 표적(44)과 리본형 샘플 스트림(32) 사이의 기지의 변위 거리에 걸쳐서 변위된다. 그 결과, 광학 고분해능 이미징 디바이스(44)의 대물 렌즈는 봉입된 입자들을 함유하는 리본형 샘플 스트림(32) 상에 정확하게 포커싱된다.
본 발명의 예시적인 실시 형태들은 포커스 또는 이미징 표적(44) 상에 오토포커싱하는 것을 수반하는데, 이는 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스(24)의 광학 축을 따라 기지의 위치를 한정하는 고대비 특징부(high contrast figure)이다. 표적(44)은 리본형 샘플 스트림(32)의 위치에 대해 기지의 변위 거리를 가질 수 있다. 표적 특징부에 대해 대비 측정 알고리즘이 구체적으로 채용될 수 있다. 일 실시예에서, 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 위치는 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스의 광학 축에 평행한 라인을 따라 변화되어, 대비 특징부의 에지 위를 가로지르는 것으로 알려진 이미지 내의 한 줄의 픽셀들을 따라 발생하는 픽셀 휘도 값들 중에서 하나 이상의 최대 차동 진폭이 발견되는 깊이 또는 거리를 찾을 수 있다. 일부 경우에, 오토포커스 패턴은 광학 축에 평행한 라인을 따라 아무 변화가 없는데, 라인은 또한 기록된 변위 거리를 제공하기 위해 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 위치를 조절하도록 전동식 제어(motorized control)가 작동하는 라인이다.
이런 방식으로, 참고를 위한 거리 위치를 결정하기 위한 근거로서, 상이한 이미지들 사이에서 가변적이거나, 대비에 대해 덜 높게 한정되거나, 또는 소정 범위의 위치들 중 어딘가에 위치될 수 있는 이미지 내용물 양상(image content aspect)을 오토포커싱하거나 또는 그에 의존하는 것은 필요하지 않을 수도 있다. 오토포커스 표적(44)에 대해 최적의 또는 원하는 포커스의 위치를 찾으면, 광학 고분해능 이미징 디바이스 대물 렌즈(24)와 플로우셀(22)의 상대 위치들이 기록된 변위 거리만큼 변위되어 리본형 샘플 스트림(32) 내의 입자들에 대해 최적의 또는 원하는 포커스 위치를 제공할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 조명 개구부(창)(43)를 통해 적용된 광원(42)에 의해 백라이트된 바와 같은 리본형 샘플 스트림(32)의 이미지를 분해할 수 있다. 도 1에 도시된 실시 형태에서, 조명 개구부(43)의 주변부는 오토포커싱 표적(44)을 형성한다. 그러나, 목적은 광학 고분해능 이미징 디바이스 광학 장치(46)를 통해 통합형 전하 결합 장치와 같은 감광 요소의 어레이 상에 리본형 샘플 스트림(32)의 정확하게 포커싱된 이미지를 수집하는 것이다.
광학 고분해능 이미징 디바이스(24) 및 그의 광학 장치(46)는 거리(50)에서 인-포커스 상태에 있는 리본형 샘플 스트림(32) 내의 입자들의 이미지를 분해하도록 구성되며, 상기 거리는 광학 시스템의 치수, 렌즈들의 형상, 및 그들 재료의 굴절률의 결과일 수 있다. 일부 경우에, 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)와 리본형 샘플 스트림(32) 사이의 최적의 또는 원하는 거리는 변화되지 않는다. 다른 경우에, 플로우셀(22)과 광학 고분해능 이미징 디바이스 및 그의 광학 장치(46) 사이의 거리는 변화될 수 있다. (예를 들어, 이미징 디바이스(24)와 플로우셀(22) 사이의 거리(51)를 조절함으로써) 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) 및/또는 플로우셀(22)을 서로에 대해 더 가깝게 또는 더욱 멀어지게 이동시키면, 플로우셀에 대해 거리(50)의 끝에 있는 포커싱 지점의 위치가 이동된다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 포커스 표적(44)은 리본형 샘플 스트림(32)으로부터 소정 거리에 위치될 수 있으며, 이 경우에는 조명원(42)으로부터의 광을 위한 개구부(43)의 에지에서 플로우셀(22)에 직접 고정될 수 있다. 포커스 표적(44)은 리본형 샘플 스트림(32)으로부터 일정한 변위 거리(52)에 있다. 대체로, 변위 거리(52)는 일정한데, 그 이유는 플로우셀 내의 리본형 샘플 스트림(32)의 위치가 일정한 상태로 유지되기 때문이다.
예시적인 오토포커스 절차는 모터(54)를 사용하여 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) 및 플로우셀(22)의 상대 위치를 조절하여 적절한 초점 길이에 도달하도록 하고, 그럼으로써 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)를 오토포커스 표적(44) 상에 포커싱하게 하는 것을 수반한다. 이러한 실시예에서, 오토포커스 표적(44)은 플로우셀 내의 리본형 샘플 스트림(32)의 뒤에 있다. 이어서, 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는, 오토포커스 절차가, 광센서 상에 분해된 이미지가 오토포커스 표적(44)의 정확하게 포커싱된 이미지임을 확립할 때까지, 플로우셀(22)을 향해 또는 그로부터 멀어지게 이동된다. 이어서, 모터(54)는 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) 및 플로우셀(22)의 상대 위치를 변위시켜서, 즉, 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)를 플로우셀(22)로부터 멀어지게, 정확하게는 변위 거리(52)의 스팬(span)만큼 이동시킴으로써, 광학 고분해능 이미징 디바이스가 리본형 샘플 스트림(32) 상에 포커싱하게 하도록 작동된다. 이러한 예시적인 실시 형태에서, 이미징 디바이스(24)는 모터(54)에 의해 이동되어 포커스 위치에 이르는 것으로 보여진다. 다른 실시 형태에서, 유사한 수단에 의해 플로우셀(22)이 이동되거나 또는 플로우셀(22) 및 이미징 디바이스(24) 둘 모두가 이동되어 포커싱된 이미지를 얻는다.
물론, 이들 운동 방향은 포커스 표적(44)이 후방 조명 창(43)에 대향된 것과 같은 전방 관찰구 창에 위치되어 있었다면 역으로 되었을 것이다. 그 경우에, 변위 거리는 전방 관찰구(미도시)에서 리본형 샘플 스트림(32)과 표적(44) 사이의 스팬일 것이다.
광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 광학 축을 따르는 리본형 샘플 스트림(32)과 오토포커스 표적(44) 사이의 거리와 동일한 변위 거리(52)는 공장 교정 단계에서 확립될 수 있거나 또는 사용자에 의해 확립될 수 있다. 전형적으로, 일단 확립되면, 변위 거리(52)는 변화되지 않는다. 열 팽창 변화 및 진동(vibration)은 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) 및 플로우셀(22)의 정확한 위치가 서로에 대해 변하게 하여, 그에 따라 오토포커스 과정의 재개시를 필요하게 만들 수 있다. 그러나, 표적(44)에 대한 오토포커싱은 플로우셀(22)에 대해 고정되고 그에 따라 리본형 샘플 스트림(32)에 대해 고정되는 위치 기준을 제공한다. 마찬가지로, 변위 거리는 일정하다. 그러므로, 표적(44)에 대해 오토포커싱하고 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) 및 플로우셀(22)을 변위 거리의 스팬만큼 변위시킴으로써, 광학 고분해능 이미징 디바이스가 리본형 샘플 스트림(32) 상에 포커싱되는 결과를 가져온다.
일부 실시 형태에 따르면, 포커싱 표적은 조명 개구부(43) 둘레에 프린팅 또는 적용되는 고대비 원(high contrast circle)으로서 제공된다. 대안적인 포커싱 표적 구성들은 본 명세서의 다른 곳에서 논의되어 있다. 정사각형 또는 직사각형 이미지가 표적(44) 상에 인-포커스 상태로 수집되는 경우, 고대비 경계부가 조명의 중심 둘레에 나타난다. 개구부의 내부 에지에 있는 이미지에서 최고대비가 얻어지는 위치를 찾으면, 표적(44)의 작동 위치에서 광학 고분해능 이미징 디바이스가 자동으로 포커싱된다. 일부 실시 형태에 따르면, 용어 "작동 거리"는 대물 렌즈와 그 초점 평면 사이의 거리를 지칭할 수 있고, 용어 "작동 위치"는 이미징 디바이스의 초점 평면을 지칭할 수 있다. 이미지의 최고대비 측정은 가장 밝은 백색 및 가장 어두운 흑색의 측정된 픽셀들이 내부 에지를 통한 라인을 따라 서로 인접하는 경우이다. 최고대비 측정은 이미징 디바이스의 초점 평면이 표적(44)에 대해 원하는 위치에 있는지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다. 에지 검출 기술, 이미지 세분, 및 인접 픽셀들 사이의 진폭 차이를 통합하고 그 차이들의 최고 합을 찾는 것과 같은 다른 오토포커스 기술들이 또한 사용될 수 있다. 하나의 기술에서, 차이의 합은 표적(44)의 어느 면 상의 작동 위치를 포함하고 그 생성 값들을 특성 곡선에 매칭시키는 3개의 거리에서 계산되는데, 여기서 최적의 거리는 곡선 상의 피크 값에 있다. 이와 관련하여, 예시적인 오토포커스 기술은 상이한 위치에서 플로우셀 표적의 이미지를 수집하는 것 및 표적의 이미지가 가장 선명한(sharpest) 경우에 최대로 되는 메트릭(metric)을 사용하여 최상의 포커스 위치를 찾기 위해 이미지들을 분석하는 것을 수반할 수 있다. 제1 단계(조악한 단계(coarse)) 동안, 오토포커스 기술은 2.5 μm 간격으로 수집된 이미지들의 세트로부터 일차적인 최상의 위치를 찾도록 작동할 수 있다. 이어서, 그 위치로부터, 오토포커스 기술은 0.5 μm 간격으로 이미지들의 제2 세트(미세 이미지(fine))를 수집하는 것 및 표적 상의 최종적인 최상의 포커스 위치를 계산하는 것을 수반할 수 있다.
일부 경우에, 포커스 표적(오토포커스 패턴)은 샘플이 나타나게 될 관찰 영역의 주위에 있을 수 있다. 또한, 포커스 표적은 도 15에 도시된 것과 같이 시야에 있는 형상들을 조영함으로써 한정될 수 있음이 가능하다. 전형적으로, 오토포커스 표적은 플로우셀 상에 장착되거나 또는 플로우셀에 대해 고정된 위치에 견고하게 부착된다. 오토포커싱 표적의 이미지의 대비를 최대화하는 것에 반응하는 검출기에 의해 제어된 위치설정 모터의 동력 하에, 본 장치는 리본형 샘플 스트림에 대향된 것과 같은 표적 상에 오토포커싱한다. 이어서, 플로우셀 및/또는 광학 고분해능 이미징 디바이스를 오토포커스 표적과 리본형 샘플 스트림 사이의 거리인 것으로 알려진 변위 거리만큼 서로에 대해 변위시킴으로써, 광학 고분해능 이미징 디바이스의 작동 위치 또는 초점 평면은 오토포커스 표적으로부터 리본형 샘플 스트림까지 변위된다. 그 결과, 리본형 샘플 스트림은 수집된 디지털 이미지 내에 인-포커스 상태로 나타난다.
데이터 처리 기술에 의해 입자 유형들, 예컨대 적혈구 및 백혈구의 범주 및/또는 하위범주를 구분하기 위해서, 하나의 범주 또는 하위범주를 다른 것들로부터 구분하는 양상들을 나타내기에 충분한 분해능 및 선명도를 갖는 현미경적 픽셀 이미지들을 기록하는 것이 유리하다. 본 발명의 목적은 전술한 바와 같은 오토포커스 기술들을 가능하게 하는 것이다.
실용적인 실시 형태에서, 장치는 도 1a에 도시된 바와 같은 그리고 도 1b에 확대된 바와 같은 광학 벤치 배열에 기초할 수 있으며, 짐벌형(gimbaled) 또는 플로우셀 캐리어(55) 내에 장착된 플로우셀(22) 상에 지향되어 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)에 의해 얻은 이미지 내에 플로우셀(22)의 내용물을 백라이팅하는 조명원(42)을 갖는다. 캐리어(55)는 모터 드라이브 상에 장착되어 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)를 향해 그리고 그로부터 멀어지게 정밀하게 이동가능하게 된다. 캐리어(55)는 또한 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스의 광학 관찰 축에 대해 플로우셀의 정밀한 정렬을 허용하여서, 리본형 샘플 스트림이 이미징되는 구역, 즉 도 1에 도시된 바와 같은 조명 개구부(43)와 관찰구(57) 사이에서 리본형 샘플 스트림은 관찰 축에 수직인 평면 내를 유동한다. 포커스 표적(44)은, 예를 들어 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스의 광학 축에 수직인 리본형 샘플 스트림의 평면을 확립하도록, 캐리어(55)의 조절을 지원할 수 있다.
따라서, 캐리어(55)는 예를 들어 이미지 캡처 디바이스(24) 또는 이미지 캡처 디바이스 대물 렌즈에 대해, 플로우셀(22)의 위치 및 배향의 매우 정밀한 선형 및 각형 조절을 제공한다. 여기에 도시된 바와 같이, 캐리어(55)는 이미지 캡처 디바이스에 대해 캐리어 및 플로우셀의 각형 조절을 가능하게 하기 위해 2개의 피벗 지점들(55a, 55b)을 포함한다. 각형 조절용 피벗 지점들(55a, 55b)은 동일 평면 내에 위치되고, (예컨대, 이미지 캡처 영역에서) 플로우셀 채널에 중심이 맞추어진다. 이는 플로우셀 위치의 어떠한 선형 이동도 야기함이 없이 각도들의 조절을 허용한다. 캐리어(55)는 피벗 지점(55a)의 축을 중심으로 또는 피벗 지점(55b)의 축을 중심으로, 또는 양 축들을 중심으로 회전될 수 있다. 그러한 회전은 프로세서 및 플로우셀 이동 제어 메커니즘, 예컨대 도 4에 도시된 프로세서(440) 및 플로우셀 제어 메커니즘(442)에 의해 제어될 수 있다.
도 1b를 다시 참조하면, 이미지 캡처 디바이스(24) 및 캐리어(55)(플로우셀(22)과 함께) 중 어느 하나 또는 양쪽 모두는 다양한 축들(예컨대, X, Y, Z)을 따라 3차원으로 회전 또는 이동될 수 있음을 볼 수 있다. 따라서, 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 조절하기 위한 예시적인 기술은 예를 들어 X축을 중심으로 디바이스(24)를 회전시킴으로써, 이미징 축을 중심으로 하는 이미지 캡처 디바이스(24)의 축방향 회전을 구현하는 것을 포함할 수 있다. 포커스 조절은 또한, 이미징 축을 따라 연장되는 축을 중심으로 하는, 예를 들어 X축을 중심으로 하는 그리고 이미징 디바이스의 시야 내에서의 플로우셀(22) 및/또는 캐리어(55)의 축방향 회전에 의해 달성될 수 있다. 일부 경우에, 포커스 조절은 이미지 캡처 디바이스의 팁 회전(예컨대, Y축을 중심으로 하는 회전)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 포커스 조절은 플로우셀의 팁 회전(예컨대, Y축을 중심으로 하는 회전, 또는 피벗 지점(55a) 둘레에서의 회전)을 포함할 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 피벗 지점(55a)은 플로우셀의 유로를 따라 그리고 그 내부에서 연장하는 Y축에 상응한다. 일부 경우에, 포커스 조절은 이미지 캡처 디바이스의 틸트 회전(예컨대, Z축을 중심으로 하는 회전)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 포커스 조절은 플로우셀의 틸트 회전(예컨대, Z축을 중심으로 하는 회전, 또는 피벗 지점(55b) 둘레에서의 회전)을 포함할 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 피벗 지점(55b)은 유로 및 이미징 축을 횡단하는 Z축에 상응한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스는 (예컨대, X축을 중심으로 하는) 플로우셀의 회전을 구현함으로써 샘플 유동 스트림 상에 포커싱될 수 있어서, 그 회전 중심이 이미지 캡처 디바이스의 시야에 맞추어지게 된다. 본 명세서에 기술된 3차원 회전 조절은 분석기 시스템의 하나 이상의 구성요소 내의 위치 드리프트(positional drift)를 설명하도록 하기 위해 구현될 수 있다. 일부 경우에, 3차원 회전 조절은 분석기 시스템의 하나 이상의 구성요소 내의 온도 변동을 설명하도록 하기 위해 구현될 수 있다. 일부 경우에, 분석기 시스템의 조절은 X축을 따라 이미징 디바이스(24)를 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 분석기 시스템의 조절은 X축을 따라 캐리어(55) 또는 플로우셀(22)을 이동시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 액체 중에 현탁된 입자들을 함유하는 샘플의 이미지를 얻기 위한 시각적 분석기는 도 1에 도시된 바와 같이 샘플의 공급원(25) 및 PIOAL 재료의 공급원(27)에 커플링되는 플로우셀(22)을 포함한다. 도 3의 단면도에 도시된 바와 같이, 플로우셀(22)은 유동 방향(도 3의 우측에서 좌측 또는 도 1의 하측에서 상측)으로 대칭적으로 협소화되는 내부 유로를 한정한다. 플로우셀(22)은 PIOAL로 봉입된 샘플의 유동(32)을 플로우셀 내의, 즉 관찰구(57) 뒤의 관찰 구역을 통해 지향시키도록 구성된다.
도 1을 다시 참조하면, 대물 렌즈(46)를 갖는 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 리본형 샘플 스트림(32)과 교차하는 광학 축을 따라 지향된다. 대물 렌즈(46)와 플로우셀(33) 사이의 상대 거리는 광센서 어레이 상의 포커싱된 디지털화 이미지를 분해 및 수집하기 위하여 모터 드라이브(54)의 작동에 의해 변동가능하다.
플로우셀(22)에 대해 고정된 위치를 갖는 오토포커스 패턴(44)은 리본형 샘플 스트림(32)의 평면으로부터의 변위 거리(52)에 위치된다. 도시된 실시 형태에서, 오토포커스 패턴(표적(44))은 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)에 의해 수집된 이미지에서 가시적인 위치에서 플로우셀(22)에 직접 적용된다. 다른 실시 형태에서, 표적은 플로우셀의 몸체에 통합식으로 직접 적용되지 않으면, 플로우셀(22) 및 그 내부의 리본형 샘플 스트림(32)에 대해 제 위치에 견고하게 고정되는 부품 상에 운반될 수 있다.
안정된 공급원일 수 있거나 또는 광학 고분해능 이미징 디바이스 광센서의 작동에 맞춰 플래싱되는(flashed) 스트로브일 수 있는 광원(42)은 리본형 샘플 스트림(32)을 조명하도록 그리고 또한 표적(44)의 조영에 기여하도록 구성된다. 도시된 실시 형태에서, 조명은 백라이팅으로부터의 것이다.
도 1c는 예시적인 혈액 분석기의 추가 태양들을 도시하는 블록 다이어그램을 제공한다. 여기에 도시된 바와 같이, 분석기(100c)는 모터 드라이브(54)를 작동시키도록, 그리고 표적 오토포커스 패턴(44)에 대하여 상이한 포커스 위치들에서 수집된 바와 같은 광센서 어레이로부터의 디지털화 이미지를 분석하도록 커플링되는 적어도 하나의 디지털 프로세서(18)를 포함한다. 프로세서(18)는 오토포커스 패턴(44)의 포커스 위치를 결정하도록, 즉 표적 오토포커스 패턴(44) 상에 오토포커싱하고, 이에 따라 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)와 오토포커스 패턴(44) 사이의 최적 거리를 확립하도록 구성된다. 이는, 알고리즘을 적용하여 제1 거리에 있는 이미지 내의 대비 수준을 평가하는 단계와 같은 이미지 처리 단계들에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 단계는 전체 이미지에 또는 적어도 오토포커스 패턴(44)의 에지에서 적용될 수 있다. 프로세서는 모터(54)를 다른 위치로 이동시키고 그 위치 또는 에지에서 대비를 평가하고, 2회 이상의 반복 후에 오토포커스 패턴(44) 상에의 포커스의 정확도를 최대화하는(또는 그 위치로 이동되는 경우 포커스의 정확도를 최적화하게 할) 최적 거리를 결정한다. 프로세서는 오토포커스 표적 오토포커스 패턴(44)과 리본형 샘플 스트림 사이의 고정된 간격에 의지하며, 이어서 프로세서(18)는 모터(54)를 제어하여 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)를 올바른 거리로 이동시켜 리본형 샘플 스트림(32) 상에 포커싱한다. 보다 상세하게는, 프로세서는 모터를 작동시켜서, 광학 고분해능 이미징 디바이스와 리본형 샘플 스트림(32) 사이의 거리를, 리본형 샘플 스트림이 표적 오토포커스 패턴(44)으로부터 변위되는 (예컨대, 도 1에 도시된 바와 같은) 변위 거리(52)만큼 변위시킨다. 이러한 방식으로, 광학 고분해능 이미징 디바이스가 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱된다.
모터(54)는 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스에 의해 이미징되는 구분되는 특징부들, 특히 혈구의 양상들보다 다소 더 작은 정밀도를 갖는 기어드 스테핑 모터(geared stepping motor)를 포함할 수 있다. 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 위치가, 광학 대물 렌즈의 위치를 리본형 샘플 스트림의 폭 내에 두도록 조정되면, 리본형 샘플 스트림 내의 세포/입자의 관찰은 인-포커스 상태에 있다. 오토포커스 패턴(44)은 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스의 시야의 에지에 위치될 수 있으며, 그러한 이유로 관찰을 방해하지 않는다.
더욱이, 광학 고분해능 이미징 디바이스가 변위 거리에 걸쳐 이동되고 오토포커스 패턴이 포커스를 벗어나게 될 때, 인-포커스인 것으로 보이는 특징부들은 오토포커스 패턴에 대향된 것과 같은 혈구들이다. 도 21의 실시 형태에서, 예를 들어, 오토포커스 패턴은 시야 내에 있는 형상들에 의해 한정된다. 이러한 형상들은 제한된 크기의 비교적 얇은 개별 형태들이며, 이에 따라 변위 거리만큼 이동한 후에, 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱될 때, 형태들은 디지털화 이미지에서 사실상 비가시적이게 된다. 전형적인 변위 거리는, 혈액(혈구) 이미징 적용을 위한 치수를 갖는 플로우셀에서, 예를 들어 50 내지 100 μm일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 오토포커스 특징부는 최적 포커스 거리의 1 μm 이내에 광학 고분해능 이미징 디바이스를 유지한다.
플로우셀 내부 윤곽 및 PIOAL과 샘플의 유량은, 샘플이 리본형 스트림으로 형성되도록 조정될 수 있다. 이러한 스트림은 대략적으로, 리본형 샘플 스트림 내에 봉입되는 입자들만큼 박형이거나 또는 심지어 이들보다 더 박형일 수 있다. 백혈구는, 예를 들어 직경이 약 10 μm일 수 있다. 두께가 10 μm 미만인 리본형 샘플 스트림을 제공함으로써, 리본형 샘플 스트림이 시스 유체 또는 PIOAL에 의해 연신될 때 세포들이 배향될 수 있다. 의외로 리본형 샘플 스트림과 상이한 점도의, 예컨대 더 높은 점도의 PIOAL 층들 내의 협소화 유로를 따라 리본형 샘플 스트림을 연신하는 것은, 유리하게는 유동 방향과 사실상 평행한 평면 내에 비구형 입자들을 정렬시키고 세포들 상에 힘을 인가하여 세포들의 세포내 구조의 인-포커스 내용물을 개선하는 경향이 있다. 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 광학 축은 리본형 샘플 스트림의 평면에 사실상 수직(직각)이다. 이미징 지점에서의 리본형 샘플 스트림의 선속도는, 예를 들어 20 내지 200 mm/sec일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 리본형 샘플 스트림의 선속도는, 예를 들어 50 내지 150 mm/sec일 수 있다.
리본형 샘플 스트림 두께는 샘플 유체 및 PIOAL의 상대 점도 및 유량에 의해 영향을 받을 수 있다. 다시 도 1을 참조하면, 예를 들어 정밀 변위 펌프를 포함하는 샘플의 공급원(25) 및/또는 PIOAL의 공급원(27)은 리본형 샘플 스트림(32)의 치수를 최적화하기에 제어가능한 유량으로, 즉 적어도 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 시야만큼 넓은 박형 리본으로서 샘플 및/또는 PIOAL을 제공하도록 구성될 수 있다.
일 실시 형태에서, PIOAL 공급원(27)은 사전결정된 점도의 PIOAL을 제공하도록 구성된다. 그러한 점도는 샘플의 점도와 상이할 수 있으며, 샘플의 점도보다 더 높을 수 있다. PIOAL의 점도 및 밀도, 샘플 재료의 점도, PIOAL의 유량 및 샘플 재료의 유량을 조정하여, 오토포커스 패턴으로부터의 변위 거리에서, 그리고 사전결정된 치수 특성으로, 예컨대 유리한 리본형 샘플 스트림 두께로 리본형 샘플 스트림을 유지한다.
실용적인 실시 형태에서, PIOAL은 샘플보다 더 높은 선속도 및 샘플보다 더 높은 점도를 가지며, 그럼으로써 샘플을 편평한 리본으로 연신시킨다. 일부 경우에, PIOAL의 점도는 최대 10 센티푸아즈일 수 있다.
도 1c에 도시된 실시 형태에서는, 광센서 어레이로부터 얻어진 픽셀 디지털 이미지를 분석하는 데 사용되는 동일한 디지털 프로세서(18)가 또한 오토포커싱 모터(54)를 제어하는 데 사용된다. 그러나, 전형적으로, 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 캡처링되는 이미지마다 오토포커싱되지는 않는다. 오토포커스 과정은 (하루의 시작 시점에서 또는 시프트(shift)의 시작 시점에서) 주기적으로, 또는 예를 들어 온도 또는 다른 과정 변화가 적절한 센서에 의해 검출될 때, 또는 이미지 분석이 재포커싱에 대한 잠재적 필요성을 검출할 때 수행될 수 있다. 일부 경우에, 자동화 오토포커싱 과정은 약 10초의 지속 시간 내에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 오토포커스 절차는 하나의 랙(rack)의 샘플들(예컨대, 랙 당 10개의 샘플들)을 처리하기 전에 수행될 수 있다. 또한, 다른 실시 형태에서는, 혈액 이미지 분석이 하나의 프로세서에 의해 수행되게 하는 것 그리고 선택적으로 자신의 광센서 어레이와 관련된 별개의 프로세서가 고정된 표적(44)에 대한 오토포커싱하는 단계들을 취급하도록 배열되게 하는 것이 가능하다.
디지털 프로세서(18)는 프로그래밍된 시간에 또는 프로그래밍된 조건에서 또는 사용자 요구시에 오토포커싱하도록 구성되고 또한 입자들의 이미지-기반 범주화 및 하위범주화를 수행하도록 구성될 수 있다. 예시적인 입자들에는 세포, 백혈구, 적혈구 등이 포함된다.
일 실시 형태에서, 도 1 또는 도 1c의 디지털 프로세서(18)는 오토포커스 재개시 신호를 검출하도록 구성된다. 오토포커스 재개시 신호는 검출된 온도 변화, 픽셀 이미지 데이터의 파라미터들에 의해 인식된 바와 같은 포커스 품질의 감소, 시간 경과, 또는 사용자 입력에 의해 촉발될 수 있다. 유리하게, 재교정하기 위해 도 1에 도시된 변위 거리(52)를 측정한다는 의미에서 재교정하는 것이 필요하지 않다. 선택적으로, 오토포커스는 품질 제어를 위한 실시들 사이의 소정의 빈도수/간격으로 재교정되도록 그리고/또는 포커스를 유지하도록 프로그래밍될 수 있다.
변위 거리(52)는 플로우셀마다 약간 변하지만, 주어진 플로우셀에 대해서는 일정하게 유지된다. 플로우셀과 함께 이미지 분석기를 구비할 때 셋업 과정으로서, 변위 거리를 먼저 평가하고, 이어서 오토포커스 및 이미징 양상들이 발휘되는 교정 단계 동안에, 플로우셀에 대한 정확한 변위 거리가 결정되고 프로세서(18)의 프로그래밍 내로 상수로 입력된다.
따라서, 도 1d에 흐름도 형태로 도시된 바와 같이, 그리고 도 1 및/또는 도 1c의 혈액 분석기를 참조하면, 본 발명의 방법 및 장치에 따라 행해진 과정은 1회 교정하거나 또는 거의 교정하지 않는 것을 수반할 수 있다. 교정은 단계(110d)에 나타난 바와 같이, 조영 표적(44) 상에 포커싱하는 것, 리본형 샘플 스트림(32) 상에 포커싱하는 것, 및 이러한 두 위치들 사이의 광학 축을 따르는 변위를 기록하는 것을 포함할 수 있다. 그 변위는 상수로서 기록될 수 있다. 그 후에, 모터(54)를 제어하고 광센서 어레이로부터의 이미지 데이터를 분석함으로써, 단계(120d)에 나타난 바와 같이, 프로세서(18)는 표적(44)에 대해 오토포커싱하고 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) 및/또는 플로우셀(22)을 기록된 변위 거리만큼 서로에 대해 변위시킨다. 이어서, 리본형 샘플 스트림(32)이 인-포커스 상태로 되고, 그의 이미지는 규칙적인 간격으로, 특히 관찰구(57)에 있는 관찰 구역을 통과하는 리본형 샘플 스트림의 부분들의 사실상 중첩하지 않는 인접 뷰들을 수집하기에 충분한 간격으로 (단계(130d)에 나타난 바와 같이) 수집될 수 있고 그리고 (단계(140d)에 나타난 바와 같이) 처리될 수 있다. (단계(150d)에 나타난 바와 같이) 자체 모니터링이 열 팽창 차이로 인해 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) 및 플로우셀(22)의 상대 위치를 변경시키게 된 온도 변화 또는 데이터 이상(data anomaly)을 나타낼 경우, 이어서, (단계(160d)에 나타난 바와 같이) 오토포커스가 개시되고, 그 후 정규의 작동이 재개된다. 따라서, 오토포커싱 과정은 오토포커스 재개시 신호를 검출하는 것, 및 오토포커스 재개시 신호에 응답하여 오토포커싱하는 단계 및 이미지를 획득하는 단계를 반복하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 오토포커스 재개시 신호는 온도 변화, 포커스 품질의 감소, 경과된 시간 간격, 또는 사용자 입력을 포함할 수 있거나 또는 그들에 기초할 수 있다.
리본형 샘플 스트림의 선속도는 광센서 어레이의 이미지 노출 시간에 디지털화 이미지의 모션 블러링(motion blurring)을 방지하도록 충분히 제한될 수 있다. 광원은 선택적으로, 짧은 시간 동안 높은 입사 진폭을 적용하도록 플래싱되는 스트로브 광일 수 있다. 오토포커스 패턴(44) 및 이미지가 동일한 시야에 있기 때문에, 광원은 리본형 샘플 스트림 및 오토포커스 패턴을 동시에 조명하도록 구성된다. 그러나, 다른 실시 형태에서, 이미징을 위한 시야와 오토포커스를 위한 시야는 상이할 수 있으며, 예를 들어 별개로 조명 및/또는 이미징될 수 있다.
본 발명은 장치뿐만 아니라 방법 태양들도 갖는다. 시각적 분석기를 포커싱하는 방법은 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) - 이는 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스일 수 있음 - 를 플로우셀(22)에 대해 고정된 오토포커스 패턴(44) 상에 포커싱하는 단계를 포함하며, 여기서 오토포커스 패턴(44)은 리본형 샘플 스트림(32)으로부터의 변위 거리(52)에 위치된다. 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 리본형 샘플 스트림(32)과 교차하는 광학 축을 갖는 대물 렌즈를 갖는다. 대물 렌즈와 플로우셀(22) 사이의 상대 거리는 모터 드라이브(54)의 작동에 의해 변동되며, 한편 광학 고분해능 이미징 디바이스와 최적 포커스의 지점 사이의 광학 축을 따른 거리는 알고 있다. 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스는 광센서 어레이 상의 디지털화 이미지를 분해 및 수집하도록 구성된다. 모터 드라이브는 오토포커스 과정에서 오토포커스 패턴 상에 포커싱하도록 작동된다. 이어서, 모터 드라이브는 변위 거리에 걸쳐 작동되며, 그럼으로써 광학 고분해능 이미징 디바이스를 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱한다.
표적에 대해 오토포커싱을 이용하고 변위 거리만큼의 변위를 이용하여 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱하기에 적절한 거리를 얻을 수가 있다. 그러나, 유리하게는, 오토포커싱은 각각의 이미지 캡처에 대해 필요하지 않거나 또는 반복되지 않는다. 그러나, 오토포커싱은 소정의 조건으로 개시된다. 오토포커스 재개시 신호가 검출 또는 생성되어, 오토포커스 패턴 상에 재포커싱하는 단계, 변위 거리에 걸쳐 모터 드라이브를 작동하는 단계, 및 광학 고분해능 이미징 디바이스를 리본형 샘플 스트림 상에 재포커싱하는 단계로 이어질 수 있다. 오토포커스 재개시 신호는 예를 들어 온도 변화, 포커스 품질의 감소, 시간 경과, 다른 프로세스 파라미터들 또는 사용자 입력의 검출에 의해 야기될 수 있다.
도 1e는 예시적인 모듈 시스템의 간략화한 블록 다이어그램으로, 이는 모듈 시스템(100e)을 위한 개별 시스템 요소들이 어떻게 분리된 방식 또는 더 통합된 방식으로 구현될 수 있는지를 대략적으로 예시한다. 모듈 시스템(100e)은, 본 발명의 실시 형태들에 따른, 혈액 샘플 유체 중의 입자들을 이미징하기 위한 입자 분석 시스템의 일부이거나 또는 그와 접속될 수 있다. 모듈 시스템(100e)은 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 포커싱 및 이미징 기술들에 관련된 데이터 또는 명령어들을 생성하는 데, 포커싱 및 이미징 기술들에 관련된 입력을 수신하는 데, 그리고/또는 포커싱 및 이미징 기술들에 관련된 정보 또는 데이터를 처리하는 데 매우 적합하다. 일부 경우에, 모듈 시스템(100e)은, 버스 서브시스템(102e)을 통해 전기적으로 결합되는 하드웨어 요소들을 포함하는데, 이러한 요소들에는 하나 이상의 프로세서들(104e), 사용자 인터페이스 입력 디바이스들과 같은 하나 이상의 입력 디바이스들(106e), 및/또는 사용자 인터페이스 출력 디바이스들과 같은 하나 이상의 출력 디바이스들(108e)이 포함된다. 일부 경우에, 시스템(100e)은 네트워크 인터페이스(110e), 및/또는 이미징 시스템(142e)으로부터 신호들을 수신할 수 있고 그리고/또는 이미징 시스템(142e)으로 신호들을 송신할 수 있는 이미징 시스템 인터페이스(140e)를 포함한다. 일부 경우에, 시스템(100e)은 소프트웨어 요소들을 포함하는데, 예를 들어 여기에서는, 본 명세서에 개시된 기술들의 하나 이상의 태양들을 구현하도록 구성된 프로그램과 같은, 메모리(114e)의 작업 메모리(112e), 운영 체제(116e), 및/또는 기타 코드(118e) 내에 현재 위치되어 있는 것으로 도시되어 있다.
일부 실시 형태에서, 모듈 시스템(100e)은 본 명세서에 개시된 다양한 기술들의 기능을 제공하는 기본 프로그래밍 및 데이터 구성들을 저장할 수 있는 저장 서브시스템(120e)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법 태양들의 기능을 구현하는 소프트웨어 모듈들이 저장 서브시스템(120e)에 저장될 수 있다. 이들 소프트웨어 모듈들은 하나 이상의 프로세서들(104e)에 의해 실행될 수 있다. 분산형 환경에서, 소프트웨어 모듈들은 복수의 컴퓨터 시스템들 상에 저장될 수 있고, 복수의 컴퓨터 시스템들의 프로세서들에 의해 실행될 수 있다. 저장 서브시스템(120e)은 메모리 서브시스템(122e) 및 파일 저장 서브시스템(128e)을 포함할 수 있다. 메모리 서브시스템(122e)은, 프로그램 실행 동안 명령어들 및 데이터의 저장을 위한 메인 랜덤 액세스 메모리(RAM)(126e), 및 고정 명령어들이 저장되는 판독 전용 메모리(ROM)(124e)를 포함한 다수의 메모리들을 포함할 수 있다. 파일 저장 서브시스템(128e)은 프로그램 및 데이터 파일들을 위한 지속적(비휘발성) 저장소를 제공할 수 있고, 선택적으로 샘플, 환자, 치료, 평가, 또는 기타 데이터를 구현할 수 있는 유형적 저장 매체들을 포함할 수 있다. 파일 저장 서브시스템(128e)에는 하드 디스크 드라이브, 관련된 탈착식 매체들과 함께 있는 플로피 디스크 드라이브, 콤팩트 디지털 판독 전용 메모리(CD-ROM) 드라이브, 광학 드라이브, DVD, CD-R, CD RW, 솔리드-스테이트 탈착식 메모리, 기타 탈착식 매체 카트리지들 또는 디스크들 등이 포함될 수 있다. 드라이브들 중 하나 이상은 모듈 시스템(100e)에 커플링된 다른 장소에 있는 다른 접속된 컴퓨터들 상의 원격 위치들에 위치될 수 있다. 일부 경우에, 시스템들은, 하나 이상의 프로세서들에 의해 실행될 때, 하나 이상의 프로세서들로 하여금 본 명세서에 개시된 기술 또는 방법의 임의의 태양을 수행하게 할 수 있는 명령어들의 하나 이상의 시퀀스들을 저장하는 컴퓨터-판독가능 저장 매체 또는 다른 유형적 저장 매체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 기술들의 기능을 구현하는 하나 이상의 모듈들이 파일 저장 서브시스템(128e)에 의해 저장될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 소프트웨어 또는 코드는 모듈 시스템(100e)이 통신 네트워크(130e)와 통신할 수 있게 하는 프로토콜을 제공할 것이다. 선택적으로, 그러한 통신에는 다이얼-업(dial-up) 또는 인터넷 접속 통신이 포함될 수 있다.
시스템(100e)이 본 발명의 방법의 다양한 태양들을 수행하도록 구성될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 프로세서 컴포넌트 또는 모듈(104e)은 센서 입력 디바이스 또는 모듈(132e)로부터, 사용자 인터페이스 입력 디바이스 또는 모듈(106e)로부터, 그리고/또는 이미징 시스템(142e)으로부터, 선택적으로, 이미지 시스템 인터페이스(140e) 및/또는 네트워크 인터페이스(110e)와 통신 네트워크(130e)를 경유하여 온도 파라미터 신호들 및/또는 플로우셀 작동 파라미터들을 수신하도록 구성된 마이크로프로세서 제어 모듈일 수 있다. 일부 경우에, 센서 입력 디바이스(들)는 혈액 유체 샘플의 이미지들을 얻도록 구비된 입자 분석 시스템을 포함할 수 있거나 또는 그의 일부일 수 있다. 일부 경우에, 사용자 인터페이스 입력 디바이스(들)(106e) 및/또는 네트워크 인터페이스(110e)는 이미지 파라미터들을 얻도록 구비된 입자 분석 시스템에 의해 생성된 이미지 파라미터 신호들을 수신하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 이미징 시스템(142e)은 혈액 유체 샘플에 관련된 이미지 파라미터들을 얻도록 구비된 입자 분석 시스템을 포함할 수 있거나 또는 그의 일부일 수 있다.
프로세서 컴포넌트 또는 모듈(104e)은 또한, 본 명세서에 개시된 기술들 중 임의의 것에 따라 선택적으로 처리되는, 입자 분석 파라미터 신호들 또는 이미지 파라미터 신호들을 센서 출력 디바이스 또는 모듈(136e)에, 사용자 인터페이스 출력 디바이스 또는 모듈(108e)에, 네트워크 인터페이스 디바이스 또는 모듈(110e)에, 이미징 시스템 인터페이스(140e)에, 또는 이들의 임의의 조합으로 송신하도록 구성될 수 있다. 본 발명의 실시 형태들에 따른 디바이스들 또는 모듈들 각각은 프로세서에 의해 처리되는 컴퓨터 판독가능 매체 상의 하나 이상의 소프트웨어 모듈들, 또는 하드웨어 모듈들, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 윈도우(Windows), 매킨토시(MacIntosh), 및 유닉스(Unix)와 같이 보편적으로 사용되는 다양한 플랫폼들 중 임의의 것이, 보편적으로 사용되는 다양한 프로그래밍 언어들 중 임의의 것과 함께, 본 발명의 실시 형태들을 구현하는 데 사용될 수 있다.
사용자 인터페이스 입력 디바이스들(106e)에는, 예를 들어 터치패드, 키보드, 포인팅 디바이스, 예컨대 마우스, 트랙볼, 그래픽 태블릿, 스캐너, 조이스틱, 디스플레이 내에 포함된 터치 스크린, 오디오 입력 디바이스들, 예컨대 음성 인식 시스템들, 마이크로폰들, 및 기타 유형의 입력 디바이스들이 포함될 수 있다. 사용자 입력 디바이스들(106e)은 또한 유형적 저장 매체들로부터 또는 통신 네트워크(130e)로부터 컴퓨터 실행가능 코드를 다운로딩할 수 있으며, 이러한 코드는 본 명세서에 개시된 방법 또는 그의 태양들 중 임의의 것을 구현한다. 단말기 소프트웨어가 때때로 업데이트될 수 있고 적절한 경우에 단말기에 다운로딩될 수 있음이 이해될 것이다. 일반적으로, "입력 디바이스"라는 용어의 사용은 정보를 모듈 시스템(100e)에 입력하기 위한 다양한 종래의 전용 디바이스들 및 방식들을 포함하는 것으로 의도된다.
사용자 인터페이스 출력 디바이스들(106e)에는, 예를 들어 디스플레이 서브시스템, 프린터, 팩시밀리, 또는 오디오 출력 디바이스들과 같은 비시각적 디스플레이들이 포함될 수 있다. 디스플레이 서브시스템은 음극선관(CRT), 액정 디스플레이(LCD)와 같은 평판 디바이스, 프로젝션 디바이스 등일 수 있다. 디스플레이 서브시스템은 또한 비시각적 디스플레이를 제공할 수 있으며, 예컨대 오디오 출력 디바이스들을 통해 제공할 수 있다. 일반적으로, "출력 디바이스"라는 용어의 사용은 정보를 모듈 시스템(600)으로부터 사용자에게 출력하기 위한 다양한 종래의 전용 디바이스들 및 방식들을 포함하는 것으로 의도된다.
버스 서브시스템(102e)은 모듈 시스템(100e)의 다양한 컴포넌트들 및 서브시스템들이 의도에 따라 또는 요구에 따라 서로 통신하게 하기 위한 메커니즘을 제공한다. 모듈 시스템(100e)의 다양한 서브시스템들 및 컴포넌트들은 동일한 물리적 위치에 있어야 하는 것이 아니라, 분산형 네트워크 내의 다양한 위치들에 분포될 수 있다. 버스 서브시스템(102e)이 개략적으로 단일 버스로서 도시되어 있지만, 버스 서브시스템의 대안적인 실시 형태들은 다수의 버스들을 이용할 수 있다.
네트워크 인터페이스(110e)는 외부 네트워크(130e) 또는 기타 디바이스들에 대한 인터페이스를 제공할 수 있다. 외부 통신 네트워크(130e)는 필요에 따라 또는 요구에 따라 제3자와의 통신을 실시하도록 구성될 수 있다. 이에 따라, 그것은 모듈 시스템(100e)으로부터 전자 패킷을 수신할 수 있고, 필요에 따라 또는 요구에 따라 임의의 정보를 모듈 시스템(100e)으로 다시 송신할 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 통신 네트워크(130e) 및/또는 이미징 시스템 인터페이스(142e)는 혈액 유체 샘플에 상응하는 이미지들 또는 이미지 파라미터들을 얻도록 구비된 이미징 시스템(142e)으로 정보를 송신할 수 있거나 또는 이미징 시스템(142e)으로부터 정보를 수신할 수 있다.
시스템 내부에 그러한 인프라구조 통신 링크들을 제공하는 것 외에도, 통신 네트워크 시스템(130e)은 또한 인터넷과 같은 다른 네트워크들에 대한 접속을 제공할 수 있고, 유선, 무선, 모뎀, 및/또는 기타 유형의 인터페이싱 접속을 포함할 수 있다.
사실상의 변형들이 특정 요건들에 따라 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 맞춤형 하드웨어가 또한 사용될 수 있고/있거나 특정 요소들이 하드웨어, 소프트웨어(애플릿(applet)들과 같은 휴대용 소프트웨어를 포함함), 또는 둘 모두로 구현될 수 있다. 또한, 네트워크 입력/출력 디바이스들과 같은 다른 컴퓨팅 디바이스들에 대한 접속이 채용될 수 있다. 모듈 단말기 시스템(100e) 자체는 컴퓨터 단말기, 개인용 컴퓨터, 휴대용 컴퓨터, 워크스테이션, 네트워크 컴퓨터, 또는 임의의 다른 데이터 처리 시스템을 포함한 다양한 유형의 것일 수 있다. 컴퓨터들 및 네트워크들의 변화무쌍한 성격으로 인해, 도 1e에 도시된 모듈 시스템(100e)의 설명은 본 발명의 하나 이상의 실시 형태를 예시하려는 목적을 위한 구체적인 예인 것으로만 의도된다. 모듈 시스템(100e)의 많은 다른 구성들은 도 1e에 도시된 모듈 시스템보다 더 많거나 또는 더 적은 컴포넌트들을 갖는 것이 가능하다. 모듈 시스템(100e)의 모듈들 또는 컴포넌트들, 또는 그러한 모듈들 또는 컴포넌트들의 임의의 조합 중 임의의 것이, 본 명세서에 개시된 입자 분석 및/또는 이미징 시스템 실시 형태들 중 임의의 것과 결합될 수 있거나, 또는 그에 통합될 수 있거나, 또는 달리 그와 접속하도록 구성될 수 있다. 이와 관련하여, 상기에 논의된 하드웨어 및 소프트웨어 컴포넌트들 중 임의의 것이, 다른 위치들에서 사용되는 다른 의료 평가 또는 치료 시스템들과 통합될 수 있거나 또는 그와 인터페이싱하도록 구성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 모듈 시스템(100e)은 입력 모듈에서 혈액 유체 샘플의 하나 이상의 이미지 파라미터들을 수신하도록 구성될 수 있다. 이미지 파라미터 데이터는 평가 모듈로 송신될 수 있는데, 여기서는 이미지 데이터의 분석에 기초하여 진단 결과 또는 다른 결과가 예측 또는 결정될 수 있다. 이미지 데이터 또는 진단 데이터는 출력 모듈을 통해 시스템 사용자에게 출력될 수 있다. 일부 경우에, 모듈 시스템(100e)은, 예를 들어 진단 모듈을 사용함으로써 혈액 유체 샘플에 대한 진단 결과를 결정할 수 있다. 진단 정보는 출력 모듈을 통해 시스템 사용자에게 출력될 수 있다. 선택적으로, 진단의 소정 양상들은 출력 디바이스에 의해 결정되고, 진단 시스템으로 또는 진단 시스템의 서브디바이스로 송신될 수 있다. 혈액 유체 샘플, 또는 샘플을 얻은 환자에 관한 다양한 데이터 중 임의의 것이 모듈 시스템에 입력될 수 있으며, 이러한 데이터에는 연령, 체중, 성별, 치료 이력, 병력 등이 포함된다. 그러한 데이터에 기초하여 치료 계획(treatment regimen) 또는 진단 평가의 파라미터들이 결정될 수 있다.
이와 관련하여, 일부 경우에, 시스템은 입력으로서 이미지 데이터를 수신하도록 구성된 프로세서를 포함한다. 선택적으로, 프로세서, 저장 매체, 또는 둘 모두가 혈액학 기계 또는 입자 분석 기계 내에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 혈액학 기계는 프로세서 내로의 입력을 위한 이미지 데이터 또는 기타 정보를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 프로세서, 저장 매체, 또는 둘 모두가 컴퓨터 내에 통합될 수 있고, 컴퓨터는 혈액학 기계와 통신할 수 있다. 일부 경우에, 프로세서, 저장 매체, 또는 둘 모두가 컴퓨터 내에 포함될 수 있고, 컴퓨터는 네트워크를 통해 혈액학 기계와 원격 통신할 수 있다.
플로우셀
플로우셀(22)의 실용적인 실시 형태가 도 2 및 도 3에 추가로 도시되어 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 플로우셀(22)은 샘플 공급원(25)과 커플링되고 또한 PIOAL 재료의 공급원(27)에 커플링될 수 있다. 샘플 유체는 캐뉼러(29)를 거쳐, 예를 들어 캐뉼러(29)의 원위 출구(31)를 통해 플로우셀(22) 내로 주입된다. 전형적으로, PIOAL 시스 유체는, 그것이 공급원(27)으로부터 관찰 구역(23)을 향해 플로우셀 내의 곡선형 채널 섹션(41)을 통해 이동함에 따라 층류 상태에 있지 않다. 그러나, 플로우셀(22)은, 유동하는 PIOAL 시스 유체 내로 샘플 유체가 도입되는 곳인 원위 출구(31)를 지나서 PIOAL 시스 유체가 유동함에 따라, PIOAL 시스 유체가 층류이거나 층류가 되도록 또는 편평한 속도 프로파일을 제공하도록 구성될 수 있다. 샘플 유체 및 PIOAL은 화살표 A로 대체로 표시된 방향으로 플로우셀(22)을 따라 유동하고, 이어서 배출구(33)를 통해 플로우셀(22)로부터 유출될 수 있다. 플로우셀(22)은 유동 방향(A)으로 (예를 들어, 전이 구역(21)에서) 대칭적으로 협소화되는 내부 유로(20)를 한정한다. 유로의 대칭은 샘플 스트림의 확고하고 중심화된 유동에 기여한다. 플로우셀(22)은 PIOAL로 봉입된 샘플의 유동(32)을 플로우셀 내의 관찰 구역(23) - 즉, 관찰구(57) 뒤에 있음 - 을 통해 지향시키도록 구성된다. 오토포커스 패턴(44)이 관찰구(57)와 관련된다. 플로우셀(22)은 또한 현미경 대물 렌즈(도시되지 않음)를 수용하거나 받아들이도록 구성된 둥근형 또는 리세스형 안착부(seat)(58)를 갖는다.
일부 실시 형태에 따르면, 오토포커스 패턴(44)은 플로우셀(22)에 대해 고정되고 리본형 샘플 스트림(32)의 평면으로부터의 변위 거리에 놓여진 위치를 가질 수 있다. 여기에 도시된 실시 형태에서, 오토포커스 패턴(표적(44))은 광학 고분해능 이미징 디바이스(도시되지 않음)에 의해 관찰구(57)를 통해 수집된 이미지에서 가시적인 위치에서 플로우셀(22)에 직접 적용된다. 플로우셀(22)은 단일 조각의 재료로 구성될 수 있다. 대안적으로, 플로우셀(22)은 제1 또는 상부 섹션 또는 층(22a) 및 제2 또는 하부 섹션 또는 층(22b)으로 구성될 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 유리 또는 투명 창 판자(60)가 제1 섹션(22a)에 부착되거나 그와 일체화된다. 판자(60)는 플로우셀 내의 샘플 유로의 적어도 일부분을 한정할 수 있다. 광원(42)으로부터의 광은 유동 스트림(32) 내에서 유동하는 샘플 입자들을 조명하도록 오토포커스 패턴(44)의 개구부 또는 통로를 통해 이동할 수 있다.
일부 경우에, 판자(60)의 두께는 약 150 μm 내지 약 170 μm 범위의 값을 가질 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 판자(60)는 유로 또는 시스(예를 들어, PIOAL) 채널의 일부를 한정 또는 형성할 수 있다. 박형 판자(60)를 사용함으로써, 샘플 유체 리본에 매우 근접하게 현미경 대물 렌즈를 배치하고, 이에 따라 유로를 따라 유동하는 입자들의 고확대 이미지를 얻는 것이 가능하다.
도 3a는 플로우셀 실시 형태의 태양들을 도시하는데, 이 실시 형태에서는 이미징 축(355)과 원위 전이 구역 부분(316) 사이의 거리가 약 8.24 mm이다. 원위 전이 구역 부분(316)과 캐뉼러 출구(331) 사이의 거리는 약 12.54 mm이다. 캐뉼러 출구(331)와 시스 유체 입구(301) 사이의 거리는 약 12.7 mm이다. 캐뉼러 출구(331)와 근위 전이 구역 부분(318) 사이의 거리는 약 0.73 mm이다. 도 3b는 플로우셀 실시 형태의 태양들을 도시하는데, 이 실시 형태에서는 도 3a의 실시 형태와 비교하여 캐뉼러 출구가 전이 구역에 대해 더 원위인 위치로 이동되었다. 여기에 도시된 바와 같이, 캐뉼러 원위 단부는 플로우셀의 협소화 전이 구역 내로 전진되어 있으며, 이미징 축(355)과 원위 전이 구역 부분(316) 사이의 거리가 약 16 mm 내지 약 26 mm 범위이다. 일부 경우에, 이미징 축(355)과 원위 전이 구역 부분(316) 사이의 거리는 약 21 mm이다.
도 1을 다시 참고하면, (예를 들어, 전이 구역(21)에서의) 플로우셀 내부 윤곽 및 PIOAL과 샘플의 유량은, 샘플이 리본형 스트림(32)으로 형성되도록 조정될 수 있다. 이러한 스트림은 대략적으로, 리본형 샘플 스트림 내에 봉입되는 입자들만큼 박형이거나 또는 심지어 이들보다 더 박형일 수 있다. 백혈구는, 예를 들어 직경이 약 10 μm일 수 있다. 두께가 10 μm 미만인 리본형 샘플 스트림을 제공함으로써, 리본형 샘플 스트림이 시스 유체 또는 PIOAL에 의해 연신될 때 세포들이 배향될 수 있다. 의외로 리본형 샘플 스트림과 상이한 점도의, 예컨대 더 높은 점도의 PIOAL 층들 내의 협소화 유로를 따라 리본형 샘플 스트림을 연신하는 것은, 유리하게는 유동 방향과 사실상 평행한 평면 내에 비구형 입자들을 정렬시키고 세포들 상에 힘을 인가하여 세포들의 세포내 구조의 인-포커스 내용물을 개선하는 경향이 있다. 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 광학 축은 리본형 샘플 스트림의 평면에 사실상 수직(직각)이다. 이미징 지점에서의 리본형 샘플 스트림의 선속도는, 예를 들어 20 내지 200 mm/sec일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 리본형 샘플 스트림의 선속도는, 예를 들어 50 내지 150 mm/sec일 수 있다.
리본형 샘플 스트림 두께는 샘플 유체 및 PIOAL의 상대 점도 및 유량에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 정밀 변위 펌프를 포함하는 샘플의 공급원(25) 및/또는 PIOAL의 공급원(27)은 리본형 샘플 스트림(32)의 치수를 최적화하기에 제어가능한 유량으로, 즉 적어도 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 시야만큼 넓은 박형 리본으로서 샘플 및/또는 PIOAL을 제공하도록 구성될 수 있다.
일 실시 형태에서, PIOAL 공급원(27)은 사전결정된 점도의 PIOAL을 제공하도록 구성된다. 그러한 점도는 샘플의 점도와 상이할 수 있으며, 샘플의 점도보다 더 높을 수 있다. PIOAL의 점도 및 밀도, 샘플 재료의 점도, PIOAL의 유량 및 샘플 재료의 유량을 조정하여, 오토포커스 패턴으로부터의 변위 거리에서, 그리고 사전결정된 치수 특성으로, 예컨대 유리한 리본형 샘플 스트림 두께로 리본형 샘플 스트림을 유지한다.
실용적인 실시 형태에서, PIOAL은 샘플보다 더 높은 선속도 및 샘플보다 더 높은 점도를 가지며, 그럼으로써 샘플을 편평한 리본으로 연신시킨다. PIOAL의 점도는 최대 10 센티푸아즈일 수 있다.
도 2 및 도 3을 또한 참고하면, 플로우셀의 내부 유로는 PIOAL 내로의 리본형 샘플 스트림의 주입 지점의 하류에서 협소화되어, 예를 들어 최대 7 μm의 리본형 샘플 스트림 두께를 생성하고/하거나, 내부 유로는 500 내지 3,000 μm의 리본형 샘플 스트림 폭을 생성한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 예시적인 실시 형태에서, 플로우셀의 내부 유로는 PIOAL 내로의 샘플 스트림의 주입 지점의 상류에서 협소화 전이 구역을 시작한다.
다른 실시 형태에서, 내부 유로는 협소화되어서 2 내지 4 μm 두께의 리본형 샘플 스트림 두께를 생성하고/하거나, 내부 유로는 2000 μm 폭의 리본형 샘플 스트림을 생성한다. 이들 치수는 혈액학에 특히 유용하다. 이러한 경우에 스트림의 두께는 일부 입자들, 예컨대 완화된 상태에서의 적혈구의 직경 미만이다. 따라서, 이러한 입자들은 그들의 더 넓은 치수가 이미징 축에 대면하도록 재배향되게 될 수 있으며, 이는 구분되는 특성을 밝혀내는 데 도움이 된다.
리본형 샘플 스트림의 선속도는 광센서 어레이의 이미지 노출 시간에 디지털화 이미지의 모션 블러링을 방지하도록 충분히 제한될 수 있다. 광원은 선택적으로, 짧은 시간 동안 높은 입사 진폭을 적용하도록 플래싱되는 스트로브 광일 수 있다. 오토포커스 패턴(44) 및 이미지가 동일한 시야에 있기 때문에, 광원은 리본형 샘플 스트림 및 오토포커스 패턴을 동시에 조명하도록 구성된다. 그러나, 다른 실시 형태에서, 이미징을 위한 시야와 오토포커스를 위한 시야는 상이할 수 있으며, 예를 들어 별개로 조명 및/또는 이미징될 수 있다.
본 발명은 장치뿐만 아니라 방법 태양들도 갖는다. 시각적 분석기를 포커싱하는 방법은 광학 고분해능 이미징 디바이스(24) - 이는 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스일 수 있음 - 를 플로우셀(22)에 대해 고정된 오토포커스 패턴(44) 상에 포커싱하는 단계를 포함하며, 여기서 오토포커스 패턴(44)은 리본형 샘플 스트림(32)으로부터의 변위 거리(52)에 위치된다. 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 리본형 샘플 스트림(32)과 교차하는 광학 축을 갖는 대물 렌즈를 갖는다. 대물 렌즈와 플로우셀(22) 사이의 상대 거리는 모터 드라이브(54)의 작동에 의해 변동되며, 한편 광학 고분해능 이미징 디바이스와 최적 포커스의 지점 사이의 광학 축을 따른 거리는 알고 있다. 디지털 광학 고분해능 이미징 디바이스는 광센서 어레이 상의 디지털화 이미지를 분해 및 수집하도록 구성된다. 모터 드라이브는 오토포커스 과정에서 오토포커스 패턴 상에 포커싱하도록 작동된다. 이어서, 모터 드라이브는 변위 거리에 걸쳐 작동되며, 그럼으로써 광학 고분해능 이미징 디바이스를 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱한다.
본 방법은 리본형 샘플 스트림을 리본 형상으로 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 리본 형상은, 광학 고분해능 이미징 디바이스의 광학 축이 리본형 샘플 스트림에 사실상 직각이 되도록, 즉 리본형 스트림의 평면에 수직이 되도록 제공된다.
도 4는 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 시스템(400)의 태양들을 도시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 시스템(400)은 샘플 유체 주입 시스템(410), 플로우셀(420), 및 이미지 캡처 디바이스(430), 및 프로세서(440)를 포함한다. 플로우셀(420)은 시스 유체의 유동을, 선택적으로 샘플 유체와 조합하여 전송하는 유로(422)를 제공한다. 일부 실시 형태에 따르면, 샘플 유체 주입 시스템(410)은 캐뉼러 또는 관(412)을 포함하거나 또는 이와 커플링될 수 있다. 샘플 유체 주입 시스템(410)은 유로(422)와 (예를 들어, 샘플 유체 입구(402)를 통해) 유체 연통될 수 있으며, 캐뉼러(412)의 원위 출구(413)를 통해 그리고 플로우셀(420) 내의 유동하는 시스 유체(426) 내로 샘플 유체(424)를 주입하여 샘플 유체 스트림(428)을 제공하도록 작동될 수 있다. 예를 들어, 프로세서(440)는 컴퓨터 애플리케이션을 갖는 저장 매체를 포함하거나 또는 이와 작동식으로 관련될 수 있는데, 컴퓨터 애플리케이션은, 프로세서에 의해 실행될 때, 샘플 유체 주입 시스템(410)으로 하여금 샘플 유체(424)를 유동하는 시스 유체(426) 내로 주입하게 하도록 구성된다. 여기에 도시된 바와 같이, 시스 유체(426)는 시스 유체 주입 시스템(450)에 의해(예를 들어, 시스 유체 입구(401)를 통해) 플로우셀(420) 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 프로세서(440)는 컴퓨터 애플리케이션을 갖는 저장 매체를 포함하거나 또는 이와 작동식으로 관련될 수 있는데, 컴퓨터 애플리케이션은, 프로세서에 의해 실행될 때, 시스 유체 주입 시스템(450)으로 하여금 시스 유체(426)를 플로우셀(420) 내로 주입하게 하도록 구성된다. 도 4에 도시된 바와 같이, 캐뉼러(412)의 원위 출구(413)는 협소화 전이 구역(419)의 길이를 따라 중심 위치에 위치될 수 있다. 일부 경우에, 원위 출구는 전이 구역(419)의 시작부(근위 부분)에 더 근접하게 위치될 수 있다. 일부 경우에, 원위 출구는 전이 구역(419)의 단부(원위 부분)에 더 근접하게 위치될 수 있다. 일부 경우에, 원위 출구(413)는 전이 구역(419)의 완전히 밖에 위치될 수 있는데, 예를 들어 이는 도 3a(여기서는 원위 출구(331)가 협소화 전이 구역에 근접하게 배치됨)에 도시된 바와 같다.
샘플 유체 스트림(428)은 주입관(412)에 인접해서 제1 두께 T1을 갖는다. 플로우셀의 유로(422)는, 샘플 유체 스트림(428)의 두께가 초기 두께 T1로부터 이미지 캡처 영역(432)에 인접하여 제2 두께 T2로 감소되도록 한 유로 크기의 감소부를 갖는다. 이미지 캡처 디바이스(430)는, 플로우셀(420)의 이미지 캡처 영역(432)에서 제1 샘플 유체로부터의 제1 복수의 입자들을 이미징하도록, 이미지 캡처 영역(432)과 정렬된다.
프로세서(440)는 샘플 유체 주입기 시스템(410), 이미지 캡처 디바이스(430), 및 선택적으로 시스 유체 주입 시스템(450)과 커플링된다. 프로세서(440)는 유동하는 시스 유체(426) 내로의 제1 샘플 유체의 주입을 종료하고 유동하는 시스 유체(426) 내로의 제2 샘플 유체의 주입을 시작하여 샘플 유체 과도상태가 개시되도록 구성된다. 예를 들어, 프로세서(440)는 컴퓨터 애플리케이션을 갖는 저장 매체를 포함하거나 또는 이와 작동식으로 관련될 수 있는데, 컴퓨터 애플리케이션은, 프로세서에 의해 실행될 때, 샘플 유체 주입 시스템(410)으로 하여금 제2 샘플 유체를 유동하는 시스 유체(426) 내로 주입하여 샘플 유체 과도상태가 개시되게 하도록 구성된다.
또한, 프로세서(440)는 샘플 유체 과도상태 후에 그리고 제1 복수의 입자들을 이미징하고 나서 4초 이내에 플로우셀(420)의 이미지 캡처 영역(432)에서 제2 샘플 유체로부터의 제2 복수의 입자들의 이미지의 캡처를 개시하도록 구성된다. 예를 들어, 프로세서(440)는 컴퓨터 애플리케이션을 갖는 저장 매체를 포함하거나 또는 이와 작동식으로 관련될 수 있는데, 컴퓨터 애플리케이션은, 프로세서에 의해 실행될 때, 이미지 캡처 디바이스(430)로 하여금 샘플 유체 과도상태 후에 그리고 제1 복수의 입자들을 이미징하고 나서 4초 이내에 플로우셀(420)의 이미지 캡처 영역(432)에서 제2 샘플 유체로부터의 제2 복수의 입자들의 이미지의 캡처를 개시하게 하도록 구성된다.
일부 실시 형태에서, 프로세서(440)는 컴퓨터 애플리케이션을 갖는 저장 매체를 포함하거나 또는 그와 작동식으로 관련될 수 있는데, 컴퓨터 애플리케이션은, 프로세서에 의해 실행될 때, 플로우셀 이동 제어 메커니즘(442)으로 하여금, 예를 들어 이미지 캡처 디바이스(430)에 대해 플로우셀(420)의 위치를 조절하게 하도록 구성된다. 일부 실시 형태에서, 프로세서(440)는 컴퓨터 애플리케이션을 갖는 저장 매체를 포함하거나 또는 그와 작동식으로 관련될 수 있는데, 컴퓨터 애플리케이션은, 프로세서에 의해 실행될 때, 이미지 캡처 디바이스 이동 제어 메커니즘(444)으로 하여금, 예를 들어 플로우셀(420)에 대해 이미지 캡처 디바이스(430)의 위치를 조절하게 하도록 구성된다. 이동 제어 메커니즘들(442, 444)은 각각 모터들, 짐벌들, 및 플로우셀과 이미지 캡처 디바이스 내의 이동을 가능하게 하고 생성하는 다른 기계적 특징부들을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 플로우셀 제어 메커니즘(442) 및/또는 이미지 캡처 디바이스 제어 메커니즘(444)은 플로우셀에 대해 이미지 캡처 디바이스의 전동식 및 자동화 포커싱을 제공하는 고정밀도 스테퍼 모터 제어를 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 프로세서는 이미지 캡처 디바이스(24)의 이동을 제어할 수 있다. 유사하게, 도 1b에 도시된 바와 같이, 프로세서는 플로우셀 캐리어(55)의 이동을 제어할 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시 형태들은 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 수행하는 입자 분석 시스템을 포함한다. 예시적인 시스템은 주입관을 갖는 유로 및 이미징 축이 통과하는 이미징 창을 구비한 플로우셀을 포함할 수 있다. 플로우셀의 유로는 유로 크기의 감소부를 가질 수 있다. 또한, 분석기 시스템은 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구, 및 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 입구를 포함할 수 있다. 혈액 유체 입구는 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 구성될 수 있다. 시스 유체는 혈액 유체 샘플의 점도보다 더 큰 점도를 가질 수 있다. 더욱이, 분석기 시스템은 이미지 캡처 디바이스, 및 플로우셀에 대해 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태를 설정하는 포커싱 메커니즘을 포함할 수 있다. 또한, 시스템은 플로우셀에 대해 고정된 위치를 갖는 이미징 표적을 포함할 수 있는데, 이 경우, 이미징 표적 및 샘플 유동 스트림은 이미징 축을 따르는 변위 거리를 한정한다. 시스템은 또한 프로세서 및 포커싱 모듈을 포함할 수 있고, 이 포커싱 모듈은 변위 거리를 이용하여, 입자 특성화 및 카운팅에 적합한 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태를 설정하도록 포커싱 메커니즘을 작동하기 위해 프로세서 상에 실행된 기계 판독가능 코드를 구현하는 유형적 매체를 갖는다. 시스 유체와 혈액 유체 샘플 사이의 점도 차이는, 유로 크기의 감소부와 조합하여, 혈액 유체 샘플 중의 세포들의 생존능력을 유지하면서 이미징 축에서 제1 및 제2 샘플 유체를 하이드로포커싱하기에 효과적일 수 있다. 일부 경우에, 포커싱 메커니즘은 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하도록 구성된 드라이브 모터를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 분석기 시스템(400)은 도 4에 도시된 바와 같이, 플로우셀(420)과 열적으로 커플링되는 온도 또는 열 센서(448)를 포함할 수 있다. 프로세서와 작동적으로 관련될 수 있는 포커싱 모듈은, 온도 센서에 의해 감지된 온도의 변화 및 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계에 응답하여, 입자 특성화 및 카운팅에 적합한 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태 또는 초점 평면을 설정하도록 포커싱 메커니즘(예컨대, 플로우셀 제어 메커니즘(442) 또는 이미지 캡처 디바이스 제어 메커니즘(444))을 작동하기 위해 프로세서 상에 실행되는 기계 판독가능 코드를 구현하는 유형적 매체를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시 형태는 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플(424) 중의 복수의 입자들을 이미징하기 위한 시스템(400)을 포함한다. 시스템(400)은 사전결정된 점도 차이 범위 내의 일정 점도 차이만큼 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 갖는 시스 유체(426)와 함께 사용될 수 있다. 시스템(400)은 유로(422) 및 샘플 유체 주입관(412)을 갖는 플로우셀(420)을 포함할 수 있다. 유로(422)는 유로 크기의 감소부 또는 협소화 전이 구역을 가질 수 있다. 또한, 시스템(400)은, 플로우셀(420)의 유로(422)를 따라 시스 유체의 유동을 전송하도록 하기 위해 플로우셀(420)의 유로(422)와 유체 연통하는 시스 유체 입구(401)를 포함할 수 있다. 시스템(400)은 또한, 플로우셀(420) 내의 유동하는 시스 유체(428) 내로의 혈액 유체 샘플의 유동 또는 스트림(428)을 주입하도록 하기 위해 플로우셀(420)의 주입관(412)과 유체 연통하는 혈액 유체 샘플 입구(402)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플 유체(424)는 캐뉼러(412)의 원위 출구(423)를 빠져나가서, 유동하는 시스 유체(426)의 봉입물 내로 진입하여, 그 안에서 샘플 리본(428)을 형성할 수 있다.
시스 유체(426)가, 샘플 유체(424)로부터 형성된 샘플 유체 리본(428)과 함께, 유로 크기의 감소부(419)를 통해 그리고 이미징 영역(432)을 향해 유동함에 따라, 점도 차이와 관련된 시스 유체(426)와 샘플 유체(424) 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과가, 유로 크기의 감소부와 관련된 시스 유체(426)와 샘플 유체(424) 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 이미징 영역(432)에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공한다. 여기에 도시된 바와 같이, 시스템(400)은 또한 이미징 영역(432)에서 복수의 입자들을 이미징하는 이미징 디바이스(430)를 포함한다.
도 4a에 도시된 플로우셀 실시 형태에 도시된 바와 같이, (예를 들어, 전이 구역(419a)에서의) 유로 크기의 감소부는 유로(422a)의 대향되는 벽들(421a, 423a)에 의해 한정될 수 있다. 대향되는 벽들(421a, 423a)은, 샘플 유체 스트림(428a)을 이등분하는 횡방향 평면(451a) 주위에서 대체로 대칭인 유로(422a)를 따라 반경방향으로 내향으로 경사질 수 있다. 평면(451a)은 샘플 스트림(428a)을 이등분할 수 있으며, 여기서 샘플 스트림은 샘플 스트림(428a)이 캐뉼러 또는 샘플 주입관(412a)의 원위 부분(427a)을 빠져나가는 위치에서 제1 두께 T1을 갖는다. 유사하게, 평면(451a)은 샘플 스트림(428a)을 이등분할 수 있으며, 여기서 샘플 스트림은 샘플 스트림(428a)이 이미지 캡처 영역(432a)을 통과하는 위치에서 제2 두께 T2를 갖는다. 일부 실시 형태에 따르면, 제1 두께 T1은 약 150 μm의 값을 갖고, 제2 두께 T2는 약 2 μm의 값을 갖는다. 그러한 경우에, 샘플 리본 스트림의 압축비는 75:1이다. 일부 실시 형태에 따르면, 제1 두께 T1은 약 50 μm 내지 약 250 μm 범위의 값을 갖고, 제2 두께 T2는 약 2 μm 내지 약 10 μm 범위의 값을 갖는다. 샘플 스트림 유체가 플로우셀을 통해 유동됨에 따라, 리본은 그것이 가속되고 연신됨에 따라 박형화된다. 플로우셀의 2가지 특징은 샘플 유체 리본의 박형화에 기여할 수 있다. 첫째, 시스 유체 봉입물과 샘플 유체 리본 사이의 속도 차이가 리본의 두께를 감소시키도록 작동할 수 있다. 둘째, 전이 구역의 테이퍼진(tapered) 기하학적 형태가 리본의 두께를 감소시키도록 작동할 수 있다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 캐뉼러(412a)의 원위 출구(413a)는 협소화 전이 구역(419a)의 길이를 따라 중심 위치에 위치될 수 있다. 일부 경우에, 원위 출구는 전이 구역(419a)의 시작부(근위 부분(415a))에 더 근접하게 위치될 수 있다. 일부 경우에, 원위 출구는 전이 구역(419a)의 단부(원위 부분(416a))에 더 근접하게 위치될 수 있다. 일부 경우에, 원위 출구(413a)는 전이 구역(419a)의 완전히 밖에 위치될 수 있는데, 예를 들어 이는 도 3a(여기서는 원위 출구(331)가 협소화 전이 구역에 근접하게 배치됨)에 도시된 바와 같다.
도 4a에(뿐만 아니라 도 4 및 도 4b-1에도) 도시된 바와 같이, 전이 구역(419a)은 근위 부분(415a) 및 원위 부분(416a)에서의 각진 전이부들에 의해 한정될 수 있다. 또한, 전이 구역(419a)은 근위 부분(415a) 및 원위 부분(416a)에서 매끄럽거나 곡선형인 전이부들을 대신 제공할 수 있음이 이해되는데, 이는 도 1, 도 3, 도 3a, 도 3b 및 도 4b-2에 도시된 바와 같은 매끄럽거나 곡선형인 전이부들과 유사하다.
전형적으로, 제1 두께 T1은 샘플 입자들의 크기보다 훨씬 더 크며, 이에 따라 이들 입자는 샘플 리본 스트림 내에 완전히 수용된다. 그러나, 제2 두께 T2는 소정 샘플 입자들의 크기보다 더 작을 수 있으며, 이에 따라 이러한 입자들은 샘플 유체로부터 나와서 주위의 시스 유체 내로 연장될 수 있다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 샘플 리본 스트림은 그것이 캐뉼러를 빠져나가서 이미지 캡처 영역을 향해 이동함에 따라 동일 평면을 따라 대체로 유동할 수 있다.
플로우셀은 또한 캐뉼러 원위 부분(427a)과 이미지 캡처 영역(432a) 사이에 분리 거리(430a)를 제공할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 샘플 유체 주입관(412a)의 원위 부분(427a)은 이미지 캡처 영역(432a)으로부터 축상 분리 거리(430a)에 위치될 수 있으며, 여기서 축상 분리 거리(432a)는 약 21 mm의 값을 갖는다. 일부 경우에, 축상 분리 거리(430a)는 약 16 mm 내지 약 26 mm 범위의 값을 갖는다.
캐뉼러 출구와 이미지 캡처 영역 사이의 축상 분리 거리(430a)는 유체가 출구로부터 이미지 캡처 영역으로 이동함에 따라 샘플 유체에 대한 전이 시간에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 더 짧은 축상 분리 거리(430a)는 더 짧은 전이 시간에 기여할 수 있고, 상대적으로 더 긴 축상 분리 거리(430a)는 더 긴 전이 시간에 기여할 수 있다.
유로 전이 구역(419a)에 대한, 또는 유로 전이 구역(419a)의 근위 부분(415a)에 대한 캐뉼러 원위 부분(427a)에서의 출구의 위치도 또한, 유체가 출구로부터 이미지 캡처 영역으로 이동함에 따라 샘플 유체에 대한 전이 시간을 추론할 수 있다. 예를 들어, 시스 유체는 근위 부분(415a)에서 상대적으로 더 느린 속도를, 그리고 근위 부분(415a)과 원위 부분(416a) 사이의 위치에서 상대적으로 더 빠른 속도를 가질 수 있다. 따라서, 원위 부분(427a)에서의 캐뉼러 출구가 근위 부분(415a)에 위치된다면, 샘플 유체가 이미지 캡처 영역에 도달하는 데 더 긴 시간이 걸리게 될 것인데, 그 이유는 이동 거리가 더 길기 때문일 뿐만 아니라, 샘플 유체가 캐뉼러 원위 포트를 빠져나간 후의 샘플 유체의 초기 속도가 (더 느린 시스 유체 속도로 인해) 더 느리기 때문이기도 하다. 바꿔 말하면, 샘플 유체가 플로우셀의 더 두꺼운 부분에(예를 들어, 근위 부분(415a) 부근에) 더 오래 존재할수록, 샘플이 이미지 캡처 영역에 도달하는 데 더 오래 걸린다. 역으로, 원위 부분(427a)에서의 캐뉼러 출구가 근위 부분(415a)에 대해 원위에(예를 들어, 도 4a에 도시된 바와 같이 근위 부분(415a)과 원위 부분(416a) 사이의 중심 위치에) 위치된다면, 샘플 유체가 이미지 캡처 영역에 도달하는 데 더 짧은 시간이 걸리게 될 것인데, 그 이유는 이동 거리가 더 짧기 때문일 뿐만 아니라, 샘플 유체가 캐뉼러 원위 포트를 빠져나간 후의 샘플 유체의 초기 속도가 (더 빠른 시스 유체 속도로 인해) 더 빠르기 때문이기도 하다. 본 명세서의 어딘가 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 전이 구역(419a)의 협소화되는 단면적으로 인해, 시스 유체는 그가 구역(419a)을 통해 유동됨에 따라 가속된다.
일부 실시 형태에 따르면, 더 짧은 전이 시간으로, 이미지 캡처 영역에서의 이미지 수집에 있어서 더 많은 시간이 이용가능하다. 예를 들어, 캐뉼러 원위 팁으로부터 이미징 영역까지의 전이 시간의 지속기간이 감소됨에 따라, 특정 시간 내에 더 많은 샘플을 처리하는 것이 가능하며, 이와 관련하여 특정 시간 내에 더 많은 이미지(예를 들어, 분당 이미지 수)를 얻는 것이 가능하다.
캐뉼러 원위 부분(427a)의 출구를 이미지 캡처 영역(432a)에 더 근접하게 위치설정하는 것과 관련된 이점이 있더라도, 출구와 캡처 영역 사이에 소정 거리를 유지하는 것이 또한 바람직하다. 예를 들어, 도 3에 도시된 바와 같이, 이미징 디바이스의 광학 대물 렌즈 또는 전면 렌즈가 플로우셀(22)의 안착부(58)에 위치될 수 있다. 캐뉼러의 출구(31)가 안착부(58)에 너무 근접해 있다면, 이때 샘플 유체는, 그것이 시스 유체 내로 주입된 후에 충분히 안정화될 수 없어서, 이미지 캡처 영역에서 원하는 이미징 특성을 제공하게 될 수 없다. 유사하게, 관찰 구역(23)으로부터 일정 거리에서 테이퍼진 전이 구역(21)을 유지하여, 테이퍼진 구역이 이미지 캡처 디바이스 대물 렌즈를 받아들이는 안착부(58)의 위치설정을 방해하지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다.
도 4a를 계속 참고하면, 샘플 유체 주입관(412a)의 하류 단부(427a)는 유로 전이 구역(419a)의 근위 부분(415a)에 대해 원위에 위치될 수 있다. 이와 관련하여, 샘플 유체 주입관(412a)의 하류 단부(427a)는 유로 전이 구역(419a)의 원위 부분(416a)에 대해 근위에 위치될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에 따르면, 샘플 유체는 전이 구역(419a) 내의 위치에서 주입 캐뉼러(412a)로부터 플로우셀 내로 주입될 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, (예를 들어, 유로 전이 구역(419a)에서의) 유로 크기의 감소부에서의 대칭은 혈액 유체 샘플 내에서의 입자 오정렬을 제한하도록 작동한다. 예를 들어, 그러한 대칭은 혈액 유체 샘플 내에서의 적혈구 이미징 배향 오정렬을 약 20% 미만으로 제한하는 데 효과적일 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 본 명세서에 개시된 방법은 혈구 카운트 분석 동안 샘플의 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 미만으로의 플래깅률(flagging rate)로 작동가능하다.
일부 실시 형태에 따르면, 이미지 캡처 영역(432a)은 약 150 μm × 150 μm 내지 400 μm × 400 μm의 시야(433a)를 갖는다. 일부 경우에, 이미지 캡처 영역(432a)은 약 275 μm × 275 μm의 시야(433a)를 갖는다. 일부 경우에, 시야는 길이 × 폭의 관점에서 한정될 수 있다. 표면적으로 표현된다면, 275 μm × 275 μm의 시야는 75,625 μm2의 면적을 갖는다. 일부 실시 형태에 따르면, 시야는 이미징 디바이스 대물 렌즈 및 그의 배율에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에, 시야는 수집 광학장치(예를 들어, 대물 렌즈, 튜브 렌즈, 및 카메라)에 의해 이미징되는 필드(영역)의 범위에 상응할 수 있다. 일부 경우에, 시야는 이미지 캡처 영역에서의 투명 영역의 관찰구보다 훨씬 더 작다.
도 4a-1 및 도 4a-2는 샘플 스트림이 캐뉼러 출구로부터 이미지 캡처 영역으로 이동함에 따라 샘플 스트림에 대해 하이드로포커싱이 미치는 영향을 예시한다. 도 4a-1에 도시된 바와 같이, 샘플 스트림은 높이 H(S)가 약 150 μm이고, 폭 W(S)가 약 1350 μm일 수 있다. 또한, PIOAL 시스 스트림은 높이 H(P)가 약 6000 μm이고, 폭 W(P)가 약 4000 μm일 수 있다. 하이드로포커싱 후에, 도 4a-2에 도시된 바와 같이, 샘플 스트림은 높이 H(S)가 약 2 μm이고, 폭 W(S)가 약 1350 μm일 수 있다. 또한, PIOAL 시스 스트림은 높이 H(P)가 약 150 μm이고, 폭 W(P)가 약 4000 μm일 수 있다. 일 실시 형태에서, 캐뉼러 출구에서의 PIOAL 시스 스트림의 단면적은 이미지 캡처 영역 부근의 단면적보다 40배 더 크다.
일부 실시 형태에 따르면, 이미지 캡처 영역에서 플로우셀 채널의 단면을 결정하는 것이 유용할 수 있다. 이는 도 4a-2에 도시된 바와 같이 PIOAL 시스 스트림 높이 H(P) 약 150 μm 및 폭 W(P) 약 4000 μm에 상응할 수 있다. 또한, 이미지 캡처 영역에서 플로우셀을 통해 스트리밍하는 조합된 샘플 및 시스 유체의 부피 유량(volumetric flow rate)을 결정하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 단면적 및 유량을 알고 있을 경우, 이미지 캡처 영역에서의 조합된 샘플 및 시스 유체의 속도를 결정할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 플로우셀을 통한 샘플 유체 및 시스 유체의 유동은 평행판 프로파일 모델로 근사될 수 있다. 이와 관련하여, (예를 들어, 도 4a-2에 도시된 바와 같은) 샘플 유체 스트림의 중심에서의 유량은 조합된 샘플 및 시스 유체 스트림의 평균 유량의 약 1.5배일 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 캐뉼러 출구에서의 샘플 유동의 단면적(예를 들어, 도 4a-1에서의 W(S) × H(S))은 이미징 영역에서의 샘플 유동의 단면적(예를 들어, 도 4a-2에서의 W(S) × H(S))보다 40배 더 크다. 이미징 영역에서의 시스 유체의 부피 유량은 약 45 μL/sec일 수 있다. 이미징 영역에서의 샘플 유체의 부피 유량은 약 0.232 μL/sec일 수 있다. 일부 경우에, 이미징 영역에서의 조합된 시스 및 샘플 스트림의 단면적은 600,000 μm2이다. 일부 경우에, 이미징 영역에서의 평균 유동 스트림 속도는 75 mm/sec이다.
유량 또는 유속은 선명하고 포커싱된 세포 이미지를 생성하는 속도로서 결정될 수 있다. 예시적인 유량 및 유속은 이미징 영역에서 소정의 샘플 유동 스트림 리본 형상 또는 특성을 달성하는 것으로 관찰된 2개의 샘플의 유량에 기초하여 알아내었다. 예를 들어, 약 75 mm/sec(또는 20 내지 200 mm/sec 범위)의 유량에서, 세포들은 연속된 이미지들에서 세포들의 중첩이 있을 정도로 너무 느리게 유동하지 않으며, 세포들은 고스팅 효과(ghosting effect)가 생성될 (이미지가 블러링될) 정도로 너무 빠르게 유동하지 않는다. 이와 관련하여, 과도하게 높은 유량을 피함으로써, 더 많은 시약 및 샘플을 절약할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 캐뉼러의 형상 또는 부피 유량(펌프 속도)을 변화시킴으로써 최적의 또는 원하는 선속도가 달성될 수 있다.
이미지 캡처 구역을 통한 샘플 스트림의 유속은 또한 플로우셀 기능에 대한 이미지 캡처 디바이스의 성능과 관련될 수 있다. 예를 들어, 샘플 스트림이 너무 빨리 유동한다면, 샘플 중에 함유된 입자들의 선명한 이미지를 얻기가 어려울 수 있다(예를 들어, 이미지 캡처 디바이스의 셔터 속도는 너무 느릴 수 있으며, 이에 따라 블러링된 이미지를 생성할 수 있다). 유사하게, 샘플 스트림이 너무 느리게 유동한다면, 이미지 캡처 디바이스는 동일 입자의 연속된 이미지들을 얻을 수 있다(예를 들어, 2회의 이미지 캡처 동안 동일 입자가 캡처 프레임 내에 남아 있다). 일부 실시 형태에서, 샘플 리본의 속도는 이미지 캡처 속도에 대해 (예를 들어, 다양한 플로우셀 작동 파라미터들 중 임의의 것을 조정함으로써) 조절될 수 있어서, 프레임 캡처들 사이에 최소한의 유동이 있게 되며, 이에 따라 샘플의 높은 백분율이 이미징되게 된다.
일부 실시 형태에 따르면, 입자 분석 시스템 및 관련 구성요소들은, 시스 유체 및 유체 샘플이 플로우셀을 통해 유동함에 따라, 시스 유체는 45 μL/s의 시스 유체 부피 유량으로 유동할 수 있고, 유체 샘플은 0.232 μL/s(또는 0.2 내지 0.35 μL/s의 범위)의 유체 샘플 부피 유량으로 유동할 수 있도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 시스 유체 유량 대 샘플 유체 유량의 비는 약 200이다. 일부 경우에, 시스 유체 유량 대 샘플 유체 유량의 비는 약 70 내지 200 범위의 값을 갖는다. 일부 경우에, 시스 유체 유량 대 샘플 유체 유량의 비는 약 193이다. 일부 경우에, 시스 유체 유량 대 샘플 유체 유량의 비는 약 70이다. 일부 경우에, 플로우셀 내에서 유동하는 시스 유체 부피 대 유체 샘플 부피의 비는 25:1 내지 250:1의 범위일 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 이러한 시스템 및 관련 구성요소들은, 시스 유체 및 유체 샘플이 플로우셀(420)을 통해 유동함에 따라, 시스 유체는 이미징 영역 전에서 75 mm/sec의 시스 유체 속도로 유동할 수 있고, 유체 샘플은 이미징 영역 전에서 130 mm/sec의 유체 샘플 속도로 유동할 수 있도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 플로우셀 내에서 유동하는 시스 유체 부피 대 유체 샘플 부피의 비는 100:1 내지 200:1의 범위일 수 있다.
일부 경우에, 플로우셀은 약 50:1의 최소 압축비 및 약 125:1의 최대 압축비를 가질 수 있다. 일부 경우에, 최소 압축비는 약 30:1 또는 20:1일 수 있다. 이러한 압축비는 도 4a-1과 도 4a-2를 비교할 때의 유동 스트림 두께들의 비 H(S):H(S)를 지칭한다. 이러한 압축비는 기하학적 압축(예를 들어, 도 4a-1과 도 4a-2를 비교할 때의 시스 유체 두께들의 비 H(P):H(P), 이는 또한 도 4a에 도시된, 플로우셀이 협소화되는 테이퍼진 전이 구역(419a)의 치수들에 대체로 상응할 수 있음)과 유체역학적 압축(예를 들어, 이는 또한 속도의 차이에 상응함)의 조합에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 기하학적 압축비는 약 40:1이다.
전이 구역에 상응하는 유로 크기의 감소부는, 근위 두께 또는 높이를 갖는 근위 유로 부분, 및 근위 두께 또는 높이보다 더 작은 원위 두께 또는 높이를 갖는 원위 유로 부분에 의해 한정될 수 있다. 예를 들어, 도 4b-1 및 도 4b-2의 부분도에 도시된 바와 같이, 유로의 전이 구역(419b)은 근위 부분(415b)과 원위 부분(416b) 사이에 길이 L을 가질 수 있으며, 여기서 근위 부분(415b)은 근위 높이(417b)를 갖고, 원위 부분(416b)은 원위 높이(418b)를 갖는다. 도 4b-2에 도시된 바와 같이, 그리고 본 명세서의 어딘가 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 전이 구역의 형상 또는 윤곽은 곡선형이거나 매끄러울 수 있으며, 예를 들어 S-곡선, S자형 곡선, 또는 탄젠트 곡선의 형상으로 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 근위 높이(417b)는 약 6000 μm의 값을 갖는다. 일부 경우에, 근위 높이(417b)는 약 3000 μm 내지 약 8000 μm 범위의 값을 갖는다. 일부 실시 형태에 따르면, 원위 높이(418b)는 약 150 μm의 값을 갖는다. 일부 경우에, 원위 높이(418b)는 약 50 μm 내지 약 400 μm 범위의 값을 갖는다.
전이 구역(419a)의 기하학적 형태는 제1 유로 경계(403b)와 이등분 횡방향 평면(451b) 사이에 제1 각도 α1을, 그리고 제2 유로 경계(404b)와 이등분 횡방향 평면(451b) 사이에 제2 각도 α2를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 각도 α1은 약 45도이고, 각도 α2는 약 45도이다. 일부 경우에, 각도 α1은 약 10도 내지 약 60도 범위의 값을 갖는다. 일부 경우에, 각도 α2는 약 10도 내지 약 60도 범위의 값을 갖는다. 일부 실시 형태에 따르면, 각도 α1 및 α2는 동일한 값을 갖는다. 각도 α1 및 α2는, 샘플 유체가 근위 부분(415b)으로부터 원위 부분(416b)으로 이동함에 따라, 샘플 유체의 층류를 유지하거나 이의 난류(turbulence)를 최소화하도록 선택될 수 있으며, 이는 다시, 횡방향 평면(451b)을 따라 샘플 내에서의 입자들의 정렬을 향상시킬 수 있다. 도 4a를 참고하여 상기에 기재된 바와 같이, 전이 구역의 원위 및 근위 경계 또는 부분은 각진 대신에 곡선형이거나 매끄러울 수 있다.
도 4c는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 캐뉼러 또는 샘플 공급관(400c)의 특징부를 도시하며, 여기서 캐뉼러는 길이 L을 갖는다. 도 4d는 캐뉼러(400d)의 종단면을 도시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 캐뉼러(400d)는 납작한 원위 섹션(410d), 테이퍼진 중심 섹션(420d), 및 관형 근위 부분(430d)을 포함한다. 도 4c-1에 도시된 바와 같이, 예시적인 캐뉼러 또는 샘플 공급관(400c-1)은 원위 부분(410c-1) 및 근위 부분(430c-1)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 원위 부분(410c-1)은 약 1.359 mm의 길이 및 약 1.43 mm의 폭을 갖는다. 일부 경우에, 근위 단부의 출구는 약 1.359 mm의 출구 폭 W(E)를 갖는다. 일부 실시 형태에 따르면, 캐뉼러는 도 4c 및 도 4d에 도시된 것과 상이한 내부 유로 기하학적 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 도 4d-1에 예시된 바와 같이, 캐뉼러(400d-1)는 확장된 유동 영역 단면을 갖는 테이퍼진 중심 섹션을 포함하지 않는다. 도 4d-1에 도시된 바와 같이, 캐뉼러(400d-1)는 원위 섹션(410d-1), 내경이 점차 감소하는 테이퍼진 중심 섹션(420d-1), 및 근위 섹션(430d-1)을 갖는다. 중심 섹션(420d-1)의 점차 감소하는 내경에 상응하여, 410d-1의 내부 단면적은 430d-1의 내부 단면적보다 더 작다.
본 발명의 실시 형태들에 따른 혈액학 시스템은 약 150 μL의 부피를 갖는 혈액 샘플을 처리할 수 있다. 흡인된 혈액 부피는 약 120 내지 150 μL일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 관 내의 이용가능한 최소의 혈액 부피는, 자동 샘플링 모드의 경우는 약 500 μL이고, 수동 샘플링 모드의 경우는 약 250 μL이다. 도 4d에 도시된 캐뉼러 또는 주입관(400d)은 약 13 uL의 내부 부피를 갖는다. 일부 실시 형태에 따르면, 캐뉼러 또는 주입관은 약 30 uL 미만의 내부 부피를 갖는다.
도 4e는 납작한 원위 섹션(410e)의 횡단면을 예시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 원위 섹션(410e)은 내부 폭 W(I) 및 내부 높이 H(I)를 가지며, 이를 통해 샘플 스트림이 유동한다. 또한, 원위 섹션(410e)은 외부 폭 W(O) 및 외부 높이 H(O)를 갖는다. 조합하여 취해진 도 4d 및 도 4e에 도시된 바와 같이, 샘플 유체 주입관의 원위 부분(410e)은 높이 H(I) 및 폭 W(I)를 갖는 출구(P)를 가지며, 여기서 높이 H(I)는 폭 W(I)보다 더 작다. 일부 실시 형태에 따르면, 원위 부분(410e)의 출구(P)의 높이 H(I)(또는 원위 부분(410d)의 내부 높이)는 약 150 μm의 값을 가질 수 있다. 일부 경우에, 높이 H(I)는 약 50 μm 내지 약 250 μm 범위일 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 원위 부분(410e)의 출구(P)의 폭 W(I)(또는 원위 부분(410d)의 내부 폭)는 약 1350 μm의 값을 가질 수 있다. 일부 경우에, 폭은 약 1194 μm이다. 일부 경우에, 폭 W(I)는 약 500 μm 내지 약 3000 μm 범위의 값을 가질 수 있다. 일부 경우에, 납작한 원위 섹션(410d)은 관 또는 도관에 클램핑 힘을 적용함으로써 제조될 수 있다.
도 4f는 테이퍼진 중심 섹션(420f)의 횡단면을 예시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 테이퍼진 중심 섹션(420f)은 내경 D(I)를 가지며, 이를 통해 샘플 스트림이 유동한다. 또한, 테이퍼진 중심 섹션(420f)은 외경 D(O)를 갖는다. 도 4g는 근위 섹션(430g)의 횡단면을 예시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 근위 섹션(430g)은 내경 D(I)를 가지며, 이를 통해 샘플 스트림이 유동한다. 또한, 원위 섹션(430g)은 외경 D(O)를 갖는다.
도 4d에 도시된 바와 같이, 주입관 또는 캐뉼러(400d)는 제1 유동 단면적(예를 들어, 도 4g에 도시된 π*(D/2)2)을 갖는 근위 부분(430d), 제1 유동 단면적보다 더 작은 제2 유동 단면적(예를 들어, 도 4e에 도시된 W(I)*H(I))을 갖는 원위 부분(410d), 및 근위 부분(430d)과 원위 부분(410d) 사이에 배치된 제3 부분(420d)을 가질 수 있다. 제3 부분(420d)은 제1 및 제2 유동 단면보다 더 큰 제3 유동 단면(예를 들어, 도 4f에 도시된 π*(D/2)2)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 근위 부분(430g)의 외경 D(O)는 약 1067 μm이고, 근위 부분(430g)의 내경 D(I)는 약 813 μm이다.
일부 실시 형태에 따르면, 주입관의 근위 부분이 샘플 입구 피팅의 샘플 포트와 커플링될 수 있다. 예를 들어, 도 4h에 도시된 바와 같이, 캐뉼러(400h)의 근위 부분(405h)이 샘플 입구 피팅(420h)의 출구에서 샘플 포트(410h)에 직접 커플링될 수 있다.
혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 시스템의 플로우셀이 중력의 방향에 대해 임의의 원하는 각도 또는 방향으로 배향될 수 있다. 예를 들어, 플로우셀 내에서 유동하는 유체(예를 들어, 선택적으로 샘플 유체와 조합된 시스 유체)가 중력에 대항하여 상향 방향으로 이동할 수 있도록, 플로우셀이 상향 방향으로 배향될 수 있다. 마찬가지로, 플로우셀 내에서 유동하는 유체(예를 들어, 선택적으로 샘플 유체와 조합된 시스 유체)가 중력에 따라 하향 방향으로 이동할 수 있도록, 플로우셀이 하향 방향으로 배향될 수 있다. 도 4i는 플로우셀(420i) 내에서 유동하는 시스 유체(426i) 및 샘플 유체(424i)가 중력 G에 대항하여 유동하도록, 상향 방향으로 배향된 플로우셀(420i)을 도시한다. 도 4j는 플로우셀(420j) 내에서 유동하는 시스 유체(426j) 및 샘플 유체(424j)가 중력 G에 대항하여 유동하지 않고 오히려 중력 G에 따라 유동하도록, 하향 방향으로 배향된 플로우셀(420j)을 도시한다.
도 4k에 도시된 바와 같이, 플로우셀(420k)의 이미지 캡처 영역(432k)을 통해 유동하는 샘플 스트림 리본(R)은 약 2 μm의 두께 T를 가질 수 있다. 일부 경우에, 샘플 스트림 리본의 두께 T는 최대 약 3 μm일 수 있다. 전형적으로, 샘플 스트림 두께보다 더 작은 세포들 또는 입자들이 리본 내에 함유될 것이다. 예시적인 적혈구(RBC)는 양요 원판(biconcave disk)으로서 존재할 수 있으며, 약 6.2 μm 내지 약 8.2 μm의 직경 D를 가질 수 있다. 또한, 예시적인 적혈구는 약 2 μm 내지 약 2.5 μm의 최대 두께 T1 및 약 0.8 μm 내지 약 1 μm의 최소 두께 T2를 가질 수 있다. 일부 경우에, 적혈구는 최대 약 3 μm의 두께를 가질 수 있다. 예시적인 인간 혈소판은 크기가 다양할 수 있으며, 또한 약 2 μm의 두께 또는 직경을 가질 수 있다. 여기에 축적대로 도시되어 있지는 않지만, 플로우셀은 이미지 캡처 영역에서 약 150 μm의 값을 갖는 유로 두께 F를 한정할 수 있다. 일부 경우에, 유로 두께 F는 50 μm 내지 400 μm의 값을 갖는다. 이러한 유로 두께 F는 또한 도 4b-1 및 도 4b-2에 도시된 원위 부분(461b)의 원위 높이(418b)에 상응할 수 있다.
도 4k에 도시된 바와 같이, 샘플 유체 스트림의 두께 T 대 입자(적혈구)의 두께의 비는 약 1:1이다. 일부 실시 형태에 따르면, 이미지 캡처 영역에서의 샘플 유체 스트림의 두께 T 대 입자들 중 하나의 크기의 비는 0.25 내지 25의 범위이다. 일부 경우에, 두께 T는 0.5 μm 내지 5 μm 범위의 값을 가질 수 있다. 시스 유체와 샘플 유체 사이의 점도 차이는 플로우셀 내에서의 리본 샘플 스트림의 원하는 위치설정을 달성하도록 선택될 수 있다.
샘플 리본(R)의 유체와 시스 유체 사이의 점도 차이는, 유동 방향을 따라 샘플 스트림 내의 입자들, 예를 들어 적혈구를 정렬 또는 배향시키도록 작동할 수 있다. 그렇게 정렬될 때, 도 4k에 도시된 바와 같이, 이미징 디바이스 또는 카메라는, 혈구의 주 표면이 카메라를 향해 대면하고 있기 때문에, 적혈구가 둥글게 보이도록 적혈구의 이미지를 얻을 수 있다. 이러한 방식으로, 적혈구는 유동에 대한 낮은 저항을 제공하는 정렬을 나타낸다. 따라서, 시스 유체 및 샘플 유체의 상대 점도 특성은 카메라를 향해 대면하는 적혈구의 높은 백분율 또는 수에 기여하며, 이에 따라 입자 분석 시스템의 평가 능력을 향상시킬 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 시스 유체의 점도 특성은 혈액 유체 샘플 내에서의 입자 오정렬을 제한하도록 작동한다. 예를 들어, 점도 차이는 혈액 유체 샘플 내에서의 적혈구 이미징 배향 오정렬을 약 10% 미만으로 제한하는 데 효과적일 수 있다. 즉, 샘플 중의 100개의 적혈구 중 90개 이상의 적혈구가 그들의 주 표면들이 이미징 디바이스를 향해 대면하도록 정렬될 수 있다. 대칭 협소화 전이 구역은 20%의 값을 제공할 수 있다. 본 명세서의 어딘가 다른 곳에서, 예를 들어 도 4r을 참고하여 논의된 바와 같이, 대칭 협소화 플로우셀 전이 구역을 갖는 플로우셀 및 점성 시스 유체를 포함하는 분석기 구성으로부터 얻어진 정렬 결과를, 점성 시스 유체의 사용 없이 대칭 협소화 플로우셀 전이 구역을 갖는 플로우셀을 포함하는 분석기 구성으로부터 얻어진 정렬 결과와 비교할 수 있다. 점성 시스 유체의 사용은 오정렬된 세포들의 백분율을 감소시킬 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 시스 유체는 물의 굴절률(즉, n=1.3330)과 유사한 굴절률을 갖는다. 일부 경우에, 시스 유체는 약 89%의 물 함량을 갖는다. 점도 차이의 결과로서 관찰된 정렬 효과에 더하여, 양측방향(bilateral) 테이퍼진 전이 구역의 결과로서 정렬 효과가 또한 관찰된다. 일부 경우에, 양측방향(즉, 대칭) 테이퍼진 전이 구역이, 비대칭 테이퍼진 전이 구역 설계와 비교하여, 입자들을 정렬하는 데 2배 더 효과적인 것으로 관찰된다.
적혈구의 효율적인 정렬은 개선된 진단에 기여할 수 있다. 일부 경우에, 이미징된 적혈구의 형상은, 샘플이 얻어진 환자가 특정 생리학적 질환 또는 질병을 갖는지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 겸상 적혈구 질병을 갖는 환자에게는 비정상 형상(즉, 낫의 형상임)을 갖는 혈구가 나타난다. 따라서, 정렬된 적혈구의 고품질 이미지를 얻음으로써, 정확한 진단을 보장할 수 있다. 적혈구의 다른 형상 변형, 예를 들어 얇은 주연 영역 및 크고 편평한 중심 영역을 가짐으로써 자전거 타이어의 외형을 갖는 것으로 보이는 적혈구가 본 발명의 정렬 기술을 사용하여 효과적으로 이미징될 수 있다. 유사하게, 작은 중심 부분 및 두꺼운 주연 영역을 가져서 트럭 타이어의 외형을 갖는 것으로 보이는 적혈구가 진단 목적으로 이미징될 수 있다. 본 명세서에 개시된 개선된 이미징 기술은 또한 다른 적혈구 특성, 예컨대 헤모글로빈 함량, 철 함량 등을 평가하는 데 유용하다.
어떠한 특정 이론에 의해서도 구애됨이 없이, 시스 유체의 점도와 샘플 유체의 점도 사이의 점도 차이가, 변경된 포물선 프로파일을 생성하는 것으로 여겨지는데, 여기서 이러한 프로파일은 대체로 포물선이고, 가속이 증가되는 곳인 유동의 중심 영역에 상응하는 중심 범프(central bump)를 가지며, 이러한 중심 범프는 샘플 입자들 또는 입자내 세포소기관들의 정렬에 기여한다. 일부 실시 형태에 따르면, 시스와 샘플 리본 사이의 속도 차이 및 점도 차이는 전단력을 발생시켜서 세포소기관들 또는 세포내 입자들의 정렬을 증가시킨다. 시스 유체 포물선 프로파일의 예시적인 양상들이 공계류 중인 미국 특허 출원 제________호에 논의되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
백혈구는 전형적으로 적혈구 및 혈소판보다 더 크다. 예를 들어, 예시적인 호중구 및 호산구는 약 10 μm 내지 약 12 μm의 직경을 가질 수 있다. 예시적인 호염기구는 약 12 μm 내지 약 15 μm의 직경을 가질 수 있다. 예시적인 (소)림프구는 약 7 μm 내지 약 8 μm의 직경을 가질 수 있고, 예시적인 (대)림프구는 약 12 μm 내지 약 15 μm의 직경을 가질 수 있다. 예시적인 단핵구는 약 12 μm 내지 약 20 μm의 직경을 가질 수 있다. 시스 유체 및 유체 샘플 리본이 플로우셀을 통과함에 따라 이들 사이에서의 상호작용을 포함하는 입자 분석 시스템의 구성은, 도 4l에 나타낸 바와 같이, 백혈구가 이미지 캡처 영역(432l)을 통해 이동함에 따라 백혈구를 압축시키도록 작동할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 백혈구(WBC)의 중심 부분은 샘플 유체 리본(R) 내에 위치될 수 있고, 백혈구의 주연 부분은 시스 유체 내에 위치될 수 있다. 따라서, 백혈구가 리본에 의해 플로우셀을 통해 수송됨에 따라, 백혈구의 측부들은 시스 유체 내로 연장될 수 있다. 도 4k에 관하여 상기에 논의된 바와 같은 샘플 스트림 리본(R)의 두께 T, 및 유로의 두께 F에 대한 수치 값 또는 범위가 도 4l에 유사하게 적용가능하다.
일부 실시 형태에 따르면, 시스 유체와 샘플 유체 사이의 점도 차이는 백혈구와 같은 세포들 내에 존재하는 세포소기관들 또는 다른 세포내 특징부들을 정렬시키도록 작동할 수 있다. 어떠한 특정 이론에 의해서도 구애됨이 없이, 시스 유체와 샘플 유체 사이의 점도 차이와 관련된 전단력이, 세포내 특징부들을 정렬시키도록 백혈구 상에 작용할 수 있는 것으로 여겨진다. 일부 경우에, 시스 유체와 샘플 유체 사이의 속도 차이와 관련된 전단력이 그러한 정렬에 기여할 수 있다. 이러한 정렬 효과는 마찬가지로 입자들과 샘플 유체 리본 사이의 크기 차이에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 입자들의 부분들이 샘플 유체 리본으로부터 주위의 시스 유체 내로 연장되는 경우, 점도 차이와 관련된 전단력은 세포내 특징부 정렬에 대해 현저한 효과를 가질 수 있다.
도 4l에 도시된 바와 같이, 백혈구와 같은 세포의 부분들이 시스 유체 내로 연장될 수 있다. 본 발명의 실시 형태들은, 세포가 시스 유체에 노출될 때, 세포를 용해시키지 않거나 찢지 않거나, 또는 달리 외부 세포막의 완전성을 손상시키지 않는 시스 유체 조성물을 포함한다. 시스 유체 내의 점도제는, 세포막 또는 세포벽이 샘플 유체 리본과 시스 유체 봉입물 사이의 계면을 횡단하거나 또는 달리 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 샘플 유체 스트림 내의 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조(예를 들어, 형상) 및 내용물(예를 들어, 핵)을 온전하게 하도록 작동할 수 있다.
종종, 세포들 또는 입자들이 플로우셀을 따라 샘플 유체 리본 내에서 유동함에 따라 이들 상에 작용하는 압축력이 있다. 따라서, 협소화 전이 구역의 결과로서 세포들이 압축된 상태에 있거나 달리 압축력을 받는 동안에, 세포들은 시스 유체와 접촉될 수 있다. 시스 유체의 점도제는, 압축된 세포들이 박형 샘플 유체 리본으로부터 방출되고 점성 시스 유체에 노출되게 될 때, 적어도 그러한 세포들이 이미지 캡처 영역에 도달할 때까지, 찢어지거나 파괴되는 것으로부터 그러한 세포들을 보호하도록 작동할 수 있다. 따라서, 시스 유체의 점도제 조성물은 세포 보호제로서 작동하면서, 또한 입자들 또는 입자내 내용물의 정렬을 향상시킬 수 있다.
도 4k 및 도 4l을 참고하면, 일부 경우에, 세포 또는 입자의 부분들이 박형 샘플 유체 리본(R)으로부터 주위의 시스 유체 내로 연장될 수 있다. 공계류 중인 미국 특허 출원 제____호에 논의된 바와 같이, 시스 유체는 시스 유체가 세포들 또는 입자들을 붕괴 또는 용해시키는 것을 억제 또는 방지하는 세포 보호제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 시스 유체는, 세포들이 시스 유체의 화학적 환경에 노출됨에 따라, 세포벽의 구조적 완전성을 보존하는 세포 보호제를 함유할 수 있다. 유사하게, 세포 보호제는 또한, 세포들이 플로우셀 기하학적 형태에 의해 유도된 어떠한 전단력이라도 겪고, 샘플 유체와 시스 유체 사이의 속도 및/또는 점도 차이를 겪음에 따라, 세포벽의 구조적 완전성을 보존하도록 작동할 수 있다. 이와 관련하여, 보호제는 샘플 유체와 시스 유체 사이의 속도 차이로부터 기인되는 힘으로부터 세포들 또는 입자들을 보호할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포들은 그들이 이미지 캡처 영역에 도달함에 따라 그들의 생존능력을 유지한다.
전단력은 샘플 유체 리본과 시스 유체 봉입물 사이의 계면에서 상당할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 플로우셀 유로 내에서의 유동은 포물선 유동 프로파일에 의해 특징지어질 수 있다. 도 4l-1은 포물선 유동 프로파일들(400l-1a, 400l-1b)의 예시적인 양상들을 도시한다. 상측 패널에서의 포물선 프로파일(400l-1a)은 (예를 들어, 시스 유체 유동 스트림 내에 봉입되는 샘플 유체 유동 스트림 사이에 점도 차이가 거의 또는 전혀 없는) 본 발명의 소정의 플로우셀 실시 형태 내에서의 유동 내에서 발견되는 전형적인 속도 프로파일이다. 알 수 있는 바와 같이, 유체 스트림의 중앙에서 최고 선속도가 관찰되고, 더 느린 선속도가 플로우셀 벽 부근에서 관찰된다. 프로파일(400l-1a)은 또한, 시스 유체와 샘플 유체 사이에 약간의 점도 차이를 갖는 유체 스트림에서 관찰될 수 있다. 시스 스트림과 유체 스트림 사이에 높은 점도 차이가 있는 경우에, 프로파일(400l-1b)에 도시된 바와 같이 중심 범프가 관찰되는데, 여기에는 증폭된 선속도를 갖는 국지화된 중심 영역이 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 크기가 충분히 큰 입자들은, 그러한 입자들이 완전히 단일 유체 상(fluid phase) 내에(즉, 시스 유체 봉입물 내에, 또는 대안적으로 샘플 유체 리본 내에) 함유되어 있는 경우에도, 어느 정도의 전단력을 받을 것이다.
일부 경우에, 시스 유체의 속도는 샘플 유체의 속도와 상이할 수 있다. 예를 들어, 시스 유체는 80 mm/sec로 이동 중일 수 있고, 샘플 유체는 60 mm/sec로 이동 중일 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 샘플 유체는 주위 봉입물의 시스 유체 속도보다 더 느린 샘플 유체 속도로 캐뉼러 원위 포트를 빠져나간다. 따라서, 시스 유체는 캐뉼러의 유로를 따라 샘플 유체를 드래깅(dragging)하도록 작동할 수 있으며, 이에 따라 샘플 유체를 가속시키고 샘플 유체 리본의 두께를 감소시킬 수 있다. 샘플 유체 리본은 전체 부피 및 질량을 유지하여, 그것이 더 빨리 이동함에 따라 더 박형이 된다. 일부 실시 형태에 따르면, 시스 유체 및 샘플 유체 둘 모두는 이미지 캡처 영역에서 약 20 내지 200 mm/sec의 속도를 갖는다.
전형적으로, 샘플 유체가 캐뉼러 출구로부터 이미지 캡처 영역으로 이동함에 따라 샘플 유체의 속도는 증가된다. 일부 경우에, 이미지 캡처 영역에서의 샘플 유체의 속도는, 샘플 유체가 캐뉼러 원위 부분에서 캐뉼러 포트를 빠져나갈 때의 샘플 유체의 속도의 40배이다. 일부 실시 형태에 따르면, 샘플 리본의 단면적의 감소는 속도의 증가에 대해 선형이다. 일부 실시 형태에 따르면, 캐뉼러 출구에서의 시스 속도가 샘플 리본 속도보다 더 높다면, 이는 또한 이미징 영역에서의 최종 샘플 리본 속도를 증가시킬 것이다.
시스 유체는 샘플 유체 리본 상에, 그리고 샘플 유체 리본 내의 입자들 상에 상당한 전단력을 인가하도록 작동할 수 있다. 일부 힘은 유동 방향에 평행하고, 입자들은 또한 유동 방향에 직각인 힘에 접할 수 있다. 종종, 시스 유체 및 샘플 유체가 이미지 캡처 영역 또는 구역에 접근함에 따라, 시스 및 샘플 유체는 동일한 속도로 또는 거의 동일한 속도로 이동하고 있다. 따라서, 시스 유체 및 샘플 유체가 이미지 캡처 영역을 지나감에 따라, 이들 사이의 경계 또는 계면은, 캐뉼러 원위 출구에서의 또는 테이퍼진 전이 구역에서의 경계 또는 계면과 비교하여, 더 낮은 전단력을 제공할 수 있다. 예를 들어, 테이퍼진 전이 구역에서, 시스 유체 봉입물과 샘플 유체 리본 사이의 경계 또는 계면은, 초기에 더 느리고 더 두꺼운 샘플 리본이 더 빠르고 더 얇아지도록 그리고 샘플 유체 내의 입자들이 더 많이 정렬되게 되도록 전이 상태에 있을 수 있다. 바꿔 말하면, 전단력은 테이퍼진 전이 구역에서 현저할 수 있으며, 이미지 캡처 영역으로 향하면서 소산될 수 있다. 이미지 캡처 영역에서의 전단력은 포물선 프로파일로 나타날 수 있으며, 테이퍼진 전이 구역에서의 전단력보다 훨씬 더 낮을 수 있다. 따라서, 세포들 또는 입자들은, 이들이 전이 구역을 통과함에 따라 더 높은 전단력을 겪을 수 있고, 이들이 이미지 캡처 영역을 통과함에 따라 더 낮은 전단력을 겪을 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 시스 유체와 샘플 유체 사이의 점도 차이는 적혈구를 정렬되게 하고, 그럼으로써 포커싱되게 할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 시스 유체와 샘플 유체 사이의 점도 차이는 백혈구 세포소기관을 정렬되게 하고, 그럼으로써 포커싱되게 할 수 있다. 이와 관련하여, 스트림의 기하학적 협소화 및 시스 유체와 샘플 유체 사이의 속도 차이로부터 기인된, 정렬되고 포커싱되게 한 세포 및 세포소기관 성분들에 대해 증강된 이미징 결과가 얻어질 수 있다.
본 명세서의 어딘가 다른 곳에 기재된 바와 같이, 그리고 도 4k 및 도 4l을 참고하여, 시스 유체 및 샘플 유체(R)가 플로우셀의 유로 크기의 감소부 또는 전이 구역을 통해 이미징 영역(432k 또는 432l)을 향해 유동함에 따라, 시스 유체 점도와 샘플 유체 점도 사이의 점도 차이와 관련된 시스 유체와 샘플 유체(R) 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과가, 유로 크기의 감소부 또는 전이 구역과 관련된 시스 유체와 샘플 유체(R) 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 이미징 영역(432k 또는 432l)에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공한다.
일부 경우에, 표적 이미징 상태는 이미징 영역에서의 초점 평면(F)에 대한 표적 배향이다. 예를 들어, 도 4k-1에 도시된 바와 같이, 입자(RBC)는 초점 평면(F)으로부터 일정 거리에 변위될 수 있다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역(432k-1)에서의 초점 평면(F)에 대한 표적 입자 배향을 포함한다. 입자는 혈구, 예컨대 적혈구, 백혈구, 또는 혈소판일 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 이미징 영역(432k-1)에서의 유로는 초점 평면(F)에 실질적으로 평행하거나 또는 이와 동일평면인 P 평면을 한정할 수 있다. 일부 경우에, 입자의 일부분은 초점 평면(F)을 따라 위치될 수 있으면서, 여전히 입자의 중심 부분은 달리 초점 평면(F)으로부터 오프셋될 수 있다. 일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역(432k-1)에서의 초점 평면(F)에 대한 표적 위치를 포함한다. 예를 들어, 표적 위치는 입자의 적어도 일부분이 초점 평면(F)을 따라 배치되도록 하는 입자의 위치설정을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적 위치는 입자와 초점 평면(F) 사이의 거리가 소정의 역치를 초과하지 않도록 하는 입자의 위치설정을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적 위치는 이미징 영역(432k-1)에서의 초점 평면(F)에 대한 표적 입자 위치를 포함한다. 일부 경우에, 표적 위치는 초점 평면(F)으로부터 거리 D 이내에 있으며, 여기서 거리 D는 위치 공차에 상응한다. 시스 유체와 샘플 유체 사이의 점도 차이는 플로우셀 내에서의 (예를 들어, 유로 평면(P) 및/또는 초점 평면(F)에 대한) 리본 샘플 스트림의 원하는 위치설정을 달성하도록 선택될 수 있다. 일부 경우에, 점도 차이는 위치 공차 D 이내에 있는 표적 입자 위치를 달성하도록 선택될 수 있다.
일부 경우에, 초점 평면(F)은 도 4k-2에 나타낸 바와 같이 두께 또는 피사계 심도(depth of field)를 가지며, 입자(RBC)는 초점 평면 두께에 대한 표적 이미징 상태를 갖는다. 예를 들어, 입자에 대한 표적 위치는 초점 평면(F) 내에 또는 적어도 부분적으로 초점 평면(F) 내에 있을 수 있다. 일부 경우에, 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 카메라는 약 7 μm의 피사계 심도 또는 초점 평면 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 피사계 심도 또는 초점 평면 두께는 약 2 μm 내지 약 10 μm 범위의 값을 갖는다. 일부 경우에, 카메라의 피사계 심도는 이미지 캡처 영역에서 샘플 리본 두께와 유사하거나 동일하다.
일부 경우에, 표적 배향은 이미징 영역에서의 초점 평면(F)에 대한 표적 정렬을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 정렬은, 도 4k-3에 도시된 바와 같이 이미지 캡처 영역(432k-3)에서 초점 평면(F)에 대해 소정 각도 α 를 초과하지 않도록, 입자에 의해 한정된 평면이 초점 평면(F)과 정렬되는 것을 가리킬 수 있다. 일부 경우에, 표적 이미징 상태는 샘플 중의 오정렬된 입자들의 수 또는 백분율에 대한 제한을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스 유체와 샘플 유체(R) 사이의 점도 차이는 혈액 유체 샘플 내에서의 적혈구 이미징 배향 오정렬을 약 10% 미만으로 제한하는 데 효과적일 수 있다. 즉, 샘플 중의 100개의 적혈구 중 90개 이상의 적혈구가, 그들의 주 표면들이 이미징 디바이스를 향해 대면하도록(도 4k-1 및 도 4k-2에 도시된 바와 같음), 또는 이러한 90개 이상의 RBC의 정렬이 유동 방향에 사실상 평행한 평면으로부터 20도 이내에 있도록(예를 들어, RBC 정렬 각도 α는 20도 이하임) 정렬될 수 있다. 본 명세서의 어딘가 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 일부 경우에, RBC와 같은 비구형 입자들의 92% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬될 수 있다. 일부 경우에, RBC와 같은 비구형 입자들의 적어도 75% 내지 95%가 사실상 정렬될 수 있으며, 즉 유동 방향에 사실상 평행한 평면으로부터 20도 이내에 정렬될 수 있다(예를 들어, 정렬 각도 α는 20도 이하이다). 일부 실시 형태에 따르면, 소정의 입자들(예를 들어, 적혈구 및/또는 혈소판)의 90% 이상이 이미징 디바이스의 이미징 축에 대해 횡방향으로 배향될 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 실시 형태들은 본 명세서에 기재된 바와 같은 혈액학 시스템과 함께 사용하기 위한 조성물, 예컨대 시스 유체 또는 입자 및 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL)를 포함한다. 그러한 시스 유체 또는 PIOAL은 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱 시각적 분석기에서 사용하기에 적합하다. PIOAL은 시각적 분석기의 협소화 플로우셀 전이 구역을 통한 주어진 점도의 혈액 샘플 유체의 유동을 지향시키거나 용이하게 하도록 작동할 수 있다. PIOAL은 샘플의 점도보다 더 높은 점도를 갖는 유체를 포함할 수 있다. 점도 차이와 관련된 PIOAL 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과는, 협소화 플로우셀 전이 구역과 관련된 PIOAL 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 혈액 샘플 유체 중의 세포들의 생존능력을 유지하면서 시각적 분석기의 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하는 데 효과적일 수 있다.
도 4m은 내부 세포소기관들, 예컨대 엽(410m)들을 갖는 예시적인 호중구(400m)(일 유형의 백혈구)를 도시한다. 샘플 유체와 시스 유체 사이의 점도 차이의 결과로서, 도 4n에 의해 나타낸 바와 같이, 내부 세포소기관들은 세포 내에 정렬될 수 있다. 따라서, 세포내 세포소기관들은, 이러한 세포소기관들이 서로 중첩되지 않고서, 이미지 캡처 디바이스(430m)를 사용하여 효과적으로 이미징될 수 있다. 즉, 도 4m에 도시된 바와 같이, 엽들이 서로 적층되는 대신에, 이미지 캡처 디바이스의 이미징 또는 광학 축으로부터 관찰했을 때, 도 4n에 도시된 바와 같이 엽들은 정렬되고 나란히 배치되어 있다. 따라서, 엽들은 캡처링된 이미지에서 더 효과적으로 시각화될 수 있다. 내부 세포소기관 정렬은 샘플 유체와 시스 유체 사이의 점도 차이의 의외의 예기치 않은 결과이다. 따라서, 점도 차이, 유체역학적 유동, 및 기하학적 압축 특징들을 사용하여, 세포 정렬 및 인-포커스에 상응하는 증강된 이미징 결과가 달성된다.
본 명세서의 어딘가 다른 곳에 기재된 바와 같이, 그리고 도 4m 및 도 4n을 참고하여, 시스 유체 및 샘플 유체(R)가 플로우셀의 유로 크기의 감소부 또는 전이 구역을 통해 이미지 캡처 디바이스(430m 또는 430n)의 이미징 영역을 향해 유동함에 따라, 시스 유체 점도와 샘플 유체 점도 사이의 점도 차이와 관련된 시스 유체와 샘플 유체(R) 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과가, 유로 크기의 감소부 또는 전이 구역과 관련된 시스 유체와 샘플 유체(R) 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공한다. 일부 실시 형태에 따르면, 표적 이미징 상태는 이미징 상태들의 분포에 상응할 수 있다.
일부 경우에, 표적 이미징 상태는 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 배향(예를 들어, 정렬 및/또는 위치)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 4n에 도시된 바와 같이, 내부 구조(410m)들(예를 들어, 세포내 구조, 세포소기관, 엽 등)은 초점 평면(F)에 대해 배향될 수 있다. 일부 경우에, 표적 정렬은 이미징 영역에서의 초점 평면(F)에 대한 표적 입자내 구조 정렬을 포함하는데, 이는 도 4k-3에 도시된 입자 정렬 관계와 유사하다. 일부 경우에, 표적 위치는 이미징 영역에서의 초점 평면에 대한 표적 입자내 구조 위치를 포함하는데, 이는 도 4k-1에 도시된 입자 위치 관계와 유사하다. 일부 경우에, 입자내 구조의 표적 배향은 초점 평면에 대한 표적 정렬 및 또한 초점 평면에 대한 표적 위치 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적 이미징 상태는 이미징 영역에서의 표적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 4n에 도시된 바와 같이, 입자(400m)는 도 4m에 도시된 입자 형상과 비교하여 압축된 형상을 갖는다. 따라서, 플로우셀의 작동은 입자 형상에 대한 측방향 압축 효과를 생성할 수 있음을 알 수 있다. 이와 관련하여, 입자내 특징부들은, 입자 그 자체가 형상에 있어서 압축됨에 따라, 위치적으로 또는 방향적으로 배향될(예를 들어, 초점 평면(F) 및/또는 리본 유동 평면에 대해 정렬될) 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 시스 유체와 샘플 유체 사이의 속도 차이는 유동 스트림 내에서 마찰을 생성할 수 있고, 시스 유체와 샘플 유체 사이의 점도 차이는 유체역학적 마찰을 증폭시킬 수 있다.
실시예
다양한 혈액학 또는 혈액 입자 분석 기술들 중 어느 것도 플로우셀을 통해 유동하는 샘플 유체의 이미지를 사용하여 수행될 수 있다. 종종, 이미지 분석은 소정의 세포 또는 입자 파라미터들을 결정하는 것, 또는 소정의 세포 또는 입자 특징부들을 측정, 검출, 또는 평가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이미지 분석은 세포 또는 입자 크기, 세포 핵 특징부, 세포 세포질 특징부, 세포내 세포소기관 특징부 등을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 분석 기술은, 백혈구(WBC) 감별을 포함하여, 소정의 카운팅 또는 분류 방법 또는 진단 검사를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 플로우셀을 사용하여 얻어진 이미지는 5종 WBC 감별 검사를 지원할 수 있다. 일부 경우에, 플로우셀을 사용하여 얻어진 이미지는 9종 WBC 감별 검사를 지원할 수 있다. 이와 관련하여, 도 4를 참고하면, 프로세서(440)는 컴퓨터 애플리케이션을 갖는 저장 매체를 포함하거나 또는 그와 작동식으로 관련될 수 있는데, 컴퓨터 애플리케이션은, 프로세서에 의해 실행될 때, 시스템(400)으로 하여금 이미지 캡처 디바이스로부터 얻어진 이미지에 기반하여 상이한 유형들의 세포들을 감별하게 하도록 구성된다. 예를 들어, 다양한 세포들(예를 들어, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 후골수세포, 골수세포, 전골수세포, 및 아세포)을 감별하기 위해 진단 또는 검사 기술이 사용될 수 있다.
본 명세서에 제공된 실시예는 단지 예시 목적을 위한 것이며, 본 발명은 이들 실시예로 제한되지 않고, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백한 모든 변형을 포함한다.
본 명세서에 기술된 실험 이전에는, 본 명세서에 개시된 바와 같이 입자들을 정렬하고 세포내 내용물을 위치재설정하기 위한 PIOAL을 포함하는 개발 및 사용 방법을 가능하게 하는 공개된 프로토콜이 없었다. 이는 체액(예를 들어, 혈액) 샘플 중의 입자들의 이미지-기반 분석 및 감별 범주화 및 하위범주화에 유용하다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 선택적으로, 전혈 도말 상에서 관찰되는 라이트 염색된 세포를 모방하는, 백혈구 염색, 망상적혈구 염색 및 혈소판 염색을 달성하기에 적합한 방식으로 입자들을 염색 및/또는 용해시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 예시적인 조성물은 비교적 낮은 혈액 대 시약 희석률에서 염색이 일어날 수 있게 하며, 그러한 염색은 신속히(예를 들어, 30초 이내에) 일어날 수 있다. 필요하다면, 예시적인 방법은 적혈구 용해를 달성하기 위해 열과 조합된 계면활성제의 사용을 채용할 수 있다. 예시적인 제형은, RBC 완전성을 유지하고 여전히 WBC, 망상적혈구 및 혈소판 염색 효능을 달성하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 태양 및 실시 형태는, 소정의 PIOAL 조성물이 이미지-기반 입자/세포 분석을 수행하는 데 사용될 때, 세포들을 정렬시키고 세포내 구조들을 위치재설정하는 예기치 않은 특성을 갖는다는 의외의 예기치 않은 발견에 기초한다.
예로서, 몇몇 예시적인 PIOAL 제형 및 이의 사용 방법을 개발하였다. 하기는 원하는 특성을 갖는 일부 전형적인 PIOAL 제형이다.
도 4o는 PIOAL을 사용하여 얻어진 이미지 대 비 PIOAL 시스 유체를 사용하여 얻어진 이미지의 비교를 보여준다. PIOAL의 사용은 더 많은 인-포커스 세포 내용물, 예컨대 엽, 세포질, 및/또는 과립을 생성하였다. 이 실시예에서는, 점도제(약 30% 글리세롤)를 포함하는 PIOAL을 사용하여 샘플을 처리하였다. pH를 약 6.8 내지 7.2의 pH로 조정하였으며, 샘플 혼합물을 (0.9% 염화나트륨)에 의해 등장성으로 만들었다. 여기서 보여주는 결과는 세포들 및 세포내 세포소기관들을 정렬하기 위해 이미지 분석기 상에서 사용되는 예시적인 PIOAL의 효능을 입증한다.
도 4p 및 도 4q는 표준 시스 유체를 사용하여 얻어진 이미지(도 p의 상측 및 하측 패널) 대 예시적인 PIOAL 유체를 사용하여 얻어진 이미지(도 4q의 상측 및 하측 패널)의 비교를 보여준다. 여기서 보여주는 바와 같이, PIOAL의 사용은, 예를 들어 적혈구의 주 표면들을 카메라 또는 이미징 디바이스를 향해 대면하도록 배향시킴으로써 개선된 RBC 정렬을 가져왔다. (도 1에 도시된 바와 같은 예시적인 표적(44) 상에서) 기기 포커싱 프로토콜을 사용하여 샘플을 분석하였으며, 시각적 분석기에 의해 표적을 포커싱되게 하였다. 이어서, 포커싱 시스템을 변위 거리(52)만큼 오프셋하였으며, 그 결과 리본형 샘플 스트림 내의 입자들이 인-포커스 상태가 되었다. 혈액 샘플을 샘플 희석제를 사용하여 사전에 희석시켰다. 샘플은 캐뉼러를 통해 플로우셀의 유로를 따라 유동하였으며, 그럼으로써 PIOAL 또는 표준 시스(대조군에서)의 2개의 층들 사이에 있는 리본형 샘플 스트림(예를 들어, 2 마이크로미터 두께)을 생성하였다. 이어서, 시각적 분석기는 분석에 사용될 리본형 샘플 스트림 내의 입자들의 포커싱된 이미지를 (예를 들어, 초당 약 60 프레임으로) 생성한다. 혈액 샘플은 대상체로부터 얻고 혈액 분석기에 의한 분석을 위해 처리한다. 표준 시스 유체 또는 PIOAL을 사용하여 샘플을 처리하고 있는 동안에 플로우셀 내의 RBC의 이미지를 캡처링한다. 상대 백분율은 이미징 데이터(예를 들어, 4p 및 4q)에 기초한 정렬된 RBC의 수에 있어서 상당한 개선을 입증한다. 이러한 결과는 PIOAL이, 본 명세서에 기술된 바와 같이 포커싱 기기/프로토콜을 사용하여 리본형 샘플 스트림으로 유동 중인 동안에, RBC 정렬의 백분율을 증가시키는 데 효능적임을 입증하였다.
또한, PIOAL의 구현은 대칭 및 비대칭 플로우셀 내에서의 증가하는 수준의 글리세롤(gly)의 사용에 기초하여 개선된 정렬을 가져오는 것으로 관찰되었다.
도 4r에서의 차트는 대칭 대 비대칭 플로우셀과 함께 PIOAL 중 0% 내지 30% 글리세롤을 사용하여 얻어진 미정렬 세포들의 백분율을 보여준다. PIOAL 중 30% 글리세롤 및 대칭 플로우셀의 사용은 오정렬된 세포들의 백분율이 단지 8%로 감소되는 결과를 가져온다. PIOAL 중에 글리세롤을 함유하지 않고 비대칭 셀을 사용함에 의해, 오정렬된 세포들의 백분율은 87%로 증가되었음에 유의한다. 따라서, 이 차트는 입자(예를 들어, RBC) 정렬에 대한 글리세롤 백분율 및 플로우셀 기하학적 형태의 영향을 입증한다. 글리세롤의 첨가는, 대칭 또는 비대칭 플로우셀 기하학적 형태를 사용하여, 오정렬된 RBC 세포들의 백분율을 감소시킨다. %미정렬 RBC는, 비대칭 셀에서는 87%에서 15%로, 그리고 대칭 셀에서는 46%에서 8%로 감소되었다. 따라서, 이 차트는 대칭 협소화 플로우셀 전이 구역을 갖는 플로우셀 및 점성 시스 유체를 포함하는 분석기 구성으로부터 얻어진 오정렬 결과(8%)와 점성 시스 유체의 사용 없이 대칭 협소화 플로우셀 전이 구역을 갖는 플로우셀을 포함하는 분석기 구성으로부터 얻어진 오정렬 결과(46%) 사이의 비교를 제공한다.
이러한 결과들은 소정의 PIOAL 조성물이 이미지-기반 입자/세포 분석을 수행하는 데 사용될 때, 세포들을 정렬시키고 세포내 구조들을 위치재설정하는 예기치 않은 특성을 갖는다는 의외의 예기치 않은 발견에 대한 증거를 제공한다.
예로서, 몇몇 예시적인 PIOAL 제형 및 이의 사용 방법을 개발하였다. 하기는 원하는 특성을 갖는 일부 전형적인 PIOAL 제형이다. PIOAL은 희석제 및 적어도 하나의 점도 개질제를 포함한다.
예시적인 PIOAL 제형 A는 300 mL의 글리세롤, 및 1 L가 되도록 하는 QS(최종 부피에 이르게 하는 또는 충분한 양)의 희석제를 갖는 30% (v/v) 글리세롤 용액을 포함하며, 이때 희석제는 9.84 g의 황산나트륨, 4.07 g의 염화나트륨, 0.11 g의 프로카인(Procaine) HCl, 0.68 g의 제1인산칼륨, 0.71 g의 제2인산나트륨, 및 1.86 g의 다이소듐 EDTA를 함유한다. 이후에, 초기 혼합물에, 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.2로 조정하면서 1 L가 되도록 하는 QS의 탈이온수를 첨가하였다.
예시적인 PIOAL 제형 B는 65 mL의 글리세롤, 및 1 L가 되도록 하는 QS의 적합한 예시적인 희석제를 갖는 6.5% (v/v) 글리세롤 용액을 포함하며, 이때 희석제는 9.84 g의 황산나트륨, 4.07 g의 염화나트륨, 0.11 g의 프로카인 HCl, 0.68 g의 제1인산칼륨, 0.71 g의 제2인산나트륨, 및 1.86 g의 다이소듐 EDTA를 함유한다. 이후에, 초기 혼합물에, 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.2로 조정하면서 1 L가 되도록 하는 QS의 탈이온수를 첨가하였다.
예시적인 PIOAL 제형 C는 50 mL의 글리세롤, 10 g의 PVP(MW: 360,000), 1 패킷(packet)의 시그마(Sigma) PBS 분말 - 이는 pH 7.4(0.01 M 인산 완충 식염수; 0.138 M 염화나트륨; 0.0027 M 염화칼륨)인 상태 -, 및 1 L가 되도록 하는 QS의 탈이온수를 갖는 완충제 중 1% PVP (w/v)를 함유하는 5% 글리세롤 (v/v) 용액을 포함한다.
예시적인 PIOAL 제형 D는 16 g의 PVP(MW: 360,000) 및 1 패킷의 시그마 PBS 분말 - 이는 pH 7.4(0.01 M 인산 완충 식염수; 0.138 M 염화나트륨; 0.0027 M 염화칼륨)인 상태 -, 및 1 L가 되도록 하는 QS의 탈이온수를 갖는 1.6% PVP (w/v) 용액을 포함한다.
처리량
도 5는 플로우셀 내에서의 하나 이상의 샘플 유체의 주입에 상응하는 타임라인(timeline)(500)을 도시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 단계(510)에 의해 나타낸 바와 같이 제1 샘플 유체의 주입이 플로우셀 내로 개시될 수 있다. 이후에, 단계(515)에 의해 나타낸 바와 같이 제1 샘플 유체로부터의 입자들이 플로우셀 내에서 이미징될 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 제1 샘플 유체는 약 5 μL 내지 약 150 μL 범위의 부피를 가질 수 있다. 일부 경우에, 이러한 유동은 이미징 영역에서 0.232 μL/sec(또는 0.2 μL/sec 내지 0.35 μL/sec의 범위)이다. 20초의 이미징 동안, 유동 값은 5 μL 내지 15 μL의 범위 내에 있을 수 있다. 단계(520)에 의해 나타낸 바와 같이 제1 샘플 유체의 주입은 종료될 수 있으며, 단계(530)에 의해 나타낸 바와 같이 제2 샘플 유체의 주입이 플로우셀 내로 개시될 수 있다. 제1 샘플 유체 주입의 종료 및 제2 샘플 유체 주입의 개시의 결과로서, 단계(535)에 의해 나타낸 바와 같이 샘플 유체 과도상태가 개시될 수 있다. 이어서, 단계(445)에 의해 나타낸 바와 같이 플로우셀 내의 샘플 유체 과도상태가 소산될 수 있다. 단계(550)에 의해 나타낸 바와 같이, 제2 샘플 유체로부터의 입자들이 플로우셀 내에서 이미징될 수 있다. 단계(560)에 의해 나타낸 바와 같이, 제2 샘플 유체의 주입이 종료될 수 있다. 일부 경우에, 주입 및 유동 절차는 약 18℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 수행된다.
전형적으로, 시스 유체의 스트림은, 샘플이 주입될 때 그리고 그러한 주입이 종료될 때, 플로우셀 내에서 유동하는 상태를 유지한다. 따라서, 일부 실시 형태에 따르면, 샘플 유체의 주입들이 유동하는 시스 내로 펄스형으로 보내지는 동안에 시스 유체의 연속 유동이 유지된다. 시스 유체의 연속 유동은, 샘플 유체가 플로우셀을 따라 유동함에 따라, 샘플 유체에서의 리본 형상의 보존에 기여할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 단계(550)와 관련된 이미지 캡처는 단계(515)와 관련된 이미지 캡처 후 4초 이내에 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 제1 샘플 유체 주입과 제2 샘플 유체 주입 사이(예를 들어, 단계(510)와 단계(530) 사이)의 시간은 약 30초이다. 이와 관련하여, 일부 실시 형태에 따르면, 제1 샘플 유체의 이미징 개시와 제2 샘플 유체의 이미징 개시 사이(예를 들어, 단계(515)의 개시와 단계(550)의 개시 사이)의 시간은 약 30초이다. 이러한 방식으로, 시간당 120개의 샘플 유체를 처리하는 것이 가능하다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스가 초당 180 프레임(180 FPS)의 프레임률로 작동하며, 이에 따라 높은 빈도수 또는 속도로 다수의 독자적인 연속된 이미지들 또는 프레임들을 생성한다. 여기에 도시된 바와 같이, 이미징 단계(예를 들어, 515 또는 550)의 지속기간은 15초일 수 있으며, 이에 따라 샘플 유체당 2,700개의 이미지를 생성할 수 있다.
일부 경우에, 제1 샘플 유체는, 샘플 유체 주입관으로부터 유동하는 시스 유체 내로의 제1 샘플 유체의 주입(예를 들어, 단계(510)) 후, 약 1 내지 3초 이내에 안정화 상태에 도달한다. 일부 경우에, 제1 샘플 유체는, 샘플 유체 주입관으로부터 유동하는 시스 유체 내로의 제1 샘플 유체의 주입(예를 들어, 단계(510)) 후, 1 초 미만 이내에 안정화 상태에 도달한다. 플로우셀 내로의 샘플의 주입은 2단계 과정일 수 있다. 이러한 실시 형태에 따르면, 제1 단계는 캐뉼러로부터 모든 희석제를 제거하는 고속 푸시(high speed push)이고, 초기 푸시 후에는 샘플의 유량이 상당히 감소된다. 전이 시간은, 이미징 유동 조건(더 작은 샘플 유량) 하에서, 샘플(예를 들어, 세포)이 캐뉼러 출구로부터 이미징 영역까지 이동하는 데 걸리는 시간으로서 정의될 수 있다. 일부 경우에, 제1 샘플 유체는, 샘플 유체 주입관으로부터 유동하는 시스 유체 내로의 제1 샘플 유체의 주입(예를 들어, 단계(510))으로부터 약 1.8초 이내에 안정화 상태에 도달한다. 일부 경우에, 샘플 유체는 (예를 들어, 캐뉼러 출구로부터 이미지 캡처 영역까지) 플로우셀을 통과하는 수송 시간이 약 2 내지 4초의 범위이다.
일부 실시 형태에 따르면, 유동이 안정화하는 데, 또는 캐뉼러의 원위 출구로부터 이미징 영역까지 이동하는 데 약 5초가 걸린다. 일부 경우에, 이미지 캡처 지속기간은 약 20초일 수 있다.
본 발명의 실시 형태들에 따른 혈액학 시스템은 약 150 μL의 부피를 갖는 혈액 샘플을 처리할 수 있다. 흡인된 혈액 부피는 약 120 내지 150 μL일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 관 내의 이용가능한 최소의 혈액 부피는, 자동 샘플링 모드의 경우는 약 500 μL이고, 수동 샘플링 모드의 경우는 약 250 μL이다. 도 4d에 도시된 캐뉼러 또는 주입관(400d)은 약 13 uL의 내부 부피를 갖는다. 일부 실시 형태에 따르면, 캐뉼러 또는 주입관은 약 30 uL 미만의 내부 부피를 갖는다. 이러한 혈액 샘플의 부피는 이미지 수집을 시작하기 전에 캐뉼러를 플러싱하는 데 효과적이며, 이에 따라 샘플 유동이 안정되지 않는 기간이 연장되는 것을 피할 수 있다. 예를 들어, 내부 부피가 약 13 uL인 캐뉼러의 사용은 약 2 내지 3초의 샘플 유동 불안정성 기간에 상응할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 캐뉼러 내부 부피는 샘플 유동 안정성에 영향을 주지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 초기 고속 샘플 푸시가 캐뉼러 내부의 모든 희석제를 대체하기에 불충분하다면, 캐뉼러 내부 부피는 샘플 리본 그 자체 내의 세포 농도 안정성에 영향을 줄 수 있다. 이와 관련하여, 캐뉼러는 소량의 희석제를 사용하여 단시간 내에 샘플들 사이에서 세정될 수 있다. 이러한 방식으로, 고품질 이미지의 캡처를 가능하게 하는 안정된 샘플 유동을 달성하고, 동시에 낮은 캐리-오버(carry-over)와 함께 고처리량을 달성하는 것이 가능하다. 일부 실시 형태에 따르면, 높은 내부 부피를 갖는 캐뉼러는 라인들 및 캐뉼러 내의 모든 희석제를 제거하는 데 샘플의 높은 부피의 초기 고속 푸시를 필요로 할 수 있다. 본 발명의 실시 형태는 더 낮은 내부 캐뉼러 부피의 구현을 포함하는데, 이는 이용가능한 샘플 부피가 낮은 혈액학적 응용, 및 더 낮은 부피 푸시가 더 단시간 내에 달성될 수 있는 혈액학적 응용에 적합하다.
일부 실시 형태에 따르면, 혈액 유체 샘플로부터의 이미지 획득을 가속화하도록 하기 위해, 혈액학 시스템은 과도상태 및 순차적인 샘플 교차-오염을 제한하도록 구성될 수 있다.
세포 구조, 내용물, 및 정렬
일부 실시 형태에 따르면, 백혈구의 염색 및 시각화를 달성하기 위하여, 샘플 중의 적혈구를 용해시키고 백혈구를 투과화하여 염색제가 백혈구와 일체화될 수 있도록 하는 것이 도움이 된다. 세포들에 대한 형태에서의 변화가 거의 내지 전혀 없이 백혈구의 염색을 얻는 것이 종종 바람직하다. 또한, 라이트 염색제와 유사한 염색 특성을 얻는 것이 종종 바람직하다. 더욱이, 높은 적혈구 정렬(예를 들어, 목표치 90% 초과)을 얻는 것이 종종 바람직하다.
도 5a는 글루타르알데하이드를 포함하지 않는 염색제 제형을 사용하여 얻어진 결과를 도시한다. 세포들이 플로우셀 내에서 접한 전단력의 결과로서 부서진 것으로 관찰되었다. 핵의 우수한 염색이 달성되었기는 하지만, 핵 그 자체는 변형된 것으로 보였으며, 세포막은 손상된 것으로 보였다. 요컨대, 이미징될 때, 세포는 세포 내용물 및 구조에 대한 붕괴로 인해 파괴된 것으로 보였다.
도 5b는 글루타르알데하이드를 포함하는 염색제 제형을 사용하여 얻어진 WBC 결과를 도시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 세포막은 온전하고 세포는 둥글다. 따라서, (예를 들어, 도 5a에 도시된) 글루타르알데하이드를 사용하지 않은 염색제의 변형물은 약화된 WBC를 생성하는 것으로 관찰되었다. WBC는 도 5b에서 더 온전하기는 하지만, 핵 부분이 손상된다.
도 5b의 이미지를 얻는 데 사용된 시스 유체(PIOAL)는 30% 글리세롤을 포함하였다. 대조적으로, 도 5c의 이미지를 얻는 데 사용된 시스 유체(PIOAL)는 6.5% 글리세롤을 포함하였다. 더 낮은 글리세롤 농도는, 핵이 거의 변화되지 않은 상태로, 더 우수한 형태를 가져왔다. 따라서, 도 5c에서의 세포막은 도 5b에서의 세포막보다 더욱 더 온전한 것으로 관찰되었다. 도 5c에서의 더 낮은 글리세롤 농도는 점도 차이를 감소시킴으로써 전단력을 감소시키도록 작동할 수 있다. 과도한 전단력이 존재한다면, 그 힘은 세포막을 파괴할 수 있다. 글리세롤은 세포와 양립불가능한 일부 특성을 가질 수 있으며, 이에 따라 더 높은 글리세롤 농도가 또한 세포막을 파괴할 수 있다. 따라서, 도 5a에 도시된 핵에 대한 손상은 시스 유체 중 30% 글리세롤의 결과일 수 있는 것으로 결론내릴 수 있다.
그러나, 도 5c에 도시된 바와 같이 글리세롤 농도를 6.5%로 낮추었을 때, 샘플 유체 중의 적혈구의 정렬이 감소된 것으로 관찰되었다.
적혈구에서의 개선된 정렬을 얻기 위한 시도로 다양한 대안적인 PIOAL 제형들을 사용하였지만, 이러한 대안적인 제형들은 만족스러운 결과를 제공하지 않았다. 예를 들어, 수 개의 상이한 점도 향상제를 시험하였지만, 이들 중 다수는 30% 초과의 글리세롤 제형의 거동과 유사한 거동을 나타내어서, 세포 내용물이 손상되었다.
점도제 성분으로서 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 5% 글리세롤을 사용함으로써, 핵을 파괴하는 부정적인 영향 없이 30% 글리세롤 제형의 점도와 매칭된 점도를 갖는 시스 유체를 얻을 수 있었음(이에 따라, 개선된 정렬 결과를 달성하였음)을 알아내었다. 도 5d는 5% 글리세롤 및 1% PVP를 갖는 PIOAL을 사용하여 얻어진 결과를 도시한다. 따라서, 시스 유체 내의 점도제는, 예를 들어 샘플 유체 스트림 내의 세포들이 플로우셀을 통해 유동하고 유동하는 시스 유체에 노출될 때, 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 함을 알 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 글리세롤의 농도 백분율은 (v/v)로 표현되고, PVP의 농도 백분율은 (w/v)로 표현된다.
도 5e는 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀 기술(우측 컬럼)과 비교하여 전통적인 현미경 습식 마운트(wet mount) 기술(좌측 컬럼)에 기초한 이미지 캡처 결과를 도시한다. 습식 마운트 절차는 이미지 선명도 및 품질에 대한 목표 표준으로서 간주될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이 설계된 플로우셀 및 시스 유체를 포함하는 기술들은 습식 마운트 절차와 등가인 이미지 선명도 및 품질을 달성하는 데 효과적인 것으로 관찰되었다.
일부 실시 형태에 따르면, 샘플 유체와 시스 유체 사이의 점도 차이가 소정의 역치를 초과할 때, 유동 스트림 리본이 분할될 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 60%로 존재하는 글리세롤을 함유하는 시스 유체를 사용할 때, 분할된 유동 스트림 리본이 관찰되었다.
방법
도 6은 본 발명의 실시 형태들에 따른 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 위해 구성된 입자 분석 시스템을 사용하여 복수의 입자들을 이미징하기 위한 예시적인 방법(600)의 태양들을 도시한다. 입자들은 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플(610) 중에 포함될 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 이러한 방법은 단계(630)에 의해 나타낸 바와 같이 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체(620)를 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 시스 유체(620)는 사전결정된 점도 차이 범위 내의 일정 점도 차이만큼 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 가질 수 있다. 이러한 방법은 또한, 단계(630)에 의해 나타낸 바와 같이, 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 혈액 유체 샘플(610)을 주입하여, 시스 유체에 의해 봉입된 샘플 유체 스트림을 제공하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은, 단계(640)에 의해 나타낸 바와 같이, 샘플 유체 스트림 및 시스 유체를 유로 크기의 감소부를 통해 이미징 영역을 향해 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 샘플 스트림 및 시스 유체가 유로 크기의 감소부 또는 협소화 전이 구역을 통과함에 따라, 점도 차이와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 스트림 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과(단계(650)에 나타낸 바와 같음)가, 유로 크기의 감소부와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 스트림 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과(단계(660)에 나타낸 바와 같음)와 조합하여, 단계(670)에 의해 나타낸 바와 같이 샘플 유체 스트림 내의 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하는 데 효과적이다. 방법은 또한, 단계(680)에 의해 나타낸 바와 같이, 이미징 영역에서 복수의 입자들을 이미징하는 단계를 포함할 수 있다.
도 6a 및 도 6b는 전단력, 측방향 압축, 배향, 차별적인 점도, 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상대 운동 등과 관련된 예시적인 유동 스트림 특성을 도시한다.
도 6c는, 본 발명의 실시 형태들에 따른, 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 예시적인 방법(6000)의 태양들을 도시한다. 여기서 보여주는 바와 같이, 혈액 샘플(6010)은 입자들을 포함하며, 하나 이상의 샘플 유체, 예컨대 입자들을 함유하는 제1 샘플 유체(6012) 및 입자들을 함유하는 제2 샘플 유체(6014)로 분할될 수 있다. 이러한 방법은, 단계(6020)에 의해 나타낸 바와 같이, 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체를 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은, 단계(6030)에 의해 나타낸 바와 같이, 제1 샘플 유체(6012)를 샘플 유체 주입관으로부터 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여, 주입관에 인접하여 제1 두께를 갖는 샘플 유체 스트림을 제공하도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 플로우셀의 유로는, 샘플 유체 스트림의 두께가 초기 두께로부터 이미지 캡처 영역에 인접하여 제2 두께로 감소되도록 한 유로 크기의 감소부를 가질 수 있다. 방법(6000)은, 단계(6040)에 의해 나타낸 바와 같이, 플로우셀의 이미지 캡처 영역에서 제1 샘플 유체로부터의 제1 복수의 입자들을 이미징하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
방법(6000)은 또한 샘플 유체 과도상태를 개시하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플 유체 과도상태는, 단계(6050)에 의해 나타낸 바와 같이, 유동하는 시스 유체 내로의 제1 샘플 유체의 주입을 종료하고, 유동하는 시스 유체 내로 제2 샘플 유체를 주입함으로써 개시될 수 있다. 또한, 방법(6000)은, 단계(6060)에 의해 나타낸 바와 같이, 플로우셀의 이미지 캡처 영역에서 제2 샘플 유체로부터의 제2 복수의 입자들을 이미징하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 제2 복수의 입자들의 이미징은 사실상 샘플 유체 과도상태 후에 그리고 제1 복수의 입자들을 이미징하고 나서 4초 이내에 수행될 수 있다.
전단 변형 속도
도 7 및 도 8은 본 발명의 실시 형태들에 따른 플로우셀 내에서의 소정의 유동 조건에 대한 전단 변형 속도 값의 양상들을 도시한다. 이들 도면 각각에서, 30% 글리세롤 시스 유체가 사용된다. 일부 경우에, 점도는 2.45 × 10-3의 값을 가질 수 있다. 전단 응력 값은 점도 값을 변형 속도 값과 곱함으로써 얻어진 곱(product)과 동일할 수 있다. 도 7에 관련하여, 샘플은 0.3 μL/sec의 유량을 가질 수 있으며, 시스 유체는 21 μL/sec의 유량을 가질 수 있다. 도 8에 관련하여, 샘플은 1 μL/sec의 유량을 가질 수 있으며, 시스 유체는 70 μL/sec의 유량을 가질 수 있다. 이들 도면 각각에서, 유동은 중심(C)을 향해 더 낮은 변형 값을, 그리고 주연부(P)를 향해 더 높은 변형 값을 제공함을 알 수 있다. 일부 실시 형태에서, 그러한 변형 값은 비대칭 플로우셀 구성에 상응할 수 있다.
도 7에 도시된 바와 같이, 일부 실시 형태에 따르면, 유동 스트림의 중심(C) 부분을 향하는 더 낮은 변형 속도는 약 500 (1/s) 이하의 값을 가질 수 있고, 유동 스트림의 주연부(P)를 향하는 더 높은 변형 속도는 약 3000 (1/s) 이상의 값을 가질 수 있다. 도 8에 도시된 바와 같이, 일부 실시 형태에 따르면, 유동 스트림의 중심(C) 부분을 향하는 더 낮은 변형 속도는 약 1000 (1/s) 이하의 값을 가질 수 있고, 유동 스트림의 주연부(P)를 향하는 더 높은 변형 속도는 약 9000 (1/s) 이상의 값을 가질 수 있다.
따라서, 샘플 및 시스 유체의 더 낮은 속도(예를 들어, 도 7)는 더 낮은 변형 속도에 상응하고, 샘플 및 시스 유체의 더 높은 속도(예를 들어, 도 8)는 더 높은 변형 속도에 상응한다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 실시 형태들은 다양한 점도 값, 다양한 변형 속도 값, 및/또는 다양한 전단 응력 값에 상응하는 샘플 및/또는 시스 유체의 사용을 포함하는 것으로 이해된다.
오토포커스 표적
PIOAL은 플로우셀 내로 도입될 수 있으며, 샘플을 이미징 영역을 통해, 그리고 이어서 배출구를 향해 운반한다. 샘플 유체의 스트림은 상당한 폭을 갖는 유로를 확립하도록, 납작한 개구부를 갖는 캐뉼러를 통해 주입될 수 있다. 예를 들어, PIOAL은 샘플 유체보다 상대적으로 더 높은 점도 및 적합한 밀도를 가질 수 있으며, 샘플의 주입 지점에서의 유량은 샘플 유체가 박형 리본 형상으로 편평화되도록 하는 유량이다. 샘플 유체의 리본은 PIOAL과 함께 운반되어서 관찰구의 전방을 지나가는데, 이때 관찰구에는 광학 고분해능 이미징 디바이스 및 광원이 리본형 샘플 스트림을 관찰하도록 배열되어 있다.
리본형 샘플 스트림은 PIOAL과 함께 운반되어서 관찰구의 전방을 지나가는데, 이때 관찰구에는 광학 고분해능 이미징 디바이스 및 광원(예컨대, UV, 가시광, 또는 IR)이 리본형 샘플 스트림을 관찰하도록 배열되어 있다. 광학 고분해능 이미징 디바이스 및 광원은 혈구와 같은 입자들의 백라이트 이미지를 얻기 위해 플로우셀의 대향면들 상에 배치될 수 있다. 광학 고분해능 이미징 디바이스는 플로우셀 내의 관찰구를 통해 샘플의 픽셀 데이터 이미지를 캡처링한다. 예를 들어, 광학 고분해능 이미징 디바이스는 리본형 샘플 스트림의 섹션들이 실질적인 갭 또는 오버랩 없이 이미징되도록 샘플 유동 속도와 일치하는 반복율로 이미지를 캡처링한다.
본 발명의 실시 형태들은 플로우셀을 통해 유동하는 리본형 샘플 스트림의 이미지를 수집하기 위한 시스템의 설계 및 작동에서 구현되는 다수의 독특한 구조적 및 기능적 특징부를 제공한다. 예시적인 실시 형태들은, 입자 및/또는 세포 유형들이 서로 구분될 수 있게 하는, 혈구와 같은 다양한 입자들의 상이한 특징들을 나타내기에 충분한 선명도 및 분해능을 갖는 입자들의 충분히 포커싱된 이미지를 얻도록 구성된다.
리본형 샘플 스트림을 포커싱되게 하기 위해서, 광학 고분해능 이미징 디바이스와 리본형 샘플 스트림 사이의 거리는 리본형 샘플 스트림이 광학 축을 따라 광학 고분해능 이미징 디바이스로부터 원하는 거리(예컨대, 포커싱 거리)에 있도록 설정될 수 있다.
포커싱 거리는 광센서 어레이 상에 이미지를 분해하는 데 사용되는, 즉 렌즈 요소의 재료, 형상 및 치수와 광학 축을 따르는 그들의 구성 및 배치에 의해 한정되는 광학 고분해능 이미징 디바이스의 렌즈들의 특성이다. 이미징되는 샘플의 영역의 치수 및 샘플 내에 인-포커스 상태에 있는 피사계 심도는 렌즈 구성에 의해 결정된다.
개구 조절 및 줌 조절(zoom adjustment)이 가능하지만, 단순화를 위해, 본 발명의 소정의 실시예들은 광학 고분해능 이미징 디바이스를 리본형 샘플 스트림 중의 입자들 상에 포커싱하는 것이 단순히 광학 고분해능 이미징 디바이스 및 플로우셀 내의 리본형 샘플 스트림을 올바른 거리에, 즉 리본형 샘플 스트림 중의 입자들의 광센서 어레이(예컨대, 전하 결합 디바이스 어레이) 상에 포커싱된 이미지를 분해하는 거리에 상대적으로 위치설정하는 것을 필요로 하는 것이다. 광학 고분해능 이미징 디바이스는 표시 및/또는 처리 및/또는 전송을 위해 정지 이미지 또는 비디오 이미지를 기록하거나 또는 전송하는 카메라를 포함할 수 있다.
일 태양에서, 플로우셀의 대칭적 성질과 샘플 유체 및 PIOAL의 주입 방식은 PIOAL 중의 리본형 샘플 스트림에 대해 플로우셀 내에 반복가능한 위치를 제공한다. 그러나, 플로우셀과 광학 고분해능 이미징 디바이스의 상대 위치는 광학 고분해능 이미징 디바이스와 리본형 샘플 스트림 사이에 최적의 거리를 유지하기 위해 변경되고 이따금씩의 위치 조절을 필요로 하여서, 그에 따라 소정 품질의 포커스 이미지를 제공하게 된다.
본 발명의 실시 형태들은 리본형 샘플 스트림과 광학 고분해능 이미징 디바이스 사이의 거리를 아주 정확하게 설정해 줌으로써 샘플의 신뢰성 있게 포커싱된 이미지를 제공하도록 오토포커스 디바이스/장치를 통합하는, 혈액 및/또는 다른 생물학적 유체를 위한 자동화 시각적 분석기 시스템 및 방법을 포함한다. 일 태양에서, 본 명세서에 개시된 오토포커스 시스템 실시 형태들은 리본형 샘플 스트림과 광학 고분해능 이미징 디바이스 사이의 거리를 아주 정확하게 설정할 수 있고, 샘플의 신뢰성 있게 포커싱된 이미지를 캡처링할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 양호한 포커스 결과를 달성하는 거리를 확립하도록 알고리즘이 사용된다.
광학 고분해능 이미징 디바이스 및 광학 고분해능 이미징 디바이스와 리본형 샘플 스트림 사이에 최적의 거리를 유지하는 오토포커스 디바이스/장치와 조합하여, PIOAL의 유동 내에 봉입된 리본형 샘플 스트림에 대해 안정되고 그리고 매우 반복가능한 위치를 제공하여서 소정 품질의 포커싱된 이미지를 제공하는 플로우셀을 채용하는 것이 하나의 목적이다.
그러한 장치 및 방법은 본 명세서에 개시되고 청구되어 있다. 대칭적인 플로우셀이 제공되는데, 이는 플로우셀 내에 반복가능한 리본형 샘플 스트림 위치를 생성하는 것이 발견되었다. 포커싱은 리본형 샘플 스트림에 대한 포커스를 유지하도록 하기 위해, 리본형 샘플 스트림에 대해 광학 고분해능 이미지 디바이스의 정밀하게 정확한 상대 위치를 설정하는 것을 수반한다.
유리하게는, 플로우셀 및/또는 광학 고분해능 이미지 디바이스는 고대비 패턴과 같은 오토포커스 패턴 또는 유사한 포커싱 표적, 바람직하게는 에지와 같은 선명한 대비 특징부(sharply contrasting feature)를 갖는 평면형 표적을 사용하는 오토포커싱 과정에서 서로에 대해 이동될 수 있으며, 오토포커스 패턴은 플로우셀에 대해 제 위치에 고정되고 샘플 자체 대신에 포커싱 대상체로서 사용된다. 리본형 샘플 스트림은 광학 고분해능 이미징 디바이스의 광학 축에 평행한 라인을 따라 오토포커스 패턴으로부터의 일정한 거리에 있는 박형 리본이다. 오토포커스 패턴과 리본형 샘플 스트림 위치 사이의 변위 거리는 일정한 거리이고, 이는 초기에 결정되고 오토포커스 절차 내로 프로그래밍된다. 이후의 예시적인 기술은 오토포커스 패턴 상에 오토포커싱하고, 이어서, 광학 고분해능 이미지 디바이스 및/또는 플로우셀을 기지의 일정한 사전결정된 거리만큼 서로에 대해 변위시키는 것인데, 그에 따라 광학 고분해능 이미지 디바이스와 리본형 샘플 스트림의 위치 사이의 거리가 리본형 샘플 스트림의 소정 품질의 포커싱된 이미지를 제공하는 최적의 거리가 된다. 예를 들어, 처음에, 오토포커스 알고리즘이 광학 고분해능 이미징 디바이스의 위치를 리본형 샘플 스트림으로부터 일정한 거리에 위치된 오토포커스 패턴 상에 포커싱한다. 오토포커스 패턴 상에 포커싱되면, 프로세서는 일정한 거리에 걸쳐 모터 드라이브를 작동하고, 그에 따라 리본형 샘플 스트림을 광학 고분해능 이미징 디바이스로 포커싱되게 한다.
예시적인 광학 고분해능 이미지 디바이스는 대물 렌즈 및 관련 픽셀 이미지 센서를 포함하여, 입자들의 가시적 특징부를 분해하기에 충분한 세부를 제공하도록 충분한 배율 및 분해능으로 입자들을 나타내는 이미지를 캡처링할 수 있다. 소정 실시 형태에서, 배율은 2x 이상의 비율만큼 더 높고(그에 따라 취해진 각 이미지 당 2x 이미지 영역을 제공함), 그럼으로써 전통적인 혈액 분석기들과 비교하여 각각의 입자에 대해 보다 상세한 정보를 생성한다.
PIOAL 유로는 동일한 양의 PIOAL이 리본형 샘플 스트림의 위와 아래로 유동하도록 대칭적으로 배열될 수 있는데, 이 유로는 광학 고분해능 이미징 디바이스의 광학 축에 평행한 라인을 따라 오토포커스 패턴으로부터 일정한 거리에 있는 박형 리본으로서 리본형 샘플 스트림을 연신시키고 위치시킨다. 일 실시 형태에서, 오토포커스 패턴은 후방 조명 공급원으로부터의 광을 허용하는 개구부 둘레의 불투명 경계부를 포함하고, 오토포커스 패턴의 거리는 오토포커스 제어에 의해 용이하게 그리고 확실하게 마련된다. 이어서, 리본형 샘플 스트림은 광학 고분해능 이미징 디바이스를 플로우셀에 대해 사전결정된 그리고 일정한 변위 거리에 걸쳐 변위시킴으로써 포커싱되게 한다. 샘플의 이미지 내용물 상에 직접 오토포커싱할 필요는 없지만, 추가의 오토포커싱이 생각될 수 있다.
자동화 포커싱 구성은 소정 거리 범위에 걸쳐 포커스 품질의 하나 이상의 측정을 평가하고 최적의 거리를 찾는 프로세서로부터의 제어 신호에 응답하여, 광학 축을 따라 플로우셀과 광학 고분해능 이미징 디바이스의 상대 위치를 조절하는 모터 드라이브를 포함한다. 예를 들어, 프로세서는 대비의 측정을 평가할 수 있고, 오토포커싱을 위해 모터 드라이브를 작동시킬 수 있다. 정상 작동 시에, 프로세서는 모터 드라이브를 작동시켜 표적에 대해 오토포커싱하고, 이어서, 광학 고분해능 이미징 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 표적으로부터의 기록된 변위만큼 조절하여 리본형 샘플 스트림을 포커싱되게 한다. 디바이스가 동일한 방식으로 리본형 샘플 스트림을 계속 이동시키고 그리고 열 팽창이나 유사한 혼란 인자들이 발생하지 않는 한, 리본형 샘플 스트림의 이미지는 인-포커스 상태로 유지될 것이다.
표적과 플로우셀 내의 리본형 샘플 스트림 위치 사이의 변위 거리를 결정 및 기록하기 위해 일차적인 셋업 또는 교정 과정이 이용될 수 있다. 상이한 플로우셀들에 대해 약간 다를 수 있는 정확한 변위 거리는, 일차적인 검사에 의해, 예컨대 표적에 대해 그리고 테스트 리본형 샘플 스트림에 대해 여러 번 택일적으로 오토포커싱하는 것에 의해 그리고 플로우셀과 관련된 상수로서 그 평균 결과를 기록하는 것에 의해 확립된다.
따라서, 이미징될 샘플, 예컨대 준비된 혈액 샘플 또는 다른 유형의 샘플은 플로우셀 내의 관찰 구역을 통해 한정된 유로를 따라 지향된다. PIOAL 유로는 바람직하게는 대칭적이고, 샘플은 PIOAL 유동의 중심에 주입되는데, 그 PIOAL로 샘플이 봉입된다. 샘플과 시스 재료, 예컨대 PIOAL의 유량 및 점도와 밀도 특성은, 플로우셀의 윤곽과 함께, 리본형 샘플 스트림을 반복가능한 위치에 있는 관찰 구역을 통해 일관되게 유동하는 편평한 리본으로 형성하도록 하기 위해 협동한다.
샘플은 광학 고분해능 이미징 디바이스의 카메라 구성요소, 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 오토포커스 과정을 포함하는 적어도 부분적으로 자동화된 이미지 분석 과정에 의해 분석되도록 수집된 디지털 이미지들에 의해 이미징될 수 있다.
하나의 목적은 혈액 샘플뿐 아니라 본 명세서에 기술된 다른 생물학적 샘플 중의 입자들, 예컨대 혈구들을 구분하고, 범주화하고, 하위범주화하고, 그리고/또는 카운팅하기 위한 것이며, 이는 특정 질환과 관련될 수 있다. 일 태양에서, 본 발명의 입자 조영제 조성물은 유동 중인 세포들의 놀라울 정도로 고품질의 포커싱된 이미지를 제공하는 방법에 있어서 본 명세서에 기술된 분석기와 같은 시각적 분석기와 조합될 수 있다. 세포들은 자동으로 캡처링되고 처리될 수 있다.
이미지들은 자동화 이미지 기반 WBC 감별 카운팅뿐만 아니라, 대상체가 건강한지 또는 질병, 질환, 비정상 및/또는 감염을 갖는지를 결정, 진단, 예후, 예측, 및/또는 그러한지의 진단을 지원하는 데, 그리고/또는 대상체가 치료에 반응성인지 또는 비반응성인지를 결정 또는 모니터링하는 데 유용한 형태학적 비정상의 자동화 식별도 허용한다. 혈액 샘플 중의 세포 범주 및/또는 하위범주 카운트는 분석될 수 있는 유체들의 종류의 비제한적인 예로서 본 발명에서 사용된다.
일 태양에서, 본 발명의 조성물과 함께 사용하기 위한 이미지 분석기는 리본형 샘플 스트림과 광학 시스템의 광학 고분해능 이미징 디바이스 사이의 거리를 아주 정확하게 설정해 줌으로써 샘플의 신뢰성 있게 포커싱된 이미지를 캡처링할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 시각적 분석기는 본 발명의 조성물 및 양호한 포커스 결과를 달성할 수 있는 상기 거리를 확립하기 위한 알고리즘과 조합하여 사용될 수 있다. 샘플은 플로우셀 내에 배열되고, 관찰구를 통해 관찰이 가능하도록 조명된다. 개개의 세포들 또는 입자들은 속성들을 나타내기에 충분한 특징 세부를 갖고 캡처링된 픽셀 데이터 이미지 내에 명확하게 나타나는데, 이들 속성은 이어서 세포들의 범주 및 하위범주를 서로로부터 구분하는 것으로 알려진 파라미터들과 비교되고 대조된다.
본 명세서에 기술된 예시적인 입자 조영제 조성물 및 예시적인 PIOAL과 조합하여, 최적 품질의 이미지 및 입자 인식을 위한 세부를 제공하는 플로우셀을 채용하는 것이 하나의 목적이다. 또한, PIOAL 및 장치는 PIOAL의 유동 내에 봉입된 리본형 샘플 스트림에 대해 안정되고 그리고 매우 반복가능한 위치를 제공한다. 이는, 광학 고분해능 이미징 디바이스 및 광학 고분해능 이미징 디바이스의 리본형 샘플 스트림까지의 최적의 거리를 유지하는 오토포커스 디바이스/장치와 조합하여, 소정 품질의 포커싱된 이미지를 제공한다.
오토포커스 표적
다시 도 1을 참고하면, 입자 이미징 시스템은 플로우셀(22)에 대해 고정된 오토포커스 패턴 또는 표적(44)을 포함할 수 있다. 오토포커스 표적(44)은 플로우셀을 통해 유동하는 혈액 유체 입자들의 포커싱된 이미지를 달성하기 위해 사용될 수 있다.
도 9a는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 오토포커스 표적(900)을 도시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 표적(900)은 불투명 환상 밴드(910) 및 투명 중심 또는 개구부(920)를 포함한다. 작동시에, 이미징 디바이스는 밴드(910) 상에 포커싱하고, 개구부를 통해 이미지를 캡처링한다. 본 명세서의 어딘가 다른 곳에서, 그리고 공계류 중인 미국 특허 출원 제 ____호에서 논의된 바와 같이, 이미지 캡처 과정은 먼저 밴드(910) 상에 포커싱(또는 오토-포커싱)하는 단계, 및 이어서 개구부(920)를 통해 이미지를 얻기 전에 이미지 캡처 디바이스와 샘플 유체 스트림 사이의 거리를 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 밴드(910)는 이미지 캡처 디바이스의 오토-포커스 시스템이 검출하고 포커싱할 수 있는 표적을 제공할 수 있으며, 표적의 소정 부분들(예를 들어, 에지들 또는 세그먼트들)이 이미지 내에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 표적은 중심 개구부를 갖는 크롬 디스크로서 제공될 수 있다. 예시적인 표적에는 약 0.5 mm의 직경을 갖는 중심 핀홀이 구비될 수 있으며, 이러한 핀홀은 플로우셀에 접착 또는 고정되어 있다. 중심 핀홀 또는 개구부(920)의 크기는, 도 9b에 예시된 바와 같이, 불투명 환상 밴드(910)의 단지 4개의 에지 부분(930)이 캡처링된 이미지(940)에서 가시적이도록 선택될 수 있다. 따라서, 환상 밴드(910)는 세포 이미지의 캡처링을 방해하지 않는다(예를 들어, 샘플 입자들을 조명하도록 광이 개구부(920)를 통과할 수 있으며, 시야가 환상 밴드에 의해 사실상 방해받지 않는다). 이러한 방식으로, 밴드(910)는 단지 이미지의 코너에서만 나타난다.
도 10은 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 오토포커스 표적(1000)을 도시한다. 표적(1000)은 밴드 또는 경계부(1010) 및 중심 개구부(1020)를 포함한다. 도 11은 본 발명의 실시 형태들에 따른 다른 예시적인 오토포커스 표적(1100)을 도시한다. 표적(1100)은 밴드 또는 경계부(1110) 및 중심 개구부(1120)를 포함한다. 일부 실시 형태에 따르면, 오토포커스 표적(1100)은 상부 및 하부 상에 흑색의 50개의 픽셀을 갖는 이미지를 제공한다. 일부 경우에, 오토포커스 표적(1100)은 약 65.3 μm의 플로우셀 포커스 오프셋(flowcell focus offset, FCFO)을 제공한다. FCFO의 양상들이 공계류 중인 미국 특허 출원 제_____호에 추가로 논의되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
도 12a는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 오토포커스 표적(1200)을 도시한다. 표적(1200)은 레터박스 설계(letterbox design)로서 제공되며, 제1 또는 상부 경계부(1210) 및 제2 또는 하부 경계부(1220)를 포함한다. 표적(1200)은 또한 제1 경계부와 제2 경계부 사이에 개구부 또는 투명 통로(1230)를 포함한다. 일부 실시 형태에 따르면, 표적은 약 4 mm의 직경을 가지며, 레터박스의 높이는 265 μm이다. 일부 경우에, 상부 및 하부 경계부는 반원으로서 존재할 수 있으며, 침착된 금속, 예컨대 산화크롬 또는 일부 다른 불투명 재료를 사용하여 생성될 수 있다.
도 12b는 오토포커스 표적(1200)의 중심 부분의 확대도를 도시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 제1 경계부(1210)는 중심에 있는 0의 값과 함께 음/양의 숫자 스케일을 포함한다. 제2 경계부(1220)는 유사한 스케일을 포함한다. 일부 경우에, 스케일 증분값은 100 μm이다. 일부 실시 형태에 따르면, 스케일은, 이미징 디바이스 또는 카메라의 시야가 샘플 스트림 상에 중심이 맞추어지도록, 플로우셀의 위치설정을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 샘플 스트림(1240)은 제1 및 제2 경계부의 스케일에 직각인 방향으로 유동한다. 포커싱 프로토콜의 일부로서, 이미지 캡처 디바이스는 경계부(1210, 1220) 상에 존재하는 이미징가능한 물체들의 수 또는 다른 특징에 포커싱하도록 작동할 수 있다.
본 발명의 실시 형태들은 입자 분석 시스템의 사용과 관련된 열 드리프트(thermal drift)에 대처하기 위한 기술을 포함하는데, 그러한 열적 효과는 그렇지 않으면 이미징 디바이스에 의해 얻어지는 이미지의 품질을 손상시킬 수 있다. 도 13a는 열 센서(1370), 반사기(1380), 및 오토포커스 표적(1344)을 갖는 플로우셀(1320)의 부분 측면도를 도시한다. 입자 분석 시스템의 작동 동안, 열적 효과는 샘플 스트림이 이미징 디바이스의 포커스로부터 서서히 드리프팅되게 할 수 있다. 예를 들어, 열적 효과는 램프로부터 기인되는 방사열을 통한 플로우셀의 열 팽창에 의해 야기될 수 있다. 또한, 열적 효과는 전도 및 방사 가열을 통한 플로우셀 및 광학 벤치 조립체(optical bench assembly, OBA)의 열 팽창에 의해 야기될 수 있다. 일부 실시 형태에서, OBA의 소정의 구성요소들이 팽창될 수 있으며, 이는 포커싱 오류의 원인이 될 수 있다. 예를 들어, 그러한 구성요소에는 카메라(24)를 결속시키는 금속 플레이트, 플로우셀을 유지하거나 이에 연결된 금속 플레이트, 또는 플로우셀 및 카메라(24) 둘 모두를 결속시키는 금속 플레이트가 포함될 수 있다. 도 13b는 열 센서(1370) 및 오토포커스 표적(1344)을 갖는 플로우셀(1320)의 부분 사시도를 도시한다. 또한, 도 13c는 열 센서(1370), 반사기(1380), 및 오토포커스 표적(1344)을 갖는 플로우셀(1320)의 다른 사시도를 도시한다.
도 13b는 열 센서(1370) 및 오토포커스 또는 이미징 표적(1344)을 갖는 플로우셀(1320)의 부분 사시도를 도시한다. 본 발명의 일부 실시 형태에 따르면, 이미지 캡처 디바이스는 분석기와 관련된 열 센서에 의해 감지되는 온도를 사용하여 샘플 유동 스트림 상에 포커싱될 수 있다. 예를 들어, 온도는 샘플 유체 온도, 시스 유체 온도, 플로우셀 온도, 또는 이미지 캡처 디바이스 온도에 상응할 수 있다. 일부 경우에, 온도는 플로우셀의 이미징 영역에서의 온도이다. 일부 경우에, 온도는 이미징 영역의 하류 위치에서의 온도이다. 일부 경우에, 온도는 이미징 영역의 상류 위치에서의 온도이다. 본 발명의 일부 실시 형태에 따르면, 이미지 캡처 디바이스는 분석기와 관련된 온도의 변화율을 사용하여 샘플 유동 스트림 상에 포커싱될 수 있다. 예를 들어, 온도 변화율은 샘플 유체 온도 변화율, 시스 유체 온도 변화율, 플로우셀 온도 변화율, 또는 이미지 캡처 디바이스 온도 변화율에 상응한다.
도 13c는 열 센서(1370), 반사기(1380) 및 오토포커스 또는 이미징 표적(1344)을 갖는 플로우셀(1320)의 다른 사시도를 도시한다. 반사기(1380)는 플로우셀(1320)에 의해 흡수되는 열의 양을 감소 또는 제한하도록 작동할 수 있다. 예를 들어, 반사기(1380)는, 도 13a에 나타낸 바와 같이, 플래시 램프(1342)에 의해 방사되는 열을 차단할 수 있다. 따라서, 반사기(1380)는 램프의 열 충격을 최소화할 수 있다. 반사기(1342)는 또한 램프에 의해 발생되는 눈부심 및 광 산란을 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 결국 개선된 이미지 품질을 가져온다. 열 센서(1370)는, 정확한 온도 판독이 얻어질 수 있도록, 유체 유동 채널 부근에 그리고 이미지 캡처 영역에 인접하게 위치된다. 온도 센서로부터의 정보는 이미지 캡처 디바이스를 샘플 유체 리본 스트림 상에 포커싱하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 예시적인 오토포커싱 기술은 분석기의 소정 요소들 내에서 발생하는 온도 변동에 기초할 수 있다.
도 13d에 도시된 바와 같이, 플로우셀(1320d)은 포트 또는 통기구(1301d)를 갖는 유로(1322d)를 포함할 수 있으며, 이를 통해 버블(1302d)이 방출 또는 제거될 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 유동 스트림으로부터 버블(1302d)을 인출하도록 하기 위해, 관(1303d) - 이를 통해 진공이 적용될 수 있음 - 이 포트(1301d)와 접촉될 수 있다. 그러한 버블 제거 메커니즘은 플로우셀 내의 유동하는 유체로부터 버블을 제거하기에 적합하며, 버블 또는 미세버블이 플로우셀의 내부에 체류하거나 갇히게 되는 것을 방지하도록 작동할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 혈액 유체 샘플 내의 입자들을 이미징하기 위한 방법은 시스 유체를 플로우셀의 유로를 따라 유동시키는 단계, 및 혈액 유체 샘플을 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 플로우셀은 관련 온도를 갖는다. 또한, 방법은 플로우셀과 관련된 온도가 제1 온도에 있는 동안 이미지 캡처 디바이스를 이미징 축을 따라 유동 스트림 상에 제1 초점 상태로 포커싱하는 단계, 및 제1 초점 상태에 있는 이미지 캡처 디바이스로 유동 스트림 내의 입자들의 제1 하위세트의 제1 포커싱된 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 더욱이, 방법은 플로우셀과 관련된 온도가 제1 온도로부터 제2 온도로의 변화를 겪는 것을 판정하는 단계, 및 온도의 변화 및 플로우셀 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계에 응답하여 제1 초점 상태로부터 제2 초점 상태로 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 자동으로 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 게다가, 방법은 제2 초점 상태에 있는 이미지 캡처 디바이스로 유동 스트림 내의 입자들의 제2 하위세트의 제2 포커싱된 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 조절하는 과정은 온도의 변화 및 플로우셀 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계를 사용하여 이미지 캡처 디바이스와 플로우셀 사이의 거리를 조절하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스의 포커스를 조절하는 과정은 온도의 변화 및 플로우셀 온도와 원하는 포커스 사이의 기지의 관계를 사용하여 이미지 캡처 디바이스의 초점 거리를 조절하는 것을 포함한다.
동적 범위 확대
도 14는 본 발명의 실시 형태들에 따른, 혈액 샘플에서의 입자 분석을 위한 동적 또는 검출 범위 확대를 달성하기 위한 시스템 및 방법의 추가 태양들을 보여주는 블록 다이어그램이다. 여기에 도시된 바와 같이, 적어도 하나의 디지털 프로세서(18)는 모터 드라이브(54)를 작동시키도록, 그리고 표적 오토포커스 패턴(44)에 대하여 상이한 포커스 위치들에서 수집된 바와 같은 광센서 어레이로부터의 디지털화 이미지를 분석하도록 커플링된다. 프로세서(18)는 오토포커스 패턴(44)의 포커스 위치를 결정하도록, 즉 표적 오토포커스 패턴(44) 상에 오토포커싱하고, 이에 따라 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)와 오토포커스 패턴(44) 사이의 최적 거리를 확립하도록 구성된다. 이는, 알고리즘을 적용하여 제1 거리에 있는 이미지 내의 대비 수준을 평가하는 단계와 같은 이미지 처리 단계들에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 단계는 전체 이미지에 또는 적어도 오토포커스 패턴(44)의 에지에서 적용될 수 있다. 프로세서는 모터(54)를 다른 위치로 이동시키고 그 위치 또는 에지에서 대비를 평가하고, 2회 이상의 반복 후에 오토포커스 패턴(44) 상에의 포커스의 정확도를 최대화하는(또는 그 위치로 이동되는 경우 포커스의 정확도를 최적화하게 할) 최적 거리를 결정한다. 프로세서는 오토포커스 표적 오토포커스 패턴(44)과 리본형 샘플 스트림 사이의 고정된 간격에 의지하며, 이어서 프로세서(18)는 모터(54)를 제어하여 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)를 올바른 거리로 이동시켜 리본형 샘플 스트림(32) 상에 포커싱한다. 보다 상세하게는, 프로세서는 모터를 작동시켜서, 광학 고분해능 이미징 디바이스와 리본형 샘플 스트림(32) 사이의 거리를, 리본형 샘플 스트림이 표적 오토포커스 패턴(44)으로부터 변위되는 변위 거리(52)(도 1 참조)만큼 변위시킨다. 이러한 방식으로, 광학 고분해능 이미징 디바이스가 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱된다.
일부 실시 형태에 따르면, 시각적 분석기(17)가 도 1의 예시적인 분석기(17)이다. 시각적 분석기(17)는 적어도 하나의 플로우셀(22) 및 적어도 하나의 이미징 디바이스(24), 예컨대 디지털 카메라와 같은 이미징 센서를 갖는 광학 고분해능 이미징 디바이스를 포함할 수 있다. 시각적 분석기(17)는 또한 샘플 주입기(29)를 포함할 수 있다. 샘플 주입기(29)는 샘플(12)을 적어도 하나의 플로우셀(22) 내로 제공하도록 구성된다. 플로우셀(22)은 내부 PIOAL 유로를 한정하는데, 이러한 유로는, 예를 들어 유동 방향으로 대칭적으로 협소화된다. 플로우셀(22)은 샘플의 유동(32)을 플로우셀(22) 내의 관찰 구역을 통해 지향시키도록 구성된다.
도 14는 기재된 바와 같은 디지털 이미징의 오토포커스 및 다른 태양을 예시한다. 그러한 기술은 이미징을 기반으로 하지 않거나 아마도 기재된 실시 형태들보다는 이미지와 덜 관련된 혈구 장치, 예컨대 컬터(Coulter) 혈구 카운터- 유세포분석기(flow cytometer)로도 알려짐 - 와 함께 사용될 수 있다. 그러한 카운터는 유체 중의 혈구들 및 입자들을 검출 및 카운팅하기 위한 것으로 알려져 있지만, 이는 통상 이미징에 의해 행해지지 않는다. 그러한 유형의 카운터에서는, 유체 내에 봉입된 입자들의 유동을 운반하도록 플로우셀이 배열된다. 플로우셀은 협소화되어서 강제로 유로 내의 입자들을 일렬 종대로 되게 한다. 유로에 걸쳐 있는 한 쌍의 전극 또는 다른 검출기들이, 전기 임피던스의 펄스형 변화의 검출에 의해, 또는 세포들이 지나갈 때 광원과 광검출기 사이의 광로의 차단에 의해 카운트를 생성한다.
유세포분석기가 유리한데, 그 이유는 시각적 카운터에서 실제로 이미징될 수 있는 세포들의 수보다 훨씬 더 많이 다수의 세포들 또는 다른 입자들이 카운팅될 수 있기 때문이다. 그러나, 유세포분석기는 유형에 의해 세포들 사이를 구분하는 데, 또는 정상 세포와 비정상 세포 사이의 구분을 가능하게 하는 데, 또는 개별 혈구들로부터 혈소판 응괴와 같은 그룹화된 세포들을 구분하는 데 효과적이지 않다. 기재된 바와 같이, 분석기, 예를 들어 시각적 분석기를 작동시킴으로써, 리본형 샘플 스트림의 통계학적으로 유의한 이미지 프레임 수를 통해, 혈구 유형들의 분포 또는 비례적인 비가 측정될 수 있다. 시각적 분석기로부터 결정된 비례적인 비, 또는 이의 함수는 혈구 카운트, 및 유세포분석기에 의해 카운팅된 더 많은 수의 혈구들에 적용되어서, 비록 세포 유형에 대한 구별이 더 적게 이루어지거나 전혀 이루어지지 않더라도, 두 유형의 분석기 모두의 특유의 이점들을 활용한, 정확한 총 혈구 카운트를 제공한다.
일부 실시 형태에 따르면, 입자 카운트는 알고리즘, 예를 들어 입자 카운트의 비례적인 비에 기초한 알고리즘을 적용함으로써 추론될 수 있다. 도 14는 혈액 분석에 적합하게 된 예시적인 장치를 예시한다. 일부 실시 형태에서, 입자 카운터(15)와 시각적 분석기(17)는 병렬이 아닌 직렬로 연결될 수 있다. 입자 카운터(15)는, 예를 들어 컬터 혈구 카운터일 수 있는데, 이는 유체 중의 혈구들 및 입자들을 검출 및 카운팅한다. 그러한 유형의 카운터에서는, 유체 내에 봉입된 입자들의 유동을 운반하도록 유로(도시되지 않음)가 배열된다. 유로는 협소화되어서 강제로 유로 내의 입자들을 일렬 종대로 되게 한다. 유로에 걸쳐 있는 한 쌍의 전극 또는 다른 검출기들이, 전기 임피던스의 펄스형 변화의 검출에 의해, 또는 세포들이 지나갈 때 광원과 광검출기 사이의 광로의 차단에 의해 카운트를 생성한다. 입자 카운터(15)는 다수의 세포들 또는 다른 입자들을 카운팅하도록 구성된다. 그러나, 입자 카운터(15)는 세포들의 하위범주들 내의 구성원들 사이를 구분하지 못할 수 있고, 그리고/또는 정상 세포와 비정상 세포 사이를 구분하지 못할 수 있거나, 또는 개별 혈구들로부터 혈소판 응괴와 같은 그룹화된 세포들을 구분하지 못할 수 있다.
시각적 분석기(17)는 또한 입자 범주화 및/또는 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성하기에 효과적인 희석제, 투과화제, 조영제 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 화학물질을 제공하도록 구성된 적어도 하나의 접촉 챔버(contacting chamber)(25)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1 및 도 14를 참고하여 도시된 바와 같이, 접촉된 샘플은 샘플 주입기(29)를 통해 플로우셀 내로 도입되고, 시스 시약 또는 세포내 세포소기관 정렬 시약이 주입기(27)로부터 도입된다. 샘플을 적합한 농도로 희석시키기 위해 희석제가 사용될 수 있다. 입자들의 범주화 및/또는 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성하기 위해 조영제 및/또는 투과화제가 사용된다. 소정 유형의 세포들 또는 세포 구조들을 더 우수한 이미징을 위한 방향으로 정렬하기 위해 PIOAL이 사용된다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 화학물질은 먼저 샘플과 접촉하도록 적용될 수 있으며, 이어서 처리된 샘플은 시각적 분석기(17) 상에 제공된다. 적어도 하나의 화학물질을 적어도 첨가하는 것에 의한 샘플의 처리는 실온에서 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 그러한 처리는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50℃와 같은 온도에서 수행될 수 있다. 선택된 온도에서의 처리는 인큐베이터 내에서 수행될 수 있는데, 인큐베이터는 시각적 분석기(17)로부터 분리되어 있거나, 또는 온도 제어되는 시각적 분석기(17) 상에 있다.
일부 실시 형태에서, 시각적 분석기는 샘플을 조영제 및/또는 투과화제 또는 계면활성제와 접촉되게 하기 위한 조영제 주입기를 가질 수 있다. 다른 실시 형태에서, 샘플은 시각적 분석기 내로 주입하기 전에 조영제, 투과화제와 접촉될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 시각적 분석기는 제어된 시간 동안 제어된 온도에서 조영제 및/또는 투과화제와 접촉되는 동안에 샘플을 가열하기 위한 가열 요소를 포함한다. 시각적 분석기는 또한 가열 단계 후에 샘플 혼합물을 냉각시키기 위한 냉각 요소를 가질 수 있다. 혈액 유체 샘플을 처리하는 데 사용될 수 있는 예시적인 조영제 조성물 및 방법이 공계류 중인 미국 특허 출원 제________호에 개시되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기재된 바와 같이 시각적 분석기(17)를 작동시킴으로써, 리본형 샘플 스트림의 통계학적으로 유의한 이미지 프레임 수를 통해, 세포 범주 및/또는 하위범주 내의 세포들의 비례적인 비가 프로세서(18)에 의해 결정될 수 있다. 시각적 분석기(17)로부터 결정된 비례적인 비는 혈구 카운트, 및 입자 카운터(15)에 의해 카운팅된 더 많은 수의 혈구들에 적용되어서, 비록 세포 범주 및/또는 하위범주 내의 구성원들에 대한 구별이 더 적게 이루어지거나 전혀 이루어지지 않더라도, 입자 카운터(15) 및 시각적 분석기(17) 둘 모두의 특유의 이점들을 활용한, 정확한 총 혈구 카운트를 제공한다.
정확한 결과를 제공하는 것에 더하여, 입자 카운터(15) 및 시각적 분석기(17)를 포함하는 장치는 분석 속도를 개선하는 데 있어서 상당한 이점을 제공한다. 도 14에서, 상이한 혈구들의 정확한 카운팅 결과가 디스플레이(63)를 통해 출력될 수 있다. 분석 과정 동안, 작업자는 단말기(65)를 통해 프로세서(18)와 상호작용할 수 있다. 이전에는, 조영제를 사용하여 슬라이드를 만들고 이를 작업자에 의해 현미경 하에서 검사함으로써 결과의 최대 약 25% 내지 30%를 수동으로 재검토하였다. 비교에서, 본 발명의 장치를 사용하는 예시적인 방법은, 일부 실시 형태에 따라, 입자 카운터 상에서의 CBC, 및 혈구들의 범주화 및/또는 하위범주화를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 작동시킴으로써, 이미지가 시각적 분석기 상에서 재검토될 수 있으며, 샘플은 더 적은 빈도의 수동 재검토를 필요로 할 것이다.
모터(54)는 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스에 의해 이미징되는 구분되는 특징부들, 특히 혈구의 양상들보다 다소 더 작은 정밀도를 갖는 기어드 스테핑 모터를 포함할 수 있다. 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 위치가, 광학 대물 렌즈의 위치를 리본형 샘플 스트림의 폭 내에 두도록 조정되면, 리본형 샘플 스트림 내의 세포/입자의 관찰은 인-포커스 상태에 있다. 오토포커스 패턴은 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스의 시야의 에지에 위치될 수 있으며, 그러한 이유로 관찰을 방해하지 않는다.
더욱이, 광학 고분해능 이미징 디바이스가 변위 거리에 걸쳐 이동되고 오토포커스 패턴이 포커스를 벗어나게 될 때, 인-포커스인 것으로 보이는 특징부들은 오토포커스 패턴에 대향된 것과 같은 혈구들이다. 일부 실시 형태에 따르면, 오토포커스 패턴은 시야 내에 있는 형상들에 의해 한정될 수 있다. 이러한 형상들은 제한된 크기의 비교적 얇은 개별 형태들이며, 이에 따라 변위 거리만큼 이동한 후에, 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱될 때, 형태들은 디지털화 이미지에서 사실상 비가시적이게 된다. 전형적인 변위 거리는, 혈액(혈구) 이미징 적용을 위한 치수를 갖는 플로우셀에서, 예를 들어 50 내지 100 μm일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 오토포커스 특징부는 최적 포커스 거리의 1 μm 이내에 광학 고분해능 이미징 디바이스를 유지한다.
플로우셀 내부 윤곽 및 PIOAL과 샘플의 유량은, 샘플이 리본형 스트림으로 형성되도록 조정될 수 있다. 이러한 스트림은 대략적으로, 리본형 샘플 스트림 내에 봉입되는 입자들만큼 박형이거나 또는 심지어 이들보다 더 박형일 수 있다. 백혈구는, 예를 들어 직경이 약 10 μm일 수 있다. 두께가 10 μm 미만인 리본형 샘플 스트림을 제공함으로써, 리본형 샘플 스트림이 시스 유체 또는 PIOAL에 의해 연신될 때 세포들이 배향될 수 있다. 의외로 리본형 샘플 스트림과 상이한 점도의, 예컨대 더 높은 점도의 PIOAL 층들 내의 협소화 유로를 따라 리본형 샘플 스트림을 연신하는 것은, 유리하게는 유동 방향과 사실상 평행한 평면 내에 비구형 입자들을 정렬시키고 세포들 상에 힘을 인가하여 세포들의 세포내 구조의 인-포커스 내용물을 개선하는 경향이 있다. 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 광학 축은 리본형 샘플 스트림의 평면에 사실상 수직(직각)이다. 이미징 지점에서의 리본형 샘플 스트림의 선속도는, 예를 들어 20 내지 200 mm/sec일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 리본형 샘플 스트림의 선속도는, 예를 들어 50 내지 150 mm/sec일 수 있다.
리본형 샘플 스트림 두께는 샘플 유체 및 PIOAL의 상대 점도 및 유량에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 정밀 변위 펌프를 포함하는 샘플의 공급원(25) 및/또는 PIOAL의 공급원(27)은 리본형 샘플 스트림(32)의 치수를 최적화하기에 제어가능한 유량으로, 즉 적어도 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)의 시야만큼 넓은 박형 리본으로서 샘플 및/또는 PIOAL을 제공하도록 구성될 수 있다.
일 실시 형태에서, PIOAL 공급원(27)은 사전결정된 점도의 PIOAL을 제공하도록 구성된다. 그러한 점도는 샘플의 점도와 상이할 수 있으며, 샘플의 점도보다 더 높을 수 있다. PIOAL의 점도 및 밀도, 샘플 재료의 점도, PIOAL의 유량 및 샘플 재료의 유량을 조정하여, 오토포커스 패턴으로부터의 변위 거리에서, 그리고 사전결정된 치수 특성으로, 예컨대 유리한 리본형 샘플 스트림 두께로 리본형 샘플 스트림을 유지한다.
실용적인 실시 형태에서, PIOAL은 샘플보다 더 높은 선속도 및 샘플보다 더 높은 점도를 가지며, 그럼으로써 샘플을 편평한 리본으로 연신시킨다. PIOAL의 점도는 최대 10 센티푸아즈일 수 있다.
도 14에 도시된 실시 형태에서는, 광센서 어레이로부터 얻어진 픽셀 디지털 이미지를 분석하는 데 사용되는 동일한 디지털 프로세서(18)가 또한 오토포커싱 모터(54)를 제어하는 데 사용된다. 그러나, 광학 고분해능 이미징 디바이스(24)는 캡처링되는 이미지마다 오토포커싱되지는 않는다. 오토포커스 과정은 주기적으로, 또는 예를 들어 온도 또는 다른 과정 변화가 적절한 센서에 의해 검출될 때, 또는 이미지 분석이 재포커싱에 대한 잠재적 필요성을 검출할 때 수행될 수 있다. 또한, 다른 실시 형태에서는, 혈액 이미지 분석이 하나의 프로세서에 의해 수행되게 하는 것 그리고 선택적으로 자신의 광센서 어레이와 관련된 별개의 프로세서가 고정된 표적(44)에 대한 오토포커싱하는 단계들을 취급하도록 배열되게 하는 것이 가능하다.
도 14에서, 적어도 하나의 상기 디지털 프로세서(18)는 프로그래밍된 시간에 또는 프로그래밍된 조건에서 또는 사용자 요구시에 오토포커싱하도록 구성되고, 또한 입자들의 이미지-기반 범주화 및 하위범주화를 수행하도록 구성된다. 예시적인 입자들에는 세포, 백혈구, 적혈구 등이 포함된다.
일 실시 형태에서, 적어도 하나의 상기 디지털 프로세서(18)는 오토포커스 재개시 신호를 검출하도록 구성된다. 오토포커스 재개시 신호는 검출된 온도 변화, 픽셀 이미지 데이터의 파라미터들에 의해 인식된 바와 같은 포커스 품질의 감소, 시간 경과, 또는 사용자 입력에 의해 촉발될 수 있다. 유리하게, 재교정하기 위해 변위 거리(52)를 측정한다는 의미에서 재교정하는 것이 필요하지 않다. 선택적으로, 오토포커스는 품질 제어를 위한 실시들 사이의 소정의 빈도수/간격으로 재교정되도록 그리고/또는 포커스를 유지하도록 프로그래밍될 수 있다.
변위 거리(52)는 플로우셀마다 약간 변하지만, 주어진 플로우셀에 대해서는 일정하게 유지된다. 플로우셀과 함께 이미지 분석기를 구비할 때 셋업 과정으로서, 변위 거리를 먼저 평가하고, 이어서 오토포커스 및 이미징 양상들이 발휘되는 교정 단계 동안에, 플로우셀에 대한 정확한 변위 거리가 결정되고 프로세서(18)의 프로그래밍 내로 상수로 입력된다.
도 15를 참고하면, 입자들을 함유하는 샘플(12)을 분석하기 위한 예시적인 장치(10)는, 일부 실시 형태에 따라, 적어도 하나의 검출 범위를 갖는 입자 카운터(15), 분석기(17), 및 프로세서(18)를 포함한다. 도 15의 블록 다이어그램은 예시 목적을 위한 것이다. 입자 카운터(15), 분석기(17), 및 프로세서(18)는 서로 연결될 수 있거나 연결되지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프로세서는 분석기 및/또는 입자 카운터에 커플링될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 프로세서는 분석기 및/또는 입자 카운터의 구성요소일 수 있다.
입자 카운터(15)는 적어도 하나의 채널을 포함하고, 입자들의 적어도 하나의 범주 및/또는 하위범주에 대한 입자 카운트를 제공하도록 구성된다. 일부 실시 형태에서는, 입자 카운터(15)가 입자들의 상이한 범주들 및/또는 하위범주들을 위한 적어도 2개의 채널을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 입자들은 샘플의 전기 임피던스 또는 광 산란을 감지함을 통해 카운팅된다. 적합한 입자 카운터(15)의 일 예에는 유세포분석기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상이한 물리적 특성들에 응답하는 복수의 채널들 각각에서 동시에 또는 순차적으로 검출이 일어날 수 있다.
분석기(17)는 입자들의 상이한 범주들 및/또는 하위범주들 및 그들의 각각의 범주 및/또는 하위범주의 상응하는 구성원들을 감별하도록 구성된다. 적합한 분석기(17)의 예에는 시각적 분석기, 디지털 카메라, 또는 픽셀 데이터를 캡처링할 수 있으며, 픽셀 파일에서 나타나는 속성들을 구별하도록 프로그래밍되는 임의의 다른 픽셀 데이터 분석기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 프로세서(18) 및 분석기(17)는, 알고리즘, 예컨대 입자들의 2개의 범주 또는 2개의 상응하는 하위범주의 카운트들의 비례적인 비를 결정하는 알고리즘을 적용하도록, 그리고 그러한 비례적인 비를 입자 카운터(15)의 적어도 하나의 채널에서 얻어진 입자들의 적어도 하나의 범주 및/또는 하위범주의 입자 카운트에 적용하도록 구성된다. 데이터 분석 후, 프로세서(18)는, 출력(20)에서, 샘플(12) 중의 입자들의 각각의 범주 및 각각의 상응하는 하위범주의 농도의 정확한 측정을 제공한다.
일부 실시 형태에서는, 샘플(12) 중에, 적어도 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 밖의 농도로 존재할 수 있으며, 반면 적어도 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 내의 농도로 존재한다. 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 농도가 입자 카운터(15) 상에서 결정된다. 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주 대 제2 범주 및/또는 하위범주의 비례적인 비가 분석기(17) 상에서 결정된다. 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 농도에 그러한 비례적인 비를 적어도 부분적으로 적용시킴으로써, 프로세서(18) 상에서, 제1 범주 및/또는 하위범주 내의 입자들의 농도가 계산된다.
일부 실시 형태에서, 입자 카운터(15)의 적어도 하나의 채널 내에서 검출되는 입자들의 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 적어도 2개의 부류를 포함할 수 있다. 그리고 입자들의 각각의 부류는 복수의 하위부류들을 포함할 수 있다. 입자 카운터(15)는, 예를 들어 사전결정된 크기 범위에 기초하여, 하나 이상의 선택 기준을 충족시키는 복수의 입자들을 검출하도록, 그리고 그들의 입자 카운트를 제공하도록 구성된다. 선택 기준은 입자들의 적어도 2개의 부류의 구성원들을 포함한다. 분석기(17) 및 프로세서(18)는 입자들의 적어도 2개의 범주 및/또는 하위범주의 구성원들을 구분하도록 프로그래밍된다. 적어도 2개의 범주 및/또는 하위범주에 걸친 각각의 구성원의 분포가 프로세서(18) 상에서 결정된다. 프로세서(18)는 그러한 분포를 사용하여, 입자 카운터(15) 상에서 얻어진 적어도 2개의 범주 및/또는 하위범주 중 적어도 하나의 구성원들에 대한 입자 카운트를 정정한다.
보다 구체적으로는, 장치(10)는 RBC, WBC, PLT, 및 다른 혈구를 포함한 상이한 혈구들, 태아 세포, 또는 세균성 세포, 바이러스성 입자, 기생충, 기생충 낭포를 포함한 낭포, 결정(crystal), 또는 이들의 단편 또는 샘플 중의 다른 세포 단편을 식별 및 정량화하는 데 사용될 수 있다.
도 15a는 본 발명의 실시 형태들에 따른 예시적인 카운터 또는 카운팅 모듈(1500a)의 태양들을 도시한다. 그러한 카운터는 WBC, RBC 및 PLT 세포 카운팅 및 헤모글로빈 측정을 위한 다양한 기계적 기능뿐만 아니라 전자적 및 광도 측정 기능도 제어 또는 수행하도록 작동될 수 있다. 예시적인 카운터는 CBC 분석을 위한 샘플을 준비하는 데, 그리고 개구 배스 조립체(aperture bath assembly)(예를 들어, WBC 배스(1510a) 및 RBC 배스(1520a))를 통해 CBC 파라미터 측정치를 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 도 15의 카운터(15)는 도 15a의 카운터(1500a)로 나타낼 수 있다. 유사하게, 일부 실시 형태에 따르면, 도 14의 카운터(15)는 도 15a의 카운터(1500a)로 나타낼 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 도 16의 카운터(722)는 도 15a의 카운터(1500a)로 나타낼 수 있다.
혈액의 세포 요소들(예를 들어, 적혈구, 백혈구, 및 혈소판)이 전기 임피던스 방법을 사용하여 카운팅될 수 있다. 예를 들어, 흡인된 전혈 샘플이 2개의 분취물로 나뉠 수 있고 등장성 희석제와 혼합될 수 있다. 제1 희석물은 RBC 개구 배스(1520a)에 전달될 수 있고, 제2 희석물은 WBC 개구 배스(1510a)에 전달될 수 있다. RBC 챔버에서는, RBC 및 혈소판 둘 모두는 세포들이 감지 개구를 통과함에 따라 전기 임피던스에 의해 카운팅 및 구별될 수 있다. 예를 들어, 2 내지 20 fL의 입자들은 혈소판으로 카운팅될 수 있고, 36 fL 초과의 입자들은 RBC로 카운팅될 수 있다. WBC 챔버 처리의 경우, RBC-용해 시약이 WBC 희석 분취물에 첨가되어 RBC를 용해시키고 헤모글로빈을 유리시킬 수 있으며, 이어서 WBC가 WBC 배스의 감지 개구들에서 임피던스에 의해 카운팅될 수 있다. 일부 경우에, 배스들은 다수의 개구들을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 혈구 계수 기술에 사용되는 혈구 카운트가 RBC 삼중 개구 배스를 사용하여 얻어질 수 있다.
예시적인 CBC 샘플 준비 기술은 2개의 과정, 즉 샘플 획득 및 샘플 전달을 포함할 수 있다. 샘플 획득은, 165 uL의 환자 샘플이 흡인되고 혈액 샘플링 밸브(Blood Sampling Valve, BSV)에 보내질 때 일어날 수 있다. BSV는 2개의 삼중-개구 배스에 전달하기 위해 처리 시약들과 함께 특정 부피의 환자 샘플을 보내도록 작동할 수 있다. 환자 샘플 및 처리 시약들은, 둥글게 설계되어, 샘플 및 시약들이 기포를 혼합시키지 않고서 완전히 혼합될 수 있게 하는 경사진 개구 배스들의 하부로 전달될 수 있다. 이어서, 샘플은 측정 및 분석을 위해 준비될 수 있다. 일부 실시 형태들에 따르면, WBC 배스에서는, 6.0 mL(±1.0%)의 희석제와 28 uL의 샘플이, 1:251의 최종 희석률을 위해, 1.08 mL(±1.0%)의 DxH 세포 용해제와 배합될 수 있다. 일부 실시 형태들에 따르면, RBC 배스에서는, 10 mL(±1.0%)의 희석제와 1.6 uL의 샘플이 1:6250의 최종 희석률을 위해 배합될 수 있다. 환자 샘플 및 시약들이 혼합된 후, 진공 및 개구 전류가 세포 카운트 및 세포 부피의 측정을 위해 개구들에 인가될 수 있다. RBC 및 PLT 카운트는 또한 개구 부근에서의 세포들의 재순환을 방지하기 위해 스위프 유동(sweep flow)의 적용을 포함할 수 있다. 소정 실시 형태에서, RBC 및 PLT에 대한 데이터 획득은 최대 20초일 수 있고, WBC의 경우 최대 10초일 수 있다. 소정 실시 형태에서, 개구 조립체들에 의해 생성되는 모든 아날로그 펄스들은 전치 증폭 카드(preamp card)에 의해 증폭되고, 이어서 아날로그-디지털 변환 및 파라미터 추출을 위한 CBC 신호 컨디셔너 분석기 카드에 보내질 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 각각의 세포 사건(cellular event)에 대한 다수의 파라미터들을 측정하기 위해 시스템이 사용될 수 있고, 시간, 부피(진폭 및 펄스 폭을 포함한 펄스 속성들), 카운트 및 카운트율(count rate), 및 대기 시간과 같은 디지털 측정치를 제공하기 위해 디지털 파라미터 추출 과정이 사용될 수 있다. 그러한 측정치는 펄스 편집, 동시 정정, 카운트 보팅(count voting), WBC, RBC 및 PLT에 대한 히스토그램의 생성, 히스토그램 보팅, 패턴 분석, 및 간섭 정정 등에 사용될 수 있다.
도 16은 본 발명의 실시 형태들에 따른, 혈액 유체 샘플 중의 제1 세포 유형의 양을 측정하기 위한 시스템 및 방법의 태양들을 도시하는데, 여기서 샘플은 또한 제2 세포 유형을 포함한다. 여기서 보여주는 바와 같이, 방법(700)은 혈액 유체 샘플(710)로부터 샘플의 제1 부피(720) 및 샘플의 제2 부피(730)를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 단계(724)에서 나타낸 바와 같이, 방법은 혈액학 세포 카운터(722)를 통해 샘플의 제1 부피(720)를 유동시킴으로써 제1 부피 내의 제2 세포 유형의 집단을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 종종, 세포 카운터(722)는, 샘플 중에 충분한 양의 전기적으로 구분가능한 세포 유형이 있을 때 세포들을 정확하게 카운팅하기에 적합하며, 세포 유형의 양이 소정 한계 또는 역치를 초과할 때는 그렇지 않다. 세포 카운터는 단시간 내에 혈액 샘플 중의 적혈구를 카운팅하거나 또는 다른 성분들(예를 들어, 대형 성분들)의 총 개수를 카운팅하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 세포 카운터는 혈액 중의 백혈구와 다른 성분들(예를 들어, 대형 성분들) 사이를 구별할 때, 또는 몇몇 상이한 종들이 있을 수 있지만, 각각이 비교적 적은 수를 가질 때 어려움에 접할 수 있다.
또한, 방법(700)은, 샘플의 제2 부피(730)를 플로우셀 내에서 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 두께 및 두께보다 더 큰 폭을 갖는 샘플 스트림을 제공하도록 함으로써, 단계(732)에 의해 나타낸 바와 같이, 제1 개수의 제1 유형 세포들 및 제2 개수의 제2 세포 유형들의 이미지들을 획득하는 단계를 포함할 수 있으며, 획득된 이미지들은 샘플 스트림의 두께를 가로지르는 이미지 경로를 따라 획득된다. 일부 경우에, 이미지 획득(732)은 도 14 및/또는 도 15에 도시된 바와 같은 분석기(17)를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우에, 분석기는 혈액 유체 샘플 중의 백혈구, 거대 혈소판, 및 다른 대형 성분들 사이를 효율적으로 구별할 수 있다. 그러나, 그러한 분석기를 사용하여 샘플 중의 완전 입자 카운트를 얻는 데에는 어려움이 있을 수 있다. 또한, 일부 경우에, 소정 카운트(예를 들어, 모든 적혈구의 카운트)를 얻기 위해 이러한 분석기를 사용하는 것이 바람직하지 않을 수 있는데, 그 이유는 그러한 카운팅 절차가 또한, 카운트를 얻는 것에 더하여, 마찬가지로 입자들의 특성화를 수행하는 것을 포함할 수 있기 때문이다. 일부 실시 형태에 따르면, 분석기는 분석기를 통해 처리되는 샘플의 단지 일정 백분율 또는 일부분에 대한 이미지들을 얻기 위해 사용된다.
도 16에 도시된 바와 같이, 방법(700)은, 단계(738)에 나타낸 바와 같이, 획득된 이미지들을 사용하여 제1 세포 유형의 제1 개수(734) 대 제2 세포 유형의 제2 개수(736)의 비를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 또한, 단계(740)에 나타낸 바와 같이, 비(738) 및 제2 세포 유형의 집단(724)을 사용하여 샘플 중의 제1 세포 유형의 세포량 측정기준치를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, 단계(740)에서 계산된 세포량 측정기준치는 혈액 유체 샘플(710) 중의 제1 세포 유형에 대한 세포 농도이다. 일부 경우에, 단계(740)에서 계산된 세포량 측정기준치는 혈액 유체 샘플(710) 중의 제1 세포 유형에 대한 세포 카운트이다. 일부 경우에, 세포 카운터(722)는 제1 세포 유형의 카운팅과 관련된 제1 정확도 및 제2 세포 유형의 카운팅과 관련된 제2 정확도를 가지며, 여기서 제2 정확도는 제1 정확도보다 더 우수하거나 또는 더 높다. 일부 경우에, (예를 들어, 도 19a 및 도 19b를 참조하면) 혈액학 세포 카운터(722)는 원하는 정확도 범위를 가지며, 원하는 정확도 범위는 제1 부피(720) 내의 세포들의 최소 집단과 제1 부피(720) 내의 세포들의 최대 집단 사이에서 확대되며, 여기서 단계(724)에서 결정된 부피 내의 제2 세포 유형의 집단은 원하는 정확도 범위 내에 있고, 단계(740)에서 계산된 샘플의 제1 세포 유형의 세포량 측정기준치는 원하는 정확도 범위 밖에 있다.
도 16에 추가로 도시된 바와 같이, (그리고 도 19a 및 도 19b를 계속 참고하면), 방법은 혈액학 세포 카운터(722)를 통해 샘플의 제1 부피를 유동시킨 결과로서 제1 부피 내의 제1 세포 유형의 집단을 결정하는 단계(726)를 선택적으로 포함할 수 있다. 제1 부피 내의 결정된 제1 세포 유형 집단(726)은 제1 세포 유형에 대해 원하는 정확도 범위를 초과하거나 그 미만일 수 있으며, 또한 단계(740)에서 계산된 바와 같은 제1 세포 유형의 세포량 측정치와 상이할 수 있다. 일부 경우에, (예를 들어, 도 19a에서), 결정된 제1 세포 유형 집단(726)은 0이다. 일부 경우에, (예를 들어, 도 19b에서), 결정된 제1 세포 유형 집단(726)은 0 초과이다.
본 발명의 일부 실시 형태에 따르면, 혈액학 세포 카운터(722)는 세포 카운터를 통해 유동하는 제2 유형 세포에 응답하여 전기 임피던스의 변화를 검출하는 센서 메커니즘을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 혈액학 세포 카운터(722)는 세포 카운터를 통해 유동하는 제2 유형 세포에 응답하여 광로의 차단을 검출하는 센서 메커니즘을 포함한다.
일부 경우에, 혈액학 세포 카운터(722)는, 제1 세포 유형에 대해 최소 검출가능 농도 한계 및 최대 검출가능 농도 한계를 갖고, 제2 세포 유형에 대해 최소 검출가능 농도 한계 및 최대 검출가능 농도 한계를 갖는다. 결정된 제2 세포 유형 집단(724)은 제2 세포 유형에 대해 검출된 농도 파라미터에 기초할 수 있는데, 이러한 농도 파라미터는 제2 세포 유형에 대해 최소 한계 초과이고 최대 한계 미만이다. 제1 세포 유형은 제1 세포 유형에 대해 최소 한계 미만이거나 최대 한계 초과인 농도로 존재할 수 있다.
일부 경우에, 혈액학 세포 카운터(722)는, 제1 세포 유형에 대해 최소 검출가능 부피 한계 및 최대 검출가능 부피 한계를 갖고, 제2 세포 유형에 대해 최소 검출가능 부피 한계 및 최대 검출가능 부피 한계를 갖는다. 결정된 제2 세포 유형 집단(724)은 제2 세포 유형에 대해 검출된 부피 파라미터에 기초할 수 있는데, 이러한 부피 파라미터는 제2 세포 유형에 대해 최소 한계 초과이고 최대 한계 미만이다. 제1 세포 유형은 제1 세포 유형에 대해 최소 한계 미만이거나 최대 한계 초과인 부피 파라미터로 존재할 수 있다.
일부 경우에, 혈액학 세포 카운터(722)는, 제1 세포 유형에 대해 최소 검출가능 크기 한계 및 최대 검출가능 크기 한계를 갖고, 제2 세포 유형에 대해 최소 검출가능 크기 한계 및 최대 검출가능 부피 크기를 갖는다. 결정된 제2 세포 유형 집단(724)은 제2 세포 유형에 대해 검출된 크기 파라미터에 기초할 수 있으며, 이러한 크기 파라미터는 제2 세포 유형에 대해 최소 한계 초과이고 최대 한계 미만이다. 제1 세포 유형은 제1 세포 유형에 대해 최소 한계 미만이거나 최대 한계 초과인 크기 파라미터로 존재할 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에 따르면, (도 13b, 도 13c를 참고하면), 샘플의 제1 부피 내의 제2 세포 유형의 집단의 결정(724)은 제1 세포 유형의 세포들과 제2 세포 유형의 세포들을 함께 그룹화하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 또한, 비 및 제2 세포 유형의 집단을 사용하여 샘플 중의 제2 세포 유형의 세포량 측정기준치를 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에(예를 들어, 도 19d에 도시된 바와 같이), 샘플의 제1 부피 내의 제2 세포 유형의 집단의 결정(724)은 제1 세포 유형의 세포들과 제2 세포 유형의 세포들을 함께 그룹화하는 단계, 및 혈액학 세포 카운터(722)를 통해 샘플의 제1 부피를 유동시킨 결과로서 제1 부피 내의 제1 세포 유형의 집단을 결정하는 단계(726)를 포함한다. 단계(740)에서 계산되는 바와 같은 샘플 중의 제1 세포 유형의 세포량 측정기준치는 비(738), 제2 세포 유형의 집단(724), 및 제1 세포 유형의 집단(726)을 사용할 수 있다.
다른 태양들에서, 예를 들어 도 17 및/또는 도 19a 및 도 19b에 도시된 바와 같이, 입자들을 함유하는 샘플을 분석하기 위한 방법이 제공된다. 그러한 방법에서는, 도 17의 방법(70)에서의 단계(72)에서 나타낸 바와 같이, 검출 한계들을 갖는 입자 카운터 상에 샘플이 제공된다. 적어도 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 밖의 농도로 샘플 중에 존재할 수 있으며, 적어도 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주가 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 내에서 샘플 중에 존재한다. 단계(74)에서 나타낸 바와 같이, 입자 카운터 상에서, 샘플 중의 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 농도가 결정된다. 단계(76)에서 나타낸 바와 같이, 샘플을 또한 분석기 상에 제공하여, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주 대 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 비례적인 비를 결정한다. 이어서, 단계(78)에서 나타낸 바와 같이, 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 농도에 그러한 비례적인 비를 적어도 부분적으로 적용시킴으로써, 제1 범주 및/또는 하위범주 내의 입자들의 농도가 계산될 수 있다. 도 19a는 검출 범위 미만으로 샘플 중에 존재하는 입자들의 검출을 보여주고, 도 19b는 검출 범위를 초과하여 샘플 중에 존재하는 입자들의 검출을 보여준다.
따라서, 도 17은, 일부 실시 형태에 따라, 입자들의 제1 범주의 농도를 결정하는 예시적인 방법(70)을 예시하는데, 이때 입자들의 제1 범주는 입자 카운터 상에서의 검출 범위 밖의 농도로 샘플 중에 존재한다. 단계(72)에서는, 도 15 및 도 17을 또한 참고하면, 샘플(12)이 입자 카운터(15) 상에 제공되며, 이때 입자 카운터는 적어도 하나의 검출 범위를 갖는다. 샘플(12)은 입자들을 포함하는데, 이때 이들 입자는 유체 중에 분산될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자들의 제1 범주는 입자들의 제1 범주에 적용가능한 검출 범위의 상한을 초과하는 농도로 샘플 중에 존재한다. 입자들의 제2 범주는 입자들의 제2 범주에 적용가능한 검출 범위 내에서 샘플 중에 존재한다. 예를 들어, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주는 WBC를 포함할 수 있다. 입자들의 제2 범주는 혈소판을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자들의 제1 범주는 입자들의 제1 범주에 적용가능한 검출가능한 범위의 하한 미만의 농도로 샘플 중에 존재한다. 입자들의 제2 범주는 입자들의 제2 범주에 적용가능한 검출 범위 내에서 샘플 중에 존재한다. 예를 들어, 입자들의 제1 범주는 혈소판을 포함한다. 입자들의 제2 범주는 백혈구를 포함한다.
도 17의 단계(74)에서는, 샘플(12) 중의 입자들의 제2 범주의 농도가 입자 카운터(15) 상에서 결정된다. 입자 카운터는 적어도 하나의 채널을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자들의 제2 범주가 채널들 중 하나에서 측정된다. 일부 실시 형태에서, 입자 카운터는 적어도 2개의 채널을 포함할 수 있다. 입자들의 제1 범주는, 그 농도가 입자들의 제1 범주에 적용가능한 검출 범위 내에 있다면, 다른 채널 내에서 카운팅될 수 있다.
도 17의 단계(76)에서는, 샘플(12)을 (예를 들어, 도 14 또는 도 15에 도시된 바와 같은) 시각적 분석기(17)와 같은 분석기 상에 제공하여, 입자들의 제1 범주 대 입자들의 제2 범주의 비례적인 비를 결정한다. 일부 실시 형태에서, 시각적 분석기(17)는 전술된 바와 같이 이미징 디바이스에 연결된 플로우셀(22)을 포함한다. 입자들의 제1 범주 대 입자들의 제2 범주의 비례적인 비는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 희석제, 투과화제, 및 조영제 중 적어도 하나를 포함한 적어도 하나의 화학물질이 샘플에 도입될 수 있다. 혈액 유체 샘플을 처리하는 데 사용될 수 있는 예시적인 화학물질, 조성물, 조영제, 및 관련 조성물이 공계류 중인 미국 특허 출원 제____호에 논의되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 조영제는 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주 및 제2 범주 및/또는 하위범주를 감별하는 시각적 구분을 생성하는 데 효과적일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 도 14에 도시된 준비된 샘플(12B)은 적어도 하나의 플로우셀(22)에 적용될 수 있다. 준비된 샘플(12B)의 입자들의 이미지들이 캡처링된다. 시각적 분석기(17)일 수 있는 분석기 및/또는 프로세서(18)에 의해 이미지 분석이 수행된다. 이어서, 리본형 샘플 스트림의 복수의 이미지들을 분석함으로써 입자들의 제1 범주 대 입자들의 제2 범주의 비례적인 비가 결정된다.
이어서, 도 17의 단계(78)에서는, 입자들의 제2 범주의 농도에 그러한 비례적인 비를 적어도 부분적으로 적용시킴으로써, (예를 들어, 도 15에 도시된 바와 같은) 프로세서(18)에 의해 제1 범주 내의 입자들의 농도가 계산될 수 있다.
본 발명은 또한 입자들을 함유하는 샘플을 분석하기 위한 방법을 제공한다. 도 18은, 일부 실시 형태에 따라, 입자들의 2개의 하위범주의 농도를 결정하는 예시적인 방법(80)을 예시하는데, 이러한 입자들은 입자 카운터에 의해 구분될 수 없는 것이다. 단계(82)에서는, 샘플(예를 들어, 도 15의 샘플(12))이 입자 카운터(예를 들어, 도 15의 입자 카운터(15)) 상에 제공되며, 입자 카운터는, 구분되도록 요구되는 입자들의 적어도 2개의 범주 또는 하위범주에 의해 충족되는 검출 기준을 갖는다. 입자 카운터로부터의 결과는, 도 18의 단계(84)에서, 단일 카운트 내에 이들 범주 또는 하위범주를 포함한다.
단계(86)에서는, 샘플을 분석기(예컨대, 시각적 분석기) 상에 제공하여, 입자들의 제1 범주 또는 하위범주 대 입자들의 제2 범주 또는 하위범주의 비례적인 비를 결정한다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어 도 14 및/또는 도 15에 도시된 바와 같이, 시각적 분석기(17)는 이미징 디바이스에 연결된 플로우셀(22)을 포함한다.
입자들의 제1 범주 또는 하위범주 대 입자들의 제2 범주 또는 하위범주의 비례적인 비는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 결정될 수 있다. 희석제, 투과화제, 및 조영제 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 화학물질이 샘플에 도입된다. 조영제는 입자들의 제2 범주 또는 하위범주로부터 제1 범주 또는 하위범주를 감별하는 입자 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 일부 실시 형태에서, 도 14에 도시된 바와 같이, 준비된 샘플(12B)은 적어도 하나의 플로우셀(22)에 적용될 수 있다. 준비된 샘플(12B)의 입자들의 이미지들이 캡처링된다. 시각적 분석기 및/또는 프로세서(18)에 의해 이미지 분석이 수행된다. 이어서, 복수의 이미지들을 분석함으로써, 적어도 입자들의 제1 하위범주 대 입자들의 제2 하위범주의 비례적인 비가 결정된다.
이어서, 도 18의 단계(88)에서는, 입자 카운터로부터 얻어진 단일 카운트(예를 들어, 도 18의 단계(84))에 그러한 비례적인 비를 적어도 부분적으로 적용시킴으로써, 도 14 또는 도 15에 도시된 바와 같은 프로세서(18)에 의해, 제1 범주 또는 하위범주 내의 입자들의 농도가 계산될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주는 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위의 상한을 초과하는 농도로 샘플 중에 존재한다. 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주는 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 내에서 샘플 중에 존재한다. 예를 들어, 입자들의 제1 범주는 백혈구를 포함한다. 입자들의 제2 범주는 혈소판을 포함한다. 도 19b에 예시된 바와 같이, 본 발명의 분석기로부터의 입자 카운트는, 입자 카운터에 의해 사용되는 적어도 하나의 검출 범위, 예컨대 입자 농도, 부피 및/또는 크기와 관련된 부정확한 입자 카운트들을 정정하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 작동시킴으로써, 검출 범위의 상한을 초과하는 양으로 존재하는 입자들이 정확하게 검출 및 측정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주는, 도 19a에 예시된 바와 같이, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한, 일부 파라미터, 예를 들어 농도의 검출가능한 범위의 하한 미만으로 샘플 중에 존재한다. 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주는 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 내에서 샘플 중에 존재한다. 도 19a에 예시된 바와 같이, 본 발명의 분석기로부터의 2개의 범주 및/또는 하위범주 내의 입자 카운트들의 비례적인 비는 적어도 하나의 범주 및/또는 하위범주에 대한 입자 카운터로부터의 부정확한 카운트들을 정정하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 작동시킴으로써, 입자 카운터에 의해서는 검출되지 않는, 검출 범위 한계 미만으로 존재하는 입자들이 정확하게 측정될 수 있다.
도 19a에 도시된 바와 같이, 입자 카운터는 범주 2에 대한 입자 카운트를 제공한다. 분석기는 범주 1과 범주 2에 대한 입자 카운트들의 비례적인 비를 제공한다. 비례적인 비를 범주 2에 대한 입자 카운트에 곱함으로써, 이 과정은 범주 1에 대한 입자 카운트에 이른다. 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주는, 예를 들어 혈소판을 포함할 수 있다. 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주는 백혈구를 포함한다. 일부 실시 형태에 따르면, 본 명세서에 개시된 동적 또는 검출 범위 확대 시스템 및 방법은, 샘플 중에 함유된 혈소판의 개수가 낮은 경우에, 정확한 혈소판 카운트를 얻는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 분석기는, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주 대 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 비례적인 비를 결정하기 위해, 이미징 디바이스 및 이미징 디바이스에 연결된 플로우셀을 포함한다. 희석제, 투과화제, 조영제 중 적어도 하나가 샘플에 도입된다. 적어도 하나의 화학물질은 입자들의 제1 및 제2 범주 및/또는 하위범주를 감별하는 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 그러한 비례적인 비를 결정하는 단계에서, 샘플은 일부 실시 형태에서 존재하는 적어도 하나의 플로우셀에 적용된다. 샘플의 입자들의 복수의 이미지들을 캡처링하여 카운트 또는 비례적인 비의 통계학적으로 유의한 평가를 제공한다. 이어서, 입자들의 제1 및 제2 범주 및/또는 하위범주 각각의 내의 입자들을 카운팅함으로써, 입자들의 적어도 제1 범주 및/또는 하위범주 대 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 비례적인 비를 결정한다.
다른 태양에서, 도 18 및/또는 도 19d에 도시된 바와 같이, 입자 카운터 상에서 얻어진 입자 카운트를 정정하기 위해, 입자들을 함유하는 샘플을 분석하기 위한 방법(80)이 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 분석기로부터의 결과, 예를 들어 상대적 카운트는, 입자 카운터 단독에 의해 사용되는 검출 기준 또는 기준들에 의해 감별될 수 없는 입자들의 범주들 및/또는 하위범주들의 정확한 입자 카운트들을 얻는 데 사용될 수 있다.
도 19c에 도시된 다른 실시 형태에서, 카운터는 복수의 입자들에 대해 사실상 정확한 카운트를 제공할 수 있다. 복수의 입자들은 적어도 2개의 하위범주의 구성원들을 포함하지만, 카운트는 하위범주들 사이를 구분하지 않는다. 적어도 2개의 하위범주의 각각의 구성원의 분포가 분석기 상에서 결정될 수 있다. 하위범주들의 분포는 총 카운트에 대한 각각의 하위범주들의 카운트들의 비례적인 비이다. 적어도 2개의 하위범주의 구성원들을 구분하도록 프로세서를 프로그래밍한다. 이어서, 예를 들어 도 19c에 도시된 바와 같이, 분석기로부터의 분포 및 입자 카운터로부터의 총 입자 카운트를 사용함으로써, 각각의 구성원의 분포를 사용함으로써 프로세서에 의해 적어도 2개의 하위범주 중 적어도 하나의 구성원들에 대한 입자 카운트를 결정할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 도 19d에 도시된 바와 같이, 샘플은 존재하는 입자들의 2개의 범주를 가질 수 있다. 이와 관련하여, 범주들은 다수의 범주들 및/또는 다수의 하위범주들의 가능성을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 작동시킴으로써, 입자들의 카운트에 대한 정정이 이루어질 수 있는데, 이러한 카운트에는 입자들의 적어도 하나의 추가 범주로부터의 적어도 일부 구성원들이, 입자 카운터에 의해, 입자들의 제1 범주의 구성원들로서 올바르지 않게 범주화 또는 하위범주화되어 있다. 그러한 방법에서, 복수의 입자들에 대한 카운트는 사전결정된 범위, 예를 들어 크기 및/또는 부피 범위를 사용하여, 입자 카운터 상에서 이들의 입자 카운트들을 제공함으로써 결정될 수 있다. 사전결정된 범위는 입자들의 제1 범주의 구성원들과 적어도 입자들의 제2 범주의 적어도 일부 구성원들을 입자 카운트 내에 함께 그룹화시킨다. 장치의 하나의 채널에서 입자의 다른 범주로서 올바르지 않게 카운팅되는 하나 이상의 범주 또는 하위범주 내의 그러한 입자들은, 샘플 중의 입자들의 제1 범주 및 적어도 입자들의 제2 범주에 걸친 입자들의 분포를 구분하도록 구성된 분석기를 사용하여 별도로 그리고 정확하게 측정될 수 있다. 범주들 및/또는 하위범주들의 분포는 총 카운트에 대한 각각의 범주들 및/또는 하위범주들의 카운트들의 비례적인 비이다. 이어서, 프로세서는 그러한 분포를 사용하여 입자들의 제1 범주 및 적어도 제2 범주 및/또는 하위범주의 구성원들에 대한 입자 카운트를 계산한다. 이러한 실시 형태에서는, 도 19d에 예시된 바와 같이, 본 발명의 장치 및 방법과 각각의 범주 및/또는 하위범주 내의 입자들의 카운트가 정정될 수 있다.
도 19d에 도시된 바와 같이, 입자 카운터는 2개의 범주를 포함하는 사실상 정확한 총 카운트를 제공할 수 있다. 이 카운트는 범주 1 및 범주 2에 대해 추정된 카운트들을 포함할 수 있다. 그러나, 추정된 카운트는, 입자 카운터가 범주 2의 적어도 하나의 구성원을 범주 1과 함께 잘못 분류하였다는 점에서 부정확하다. 분석기는, 범주 1 및 범주 2에 대해, 입자 카운터에서 사용된 샘플보다 더 작은 샘플에 기초한 입자 카운트들의 분포를 제공하지만, 분석기는 정확한 분포를 생성한다. 프로세서는 이러한 정보를 사용하여, 두 범주 모두에 대해 정확한 카운트에 이른다. 이와 동일한 과정이 입자들의 2개 초과의 범주 및/또는 하위범주를 포함하는 샘플들에 대해 사용될 수 있다.
예를 들어, 유사한 크기 또는 형태를 갖는 상이한 입자 범주들 또는 하위범주들의 구성원들은 입자 카운터에 의해 정확하게 범주화 또는 하위범주화될 수 없다. 예를 들어, "거대" PLT, PLT 응집체, 응괴, 다수의 혈소판 및 유핵 RBC가 WBC로서 잘못 카운팅될 수 있으며, 그 결과 WBC 카운트가 샘플 중에 실제로 존재하는 것보다 더 높게 된다. 다른 예로서, 미소성 적혈구, 세포 단편, 인공물(artifact), 및 심지어 전자 노이즈가 혈소판으로서 잘못 카운팅될 수 있으며, 그 결과 PLT의 카운트가 부정확하게 높게 된다.
일부 실시 형태에서, 분석기는 이미징 디바이스 및 플로우셀을 포함하는 시각적 분석기이다. 일 예로서, 희석제, 투과화제, 조영제 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 화학물질이 샘플에 도입된다. 적어도 하나의 화학물질은 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주와 제2 범주 및/또는 하위범주를 감별하는 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 일부 실시 형태에서, 그러한 분포를 결정하는 단계에서, 샘플은 존재하는 적어도 하나의 플로우셀에 적용된다.
입자들의 적어도 2개의 범주 및/또는 하위범주의 각각의 구성원의 분포를 결정하는 단계에서는, 샘플의 적어도 일부분이 적어도 하나의 플로우셀 내로 적용된다. 적어도 하나의 화학물질은 입자들의 범주들 및/또는 하위범주들의 구성원들을 감별하는 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 샘플의 입자들의 복수의 이미징이 캡처링된다. 샘플의 입자들의 복수의 이미지들을 캡처링하여 카운트 또는 비례적인 비의 통계학적으로 유의한 평가를 제공한다. 이어서, 입자들의 제1 및 제2 범주 및/또는 하위범주 각각의 내의 입자들을 카운팅함으로써, 적어도 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주 대 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 비례적인 비를 결정한다.
입자들의 범주 및/또는 하위범주 내의 입자들의 2개 이상의 하위범주 각각의 구성원들의 비례적인 비, 및/또는 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주의 구성원들 대 입자들의 적어도 하나의 다른 범주 및/또는 하위범주의 구성원들의 비례적인 비가, 샘플의 입자들의 복수의 이미지들에 기초하여 결정될 수 있다. 이어서, 입자들의 각각의 범주 및/또는 하위범주에 대한 카운트 또는 농도 값이 계산, 추산, 추론 및/또는 도출될 수 있다. 일 예로서, 입자들의 하위범주들의 농도는 분석기로부터의 입자들의 각각의 하위범주의 비례적인 비, 및 입자 카운터로부터의 그 범주 내의 입자들의 총 개수의 카운트에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 적어도 2개의 하위범주의 구성원들은 백혈구, 혈소판, 및 적혈구의 하위범주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 입자들의 적어도 하나의 유형을 포함한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 방법은, 분석기 및/또는 프로세서로부터의 샘플의 입자들의 복수의 이미지들에 기초하여, 입자 카운터의 입자들의 하나의 범주에 적용가능한 검출 범위 밖의 농도로 존재하는 입자들의 하나의 범주 및/또는 하위범주 내의 입자들의 카운트 대 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 내에 있는 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주 내의 입자들의 카운트의 비례적인 비를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 이어서, 입자 카운터 상에서 얻어진 입자 카운트에 그러한 비례적인 비를 적용시킴으로써, 입자 카운터의 검출 범위 밖에 있는 입자들의 범주 및/또는 하위범주의 샘플 중의 농도가 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주는 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 검출 범위 한계의 상한을 초과하는 농도로 샘플 중에 존재한다. 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주는 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주에 적용가능한 (검출 범위의 상한 미만이고 하한을 초과하는) 입자 카운터의 검출 범위 내에서 샘플 중에 존재한다. 다른 예로서, 입자 카운터에 의해 사용되는 검출 기준 또는 기준들이, 제1 범주 및/또는 하위범주의 입자들을 적어도 제2 범주 및/또는 하위범주의 입자들과 함께 그룹화함으로써 입자들을 잘못 범주화하는 경우에, 제1 및 제2 범주 및/또는 하위범주에 대한 입자 카운트는 시각적 분석기 및/또는 프로세서로부터의 샘플의 입자들의 복수의 이미지들로부터 결정된 입자들의 비례적인 비로부터 정정될 수 있다.
측정의 검출 범위는 도 15에서의 입자 카운터(15)에 대해서만 제한될 수 있다. 예를 들어, WBC에 대한 검출 상한은 입자 카운터(15) 상에서 μL당 100,000 내지 200,000 미만일 수 있다. PLT에 대한 검출 하한은 μL당 10,000 초과일 수 있다. 본 명세서에 기재된 장치를 사용함으로써, 측정의 유효 검출 범위는 확대될 수 있는데, 예를 들어 WBC에 대한 검출 상한은, 일부 실시 형태에서, 최대 약 300,000, 350,000, 400,000, 410,000, 420,000, 430,000, 440,000, 450,000, 460,000, 470,000, 480,000, 490,000, 500,000, 510,000, 520,000, 530,000, 540,000, 550,000, 560,000, 570,000, 580,000, 590,000, 600,000, 610,000, 620,000, 630,000, 640,000, 650,000, 660,000, 670,000, 680,000, 690,000, 700,000, 710,000, 720,000, 730,000, 740,000, 750,000, 760,000, 770,000, 780,000, 790,000, 800,000, 810,000, 820,000, 830,000, 840,000, 850,000, 860,000, 870,000, 880,000, 890,000, 900,000, 910,000, 920,000, 930,000, 940,000, 950,000, 960,000, 970,000, 980,000, 990,000, 또는 1,000,000, 1,000,000, 1,010,000, 1,020,000, 1,030,000, 1,040,000, 1,050,000, 1,060,000, 1,070,000, 1,080,000, 1,090,000, 1,100,000, 1,110,000, 1,120,000, 1,130,000, 1,140,000, 1,150,000, 1,160,000, 1,170,000, 1,180,000, 또는 약 1,190,000 세포/μL, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로 확대될 수 있다. PLT에 대한 검출 하한은, 일부 실시 형태에서, 10,000, 9,500, 9,000, 8,500, 8,000, 7,500, 7,000, 6,500, 6,000, 5,500, 5,000, 4,500, 4,000, 3,500, 3,000, 2,500, 2,000, 1,500 또는 1,000, 또는 500, 400, 300, 200, 또는 100 세포/μL에 이르기까지 확대될 수 있다.
분석기는 바람직하게는, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주 대 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주의 비례적인 비를 결정하도록 작동가능한 시각적 분석기(17)를 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 전술된 바와 같은 비례적인 비는 시각적 분석기(17) 상에서 촬영된 샘플 중의 입자들의 복수의 이미지들을 분석함으로써 결정될 수 있다.
시각적 분석기(17)는 입자 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성하기 위해 희석제, 투과화제, 및/또는 조영제 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 화학물질을 샘플에 도입하도록 구성될 수 있다. 그러한 시각적 구분은 적어도 2개의 범주의 구성원들을 감별한다. 샘플의 입자들의 이미지들이 캡처링된다. 시각적 분석기(17) 및 프로세서(18)는, 샘플의 입자들의 이미지들 사이를 구별함으로써, 입자들의 각각의 범주 또는 하위범주의 비례적인 비를 결정하도록 구성된다. 이어서, 입자들의 각각의 범주 또는 하위범주의 농도가 계산된다. 예를 들어, WBC, 거대 PLT 및 NRBC의 정확한 결과가 결정될 수 있다. 입자 카운터 상에서는, 유사한 크기 또는 형태로 인해, 거대 PLT 및 NRBC가 WBC로서 카운팅된다. 기재된 바와 같은 장치를 작동시킴으로써, 거대 PLT 및 NRBC의 입자 카운트 또는 농도가 정확하게 기록될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 입자 카운터(15)의 검출 크기 범위 밖의 크기를 갖는 입자들을 포함할 수 있다. 시각적 분석기(17) 및 프로세서(18)는, 샘플의 입자들의 이미지들에 기초하여, 입자들을 검출하도록, 그리고 입자 카운터(15)의 검출 크기 범위 밖에 있는 입자들 대 검출 크기 범위 내에 있는 입자들의 비례적인 비를 결정하도록 구성된다. 이어서, 입자 카운터(15)의 검출 크기 범위 밖에 있는 입자들의 범주 및 하위범주의 농도가 계산될 수 있다.
일반적으로, 입자 카운터 상에서 얻어진 입자 카운트를 정정하기 위해, 입자들을 함유하는 샘플을 분석하기 위한 방법이 제공된다. 예를 들어 도 14 및 도 15에 도시된 바와 같은 입자 카운터(15) 상에서 입자들의 동일한 범주 및/또는 하위범주 내에 속하는 입자들의 상이한 범주들 - 상응하는 하위범주들을 포함함 - 을 감별하기 위한 예시적인 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 입자 카운터(15)에서 얻어진 입자 카운트들을 정정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어, 입자들의 제1 범주 및/또는 하위범주는 비정상 혈구, 미성숙 혈구, 응괴된 혈구, 또는 비정상 크기의 혈구의 하나 이상의 유형을 포함한다. 입자들의 제2 범주 및/또는 하위범주는 백혈구를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치를 작동시킴으로써, 하위범주들 내의 입자들은 분석기에 의해 구분될 수 있으며, 입자 카운터로부터 얻어진 입자들의 범주들 및/또는 하위범주들의 카운트들이 정정될 수 있다.
샘플 또는 그의 일부분을 입자 카운터(15) 상에 제공하여, 입자들의 적어도 2개의 범주의 하위범주들을 포함할 수 있는 하나 이상의 선택 기준들에 기초하여, 입자들을 검출하고 입자 카운트들을 제공한다. 예를 들어, 입자 카운터로부터 알려진 WBC 범주는 또한 소량의 거대 PLT 및 NRBC를 함유할 수 있다. 입자 카운터로부터의 그러한 범주는 입자 카운터에 의해 구분될 수 없는 백혈구의 하위범주들을 추가로 포함할 수 있다. 샘플의 다른 일부분을 또한, 하기에 기재된 바와 같이 시각적 분석기 상에서 분석하여, 이러한 잘못된 범주화를 해결하고/하거나 구분되지 않은 WBC 하위범주들을 하위범주화할 수 있다.
적어도 2개의 하위범주 또는 범주 각각의 분포가 도 14에 도시된 바와 같은 분석기(17) 상에서 결정될 수 있다. 그러한 분포는 상대적 카운트들의 수치적인 비, 비례적인 비 및/또는 다른 함수로 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 그러한 분포는 플로우셀(22) 및 이미징 디바이스(24)를 포함하는 시각적 분석기(17) 상에서 본 명세서에 개시된 방법에 따라 결정될 수 있다. 기재된 바와 같이, 샘플(12A) - 이는 샘플의 일부분일 수 있음 - 이 적어도 하나의 플로우셀(22)에 적용된다. 희석제, 투과화제, 조영제 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 화학물질이 샘플(12A)에 도입된다. 희석제, 투과화제, 및/또는 조영제 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 화학물질은 입자들의 적어도 2개의 범주를 감별하고, 입자들의 적어도 하나의 범주의 적어도 2개의 하위범주를 감별하는 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 샘플(12B)의 입자들의 복수의 이미지들이 캡처링된다. 이미지 분석이 시각적 분석기(17) 및/또는 프로세서(18) 상에서 수행된다.
일부 실시 형태에서, 프로세서(18)는 적어도 2개의 범주 및/또는 하위범주의 구성원들을 구분하도록 프로그래밍된다. 입자들의 적어도 2개의 하위범주 또는 범주 각각의 내의 입자들의 카운트의 비례적인 비가, 샘플의 입자들의 복수의 이미지들에 기초하여 결정될 수 있다. 이어서, 입자 카운터(15)로부터 얻어진 적어도 2개의 범주 중 적어도 하나의 하위범주들에 대한 입자 카운트가, 하위범주들 각각의 분포를 사용함으로써 프로세서(18) 상에서 정정될 수 있다. 입자들의 각각의 하위범주의 농도가, 입자들의 각각의 하위범주의 비례적인 비 및 입자 카운터로부터 얻어진 입자들의 범주의 입자 카운트에 기초하여, 프로세서(18) 상에서 계산될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법은 또한, 일부 실시 형태에 따라, 입자 카운터(15) 상에서의 검출 범위 밖에 있는 입자들의 하나 이상의 유형을 감별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 입자는 입자 카운터(15) 상에서 검출되기에 너무 크거나 너무 작은 혈구 또는 다른 단편일 수 있다. 시각적 분석기(17) 상에서, 입자 카운터 상에서의 검출 범위 밖에 있는 입자의 한 유형 대 입자 카운터의 검출 범위 내에 있는 입자의 다른 한 유형의 카운트들의 비례적인 비가, 샘플의 입자들의 복수의 이미지들에 기초하여 결정될 수 있다. 이어서, 입자 카운터(15) 상에서 얻어진 입자 카운트에 그러한 비례적인 비를 적어도 부분적으로 적용시킴으로써, 샘플 중의 검출 범위 밖에 있는 입자들의 유형의 농도가 결정될 수 있다.
포커싱된 이미지
도 20a 및 도 20b는 본 발명의 실시 형태들에 따른, 이미징 시스템 및 방법의 태양들을 예시하는 측단면도를 제공한다. 도 20a를 참조하면, 혈액 분석기와 같은 입자 분석 시스템(1400a)은 예를 들어 공계류중인 미국 특허 출원 제_____호에 기술된 것과 같은 플로우셀 및 점성 시스 유체 기술들을 사용하여, 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 위해 구성될 수 있으며, 이 출원의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 입자 분석 시스템을 사용하여 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 예시적인 방법은 입자 분석 시스템의 플로우셀(1430a)의 유로(1420a)를 따라 시스 유체(1410a)를 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 유로(1420a)는 플로우셀의 대향하는 플로우셀 벽들(1422a, 1424a)에 의해 적어도 부분적으로 한정될 수 있다. 시스 유체(1410a)는 혈액 유체 샘플의 점도와 상이한 점도를 가질 수 있다. 이미징 방법은 혈액 유체 샘플을 플로우셀(1430a) 내의 유동하는 시스 유체(1410a) 내로 주입하여 혈액 유체 샘플이 샘플 유동 스트림(1440a) 내를 유동하도록 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 샘플 유동 스트림(1440a)은 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 가질 수 있다. 샘플 유동 스트림(1440a)은 또한 유로 크기의 감소부를 통해 유동할 수 있고, 이미징 축(1450a)을 횡단할 수 있다. 도 20a의 예시에서, 유동의 방향은 좌측에서 우측으로이다.
추가적으로, 이미징 방법은 플로우셀(1430a)에 대해 고정된 위치를 갖는 이미징 표적(1470a)을 이미징함으로써 이미지 캡처 디바이스(1460a)를 포커싱하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 여기에 도시된 바와 같이, 이미징 표적(1470a)은 플로우셀의 조명 창(1480a)에 대해 고정된 위치를 가질 수 있다. 일부 경우에, 이미징 표적(1470a)은 창(1480a) 내부에 매립되거나 또는 창(1480a) 위에 고정될 수 있다. 방법들은 또한 이미지 캡처 디바이스(1460a)로 샘플 유체 중의 입자들(예컨대, 유동 스트림(1440a) 내에 적어도 부분적으로 배치되는 입자(1490a))의 포커싱된 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 포커싱된 이미지는 입자 특성화 및 카운팅에 적합하다.
이미지 캡처 디바이스(1460a)는 변위 거리를 이용하여 샘플 유동 스트림(1440a) 상에 포커싱될 수 있다. 예를 들어, 변위 거리는 샘플 유동 스트림(1440a)과 이미징 표적(1470a) 사이의 거리 D에 상응할 수 있다. 시스 유체(1410a)와 혈액 유체 샘플 사이의 점도 차이는, 유로 크기의 감소부와 조합하여, 혈액 유체 샘플 중의 세포들의 생존능력을 유지하면서 이미징 축(1450a)에서 샘플 유동 스트림(1440a) 내의 샘플 유체를 하이드로포커싱하기에 효과적이다. 예를 들어, 점도 차이와 관련된 시스 유체(1410a)와 샘플 유체 스트림(1440a) 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과는, 유로 크기의 감소부와 관련된 시스 유체(1410a)와 샘플 유체 스트림(1440a) 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 샘플 유체 스트림(1440a) 내의 세포들이 샘플 유체 스트림(1440a)으로부터 유동하는 시스 유체(1410a) 내로 연장될 때, 시스 유체(1410a) 내의 점도제가 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 이미징 축(1450a)에서 유체 샘플 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하는 데 효과적일 수 있다.
이미지 캡처 디바이스(1460a)가 변위 거리를 이용하여 샘플 유동 스트림(1440a) 상에 포커싱됨에 따라, 이미지 캡처 디바이스(1460a)는 이미징 축(1450a)에서, 또는 이미징 축(1450a)과 관련된 이미지 캡처 영역에서 샘플 유동 스트림(1440a) 내의 입자들 또는 세포들의 이미지를 얻을 수 있다. 일부 경우에, 입자들은 조명원 또는 램프(1426a)로 조명될 수 있다. 샘플 유동 스트림(1440a)의 이미지들은 입자들이 이미징 축(1450a)에 접근함에 따라, 입자들이 이미징 축(1450a)을 횡단함에 따라, 그리고/또는 입자들이 이미징 축(1450a)으로부터 멀어지게 유동함에 따라 얻어질 수 있다.
도 20b는 대안적인 플로우셀 구성의 태양들을 도시하는데, 여기서 이미징 표적(1470b)은 플로우셀(1430b)의 관찰구 창(1482b)에 대해 고정된 위치를 갖는다. 예를 들어, 이미징 표적(1470b)은 창(1482b) 내부에 매립되거나 또는 창(1482b) 위에 고정될 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 이미징 방법은 플로우셀(1430b)에 대해 고정된 위치를 갖는 이미징 표적(1470b)을 이미징함으로써 이미지 캡처 디바이스(1460b)를 포커싱하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 이미지 캡처 디바이스(1460b)는 변위 거리를 이용하여 샘플 유동 스트림(1440b) 상에 포커싱될 수 있다. 예를 들어, 변위 거리는 샘플 유동 스트림(1440b)과 이미징 표적(1470b) 사이의 거리 D에 상응할 수 있다.
도 20c는 오토포커스 또는 이미징 표적을 위한 다양한 대안적인 배치 위치들을 예시하는, 플로우셀(1430c)의 단부 단면도를 도시한다. 예를 들어, 이미징 표적(1472c)은 플로우셀(1430c)의 관찰구 창(1482c)에 위치될 수 있다. 선택적으로, 이미징 표적(1474c)은 플로우셀(1430c)의 조명 창(1480c)에 위치될 수 있다. 더욱 선택적으로, 이미징 표적(1476c)은 측방향 플로우셀 벽(예컨대, 1432c 및/또는 1434c) 내에 위치될 수 있다. 이미지 캡처 디바이스(1460c)는 변위 거리를 이용하여, 시스 유체(1410c) 내에 봉입되는 샘플 유동 스트림(1440c) 상에 포커싱될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변위 거리는 샘플 유동 스트림(1440c)(또는 유동 스트림(1440c)에 의해 한정된 중심 평면(1441c))과 관찰구 창 이미징 표적(1472c) 사이의 이미징 축(1450c)을 따르는 거리 D1에 상응하거나 또는 그 거리 D1에 의해 한정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변위 거리는 샘플 유동 스트림(1440a)(또는 중심 평면(1441c))과 조명 창 이미징 표적(1476c) 사이의 이미징 축을 따르는 거리 D2에 상응하거나 또는 그 거리 D2에 의해 한정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변위 거리는 샘플 유동 스트림(1440a)(또는 중심 평면(1441c))과 플로우셀 측방향 벽 이미징 표적(1474c) 사이의 이미징 축을 따르는 거리 D3에 상응하거나 또는 그 거리 D3에 의해 한정될 수 있다. 일부 경우에, 거리 D3는 0 초과의 값을 갖는다. 일부 경우에, 거리 D3는 0의 값을 갖는데; 즉, 이는 샘플 유동 스트림(1440a)(또는 중심 평면(1441c))이 이미징 표적(1474c)과 동일 평면에 있는 경우이다. 일부 경우에는, 거리 D1, 거리 D2, 또는 거리 D3에 기초하여 계산되지 않는 변위 거리를 한정하는 것이 가능하다. 예를 들어, 변위 거리는 플로우셀 또는 혈액 분석기 제조자에 의해 제공되는 사전결정된 수치 또는 값일 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 샘플 유동 스트림(1440c)은 이미징 축에서 약 2 μm 내지 약 10 μm 범위의 두께 T1을 가질 수 있다. 일부 경우에, 유로 또는 시스 유체(1410c)는 이미징 축에서 약 150 μm의 두께 T2를 가질 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 이미징 표적(1472c)은 샘플 유동 스트림(1440c)과 이미지 캡처 디바이스(1460c) 사이에 배치된 관찰구 창(1482c) 상에 위치될 수 있다. 일부 경우에, 이미징 표적(예컨대, 1474c)은 조명 창(1480c)과 관찰구 창(1482c) 사이에 위치될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 포커싱된 이미지를 획득하는 과정은 변위 거리를 이용하여 이미지 캡처 디바이스(1460c)와 플로우셀(1430c) 사이의 거리를 조절하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 포커싱된 이미지를 획득하는 과정은 변위 거리를 이용하여 이미지 캡처 디바이스(1460c)의 초점 거리를 조절하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 포커싱된 이미지를 획득하는 과정은 이미지 캡처 디바이스(1460c)와 플로우셀(1430c) 사이의 거리를 조절하는 것을 포함할 수 있고, 거리를 조절하는 과정은 예를 들어 이미지 캡처 디바이스(1460c)에 보다 근접하는 위치로 또는 이미지 캡처 디바이스(1460c)로부터 더욱 멀어지는 위치로 플로우셀(1430c)을 이동시키는 것을 포함한다.
도 20d에 도시된 바와 같이, 이미지 캡처 디바이스(1460d)의 제1 초점 거리는 이미지 캡처 디바이스(1460d)와 이미징 표적(1470d) 사이의 (예컨대, 이미징 축(1450d)을 따르는) 거리 D1에 상응할 수 있고, 이미지 캡처 디바이스(1460d)의 제2 초점 거리는 이미지 캡처 디바이스(1460d)와 샘플 유동 스트림(1440d)(또는 샘플 유동 스트림에 의해 한정되는 중심 평면) 사이의 (예컨대, 이미징 축(1450d)을 따르는) 거리 D2에 상응할 수 있다. 일부 경우에, 이미징 표적은 예를 들어 도 20c에 도시된 바와 같이, 플로우셀 내의 다른 위치에 위치될 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 변위 거리는 제1 초점 거리(또는 거리 D1)와 제2 초점 거리(또는 거리 D2) 사이의 거리 차이에 상응할 수 있다. 이미지 캡처 디바이스(1460d)는 이러한 변위 거리(예컨대, D1과 D2 사이의 차이)를 사용하여 샘플 유동 스트림(1440d) 상에 포커싱될 수 있다.
도 21은 예를 들어 조명 오리피스 또는 조명 창 상에, 관찰구 또는 관찰 창 상에, 또는 다른 플로우셀 위치에 위치될 수 있는 오토포커스 패턴(또는 이미징 표적)의 실시 형태를 보여주는 입면도를 도시한다. 표적은 광학 고분해능 이미징 디바이스의 거리 또는 위치가 리본형 샘플 스트림에 대해 이동됨에 따라 점점 희미해질 수 있다. 도 9 내지 도 12b에 도시된 바와 같이, 이미징 또는 포커스 표적(오토포커스 패턴)은 샘플이 나타나게 될 관찰 영역의 주위에 있을 수 있다. 도 21을 다시 참조하면, 포커스 표적은 시야에 있는 형상들을 조영함으로써 한정될 수 있음이 가능하다는 것을 또한 알 수가 있다.
이미징 디바이스가 오토포커스 패턴(표적)(도 21의 패널 B) 상에 인-포커스 상태로 있는 경우, 디바이스에 의해 이미징된 바와 같은 형상들은 잘 한정되어 있고, 본 명세서에 기술된 바와 같은 오토포커싱을 위해, 즉 표적과 이미징 디바이스 사이의 거리를 찾는 데 사용될 수 있는데, 그 거리에서 상기 형상들은 형상들 위를 가로지르는 라인들, 예컨대 화살표로 도시된 바와 같은 라인들을 따라 위치되는 인접 픽셀들 사이의 진폭의 최고대비를 생성한다. 패널 B에 도시된 포커스 구성은 도 22a에 도시된 유사 포커스 구성에 상응한다. 도 22a에 도시된 바와 같이, 이미지 캡처 디바이스의 초점 평면은 오토포커스 표적과 정렬되고, 그에 따라 이미지 캡처 디바이스는 오토포커스 표적의 선명한 이미지를 얻기 위한 위치에 있게 된다.
도 21을 다시 참조하면, 작동 위치(예컨대, 이미징 디바이스의 초점 평면)가 예를 들어 대물 렌즈의 작동 거리 또는 대물 렌즈와 그의 초점 평면 사이의 거리를 조절함으로써 오토포커스 패턴으로부터 멀어지게 이동되는 경우(도 21에서 오토포커스 패턴의 좌측 및 우측에 도시된 패널들 A와 C에 도시됨), 포커스 표적 형상들은 이제 포커스에서 벗어나게 되고, 광학 고분해능 이미징 디바이스가 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱되는 위치에서, 포커스 표적 형상들은 더 이상 식별할 수 없게 된다(도 21의 패널 D 참조). 패널 D에 도시된 포커스 구성은 도 22b에 도시된 유사 포커스 구성에 상응할 수 있다. 도 22b에 도시된 바와 같이, 이미지 캡처 디바이스의 초점 평면은 샘플 유체 스트림과 정렬되고, 그에 따라 이미지 캡처 디바이스는 샘플 유동 스트림 중의 입자들의 선명한 이미지를 얻기 위한 위치에 있게 된다. 도 22a의 초점 평면은 도 22b의 초점 평면으로부터 거리 D만큼 떨어져 있다. 도 22b에 도시된 바와 같이, 이미지 캡처 디바이스를 거리 D만큼 이동시킴으로써, 초점 평면을 거리 D만큼 이동시키고 그에 따라 초점 평면을 오토포커스 표적으로부터 샘플 유동 스트림까지 이동시키는 것이 또한 가능하다. 일부 경우에, 초점 평면은 이미지 캡처 디바이스를 플로우셀에 대해 고정된 위치에 유지하면서 이미지 캡처 디바이스의 초점 거리를 내부적으로 조절함으로써, 오토포커스 표적으로부터 샘플 유동 스트림까지 이동될 수 있다. 일부 경우에, 초점 평면은 플로우셀에 대해 이미지 캡처 디바이스의 위치를 조절하는 것과 조합하여 이미지 캡처 디바이스의 초점 거리를 내부적으로 조절함으로써, 오토포커스 표적으로부터 샘플 유동 스트림까지 이동될 수 있다. 오토포커스 형상들은 시야 내에 있고 플로우셀에 대해 고정되는 임의의 위치에, 예컨대 조명 개구부 또는 조명 창 상에, 또는 광학 고분해능 이미징 디바이스가 지향되는 관찰구 또는 관찰 창의 전방 또는 후방에, 또는 이미징될 위치에 표적을 유지하도록 광전지에 부착되는 고정구에 제공될 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 광학 고분해능 이미징 디바이스가 변위 거리에 걸쳐 이동되고 오토포커스 패턴이 포커스를 벗어나게 될 때, 인-포커스인 것으로 보이는 특징부들은 오토포커스 패턴에 대향된 것과 같은 혈구들이다. 도 21의 실시 형태에서, 오토포커스 패턴은 시야 내에 있는 형상들에 의해 한정된다. 이러한 형상들은 제한된 크기의 비교적 얇은 개별 형태들이며, 이에 따라 변위 거리만큼 이동한 후에, 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱될 때, 형태들은 디지털화 이미지에서 사실상 비가시적이게 된다. 전형적인 변위 거리는, 혈액(혈구) 이미징 적용을 위한 치수를 갖는 플로우셀에서, 예를 들어 50 내지 100 μm일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 오토포커스 특징부는 최적 포커스 거리의 1 μm 이내에 광학 고분해능 이미징 디바이스를 유지한다.
따라서, 도 21에 도시된 특징들은 변위 거리를 결정하기 위한 예시적인 기술을 제공한다. 예를 들어, 변위 거리를 결정하는 방법은 테스트 유체 샘플을 시스 유체 내로 주입하여 플로우셀 내에 테스트 샘플 유동 스트림을 형성하는 단계, 및 이미지 캡처 디바이스를 사용하여 이미징 표적의 제1 포커싱된 이미지를 얻는 단계를 수반하는 오토포커싱 과정을 포함할 수 있다. 제1 포커싱된 이미지는 도 21의 패널 B에 상응할 수 있는데, 이 경우, 포커싱된 이미징 표적 및 이미지 캡처 디바이스는 제1 초점 거리를 한정한다. 여기에 도시된 바와 같이, 이미지 캡처 디바이스의 초점 평면 또는 작동 거리/위치는 이미징 표적에 위치된다. 오토포커싱 과정은 또한 이미지 캡처 디바이스를 사용하여 테스트 샘플 유동 스트림의 제2 포커싱된 이미지를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 제2 포커싱된 이미지는 도 21의 패널 D에 상응할 수 있는데, 이 경우, 포커싱된 테스트 샘플 유동 스트림 및 이미지 캡처 디바이스는 제2 초점 거리를 한정한다. 여기에 도시된 바와 같이, 이미지 캡처 디바이스의 초점 평면 또는 작동 거리/위치는 이미징 표적에 위치된다. 오토포커싱 과정은 제1 초점 거리와 제2 초점 거리 사이의 차이를 계산함으로써 변위 거리를 얻는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 테스트 유체 샘플은 혈액 유체 샘플과 동일하고, 테스트 샘플 유동 스트림은 샘플 유동 스트림과 동일하다. 일부 경우에, 오토포커싱 과정은 이미지 캡처 디바이스와 관련된 초점 평면을 확립하고, 초점 평면은 이미지 캡처 디바이스에 대해 고정된 채로 유지된다. 일부 경우에, 이미지 캡처 디바이스를 오토포커싱하는 과정은 복수의 포커스 위치 중에서 최적의 포커스 위치를 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, 이미지 캡처 디바이스는 온도 데이터를 사용함이 없이 샘플 유동 스트림 상에 포커싱될 수 있다. 예를 들어, 이미지 캡처 디바이스를 샘플 유동 스트림 상에 포커싱하는 과정은 이미지 캡처 디바이스의 온도와는 독립적으로 수행될 수 있다. 일부 경우에, 이미징 표적은 샘플 유동 스트림에 대해 이미지 캡처 디바이스의 이미징 축을 위치설정하는 데 사용하기 위한 (예컨대, 도 12b에 도시된 바와 같은) 스케일을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이미징 표적은 이미징 축에 대해 정렬된 아이리스를 포함하여서, 이미징된 입자들이 아이리스에 의해 한정된 개구 내에 배치되고 아이리스의 하나 이상의 에지 부분들이 오토포커싱 동안 이미징되게 할 수 있다.
예시적인 실시 형태에서, 오토포커싱 기술은 플로우셀을 샘플 스트림의 최적의 초점 위치로부터 ±1 μm 이내로 위치설정할 수 있다. 일부 경우에, 실시 형태들은 별도의 포커싱 액체나 용액 또는 어떤 사용자 간섭의 필요 없이도 이미징 시스템을 자동으로 포커싱할 수 있는 오토포커스 기술을 포함한다. 예시적인 오토포커싱 기술은 또한, 이미징 디바이스 대물 렌즈와 플로우셀 사이의 거리에 변동을 야기할 수 있는 드리프트 또는 열 팽창과 같은 최적에 못 미치는 포커싱 성능의 기계적 원인을 설명할 수 있다. 일부 경우에, 플로우셀 내의 샘플 유동의 위치는 매우 안정적일 수 있고 온도와는 무관함이 관찰되었다. 따라서, 예시적인 이미징 기술은 플로우셀에서 이미징 표적 상에 포커싱하는 것, 및 고정된 오프셋을 사용하여 샘플 스트림 상에 최적의 포커스를 달성하는 것을 수반할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 이미징 시스템 상에 사용되는 현미경 대물 렌즈는 개구수가 0.75이고, 그 결과 이론적인 피사계 심도(DoF)는 ±0.5 μm로 된다. 소정의 실험적인 시도에서, 양호한 이미지 품질은 최적의 초점 지점으로부터 ±1.25 μm에서 얻어질 수 있음이 관찰되었다. 또한, 실용적인 또는 실험적인 피사계 심도는 이론적인 피사계 심도와는 상이할 수 있음이 관찰되었다. 예를 들어, 소정의 실험적인 시도에서, 피사계 심도는 약 2.5 내지 3 μm였음이 관찰되었다. 소정의 실험적인 연구들에 기초하여, 플로우셀을 ±1.25 μm 이내로 위치설정하기 위한 오토포커스 성능이 양호한 이미지 품질을 보장할 수 있음이 결정되었다. 일부 실시 형태에서, 오토포커스 시스템은 플로우셀을 샘플 스트림의 최적의 포커스 위치로부터 ±1 μm 이내로 위치설정하도록 작동할 수 있다. 소정의 실험적인 시도에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 오토포커스 기술은 플로우셀 내의 표적을 0.3 μm 미만의 표준 편차로 반복적으로 위치시킬 수 있음이 관찰되었다. 일부 경우에, 시도된 오토포커스 시스템 실시들은 우수한 반복성(표준 편차 ≤ 0.23 μm)을 입증했고, ±1 μm 위치 공차 이내에 있는 최적화된 메트릭 위치로부터 샘플 스트림의 포커스 위치를 <0.6 μm 이내로 결정하는 것이 가능하였다. 다양한 온도 조건에서의 추가적인 오토포커스 시도 실시들은 또한 우수한 위치설정 성능(예컨대, 최적 포커스 위치의 요구되는 ±1 μm 공차 이내에서의 플로우셀 위치설정)을 나타냈다. 자동화 분석기 시스템에서의 이러한 정확도 정도는 표준 실험실 조건에 상응하는 작동 온도 범위에 걸쳐, 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 박형 리본 유동 스트림 내를 유동하는 혈액 유체 샘플로부터의 입자들의 고품질 이미지를 일관성 있게 그리고 신뢰성 있게 얻는 데 매우 적합하다.
도 23은 본 발명의 실시 형태들에 따른 샘플 처리 방법(2300)의 태양들을 도시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 샘플 처리 방법은 단계(2305)에 의해 나타낸 바와 같이 샘플을 전단 밸브 내로 흡인하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 CBC 모듈에 의해 수행될 수 있다. 방법은 또한, 단계(2310)에 의해 나타낸 바와 같이 샘플 및 시약을 반응 챔버 내로 분배하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 CBC 모듈 및 제1 유체학 시스템(예컨대, BBL1 유체학)에 의해 수행될 수 있다. 더욱이, 방법은 단계(2315)에 나타낸 바와 같이, 원하는 온도에서 원하는 지속 시간 동안(예컨대, 47.5℃에서 40초 동안) 반응 혼합물을 인큐베이팅하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 또한, 단계(2320)에 의해 나타낸 바와 같이 켄칭 시약(quenching reagent)을 반응 챔버 내로 분배하는 단계, 단계(2325)에 의해 나타낸 바와 같이 반응 혼합물을 이미징 준비 섹션 내로 흡인하는 단계, 및 단계(2330)에 의해 나타낸 바와 같이 공기/액체 계면을 전단하고 샘플을 플로우셀 내로 푸싱하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 단계들(2315, 2320, 2325, 2330)은 유체학 시스템(예컨대, BBL 유체학)에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 방법은 단계(2335)에 의해 나타낸 바와 같이 이미지들을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이미징 수집 과정은 5000 내지 7000개의 프레임들을 수집하는 단계를 포함할 수 있고, 이미지들은 비디오 파일 내에 저장될 수 있다. 일부 경우에, 단계(2335)는 비디오 시스템(예컨대, BBL 비디오)에 의해 수행될 수 있다. 더욱이, 방법은 단계(2340)에 의해 나타낸 바와 같이 이미지들의 수집을 생성하는 각 프레임에 대해 패치 추출을 수행하는 단계, 단계(2345)에 의해 나타낸 바와 같이 5종 감별 또는 다른 진단 결과 파일을 생성하는 단계, 및 단계(2350)에 의해 나타낸 바와 같이 각각의 패치/세포를 분류하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단계들(2340, 2345, 2350)은 혈액학 자동화 입자 인식(APR) 소프트웨어를 사용하여 오프라인 처리로 수행될 수 있다.
PIOAL은 적합한 점도 및 밀도를 가지며, 플로우셀로의 샘플의 도입 지점에서의 유량은 샘플 유체가 박형 리본으로 편평화되도록 하는 유량이다. 리본형 샘플 스트림은 PIOAL과 함께 운반되어서 관찰구의 전방을 지나가는데, 이때 관찰구에서는 대물 렌즈 및 광원이 리본형 샘플 스트림의 관찰을 가능하게 하도록 배열되어 있다. 샘플 유체가 도입되는데, 이는 예를 들어 PIOAL의 유로가 대칭적으로 협소화되는 지점에서 주입된다. 결과적으로, 샘플 유체 스트림은 박형 리본으로 편평화되고 연신된다. 본 발명의 PIOAL은 본 발명의 임의의 시각적 분석기와 함께 시스 유체로서 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, PIOAL은 플로우셀의 단부 내로 도입되어서, 샘플 유체와 함께 방출구를 향해 운반될 수 있다.
관찰 구역에서의 리본형 샘플 스트림의 치수는, PIOAL 유로의 기하학적 박형화 및 샘플 유체와 PIOAL의 차별적인 선속도에 의해 영향을 받으며, 이는 리본형 샘플 스트림의 박형화 및 연신을 가져온다. 샘플 대 PIOAL의 초기의 차별적인 선속도는 0.5:1 내지 5:1의 범위일 수 있다. PIOAL 유로 단면은 약 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, 또는 200:1의 비율로 깊이를 감소시킴으로써 박형화될 수 있다. 일 실시 형태에서, 기하학적 박형화는 40:1이다. 일 실시 형태에서, 기하학적 박형화는 30:1이다. 고려되는 인자는 플로우셀을 통한 수송 시간, 원하는 샘플 처리율, 입자 크기에 비견되는 리본형 샘플 스트림 두께의 달성, 입자들 및 세포소기관들의 정렬의 달성, 입자들의 인-포커스 내용물의 달성, 작동 한계 이내의 압력, 유동, 및 점도의 균형, 리본형 샘플 스트림 두께의 최적화, 원하는 선속도의 달성, 제조가능성 고려, 및 샘플 및 PIOAL의 필요 부피이다.
캐뉼러의 길이 및 부피와 단면 편평화는 샘플 유동 불안정성의 기간을 감소시킴으로써 처리량을 증가시키도록 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 유동 불안정성의 기간은 약 3, 2.75, 2.5, 2.25, 2, 1.75, 1.5 1.25초 미만, 또는 약 1초 미만일 수 있다. 더 작은 캐뉼러 부피는 또한 샘플 실시들 사이에 캐뉼러를 세정하는 데 필요한 시간 및 희석제의 부피를 감소시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 플로우셀을 통한 수송 시간은 1, 2, 3, 또는 4초이거나, 또는 이들 시간 중 임의의 2개 사이의 임의의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 수송 시간은 4, 3 또는 2초 미만일 수 있다.
샘플 유체 및 PIOAL의 점도 및 유량과 플로우셀의 윤곽은, PIOAL 유동이, 이미지 캡처 영역에 상응하는 신뢰할 수 있는 위치에서 관찰 구역을 통해 일관성 있게, 샘플 유동을 편평한 리본으로 편평화하고 연신시키도록 배열된다. 샘플 유체 스트림은 유체 유동 두께가 대략 2 내지 3 μm로 압축될 수 있다. 몇몇 혈구 유형들은 스트림 두께보다 더 큰 직경을 갖는다. 유동 방향에 평행한 방향으로의 전단력은, 광학 고분해능 이미징 디바이스의 초점 평면에서의 이미징 조건 하에서의 입자들의 이미지 투영의 증가를 야기시키고/시키거나, 입자내 구조, 예를 들어 세포내 구조, 세포소기관 또는 엽이 유동 방향에 사실상 평행하도록 위치설정, 위치재설정, 및/또는 더 우수하게 위치설정되게 한다. 광학 고분해능 이미징 디바이스의 피사계 심도는 최대 7 μm, 예를 들어 1 내지 4 μm이다.
리본형 샘플 스트림이 함께 운반되고 있는 PIOAL의 유동 단면은 관찰구의 전방에서 관찰 구역을 통해 일정하며, 이때 관찰구를 통해 대물 렌즈가 지향된다. 대물 렌즈는 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스의 대물 구성요소일 수 있다. 리본형 샘플 스트림은 플로우셀 내의 기지의 반복가능한 위치에서, 예를 들어 플로우셀의 2개의 벽으로부터의 기지의 반복가능한 거리에서 관찰 구역을 가로지르는 경로를 따르며, 하류에서 방출된다.
샘플 중의 입자들로부터의 광학 정보는, 리본형 샘플 스트림이 관찰구의 전방에서 관찰 구역을 통해 운반될 때, 분석기 내의 검출 섹션에 의해 검출되며, 그럼으로써 샘플 중에 함유된 입자들/세포들로부터의 데이터를 생성한다. 이러한 분석기의 사용은 샘플 중에 함유된 세포들 및/또는 입자들의 캡처, 처리, 범주화 및 하위범주화와 카운팅을 가능하게 한다. PIOAL 액체는 점도 개질제, 완충제, pH 조정제, 항미생물제, 이온 강도 개질제, 계면활성제, 및/또는 킬레이트화제의 첨가에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서의 분석기의 예시적인 기능적 구성요소 및/또는 특징부에는, 예를 들어 이미지 분석으로부터 데이터를 획득 및/또는 처리하는 능력, 샘플 염색 처리, 이미지 처리, 및/또는 입자 이미지 식별, 카운팅, 및/또는 범주화 및 하위범주화가 포함될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 PIOAL 중에의 적합한 양의 점도제의 첨가가, 플로우셀 내에서의 입자/세포 정렬을 상당히 개선하며, 이는 더 높은 백분율의 정렬된 인-포커스 세포들 또는 세포 성분, 및 유동 중인 세포들 및/또는 입자들의 더 높은 품질의 이미지로 이어진다는 의외의 예기치 않은 발견에 기초하였다. 협소화 전이 구역의 기하학적 포커싱 효과와 조합하여 점도 차이는 향상된 정렬 및 포커스 결과를 달성할 수 있다. 점도제의 첨가는 RBC와 같은 세포들 상에 전단력을 증가시키고, 이는 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에의 세포들의 정렬을 개선하며, 이는 결국 이미지 최적화를 가져온다. 이는 또한, 유동 방향에 사실상 평행한 입자내 구조, 예컨대 세포내 구조, 세포소기관 또는 엽의 위치설정, 위치재설정, 및/또는 더 우수한 위치설정을 가져오며, 이는 결국 이미지 최적화를 가져온다. 점도제는 또한 세포들의 오정렬을 감소시키지만, 일반적으로, 유동 스트림보다 직경이 더 작은 세포들로 제한되지 않는다.
유동 스트림보다 직경이 더 작은 세포들, 예를 들어 적혈구의 정렬은, 예를 들어 PIOAL의 점도를 증가시킴으로써, 또는 유속비를 증가시킴으로써 얻어질 수 있다. 이는 (예를 들어, 도 4k에 도시된 바와 같이) 유동 방향에 평행하고 초점 평면(FP)에 평행한 RBC의 정렬을 가져온다. 일부 실시 형태에서, PIOAL의 점도를 증가시킴으로써 RBC 오정렬의 감소 및/또는 RBC 정렬의 증가가 달성된다.
리본형 샘플 스트림 두께는 샘플 유체 및 PIOAL의 상대 점도 및 유량에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 정밀 변위 펌프를 포함하는 샘플의 공급원 및/또는 PIOAL의 공급원은, 리본형 샘플 스트림의 치수를 최적화하기에 제어가능한 유량으로, 즉 적어도 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스의 시야만큼 넓은 박형 리본으로서 샘플 및/또는 PIOAL을 제공하도록 구성될 수 있다.
리본형 샘플 스트림이 함께 운반되고 있는 PIOAL의 유동 단면은 관찰구의 전방에서 관찰 구역을 통해 일정하며, 이때 관찰구를 통해 광학 고분해능 이미징 디바이스가 지향된다. 리본형 샘플 스트림은 플로우셀의 전방 벽 및 후방 벽 중 어느 하나로부터의 기지의 반복가능한 거리에서 관찰 구역을 가로지르는 경로를 따르며, 그의 하류에서 방출된다.
본 발명은 리본형 샘플 스트림 상에 포커싱하기 위한 광학 고분해능 이미징 디바이스의 올바른 작업 위치를 자동으로 달성하기 위한 기술을 제공한다. 플로우셀 구조는, 리본형 샘플 스트림이, PIOAL의 층들 사이에 박형 리본으로, 샘플 유체의 유로를 한정하는 플로우셀의 벽들 사이에서 고정되고 반복가능한 위치를 가져서, 플로우셀 내의 관찰 구역을 통과하도록 구성된다. 예를 들어 도 1 내지 도 4g에 개시된 플로우셀 실시 형태에서, PIOAL에 대한 유로의 단면은 전이 구역에서 대칭적으로 협소화될 수 있으며, 오리피스에서 직사각형 루멘을 갖는 관과 같은 납작한 오리피스를 통해 샘플이 삽입될 수 있다. (예를 들어, 단면적이 20: 1 내지 40:1의 비로 기하학적으로 협소화되는) 협소화 유로와, 또한 샘플의 유동과 비교하여 PIOAL의 선택적으로 더 큰 선속도는 약 20:1 내지 70:1의 비로 샘플 단면을 편평화하도록 협동한다. 일부 실시 형태에 따르면, 이 비는 10:1 내지 100:1의 범위, 50:1 내지 100:1의 범위, 70:1 내지 80:1이 범위일 수 있다. 일부 실시 형태에 따르면, 이 비는 75:1이다. 효과적으로, 유량, 점도, 및 기하학적 형태의 조합으로 인해, 샘플은 박형 리본으로 형성된다. (예를 들어, 단면적이 40:1의 비로, 또는 20:1 내지 70:1의 비로 기하학적으로 협소화되는) 협소화 유로와, 샘플의 유동과 비교하여 PIOAL의 선속도의 차이는 약 20:1 내지 70:1의 비로 샘플 단면을 압축하도록 협동한다. 일부 실시 형태에서, 단면 두께 비는 40:1일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 단면 두께 비는 30:1일 수 있다.
결과적으로, 샘플 및 PIOAL의 특정 선속도와 같은 처리 변동은 리본형 샘플 스트림을 유동 중에 그의 위치로부터 변위시키려는 경향이 없다. 플로우셀의 구조에 대하여, 리본형 샘플 스트림 위치는 안정하고 반복가능하다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 입자 조영제 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 키트는 또한 본 명세서에 기재된 방법들 중 임의의 것에 따른 입자 조영제 조성물의 사용에 대한 사용설명서를 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL)를 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 RBC, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 세균, 진균, 원생생물, 원생동물, 또는 기생충과 같은 입자들의 이미지-기반 식별을 위한 프로그래밍가능한 저장 매체 및 관련 소프트웨어를 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 하나 이상의 완충제 - 이에는 등장성 완충제가 포함될 수 있음 - 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 키트 및/또는 완충제는 계면활성제, pH 조정제, 및/또는 항미생물제를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 키트는 또한 세정 또는 플러싱 용액을 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 양성 및 음성 대조군을 위한 표준물을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표준물은 표준 염색된 세포 시약을 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 키트의 구성요소들을 전달하기 위한 일회용 미세피펫, 팁 또는 관과 같은 일회용 물품을 포함할 수 있다. 본 키트는 이들 키트 구성요소 중 임의의 하나, 또는 이들의 둘 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
혈액 샘플 중의 혈구들의 구별은 본 발명의 실시 형태들이 특히 잘 적합한 예시적인 응용이다. 샘플은 자동화 기술에 의해 준비되고, 박형 리본형 샘플 스트림으로서 광학 고분해능 이미징 디바이스에 제공되어서, 리본형 샘플 스트림이 시야를 가로질러 유동하는 동안에 주기적으로 이미징된다. 입자들(예컨대, 혈구들)의 이미지는, 오로지 자동적으로 또는 제한된 인력 지원 하에, 픽셀 이미지 데이터 프로그래밍된 처리 기술을 사용하여 서로 구분되고, 범주화되고, 하위범주화되고, 카운팅되어서 세포들 또는 입자들을 식별 및 카운팅하게 할 수 있다. 입자들의 특이하거나 중대한 특징부의 경우에 저장되고 입수가능하게 될 수 있는 세포 이미지에 더하여, 출력 데이터는 기록된 샘플 이미지에서 구분되는 세포 또는 입자의 각각의 특정 범주 및/또는 하위범주의 발생 카운트를 포함한다.
각각의 이미지에서 발견되는 상이한 입자들의 카운트는 추가로 처리될 수 있는데, 예를 들어 전체로서 샘플 중의 각각의 구분된 범주 및/또는 하위범주의 세포들의 정확하고 통계학적으로 유의한 비를 축적하는 데 사용될 수 있다. 시각적 구별에 사용되는 샘플은 희석될 수 있지만, 각각의 범주 및/또는 하위범주 내의 세포들의 비율은, 특히 다수의 이미지들이 처리된 후에, 희석된 샘플에서 나타난다.
본 명세서에 개시된 장치, 조성물, 및 방법은 시각적 구분에 기초한 샘플 중의 세포들의 구별 및 정량화에 유용하다. 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들어, 백혈구를 포함하는 체액 샘플일 수 있으며, 이에는 제한 없이, 혈액, 혈청, 골수, 세척액(lavage fluid), 침출물, 삼출물, 뇌척수액, 흉막액, 복수, 및 양수가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 고형 조직 샘플, 예를 들어 세포 현탁액을 생성하도록 처리된 생검 샘플일 수 있다. 샘플은 또한 배설물 샘플을 처리해서 얻어진 현탁액일 수 있다. 샘플은 또한 입자들을 포함하는 실험실 또는 생산 라인 샘플, 예컨대 세포 배양물 샘플일 수 있다. 용어 샘플은 환자 또는 실험실로부터 얻어진 샘플 또는 이의 임의의 분획, 부분 또는 분취물을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 샘플은 일부 과정에서 희석되거나, 부분들로 나누어지거나, 염색될 수 있다.
일 태양에서, 본 발명의 시스템, 조성물 및 방법은 유동 중인 세포들의 대단히 고품질의 이미지를 제공한다. 일 태양에서, 시각적 분석기는 자동화 이미지-기반 WBC 감별 카운팅을 제공하기 위하여 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 본 발명의 방법은, 대상체가 건강한지 또는 질병, 질환, 비정상 및/또는 감염을 갖는지, 그리고/또는 치료에 반응성인지 또는 비반응성인지를 결정, 진단, 예후, 예측, 및/또는 그러한지의 진단을 지원하기 위한 형태학적 특징부 및/또는 비정상을 포함한 시각적 구분의 자동화 식별에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 시스템은 입자 카운터를 추가로 포함할 수 있다. 응용에는 유체 샘플, 예컨대 혈액 샘플 중의 세포들의 범주화 및/또는 하위범주화, 그리고 카운팅이 포함된다. 추가 유형의 입자들 및/또는 다른 유체 샘플 중의 입자들을 카운팅하기 위한 다른 유사한 용도가 또한 고려된다. 본 발명의 시스템, 조성물, 및 방법은 임의의 적합한 자동화 입자 인식 알고리즘을 사용하는 이미지의 실시간 범주화 및 하위범주화와 관찰에 사용될 수 있다. 각각의 샘플에 대해 캡처링된 이미지는 추후에 관찰되도록 저장될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명의 장치, 조성물, 및 방법은 매우 더 정확한 이미지-기반 세포 범주화 및 하위범주화와, 현재의 자동화 분석기를 사용하는 경우의 수동 재검토율과 비교하여 수동 재검토율을 감소시키는 플래깅(flagging)을 제공한다. 이러한 시스템, 조성물, 및 방법은 수동 재검토율을 감소시키고, 수동 재검토가 기기 상에서 수행될 수 있게 한다. 게다가, 본 발명의 시스템, 조성물, 및 방법은 또한 수동 재검토를 필요로 하는 것으로서의 자동화 분석 동안 플래깅된 샘플들의 백분율을 감소시킨다.
본 발명은 추가로, 온혈구 카운트(CBC) 카운터를 분석기, 예컨대 시각적 분석기와 조합하기 위한 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것으로, 이는 CBC와 이미지-기반의 확장된 백혈구 감별 카운트 및 이미지-기반의 확장된 혈소판 카운트를 얻음으로써 혈소판을 카운팅하기 위한 유효 검출 범위를 확대시키기 위한 것이다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 본 발명은 입자들, 예를 들어 혈구들을 함유하는 샘플을 분석하기 위한 장치 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 액체 중에 현탁된 입자들을 포함하는 샘플의 이미지를 얻기 위한, 시각적 분석기가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 시각적 분석기는 플로우셀 및 오토포커스 구성요소를 포함하며, 여기서 관심 대상인 입자들을 함유하는 액체 샘플이, 관찰구를 갖는 플로우셀을 통해 유동되게 하며, 관찰구를 통해, 대물 렌즈에 커플링된 카메라가 입자들의 디지털 이미지를 캡처링한다. 본 발명의 실시 형태들을 사용하여 구현될 수 있는 예시적인 오토포커스 기술이 공계류 중인 미국 특허 출원 제____호에 개시되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 플로우셀은 샘플 유체, 예컨대 희석 및/또는 처리된 혈액 샘플, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 체액 샘플의 공급원에, 그리고 투명한 시스 유체, 또는 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL)의 공급원에 커플링된다.
일 실시 형태에서, 본 장치는 또한 적어도 하나의 검출 범위를 갖는 입자 카운터뿐만 아니라, 분석기, 및 프로세서도 포함한다. 분석기 및 프로세서는 입자 카운터와 관련된 카운팅, 범주화, 및 하위범주화 오류를 정정하기 위한 추가 정보를 제공하도록 구성되고, 샘플 중의 입자들의 상이한 범주 및/또는 하위범주의 정확한 입자 카운트 또는 농도를 추가로 결정한다.
본 발명은 이미지-기반 샘플 분석을 수행함에 있어서 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은, 예를 들어 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 망상적혈구, 유핵 RBC, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 또는 후골수세포를 포함한 WBC, RBC, 및/또는 혈소판과 같은 세포 유형을 식별 및 카운팅할 수 있는 온혈구 카운트(CBC) 및 이미지-기반의 확장된 백혈구(WBC) 감별을 수행하는 능력, 및 WBC 카운트와 형태, 적혈구(RBC) 카운트와 형태, 및 혈소판(PLT) 카운트와 형태에 대한 이미지-기반 정보를 제공하는 능력을 갖는, 조합된 카운팅 및 이미징 시스템을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 입자들의 이미지-기반 분석에서 사용될 수 있는 PIOAL에 관한 것이다. 혈액 샘플 중의 세포 범주 및/또는 하위범주 카운트는 분석될 수 있는 샘플들의 종류의 비제한적인 예로서 본 발명에서 사용된다. 일부 실시 형태에서, 샘플 중에 존재하는 세포들은 또한 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판뿐만 아니라 세균성 또는 진균성 세포들도 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조직 또는 흡인물로부터 얻어진 입자 현탁액이 분석될 수 있다.
혈액 샘플 중의 혈구들의 구별은 본 발명의 요지가 특히 잘 적합한 예시적인 응용이다. 샘플은 자동화 기술에 의해 준비되고, 리본형 샘플 스트림으로서 광학 고분해능 이미징 디바이스에 제공되어서, 샘플이 시야를 가로질러 유동하는 동안에 주기적으로 이미징된다. 입자들(예컨대, 혈구들)의 이미지는, 오로지 자동적으로 또는 제한된 인력 지원 하에, 픽셀 이미지 데이터 프로그래밍된 처리 기술을 사용하여 서로 구분되고/되거나, 범주화되고/되거나, 하위범주화되고/되거나, 카운팅되어서 세포들 또는 입자들을 식별 및 카운팅하게 할 수 있다. 특이하거나 중대한 특징부의 경우에 저장되고 입수가능하게 될 수 있는 세포 이미지에 더하여, 출력 데이터는 기록된 샘플 이미지에서 구분되는 세포 또는 입자의 각각의 특정 범주 및/또는 하위범주의 발생 카운트를 포함한다. 각각의 이미지에서 발견되는 상이한 입자들의 카운트는 추가로 처리될 수 있는데, 예를 들어 전체로서 샘플 중의 각각의 구분된 범주 및/또는 하위범주의 세포들의 정확하고 통계학적으로 유의한 비례적인 비, 또는 그의 함수를 축적하는 데 사용될 수 있다. 시각적 구별에 사용되는 샘플은 또한 고도로 희석될 수 있지만, 각각의 범주 및/또는 하위범주 내의 세포들의 비율은, 특히 다수의 이미지들이 처리된 후에, 희석된 샘플에 대한 분포에서 나타난다.
일부 태양에서, 샘플은 자동화 방식으로 제공되고, 이미징되고 분석된다. 혈액 샘플의 경우에, 이러한 샘플은 적합한 희석제 또는 식염수 용액을 사용하여 사실상 희석될 수 있는데, 이는 일부 세포들의 모습이 희석되지 않거나 덜 희석된 샘플 중의 다른 세포들에 의해 가려질 수 있는 정도를 감소시킨다. 세포들은, 예를 들어 세포막이 투과성이 되게 하기 위한 투과화제, 및 특징부들, 예컨대 과립 및 핵에 부착되어 이들을 드러내는 조직학적 염색제를 사용하여, 일부 세포 양상들의 조영을 증강시키는 작용제로 처리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 및 혈소판을 포함하는 입자들을 카운팅 및 특성화하기 위해, 그리고 백혈구 감별, 특성화 및 분석을 위해 샘플의 분취물을 염색하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 적혈구를 함유하는 샘플은 플로우셀로의 도입 및 이미징 전에 희석될 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 샘플 희석, 투과화 및 조직학적 염색을 위한 샘플 준비 장치 및 방법의 상세 사항은 일반적으로, 하나 이상의 프로그래밍가능한 제어기에 의해 작동되는 정밀 펌프 및 밸브를 사용하여 달성되는데, 본 발명에 중심이 되지 않는다. 인터내셔널 리모트 이미징 시스템즈, 인크.(International Remote Imaging Systems, Inc.)에 양도된 특허, 예컨대 미국 특허 제7,319,907호에서 예를 찾아볼 수 있는데, 이는 프로그래밍가능한 제어에 관한 것이다. 마찬가지로, 소정의 세포 범주 및/또는 하위범주 사이를 상대 크기 및 색과 같은 그들의 속성에 의해 구분하기 위한 기술을, 백혈구와 관련된 미국 특허 제5,436,978호에서 찾아볼 수 있다. 이들 특허의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시 형태에 따르면, 샘플 준비 기술은 공계류 중인 미국 특허 출원 제____호에 기재된 것들과 같은 염색, 용해, 투과화, 및 다른 처리 방식을 포함할 수 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
용어 광학 고분해능 이미징 디바이스는 형태학적 특징부 및/또는 변화를 감별하기에 충분한 시각적 구분을 갖는 입자 이미지를 얻을 수 있는 디바이스를 포함할 수 있다. 예시적인 광학 고분해능 이미징 디바이스는 1 μm 이하 - 예를 들어, 0.4 내지 0.5 μm, 예컨대 이를 테면 0.46 μm를 포함함 - 의 광학 분해능을 갖는 디바이스를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법 중 임의의 것에서 얻어진 이미지는 디지털화 이미지일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 얻어진 이미지는 현미경 이미지이다. 소정 실시 형태에서, 이미지는 수동으로 얻어질 수 있다. 다른 실시 형태에서, 이미지를 얻기 위한 절차의 적어도 일부분은 자동화된다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 플로우셀, 광학 고분해능 이미징 디바이스 또는 디지털 이미지 캡처 디바이스 - 선택적으로 오토포커스 특징부를 가짐 - 를 포함하는 시각적 분석기를 사용하여 얻어질 수 있다.
일 실시 형태에서, 이미지는 세포의 세포질, 세포핵 및/또는 핵 성분들에 관한 정보를 제공한다. 일 실시 형태에서, 이미지는 세포의 과립 성분 및/또는 다른 형태학적 특징부에 관한 정보를 제공한다. 일 실시 형태에서, 이미지는 세포의 세포질, 핵 및/또는 과립 성분들에 관한 정보를 제공한다. 이러한 과립 및/또는 핵 이미지 및/또는 특징부는, 둘 모두 독립적으로 또는 서로 조합하여, 세포 범주화 및 하위범주화에 있어 결정적이다.
본 발명의 방법의 일 태양에서, 입자 조영제 조성물과 접촉되고/되거나 이미징된 세포들은 유핵 적혈구이다. 또 다른 태양에서, 본 발명의 방법은 이미지-기반 적혈구 범주화 및 하위범주화를 수행하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 방법은 a) 적혈구의 일부분을 이미징하는 단계; 및 b) 이미징된 적혈구의 형태를 결정하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 적혈구(RBC)에는, 예를 들어 정상 또는 비정상 적혈구, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 및/또는 말라리아-감염된 세포가 포함될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미징은 본 발명의 장치, 예컨대 입자 카운터, 시각적 분석기 및 프로세서를 포함하는 장치를 사용하여 수행된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 예시적인 온혈구 카운트(CBC)는 의사 또는 다른 의학 전문가에 의해 전형적으로 요구되는 테스트 패널을 포함할 수 있는데, 이러한 테스트 패널은 환자의 혈액 샘플 중의 입자들 및/또는 세포들에 대한 정보를 제공한다. 혈류 중에서 순환하는 예시적인 세포들은 일반적으로 3가지 유형으로 나누어질 수 있으며, 이에는, 예를 들어 백혈구(예를 들어, 백혈구(leukocyte)), 적혈구(예를 들어, 적혈구(erythrocyte)), 및 혈소판(예를 들어, 혈소판(thrombocyte))이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 비정상적으로 높거나 낮은 카운트는 질병, 장애, 및/또는 질환의 존재를 나타낼 수 있다. 따라서, CBC는 의료에서 일반적으로 수행되는 혈액 검사들 중 하나인데, 그것이 환자의 전반적인 건강 상태의 개관을 제공할 수 있기 때문이다. 따라서, CBC는 매년마다의 신체 검사 동안 일상적으로 수행된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 전형적으로 사혈전문의는 대상체로부터 혈액 샘플을 수집하며, 그러한 혈액은 일반적으로, 항응고제(예를 들어, EDTA, 때때로 시트레이트)가 전형적으로 담긴 시험관 내로 채취되어서, 그것이 혈병형성되는 것을 중지시킨다. 이어서, 샘플은 실험실로 이송된다. 때때로, 샘플은 자동화 카운터에 의한 즉각적인 처리를 위하여 파스퇴르 피펫을 사용하여 손가락 단자(finger prick)로부터 채취된다. 일 실시 형태에서, 입자 이미지는 입자가 시스 유체 또는 PIOAL 내에 봉입되어 있는 동안에 획득된다. 소정 실시 형태에서, 혈액 샘플은 현미경 하에서 환자 혈액의 샘플(혈액막(blood film), 또는 말초혈액 도말(peripheral smear))이 준비된 슬라이드 상에서 관찰될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 온혈구 카운트는 자동화 분석기에 의해 수행된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 일반적으로, 혈액 분석기는 협관(narrow tubing)을 통해 매우 소량의 검체를 흡인할 수 있다. 센서가 그러한 관을 통과하는 세포들의 수 및/또는 카운트를 검출할 수 있고, 세포의 유형을 식별할 수 있다. 예시적인 센서에는 광(예를 들어, 가시광, UV 또는 IR) 및/또는 전기 임피던스의 검출기가 포함될 수 있다. 예시적인 검출 파라미터에는 크기, 부피, 및/또는 세포 특징부들이 포함될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 센서는 약 200 nm 내지 약 10000 nm 범위의 파장 스펙트럼 내의 가시광 및 비가시광을 검출할 수 있다. 소정 실시 형태에서, 센서는 약 380 nm 내지 약 760 nm의 파장을 검출할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 혈구 카운트의 데이터/파라미터에는, 예를 들어 전체 적혈구; 헤모글로빈 - 혈액 중의 헤모글로빈의 양; 적혈구용적률(hematocrit) 또는 충전 세포 부피(packed cell volume, PCV); 평균 적혈구 부피(mean corpuscular volume, MCV) - 적혈구의 평균 부피(빈혈은 이 값이 예측 정상 범위의 초과인지 미만인지에 기초하여 소구성(microcytic) 또는 대구성(macrocytic)으로 분류됨. MCV에 영향을 줄 수 있는 다른 질환에는 지중해빈혈증, 망상적혈구증가증 및 알코올 중독이 포함됨); 평균 적혈구 헤모글로빈(mean corpuscular hemoglobin, MCH) - 적혈구당 헤모글로빈의 평균량(피코그램 단위); 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC) - 세포 중의 헤모글로빈의 평균 농도; 적혈구 분포 폭(RDW) - RBC 집단의 세포 부피의 변동; 전체 백혈구; 호중성 과립구(전형적으로 급성 바이러스 감염에서 증가된 세균성 감염을 지시할 수 있음)가 포함될 수 있다. 핵의 분절된(segmented) 외관으로 인해, 호중구는 때때로 "세그(seg)"라 지칭된다. 덜 성숙한 호중구의 핵은 분절되지 않지만, 밴드 또는 세장형 형상을 갖는다. 덜 성숙한 호중구 - 최근에 골수로부터 혈류 내로 방출된 것 - 는 "밴드(band)"로 알려져 있다. 혈구 카운트에 대한 다른 데이터/파라미터에는 또한, 예를 들어 림프구(예를 들어, 선열(glandular fever)과 같은 일부 바이러스성 감염에 의해, 그리고 만성 림프구성 백혈병(CLL)에서 증가되거나, 또는 HIV 감염에 의해 감소됨); 단핵구(세균성 감염, 결핵, 말라리아, 록키산 홍반열, 단핵구성 백혈병, 만성 궤양성 결장염 및 국소성 장염에서 증가될 수 있음); 호산성 과립구(예를 들어, 기생충성 감염, 천식, 또는 알러지성 반응에서 증가됨); 호염기성 과립구(예를 들어, 백혈병 또는 림프종과 같은 골수 관련 질환에서 증가됨)가 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 혈구 카운트의 데이터/파라미터에는 또한, 예를 들어 혈소판과 관련된 데이터가 포함될 수 있으며, 이러한 데이터에는 혈소판 수, 혈액 중에서의 그의 크기 및 크기 범위에 대한 정보; 평균 혈소판 부피(MPV) - 혈소판의 평균 크기의 측정치 - 가 포함된다.
본 발명의 방법의 다른 태양에서, 입자 조영제 조성물과 접촉되고/되거나 이미징된 세포들은 비정상 세포, 예컨대 말라리아-감염된 세포, 비정형 림프구이다. 본 발명의 일부 태양에서, 세포는 질환, 질병, 감염 및/또는 증후군을 식별, 예측, 진단, 예후하거나, 또는 이들의 진단을 지원하는 데 사용될 수 있는 비정상 세포이다.
본 발명의 방법의 다른 태양에서, 세포들은 혈소판이다.
명백히 달리 나타나 있지 않는 한, 본 명세서에서의 "입자" 또는 "입자들"에 대한 언급은 유체 중에 분산된 임의의 개별적 또는 유형적(formed) 물체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "입자"는 생물학적 유체 중의 (예를 들어, 이미지 및/또는 다른 측정가능한 파라미터에 의해) 모든 측정가능하고 검출가능한 성분들을 포함할 수 있다. 입자들은 임의의 재료, 임의의 형상 및 임의의 크기를 갖는다. 소정 실시 형태에서, 입자들은 세포들을 포함할 수 있다. 입자들의 예에는, 혈구, 태아 세포, 상피, 줄기 세포, 종양 세포를 포함한 세포, 또는 세균, 기생충, 또는 상기 중 임의의 것의 단편 또는 생물학적 유체 내의 다른 단편이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 혈구는 생물학적 유체 내에 잠재적으로 존재하는 임의의 정상 또는 비정상, 성숙 또는 미성숙 세포를 포함한 임의의 혈구, 예를 들어 적혈구(RBC), 백혈구(WBC), 혈소판(PLT) 및 다른 세포들일 수 있다. 이들 구성원에는 또한 미성숙 또는 비정상 세포가 포함된다. 미성숙 WBC에는 후골수세포, 골수세포, 전골수세포 및 아세포가 포함될 수 있다. 성숙 RBC에 더하여, RBC의 구성원에는 유핵 RBC(NRBC) 및 망상적혈구가 포함될 수 있다. PLT에는 "거대(giant)" PLT 및 PLT 응괴가 포함될 수 있다. 혈구 및 유형적 요소는 본 명세서의 어딘가 다른 곳에서 추가로 설명되어 있다.
예시적인 입자들에는 생물학적 유체 샘플 중의 유형적 요소들이 포함될 수 있으며, 이러한 유형적 요소들에는, 예를 들어 구형 및 비구형 입자들이 포함된다. 소정 실시 형태에서, 입자들은 비구형 성분들을 포함할 수 있다. 비구형 성분들의 이미지 투영은 광학 고분해능 이미징 디바이스의 초점 평면에서 최대화될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 비구형 입자들은 광학 고분해능 이미징 디바이스의 초점 평면 내에 정렬된다(유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬된다). 일부 실시 형태에서, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 RBC, 및 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 및 미성숙 WBC - 아세포, 전골수세포, 골수세포, 또는 후골수세포를 포함함 - 를 포함한 WBC가 입자들로서 카운팅되고 분석된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 검출가능하고 측정가능한 입자 파라미터에는, 예를 들어 크기, 형상, 대칭, 윤곽 및/또는 다른 특성들의 시각적 및/또는 이미지-비기반 지표가 포함될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은, 예를 들어 하기 단계를 포함하는 방법들 중에서, 예를 들어 본 발명의 키트를 사용하여 입자들을 이미징하기 위한 방법에 관한 것이다: 1) 입자들을 시각적 분석기 내에서 광으로 조명하는 단계; 2) PIOAL 내에 봉입된 샘플 입자들의 디지털화 이미지를 얻는 단계; 및 3) 이미지 정보에 기초하여 입자 함유 샘플을 분석하는 단계. 다른 실시 형태에서, 본 방법은, 처리된 샘플을 조명하기 전에, 입자들을 함유하는 샘플을 입자 조영제 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 분석된 입자들은 구형 입자, 비구형 입자 중 적어도 하나, 또는 둘 모두를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 입자들은 적어도 하나의 구형 입자를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 입자들은 적어도 하나의 비구형 입자를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 비구형 입자들 또는 비구형 성분들을 갖는 입자들의 이미지 투영은 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에서 최대화된다. 입자들은, 예를 들어 WBC, RBC, 및/또는 혈소판일 수 있다. 일 실시 형태에서, 비구형 입자들의 50% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬된다. 다른 태양에서, 플로우셀 내에서의 본 발명의 PIOAL의 사용은 비구형 입자들의 90% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬될 수 있게 한다.
PIOAL 내에 봉입된 리본형 샘플 스트림의 두께보다 더 작은 세포들의 유동은 유동 방향에 평행한 그들 세포들의 정렬을 가져온다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 비구형 입자들의 92% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬된다. 또 다른 실시 형태에서, 비구형 입자들의 90% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬된다. 다른 실시 형태에서, 입자들의 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 이상 또는 95% 이상이 사실상 정렬, 즉 유동 방향에 사실상 평행한 평면으로부터 20도 이내에 정렬된다. 다른 실시 형태에서, 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬되는 비구형 및/또는 구형 입자들의 백분율은 언급된 백분율 중 임의의 2개 사이의 임의의 범위, 예를 들어 적어도 75 내지 85%, 75 내지 80%, 및 다른 범위, 예컨대 75 내지 92%일 수 있다.
PIOAL 내에 봉입된 샘플 중의 더 큰 세포들, 예컨대 WBC의 유동의 결과로서의 유동 방향에 평행한 방향으로의 전단력은, 유동 방향에 팽행한 평면에 더 근접한 핵 구조, 세포질 구조 또는 과립 또는 다른 세포내 성분 또는 구조의 위치설정, 위치재설정, 및/또는 더 우수한 위치설정을 가져온다.
일 실시 형태에서, 비구형 입자들은 적혈구를 포함한다. 본 발명의 다른 태양에서, 구형 입자들은 백혈구 또는 유핵 적혈구를 포함한다.
본 발명의 방법의 일 실시 형태에서, 입자들은 비구형 입자들이다. 일 실시 형태에서, 분석된 입자들은 구형 입자, 비구형 입자 중 적어도 하나, 또는 둘 모두를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 입자들은 적어도 하나의 구형 입자를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 입자들은 적어도 하나의 비구형 입자를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 비구형 입자들 또는 비구형 성분들을 갖는 입자들의 이미지 투영은 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에서 최대화된다. 입자들은, 예를 들어, 망상적혈구 및 유핵 RBC를 포함한 RBC, 혈소판 및/또는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 또는 미성숙 WBC - 아세포, 전골수세포, 골수세포, 또는 후골수세포를 포함함 - 를 포함한 WBC일 수 있다. 일 실시 형태에서, 비구형 입자들의 50% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬된다. 다른 태양에서, 플로우셀 내에서의 본 발명의 PIOAL의 사용은 비구형 입자들의 90% 이상이 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬될 수 있게 한다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 이미지 단면은 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 또는 미성숙 WBC - 아세포, 전골수세포, 골수세포, 또는 후골수세포를 포함함 - 를 포함한 WBC 내의 감별 염색된 핵 구조, 감별 염색된 세포질 구조 또는 감별 염색된 과립 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 구형 및/또는 비구형 입자들의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 이상, 또는 95% 이상은 광학 고분해능 이미징 디바이스의 초점 평면 또는 피사계 심도 내에 핵 구조, 세포질 구조 또는 과립을 갖는다.
본 발명의 방법의 일부 실시 형태에서, 이미지 정보는 입자의 이미지 단면이다. 일부 태양에서, 이미지 단면은 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 또는 미성숙 WBC - 아세포, 전골수세포, 골수세포, 또는 후골수세포를 포함함 - 를 포함한 WBC 내의 감별 염색된 핵 구조, 감별 염색된 세포질 구조 또는 감별 염색된 과립 중 적어도 하나를 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 유동 중인 인-포커스 입자들 및 입자 내용물의 높은 백분율을 갖는 세포들의 대단히 고품질의 이미지를 제공하는데, 이러한 이미지는 자동화 이미지-기반 WBC 감별뿐만 아니라, 대상체가 건강한지 또는 질병, 질환, 비정상 또는 감염을 갖는지, 그리고/또는 치료에 반응성인지 또는 비반응성인지를 결정, 진단, 예후, 예측, 또는 그러한지의 진단을 지원하는 데 유용한 형태학적 비정상의 자동화 식별을 얻는 데 있어 유용하다.
다른 태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 더 정확한 이미지-기반 세포 범주화 및 하위범주화와, 현재의 분석기와 비교하여 수동 재검토율을 크게 감소시키는 플래깅을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 예시적인 백혈구(WBC)에는, 예를 들어 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 후골수세포, 골수세포, 전골수세포 및 아세포를 포함한 미성숙 과립구, 및 비정상 백혈구가 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 적혈구(RBC)에는, 예를 들어 정상 또는 비정상 적혈구, 망상적혈구, 및 유핵 적혈구가 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 점도제에는 점도제 또는 점도 개질제가 포함될 수 있다. 예시적인 점도제/개질제는 샘플의 점도와는 상이한 특징적 점도를 가져서, PIOAL과 점도제가 혼합될 때, PIOAL의 점도가 변경 및/또는 증가되어 입자들의 정렬을 최대화하도록 한다. 소정 실시 형태에서, 리본형 샘플 스트림과 PIOAL 사이의 점도 차이 및/또는 속도 차이는 전단력을 도입하여 유동 중인 입자들 상에 작용하도록 하고, 그럼으로써 오정렬을 감소시키고/시키거나 입자들이 정렬되게 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 입자 조영제 조성물은 대상체로부터의 샘플 중의 입자들을 분석하기 위한 시각적 분석기에서 입자 및/또는 세포내 세포소기관 정렬 액체(PIOAL)와 조합하여 사용하기에 적합하게 될 수 있다. 예시적인 PIOAL은, 일 예로서, 대상체로부터의 샘플 중의 입자들의 상이한 유형들의 자동화 인식을 위한 방법에 유용하다.
다른 태양에서, 세포들은, 이미지가 얻어질 때, PIOAL 내에 봉입될 수 있다. 적합한 예시적인 세포내 세포소기관 정렬 액체가 본 명세서에 기술되어 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 시각적 분석기에서 사용하기 위한 PIOAL에 관한 것이다. 소정 실시 형태에서, PIOAL은 완충제; pH 조정제; 완충제; 점도제/개질제; 이온 강도 개질제, 계면활성제, 킬레이트화제, 및/또는 항미생물제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일 태양에서, PIOAL은 둘 이상의 점도제/개질제를 포함할 수 있다.
일 태양에서, 본 발명의 PIOAL은 점도가 약 1 내지 약 10 센티푸아즈일 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 PIOAL은 점도제/개질제를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, PIOAL은 최대 100%의 점도제를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 점도제 및/또는 점도 개질제는, 이미징 시스템에서 사용하기에 적절한, 광학 투명도를 포함한 광학 특성들과 함께, 약 1 내지 약 10 센티푸아즈의 점도를 달성하기에 적합한 임의의 물질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 점도제 또는 개질제는 비독성이고 생체적합성이며, 세포 구조 및 내용물을 사실상 온전하게 한다. 점도제 및/또는 점도 개질제는 글리세롤; 글리세롤 유도체; 에틸렌 글리콜; 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판); 폴리에틸렌 글리콜; 수용성 중합체 및/또는 덱스트란 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일 태양에서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 글리세롤일 수 있다. 일 예로서, 일 태양에서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 글리세롤 유도체일 수 있다. 일 예로서, 일 태양에서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 폴리비닐피롤리돈(PVP)일 수 있다. 다른 예로서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 에틸렌 글리콜일 수 있다. 다른 예로서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판)일 수 있다. 다른 예로서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 다른 예로서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 수용성 중합체 또는 덱스트란일 수 있다. 다른 태양에서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 글리세롤, 글리세롤 유도체; 에틸렌 글리콜; 프로필렌 글리콜(다이하이드록시프로판); 폴리비닐피롤리돈(PVP); 폴리에틸렌 글리콜; 수용성 중합체 또는 덱스트란 중 둘 이상을 포함할 수 있다. 점도제/개질제는, 이미징 시스템에서 사용하기에 적절한, 광학 투명도를 포함한 광학 특성들과 함께, 약 1 내지 약 10 센티푸아즈의 점도를 제공하기에 적합한 임의의 작용제를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다른 예시적인 점도제/개질제에는, 예를 들어 천연 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 아카시아, 트래거캔스, 알긴산, 카라기난, 로커스트 빈 검(locust bean gum), 구아 검, 잔탄 검, 아라비아 검, 구아 검, 젤라틴, 셀룰로스, 알기네이트, 전분, 당(sugar), 덱스트란; 젤라틴; 당(및 유도체), 예컨대 덱스트로스, 프룩토스; 폴리덱스트로스; 덱스트란; 폴리덱스트란; 당류(saccharide); 및 다당류(polysaccharide); 반합성 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 글리세롤, 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 전분(헤타스타치(hetastarch)), 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈(PVP); 합성 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 폴리비닐 알코올(PVA) 및/또는 카르보폴(Carbopol)(등록상표)이 포함될 수 있다. 다른 세포 적합성 점도제/개질제가 또한 이러한 목적에 유용한 것으로 여겨진다.
다른 태양에서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 PIOAL의 약 1 내지 약 50% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤일 수 있다. 일 예로서, 일 실시 형태에서, 점도제/개질제는 약 5.0% 내지 약 8.0% (v/v)의 농도로 PIOAL 내에 존재할 수 있다. 다른 태양에서, 점도제/개질제는 약 6.5% (v/v)의 농도로 존재할 수 있다. 일 실시 형태에서, 점도제/개질제는 약 6.5% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤이다.
또 다른 실시 형태에서, PIOAL은 약 30% (v/v)의 농도로 존재하는 글리세롤 점도제/개질제를 포함할 수 있다.
다른 태양에서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 약 0.5 내지 약 2.5% (w/v)의 농도로 존재하는 PVP일 수 있다. 일 예로서, 일 실시 형태에서, 점도제/개질제 PVP는 약 1.0 내지 약 1.6% (w/v)의 농도로 PIOAL 내에 존재할 수 있다. 일 실시 형태에서, PVP는 약 1.0% (w/v)의 농도로 존재한다.
다른 태양에서, PIOAL 내의 점도제/개질제는 PVP 및 글리세롤일 수 있다. 일 예로서, 일 실시 형태에서, 글리세롤은 약 1% (w/v)의 PVP와 조합하여 약 5% (v/v)의 농도로 PIOAL 내에 존재할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 PIOAL은 입자들을 이미징하기 위해 시각적 분석기에서 사용될 수 있다. 일 태양에서, 시각적 분석기는 대칭 유로를 갖는 플로우셀, 및 오토포커스 구성요소를 포함한다.
점도제 및/또는 점도 개질제/조정제, 예컨대 글리세롤이 PIOAL 내에 포함될 수 있다. 점도제 또는 점도 개질제는, 도입될 때, PIOAL의 점도를 원하는 범위로 적절히 조정할 수 있다. 유동 중인 세포들의 고품질 이미징을 가능하게 하기에 적합한 광학 특성들을 갖는, PIOAL의 점도를 충분히 증가시키는 임의의 적합한 점도제가 사용될 수 있다. PIOAL은 세포들 및/또는 세포 구조들을 유동 방향에 사실상 평행한 단일 평면 내에 정렬시킴으로써, 입자들의 인-포커스 내용물을 부분적으로 증가시키기에 적합한 점도를 가질 것이다.
PIOAL은 본 발명의 임의의 분석기와 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "글리세롤"은 글리세롤 및 글리세롤의 유도체(이하, 글리세롤 유도체로 지칭됨)를 포함한다. 글리세롤 유도체의 예에는 티오글리세롤, 폴리글리세롤 등이 포함된다. 폴리글리세롤의 유용한 예에는 다이글리세롤, 폴리글리세린(POLYGLYCERIN) #310(사카모토 야쿠힌 코교 컴퍼니, 리미티드(Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.)), 폴리글리세린 #750(사카모토 야쿠힌 코교 컴퍼니, 리미티드), 폴리글리세린 #500(사카모토 야쿠힌 코교 컴퍼니, 리니티드) 등이 포함될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 PIOAL은 pH 조정제를 추가로 포함한다. 일 태양에서, PIOAL 및/또는 샘플의 최종 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 다른 태양에서, PIOAL 및/또는 샘플의 최종 pH는 약 6.6 내지 약 7.4이다. 일 태양에서, PIOAL의 최종 pH는 제조된 샘플 12B와 동일한 pH일 수 있다(도 8 참고).
예시적인 pH 조정제에는, 예를 들어 산(예에는 유기산 및 광산(mineral acid)이 포함됨), 염기(예에는 유기 염기 및 알칼리 금속 및 알칼리 토금속의 수산화물이 포함됨)가 포함될 수 있다. 예시적인 유기산에는 아세트산, 락트산, 포름산, 시트르산, 옥살산, 및 요산이 포함될 수 있다. 예시적인 광산에는, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 붕산, 불화수소산, 브롬화수소산 및 과염소산이 포함될 수 있다. 예시적인 유기 염기에는, 예를 들어 피리딘, 메틸아민, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 히스티딘, 포스파젠, 및 양이온의 하이드록사이드가 포함될 수 있다. 예시적인 알칼리 금속 및 알칼리 토금속의 수산화물에는, 예를 들어 수산화칼륨(KOH), 수산화바륨(Ba(OH)2), 수산화세슘(CsOH), 수산화나트륨(NaOH), 수산화스트론튬(Sr(OH)2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화리튬(LiOH), 및 수산화루비듐(RbOH)이 포함될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 완충제의 사용으로, PIOAL의 pH는 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.5, 더 바람직하게는 약 7.0 내지 약 8.0으로 유지된다. 일부 실시 형태에서, PIOAL의 pH를 조정하기 위하여 PIOAL에 완충제를 첨가하는 것이 바람직하다. PIOAL의 pH를 적절한 범위로 조정하는 한, 임의의 적합한 완충제 또는 완충제들이 사용될 수 있다. 그러한 완충제의 예에는 PBS, 굿(Good)의 완충제(구체적으로, 트리스 완충제, MES, 비스-트리스(Bis-Tris), ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, 트라이신(Tricine), 바이신(Bicine), TAPS 등), 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨, 제1인산칼륨, 베로날 소듐-HCl, 콜리딘-HCl, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-말레산, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-HCl이 포함되며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 PIOAL은 생성된 제형의 이온 강도를 조정하기 위해 이온 강도 개질제를 포함한다. 예시적인 이온 강도 개질제에는 Li+, Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, Br-, HCO- 3, 설페이트, 피로설페이트, 포스페이트, 피로포스페이트(예를 들어, 피로인산칼륨), 시트레이트, 카코딜레이트 또는 다른 적합한 염이 포함될 수 있다. 일 실시 형태에서, PIOAL은 등장성일 수 있다.
계면활성제가 PIOAL에 첨가될 수 있다. PIOAL의 다른 성분들과 상용성이고 리본형 샘플 스트림 및 샘플 중의 입자들과 상용성인 한, 계면활성제의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 계면활성제에는, 예를 들어 양이온성, 음이온성, 비이온성, 및 양쪽성 계면활성제가 포함될 수 있다. 예시적인 계면활성제에는 폴리옥시에틸렌알킬 에테르-유형 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬페닐 에테르-유형 계면활성제(예를 들어, 닛산 노니온(NISSAN NONION) NS-240(노프 코포레이션(NOF CORPORATION), 등록상표)), 폴리옥시에틸렌소르비탄 알킬 에스테르-유형 계면활성제(예를 들어, 레오돌(RHEODOL) TW-0120(카오 코포레이션(Kao Corporation), 등록상표), 폴리올 공중합체(예를 들어, 플루로닉(PLURONIC) F-127, F-123, F-109, F-87, F-86, F-68, T-1107, T-1102(바스프 코포레이션(BASF Corporation), 등록상표)), MEGA-8, 수크로스 모노카프레이트, 데옥시-BIGCHAP, n-옥틸-β-D-티오글루코사이드, n-노닐-β-D-티오말토사이드, n-헵틸-β-D-티오글루코사이드, n-옥틸-β-D-티오글루코사이드, CHAPS, CHAPSO 등이 포함되고 사용될 수 있다. 다른 계면활성제에는 샘플 및 리본형 샘플 스트림과 상용성인 농도로 트리톤(Triton)-X-100 및 트윈(Tween) 20이 포함될 수 있다.
PIOAL 중의 계면활성제의 농도는 바람직하게는, 샘플 중의 세포들과 같은 입자들이 영향을 받지 않고/않거나 사실상 온전하게 유지되는 농도 수준이다. 구체적으로, 이 농도는 바람직하게는 5 내지 5000 mg/L, 더 바람직하게는 100 내지 3000 mg/L이다.
샘플 중에 함유된 입자들이 분석기에 의해 분석되는 경우, 인산암모늄, 인산마그네슘, 탄산칼슘과 같은 비정질 염이 샘플 중에 침전될 수 있다. 이러한 비정질 염을 용해시키기 위하여 킬레이트화제가 PIOAL에 첨가될 수 있다. 킬레이트화제의 첨가는 비정질 염을 용해시키는 것뿐만 아니라 PIOAL의 산화를 억제하는 것도 가능하게 한다. 킬레이트화제의 유용한 예에는 EDTA 염, CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, 메틸-EDTA, NTA, NTP, NTPO, EDDPO 등이 포함된다. PIOAL 중의 킬레이트화제의 농도는 0.05 내지 5 g/L의 범위인 것이 바람직하다.
다른 실시 형태에서, PIOAL은 하나 이상의 항미생물제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 항미생물제는, 예를 들어 살진균 활성을 갖는 물질(살진균제) 및/또는 살세균 활성을 갖는 물질(살세균제)일 수 있다. 소정 실시 형태에서, 적합한 항미생물제에는, 예를 들어 파라벤, 아이소티아졸리논, 페놀성 물질, 산성 방부제, 할로겐화 화합물, 쿼터니아(quarternia), 및 알코올이 포함될 수 있다. 예시적인 파라벤에는 파라벤 및 파라벤 염이 포함될 수 있다. 예시적인 아이소티아졸리논에는 메틸클로로아이소티아졸리논, 메틸아이소티아졸리논, 벤즈아이소티아졸리논 프로클린(ProClin) 150, 프로클린 200, 프로클린 300, 및 프로클린 950이 포함될 수 있다. 예시적인 페놀성 물질 유형에는 페녹시에탄올, 벤질 알코올, 및 페네틸 알코올이 포함될 수 있다. 예시적인 산성 방부제에는 데하이드로아세트산, 벤조산, 소르브산, 살리실산, 포름산, 프로피온산이 포함될 수 있다. 예시적인 할로겐화 화합물에는 2-브로모-2-니트로프로판-1, 3-다이올, 클로로아세트아미드, 클로로부탄올, 클로록실렌올, 클로르페네신, 다이클로로벤질 알코올, 요오도프로피닐 부틸카르바메이트, 메틸다이브로모 글루타로니트릴이 포함될 수 있다. 예시적인 쿼터니아에는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 헥사미딘 다이이세티오네이트, 및 폴리아미노프로필 바이구아니드가 포함될 수 있다. 예시적인 알코올에는 에틸 알코올 및 아이소프로필 알코올이 포함될 수 있다. 이들의 예에는 트라이아진 항미생물제, 티아졸 살세균제(예를 들어, 벤즈아이소티아졸론 등), 피리티온, 피리딘 살세균제(예를 들어, 1-하이드록시 피리딘-2-티오소듐 등), 2-페녹시에탄올 등이 포함된다. 구체적으로, 프록셀(Proxel) GXL(아베시아(Avecia)), 토미시드(TOMICIDE) S(에이피아이 코포레이션(API Corporation)) 등이 사용될 수 있다. 살세균제 및/또는 살진균제는 PIOAL의 안정성을 개선하도록 돕는다.
일 실시 형태에서, 항미생물제의 농도는 0.01% 내지 0.5% (w/v)일 수 있다. 이 농도는 0.03 내지 0.05% (w/v)일 수 있다.
이러한 실시 형태에서 PIOAL과 함께 분석기를 사용하여 분석을 거치는 샘플은 특별히 제한되지 않는다. 생체로부터 얻어진 샘플(생물학적 샘플)이 통상 사용된다. 대안적으로, 이러한 샘플은 사용을 위해 희석되거나, 정제되거나, 조영제와 접촉되거나 등을 할 수 있다. 구체적으로, 그러한 샘플의 예에는 혈액, 정액, 뇌척수액 등이 포함될 수 있다. 샘플에는 또한 조직 샘플로부터 유래된 입자 현탁액이 포함될 수 있다. 이러한 실시 형태에서의 PIOAL은 입자들(적혈구, 백혈구, 세균 등)이 분석될 때 적합하게 사용된다.
본 발명의 PIOAL은 입자들을 이미징하는 시각적 분석기에서 사용될 수 있다. 일 태양에서, 시각적 분석기는 사전결정된 치수 특성으로, 예컨대 유리한 리본형 샘플 스트림 두께로 리본형 샘플 스트림의 유동을 유지할 수 있는 플로우셀을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 플로우셀은 대칭 유로를 가지며, 오토포커스 구성요소와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 입자를 이미징하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 방법은 1) 샘플을 입자 조영제 조성물과 접촉시키는 단계; 2) 준비된 입자를 조명하는 단계; 3) PIOAL 내에 봉입된 리본형 샘플 스트림 내의 입자의 디지털화 이미지를 얻는 단계; 및 4) 이미지 정보를 분석하여 입자들을 범주화 또는 하위범주화하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 입자는, 예를 들어 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 망상적혈구, 유핵 RBC, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 또는 후골수세포를 포함한, WBC, RBC, 및/또는 혈소판, 세포, 세균, 기생충, 미립자 물질, 세포 응괴, 세포 성분, 및 미성숙 과립구 중 적어도 하나일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 RBC, 및 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 및 미성숙 WBC - 아세포, 전골수세포, 골수세포, 또는 후골수세포를 포함함 - 를 포함한 WBC가 입자 이미지 정보에 기초하여 카운팅되고 분석된다.
일부 실시 형태에서, 시각적 분석기는 대칭 또는 비대칭 유로를 갖는 플로우셀, 및 오토포커스 구성요소를 포함한다.
일반적인 태양에서, 예시적인 PIOAL 및 그의 사용 방법은 연구 및/또는 의학 실험실에서 발견되는 자동화 분석기와 조합하여 사용될 때 유용하다. 예시적인 자동화 분석기는 최소한의 인력 지원 하에, 예를 들어 인간 체액 샘플을 포함한 다수의 생물학적 샘플 중의 상이한 유형적 요소들 및/또는 다른 특성들을 신속히 측정하도록 설계된 기기이다. 예시적인 자동화 분석기에는, 예를 들어 혈액 분석기 및/또는 세포 카운터가 포함될 수 있으며, 이는, 예를 들어 온혈구 카운트(CBC) 결정을 수행할 수 있다. 예시적인 분석기는 단회로(singly), 배치(batch)로, 또는 연속적으로 샘플을 처리할 수 있다.
일 태양에서, 예시적인 분석기/시스템은 하나 이상의 선택 기준을 충족시키는 복수의 입자들을 검출하도록, 그리고 그의 입자 카운트를 제공하도록 구성된 자동화 입자 카운터를 포함하며, 여기서 선택 기준은 상기 입자들 내에서 적어도 두 범주의 구성원들을 포함한다. 카운터의 구성요소들을 포함할 수 있는 분석기 - 이는 프로세서를 포함할 수 있음 - 가 적어도 2개의 범주의 입자들을 구분하도록 프로그래밍된다. 분석기를 사용하여 입자들의 각각의 분포가 결정된다. 프로세서는 이러한 분포를 사용하여 적어도 2개의 범주 및/또는 하위범주 중 적어도 하나의 구성원들에 대한 입자 카운트를 정정한다. 일부 실시 형태에서, 입자 카운터는 부피, 크기, 형상, 및/또는 다른 기준에 기초한 사전결정된 범위에 기초하여 입자들의 적어도 하나의 범주 및/또는 하위범주의 입자 카운트를 제공하도록 구성된 적어도 하나의 채널을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 범주 및/또는 하위범주의 구성원들은 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 거대 혈소판(PLT), 및 유핵 적혈구(NRBC)의 하위범주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유형의 입자를 포함한다. 입자 카운터 상에서는, 유사한 크기 또는 다른 측정된 특성으로 인해, 거대 PLT 및 NRBC와 같은 세포들이 WBC로서 카운팅될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 장치를 작동시킴으로써, 거대 PLT 및 NRBC의 입자 카운트 또는 농도가 정확하게 측정될 수 있다.
샘플은 단리되고/되거나 준비된 생물학적 샘플일 수 있으며, 이에는, 예를 들어 체액 샘플, 혈액, 혈청, 뇌척수액, 흉막액, 복수, 타액, 정액, 눈물, 땀, 젖, 양수, 세척액, 골수 흡인물, 침출물, 삼출물, 또는 대상체로부터 얻어진 다른 샘플(예를 들어, 세포 현탁액을 생성하도록 처리된 생검 샘플, 또는 입자들을 포함하는 실험실 또는 생산 라인 샘플)이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 고형 조직 샘플, 예를 들어 세포 현탁액을 생성하도록 처리된 생검 샘플일 수 있다. 샘플은 또한 배설물 샘플을 처리해서 얻어진 현탁액일 수 있다. 샘플은 또한 입자들을 포함하는 실험실, 화학적, 산업적 또는 생산 라인 샘플, 예컨대 세포 배양물 샘플일 수 있다. 용어 샘플은 환자 또는 실험실로부터 얻어진 샘플 또는 이의 임의의 분획, 부분 또는 분취물을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 샘플은 일부 과정에서 희석되거나, 부분들로 나누어지거나, 조영제로 처리될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법은 광범위한 유기체로부터의 샘플들에 적용가능하며, 이러한 유기체에는 포유류, 예를 들어 인간, 인간 이외의 영장류(예를 들어, 원숭이), 말, 소 또는 다른 가축, 개, 고양이, 또는 애완동물, 래트, 마우스, 또는 다른 실험실용 동물로서 사육되는 다른 포유류; 조류, 예를 들어 닭; 파충류, 예를 들어 악어; 어류, 예를 들어 연어 및 다른 양식종; 및 양서류가 포함된다.
샘플은 어떠한 종래의 방법에 의해서도, 예를 들어 배설, 채취, 수거(harvesting), 흡인, 또는 생검에 의해서 얻어질 수 있다. 샘플은 건강한 것으로 여겨지는 대상체로부터의 것, 예를 들어 일상적인 신체 검사의 일부로서 수집된 샘플일 수 있다. 샘플은 또한 장애를 갖고 있거나 이를 가질 위험이 있거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 것일 수 있다. 장애는 질병, 유전적 비정상, 감염, 상처 또는 알려지지 않은 원인의 결과일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본 방법은 장애에 대한 치료 과정 동안 대상체를 모니터링하는 데 유용할 수 있다. 치료 및/또는 요법에 대한 비반응성의 징후가 있는 경우에, 임상의는 대체제 또는 보조제를 선택할 수 있다. 만약 있다면, 대상체의 질환 및 특정 장애에 따라, 샘플이 매일, 매주, 매월, 또는 매년 1회(또는 2회, 3회 등) 수집될 수 있다.
입자들은 샘플에 따라 변할 수 있다. 입자들은 생물학적 세포들, 예를 들어 혈구, 태아 세포, 줄기 세포, 종양 세포 또는 이들의 단편일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자들은 감염성 인자, 예를 들어 바이러스 또는 세균일 수 있다.
본 명세서에서의 "혈구"에 대한 언급은, 생물학적 유체 내에 잠재적으로 존재하는 임의의 정상 또는 비정상, 성숙 또는 미성숙 세포, 예를 들어 적혈구(RBC), 백혈구(WBC), 혈소판(PLT) 및 다른 세포들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일반적으로, 정상 RBC, PLT, 및 WBC는 각각 6 내지 8 μm, 2 내지 3 μm, 및 8 내지 15 μm 범위의 입자 직경을 갖는다. 정상 RBC, PLT 및 WBC는 정상 환자로부터의 전혈 샘플 내에 각각 3.9 내지 5.7 × 1012 세포/L, 1.4 내지 4.5 × 1011 세포/L, 3.5 내지 11 × 109 세포/L의 대략적인 농도 범위로 존재한다. 문헌[Barbara J. Bain, Blood Cells, A Practical Guide, 4th ed., Blackwell Publishing, 2007, 34-36]을 참조한다.
"유형적 요소"에 대한 언급은 생물학적 유체 샘플 내에 존재하는 비-유체 요소를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 유형적 요소에는, 예를 들어 과학적 분류 또는 생리학적 기능에 기초한 혈구들의 부류들이 포함되는데, 이들 부류에는 적혈구(RBC), 백혈구(WBC) 및 혈소판(PLT), WBC 응괴(clump), 성숙 림프구 및 미성숙 백혈구를 포함한 백혈구의 하위부류들, 예컨대 단핵구, 호중구, 호산구, 호염기구가 포함된다. 본 명세서에서 사용하기 위해 "유형적 요소"는 또한 미생물, 세균, 진균, 기생충, 또는 이들의 단편 또는 다른 세포 단편들과 같은 입자들을 포함할 것이다. WBC의 주요 구성원들에는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이들 구성원에는 또한 미성숙 또는 비정상 세포가 포함된다. 예를 들어, 미성숙 WBC에는 후골수세포, 골수세포, 전골수세포가 포함될 수 있다. 성숙 RBC에 더하여, RBC의 구성원에는 유핵 RBC(NRBC) 및 망상적혈구가 포함될 수 있다. PLT에는 정상 PLT, 및 크기가 정상 WBC의 크기에 근접하는 "거대" PLT가 포함될 수 있다. 본 명세서에서의 입자들의 범주 및/또는 하위범주의 "구성원" 또는 "구성원들"에 대한 언급은 입자들의 범주 또는 하위범주 내의 개별 입자들을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
달리 명백히 나타내지 않는 한, 본 명세서에서의 입자들의 "범주"에 대한 언급은 측정, 검출 또는 도출된 적어도 하나의 검출 기준, 예컨대 크기, 형상, 텍스처, 또는 색을 사용하여 검출된 입자들의 군을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 장치에 의해 카운팅되는 입자들의 적어도 하나의 범주 및/또는 하위범주의 구성원들은 동일한 유형의 유형적 요소일 것이다.
그러한 입자들은 "채널" 내에서 검출될 수 있다. 본 명세서에서의 "채널"에 대한 언급은, 적어도 하나의 채널 검출 기준을 충족시키는 입자들의 검출이 많든 적든 간에 이에 따라 변하는 출력을 제공하는, 신호원(signal source)에 커플링된 검출기를 포함하는 입자 카운터의 일부분을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 채널 검출 기준은 입자들의 크기 또는 부피에 기초할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 카운터 내의 채널들의 수는 하나이다. 일부 다른 실시 형태에서, 입자 카운터 내의 채널들의 수는 2개 이상이다.
입자 카운터의 하나의 채널 내에서 검출되는 입자들의 하나의 범주 및/또는 하위범주는 입자들의 상이한 부류들 및 하위부류들, 및 둘 이상의 하위부류들 내의 입자들의 그룹화된 구성원들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서의 입자들의 "범주(category)"에 대한 언급은 측정, 검출 또는 도출된 기준, 예컨대 크기, 형상, 텍스처, 또는 색에 상응하는 입자들의 그룹화를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 장치에 의해 카운팅되는 입자들의 적어도 하나의 범주 및/또는 하위범주의 구성원들은 동일한 유형의 유형적 요소일 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "정렬"은 구형 및/또는 비구형 입자들의 정렬에 의해 부분적으로 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 비구형 입자들과 같은 입자들은 유동 방향에 사실상 평행한 평면 내에 정렬될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 비구형 입자들의 정렬은 광학 고분해능 이미징 디바이스의 초점 평면 내에 이미징 조건 하에서 비구형 입자들의 이미지 투영을 증가시키는 입자들의 배향에 의해 특징지어진다. 구형 입자들과 같은 입자들은, 입자 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성하기에 유효한, 입자들 및 세포들의 인-포커스 입자내 내용물의 양에 있어서의 증가를 가질 수 있다. 구형 입자들과 같은 입자들의 입자내 구조들은 유동 방향에 사실상 평행하도록 위치설정, 위치재설정 및/또는 더 우수하게 위치설정될 수 있다. 예를 들어, 세포내 구조들, 세포소기관들 또는 엽들은 또한 유동 방향에 사실상 평행하도록 위치설정, 위치재설정 및/또는 더 우수하게 위치설정될 수 있다.
본 명세서에서의 입자들의 "부류(class)"에 대한 언급은 과학적 분류에 기초한 입자들의 군을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 혈구들의 3가지 주요 부류가 전혈 샘플 내에 존재하며, 이에는 RBC, WBC 및 PLT가 포함된다.
본 명세서에서의 입자들의 "구성원" 또는 "구성원들"에 대한 언급은 입자들의 하나의 범주 또는 하위범주 내의 입자들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 혈구들의 각각의 범주는 하위범주들 또는 구성원들로 추가로 세분될 수 있다. WBC의 주요 구성원들에는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이들 구성원에는 또한 미성숙 또는 비정상 세포가 포함된다. 예를 들어, 미성숙 WBC에는 후골수세포, 골수세포, 및 전골수세포가 포함될 수 있다. 성숙 RBC에 더하여, RBC의 구성원에는 유핵 RBC(NRBC) 및 망상적혈구가 포함될 수 있다. PLT에는 정상 PLT, 및 크기가 정상 WBC의 크기에 근접하는 "거대" PLT가 포함될 수 있다.
"미성숙 세포"에 대한 언급은, 소정 발달 단계의 세포들, 예를 들어, 골수 내부에 있거나, 골수로부터 방출된 직후이지만 성숙 세포로 완전히 발달되기 전의 세포들을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"비정상 세포"에 대한 언급은, 불규칙한 형태학적 특성을 갖는 세포들, 또는 소정 질병 또는 질환, 또는 일부 경우에 소정 질병 또는 질환과 관련될 수 있는 불규칙성(irregularity)과 관련된 세포들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 소정 질병의 예에는 적혈구증가증, 다혈구증, 빈혈, 적아구감소증, 백혈구증가증, 백혈구감소증, 림프구증가증, 림프구감소증, 과립구증가증, 과립구감소증 또는 무과립구증, 호중구증가증, 호중구감소증, 호산구증가증, 호산구감소증, 호염기구증가증, 호염기구감소증, 혈소판증가증, 혈소판감소증, 및 범혈구감소증이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 세포들의 일 부류가 혈류 중에서 증가 또는 감소될 수 있다. 일부 질환에서는, 정상 백혈구보다 훨씬 더 큰 비정상 세포들이 혈액 샘플 중에 낮은 농도로 존재한다. 크기, 형상, 색, 및/또는 세포내 구조들의 변동은 소정 질병 또는 질환과 관련될 수 있다.
본 명세서에서의 입자들의 "카운트" 또는 "입자 카운트"에 대한 언급은 입자 카운터의 하나의 채널로부터 얻어진 입자들의 수를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서의 입자들의 부류 또는 구성원의 "농도"에 대한 언급은 단위 부피당(예를 들어, 리터당) 또는 기지 부피의 샘플당 입자들의 수를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 입자 카운터는 입자들의 범주들에 대한 카운트 또는 농도 또는 다른 카운트 기반 함수를 제공할 수 있으며, 반면 시각적 분석기는 입자들의 각각의 범주 또는 하위범주에 대한 카운트, 농도, 비 또는 다른 농도 기반 파라미터를 제공할 수 있다.
본 명세서에서의 "비"에 대한 언급은 입자들의 2가지 범주/하위범주, 부류 또는 구성원의 임의의 정량적 및/또는 비례적인 비를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 그러한 비의 예에는 입자들의 농도, 중량을 기준으로 한 그리고/또는 입자들의 수를 기준으로 한 비가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 전형적으로, 이러한 비는 하나의 범주, 부류 또는 구성원의 카운트의 다른 하나의 그러한 범주, 부류 또는 구성원의 카운트에 대한 수치 분율에 관련된다. 일부 실시 형태에서는, 가중 카운트 또는 가중 및/또는 비례적인 비를 사용하여 결정이 또한 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시 형태들은 하이브리드 시스템 및 방법- 예를 들어, 이는 전자적 세포 카운팅 기술과 포토그래픽 세포 이미징 기술을 결합시킨 것임 - 을 포함하여, 예를 들어 전기적으로 구분하기가 어려울 수 있는 세포들을 분석하거나 또는 그의 정확한 전자적 카운트를 얻기가 어려운 양으로 존재하는 세포들을 분석한다.
본 발명은 또한 샘플에서의 시각적 구분을 신속하게 생성하기 위한 의외의 예기치 않은 입자 조영제 조성물에 관한 것이다. 입자 조영제 조성물은 자동화 유세포분석 시스템에서 특히 유용할 수 있다. 입자 조영제 조성물은 입자 조영제, 투과화제, 및 고정제의 배합으로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물은 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사포닌, 및 글루테르알데하이드의 혼합물이다. 의외로 효과적인 일 실시 형태에서, 염색 조건 하에서, 크리스탈 바이올렛은 약 7.8 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고, 뉴 메틸렌 블루는 약 735 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하고, 사포닌은 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하며, 본 조성물은 약 27 μM의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 에오신-Y를 추가로 포함하고, 글루테르알데하이드는 0.1% 이하의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다.
이들 예시적인 실시예는 본 명세서에 논의된 일반 주제에 대해 독자에게 소개하기 위해 제공되며, 개시된 개념의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 하기의 섹션들은 도면 - 여기서, 동일한 도면 부호는 동일한 요소를 나타냄 - 을 참고하여 다양한 추가의 특징 및 실시예를 기술하고, 안내 설명이 예시적인 실시 형태를 기술하기 위해 사용되지만, 이는 예시적인 실시 형태와 마찬가지로 본 발명을 제한하는 데 사용되어서는 안 된다. 본 명세서에서 이러한 예시들에 포함된 요소들은 축적대로 그려지지 않을 수 있다.
본 발명의 입자 조영제 조성물은, 혈액 유체 샘플에 적용될 때, 그러한 샘플에서의 세포들의 염색을 일으키는데, 이는 표준 혈액 도말 염색제로 처리된 혈액 도말의 것과 유사하며, 특히 라이트 염색제에 의한 혈액 도말 염색과 유사하다. 라이트 염색제는 혈구 유형들(예를 들어, WBC)의 감별을 용이하게 하는 조직학적 염색제이다. 이는 광학 현미경 하에서 조사되는 말초 혈액 도말 및 골수 흡인물을 염색하는 데 주로 사용된다. 세포유전학에서, 이는 증후군 및 질병의 진단을 용이하게 하기 위하여 염색체를 염색하는 데 사용된다. 완충 라이트 염색제, 라이트-김자 염색제, 및 완충 라이트-김자 염색제로서 알려진 관련 염색제들이 있다. 라이트 염색 과정은 알코올 용매를 포함하기 때문에, 이러한 염색 절차는 생존 세포들에 대해 파괴적이고 사실상 온전한 세포들을 생성하지 않는다. 더 강한 착색을 생성하는 메이-그륀발트(
Figure pct00001
) 염색제는 또한 수행하는 데 더 오랜 시간이 걸린다.
본 발명의 태양 및 실시 형태는, 예를 들어 염색제/염료 조성물 및/또는 이들의 조합을 포함한 소정의 입자 조영제 조성물이, 자동화 이미지-기반 샘플 분석, 예컨대 혈액 분석을 수행하는 데 사용될 때, 예기치 않은 특성 및 효능을 갖는다는 의외의 예기치 않은 발견에 기초한다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 많은 상이한 유형의 혈액학 이미징 시스템(hematology imaging system)과 함께 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 이미지-기반 샘플 분석, 예컨대 플로우셀 분석과 함께 사용될 수 있다. 그러한 플로우셀 분석의 일 예는 유세포분석의 전통적인 공지된 방법들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 유리하게는 하기에 간략하게 상술되고, 2014년 3월 17일에 동시출원된 출원 번호 __/___,___이며 발명의 명칭이 "혈액 샘플에서의 입자 분석을 위한 플로우셀 시스템 및 방법(Flowcell Systems And Methods For Particle Analysis In Blood Samples)"인 출원, 및 2014년 3월 17일에 동시출원된 출원 번호 PCT________이며 발명의 명칭이 "혈액학 시스템 및 방법(Hematology Systems and Methods)"인 출원에서 추가로 기술된 플로우셀 분석 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있으며, 이들 둘 모두는 본 명세서에서 참고로 포함된다.
입자 조영제 조성물
도 24는 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물의 제조의 개략도이다. 블록(208)에서, 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206)가 배합되어 입자 조영제 조성물(210)을 생성한다. 일 실시 형태에서, 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206)는 동시에 배합된다. 다른 실시 형태에서는, 임의의 순서대로, 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206) 중 하나가 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206) 중 다른 하나와 배합되고, 이어서 이는 입자 조영제(202), 투과화제(204), 및 고정제(206) 중 마지막 하나와 배합된다. 블록(208)에서의 배합은 임의의 순서대로 그리고 임의의 적합한 방법으로 수행될 수 있다.
대안적인 실시 형태에서, 투과화제(204) 및 고정제(206) 중 하나는 입자 조영제 조성물(210) 중에 포함되지 않는다. 또 다른 실시 형태에서는, 하기에 추가로 상술된 바와 같이, 추가 재료들이 입자 조영제 조성물(210)의 일부로서 블록(208)에서 배합된다.
입자 조영제 조성물(210)은 키트(kit)의 일부로서 제공될 수 있다. 입자 조영제 조성물(210)은 이미 제조된 상태로 제공되거나 하나 이상의 성분으로서 제공되어 이들 성분이 배합되어야 할 수도 있다.
입자 조영제
입자 조영제(202)는 가시적인 구분을 생성할 수 있는 임의의 조영제, 예컨대 라이트 염색제와 유사한 것들일 수 있다. 그러한 조영제의 예에는 하기가 포함된다: 알시안 블루(Alcian Blue) 및 알시안 블루 86(PAS 중성 및 산성 점액물질); 알리자린 레드(Alizarin Red) S; 알루라 레드(Allura Red) AC(아조염료 적색 염료 40호); 아날린 블루(Analine Blue)(옥살산으로 강화된 섬모(cilia)); 오라민(Auramine) O; 아주르(Azure) B; 아주르 C; 비스마르크 브라운(Bismarck Brown); 브릴리언트 블루(Brilliant Blue) FCF(쿠마시 블루(Comassie blue)); 브릴리언트 크레실 블루(Brilliant cresyl blue); 브릴리언트 그린(Brilliant green); 카르뮴(Carmium)(카르민산 및 칼륨 명반으로 이루어진 적색 핵 염료); 콩고 레드(Congo red); 클로로졸 블랙(Chlorozol black) E(핵 흑색, 세포 회색, 글리코겐 분홍색); 크레실 바이올렛 아세테이트; 다로우 레드(Darrow red); 에오신 블루이시(Eosin bluish); 에리트로신(Erythrosin) B(적색 염료 3호); 에틸 에오신(Ethyl eosin); 패스트 그린(Fast Green) FCF(녹색 염료 3호); 염기성 푹신(Fuchin basic)- (핵 및 편모); 플루오레세인(Fluorescein)- (머큐로크롬(Mercurochrome)); 김자- 말초 혈액 도말; 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin)- 퇴행성 핵 염색제(regressive nuclear stain); 인디고 카르민(Indigo Carmine)(청색 염료 2호); 야누스 그린(Janus Green) B(미토콘드리아); 제너(Jenner) 염색제- (말초 혈액 도말); 라이트 그린(Light Green) SF 옐로우이시(yellowish); 맥닐(MacNeal)- (테트라크롬 혈액 염색제); 말라카이트 그린(Malachite green); 메틸 오렌지(Methyl orange); 마르티우스 옐로우(Martius yellow); 마이어 헤마톡실린(Mayer's Hematoxylin)- 진행성 핵 염색제(progressive nuclear stain); 메틸 바이올렛(Methyl violet) 2B; 메테나민 은-페로이드산(Methenamine Silver-Peroidic acid); 메틸렌 바이올렛(Methylene violet); 메이 그륀발트- 혈액학적 염색제; MTT- 포르마잔 염색제; 뮤시카르민(Mucicarmine)- 1차 종양 염색제; 뉴트럴 레드(Neutral red); 니그로신(Nigrosin); 닐 블루(Nile Blue) A; 뉴클리어 패스트 레드(Nuclear Fast red) C.I. 60760; 나프탈(Napthal) AS; 니트로-블루 테트라졸륨(Nitro-Blue Tetrazolium)- 견뢰 포르마잔 염료; 오렌지(Orange) G; 오렌지 II; 오르세인(Orcein); 파파니콜라우(Papanicolaou) 염색제 EAS- 선명한 세포질 염색; 파라로사닐린(Pararosanilin); 파라로사날린(Pararosanaline); 페리오드산 시프(Periodic Acid Schiff)-(PAS, 특정 탄수화물 염색제); 필록신(Phyloxine) B; 프로타르골(Protargol) S; 피로닌(Pyronin) B; 피로닌 Y; 레사주린(Resazurin); 로마노우스키-김자(Romanowsky-Giemsa); 로즈 벵갈(Rose Bengal); 사프라닌 O; 수단 블랙(Sudan Black) B; 수단 III- (알파-나프톨에 의해 골수성 과립을 염색함); 수단 IV- 트라이글리세라이드를 염색함; 타르트라진(Tartrazine)- (아조 염료 황색 5호); 티오닌(Thionin)- 메타 염색질을 염색함; 트라이페닐 테트라졸륨(Triphenyl Tetrazolium); TTC- 포르마잔 적색 염료; 톨루이딘 블루(Toluidine Blue) O; 라이트 염색제- (종래의 혈액 도말을 위한 고정제, 완충제 및 염색제); 및 라이트 김자.
많은 노력과 실험을 통해, 본 명세서에서 추가로 상술된 바와 같이, 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사프라닌 O, 에오신 Y 및 메틸 그린 중 적어도 하나를 포함하는 입자 조영제(202)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 입자 조영제(202)는 이미지-기반 범주화 및 하위범주화를 위하여 생존 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들을 염색하기에 유효한 양으로 첨가된다. 입자 조영제(202)는 상기 언급된 입자 조영제들 중 2개 이상의 임의의 조합일 수 있다. 입자 조영제(202)는 생명유지 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들의 "라이트-유사" 염색된 이미지를 효과적으로 얻도록 선택될 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛을 포함한다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 1 μM 내지 약 100 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염색 조건 하에서"는 그 성분이 샘플과 혼합될 때를 지칭한다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 6 μM 내지 약 10 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 약 7.8 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 염색 조건 하에서 아주 거의 7.8 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 90% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 크리스탈 바이올렛은 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛 단독일 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 입자 조영제와 조합된 크리스탈 바이올렛일 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 뉴 메틸렌 블루를 포함한다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 70 μM 내지 약 2.4 mM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 500 μM 내지 약 950 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 약 735 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 염색 조건 하에서 아주 거의 735 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 70% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 뉴 메틸렌 블루는 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)가 크리스탈 바이올렛 및 뉴 메틸렌 블루 둘 모두를 포함하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성된다. 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비는 약 1:1 내지 약 1:500(몰농도/몰농도)일 수 있다. 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비는 약 1:50 내지 약 1:160(몰농도/몰농도)일 수 있다. 크리스탈 바이올렛 대 뉴 메틸렌 블루의 비는 약 1:90 내지 약 1:110(몰농도/몰농도)일 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 에오신 Y를 포함한다. 에오신 Y는 염색 조건 하에서 약 3 μM 내지 약 300 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신 Y는 염색 조건 하에서 약 10 μM 내지 약 50 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신 Y는 염색 조건 하에서 약 27 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신 Y는 염색 조건 하에서 아주 거의 27 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 에오신 Y는 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 에오신 Y는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 에오신 Y는 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)가 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 및 에오신 Y의 조합인 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성되며, 이들 각각은 전술된 바와 같은 농도 및 순도의 임의의 조합을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 구체적으로 약 7.8 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 크리스탈 바이올렛, 약 735 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 뉴 메틸렌 블루, 및 약 27 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 에오신 Y이다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 구체적으로 약 7.8 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 99% 순도 이상의 크리스탈 바이올렛, 약 735 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 99% 순도 이상의 뉴 메틸렌 블루, 및 약 27 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재하는 99% 순도 이상의 에오신 Y이다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 사프라닌 O를 포함한다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 1 μM 내지 약 100 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 3 μM 내지 약 30 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 약 9 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 염색 조건 하에서 아주 거의 9 μM을 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 사프라닌 O는 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 사프라닌 O는 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 사프라닌 O는 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다.
일 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 메틸 그린을 포함한다. 메틸 그린은 염색 조건 하에서 약 0.1 g/L를 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 메틸 그린은 염색 조건 하에서 아주 거의 0.1 g/L를 달성하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 메틸 그린은 80% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 메틸 그린은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도 이상으로 정제될 수 있다. 메틸 그린은 적어도 100% 순도로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입자 조영제(202)는 크리스탈 바이올렛, 뉴 메틸렌 블루, 사프라닌 O, 에오신 Y 및 메틸 그린 중 하나 이상을, 예를 들어 이미징을 위해 제공될 때 샘플 중의 입자들의 세포내 내용물 특징부를 증강시킴으로써 입자들에서의 시각적 구분을 생성하기에 유효한 양으로 포함한다. 입자 조영제(202)는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구뿐만 아니라 망상적혈구, 유핵 적혈구, 혈소판, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 또는 세포 단편의 세포하(subcellular) 구조를 증강 및/또는 염색하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 시각화가능한 또는 시각적 구분은 임의의 광원(예를 들어, UV, 가시광, IR)을 사용하여 시각화가능하거나 달리 검출가능할 수 있는 임의의 입자 특징부 또는 입자내(intraparticle) 특징부를 포함할 수 있다.
입자 조영제 조성물(210)이 2개 이상의 입자 조영제(202)들을 포함하는 실시 형태에서, 입자 조영제(202)들의 각각의 양은, 입자 조영제(202)들이 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분의 생성에 대해 독립적, 경쟁적 및/또는 증강 효과를 갖는지의 여부에 따라 적절히 조정될 수 있다.
투과화제
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 계면활성제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 사포닌을 포함할 수 있다. 대안적인 실시 형태에서, 투과화제(204)는 4차 암모늄 염, 비이온성 계면활성제, 및 쯔비터이온성 계면활성제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 투과화제는 세포내 내용물에 대한 입자 조영제(202)의 접근성을 증가시키도록 세포의 투과성을 변경시킬 수 있다. 투과화제는 신속한 1 단계 염색 절차를 허용하기에 충분한 양으로 선택되고 포함될 수 있다.
비이온성 계면활성제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: (1) 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리옥시에틸렌 에탄올에 대해 에테르화된 직쇄 지방족 소수성 물질을 포함한, 폴리옥시에틸렌 알킬 또는 아릴 에테르(폴리에톡실레이트), 예를 들어 브리즈(Brij)(등록상표) 35; (2) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에테르화된 분지쇄 지방족/방향족(예를 들어, 옥틸페놀) 소수성 물질, 예를 들어 트리톤(Triton) X(등록상표)-100; (3) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에테르화된 직쇄 지방족/방향족(예를 들어, n-노닐페놀) 소수성 물질, 예를 들어 아이게팔(Igepal)(등록상표) C0897; 및 (4) 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에스테르화된 직쇄 지방족(예를 들어, 카르복실산) 소수성 물질, 예를 들어 미르즈(Myrj)(등록상표) 53, 및 기타. 비이온성 폴리옥시에틸렌 알킬 또는 아릴 에테르(폴리에톡실레이트) 계면활성제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: 폴리옥시에틸렌(4) 라우릴 에테르(브리즈(등록상표) 30); 폴리옥시에틸렌(23) 라우릴 에테르(브리즈(등록상표) 35); 폴리옥시에틸렌(2) 세틸 에테르(브리즈(등록상표) 52); 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르(브리즈(등록상표) 58); 폴리옥시에틸렌(2) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 72); 폴리옥시에틸렌(10)스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 76); 폴리옥시에틸렌(20) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 78); 폴리옥시에틸렌(2) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 92); 폴리옥시에틸렌(10) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 96); 폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르(브리즈(등록상표) 98); 폴리옥시에틸렌(21) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 721); 폴리옥시에틸렌(100) 스테아릴 에테르(브리즈(등록상표) 700); 및 기타. 비이온성 계면활성제의 추가 예에는 트리톤 X(등록상표)-100(비환원 또는 환원됨), 트리톤(등록상표)X-114(비환원 또는 환원됨), 트리톤 X(등록상표)-165, 및 트리톤 X(등록상표)-305(비환원 및 환원됨), 및 기타가 포함될 수 있다.
일 실시 형태에서, 투과화제(204)는 염색 조건 하에서 약 0.10 g/L 내지 약 0.20 g/L 의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 브리즈(등록상표) 35를 포함할 수 있다. 브리즈(등록상표) 35는 염색 조건 하에서 약 0.10 g/L 내지 약 0.16 g/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 브리즈(등록상표) 35는 약.012 g/L 내지 약 0.14 g/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
쯔비터이온성 계면활성제의 예에는 TDAPS(테트라데실다이메틸암모니오프로판설포네이트), CHAPSO(3-[(3-콜아미도프로필) 다이메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트), 약 12 내지 약 16개의 탄소 원자를 갖는 알킬 N, N-다이메틸 N-옥사이드, 라우릴 다이메틸아민 N-옥사이드(LO), DDAPS(N-도데실-N, N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트), 및 기타가 포함될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 적혈구를 용해시키기에 충분한 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 망상적혈구 또는 유핵 적혈구 이외의 적혈구를 용해시키기에 충분한 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 백혈구, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 혈소판, 및 다른 세포가 사실상 온전하게 유지되어 있는 동안에 적혈구를 용해시키기에 충분한 작용제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 백혈구, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 및/또는 혈소판의 구성원 및/또는 핵막이 더 투과성 및/또는 다공성이게 하여 입자 조영제(202)에 의한 접근을 용이하게 한다.
일부 실시 형태에서, 투과화제(204)는 입자 조영제(202)가 샘플 내의 세포들로 진입될 수 있게 하는 데 필요한 기공 또는 개구부를 신속히 생성할 수 있도록 선택된다.
많은 노력과 실험을 통해, 미국 플로리다주 포트 라우더데일 소재의 클리니컬 다이아그노스틱 솔루션즈(Clinical Diagnostic Solutions)(CDS)로부터 입수가능한 5PD-라이틱(Lytic)을 포함하는 투과화제(204)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 5PD-라이틱은 사포닌을 포함한다. 5PD-라이틱은 개괄적으로 미국 특허 제6,632,676호에 기술되어 있으며, 이 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다.
많은 노력과 실험을 통해, 염색 조건 하에서 약 10 mg/L 내지 약 1000 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재하는 사포닌을 포함하는 투과화제(204)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 일부 실시 형태에서, 사포닌은 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L의 농도가 되도록 하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 실시 형태에서, 사포닌은 4차 암모늄-치환된 사포닌 에테르일 수 있다.
고정제
일부 실시 형태에서, 고정제(206)는 염색 및 이미징 동안 백혈구가 분해되지 않음을 보장하도록 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 고정제(206)는 다른 세포들 및 세포 구조들이 분해되지 않음을 보장할 수 있다. 고정제의 예에는 하기가 포함될 수 있다: 글루타르알디드; 포름알데하이드; 가교결합제; 등장 식염수 중 암모니아 피크레이트(예를 들어, 메틸렌 블루 염색용); 에틸 알코올; 메탄올(예를 들어, 실온, - 20℃ 또는 -70℃에서); 하이덴하인의 수사(Heidenhain's Susa) ― HgCl2, NaCl 트라이클로로아세트산, 포르말린; 보우인(Bouin) 고정제 ― 피크르산, 포르말린, 아세트산; 두보섹-브라질(Duboseq-Brazil) ― 80% EtOH를 갖는 보우인 고정제; 카르노이(Carnoy) 고정제 ― EtOH, 클로로포름, 아세트산; 젠커(Zenker) 고정제 ― HgCl2, K2CrO7, NaSO4.H2O; 아세토카르민; 가텐스비(Gatensby) 고정제 ― 크롬산, 사산화오스뮴, NaCl; 베이커(Baker) 고정제 ― 포르말린, CaCl2; 스미스(Smith) 고정제 ― K2Cr2O7, 포르말린, 아세트산; 1% 메틸 그린, 1% 아세트산; 페놀, 포르말린, 글리세롤, 겐티안 바이올렛(Gentian violet); 샤우딘(Schaudin) ― HgCl2, EtOH, 아세트산; 챔피(Champy) 고정제 ― 크롬산, K2CrO7, OsO4; 플레밍(Fleming) 고정제 ― 크롬산, OsO4, 아세트산; 포르몰-은(Formol-Silver) ― 포름알데하이드, AgNO3; 스트렉(Streck) 조직 고정제 ― 브로노폴, 다이아졸리디닐 우레아, ZnSO4.7H2O, 소듐 시트레이트; PBS 중 1% 이미다졸리디닐 우레아; 글리옥살: 글리오픽스(Glyofix), 프레퍼(Prefer), 세이프픽스(Safefix), 히스토초이스(Histochoice); 글리단트-하이단토인(Glydant- Hydantoin); 다이메틸올 우레아; 소듐 하이드록시메틸글리시네이트; 카르노브스키(Karnovsky) 고정제; 염화제2수은(B-5); 홀란데(Hollande) 고정제; 및 기타. 게다가, 적합한 예시적인 고정제는 하기 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 고정제(206)는 산화제, 수은제, 피크레이트, 헤페스-글루탐산 완충제-매개 유기 용매 보호 효과(hepes-glutamic acid buffer-mediated organic solvent protection effect, HOPE) 고정제, 또는 수용성 방부제일 수 있다. 산화제의 예에는 중크롬산칼륨, 크롬산, 과망간산칼륨, 및 기타가 포함된다. 수은제의 예에는 B-5, 젠커 고정제, 및 기타가 포함된다. 수용성 방부제의 예에는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 다이메틸올우레아, 2-피리딘티올-1-옥사이드, 소르브산, 소르브산칼륨, 및 기타가 포함된다.
많은 노력과 실험을 통해, 글루테르알데하이드 및 포름알데하이드 중 적어도 하나를 포함하는 고정제(206)를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
일부 실시 형태에서, 글루테르알데하이드를 0.1 중량% 이하로 포함하는 고정제(206)를 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
추가 성분
일부 실시 형태에서, 선택적 추가 성분(212)들이 선택적으로 블록(208)에서 입자 조영제 조성물(210) 내로 배합될 수 있다. 추가 성분(212)들의 예에는 완충제 성분, 점도 개질제, 항미생물제, 삼투압 조정제, 이온 강도 개질제, 계면활성제, 킬레이트화제, 및 기타가 포함될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 입자 조영제 조성물(210)이 인산염 완충 식염수를 포함하는 경우에 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
예시적인 점도 개질제에는 하기가 포함된다: 천연 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 카라기난, 로커스트 빈 검(locust bean gum), 구아 검, 및 젤라틴; 당(및 유도체), 예컨대 덱스트로스, 프룩토스; 폴리덱스트로스; 덱스트란; 폴리덱스트란; 당류(saccharide); 및 다당류(polysaccharide); 반합성 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스; 합성 친수콜로이드(및 유도체), 예컨대 카르보폴(Carbopol)(등록상표); 및 점토(및 유도체), 예컨대 벤토나이트 및 비검(Veegum)(등록상표).
신속한 1 단계 염색 과정
도 25는 일 실시 형태에 따른 신속한 1 단계 염색 과정(300)의 흐름도이다. 신속한 1 단계 염색 과정(300)은 여러 하위단계들을 포함할 수 있지만, 용어 "1 단계"는 샘플이 염색 절차 동안 다수의 상이한 용액들에 도입될 필요가 없음을 나타내는 데 사용된다. 도 24를 참고하여 전술된 바와 같이, 입자 조영제 조성물(210)이 블록(302)에서 제조된다. 선택적으로, 일부 실시 형태에서, 성분들, 예컨대 임의의 입자 조영제(202)들이 블록(306)에서 정제될 수 있다. 입자 조영제(202)들의 정제는 샘플과의 접촉시에 형성된 침전물의 수준을 감소시키며, 그럼으로써 백그라운드를 감소시키고 이미지-기반 혈액 샘플 분석의 결과를 개선할 수 있으며, 아울러 이미지 또는 슬라이드의 추가의 재검토, 또는 수동으로 준비된 현미경법에 대한 필요성이 감소된다.
블록(308)에서, 입자 조영제 조성물(210)은 샘플과 배합된다. 입자 조영제 조성물(210)은, 함께 혼합하는 것을 포함한 임의의 적합한 방식으로 샘플과 배합될 수 있다. 블록(308)에서의 배합은, 샘플을 소정량의 입자 조영제 조성물(210)을 사용하여 희석시키는 것을 포함할 수 있다. 샘플은 입자 조영제 조성물(210)을 사용하여 희석될 수 있다. 희석량은 이미지-기반 분석 동안 프레임당 최적의 세포수를 제공하도록 선택될 수 있다. 희석량은 이미지-기반 분석 동안 프레임당 최적의 백혈구 수를 제공하도록 선택될 수 있다. 희석량은 임의의 다른 이미지-비기반 분석에 대해 최적 부피를 제공하도록 달리 선택될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 약 2:1 내지 약 20:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비를 사용하여 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비는 약 3:1 내지 약 10:1일 수 있다. 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비는 약 3:1 내지 약 4:1일 수 있다. 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비는 약 3:1 또는 약 4:1일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 아주 거의 3:1 또는 아주 거의 4:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 비를 사용하여 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
입자 조영제를, 10:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 희석비를 갖고서, 40 mL의 5PD-라이틱 및 50 mL의 인산염 완충 식염수와 함께 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 입자 조영제를, 5:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 희석비를 갖고서, 40 mL의 5PD-라이틱, 추가 사포닌, 및 40 mL의 인산염 완충 식염수와 함께 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 입자 조영제를, 4:1의 입자 조영제 조성물(210) 대 샘플의 희석비를 갖고서, 40 mL의 5PD-라이틱, 추가 사포닌, 및 36 mL의 인산염 완충 식염수와 함께 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 승온, 예컨대 인큐베이팅과 관련하여 하기에 기재된 온도들 중 임의의 온도에서 입자 조영제 조성물(210)과 배합된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 배합된 샘플 및 입자 조영제 조성물(210)은 샘플 혼합물로 지칭된다.
블록(310)에서, 샘플 혼합물은 소정 온도에서 소정 시간 동안 인큐베이팅된다. 인큐베이션은 세포들 또는 그들의 내부 구조의 투과성을 증가시킬 수 있어서, 입자 조영제(202)가 세포들 또는 세포 구조들을 더 잘 침윤시킬 수 있게 한다. 인큐베이션의 시간 및 온도는 입자 조영제 조성물(210)이 샘플을 적절히 투과하고, 고정시키고, 염색할 수 있도록 선택될 수 있다. 인큐베이션의 시간 및 온도는 백혈구, 혈소판, 및 유핵 적혈구를 사실상 온전하게 유지하면서 적혈구의 용해를 보장하도록 선택될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 약 1 내지 60초 동안 약 37℃ 내지 약 60℃의 온도에서의 샘플 혼합물의 인큐베이션에 의해 입자 조영제 조성물(210)의 일부 실시 형태에서 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다. 샘플 혼합물은 약 46℃ 내지 약 49℃의 온도로 가열될 수 있다. 샘플 혼합물은 40 내지 50초 동안 인큐베이팅될 수 있다. 샘플 혼합물은 최대 1시간 인큐베이팅될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 약 45초 동안 약 48℃에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 약 45초 동안 약 47℃에서 샘플 혼합물을 인큐베이팅함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 블록(308)에서의 배합 및 블록(310)에서의 인큐베이팅은, 샘플 혼합물이 이미징 장치에서 처리되고 그러한 이미징 장치의 라인들이 플러싱 및/또는 세정되는 데 걸리는 시간과 대략적으로 동일한 시간이나 그보다 적은 시간 내에 완료된다. 이러한 방식으로, 제2 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅되고 있는 동안에 제1 샘플 혼합물이 이미징될 수 있다. 일단 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제2 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있다.
대안적인 실시 형태에서, 블록(308)에서의 배합 및 블록(310)에서의 인큐베이팅은 샘플 혼합물이 이미징 장치에서 처리되고 그러한 이미징 장치의 라인들이 플러싱 및/또는 세정되는 데 걸리는 시간의 2배 미만 내에 완료된다. 이러한 방식으로, 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 있는 동안에, 제2 샘플 혼합물이 이미징될 준비를 할 수 있고, 제3 샘플 혼합물 및 제4 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅되는 과정에 있을 수 있다. 일단 제1 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제2 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있다. 제3 샘플 혼합물은 그의 배합 및 인큐베이팅을 종료하는 중일 수 있고, 제4 샘플 혼합물은 여전히 배합 및 인큐베이팅하는 중일 수 있다. 일단 제2 샘플 혼합물이 이미징되고 이미징 장치가 세정되었으면, 제3 샘플 혼합물이 즉시 이미징될 수 있으며, 이 동안에 제4 샘플 혼합물은 배합 및 인큐베이팅을 종료하기 시작하고, 제5 샘플 혼합물이 배합 및 인큐베이팅을 시작한다. 이 과정은 샘플 혼합물을 연속적으로 이미징하도록 무한히 계속될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 입자 조영제 조성물(210)의 소정 실시 형태, 입자 조영제 조성물(210)을 샘플과 배합하는 소정 방식, 및 샘플 혼합물을 인큐베이팅하는 소정 방식의 조합을 통해 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
구체적으로, 염색 조건 하에서 약 7.8 μM인 90% 순도 이상의 크리스탈 바이올렛, 염색 조건 하에서 약 735 μM인 70% 순도 이상의 뉴 메틸렌 블루, 염색 조건 하에서 약 27 μM인 80% 순도 이상의 에오신-Y, 염색 조건 하에서 약 50 mg/L 내지 약 750 mg/L인 사전처리된 사포닌, 및 염색 조건 하에서 약 0.1% 이하인 글루테르알데하이드를 포함하는 입자 조영제 조성물(210)을 사용함으로써 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있는데, 여기서 입자 조영제(210)는 샘플과 약 3:1 내지 약 4:1의 입자 조영제(210) 대 샘플의 비로 배합되고; 생성된 샘플 혼합물은 약 45초 동안 약 48℃에서 인큐베이팅된다.
소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는, 비알코올계 용매 시스템 중 염료를 사용하여 자동화 시각적 분석기에 의해, 생명유지 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들의 "라이트-유사" 염색된 이미지가 효과적으로 얻어질 수 있게 한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 다양한 세포 성분, 핵엽(nuclear lobe), 및 과립 구조가 명백히 구분가능하도록 샘플들의 신속한 염색을 가능하게 한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 초생체(supravital) 염색에 적합하다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성한다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 혈청, 뇌척수액, 흉막액, 활액, 정액, 복수, 양수, 세척액(lavage fluid), 골수 흡인액, 침출물, 삼출물, 또는 혈액 샘플 중의 입자들의 세포내 내용물 특징부를 증강시키는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 혈소판, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 원주(cast), 세균, 상피, 및/또는 기생충을 염색하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는, 예를 들어 세포들 내의 1차 및 2차 과립의 감별 염색(differential staining)을 제공함으로써, 입자의 범주화 및 하위범주화를 위한 시각적 구분을 생성하는 데, 예컨대 1차 및 2차 과립의 감별 염색 또는 증강에 기반한 미성숙 과립구들의 하위범주화 및 그들의 수명(age) 결정에 도움을 주는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 적혈구, 망상적혈구, 유핵 적혈구, 및 혈소판의 카운팅 및 특성화를 위한, 뿐만 아니라 백혈구 감별 카운팅 및 백혈구 특성화 및 분석을 위한 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 생명유지 및/또는 생존 세포들 및/또는 사실상 온전하게 유지된 구조를 갖는 세포들에서 시각적 구분을 생성하는 데 효과적이다. 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차는 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구뿐만 아니라 망상적혈구, 유핵 적혈구, 혈소판, 아세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 또는 세포 단편의 세포하 구조를 염색하는 데 효과적이다.
본 명세서에 기재된 소정의 효과적인 입자 조영제 조성물(210) 및 염색 절차에 의해 가능한 신속한 염색은 수동 또는 반자동 이미징 및/또는 분석 절차와 함께 사용될 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 비알코올계 용매 시스템 중 입자 조영제들을 포함하는 입자 조영제 조성물(210)의 소정 실시 형태에 의해 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었는데, 이러한 실시 형태는, 본 발명자들이 알고 있는 한 최초로, 생명유지 세포들 및/또는 사실상 온전한 세포들의 "라이트-유사" 염색 이미지를 생성할 수 있으며, 이러한 이미지에 의해 다양한 세포 성분, 핵엽, 및 과립 구조를 밝혀내고 이들 입자 및/또는 세포 특징부들을 시각적으로 구분할 수 있다.
많은 노력과 실험을 통해, 실시 염색 시약이, 40 mL의 뉴 메틸 블루 및 5 mL의 크리스탈 바이올렛을 혼합함으로써 제조된, 표 a1에 열거된 바와 같이 구성된 입자 조영제 조성물(210)을 사용할 때, 의외로 효과적인 결과가 달성될 수 있음을 알아내었다.
[표 a1]
Figure pct00002
도 26은 표 a1에 기재된 입자 조영제 조성물(210)로 염색되고 상기에 기재된 신속한 1 단계 염색 절차를 사용하여 염색된 샘플로부터 선택된 백혈구들의 대표적인 예시이다. 이들 백혈구는 온전하고 라이트 염색제의 염색 특성을 나타낸다. 다양한 유형의 백혈구(예를 들어, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구 등)가 시각적으로 감별가능하다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 입자 조영제 조성물에 의해 염색된 세포들의 특징부들이 표 a2에 기재되어 있다.
[표 a2]
Figure pct00003
소정 실시 형태에서, 염색제/염료 조성물은 안정성, 저장 용이성, 처분, 및/또는 제한된 독성을 위해 제형화된다.
도 27은 일 실시 형태에 따른 입자 조영제 조성물(210)로 염색된 샘플로부터 선택된 백혈구들의 대표적인 예시로서, 이에는 수동 습식 마운트 이미징 및 자동 유동 이미징을 통해 이미징된 세포들이 포함된다.
초기 실험
하기의 실시예를 참고하여 설명된 바와 같이, 전술된 실시 형태들을 생성하기 위하여 다수의 염색 조성물 및 방법을 시험하고 변형시켰다.
초기 실시예 1에서는, 2 단계 염색 방법이 나타나 있는데, 이 방법에서는 샘플과 입자 조영제 조성물의 초기 실시 형태를 배합하고 47.5℃에서 40초 동안 인큐베이팅하고, 이어서 켄칭 시약을 샘플 혼합물에 적용하였다. 이 입자 조영제 조성물은 컬터 LH 시리즈 희석제, 컬터 라이즈 S III 디프 라이틱 시약(Lyse S III diff Lytic Reagent), 컬터 LH 시리즈 팩(Pak) 시약 키트, 및 컬터 LH 시리즈 레틱 팩(RETIC PAK) 시약 키트를 포함하였다. 결과가 도 28에서 보여진다.
실시예 1 후에의 초기 실시예 2에서는, 실시예 1의 2 단계 염색 방법을 1 단계 염색 방법으로 대체하였다. 실시예 1의 결과와 비교하여 호염기구의 개선된 결과가 도 29에서 보여진다.
초기 실시예 3에서는, 글루테르알데하이드를 포함하지 않는 입자 조영제 조성물이 약화된 백혈구를 생성하였으며, 이러한 백혈구는 플로우셀에서의 전단력으로 인해 부서졌을 것이다. 손상된 막을 보여주는 실시예 3의 결과의 이미지가 도 30에 도시되어 있다.
실시예 3 후에의 초기 실시예 4에서는, 입자 조영제 조성물에 글루테르알데하이드를 첨가하였다. 백혈구 막은 실시예 4에서 더 온전하였지만, 핵막은 여전히 손상되었다. PIOAL에 대해 조정을 실시하여 글리세롤 함량을 감소시킨 후에는, 백혈구들의 형태가 도 31에 도시된 바와 같이 이미징 동안 거의 변하지 않았다.
뉴 메틸렌 블루 및 크리스탈 바이올렛의 입자 조영제 조성물을 사용하는 2 염료 염색제에 의한 초기 실시예들에서는, 호산구를 제외하고는 대부분의 세포 유형이 잘 구분가능하였는데, 호산구는, 도 32에 도시된 바와 같이, 다소 일관성이 없었으며 호중구와 구분하는 것이 항상 용이한 것은 아니었다. 후속 실시예 5 및 실시예 6에서는, 제3 입자 조영제를 입자 조영제 조성물에 첨가하였다.
실시예 5에서는, 메틸 그린을 입자 조영제 조성물에 첨가하였다. 메틸 그린은 호산구를 더 잘 염색하도록 도와주었지만, 세포들의 핵은 원하는 자색으로 더 이상 염색되지 않고 청색으로 염색된다. 도 33은 실시예 5의 호중구의 이미지를 도시하는데, 여기서는 핵은 청색으로 염색되어 있지만 과립 세부 모습은 상실하였다.
실시예 6에서는, 입자 조영제 조성물 중의 제3 입자 조영제로서 메틸 그린 대신에 에오신-Y를 사용하였다. 도 34에서 보여지는 바와 같이, 에오신-Y는 핵의 자색 염색을 유지하였으며, 과립은 약간 오렌지색으로 빛나면서 일관성 있게 염색된다.
상기에 언급된 실험 및 추가 실험을 통해, 개시된 실시 형태 및 청구된 실시 형태가 우선적인 결과를 제공하는 것으로 판명되었다.
본 명세서에 기술된 각각의 계산 또는 작동은 하드웨어, 소프트웨어, 및/또는 펌웨어를 갖는 컴퓨터 또는 다른 프로세서를 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 방법 단계들은 모듈에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 모듈은 본 명세서에 기술된 방법 단계들을 수행하도록 배열된 임의의 매우 다양한 디지털 및/또는 아날로그 데이터 처리 하드웨어 및/또는 소프트웨어를 포함할 수 있다. 이러한 모듈은 선택적으로 데이터 처리 하드웨어를 포함하는데, 이러한 데이터 처리 하드웨어는 그와 관련된 적절한 기계 프로그래밍 코드를 가짐으로써 이들 단계 중 하나 이상을 수행하도록 구성되며, 둘 이상의 단계(또는 둘 이상의 단계 중 일부)를 위한 모듈은 임의의 매우 다양한 분산형 및/또는 통합형 처리 아키텍처 내의 상이한 프로세서 보드들로 분리되거나 또는 단일 프로세서 보드 내에 통합된다. 이들 방법 및 시스템은 종종 전술된 방법 단계들을 수행하기 위한 명령어들을 갖는 기계 판독가능 코드를 구현하는 유형적 매체를 채용할 것이다. 적합한 유형적 매체는 메모리(휘발성 메모리 및/또는 비휘발성 메모리를 포함함), 저장 매체(예컨대, 플로피 디스크, 하드 디스크, 테이프 등 상에의; CD, CD-R/W, CD-ROM, DVD 등과 같은 광학 메모리 상에의; 또는 임의의 다른 디지털 또는 아날로그 저장 매체 상에의 자기 기록) 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 논의된 모든 특허, 특허 공보, 특허 출원, 학술지 기사, 서적, 기술 참고 문헌 등이 모든 목적들을 위해 그들 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
전술되거나 도면에 도시된 구성요소들뿐만 아니라 도시되거나 기술되지 않은 구성요소들 및 단계들의 상이한 배열들도 가능하다. 유사하게, 일부 특징들 및 하위조합들이 유용하며, 다른 특징들 및 하위조합들에 상관없이 채용할 수 있다. 본 발명의 실시 형태들은 예시적인 그러나 비제한적인 목적을 위해 기술되었으며, 대안적인 실시 형태들이 본 특허의 독자들에게 명백해질 것이다. 소정의 경우에, 방법 단계들 또는 동작들이 상이한 순서대로 수행 또는 실행될 수 있거나, 동작들이 추가, 삭제 또는 변형될 수 있다. 본 발명의 소정 태양에서는, 요소 또는 구조를 제공하거나 주어진 기능 또는 기능들을 수행하기 위하여, 단일 구성요소가 다수의 구성요소들로 대체될 수 있고, 다수의 구성요소들이 단일 구성요소로 대체될 수 있음이 이해될 수 있다. 그러한 치환이 본 발명의 소정 실시 형태를 실시하도록 작용하지 않게 될 경우를 제외하고는, 그러한 치환은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명은 전술되거나 도면에 도시된 실시 형태들로 제한되지 않으며, 하기의 특허청구범위의 범주로부터 벗어나지 않고서 다양한 실시 형태 및 변형이 이루어질 수 있다.

Claims (11)

  1. 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱(combined viscosity and geometric hydrofocusing)을 위해 구성된 입자 분석 시스템을 사용하여, 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중에 포함된 복수의 입자들을 이미징하기 위한 방법으로서,
    플로우셀(flowcell)의 유로를 따라 시스 유체(sheath fluid) - 상기 시스 유체는 사전결정된 점도 차이 범위 내의 일정 점도 차이만큼 상기 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 가짐 - 를 유동시키는 단계;
    상기 플로우셀 내의 상기 유동하는 시스 유체 내로 상기 혈액 유체 샘플을 주입하여, 시스 유체에 의해 봉입(envelope)된 샘플 유체 스트림을 제공하도록 하는 단계;
    상기 샘플 유체 스트림 및 상기 시스 유체를 유로 크기의 감소부를 통해 이미징 영역을 향해 유동시켜서, 점도 차이와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 스트림 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과가, 상기 유로 크기의 감소부와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 스트림 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 샘플 유체 스트림 내의 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 상기 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 상기 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하는 데 효과적이도록 하는 단계; 및
    상기 이미징 영역에서 상기 복수의 입자들을 이미징하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중의 복수의 입자들을 이미징하기 위한, 사전결정된 점도 차이 범위 내의 일정 점도 차이만큼 샘플 유체 점도와 상이한 시스 유체 점도를 갖는 시스 유체와 함께 사용하기 위한 시스템으로서,
    유로 - 상기 유로는 유로 크기의 감소부를 구비함 - 및 샘플 유체 주입관을 갖는 플로우셀;
    상기 플로우셀의 유로를 따라 상기 시스 유체의 유동을 전송하도록 하기 위해 플로우셀의 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구;
    상기 시스 유체 및 상기 샘플 유체가 상기 유로 크기의 감소부를 통해 이미징 영역을 향해 유동함에 따라, 점도 차이와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과가, 유로 크기의 감소부와 관련된 시스 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 샘플 유체 스트림 내의 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 상기 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 상기 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하도록, 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 혈액 유체 샘플의 유동을 주입하도록 하기 위해 플로우셀의 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 샘플 입구; 및
    상기 이미징 영역에서 상기 복수의 입자들을 이미징하는 이미징 디바이스를 포함하는, 시스템.
  3. 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱 분석기에서 사용하기 위한 입자 및 세포내 세포소기관 정렬 액체(particle and intracellular organelle alignment liquid, PIOAL)로서, 상기 PIOAL은 시각적 분석기의 협소화(narrowing) 플로우셀 전이 구역 내로 주입되는 주어진 점도의 혈액 샘플 유체의 유동을 지향시켜 PIOAL에 의해 봉입된 샘플 유체 스트림을 생성하도록 하고, 상기 PIOAL은
    상기 혈액 샘플 유체의 점도보다 더 높은 점도를 갖는 유체를 포함하며,
    여기서 점도 차이와 관련된 PIOAL 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 점도 하이드로포커싱 효과가, 상기 협소화 플로우셀 전이 구역과 관련된 PIOAL 유체와 샘플 유체 사이의 상호작용에 의해 유도된 기하학적 하이드로포커싱 효과와 조합하여, 샘플 유체 스트림 내의 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, PIOAL 내의 점도제가 상기 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 상기 시각적 분석기의 이미징 영역에서 복수의 입자들 중 적어도 일부에 표적 이미징 상태를 제공하는 데 효과적인, PIOAL.
  4. 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중의 복수의 세포들 - 상기 세포들은 대향하는 주 표면들을 가짐 - 을 분석하기 위한 방법으로서,
    플로우셀의 유로를 따라 시스 유체 - 상기 시스 유체는 상기 샘플 유체 점도보다 더 높은 시스 유체 점도를 가짐 - 를 유동시키는 단계;
    상기 플로우셀 내의 상기 유동하는 시스 유체 내로 상기 혈액 유체 샘플을 주입하는 단계 - 상기 복수의 세포들은 이미징 경로의 배향에 대해 횡방향으로 배향되는 주 표면들을 갖는 제1 하위세트를 포함함 -;
    이미징 영역에서 상기 이미징 경로를 따라 입자들을 이미징하는 단계 - 상기 이미징하는 동안에 상기 복수의 세포들은 상기 이미징 경로에 대해 횡방향으로 배향되는 주 표면들을 갖는 제2 하위세트를 포함하며, 상기 제2 하위세트는 상기 제1 하위세트보다 더 많음 -; 및
    상이한 점도와 관련된 상기 시스 유체와 상기 샘플 유체 사이의 상호작용이 상기 복수의 세포들 중 적어도 일부를 재배향시켜 상기 제2 하위세트가 상기 제1 하위세트보다 더 많아지도록, 유로 크기의 감소부를 통해 상기 혈액 유체 샘플 및 상기 시스 유체를 지향시키는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 샘플 유체 점도를 갖는 혈액 유체 샘플 중의 복수의 세포들 - 상기 세포들은 대향하는 주 표면들을 가짐 - 을 이미징하기 위한, 상기 샘플 유체 점도보다 더 높은 시스 유체 점도를 갖는 시스 유체와 함께 사용하기 위한 시스템으로서,
    유로 및 샘플 유체 주입관을 갖는 플로우셀;
    상기 플로우셀의 유로를 따라 상기 시스 유체의 유동을 전송하도록 하기 위해 플로우셀의 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구; 및
    복수의 주입된 세포들이 이미징 경로의 배향에 대해 횡방향으로 정렬되는 주 표면들을 갖는 제1 하위세트를 포함하도록, 상기 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 상기 혈액 유체 샘플의 유동을 주입하도록 하기 위해 플로우셀의 주입관과 유체 연통하는 혈액 유체 샘플 입구를 포함하고,
    상기 플로우셀의 유로는 상이한 점도와 관련된 시스 유체와 혈액 샘플 유체 사이의 상호작용이 입자들 중 적어도 일부를 재배향시키도록 구성된 유로 크기의 변화를 갖는 구역을 갖고, 그리고
    이미징 영역에서 상기 이미징 경로를 따라 복수의 입자들을 이미징하고, 상기 이미징하는 동안에 복수의 세포들의 제2 하위세트의 주 표면들은 이미징 경로에 대해 횡방향으로 배향되는, 시스템.
  6. 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 위해 구성된 입자 분석 시스템을 사용하여, 혈액 유체 샘플 중에 포함된 입자들을 이미징하기 위한 방법으로서,
    상기 입자 분석기의 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체 - 상기 시스 유체는 상기 혈액 유체 샘플의 점도와 상이한 점도를 가짐 - 를 주입하는 단계;
    상기 혈액 유체 샘플을 일정 유량으로 샘플 유체 주입관으로부터 상기 플로우셀 내의 상기 유동하는 시스 유체 내로 주입하여, 상기 주입관에 인접하여 제1 두께를 갖는 샘플 유체 스트림을 제공하도록 하는 단계 - 상기 플로우셀의 유로는 상기 샘플 유체 스트림의 두께가 상기 초기 두께로부터 이미지 캡처 영역에 인접하여 제2 두께로 감소되도록 한 유로 크기의 감소부를 가짐 -; 및
    상기 플로우셀의 상기 이미지 캡처 영역에서 상기 샘플로부터의 제1 복수의 상기 입자들을 이미징하는 단계를 포함하며,
    상기 유로 크기의 감소부는, 근위 두께를 갖는 근위 유로 부분, 및 상기 근위 두께보다 더 작은 원위 두께를 갖는 원위 유로 부분에 의해 한정되고,
    상기 샘플 유체 주입관의 하류 단부가 상기 근위 유로 부분에 대해 원위에 위치되고,
    상기 시스 유체와 상기 혈액 유체 샘플 사이의 점도 차이는, 상기 유로 크기의 감소부 및 상기 샘플의 유량과 조합하여, 세포들이 샘플 유체 주입관으로부터 이미지 캡처 영역으로 이동함에 따라 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 샘플 중의 세포들을 샘플 유체 주입관으로부터 이미지 캡처 영역으로 4초 이내에 전달하기에 효과적인, 방법.
  7. 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 조합된 점도 및 기하학적 하이드로포커싱을 수행하는 입자 분석 시스템으로서,
    시스 유체 - 상기 시스 유체는 상기 혈액 유체 샘플의 점도와 상이한 점도를 가짐 - 의 유동을 전송하도록 구성된 유로를 갖는 플로우셀;
    상기 유로와 유체 연통하고, 상기 샘플을 상기 플로우셀 내의 상기 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 주입관에 인접하여 제1 두께를 갖는 샘플 유체 스트림을 제공하도록 구성된 샘플 유체 주입 시스템 - 상기 플로우셀의 유로는 상기 샘플 유체 스트림의 두께가 상기 초기 두께로부터 이미지 캡처 영역에 인접하여 제2 두께로 감소되도록 한 유로 크기의 감소부를 가짐 -;
    상기 플로우셀의 상기 이미지 캡처 영역에서 상기 샘플 유체로부터의 복수의 상기 입자들을 이미징하도록 하기 위해 이미지 캡처 영역과 정렬된 이미지 캡처 디바이스; 및
    상기 샘플 유체 주입기 시스템 및 상기 이미지 캡처 디바이스와 커플링된 프로세서를 포함하고, 상기 프로세서는 상기 샘플 유체를 샘플 유량으로 상기 유동하는 시스 유체 내로 주입하는 것을 개시하도록 구성되어, 상기 시스 유체와 상기 혈액 유체 샘플 사이의 점도 차이가, 상기 유로 크기의 감소부 및 상기 샘플의 유량과 조합하여, 세포들이 샘플 유체 주입관으로부터 이미지 캡처 영역으로 이동함에 따라 세포들이 샘플 유체 스트림으로부터 유동하는 시스 유체 내로 연장될 때, 시스 유체 내의 점도제가 세포들의 생존능력을 유지하여 세포들의 구조 및 내용물을 온전하게 하면서, 샘플 중의 세포들을 샘플 유체 주입관으로부터 이미지 캡처 영역으로 4초 이내에 전달하기에 효과적이도록 하는, 입자 분석 시스템.
  8. 기하학적 하이드로포커싱을 위해 구성된 입자 분석 시스템을 사용하여 혈액 유체 샘플 중의 입자들 - 상기 혈액 유체 샘플 중에 포함된 입자들은 샘플 유체 점도를 가짐 - 을 이미징하기 위한 방법으로서,
    상기 입자 분석 시스템의 플로우셀의 유로를 따라 시스 유체를 유동시키는 단계;
    상기 혈액 유체 샘플을 상기 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 상기 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 - 상기 샘플 유동 스트림은 유로 크기의 감소부를 통해 유동하고 이미징 축을 횡단함 - 내를 유동하도록 하는 단계;
    상기 플로우셀에 대해 고정된 위치를 갖는 이미징 표적을 이미징함으로써 이미지 캡처 디바이스를 포커싱하는 단계; 및
    변위 거리를 이용하여 샘플 유동 스트림 상에 포커싱되는 상기 이미지 캡처 디바이스로 유동 스트림 내의, 입자 특성화 및 카운팅에 적합한, 입자들의 포커싱된 이미지를 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 혈액 유체 샘플 중의 입자들을 이미징하기 위한 기하학적 하이드로포커싱을 수행하는 입자 분석 시스템으로서,
    주입관을 갖는 유로 및 이미징 축이 통과하는 이미징 창을 구비한 플로우셀 - 상기 플로우셀의 유로는 유로 크기의 감소부를 가짐 -;
    상기 유로와 유체 연통하는 시스 유체 입구;
    상기 주입관과 유체 연통하고, 상기 혈액 유체 샘플을 상기 플로우셀 내의 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 상기 혈액 유체 샘플이 유동 스트림 두께보다 더 큰 유동 스트림 폭을 갖는 샘플 유동 스트림 내를 유동하도록 구성되는 혈액 유체 입구;
    이미지 캡처 디바이스;
    상기 플로우셀에 대해 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태를 설정하도록 구성되는 포커싱 메커니즘;
    상기 플로우셀에 대해 고정된 위치를 갖는 이미징 표적 - 상기 이미징 표적 및 샘플 유동 스트림은 상기 이미징 축을 따르는 변위 거리를 한정함 -;
    프로세서; 및
    상기 변위 거리를 이용하여, 입자 특성화 및 카운팅에 적합한 상기 이미지 캡처 디바이스의 초점 상태를 설정하도록 상기 포커싱 메커니즘을 작동하기 위해 상기 프로세서 상에 실행된 기계 판독가능 코드를 구현하는 유형적 매체를 포함하는 포커싱 모듈을 포함하는, 입자 분석 시스템.
  10. 제2 세포 유형을 포함하는 혈액 유체 샘플 중의 제1 세포 유형의 양을 측정하기 위한 방법으로서,
    상기 샘플의 제1 부피를 혈액학 세포 카운터(hematology cell counter)를 통해 유동시킴으로써 상기 제1 부피 내의 상기 제2 세포 유형의 집단을 결정하는 단계;
    상기 샘플의 제2 부피를 플로우셀 내에서 유동하는 시스 유체 내로 주입하여 두께 및 상기 두께보다 더 큰 폭을 갖는 샘플 스트림을 제공하도록 함으로써, 제1 개수의 상기 제1 유형 세포들 및 제2 개수의 상기 제2 세포 유형들의 이미지들을 획득하는 단계 - 상기 획득된 이미지들은 상기 샘플 스트림의 두께를 가로지르는 이미지 경로를 따라 획득됨 -;
    상기 획득된 이미지들을 사용하여 상기 제1 세포 유형의 제1 개수 대 상기 제2 세포 유형의 제2 개수의 비를 결정하는 단계; 및
    상기 비 및 상기 제2 세포 유형의 집단을 사용하여 상기 샘플 중의 상기 제1 세포 유형의 세포량 측정기준치(cell quantity measure)를 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제2 세포 유형을 포함하는 혈액 유체 샘플 중의 제1 세포 유형의 양을 측정하기 위한 시스템으로서,
    채널 및 출력부 - 상기 출력부는 상기 채널을 통해 유동하는 상기 샘플의 제1 부피 내의 제2 세포 유형의 집단을 나타내는 신호들을 생성하도록 상기 채널에 작동식으로 커플링됨 - 를 갖는 혈액학 세포 카운터;
    샘플 스트림의 유동을 용이하게 하도록 구성된 플로우셀 - 상기 샘플 스트림은 상기 샘플의 제2 부피 및 시스 유체를 포함하고, 두께 및 상기 두께보다 더 큰 폭을 가짐 -;
    제1 개수의 상기 제1 유형 세포들 및 제2 개수의 상기 제2 세포 유형들의 이미지들을 획득하도록 구성된 이미징 장치 - 상기 획득된 이미지들은 상기 샘플 스트림의 두께를 가로지르는 이미지 경로를 따라 획득됨 -;
    프로세서;
    상기 획득된 이미지들을 사용하여 제1 세포 유형의 제1 개수 대 제2 세포 유형의 제2 개수의 비를 결정하기 위해 상기 프로세서 상에 실행된 기계 판독가능 코드를 구현하는 유형적 매체를 포함하는 이미지 분석 모듈; 및
    상기 비 및 제2 세포 유형의 집단을 나타내는 신호들을 사용하여 샘플 중의 제1 세포 유형의 세포량 측정기준치를 계산하기 위해 상기 프로세서 상에 실행된 기계 판독가능 코드를 구현하는 유형적 매체를 포함하는 세포량 모듈을 포함하는, 시스템.
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