JP2016520805A - 血液試料における粒子分析のためのシース液システム及び方法 - Google Patents

血液試料における粒子分析のためのシース液システム及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示の態様及び実施形態は、試料内に含有される粒子を分析するために使用される粒子分析器のための、粒子及び／又は細胞内小器官整列剤を提供する。例示的な粒子及び／又は細胞内小器官整列剤は、水溶液、粘性変性剤、及び／又は緩衝剤を含む。本発明の実施形態は、粒子を含む調製した試料の分析のための、装置、システム、組成物、及び方法に関する。いくつかの態様では、システムは、視覚分析器であり得る、分析器を備える。いくつかの態様では、装置は、視覚分析器及びプロセッサを含有する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日出願の、米国特許仮出願第６１／７９９，１５２号の正規の出願であり、これに対する優先権の利益を主張し、当該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。本出願はまた、米国特許出願第１４／２１５，８３４号、同第１４／２１６，５３３号、同第１４／２１６，３３９号、同第１４／２１６，８１１号、及び同第１４／２１７，０３４号、並びに国際特許出願（自動焦点、フローセル、動作範囲、造影剤、血液学）（全て２０１４年３月１７日出願）に関連する。これらの出願のそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、試料中の血球等の粒子を弁別し数量化するための、全体的又は部分的自動化デバイスを使用した、液体試料内の粒子の撮像を含む、粒子の分析のための、装置、システム、組成物、及び方法の分野に関する。本開示はまた、被験者からの試料内の粒子の分析に有用な粒子及び／又は細胞間小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）、該液体を生成する方法、並びに粒子を検出及び分析するために該液体を使用する方法に関する。画像ベースの生体液試料分析に有用な、組成物、システム、デバイス、及び方法もまた開示する。本開示の組成物、システム、デバイス、及び方法は、赤血球、網状赤血球、有核赤血球、血小板等の、生体液内の粒子を、検出すること、計数すること、及び特徴付けることに、並びに画像及び形態ベースの白血球分画、分類、副分類、特徴付け、及び／又は分析にもまた有用である。
血球分析は、患者の健康状態の概観を提供するために、最も一般的に行われる医療試験の１つである。血液試料は、患者の体から採取され得、凝固を防止するために凝固阻止剤を含有する試験管内で保存され得る。全血液試料は、赤血球（red blood cell）（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、白血球（white blood cell）（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、及び血小板（platelet）（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）を含む、通常３つの主要なクラスの血球を含む。それぞれのクラスは、更にメンバのサブクラスに分けられ得る。例えば、白血球（ＷＢＣ）の５つの主要な種類又はサブクラスは、異なる形状及び機能を有する。白血球は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を含み得る。赤血球の種類にもまたサブクラスがある。試料内の粒子の外見は、病理状態、細胞の成熟度、及び他の要因に応じて異なり得る。赤血球のサブクラスは、網状赤血球及び無核赤血球を含み得る。
ＲＢＣ、ＷＢＣ、又は血小板の濃度を推定する血球計数は、手動で又は自動分析器を使用して行うことができる。血球計数が手動で行われるとき、一滴の血液が薄いスメアとして顕微鏡スライドガラスに塗布される。従来、顕微鏡スライドガラス上の乾燥して着色した血液のスメアの手動の検査は、５種類の白血球の数又は相対量を測定するために使用されてきた。細胞又は細胞構造を着色するために、組織染料、及び着色料が使用されてきた。例えば、Ｗｒｉｇｈｔの着色料は、光学顕微鏡下での試験のための血液スメアを着色するために使用されている組織着色料である。全血計数（ＣＢＣ）は、自動化分析器を使用して得ることができ、そのうちの１つの種類は、粒子又は細胞が小さい管に沿う検知区域を通過する際に、インピーダンス又は動的光散乱に基づいて、血液試料内の異なる粒子又は細胞の数を計数する。自動化ＣＢＣは、ＲＢＣ、ＷＢＣ、及び血小板（ＰＬＴ）を含む、異なる種類の細胞を区別するために、器具又は方法を用い得、これらは別個に計数され得る。例えば、最小の粒径又は容積を必要とする計数技術は、大きい細胞のみを計数するために使用され得る。血液中の異常細胞等の特定の細胞は、正確に計数又は識別されないことがある。互いに接着する小さい細胞は、大きい細胞として誤って計数されることがある。誤った計数が疑われるとき、細胞を確認し識別するために、器具の結果の手動のレビューが必要とされ得る。
自動化血球計数技術は、フローサイトメトリーを含み得る。フローサイトメトリーは、細い流路を提供すること、並びに個々の血球の通過を検知及び計数することを含む。フローサイトメトリー方法は、血液試料内の細胞等の、流体内で懸濁した粒子を検出するため、並びに、血液試料内のそれぞれの粒子の種類の濃度又は粒子の容積を推定するために、粒子の種類、寸法、及び容積分布に関して粒子を分析するために使用されてきた。流体内に懸濁された粒子の分析に好適な方法の例としては、沈殿、顕微鏡を用いた特徴付け、インピーダンスに基づく計数、及び動的光散乱が挙げられる。これらのツールは、試験誤差を起こしやすい。一方で、正確な粒子の種類の特徴付け及び濃度は、医療診断等の用途において、重要であり得る。
撮像に基づく計数技術では、表示区域を通過している可能性がある調製した試料のピクセルデータ画像は、デジタルカメラに連結した顕微鏡の対物レンズを使用して捕捉される。ピクセル画像データは、データ処理技術を使用して分析することができ、モニター上に表示することもまたできる。
フローセルを伴う自動化診断システムの態様は、Ｔｕｒｎｅｒらの米国特許第６，８２５，９２６号、並びに全てＫａｓｄａｎらの米国特許第６，１８４，９７８号、同第６，４２４，４１５号、及び同第６，５９０，６４６号に開示され、該特許は参照により、完全に説明されるかのように、本明細書に組み込まれる。
動的光散乱又はインピーダンスを使用する自動化システムは、全血計数（ＣＢＣ）と、総白血球計数（ＷＢＣ）、赤血球の総細胞容積（ＲＢＣ分布）、ヘモグロビンＨＧＢ（血液内のヘモグロビンの量）と、平均細胞容積（ＭＣＶ）（赤血球の平均容積）と、ＭＰＶ（平均ＰＬＴ容積）と、ヘマトクリット（ＨＣＴ）と、ＭＣＨ（ＨＧＢ／ＲＢＣ）（赤血球当たりのヘモグロビンの平均量）と、ＭＣＨＣ（ＨＧＢ／ＨＣＴ）（細胞内のヘモグロビンの平均濃度）と、を得るために使用されてきた。自動化又は部分的自動化プロセスは、白血球５部分分画及び血液試料分析を容易にするために使用されてきた。
米国特許第６，８２５，９２６号明細書 米国特許第６，１８４，９７８号明細書 米国特許第６，４２４，４１５号明細書 米国特許第６，５９０，６４６号明細書
かかる現在周知の粒子分析システム及び方法は、関連する医療診断技術と共に、医師、臨床医、及び患者に真の利益を提供できるものの、尚も更なる改善が望ましい。例えば、自動化システムを使用して画像ベースの試料分析を行うときに、粒子及び／又は細胞内小器官整列に有用な、改善された方法及び組成物の継続する必要性がある。本発明の実施形態は、これらの目立つ必要性のうちの少なくともいくつかの解決策を提供する。
本発明の実施形態は、粒子を含む調製した試料の分析のための、装置、システム、組成物、及び方法に関する。いくつかの態様では、システムは、視覚分析器であり得る、分析器を備える。いくつかの態様では、装置は、視覚分析器及びプロセッサを含有する。一態様では、本開示は、対象の粒子を含む液体試料が、そこを通して高光学解像度撮像デバイスが画像を捕捉する、表示ポートを有するフローセルを通って流される、自動化粒子撮像システムに関する。いくつかの態様では、高光学解像度撮像デバイスは、デジタルカメラ等のカメラを備える。一態様では、高光学解像度撮像デバイスは、対物レンズを備える。
フローセルは、調製した試料等の試料流体の供給源に、並びに粒子及び／又は細胞内小器官整列流体（ＰＩＯＡＬ）に連結する。該システムは、流れにおける試料内の粒子の焦点画像の捕捉を可能にする。いくつかの実施形態では、該画像は、粒子の分類及び副分類のために、自動化、高処理能力プロセスにおいて使用できる。例示的な視覚分析器には、画像の自動化分析を容易にするためのプロセッサが挙げられ得る。いくつかの場合では、自動化画像ベースＷＢＣ分画又は他の血液試料粒子分析プロトコルを提供するために、視覚分析器が本開示の方法において使用され得る。いくつかの場合では、本開示の方法は、被験者が健康であるかどうか、又は疾患、病態、異常、及び／若しくは感染症を有するかどうかを、判定、診断、予後診断、予測、及び／又はその診断を支持するための、並びに、被験者が治療に対し反応性であるか又は非反応性であるかを観測するための、形態異常の自動化識別に関する。
本発明の実施形態は、粒子造影剤組成物で処理した細胞内の、粒子及び／又は細胞内小器官整列に有用な、システム、方法、及びシース液組成物を提供する。かかる技術は、細胞形態を維持する及び／又は１つ以上の血液成分の判定を可能にする最適画像の捕捉を提供しないという不利点に悩まされ得る、フローサイトメトリーにおいて使用される従来のシース液に関連する、特定の困難を克服する。
特定の実施形態では、リボン形状の試料ストリームとシース液との間の粘性差異及び／若しくは速度差異、並びに／又はリボン形状の試料ストリームの厚さは、例えば、狭細流路遷移帯域によって提供される幾何学的集束効果との組み合わせで、粒子上で働くせん断力を導入することができ、それによって、視覚分析器における撮像プロセスの間中、粒子を整列させる又は整列させたままにする。いくつかの実施形態では、試料は造影が増強され得る。いくつかの実施形態では、シース液は、最大１００％の粘性剤を含み得る。別の実施形態では、シース液は最大６０％ｖ／ｖの粘性剤を有する。使用される粘性剤の種類に依存して、いくつかの実施形態では、シース液は、乾燥形態で、約５〜７％の濃度で、又はより具体的には６．５％（ｗ／ｖ）で、市販されている粘性剤を含み得る。
他の実施形態では、本開示は、細胞等の試料内の粒子、並びに、脳脊髄液及び特定の状態に関連する浸出液等の、他の生体液内の他の粒子特徴の、画像ベース分析において使用され得るシース液に関連する。細胞分類及び／又は副分類は、分析され得る試料の種類の非限定的な例として、本開示内で血液試料における使用のために記載される。いくつかの実施形態では、試料内に存在する細胞は、細菌又は真菌細胞、並びに白血球、赤血球、又は血小板を含み得る。いくつかの実施形態では、組織又は吸引物から得られる粒子懸濁液が分析され得る。
いくつかの実施形態では、試料流体のストリームは、かなりの幅を有する流路を確立するために、平坦な開口部を有するカニューレを通して注入され得る。シース液は、フローセル内に導入され得、試料流体を、撮像区域を通り、その後、排出部に向かって運ぶ。シース液は、試料流体とは異なる、例えば、より高い粘性を有し、かつ任意に、リボン形状試料ストリームへの注入の点での異なる流量は、試料流体が薄いリボン形状へ平坦化することをもたらす。試料流体の薄いリボンは、シース液と共に、狭細流路繊維帯域を通って運ばれ、リボン形状の試料ストリームを見るために、高光学解像度撮像デバイス及び光源が配列される、表示ポートの前を通過する。
一実施形態では、シース液の粘性は、試料の粘性よりも高くあり得る。シース液の粘性、試料物質の粘性、シース液の流量、及び試料物質の流量は、リボン形状試料ストリーム内の流れに、好都合なリボン形状試料ストリームの厚さ等の、所定の寸法の特徴を提供するために、例えば、狭細繊維帯域によって提供されるリボン圧縮効果との組み合わせで協調する。有利なリボン形状試料ストリーム厚さを維持することは、例えば、焦点細胞又は焦点細胞成分の高い割合を提供する。
本開示の実施形態は、好適な量の粘性剤のシース液への添加は、例えば、狭細遷移帯域を有するフローセルのような、フローセル内の、粒子／細胞整列を有意に改善し、焦点化した細胞の細胞内容物を増加させ、フローサイトメトリー内で使用される非粘性変性の従来のシース液の使用と比較して、フロー内の細胞のより高い質の画像をもたらすという発見に少なくとも部分的に基づく。粘性剤の添加は、細長い又は非球状の、粒子又は赤血球（ＲＢＣ）等の細胞上のせん断力を増加させ、その後、流れ方向に実質的に平行な平面に細胞を整列させ、画像の最適化をもたらす。白血球（ＷＢＣ）等の細胞については、これはまた、細胞内構造、小器官、又はローブを、流れの方向に実質的に平行に、位置付けること、再位置付けすること、及び／又はより良好に位置付けることももたらす。例えば、白血球は、粘性剤又は差異によって与えられるせん断力に反応して、圧縮可能又は変形可能であり得、よって粒子の伸長又は圧縮及びせん断下での整列をもたらす。
流れストリームよりも直径が小さい粒子の整列は、シース液の粘性を増加させることによって得られ得る。これは、流れの方向に実質的に平行な平面における、それらの粒子の整列の改善をもたらす。
リボン形状の試料ストリーム厚さは、例えば、フローセルの狭細遷移帯域の形状との組み合わせで、試料流体及びシース液の相対粘性及び流量に影響され得る。試料の供給源及び／又はシース液の供給源は、例えば、高精度容積型ポンプを備え、リボン形状の試料ストリーム、すなわち少なくとも撮像デバイスの視野と同じ幅の細いリボンの寸法を最適化するために、試料及び／又はシース液を安定した流量で提供するように構成され得る。
例示的なシース液の実施形態は、粒子分析のためのフローセルにおいて使用される。試料はシース液のストリーム内で包まれ、分析器デバイスのフローセルを通過する。その後、検出区域を通過するときに試料からの情報が収集され、分析器が試料内に含まれる粒子／細胞を分析することができるようにする。かかる分析器上でのシース液の使用は、正確な分類及び副分類、並びに試料に含まれる細胞及び／又は粒子の計数を可能にする。
本明細書で使用されるとき、シース液は、次の細胞及び／又はそれに関連する粒子に関連する情報を得ることにおいて、有用である：例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、血小板、網状赤血球、有核ＲＢＣ、芽球、前骨髄球、骨髄球、及び／又は後骨髄球を含む。
本開示は、粒子分析を実行するための、新規組成物及びその使用方法を提供する。具体的には、本開示は、試料内の粒子を分析するために、分析器において使用される、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）に関する。シース液及びＰＩＯＡＬという用語は、本開示を通して交換可能に使用され得る。本開示は、ＰＩＯＡＬの生成方法及び粒子を分析するためのＰＩＯＡＬの使用方法を更に提供する。本発明のＰＩＯＡＬは、例えば、試料内の粒子の自動化分類及び副分類のための方法において有用である。
一態様では、本発明の実施形態は、粒子分析システムを使用した、複数の粒子の撮像方法を包含する。該システムは、複合粘性及び幾何学的流体集束のために構成され得る。粒子は、試料流体粘性を有する血液流体試料内に含まれ得る。例示的な方法は、シース液をフローセルの流路に沿って流すことを含み得、シース液は、試料流体粘性とは所定の粘性差異範囲の粘性差異で異なる、シース液粘性を有し得る。方法は、シース液に包まれた試料流体ストリームを提供するために、血液流体試料を、フローセル内を流れるシース液に注入することもまた含み得る。更に、方法は、粘性差異に関連する、シース液と試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路の大きさの縮小部に関連する、シース液と試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、シース液内の粘性剤が試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、細胞が試料流体ストリームから流れるシース液に伸びるときに、細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、撮像部位での複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的となるように、試料流体ストリーム及びシース液を、流路の大きさの縮小部を通して撮像部位に向かって流すことを含み得る。更に、方法は、撮像部位で複数の粒子を撮像することを含み得る。いくつかの場合では、シース液は屈折率ｎ＝１．３３３０を有し得る。いくつかの場合では、シース液は、水の屈折率と同じ屈折率を有する。いくつかの場合では、流路の大きさにおける縮小に関連する、シース液と試料流体との間の相互関係は、試料とシース液ストリームとの界面に沿うせん断力を生成することにより、目標撮像状態を提供することに寄与する。いくつかの場合では、目標撮像状態は、流れ内の１つ以上の目標粒子の、撮像部位にて画像を取得するために使用される撮像デバイスの焦点面に対する目標配向を含む。
いくつかの実施形態に従い、撮像部位での流路は、焦点面に実質的に平行な平面を画定する。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位での焦点面に対する目標整列に対応する。いくつかの場合では、目標整列は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子整列に対応する。いくつかの場合では、目標整列は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造整列に対応する。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位での焦点面に対する目標位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は焦点面内である。いくつかの場合では、目標位置は、焦点面から離れており、その距離は位置公差に対応する。いくつかの場合では、目標配向は、焦点面に対する目標整列、及び焦点面に対する目標位置に対応する。いくつかの場合では、目標撮像状態は、流れ内の１つ以上の目標粒子内構造の、撮像部位で画像を取得するために使用される撮像デバイスの焦点面に対する目標配向に対応する。いくつかの場合では、撮像部位での流路は、焦点面に実質的に平行な平面を画定する。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位での焦点面に対する目標整列に対応する。いくつかの場合では、目標整列は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子整列に対応する。いくつかの場合では、目標整列は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造整列に対応する。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位での焦点面に対する目標位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は焦点面内である。いくつかの場合では、目標位置は、焦点面から離れており、その距離は位置公差に対応する。いくつかの場合では、目標配向は、焦点面に対する目標整列、及び焦点面に対する目標位置に対応する。いくつかの場合では、目標撮像状態は、１つ以上の目標粒子の、又は１つ以上の目標粒子内構造の目標変形に対応する。
いくつかの実施形態に従い、血液流体試料を注入するプロセスは、血液流体試料のストリームを、試料流体速度で、試料注入管を通して方向付けることによって行われる。注入管は、流路内にポートを有し得る。ポートは、幅、厚さ、及び流路に沿って延在する流れ軸を画定し得る。幅は、厚さより大きくあり得、そのため試料ストリームが、撮像部位に隣接する撮像経路を横断する向かい合う主要面を有する。いくつかの場合では、フローセルの流路を沿って流れるシース液は、試料ストリームの主要面に沿って伸び、試料流体速度とは異なるシース液速度を有する。いくつかの場合では、異なる速度に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用は、異なる粘性に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用との組み合わせで、目標撮像状態を提供する。いくつかの実施形態に従い、複数の粒子は、赤血球、白血球、及び／又は血小板を含み得る。いくつかの実施形態に従い、複数の粒子は、粒子内構造を有する細胞を含み得る。いくつかの場合では、粒子内構造は、細胞内構造、小器官、又はローブであり得る。
いくつかの実施形態では、シース液は１〜１０センチポアズ（ｃＰ）の間の粘性を有する。いくつかの場合では、所定の粘性差異は、約０．１〜約１０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する。いくつかの場合では、所定の粘性差異は、約１．０〜約９．０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する。いくつかの場合では、所定の粘性差異は、約１．０〜約５．０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する。いくつかの場合では、所定の粘性差異は、約３．０センチポアズ（ｃＰ）の絶対値を有する。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、水溶性ポリマー（複数可）、及び／又はデキストランを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の間の濃度でグリセロールを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロールを５％（ｖ／ｖ）の濃度で、並びにグリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を１％（ｗ／ｖ）の濃度で含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、動作条件下で、約３〜約３０％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度で存在する、グリセロールを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、動作条件下で、約３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在する、グリセロールを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、動作条件下で、約６．５％ ｖ／ｖの最終濃度で存在する、グリセロールを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、動作条件下で、約５％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在するグリセロール、及び約１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。
いくつかの実施形態に従い、血液流体試料は撮像部位にて、２０〜２００ｍｍ／秒の範囲内の線速度を有する。いくつかの場合では、血液流体試料は撮像部位にて、５０〜１５０ｍｍ／秒の範囲内の線速度を有する。いくつかの場合では、血液流体試料は撮像部位にて、最大７μｍの試料ストリーム厚さ、及び５００〜３０００μｍの範囲内の試料ストリーム幅を有する。いくつかの場合では、血液流体試料は撮像部位にて、２〜４μｍの範囲内の試料ストリーム厚さ、及び１０００〜２０００μｍの範囲内の試料ストリーム幅を有する。いくつかの場合では、複数の粒子は１組の非球形粒子を含み、血液流体試料は撮像部位にて流れの方向を有し、１組の非球形粒子のうちの７５％より多くが、流れの方向に平行な平面において実質的に整列し、よってそれぞれの整列した非球形粒子の主要面が流れの方向に平行な平面に平行となる。いくつかの場合では、複数の粒子は、１組の非球形粒子を含み、血液流体試料は撮像部位にて流れの方向を有し、１組の非球形粒子のうちの少なくとも９０％が流れの方向に実質的に平行な平面から２０度以内に整列する。いくつかの場合では、複数の粒子は粒子内構造を含み、血液流体試料は撮像部位にて流れの方向を有し、粒子内構造のうちの少なくとも９２％が流れの方向に実質的に平行である。
別の態様では、本発明の実施形態は、試料流体粘性を有する血液流体試料内の複数の粒子を撮像するためのシステムを包含する。システムは、試料流体粘性とは所定の粘性差異範囲内の粘性差異で異なるシース液粘性を有する、シース液との使用のために構成され得る。例示的なシステムは、流路の大きさにおける縮小部を有する流路及び試料流体注入管を有するフローセルと、シース液の流れをフローセルの流路に沿って送るための、フローセルの流路と流体連通するシース液インプットと、血液流体試料の流れを、フローセル内を流れるシース液に注入するための、フローセルの注入管と流体連通する血液流体試料インプットと、を含み得、よって、シース液及び試料流体が流路の縮小部を通って撮像部位に向かって流れる際、粘性差異に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用によって誘発される、粘性流体集束効果が、流路の大きさにおける縮小部に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用によって誘発される、幾何学的流体集束効果との組み合わせで、撮像部位にて、複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおいて目標撮像状態を提供し、一方で、シース液内の粘性剤は試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、細胞が試料流体ストリームから流れるシース液へ伸びるときに、細胞の構造及び内容物を無傷のままにする。システムは、撮像部位にて複数の粒子を撮像する、撮像デバイスを更に備え得る。
いくつかの実施形態に従い、目標撮像状態は、流れ内の１つ以上の目標粒子の、撮像部位にて画像を取得するために使用される撮像デバイスの焦点面に対する、目標配向に対応する。いくつかの場合では、複数の粒子は、赤血球、白血球、及び血小板からなる群から選択されたメンバを含む。いくつかの場合では、複数の粒子は、粒子内構造を有する細胞を含む。細胞内構造は、細胞内構造、小器官、又はローブであり得る。いくつかの場合では、所定の粘性差異は、約０．１〜約１０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、水溶性ポリマー（複数可）、及び／又はデキストランを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の間の濃度でグリセロールを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロールを５％（ｖ／ｖ）の濃度で、並びにグリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を１％（ｗ／ｖ）の濃度で含む。
いくつかの実施形態に従い、複数の粒子は１組の非球形粒子を含み、血液流体試料は撮像部位にて流れの方向を有し、１組の非球形粒子のうちの少なくとも９０％が流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内に整列する。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子配向に対応する。いくつかの実施形態では、粒子は、赤血球、白血球、又は血小板であり得る。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造配向に対応する。（例えば、粒子内構造は、細胞内構造、小器官、又はローブであり得る。）いくつかの場合では、撮像部位での流路は、焦点面に実質的に平行な平面を画定する。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位での焦点面に対する目標整列に対応する。いくつかの場合では、目標整列は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子整列に対応する。いくつかの場合では、目標整列は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造整列に対応する。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位での焦点面に対する目標位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造位置に対応する。いくつかの場合では、目標位置は焦点面内である。いくつかの場合では、目標位置は、焦点面から離れており、その距離は位置公差に対応する。いくつかの場合では、目標配向は、焦点面に対する目標整列、及び焦点面に対する目標位置に対応する。いくつかの場合では、目標撮像状態は、撮像部位での目標変形に対応する。
いくつかの実施形態に従い、シース液が試料流体速度とは異なる試料流体速度を有するように、血液流体試料源は、血液流体試料に、流れるシース液への試料流体速度を提供するように構成され得る。いくつかの場合では、異なる速度に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用は、異なる粘性に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用との組み合わせで、目標撮像状態を提供する。
いくつかの実施形態に従い、フローセルの流路は、流路の大きさの変化を伴う帯域を含み、流路の大きさの変化に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用が、異なる粘性と関連する、シース液と試料流体との間の相互作用との組み合わせで、目標撮像状態を提供する。いくつかの場合では、流路の大きさの変化に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用は、側方流体圧縮力を生成することにより、目標撮像状態を提供することに寄与する。いくつかの場合では、複数の粒子は、赤血球、白血球、及び／又は血小板を含む。いくつかの場合では、複数の粒子は、粒子内構造を有する細胞を含み、構造は、細胞内構造、小器官、又はローブであり得る。
いくつかの実施形態に従い、所定の粘性差異は、約０．１〜約１０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する。いくつかの場合では、所定の粘性差異は、約１．０〜約９．０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する。いくつかの場合では、所定の粘性差異は、約１．０〜約５．０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する。いくつかの場合では、所定の粘性差異は、約３．０センチポアズ（ｃＰ）の絶対値を有する。いくつかの場合では、シース液は、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、水溶性ポリマー（複数可）、及び／又はデキストランを含み得る、粘性剤を含む。いくつかの場合では、シース液は、約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の濃度でグリセロールを含む。
いくつかの実施形態に従い、血液流体試料は撮像部位にて、２０〜２００ｍｍ／秒の範囲内の線速度を有する。いくつかの場合では、血液流体試料は撮像部位にて、５０〜１５０ｍｍ／秒の範囲内の線速度を有する。いくつかの場合では、血液流体試料は、撮像部位にて、最大７μｍの試料ストリーム厚さ及び５００μｍ以上の試料ストリーム幅を有する。いくつかの場合では、血液流体試料は、撮像部位にて、２〜４μｍの範囲内の試料ストリーム厚さ、及び１０００〜２０００μｍの範囲内の試料ストリーム幅を有する。いくつかの場合では、複数の粒子は、１組の非球形粒子を含み、血液流体試料は、撮像部位にて流れの方向を有し、１組の非球形粒子のうちの少なくとも９０％は、流れの方向に平行な面において実質的に整列する及び／又は位置付けられる。いくつかの場合では、複数の粒子は、１組の非球形粒子を含み、血液流体試料は撮像部位にて流れの方向を有し、１組の非球形粒子のうちの９５％が流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内に整列する。いくつかの場合では、複数の粒子は、粒子内構造を含み、血液流体試料は撮像部位にて流れの方向を有し、粒子内構造のうちの少なくとも９２％が流れの方向に実質的に平行である。
別の態様では、本発明の実施形態は、複合粘性及び幾何学的流体集束分析器における使用のための、粒子及び細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）を包含する。ＰＩＯＡＬは、ＰＩＯＡＬに包まれた試料流体ストリームを生成するために、視覚分析器の狭細フローセル遷移帯域に注入される所定の粘性の血液試料流体の流れを方向付けることができる。ＰＩＯＡＬは、血液試料流体の粘性よりも高い粘性を有する流体を含み得る。粘性差異に関連する、ＰＩＯＡＬ流体と試料流体との間の相互作用によって誘発される、粘性流体集束効果は、狭細フローセル遷移帯域に関連する、ＰＩＯＡＬ流体と試料流体との間の相互作用によって誘発される、幾何学的流体集束効果との組み合わせで、視覚分析器の撮像部位にて、複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおいて目標撮像状態を提供することに効果的であり、一方で、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤は、試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、細胞が試料流体ストリームから流れるシース液へと伸びるときに、細胞の構造及び内容物を無傷のままにする。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、水溶性ポリマー（複数可）、及び／又はデキストランを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の間の濃度でグリセロールを含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。いくつかの場合では、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、少なくとも１％（ｗ／ｖ）の濃度である。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロールを更に含む。いくつかの場合では、シース液の粘性剤は、グリセロールを５％（ｖ／ｖ）の濃度で、並びにグリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を１％（ｗ／ｖ）の濃度で含む。いくつかの場合では、ＰＩＯＡＬは、約１〜１０センチポアズ（ｃＰ）の間の粘性を有する。
更に別の実施形態では、本発明の実施形態は、流路内の所定の粘性の試料の流れを方向付けるように構成される視覚分析器における使用のための、粒子及び細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）を包含する。ＰＩＯＡＬは、試料の粘性よりも高い粘性を有する流体を含み得る。ＰＩＯＡＬは、試料の流れを支持すること、及び粒子を整列させ、流路内を流れる細胞の粒子及び細胞内小器官の焦点内容物を増加させることに効果的であり得、それによって整列した細胞の粒子及び細胞内小器官が撮像され得る。いくつかの場合では、ＰＩＯＡＬは粘性剤を更に含む。いくつかの場合では、ＰＩＯＡＬは、緩衝剤、ｐＨ調整剤、抗菌剤、イオン強度変性剤、界面活性剤、及び／又はキレート剤を更に含む。いくつかの場合では、粒子及び細胞内小器官整列液体は、等張性である。いくつかの場合では、粒子及び細胞内小器官整列液体は、塩化ナトリウムを含む。いくつかの場合では、塩化ナトリウムは、約０．９％の濃度で存在する。いくつかの場合では、ＰＩＯＡＬ試料のｐＨは、動作条件下で約６．０〜約８．０である。いくつかの場合では、ＰＩＯＡＬ試料混合物のｐＨは、動作条件下で約６．５〜約７．５の間である。いくつかの場合では、ＰＩＯＡＬは、ｐＨを動作条件下で約６．８〜約７．２の間に調節するために、ｐＨ調整剤を含む。いくつかの場合では、ＰＩＯＡＬ液体は、動作条件下で、約１〜１０センチポアズの間の目標粘性を有する。
尚も更なる別の態様では、本発明の実施形態は、濃縮ＰＩＯＡＬの原液を包含する。いくつかの場合では、濃縮原液は、目標粘性を達成するために希釈され得る。いくつかの場合では、原液の濃度は、動作条件下で少なくとも約１．１倍〜少なくとも約１００倍のＰＩＯＡＬの濃度で存在する。いくつかの場合では、粘性剤は、グリセロール、グリセロール誘導体と、ＰＶＰ、ＣＭＣ、エチレングリコールと、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）と、ポリエチレングリコールと、水溶性ポリマー及びデキストランとのうちの、少なくとも１つから選択される。いくつかの場合では、粘性剤はグリセロールを含む。いくつかの場合では、粘性剤はグリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。いくつかの場合では、粘性剤はグリセロール及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む。いくつかの場合では、粘性剤はグリセロール及び硫酸デキストランを含む。いくつかの場合では、粘性剤はグリセロール誘導体を含む。いくつかの場合では、粘性剤はＰＶＰを含む。いくつかの場合では、粘性剤はプロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）を含む。いくつかの場合では、粘性剤はポリエチレングリコールを含む。いくつかの場合では、粘性剤は水溶性デキストランを含む。いくつかの場合では、グリセロールは、動作条件下で、約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度で存在する。いくつかの場合では、該グリセロールは、動作条件下で、約３〜約３０％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度で存在する。いくつかの場合では前記グリセロールは、動作条件下で、約３０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在する。いくつかの場合では、該グリセロールは、動作条件下で、約６．５％ ｖ／ｖの最終濃度で存在する。いくつかの場合では、動作条件下で、該グリセロールは約５％ ｖ／ｖの最終濃度で存在し、ＰＶＰは約１％ ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの場合では、前記ＰＶＰは、動作条件下で、約１％ ｗ／ｖの最終濃度で存在する。いくつかの場合では、本発明の実施形態は、本明細書に開示するＰＩＯＡＬを含むキットを包含する。
別の態様では、本発明の実施形態は、試料流体粘性を有する血液流体試料内の、向かい合う主要面を有する複数の細胞の分析方法を包含する。例示的な方法は、シース液をフローセルの流路に沿って流すことを含み得る。シース液は、試料流体粘性よりも高いシース液粘性を有し得る。方法は、血液流体試料を、フローセル内を流れるシース液に注入することもまた含み得る。複数の細胞は、撮像経路の配向を横断して配向した主要面を伴う、第１のサブセットを含み得る。方法は、撮像経路に沿う粒子を撮像部位にて撮像することもまた含み得、同時に、複数の細胞は、撮像経路を横断して配向した主要面を伴う第２のサブセットを含み、第２のサブセットは第１のサブセットよりも多数である。方法は、流体血液試料及びシース液を、流路の大きさの縮小部を通して方向付けることもまた含み得、よって、異なる粘性に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用が、複数の細胞のうちの少なくともいくつかを再配向し、よって、第２のサブセットが第１のサブセットよりも多数になる。
別の態様では、本発明の実施形態は、試料流体粘性を有する血液流体試料内の複数の細胞を撮像するためのシステムを包含する。システムは、試料流体粘性よりも高いシース液粘性を有するシース液との使用のために構成され得、細胞は向かい合う主要面を有する。例示的なシステムは、流路及び試料流体注入管を有するフローセルと、シース液の流れをフローセルの流路に沿って送るための、フローセルの流路と流体連通するシース液インプットと、血液流体試料の流れを、フローセル内を流れるシース液に注入するための、フローセルの注入管と流体連通する血液流体試料インプットとを含み得、よって、複数の注入細胞が、撮像経路の配向を横断して整列した主要面を伴う第１のサブセットを含む。いくつかの場合では、フローセルの流路は、異なる粘性に関連する、シース液と血液試料流体との間の相互作用が、粒子のうちの少なくともいくつかを再配向させるように構成される、流路の大きさの変化を伴う帯域を有し得る。システムは、複数の細胞の第２のサブセットの主要面が撮像経路を横断して配向される一方で、撮像経路に沿う複数の粒子を撮像部位にて撮像する撮像デバイスもまた含み得る。
一態様では、本発明は、粒子の撮像方法に関し、該方法は、本開示の粒子造影剤組成物を使用して試料内の粒子を処理することと、着色した粒子をフローセル及び自動焦点装置を備える視覚分析器内の光で照射することと、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）内に包まれた粒子のデジタル化画像を得ることと、画像の情報に基づいて試料内の粒子を分析することとを含む。いくつかの実施形態では、粒子は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、血小板、網状赤血球、有核赤血球（ＲＢＣ）、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、赤血球（ＲＢＣ）、血小板、細胞、細菌、粒子状物質、細胞集塊、又は細胞断片又は成分のうちの少なくとも１つから選択される。例えば、いくつかの実施形態では、装置は、自動化画像ベース白血球（ＷＢＣ）分画、並びに被験者が健康であるかどうか、又は疾患、病態、若しくは感染症を有するかどうか、あるいは治療に対して反応性であるかどうか、又は非反応性であるかどうかの判定、診断、予後診断、予測、及び／又はその診断の支持に有用な、形態異常の自動化識別のために使用され得る。
上記のもの、及び本発明の実施形態の多数の他の特徴及び付随する利点は、付随の図と共に考慮されるとき、以下の詳細な説明への参照により、明らかになりより良く理解されるだろう。
例示的なフローセル、自動焦点システム、及び試料画像分析のためのデジタル画像処理を使用した高光学解像度撮像デバイスの動作態様を示す、部分的に断面であり、正確な縮尺ではない模式図である。 例示的な実施形態に従うフローセルの透視図である。 図２に示されるフローセルの線３〜３に沿った長手方向中央断面図である。 本発明の実施形態に従うフローセルの追加の断面図を提供する。 本発明の実施形態に従うフローセルの追加の断面図を提供する。 本発明の実施形態に従う、分析器システムの態様を描写する。 本発明の実施形態に従うフローセルの態様を描写する。 本発明の実施形態に従うフローセルの態様を描写する。 本発明の実施形態に従うフローセルの態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、それぞれカニューレ出口ポート及び画像捕捉部位での、フローセル内の、シース液（例えば、ＰＩＯＡＬ）エンベロープ及び試料流体ストリームの寸法の断面図を描写する。 本発明の実施形態に従う、それぞれカニューレ出口ポート及び画像捕捉部位での、フローセル内の、シース液（例えば、ＰＩＯＡＬ）エンベロープ及び試料流体ストリームの寸法の断面図を描写する。 本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、シース液組成物、方法、及び／又はシステムを使用して得られる結果の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、シース液組成物、方法、及び／又はシステムを使用して得られる結果の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、シース液組成物、方法、及び／又はシステムを使用して得られる結果の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、画像捕捉部位でのフローセル内のシース液及び試料の流れの態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、画像捕捉部位でのフローセル内のシース液及び試料の流れの態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、画像捕捉部位でのフローセル内のシース液及び試料の流れの態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、画像捕捉部位でのフローセル内のシース液及び試料の流れの態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、画像捕捉部位でのフローセル内のシース液及び試料の流れの態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、フローセル内の流体流れ速度の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、細胞内整列及び撮像の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、細胞内整列及び撮像の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、粒子及び／又は細胞内粒子整列におけるＰＩＯＡＬの効果の態様を描写する。ＰＩＯＡＬを使用して得られる画像の、非ＰＩＯＡＬシース液を使用して得られる画像に対するこの比較において、ＰＩＯＡＬの使用は、より焦点化された細胞内容物、例えば、ローブ、細胞質、及び／又は顆粒をもたらすということが分かる。 ＰＩＯＡＬを使用して得られる画像の、標準シース液を使用して得られる画像に対する比較を示す。ＰＩＯＡＬの使用がＲＢＣ整列の改善をもたらすということが分かる。 ＰＩＯＡＬを使用して得られる画像の、標準シース液を使用して得られる画像に対する比較を示す。ＰＩＯＡＬの使用がＲＢＣ整列の改善をもたらすということが分かる。 本発明の実施形態に従う、フローセル構成及びシース液を使用して得られた、特定の粒子整列結果を図示する。 本発明の実施形態に従う、シース液及び試料流体流れ特徴の態様を図示する。 本発明の実施形態に従う、シース液及び試料流体流れ特徴の態様を図示する。 本発明の実施形態に従う、粒子撮像方法の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、流れストリームのひずみ速度の態様を描写する。 本発明の実施形態に従う、流れストリームのひずみ速度の態様を描写する。
本開示は、粒子を含む試料を分析するための、装置、システム、組成物、及び方法に関する。一実施形態では、本発明は、例えば、視覚分析器であり得る、分析器を備える、自動化粒子撮像システムに関する。いくつかの実施形態では、視覚分析器は、画像の自動化分析を容易にするために、更にプロセッサを備え得る。
本開示に従い、視覚分析器を備えるシステムは、液体内に懸濁した粒子を含む試料の画像を得るために、提供される。該システムは、例えば、白血球分画、分類、及び副分類、並びに分析を含み、赤血球、網状赤血球、有核赤血球、血小板、及び白血球等の、生体液内の粒子を特徴付けることにおいて有用であり得る。血球を他の流体から特徴付けること等の、他の類似する用途もまた、本発明の実施形態によって包含される。典型的に、血液流体試料は、流れるシース液に導入され、複合したシース液及び試料流体は、試料リボン流体流れの厚さを低減する狭細流路遷移帯域で、圧縮される。したがって、細胞等の粒子は、血液流体試料内で、周りの粘性シース液によって、例えば、狭細遷移帯域によって提供される幾何学的集束効果との組み合わせで、配向及び／又は圧縮され得る。同様に、血球内の内部特徴は、試料流体とシース液との間の粘性差異の結果として、例えば、狭細遷移帯域によって提供される幾何学的集束効果との組み合わせで、整列及び配向され得る。
細胞等の粒子が分類及び／又は副分類される、容量、速さ、及び効率性を助けるために、データ処理システムによる自動化分析に、血球の明確で高い品質の画像を提供することが好都合である。本開示に従い、調製した試料ストリームは、フローセルの向かい合う壁の間に安定位置を有する薄いリボン内に配置される。試料ストリームの位置付け及びその薄いリボン形状への平坦化は、試料流体とは粘性において異なり、フローチャネルの対称的な狭細遷移帯域を通って流される、フローセルに導入されるＰＩＯＡＬの層の間の流れによって達成され得る。
血液−粒子分析システム
ここで図面を参照すると、図１は、試料流体を、デジタル画像処理を使用して試料流れストリーム３２内の微細粒子を撮像するための構成における高光学解像度撮像デバイス２４の表示帯域２３を通って運搬する、例示的なフローセル２２を模式的に示す。フローセル２２は、粒子造影剤組成物との接触及び加熱等の、処理を受けていたことがあり得る、試料流体の供給源２５に連結する。フローセル２２はまた、試料流体の粘性より高い粘性を有する透明なグリセロール溶液等の、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）の１つ以上の供給源２７にも連結する。
試料流体は、試料供給管２９の遠位端２８にて平坦な開口部を通して、ＰＩＯＡＬ流れが実質的に確立される点で、フローセル２２の内部へ注入され、リボン形状試料ストリームの上及び下（又は対向面）の、ＰＩＯＡＬの対称的な層流をもたらす。試料及びＰＩＯＡＬストリームは、ＰＩＯＡＬを注入された試料流体と共に、実質的に狭くなる流路に沿って移動させる、精密計量ポンプにより供給され得る。ＰＩＯＡＬは、流路が狭くなる帯域２１内で、試料流体を包み圧縮する。したがって、帯域２１での流路の厚さの減少は、試料ストリーム３２の幾何学的集束に寄与し得る。試料流体リボン３２は、包まれ、ＰＩＯＡＬと共に狭細帯域２１の下流に、高光学解像度撮像デバイス２４の前を、又は別の方法では例えば、ＣＣＤ ４８を使用して画像が収集される表示帯域２３を通って、運ばれる。プロセッサ１８は、ＣＣＤ ４８から、インプットとしてピクセルデータを受信し得る。試料流体リボンは、ＰＩＯＡＬと共に、排出部３３に流れる。
ここに示されるように、遠位厚さＤＴが近位厚さＰＴより小さくなるように、細狭帯域２１は、近位厚さＰＴを有する近位流路部分２１ａ、及び遠位厚さＤＴを有する遠位流路部分２１ｂを有し得る。したがって、試料流体は、近位部分２１ａの遠位、及び遠位部分２１ｂの近位の位置にて試料管２９の遠位端２８を通して注入され得る。したがって、試料流体は、ＰＩＯＡＬストリームが帯域２１によって圧縮される際に、ＰＩＯＡＬエンベロープに入ることができる。
対物レンズ４６を伴うデジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン形状試料ストリーム３２と交差する光学軸に沿って方向付けられる。対物４６とフローセル３３との間の相対距離は、フォトセンサアレイ上の、焦点デジタル画像の解像及び収集のために、モータ駆動５４の動作によって可変である。
いくつかの実施形態に従い、システムは試料流体リボン３２を流体集束させるために動作し得る。流体集束させる又は流体集束という用語は、シース液と試料流体との間の粘性差異、フローセルの幾何学的狭細遷移帯域、及びシース液と試料流体との間の速度差異によって影響される、集束効果を指す。流体力学的流れは、試料流体ストリームとシース液ストリームとの間の速度差異から生じ得、これは流れリボン厚さ及び形状に影響する。
フローセル
フローセル２２の実践的実施形態は、図２及び３において更に描写される。ここに示されるように、フローセル２２はまた、試料源２５と、及びＰＩＯＡＬ物質の供給源２７にも結合し得る。試料流体は、カニューレ２９を介して、例えば、カニューレ２９の遠位出口ポート３１を通して、フローセル２２に注入される。典型的に、ＰＩＯＡＬシース液は、供給源２７から表示帯域２３までのフローセル内の曲線チャネルセクション４１を通る際、層流状態ではない。しかしながら、フローセル２２は、試料流体が流れるシース液に導入される、遠位端出口ポート３１を過ぎて流れる際に、ＰＩＯＡＬシース液が層流である若しくは層流になるように、又は平坦な速度プロファイルを呈するように、構成され得る。試料流体及びＰＩＯＡＬは、フローセル２２に沿って、概して矢印Ａで示される方向に、その後排出部３３を介してフローセル２２の外に、流れ得る。フローセル２２は、流れ方向Ａで対称的に（例えば、遷移帯域２１にて）細くなる、内部流路２０を画定する。流路の対称性は、試料ストリームの頑強で集中した流れに寄与する。フローセル２２は、ＰＩＯＡＬで包まれた試料の流れ３２を、フローセル内の表示帯域２３、すなわち表示ポート５７の後ろを通して方向付けるように構成される。自動焦点パターン４４が表示ポート５７に関連付けられる。フローセル２２は、顕微鏡対物レンズ（図示せず）を受け入れる又は収容するように構成される、丸い又はくぼんだシート５８を有する。
いくつかの実施形態に従い、自動焦点パターン４４は、フローセル２２に対して固定され、リボン形状試料ストリーム３２の平面からの移動距離にて位置付けられる位置を有し得る。ここに示される実施形態では、自動焦点パターン（目標４４）は、フローセル２２に、高光学解像度撮像デバイス（図示せず）によって表示ポート５７を通して収集された画像において可視的な位置にて、直接適用される。フローセル２２は、物質の単一の部品から構造化され得る。あるいは、フローセル２２は、第１の又は上部セクション又は層２２ａ、及び第２の又は下部セクション又は層２２ｂで構造化され得る。ここに示されるように、ガラス又は透明窓ガラス６０が、第１のセクション２２ａに取り付けられるか、又はそれと一体である。窓ガラス６０は、フローセル内の試料流路の少なくとも一部分を画定し得る。光源４２からの光は、フローストリーム３２内を流れる試料粒子を照射するために、自動焦点パターン４４の隙間又は通路を通って移動する。
いくつかの場合では、窓ガラス６０の厚さは、約１５０μｍ〜約１７０μｍの範囲内の値を有し得る。上述のように、窓ガラス６０は、流路又はシース（例えば、ＰＩＯＡＬ）チャネルの一部を、画定又は形成し得る。薄い窓ガラス６０を使用することにより、顕微鏡対物レンズを、試料流体リボンに非常に近く配置することが可能であり、よって、流路に沿って流れる粒子の高度に拡大された画像を得ることが可能である。
図３Ａは、フローセルの実施形態の態様を描写し、ここにおいて撮像軸３５５と遠位遷移帯域部分３１６との間の距離は、約８．２４ｍｍである。遠位遷移帯域部分３１６とカニューレ出口ポート３３１との間の距離は、約１２．５４ｍｍである。カニューレ出口ポート３３１とシース液入口３０１との間の距離は約１２．７ｍｍである。カニューレ出口ポート３３１と近位遷移帯域部分３１８との間の距離は、約０．７３ｍｍである。図３Ｂは、フローセルの実施形態の態様を描写し、ここにおいてカニューレ出口ポートは、遷移帯域に対して、図３Ａの実施形態と比較して、より遠位位置に移動している。ここに示すように、カニューレ遠位端は、フローセルの狭細遷移帯域に前進し、撮像軸３５５と遠位遷移帯域部分３１６との間の距離は、約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内である。いくつかの場合では、撮像軸３５５と遠位遷移帯域部分３１６との間の距離は、約２１ｍｍである。
図１に戻って参照すると、フローセル内部輪郭（例えば、遷移帯域２１にて）並びに、ＰＩＯＡＬ及び試料流量は、試料がリボン形状のストリーム３２に形成されるように、調節することができる。ストリームは、リボン形状の試料ストリームに包まれた粒子と約同じ薄さ又は更にはより薄くあり得る。白血球は、例えば、約１０μｍの直径を有し得る。リボン形状の試料ストリームに１０μｍ未満の厚さを提供することで、リボン形状の試料ストリームがシース液又はＰＩＯＡＬによって伸長されたとき、細胞は配向され得る。リボン形状の試料ストリームより高い粘性等の、異なる粘性のＰＩＯＡＬ層内の、狭細流路に沿うリボン形状の試料ストリームの驚くべき伸長は、好都合なことに、非球形粒子を流れ方向に実質的に平行な平面に整列させ、細胞に力を適用し、細胞の細胞内構造の焦点内容物を改善する傾向がある。高光学解像度撮像デバイス２４の光軸は、リボン形状の試料ストリームの平面に、実質的に垂直（直角）である。リボン形状の試料ストリームの、撮像点での線速度は、例えば、２０〜２００ｍｍ／秒であり得る。いくつかの実施形態では、リボン形状の試料ストリームの線速度は、例えば、５０〜１５０ｍｍ／秒であり得る。
リボン形状の試料ストリームの厚さは、試料流体及びＰＩＯＡＬの相対的粘性及び流量によって影響され得る。試料の供給源２５及び／又はＰＩＯＡＬの供給源２７は、例えば、容積型ポンプを備え、リボン形状の試料ストリーム３２、すなわち少なくとも高光学解像度撮像デバイス２４の視野と同じ幅の細いリボンの寸法を最適化するために、制御可能な流量で試料及び／又はＰＩＯＡＬを提供するように構成され得る。
一実施形態では、ＰＩＯＡＬの供給源２７は、ＰＩＯＡＬを所定の粘性で提供するように構成される。粘性は、試料の粘性とは異なり得、試料の粘性よりも高くあり得る。ＰＩＯＡＬの粘性及び密度、試料物質の粘性、ＰＩＯＡＬの流量、及び試料物質の流量は、自動パターンからの移動距離にて、好都合なリボン形状の試料ストリーム厚さ等の、所定の寸法特徴で、リボン形状の試料ストリームを維持するために協調する。
実践的な実施形態では、ＰＩＯＡＬは、試料よりも速い線速度及び試料よりも高い粘性を有し、それによって試料を平坦なリボンに伸張する。ＰＩＯＡＬ粘性は、最大１０センチポアズであり得る。
更に図２及び３を参照すると、フローセルの内部流路は、リボン形状の試料ストリームのＰＩＯＡＬ注入の点の下流を細くし、例えば、最大７μｍのリボン形状の試料ストリームの厚さを生成し、及び／又は内部流路が５００〜３，０００μｍのリボン形状の試料ストリームの幅を生成する。例示的な実施形態では、図１に描写のように、フローセルの内部流路は、試料ストリームのＰＩＯＡＬへの注入の点の上流で、狭細遷移帯域を開始する。
別の実施形態では、内部流路は、厚さで２〜４μｍのリボン形状の試料ストリームの厚さを生成するために細くなり、及び／又は、内部流路は幅が２０００μｍのリボン形状の試料ストリームをもたらす。これらの寸法は、血液学に特に有用である。この場合のストリームの厚さは、緩和状態の赤血球等の、いくつかの粒子の直径よりも小さい。結果的に、これらの粒子は、そのより広い寸法が撮像軸に面するように再配向され得、これは際立った特徴を明らかにすることにおいて有用である。
リボン形状の試料ストリームの線速度は、フォトセンサアレイの画像露出時間でのデジタル画像の移動ぶれを防止するために、十分に制限することができる。光源は、任意に、短い時間に高い入射振幅を適用するために閃光する、ストロボ光であり得る。自動焦点パターン４４及び画像が同じ視野にあるため、光源は、リボン形状の試料ストリーム及び自動焦点パターンを同時に照射するように構成される。しかしながら、他の実施形態では、撮像のため及び自動焦点のための視野は異なり得、例えば、別個に照射及び／又は撮像される。
対象開発は、方法、並びに装置の態様を有する。視覚分析器を焦点化する方法は、デジタル高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスであり得る、高光学解像度撮像デバイス２４を、フローセル２２に対して固定された自動焦点パターン４４上で焦点化することを含み、ここにおいて自動焦点パターン４４は、リボン形状の試料ストリーム３２からの移動距離５２に位置付けられる。デジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン形状の試料ストリーム３２に交差する光学軸を伴う、対物レンズを有する。対物レンズとフローセル２２との間の相対距離は、モータ駆動５４の動作によって変化するが、一方で、高光学解像度撮像デバイスと最適焦点の点との間の、光学軸に沿う距離は既知である。デジタル高光学解像度撮像デバイスは、フォトセンサアレイ上でデジタル画像を解像及び収集するように構成される。モータ駆動は、自動焦点プロセスにおいて、自動焦点パターン上で焦点化するように動作される。モータ駆動は、その後移動距離を越えて動作され、それによって、高光学解像度撮像デバイスをリボン形状の試料ストリームに焦点化する。
該方法は、更に、リボン形状の試料ストリームをリボン形状に形成することを更に含み得る。高光学解像度撮像デバイスの光学軸が、リボン形状の試料ストリームに実質的に直角に、すなわちリボン形状のストリームの平面に垂直になるように、リボン形状が提供される。
図４は、血液流体試料内の粒子の撮像のためのシステム４００の態様を描写する。ここに示されるように、システム４００は、試料流体注入システム４１０と、フローセル４２０と、画像捕捉デバイス４３０と、プロセッサ４４０とを含む。フローセル４２０は、シース液の流れを、任意に試料流体との組み合わせで送る、流路４２２を提供する。いくつかの実施形態に従い、試料流体注入システム４１０は、カニューレ又は管４１２を含み得る又はそれらと連結し得る。試料流体注入システム４１０は、流路４２２と（例えば、試料流体入口４０２を介して）流体連通し得、試料流体４２４を、カニューレ４１２の遠位出口ポート４１３を通して、フローセル４２０内を流れるシース液４２６に注入するために動作し得、試料流体ストリーム４２８を提供する。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、試料流体注入システム４１０に試料流体４２４を流れるシース液４２６に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を含み得るか、又はそれと動作可能に関連し得る。ここに示されるように、シース液４２６は、シース液注入システム４５０によって（例えば、シース液入口４０１を介して）フローセル４２０へ導入され得る。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、シース液注入システム４５０に、シース液４２６をフローセル４２０に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を含み得るか、又はそれと動作可能に関連し得る。図４に描写されるように、カニューレ４１２の遠位出口ポート４１３は、狭細遷移帯域４１９の長さに沿う中央位置に位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポートは、遷移帯域４１９の開始部（近位部分）のより近くに位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポートは、遷移帯域４１９の端（遠位部分）のより近くに位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポート４１３は、例えば、図３Ａに描写されるように（遠位出口ポート３３１が狭細遷移帯域の近位に配設される）、遷移帯域４１９の完全に外部に位置付けられ得る。
試料流体ストリーム４２８は、注入管４１２に隣接する第１の厚さＴ１を有する。フローセルの流路４２２は、流路の大きさの縮小部を有し、よって、試料流体ストリーム４２８の厚さが初期厚さＴ１から、画像捕捉部位４３２に隣接する第２の厚さＴ２に縮小する。第１の試料流体からの第１の複数の粒子を、フローセル４２０の画像捕捉部位４３２にて撮像するために、画像捕捉デバイス４３０は画像捕捉部位４３２と整列する。
プロセッサ４４０は、試料流体注入システム４１０、画像捕捉デバイス４３０、及び任意にシース液注入システム４５０と連結する。プロセッサ４４０は、試料流体の過渡が開始するように、第１の試料流体の流れるシース液４２６への注入を終了させ、第２の試料流体の流れるシース液４２６への注入を開始させるように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、試料流体の過渡が開始するように、プロセッサによって実行されると、試料流体注入システム４１０に、第２の試料流体を流れるシース液４２６に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含み得るか又はそれと動作可能に関連し得る。
更に、プロセッサ４４０は、フローセル４２０の画像捕捉部位４３２にて、第２の試料流体からの第２の複数の粒子の画像の捕捉を、試料流体過渡の後でかつ第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に、開始するように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、画像捕捉デバイス４３０に、フローセル４２０の画像捕捉部位４３２にて、第２の試料流体からの第２の複数の粒子の画像の捕捉を、試料流体過渡の後でかつ第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に、開始させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含み得るか又はそれと動作可能に関連し得る。
結果的に、本発明の実施形態は、試料流体粘性を有する血液流体試料４２４内の複数の粒子を撮像するためのシステム４００を包含する。システム４００は、試料流体粘性とは所定の粘性差異範囲内の粘性差異で異なるシース液粘性を有する、シース液４２６と共に使用され得る。システム４００は、流路４２２及び試料流体注入管４１２を有する、フローセル４２０を含み得る。流路４２２は、流路の大きさにおける縮小部又は狭細遷移帯域を有し得る。更に、システム４００は、シース液の流れをフローセル４２０の流路４２２に沿って送るために、フローセル４２０の流路４２２と流体連通するシース液インプット４０１を含み得る。システム４００はまた、血液流体試料の流れ又はストリーム４２８を、フローセル４２０内を流れるシース液４２８に注入するために、フローセル４２０の注入管４１２と流体連通する血液流体試料インプット４０２も含み得る。例えば、試料流体４２４は、カニューレ４１２の遠位出口ポート４２３から流れるシース液４２６のエンベロープへと出ることができ、そこで試料リボン４２８を形成する。
シース液４２６が、試料流体４２４から形成された試料流体リボン４２８と共に、流路の大きさの縮小部４１９を通って撮像部位４３２に向かって流れる際に、粘性差異に関連する、シース液４２６と試料流体４２４との間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路の大きさの縮小部に関連する、シース液４２６と試料流体４２４との間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、撮像部位４３２での複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供する。ここに示されるように、システム４００はまた、撮像部位４３２にて複数の粒子を撮像する、撮像デバイス４３０も含む。
図４Ａに描写されるフローセルの実施形態において示されるように、流路の大きさにおける縮小部（例えば、遷移帯域４１９ａ）は、流路４２２ａの向かい合う壁４２１ａ、４２３ａによって画定され得る。向かい合う壁４２１ａ、４２３ａは、流路４２２ａに沿って半径方向内側に角度があり得、概して試料流体ストリーム４２８ａを二等分する横断面４５１ａについて対称である。面４５１ａは、試料ストリームが第１の厚さＴ１を有する試料ストリーム４２８ａを、試料ストリーム４２８ａがカニューレ又は試料注入管４１２ａの遠位部分４２７ａを出る位置にて二等分する。同様に、面４５１ａは、試料ストリームが第２の厚さＴ２を有する試料ストリーム４２８ａを、試料ストリーム４２８ａが画像捕捉部位４３２ａを過ぎた位置にて二等分する。いくつかの実施形態に従い、第１の厚さＴ１は、約１５０μｍの値を有し、第２の厚さＴ２は、約２μｍの値を有する。かかる場合では、試料リボンストリームの圧縮比は、７５：１である。いくつかの実施形態では、第１の厚さＴ１は、約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内の値を有し、第２の厚さＴ２は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲内の値を有する。試料ストリーム流体がフローセルを通って流れる際に、リボンは加速し伸長するにつれて、薄くなる。フローセルの２つの特徴が、試料流体リボンを薄くすることに寄与し得る。第１に、シース液エンベロープと試料流体リボンとの間の速度差異が、リボンの厚さを低減するように動作し得る。第２に、遷移帯域の先細り形状が、リボンの厚さを低減するように動作し得る。図４Ａに描写されるように、カニューレ４１２ａの遠位出口ポート４１３ａは、狭細遷移帯域４１９ａの長さに沿う中央位置にて位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポートは、遷移帯域４１９ａの開始部（近位部分４１５ａ）のより近くに位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポートは、遷移帯域４１９ａの端（遠位部分４１６ａ）のより近くに位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポート４１３ａは、例えば、図３Ａに描写されるように（遠位出口ポート３３１が狭細遷移帯域の近位に配設される）、遷移帯域４１９ａの完全に外部に位置付けられ得る。
図４Ａ（並びに図４及び４Ｂ−１）に描写されるように、遷移帯域４１９ａは、近位（４１５ａ）及び遠位（４１６ａ）部分での角度遷移によって画定され得る。遷移帯域４１９ａは、近位（４１５ａ）及び遠位（４１６ａ）部分にて、図１、３、３Ａ、３Ｂ、及び４Ｂ−２に描写される滑らかな又は曲線の遷移に類似する、滑らかな又は曲線の遷移を代わりに呈し得るということもまた理解される。
典型的に、第１の厚さＴ１は、試料粒子の大きさよりも非常に大きく、よって粒子は全体が試料リボンストリーム内に含まれる。しかしながら、第２の厚さＴ２は、特定の試料粒子の大きさよりも小さくあり得、よってそれらの粒子は試料流体から周りのシース液へ伸び得る。図４Ａに示されるように、試料リボンストリームは、概してカニューレを出て画像捕捉部位に向かって移動するのと同じ面に沿って流れ得る。
フローセルはまた、遠位カニューレ部分４２７ａと画像捕捉部位４３２ａとの間に分離距離４３０ａも提供し得る。いくつかの実施形態に従い、試料流体注入管４１２ａの遠位部分４２７ａは、画像捕捉部位４３２ａからの軸分離距離４３０ａにて位置付けられ得、ここにおいて軸分離距離４３２ａは約２１ｍｍの値を有する。いくつかの場合では、軸分離距離４３０ａは約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内の値を有する。
カニューレ出口ポートと画像捕捉部位との間の軸分離距離４３０ａは、流体が出口ポートから画像捕捉部位に移動する際の、試料流体の遷移時間に影響を与え得る。例えば、総体的により短い軸分離距離４３０ａは、より短い遷移時間に寄与し、総体的により長い軸分離距離４３０ａは、より長い遷移時間に寄与し得る。
流路遷移帯域４１９ａに対する、又は流路遷移帯域４１９ａの近位部分４１５ａに対する、カニューレ遠位部分４２７ａでの出口ポートの位置もまた、流体が出口ポートから画像捕捉部位に移動する際の、遷移時間に推定し得る。例えば、シース液は、近位部分４１５ａにて相対的により遅い速度、及び近位部分４１５ａと遠位部分４１６ａとの間の位置にて相対的により速い速度を有し得る。したがって、遠位部分４２７ａでのカニューレ出口ポートが、近位部分４１５ａにて位置付けられる場合、試料流体が画像捕捉部位に到達するための長い時間がかかり得、これは移動距離がより長いためだけではなく、カニューレ遠位域を出た後の試料流体の初期速度もより遅い（より遅いシース液速度のため）ためである。言い換えると、フローセルのより厚い部分（例えば、近位部分４１５ａ付近）において試料流体がより長く存在するほど、試料が画像捕捉部位に到達することにより長い時間がかかる。逆に、遠位部分４２７ａでのカニューレ出口ポートが近位部分４１５ａの遠位に（例えば、図４Ａに描写されるように、近位部分４１５ａと遠位部分４１６ａとの間の中央位置にて）位置付けられる場合、試料流体が画像捕捉部位に到達することにかかる時間がより短く、これは、移動距離がより短いためだけではなく、カニューレ遠位域を出た後の試料流体の初期速度もより速い（速いシース液速度のため）ためである。本明細書の他の箇所で記載したように、シース液は、帯域４１９ａの断面積が狭くなるため、遷移帯域４１９ａを通って流れる際に加速する。
いくつかの実施形態に従い、より短い遷移時間を伴い、画像捕捉部位での画像収集により多い時間が使用可能になる。例えば、カニューレ遠位先端から撮像区域への遷移時間の期間が減少するに伴い、特定の時間内により多くの試料を処理することが可能になり、関連して特定の時間内により多くの画像（例えば、１分当たりの画像）を得ることが可能である。
カニューレ遠位部分４２７ａの出口ポートを、画像捕捉部位４３２ａのより近くに位置付けることに関連する利点がある一方で、ポートと捕捉部位との間にある程度の距離を維持することもまた望ましい。例えば、図３に描写されるように、撮像デバイスの光学対物レンズ又は前方レンズは、フローセル２２のシート５８において位置付けられ得る。カニューレの出口ポート３１がシート５８に近すぎる場合、画像捕捉部位にて所望の撮像特性を提供するためにシース液に注入された後、試料流体が十分に安定化されないことがある。同様に、先細りの領域が画像捕捉デバイスの対物レンズを収容するシート５８の位置付けに干渉しないように、先細りの遷移領域２１を表示帯域２３から離して維持することもまた望ましいことがある。
続けて図４Ａを参照すると、試料流体注入管４１２ａの下流端４２７ａは、流路遷移帯域４１９ａの近位部分４１５ａの遠位に位置付けられ得る。関連して、試料流体注入管４１２ａの顆粒端４２７ａは、流路遷移帯域４１９ａの遠位部分４１６ａの近位に位置付けられ得る。したがって、いくつかの実施形態に従い、試料流体は、遷移帯域４１９ａ内の位置にて注入カニューレ４１２ａからフローセルに注入され得る。
いくつかの実施形態に従い、流路の大きさにおける（例えば、流路遷移帯域４１９ａでの）縮小部における対称性は、血液流体試料内の粒子の不整列を制限するために動作する。例えば、かかる対称性は、血液流体試料内の赤血球撮像配向不整列を、約２０％未満に制限することに効果的であり得る。
いくつかの実施形態に従い、本明細書に開示する方法は、血液計数分析の間の、試料の３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未満までの減退率に対して動作可能である。
いくつかの実施形態に従い、画像捕捉部位４３２ａは、１５０μｍ×１５０μｍ〜４００μｍ×４００μｍの間の視野４３３ａを有する。いくつかの場合では、画像捕捉部位４３２ａは、約２７５μｍ×２７５μｍの視野４３３ａを有する。いくつかの場合では、視野は、長さ×幅で画定され得る。表面積として表現される場合、２７５μｍ×２７５μｍの視野は、７５，６２５μｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態に従い、視野は、撮像デバイス対物レンズ及びその倍率によって決定され得る。いくつかの場合では、視野は、収集光学素子（例えば、対物レンズ、管レンズ、及びカメラ）によって撮像される、視野（面積）の範囲に対応し得る。いくつかの場合では、視野は、画像捕捉部位での透明区域の表示ポートよりもはるかに小さい。
図４Ａ−１及び４Ａ−２は、カニューレ出口ポートから画像捕捉部位へ移動する際の、試料ストリーム上の流体集束の効果を図示する。図４Ａ−１に示されるように、試料ストリームは、約１５０μｍの高さＨ（Ｓ）及び約１３５０μｍの幅Ｗ（Ｓ）を有し得る。更に、ＰＩＯＡＬシースストリームは、約６０００μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）を有し得る。流体集束の後に、図４Ａ−２に示されるように、試料ストリームは約２μｍの高さＨ（Ｓ）及び約１３５０μｍの幅Ｗ（Ｓ）を有し得る。更に、ＰＩＯＡＬシースストリームは、約１５０μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）を有し得る。一実施形態では、カニューレ出口でのＰＩＯＡＬシースストリームの断面積は、画像捕捉部位付近の断面積よりも４０倍大きい。
いくつかの実施形態に従い、画像捕捉部位にてフローセルチャネルの断面を測定することが有用であり得る。これは、図４Ａ−２に描写されるように、ＰＩＯＡＬシースストリームの、約１５０μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）に対応する。フローセルを通って流れる、複合した試料及びシース液の容積流量を、画像捕捉部位にて測定することもまた有用であり得る。断面積及び流量が分かっている場合、複合した試料及びシース液の速度を画像捕捉部位にて測定することが可能である。
いくつかの実施形態に従い、フローセルを通る試料及びシース液の流れは、平行板プロファイルモデルで概算することができる。関連して、試料流体ストリームの中央における流量（例えば、図４Ａ−２に描写される）は、複合した試料及びシース液ストリームの平均流量の約１．５倍であり得る。
いくつかの実施形態に従い、カニューレ出口での試料の流れの断面積（例えば、図４Ａ−１におけるＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））は、撮像部位での試料の流れの断面積（例えば、図４Ａ−２におけるＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））より４０倍大きい。撮像区域でのシース液の容積流量は、約４５μＬ／秒であり得る。撮像区域での試料流体の容積流量は、約０．２３２μＬ／秒であり得る。いくつかの場合では、撮像部位での、複合したシース及び試料ストリームの断面積は、６００，０００μｍ２である。いくつかの場合では、撮像部位での平均流れストリーム速度は、７５ｍｍ／秒である。
流量又は速度は、明確で焦点の合った細胞画像をもたらす速度として決定され得る。例示的な流量及び速度は、撮像部位にて特定の試料流れストリームリボン形状又は特徴を達成することが観察された、２つの試料の流速に基づいて発見された。例えば、約７５ｍｍ／秒（又は２０〜２００ｍｍ／秒の範囲内）の流量にて、連続画像において細胞の重複があるほど細胞の流れが遅すぎることはなく、ゴースト効果（ぼけた画像）が生まれるほど細胞の流れが速すぎることはない。関連して、過剰に高い流量を避けることによって、より多くの試薬及び試料を保存することが可能になる。いくつかの実施形態に従い、容積流量（ポンプ速度）又はカニューレの形状のいずれかを変更することによって、最適又は所望の線速度が達成され得る。
試料ストリームの画像捕捉帯域を通る流速はまた、フローセル機能に対する画像捕捉デバイスの性能にも関連し得る。例えば、試料ストリームの流れが速すぎる場合、試料内に含まれる粒子の明確な画像を得ることが難しいことがある（例えば、画像捕捉デバイスのシャッター速度が遅すぎ、よってぼけた画像を生成することがあり得る）。同様に、試料ストリームの流れが遅すぎる場合、画像捕捉デバイスは同じ粒子の連続画像を得ることがある（例えば、同じ粒子が２つの画像捕捉の間、捕捉フレームに残る）。いくつかの実施形態では、フレーム捕捉の間の流れが最小になり、高い割合の試料が撮像されるように、試料リボンの速度は、画像捕捉率に対して調節され得る（例えば、様々なフローセル動作パラメータのうちの任意のものを調節することによって）。
いくつかの実施形態に従い、粒子分析システム及び関連する構成要素は、シース液及び流体試料がフローセルを通って流れる際に、シース液が４５μＬ／秒のシース液容積流量で流れることができ、流体試料が０．２３２μＬ／秒（又は０．２〜０．３５μＬ／秒の範囲内）の流体試料容積流量で流れることができるように、構成され得る。いくつかの場合では、シース液流量の試料流体流量に対する比率は約２００である。いくつかの場合では、シース液流量の試料流体流量に対する比率は、約７０〜２００の範囲内の値を有する。いくつかの場合では、シース液流量の試料流体流量に対する比率は約１９３である。いくつかの場合では、シース液流量の試料流体流量に対する比率は約７０である。場合によっては、フローセル内を流れるシース液容積の流体試料容積に対する比率は、２５：１〜２５０：１の範囲内であり得る。
いくつかの実施形態に従い、システム及び関連する構成要素は、シース液及び流体試料がフローセル４２０を通って流れる際に、撮像区域の前でシース液が７５ｍｍ／秒のシース液速度で流れることができ、撮像区域の前で流体試料が１３０ｍｍ／秒の流体試料速度で流れることができるように、構成され得る。場合によっては、フローセル内を流れるシース液容積の流体試料容積に対する比率は、１００：１〜２００：１の範囲内であり得る。
場合によっては、フローセルは約５０：１の最小圧縮比率及び約１２５：１の最大圧縮比率を有し得る。いくつかの場合では、最小圧縮比率は約３０：１又は２０：１であり得る。この圧縮比率は、図４Ａ−１を図４Ａ−２と比較した際の流れストリーム厚さの比率Ｈ（Ｓ）：Ｈ（Ｓ）を指す。この圧縮比率は、幾何学的圧縮（例えば、図４Ａ−１を図４Ａ−２と比較した際のシース液の厚さの比率Ｈ（Ｐ）：Ｈ（Ｐ）であり、これは図４Ａに示されるフローセル狭細先細り遷移帯域４１９ａの寸法に概して対応する）と、流体力学的圧縮（例えば、速度における差異にもまた対応する）との組み合わせによって影響され得る。いくつかの実施形態に従い、幾何学的圧縮比率は、約４０：１である。
遷移帯域に対応する、流路の大きさにおける縮小部は、近位厚さ又は高さを有する近位流路部分、及び近位厚さ又は高さより小さい遠位厚さ又は高さを有する遠位流路部分によって画定され得る。例えば、図４Ｂ−１及び４Ｂ−２の部分図に示されるように、流路の遷移帯域４１９ｂは、近位部分４１５ｂと遠位部分４１６ｂとの間に長さＬを有し得、ここにおいて近位部分４１５ｂは近位高さ４１７ｂを有し、遠位部分４１６ｂは遠位高さ４１８ｂを有する。図４Ｂ−２に描写され、本明細書の他の箇所でも述べられるように、遷移帯域の形状又は輪郭は、曲線又は滑らかであり得、例えば、Ｓ曲線、Ｓ字状曲線、又は正接曲線の形状で提供され得る。いくつかの実施形態に従い、近位高さ４１７ｂは約６０００μｍの値を有する。いくつかの場合では、近位高さ４１７ｂは、約３０００μｍ〜約８０００μｍの範囲内の値を有する。いくつかの実施形態に従い、遠位高さ４１８ｂは約１５０μｍの値を有する。いくつかの場合では、遠位高さ４１８ｂは、約５０μｍ〜約４００μｍの範囲内の値を有する。
遷移帯域４１９ａの幾何学的形状は、第１の流路境界４０３ｂと二等分横断面４５１ｂとの間の第１の角度α１、及び第２の流路境界４０４ｂと二等分横断面４５１ｂとの間の第２の角度α２を提供し得る。いくつかの場合では、角度α１は約４５度であり、角度α２は約４５度である。いくつかの場合では、角度α１は、約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。いくつかの場合では、角度α２は、約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。いくつかの実施形態に従い、角度α１及びα２は、同じ値を有する。角度α１及びα２は、近位部分４１５ｂから遠位部分４１６ｂに移動する際に、試料流体の層流を維持する又は乱流を最小化するために選択され得、これは同じく横断面４５１ｂに沿う試料内の粒子の整列を増強し得る。図４Ａを参照して上述したように、遠位及び近位境界又は遷移帯域の部分は、角度が付く代わりに、曲線又は滑らかであり得る。
図４Ｃは、本発明の実施形態に従う例示的なカニューレ又は試料供給管４００ｃの特徴を描写し、ここにおいてカニューレは長さＬを有する。図４Ｄは、カニューレ４００ｄの長手方向断面図を描写する。ここに示されるように、カニューレ４００ｄは、遠位平坦セクション４１０ｄ、中央先細りセクション４２０ｄ、及び近位管状部分４３０ｄを含む。図４Ｃ−１に描写されるように、例示的なカニューレ又は試料供給管４００ｃ−１は、遠位部分４１０ｃ−１及び近位部分４３０ｃ−１を有し得る。いくつかの場合では、遠位部分４１０ｃ−１は、約１．３５９ｍｍの長さ及び約１．４３ｍｍの幅を有する。いくつかの場合では、遠位端の出口ポートは約１．３５９ｍｍの出口幅Ｗ（Ｅ）を有する。いくつかの実施形態に従い、カニューレは図４Ｃ及び４Ｄに描写されるものとは異なる内部流路形状を有し得る。例えば、図４Ｄ−１に図示されるように、カニューレ４００ｄ−１は、先細り中央セクションを含まず、拡張した流面積断面を有する。図４Ｄ−１に描写されるように、カニューレ４００ｄ−１は、遠位セクション４１０ｄ−１、先細り内径を有する中央先細りセクション４２０ｄ−１、及び近位セクション４３０ｄ−１を有する。中央セクション４２０ｄ−１の先細り内径に対応し、４１０ｄ−１の内部断面積は、４３０ｄ−１の内部断面積よりも小さい。
本発明の実施形態に従う血液システムは、約１５０μＬの容積を有する血液試料を処理することができる。吸引される血液容積は、約１２０〜１５０μＬであり得る。いくつかの場合では、試料管内の最小使用可能血液容積は、自動試料採取モードについては約５００μＬ、及び手動試料採取モードについては約２５０μＬである。図４Ｄに示されるカニューレ又は注入管４００ｄは、約１３μＬの内部容積を有する。いくつかの実施形態に従い、カニューレ又は注入管は、約３０μＬ未満の内部容積を有する。
図４Ｅは、遠位平坦セクション４１０ｅの横断面を図示する。ここに示されるように、遠位セクション４１０ｅは内部幅Ｗ（Ｉ）及び内部高さＨ（Ｉ）を有し、これを通って試料ストリームが流れる。更に、遠位セクション４１０ｅは、外部幅Ｗ（Ｏ）及び外部高さＨ（Ｏ）を有する。組み合わされる図４Ｄ及び４Ｅに描写されるように、試料流体注入管の遠位部分４１０ｅは、高さＨ（Ｉ）及び幅Ｗ（Ｉ）を有する排出ポートＰを有し、ここにおいて高さＨ（Ｉ）は幅Ｗ（Ｉ）よりも小さい。いくつかの実施形態に従い、遠位部分４１０ｅの排出ポートＰの高さＨ（Ｉ）（又は遠位部分４１０ｄの内部高さ）は、約１５０μｍの値を有し得る。いくつかの場合では、高さＨ（Ｉ）は、約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内であり得る。いくつかの実施形態に従い、遠位部分４１０ｅの排出ポートＰの幅Ｗ（Ｉ）（又は遠位部分４１０ｄの内部幅）は、約１３５０μｍの値を有し得る。いくつかの場合では、幅は約１１９４μｍである。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｉ）は約５００μｍ〜約３０００μｍの範囲内の値を有し得る。いくつかの場合では、遠位平坦セクション４１０ｄは、管又は導管に型締力をかけることによって製造され得る。
図４Ｆは、中央先細りセクション４２０ｆの横断面を図示する。ここに示されるように、中央先細りセクション４２０ｆは、試料ストリームが通って流れる、内径Ｄ（Ｉ）を有する。更に、中央先細りセクション４２０ｆは外径Ｄ（Ｏ）を有する。図４Ｇは、近位セクション４３０ｇの横断面を図示する。ここに示されるように、近位セクション４３０ｇは、試料ストリームが通って流れる内径Ｄ（Ｉ）を有する。更に、遠位セクション４３０ｇは外径Ｄ（Ｏ）を有する。
図４Ｄに描写されるように、注入管又はカニューレ４００ｄは、第１の流れ断面積（例えば、図４に示されるπ＊（Ｄ／２）２）を有する近位部分４３０ｄと、第１の流れ断面積よりも小さい第２の流れ断面積（例えば、図４Ｅに示されるＷ（Ｉ）＊Ｈ（Ｉ））を有する遠位部分４１０ｄと、及び近位部分４３０ｄと遠位部分４１０ｄとの間に配設された第３の部分４２０ｄとを有し得る。第３の部分４２０ｄは、第１及び第２の流れ断面よりも大きい第３の流れ断面（例えば、図４Ｆに示されるπ＊（Ｄ／２）２）を有し得る。場合によっては、近位部分４３０ｇの外径Ｄ（Ｏ）は、約１０６７μｍであり、近位部分４３０ｇの内径Ｄ（Ｉ）は約８１３μｍである。
細胞構造、内容物、及び整列
いくつかの実施形態に従い、白血球の着色及び視覚化を達成するために、着色剤が白血球と結合することができるように、試料内の赤血球を溶解し、白血球を透過処理することが役立つ。細胞への形態における変化がほとんどない又は全くない白血球の着色剤を得ることが多くの場合望ましい。更に、Ｗｒｉｇｈｔ着色に類似する着色特性を得ることが多くの場合望ましい。更に、高い赤血球整列（例えば、目標＞９０％）を得ることが多くの場合望ましい。
図４Ｈ（上部板）は、グルタルアルデヒドを含まない着色製剤を使用して得られた結果を描写する。フローセル内で遭遇するせん断力の結果として、細胞が崩れるということが観察された。核の良好な着色に到達したものの、核自体が変形したように見え、細胞膜は損傷したように見えた。まとめると、撮像された際、細胞内容物及び構造の崩壊のため、細胞は破壊されたように見えた。
図４Ｈ（下部板）は、グルタルアルデヒドを含む着色製剤を使用して得られたＷＢＣ結果を描写する。ここに示されるように、細胞膜は無傷であり、細胞は丸い。したがって、グルタルアルデヒドを使用しなかった着色剤のバージョン（例えば、図４Ｈに示される）は、弱化ＷＢＣをもたらすという結果になったということが観察された。ＷＢＣは図４Ｈ（下部板）においてより無傷であるものの、核部分は損傷される。
図４Ｈ（下部板）画像を得るために使用されるシース液（ＰＩＯＡＬ）は、グリセロールを３０％含んだ。対照的に、図４Ｉ（上部板）画像を得るために使用されたシース液（ＰＩＯＡＬ）は、グリセロールを６．５％含んだ。グリセロールのより低い濃度は、核をほとんど変化させず、より良好な形態をもたらした。したがって、図４Ｉ（上部板）における細胞膜は、図４Ｈ（下部板）における細胞膜よりもはるかに無傷であるということが観察された。図４Ｉ（上部板）におけるより低いグリセロール濃度は、粘性差異を低減するように動作し得、それによってせん断力を低減する。過剰なせん断力が存在する場合、力は細胞膜を破壊し得る。グリセロールは、いくつかの細胞と不適合な特性を有し得、よってグリセロールのより高い濃度もまた細胞膜を破壊し得る。したがって、図４Ｈ（上部板）に描写される核への損傷は、シース液内の３０％のグリセロールの結果であり得ると結論付けることが可能である。
しかしながら、グリセロール濃度が図４Ｉ（上部板）に描写されるように、６．５％まで下げられたとき、試料流体内の赤血球の整列は少なくなるということが観察された。
赤血球の整列の改善を得る試みにおいて様々な代替のＰＩＯＡＬ製剤が使用されたが、これらの代替の製剤は満足のいく結果を提供しなかった。例えば、いくつかの異なる粘性増強剤が試されたが、それらのうちの多くはより高い３０％グリセロール製剤のものに類似する挙動を示し、よって細胞内容物は損傷された。
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及び５％のグリセロールを粘性剤成分として使用することによって、核を破壊するという負の効果なく、３０％グリセロール製剤の粘性に適合する粘性を有するシース液を得ることが可能である（及びよって整列結果の改善が達成される）ということが発見された。図４Ｉ（下部板）は、５％のグリセロール及び１％のＰＶＰを伴うＰＩＯＡＬを使用して得られた結果を描写する。したがって、シース液内の粘性剤は試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、例えば、細胞がフローセルを通って流れ、流れるシース液に露出した際に、細胞の構造及び内容物を無傷のままにするということが分かる。いくつかの実施形態に従い、グリセロールの濃度パーセントは、（ｖ／ｖ）で表され、ＰＶＰの濃度パーセントは（ｗ／ｖ）によって表される。
図４Ｊは、本発明の実施形態に従うフローセル技術（右欄）と比較した、従来の顕微鏡湿式マウント技術（左欄）に基づく画像捕捉結果を描写する。湿式マウント手順は、画像の明確性及び質についての目標標準と考えることができる。本明細書に開示されるように設計されたシース液及びフローセルを含む技術は、湿式マウント手順のものに匹敵する画像の明確性及び質を達成することに効果的であるということが観察された。
いくつかの実施形態に従い、流れストリームリボンは、試料流体とシース液との間の粘性差異が特定の閾値を超えると、分裂し得る。いくつかの実施形態に従い、流れストリームリボンの分裂は、グリセロールを６０％含むシース液を使用した際に観察された。
図４Ｋに示されるように、フローセル４２０ｋの画像捕捉部位４３２ｋを通って流れる試料ストリームリボンＲは、約２μｍの厚さＴを有し得る。いくつかの場合では、試料ストリームリボンの厚さＴは最大約３μｍであり得る。典型的に、試料ストリーム厚さよりも小さい細胞又は粒子は、リボン内に含まれ得る。例示的な赤血球（ＲＢＣ）は、両凹面ディスクとして提供され得、約６．２μｍ〜約８．２μｍの間の直径Ｄを有し得る。更に、例示的な赤血球は、約２μｍ〜約２．５μｍの間の最大厚さＴ１、及び約０．８μｍ〜約１μｍの間の最小厚さＴ２を有し得る。いくつかの場合では、赤血球は最大約３μｍの厚さを有し得る。例示的なヒト血小板は、大きさにおいて多様であり得、約２μｍの厚さ又は直径もまた有し得る。ここでは一定の縮尺で示されていないものの、フローセルは画像捕捉部位にて約１５０μｍの値を有する流路厚さＨを画定し得る。いくつかの場合では、流路厚さＦは５０μｍ〜４００μｍの間の値を有する。流路厚さＦはまた、図４Ｂ−１及び４Ｂ−２に描写される遠位部分４６１ｂの遠位高さ４１８ｂに対応し得る。
図４Ｋに示されるように、試料流体ストリームの厚さＴの、粒子（赤血球）の厚さに対する比率は、約１：１である。いくつかの実施形態に従い、画像捕捉部位での試料流体ストリームの厚さＴの、粒子のうちの１つの大きさに対する比率は、０．２５〜２５の範囲内である。いくつかの場合では、厚さＴは０．５μｍ〜５μｍの範囲内の値を有し得る。シース液と試料流体との間の粘性差異は、フローセル内のリボン試料ストリームの所望の位置付けを達成するために選択され得る。
試料リボンＲの流体とシース液との間の粘性差異は、試料ストリーム内の粒子、例えば、赤血球を流れの方向に沿って整列又は配向させるように動作することができる。そのように整列すると、図４Ｋに示されるように、撮像デバイス又はカメラは、血球の主要面がカメラに向かって面するため丸く見える赤血球の画像を得ることができる。このように、赤血球は流れに対して低い抵抗性を呈する整列を採る。したがって、シース液及び試料流体の相対的粘性特徴は、カメラに向かって面する赤血球の高い割合又は数に寄与し得、よって粒子分析システムの評価能力を増強する。
いくつかの実施形態に従い、シース液の粘性特徴は、血液流体試料内の粒子不整列を制限するように動作する。例えば、粘性差異は、血液流体試料内の赤血球撮像配向不整列を約１０％未満に制限することに効果的であり得る。つまり、試料内の１００個の赤血球のうち９０個以上の赤血球が、主要面が撮像デバイスに向かって面するように整列し得る。対称狭細遷移帯域は２０％の値を提供し得る。本明細書の他の箇所で記載したように、例えば、図４Ｒを参照すると、対称狭細フローセル遷移帯域及び粘性シース液を含む分析器構成から得られた整列結果を、粘性シース液の使用を伴わない対称狭細フローセル遷移帯域を含む分析器構成から得られた整列結果と比較することが可能である。粘性シース液の使用は不整列細胞の割合を低減することができる。いくつかの実施形態に従い、シース液は水のもの（すなわちｎ＝１．３３３０）に類似する屈折率を有する。いくつかの場合では、シース液は約８９％の含水量を有する。粘性差異の結果として観察される整列効果に加え、整列効果はまた、両側性先細り遷移帯域の結果としても観察される。いくつかの場合では、両側性（すなわち対称）先細り遷移帯域は、粒子の整列において、非対称先細り遷移帯域設計と比較して２倍効果的であるということが観察される。
赤血球の効率的な整列は、診断の改善に寄与し得る。いくつかの場合では、撮像した赤血球の形状は、試料が得られた患者が特定の生理的状態又は疾患を有するかどうかの判定に使用され得る。例えば、鎌状赤血球病を有する患者は、異常な形状を有する（すなわち鎌の形状にある）血球を呈する。したがって、整列した赤血球の高い質の画像を得ることによって、正確な診断を保証することが可能である。赤血球における他の形状変化、例えば、赤血球が自転車のタイヤのプロファイルを有するように見える、薄い辺縁面積及び広い平坦中央面積を有する赤血球は、簡易整列技術を使用して効果的に撮像され得る。同様に、赤血球がトラックのタイヤのプロファイルを有するように見える、小さい中央部分及び熱い辺縁面積を有する赤血球は、診断目的のために撮像され得る。本明細書に開示される、改善した撮像技術は、ヘモグロビン含量、鉄含量等の、他の赤血球特徴の評価にもまた有用である。
いかなる特定の理論にも束縛されることなく、シース液の粘性と試料流体の粘性との間の粘性差異は、修正された放物線プロファイルを生成すると考えられており、ここにおいて、プロファイルは、概して放物線であり、加速が増加する流れの中央区域に対応する中央隆起を有し、中央隆起は試料粒子又は粒子内小器官の整列に寄与する。いくつかの実施形態に従い、シースと試料リボンとの間の速度差異及び粘性差異は、小器官又は細胞内粒子の整列を増加させるせん断力を生成する。シース液放物線プロファイルの例示的な態様は、同時係属である２０１４年３月１７日出願の米国特許第１４／２１５，８３４号に記載され、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
赤血球は典型的に赤血球及び血小板よりも大きい。例えば、例示的な好中球及び好酸球は、約１０μｍ〜約１２μｍの間の直径を有し得る。例示的な好塩基球は、約１２μｍ〜約１５μｍの間の直径を有し得る。例示的なリンパ球（小型）は、約７μｍ〜約８μｍの間の直径を有し得、例示的なリンパ球（大型）は、約１２μｍ〜約１５μｍの間の直径を有し得る。例示的な単球は、約１２μｍ〜約２０μｍの間の直径を有し得る。フローセルを通過する際のシース液と流体試料リボンとの間の相互作用を含む粒子分析システムの構成は、図４Ｌに示されるように、画像捕捉部位４３２Ｉを通って移動する際に、白血球を圧縮するために動作し得る。したがって、例えば、白血球（ＷＢＣ）の中央部分が試料流体リボンＲ内に位置付けられ得、白血球の辺縁部分はシース液内に位置付けられ得る。したがって、白血球がリボンによってフローセルを通して輸送される際に、白血球の側部がシース液に伸び得る。図４Ｋに関して上記した試料ストリームリボンＲの厚さＴ及び流路の厚さＦについての数的値又は範囲は、同様に図４Ｌに適用可能である。
いくつかの実施形態に従い、シース液と試料流体との間の粘性差異は、白血球等の細胞内に存在する小器官又は他の細胞内特徴を整列するために動作することができる。いかなる特定の理論にも束縛されることなく、粘性差異に関連する、シース液と試料流体との間のせん断力は、細胞内特徴を整列させるために白血球上で作用し得る。いくつかの場合では、シース液と試料流体との間の速度差異に関連するせん断力は、かかる整列に寄与し得る。これらの整列効果は、粒子と試料流体リボンとの間の大きさ差異によっても同様に影響され得る。例えば、粒子の部分が試料流体リボンから出て周りのシース液に伸びる場合、粘性の差異に関連するせん断力は、細胞内特徴整列に顕著な効果を有し得る。
図４Ｌに描写されるように、白血球等の細胞の部分はシース液に伸び得る。本発明の実施形態は、細胞がシース液に露出したときに、細胞を溶解しない若しくは細断しない、又はその反対に外部細胞膜の一体化を損なう、シース液組成物を包含する。シース液内の粘性剤は、細胞膜又は壁が試料流体リボンとシース液エンベロープとの間の界面を横断する、又は別様に試料流体ストリームから流れるシース液に伸びるときに、細胞の構造（例えば、形状）及び内容物（例えば、核）を無傷のままにするために、試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持するように動作し得る。
多くの場合、試料流体リボン内をフローセルに沿って流れる際に、細胞又は粒子上に作用する圧縮力がある。したがって、細胞が圧縮状態にある、又は別様に狭細遷移帯域の結果として圧縮力を受ける間、細胞はシース液と接触し得る。シース液の粘性剤は、薄い試料流体リボンから現れ、粘性シース液に露出したときに、少なくとも細胞が画像捕捉部位に到達するまで、圧縮細胞を細断又は破壊されることから保護するように動作し得る。したがって、シース液の粘性剤組成物は、粒子又は粒子内内容物の整列も増強する一方で、細胞内保護剤として動作し得る。
図４Ｋ及び４Ｌを参照すると、場合によっては、細胞又は粒子の部分は、薄い試料流体リボンＲを出て周りのシース液に伸び得る。同時係属である米国特許第＿号に記載するように、シース液は、シース液が細胞又は粒子を崩壊又は溶解することを抑制する又は防止する、細胞内保護剤を含み得る。例えば、シース液は、細胞がシース液の化学環境に露出する際に細胞壁の構造的一体性を保護する、細胞内保護剤を含み得る。同様に、細胞内保護剤もまた、細胞が、フローセルの形状、並びに試料流体とシース液との間の速度及び／又は粘性の差異によって誘発される、任意のせん断力を受ける際に、細胞壁の構造的一体性を保護するように動作し得る。関連して、保護剤は、試料流体とシース液との間の速度の差異から生じる力から、細胞又は粒子を保護し得る。このように、細胞は画像捕捉部位に到達する際に生存能を保持する。
せん断力は、試料流体リボンとシース液エンベロープとの間の界面にて著しくあり得る。いくつかの実施形態に従い、フローセル流路内の流れは、放物線流れプロファイルによって特徴付けられ得る。図４Ｌ−１は放物線流れプロファイル４００ｌ−１ａ及び４００ｌ−１ｂの例示的な態様を描写する。上部板における放物線プロファイル４００ｌ−１ａは、本発明の特定のフローセル実施形態内の流れ（例えば、シース液流れストリーム内に包まれる試料流体流れストリームの間に粘性差異がほとんど無い又は無い場合）において見られる、典型的な速度プロファイルである。分かるように、最高線速度は流体ストリームの中間において観察され、より遅い線速度はフローセル壁付近で観察される。プロファイル４００ｌ−１ａは、シース液と試料流体との間のわずかな粘性差異を伴って、流体ストリームにおいてもまた観察され得る。シースストリームと流体ストリームとの間に高い粘性差異がある場合では、中央隆起はプロファイル４００ｌ−１ｂに見られるように観察され、ここにおいて増幅した線速度を伴う局部的中央区域がある。いくつかの実施形態に従い、大きさが十分に大きい粒子は、かかる粒子が完全に単一流体相内に（すなわちシース液エンベロープ内又はあるいは試料流体リボン内のいずれか）含まれる場合でさえ、いくらかのせん断力を受け得る。
場合によっては、シース液の速度は、試料流体の速度とは異なり得る。例えば、シース液は、８０ｍｍ／秒で移動している可能性があり、試料流体は、６０ｍｍ／秒で移動している可能性がある。したがって、場合によっては、試料流体は、周りのエンベロープのシース液速度よりも遅い試料流体速度で遠位カニューレポートを出る。したがって、シース液は、試料流体をカニューレの流路に沿って引きずるように動作し得、よって試料流体を加速させ試料流体リボンの厚さを低減する。試料流体リボンは、全体的容積及び質量を維持するため、より速く移動するほどより薄くなる。いくつかの実施形態に従い、シース液及び試料流体の両方が、画像捕捉部位にて約２０〜２００ｍｍ／秒の間の速度を有する。
典型的に、試料流体の速度は、試料流体がカニューレ出口ポートから画像捕捉部位に移動するに伴って増加する。場合によっては、画像捕捉部位での試料流体の速度は、カニューレ遠位部分にてカニューレポートを出る際の試料流体の速度の４０倍である。いくつかの実施形態に従い、試料リボンの断面積の縮小は、速度における増加に比例する。いくつかの実施形態に従い、カニューレ出口でのシース速度が試料リボン速度よりも速い場合、これは撮像区域での最終試料リボン速度もまた増加させる。
シース液は、有意なせん断力を試料流体リボンに及び試料流体リボン内の粒子にかけるよう動作し得る。いくらかの力は流れの方向に平行であり、粒子は流れの方向に垂直である力にもまた遭遇し得る。多くの場合、シース液及び試料流体が画像捕捉部位又は帯域に近づくにつれ、シース液及び試料流体は同じ又はほぼ同じ速度で移動している。したがって、画像捕捉部位を通る際のシース液と試料流体との間の境界又は界面は、遠位カニューレ出口ポートでの又は先細り遷移帯域での境界又は界面と比較して、より低いせん断力を呈し得る。例えば、先細り遷移帯域にて、シース液エンベロープと試料流体リボンとの間の境界又は界面は、最初はより遅くかつより厚い試料リボンがより速くかつより薄くなり、試料流体内の粒子がより整列するように、遷移中にあり得る。別の言い方をすると、せん断力は、先細り遷移帯域にて顕著であり得、画像捕捉部位に向かって消散し得る。画像捕捉部位でのせん断力は、放物線プロファイルによって表され得、先細り遷移帯域でのせん断力よりもはるかに低くあり得る。したがって、細胞又は粒子は、遷移帯域を通過する際により高いせん断力を、及び画像捕捉部位を通過する際により低いせん断力を経験し得る。いくつかの実施形態に従い、シース液と試料流体との間の粘性差異は、赤血球を整列させ得及びそれによって集束させ得る。いくつかの実施形態では、シース液と試料流体との間の粘性差異は、白血球小器官を整列させ得及びそれによって集束させ得る。関連して、増強された撮像結果は、ストリームの幾何学的狭細化及びシース液と試料流体との間の速度差異の結果として生じた、整列し集束した細胞及び小器官成分について、得られ得る。
本明細書の他の箇所で述べたように、並びに図４Ｋ及び４Ｌを参照すると、シース液及び試料流体Ｒが流路の大きさの縮小部又はフローセルの遷移帯域を通って、及び撮像部位４３２ｋ又は４３２ｌに向かって流れる際に、シース液粘性と試料流体粘性との間の粘性差異に関連する、シース液と試料流体Ｒとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路の大きさの縮小部又は遷移帯域に関連する、シース液と試料流体Ｒとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、撮像部位４３２ｋ又は４３２ｌでの複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおいて、目標撮像状態を提供する。
いくつかの場合では、目標撮像状態は、撮像部位での焦点面Ｆに対する目標配向である。例えば、図４Ｋ−１に描写されるように、粒子（ＲＢＣ）は、焦点面Ｆから離れて配設され得る。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位４３２ｋ−１での焦点面Ｆに対する目標粒子配向を含む。粒子は、赤血球、白血球、又は血小板等の血球であり得る。ここに示されるように、撮像部位４３２ｋ−１での流路は、焦点面Ｆに実質的に平行又は同一平面上のＰ面を画定し得る。いくつかの場合では、粒子の中央位置は焦点面Ｆから別の方法でずれ得るものの、粒子の一部は焦点面Ｆに沿って位置付けられ得る。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位４３２ｋ−１での焦点面Ｆに対する目標位置を含む。例えば、目標位置は、粒子の少なくとも一部が焦点面Ｆに沿って配設されるように粒子を位置付けることを含み得る。いくつかの場合では、目標位置は、粒子と焦点面Ｆとの間の距離が特定の閾値を超えないように粒子を位置付けることを含み得る。いくつかの場合では、目標位置は撮像部位４３２ｋ−１での焦点面Ｆに対する目標粒子位置を含む。いくつかの場合では、目標位置は焦点面Ｆからの距離Ｄ又はそれより近くにあり得、ここにおいて距離Ｄは位置公差に対応する。シース液と試料流体との間の粘性差異は、フローセル内のリボン試料ストリームの（例えば、流路面Ｐ及び／又は焦点面Ｆに対する）所望の位置付けを達成するように選択され得る。いくつかの場合では、粘性差異は、位置公差Ｄ又はそれより近い目標粒子位置を達成するように選択され得る。
いくつかの場合では、焦点面Ｆは図４Ｋ−２に示されるように被写界の厚さ又は深度を有し、粒子（ＲＢＣ）は焦点面の厚さに対する目標撮像状態を有する。例えば、粒子の目標位置は、焦点面Ｆ内、又は少なくとも部分的に焦点面Ｆ内にあり得る。いくつかの場合では、高光学解像度撮像デバイス又はカメラは、約７μｍの被写界深度又は焦点面の厚さを有し得る。いくつかの場合では、被写界深度又は焦点面の厚さは、約２μｍ〜約１０μｍの範囲を伴う値を有する。いくつかの場合では、カメラの被写界深度は、画像捕捉部位での試料リボンの厚さに類似するか又は同等である。
いくつかの場合では、目標配向は撮像部位での焦点面Ｆに対する目標整列を含み得る。例えば、目標整列は、図４Ｋ−３に示されるように画像捕捉部位４３２ｋ−３での焦点面Ｆに対する特定の角度αを超えないように、粒子によって画定される面が焦点面Ｆと整列するということを示し得る。いくつかの場合では、目標撮像状態は試料内の不整列粒子の数又は割合の制限を含み得る。例えば、シース液と試料流体Ｒとの間の粘性の差異は、血液流体試料内の赤血球撮像配向不整列を約１０％未満に制限するために効果的であり得る。つまり、試料内の１００個の赤血球のうちの９０個以上の赤血球が整列し得、よって主要面が撮像デバイスに向かって面する（図４Ｋ−１及び４Ｋ−２に描写するように）、又はこれらの９０個以上のＲＢＣの整列が流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内になる（例えば、ＲＢＣ整列角度αは２０度以下である）。本明細書の他の箇所で記載したように、いくつかの場合では、ＲＢＣ等の非球形粒子の少なくとも９２％が流れの方向に実質的に平行な面において整列し得る。いくつかの場合では、ＲＢＣ等の非球形粒子の少なくとも７５％〜９５％が、実質的に、すなわち流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内（例えば、整列角度αが２０度以下である）に整列し得る。いくつかの実施形態に従い、特定の粒子（例えば、赤血球及び／又は血小板）の９０％以上が撮像デバイスの撮像軸を横断して配向され得る。
いくつかの場合では、本発明の実施形態は、本明細書に記載される血液システムとの使用のための、シース液又は粒子及び細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）等の組成物を含む。かかるシース液又はＰＩＯＡＬは、複合した粘性及び幾何学的流体集束視覚分析器における使用に好適である。ＰＩＯＡＬは、視覚分析器の狭細フローセル遷移帯域を通る、所与の粘性の血液試料流体の流れを、方向付ける又は促進するために動作することができる。ＰＩＯＡＬは、試料の粘性よりも高い粘性を有する流体を含み得る。粘性差異に関連する、ＰＩＯＡＬ液と試料流体との間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果は、狭細フローセル遷移帯域に関連する、ＰＩＯＡＬ液と試料流体との間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、血液試料流体内の細胞の生存能を保持しながら、視覚分析器の撮像部位での複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的であり得る。
図４Ｍは、ローブ４１０ｍ等の内部小器官を有する例示的な好中球４００ｍ（白血球の一種）を描写する。試料流体とシース液との間の粘性差異の結果として、図４Ｎに示されるように、内部小器官は細胞内で整列することができる。したがって、細胞内小器官は、小器官が互いに重複することなく、画像捕捉デバイス４３０ｍで効果的に撮像され得る。つまり、図４Ｍに描写されるような互いに積み重なるローブの代わりに、画像捕捉デバイスの撮像又は光学軸から見たときに、ローブは図４Ｎに描写されるように整列し横に位置する。したがって、ローブは捕捉した画像においてより効果的に視覚化され得る。内部小器官整列は、試料流体とシース液との間の粘性差異の驚くべきかつ予想外の結果である。結果的に、粘性差異、流体力学的流れ、及び幾何学的圧縮特徴を使用して、細胞整列及び焦点化に対応する増強した画像結果が達成される。
本明細書の他の箇所で述べたように、及び図４Ｍ及び４Ｎを参照すると、シース液及び試料流体Ｒが流路の大きさの縮小部又はフローセルの遷移帯域を通って、画像捕捉デバイス４３０ｍ又は４３０ｎの撮像部位に向かって流れる際に、シース液粘性と試料流体粘性との間の粘性差異に関連する、シース液と試料流体Ｒとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果は、流路の大きさの縮小部又は遷移帯域に関連する、シース液と試料流体Ｒとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、撮像部位での複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおいて目標撮像状態を提供する。いくつかの実施形態に従い、目標撮像状態は撮像状態の分布に対応し得る。
いくつかの場合では、目標撮像状態は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造配向（例えば、整列及び／又は位置）を含み得る。例えば、図４Ｎに描写されるように、内部構造４１０ｍ（例えば、細胞内構造、小器官、ローブ等）は、焦点面Ｆに対して配向され得る。いくつかの場合では、目標整列は、図４Ｋ−３に描写する粒子整列関係に類似する、撮像部位での焦点面Ｆに対する目標粒子内構造整列を含む。いくつかの場合では、目標位置は、図４Ｋ−１に描写する粒子位置関係に類似する、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造位置を含む。いくつかの場合では、粒子内構造の目標配向は、焦点面に対する目標整列及び更に焦点面に対する目標位置の両方を含み得る。いくつかの場合では、目標撮像状態は撮像部位での目標変形を含み得る。例えば、図４Ｎに描写されるように、粒子４００ｍは、図４Ｍに描写される粒子形状と比較して、圧縮された形状を有する。したがって、フローセルの動作は、粒子形状における側方圧縮効果を生成し得るということが分かる。関連して、粒子内特徴は、粒子自体が形状において圧縮される際に、位置的に又は方向的に配向され得る（例えば、焦点面Ｆ及び／又はリボン流れ面に関して整列される）。いくつかの実施形態に従い、シース液と試料流体との間の速度差異は、流れストリーム内に摩擦を生成し得、シース液と試料流体との間の粘性差異は流体力学的摩擦を増幅させ得る。
フローセルを通って流れる試料流体の画像を使用して、様々な血液又は血液粒子分析技術のうちの任意のものが行われ得る。多くの場合、画像分析は、特定の細胞若しくは粒子パラメータの決定、又は特定の細胞若しくは粒子特徴の測定、検出、及び評価を含み得る。例えば、画像分析は、細胞又は粒子の大きさ、細胞核特徴、細胞質特徴、細胞内小器官特徴等の評価を含み得る。関連して、分析技術は、白血球（ＷＢＣ）分画を含む、特定の計数若しくは分類方法、又は診断試験を包含し得る。いくつかの場合では、フローセルを使用して得られる画像は、５部分ＷＢＣ分画試験を支持し得る。いくつかの場合では、フローセルを使用して得られる画像は、９部分ＷＢＣ分画試験を支持し得る。関連して、図４を参照すると、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、システム４００に、画像捕捉デバイスから得られる画像に基づいて、細胞の異なる種類を鑑別させる記憶媒体を、含み得る又はそれと動作可能に関連し得る。例えば、診断又は試験技術は、様々な細胞（例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球）を鑑別するために使用され得る。
本明細書に提供される実施例は、例示のみを目的とし、本発明はこれらの実施例には制限されず、むしろ本明細書で提供される教示の結果として明白である全ての変形を包含する。
本明細書に記載される実験の以前は、本明細書に開示されるように粒子を整列させ細胞内内容物を再位置付けするためのＰＩＯＡＬを含む用途の、開発及び方法を許可する公開されたプロトコルは無かった。これは、体液（例えば、血液）試料内の粒子の、画像ベースの分析並びに分画分類及び副分類に有用である。本明細書に開示される方法及び組成物は、任意追加的に、全血スメアに見られるＷｒｉｇｈｔ着色細胞に疑似する、白血球着色、網状赤血球着色、及び血小板着色を達成するために、好適な様式で粒子を着色及び／又は溶解することができる。
本明細書に記載される例示的な組成物は、相対的に低い血液対試薬希釈で着色が生じることを可能にし、着色は急速に（例えば、３０秒以内で）生じることができる。所望であれば、例示的な方法は、赤血球溶解を達成するために、熱との組み合わせで界面活性剤の使用を用い得る。例示的な製剤は、ＲＢＣの一体性を保持し、なおＷＢＣ、網状赤血球、及び血小板着色有効性を達成するために修正され得る。
本開示の態様及び実施形態は、特定のＰＩＯＡＬ組成物が、画像ベースの粒子／細胞分析を行うために使用されたときに、細胞を整列させ、細胞内構造を再位置付けする、予想外の特性を有するという、驚くべきかつ予想外の発見に基づく。
例として、いくつかの例示的なＰＩＯＡＬ製剤及びその使用方法が開発された。下記は、所望の特性を伴うＰＩＯＡＬ製剤のいくつかの例である。
図４Ｏは、ＰＩＯＡＬを使用して得られた画像の非ＰＩＯＡＬシース液を使用して得られた画像に対する比較を示す。ＰＩＯＡＬの使用は、より焦点化した、ローブ、細胞質、及び／又は顆粒等の細胞内容物をもたらした。この例では、粘性剤（グリセロール約３０％）を含むＰＩＯＡＬが試料を処理するために使用された。ｐＨは約６．８〜７．２のｐＨに調節され、試料混合物は（塩化ナトリウム０．９％によって）等張性にされた。ここに示される結果は、細胞及び細胞内小器官を整列させるために画像分析器で使用される、例示的なＰＩＯＡＬの有効性を実証する。
図４Ｐ及び４Ｑは、標準シース液を使用して得られた画像（図Ｐ上部及び下部板）の、例示的なＰＩＯＡＬ液を使用して得られた画像（図４Ｑ上部及び下部板）に対する比較を示す。ここに示されるように、ＰＩＯＡＬの使用は、例えば、赤血球の主要面をカメラ又は撮像デバイスに向かって面するように配向させることによって、改善したＲＢＣ整列をもたらす。試料は、器具焦点化プロトコルを（図１に描写される例示的な目標４４上で）使用して分析し、目標は、視覚分析器によって焦点化した。焦点化システムはその後移動距離５２によってずらされ、リボン形状の試料ストリーム内の粒子が焦点化されることをもたらした。血液試料は、試料希釈剤を使用して前に希釈した。フローセルの流路に沿ってカニューレを通って流れた試料は、それによって、ＰＩＯＡＬ又は標準シース（対照）の２つの層の間にリボン形状の試料ストリーム（例えば、厚さ２ミクロン）を生成した。視覚分析器はその後、分析に使用するリボン形状の試料ストリーム粒子の焦点化した画像を（例えば、１秒当たり６０フレームで）生成する。血液試料は、被験者から得、血液分析器による分析のために処理する。フローセル内のＲＢＣの画像は、試料が標準シース液又はＰＩＯＡＬを使用して処理される間に捕捉する。相対的割合は、撮像データ（例えば、４Ｐ及び４Ｑ）に基づく、整列したＲＢＣの数における有意な改善を実証する。結果は、ＰＩＯＡＬが、本明細書に記載する焦点化器具／プロトコルを使用して、リボン形状の試料ストリーム内の流れ内にある間に、ＲＢＣ整列の割合を増加させることにおいて有効であるということを実証した。
対称性及び非対称性フローセル内のグリセロール（ｇｌｙ）の増加する度合を使用することに基づいて、ＰＩＯＡＬの実装は、整列の改善をもたらすということもまた観察された。
図４Ｒにおける表は、対称性対非対称性フローセルで、ＰＩＯＡＬ内にグリセロールを０％〜３０％使用して得られる、非整列細胞の割合を示す。ＰＩＯＡＬ内の３０％のグリセロール及び対称性フローセル使用することは、不整列細胞の割合をほんの８％に低減することをもたらす。ＰＩＯＡＬ内にグリセロールを伴わず、非対称性セルを伴うと、不整列細胞の割合は８７％に増加したということに留意されたい。したがって、表はグリセロールの割合及びフローセルの形状の、粒子（例えば、ＲＢＣ）整列における効果を実証する。グリセロールの添加は、対称性又は非対称性フローセル形状のどちらを使用しても、不整列ＲＢＣ細胞の割合を減少させる。不整列ＲＢＣ％は、非対称性のものにおいて８７％から１５％に、及び対称性セルにおいて４６％から８％に低減した。したがって、表は、対称性狭細フローセル遷移帯域及び粘性シース液を含む分析器構成から得られた不整列結果（８％）と、粘性シース液の使用を伴わずに対称性狭細フローセル遷移帯域を含む分析器構成から得られた不整列結果（４６％）との間の比較を提供する。
これらの結果は、特定のＰＩＯＡＬ組成物が、画像ベースの粒子／細胞分析を行うために使用されたときに、細胞を整列させ、細胞内構造を再位置付けする、予想外の特性を有するという、驚くべきかつ予想外の発見に根拠を提供する。
例として、いくつかの例示的なＰＩＯＡＬ製剤及びその使用方法が開発された。下記は、所望の特性を伴うＰＩＯＡＬ製剤のいくつかの例である。ＰＩＯＡＬは、希釈剤及び少なくとも１つの粘性変性剤を含む。
例示的なＰＩＯＡＬ製剤Ａは、３００ｍＬのグリセロール及び１ＬまでのＱＳ（適量化、又は最終容積をそうするまでに必要な量）を有する、３０％（ｖ／ｖ）のグリセロール溶液を含み、希釈剤は、９．８４ｇの硫酸ナトリウム、４．０７ｇの塩化ナトリウム、０．１１ｇのプロカインＨＣｌ、０．６８ｇの第一リン酸カリウム、０．７１ｇの第二リン酸ナトリウム、及び１．８６ｇのＥＤＴＡ二ナトリウムを含有する。初期の混合物は、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調節しながら、脱イオン水での１ＬまでＱＳ化した。
例示的なＰＩＯＡＬ製剤Ｂは、６５ｍＬのグリセロール及び１ＬまでのＱＳを有する６．５％（ｖ／ｖ）のグリセロール溶液を含み、好適な例示的な希釈剤は、９．８４ｇの硫酸ナトリウム、４．０７ｇの塩化ナトリウム、０．１１ｇのプロカインＨＣｌ、０．６８ｇの第一リン酸カリウム、０．７１ｇの第二リン酸ナトリウム、及び１．８６ｇのＥＤＴＡ二ナトリウムを含有する。初期の混合物は、続いて、水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調節しながら、脱イオン水での１ＬまでＱＳ化した。
例示的なＰＩＯＡＬ製剤Ｃは、５０ｍＬのグリセロール、１０ｇのＰＶＰ（ＭＷ：３６０，０００）、１包のシグマＰＢＳ粉末を有する、ｐＨ ７．４の（０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水、０．１３８Ｍの塩化ナトリウム、０．００２７Ｍの塩化カリウム）緩衝剤内に、１％のＰＶＰ（ｗ／ｖ）を伴う、５％のグリセロール（ｖ／ｖ）溶液、及び脱イオン水での１ＬまでのＱＳ化を含む。
例示的なＰＩＯＡＬ製剤Ｄは、１６ｇのＰＶＰ（ＭＷ：３６０，０００）及び１包のシグマＰＢＳ粉末を有する、ｐＨ ７．４の（０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水、０．１３８Ｍの塩化ナトリウム、０．００２７Ｍの塩化カリウム）１．６％ ＰＶＰ（ｗ／ｖ）溶液及び脱イオン水での１ＬまでのＱＳ化を含む。
図５Ａ及び５Ｂは、せん断力、側方圧縮、配向、差異粘性、シース液と試料流体との間の相対移動等に関連する、例示的な流れストリーム特徴を描写する。
方法
図６は、本発明の実施形態に従う、複合した粘性及び幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用した、複数の粒子の撮像のための、例示的な方法６００の態様を描写する。粒子は、試料流体粘性を有する血液流体試料６１０内に含まれ得る。ここに示されるように、方法は、工程６３０によって示されるように、シース液６２０をフローセルの流路に沿って流すことを含み得る。シース液６２０は、試料流体粘性とは所定の粘性差異範囲内の粘性差異で異なるシース液粘性を有し得る。方法は、工程６３０に示されるように、シース液に包まれた試料流体ストリームを提供するために、血液流体試料６１０を、フローセル内を流れるシース液に注入することもまた含み得る。更に、方法は、工程６４０に示されるように、試料流体ストリーム及びシース液を、流路の大きさの縮小部を通して、撮像部位に向かって流すことを含み得る。試料ストリーム及びシース液が流路の大きさの縮小部又は狭細遷移帯域を通過する際に、粘性差異に関連する、シース液と試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果（工程６５０に描写される通り）は、流路の大きさの縮小部に関連する、シース液と試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果（工程６６０に描写される通り）との組み合わせで、シース液内の粘性剤が試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、工程６７０に描写されるように、細胞が試料流体ストリームから流れるシース液に伸びるときに細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、撮像部位での複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的である。方法は、工程６８０に描写されるように、複数の粒子を撮像部位にて撮像することもまた含み得る。
せん断ひずみ速度
図７及び８は、本発明の実施形態に従う、フローセル内の特定の流れ条件についてのせん断ひずみ速度値の態様を描写する。これらの図面のそれぞれにおいて、３０％グリセロールシース液が使用される。いくつかの場合では、粘性は２．４５×１０−３の値を有し得る。せん断応力値は、粘性値にひずみ速度値を掛けることによって得られる積に等しくあり得る。図７を参照すると、試料は０．３μＬ／秒の流量を有し得、シース液は２１μＬ／秒の流速を有し得る。図８を参照すると、試料は１μＬ／秒の流速を有し得、シース液は７０μＬ／秒の流速を有し得る。これらの数値のそれぞれにおいて、流れは、中央（Ｃ）に向かってより低いひずみ値を、及び辺縁（Ｐ）に向かってより高いひずみ値を呈するということが分かる。いくつかの実施形態では、かかるひずみ値は非対称性フローセル構成に対応し得る。
図７に描写されるように、いくつかの実施形態に従い、流れストリームの中央（Ｃ）部分に向かうより低いひずみ速度は、約５００（１／秒）以下の値を有し得、流れストリームの辺縁（Ｐ）に向かうより高いひずみ速度は、約３０００（１／秒）以上の値を有し得る。図８に描写されるように、いくつかの実施形態に従い、流れストリームの中央（Ｃ）部分に向かうより低いひずみ速度は、約１０００（１／秒）以下の値を有し得、流れストリームの辺縁（Ｐ）に向かうより高いひずみ速度は、約９０００（１／秒）以上の値を有し得る。
したがって、より低い試料及びシース液速度（例えば、図７）は、より低いひずみ速度に対応し、より高い試料及びシース液速度（例えば、図８）は、より高いひずみ速度に対応するということが分かる。本発明の実施形態は、様々な粘性値、様々なひずみ速度値、及び／又は様々なせん断応力値に対応する、試料流体及び／又はシース液の使用を包含するということが理解される。
いくつかの実施形態に従い、ＰＩＯＡＬは、好適な粘性及び密度を有し、試料のフローセルへの導入の点での流量は、試料流体が薄いリボンに平坦化するようなものである。リボン形状の試料ストリームは、ＰＩＯＡＬと共に運ばれ、リボン形状の試料ストリームの表示を可能にするために対物レンズ及び光源が配置される表示ポートの前を通る。試料流体は、例えば、ＰＩＯＡＬの流路が対称的に狭細化する点で注入されることで、導入される。結果として、試料流体ストリームは薄いリボンへと平坦化及び伸長する。本開示のＰＩＯＡＬは、本開示の任意の視覚分析器と共にシース液として使用され得る。一実施形態では、試料流体を排出部に向かって運ぶために、ＰＩＯＡＬはフローセルの端に導入され得る。
リボン形状の試料ストリームの表示帯域における寸法は、ＰＩＯＡＬ流路の形状的厚さ減少及び試料流体及びＰＩＯＡＬの異なる線速度によって影響され、リボン形状の試料ストリームの幾何学的厚さ減少及び伸長をもたらす。試料のＰＩＯＡＬに対する初期差異線速度は、０．５：１〜５：１の範囲であり得る。ＰＩＯＡＬ流路断面は、約１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２５：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、又は２００：１の係数で深さを低減することによって、薄くなり得る。一実施形態では、幾何学的厚さ減少は４０：１である。一実施形態では、幾何学的厚さ減少は３０：１である。考慮される因子は、フローセルを通る遷移時間、試料処理能力の所望の量、粒子の大きさに匹敵するリボン形状の試料ストリーム厚さを達成すること、粒子及び小器官の整列を得ること、粒子の焦点化内容物を達成すること、圧力、流れ、及び粘性を動作制限内で平衡させること、リボン形状の試料ストリームの厚さを最適化すること、所望の線速度を得ること、製造性の考慮、並びに必要とされる試料及びＰＩＯＡＬの容積である。
カニューレ及び断面平坦化の長さ及び容積は、試料流れの不安定性の期間を低減させ、それによって処理能力を増加させるために選択され得る。いくつかの実施形態では、流れの不安定性の期間は、約３、２．７５、２．５、２．２５、２、１．７５、１．５、１．２５未満、又は約１秒未満であり得る。より小さいカニューレ容積はまた、試料走行の間にカニューレを洗浄するために必要な時間及び希釈剤の容積を低減し得る。いくつかの実施形態では、フローセルを通る遷移時間は、１、２、３、若しくは４秒間、又はこれらの時間のうちの任意の２つの間の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、遷移時間は４、３、又は２秒間未満であり得る。
試料流体及びＰＩＯＡＬの粘性及び流量、並びにフローセルの輪郭は、ＰＩＯＡＬの流れが、試料の流れを、画像捕捉部位に対応する信頼性のある位置での表示帯域を通して、一貫して平坦なリボンに、平坦化し伸長するように準備される。試料流体ストリームは、流体流れの厚さにおいて約２〜３μｍに圧縮され得る。いくつかの血球の種類は、ストリームの厚さより大きい直径を有する。流れの方向に平行な方向のせん断力は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面における撮像状態下での粒子の画像投影の増加をもたらし、並びに／又は、細胞内構造、例えば、細胞内構造、小器官、若しくはローブを、流れの方向に実質的に平行に、位置付ける、再位置付けする、及び／若しくは、より良好に位置付けることをもたらす。高光学解像度撮像デバイスの被写界深度は、最大７μｍ、例えば、１〜４μｍである。
共に運ばれるリボン形状の試料ストリームを伴うＰＩＯＡＬの流れの断面は、そこを通して対物レンズが方向付けられる表示ポートの前の表示帯域を通して一定である。対物レンズは、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの対物構成要素であり得る。リボン形状の試料ストリームは、フローセル内の既知で再現性のある位置にて、例えば、フローセルの２つの壁からの既知で再現性のある距離にて、表示帯域を横切る経路をたどり、下流で排出される。
試料内の粒子からの光学的情報は、リボン形状の試料ストリームが表示ポートの前の表示帯域を通って運ばれるとき、分析器内の検出セクションによって検出され、それによって試料内に含有される粒子／細胞からのデータを生成する。この分析器の使用は、試料内に含有される細胞及び／又は粒子の捕捉、処理、分類及び副分類、並びに計数を可能にする。ＰＩＯＡＬ液は、粘性変性剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、抗菌剤、イオン強度変性剤、界面活性剤、及び／又はキレート剤の添加によって調製することができる。本開示における分析器の例示的な機能的構成要素及び／又は特徴は、例えば、画像分析、試料着色処理、画像処理、並びに／又は粒子画像識別、計数、並びに／又は分類及び副分類からのデータを、取得する及び／若しくは処理する能力を含み得る。
一実施形態では、本開示は、好適な量の粘性剤のＰＩＯＡＬ内への添加は、フローセル内の粒子／細胞の整列を有意に改善し、整列細胞又は焦点化細胞成分のより高い割合、並びに、フロー内の細胞及び／又は粒子の質のより高い画像をもたらすという、驚くべきかつ予想外の発見に基づいた。粘性差異は、狭細遷移帯域の幾何学的集束効果との組み合わせで、増強した整列及び焦点結果を達成することができる。改善した結果は、シース液ストリームと試料流体ストリームとの間の速度差異と共に見られ得る。いくつかの場合では、試料流体が特定の速度で送達されるとき、細胞及び粒子の重複を伴わない、改善した画像が観察された。粘性剤の添加は、ＲＢＣのような細胞上のせん断力を増加させ、流れ方向に実質的に平行な面における細胞の整列を改善し、画像の最適化をもたらす。これはまた、細胞内構造、小器官、又はローブ等の粒子内構造を、流れの方向に実質的に平行に位置付けること、再位置付けすること、及び／又はより良好に位置付けることももたらし、画像最適化をもたらす。粘性剤はまた、概して、細胞の不整列を低減するが、流れストリームよりも直径が小さい細胞に限らない。
流れストリームよりも直径が小さい細胞、例えば、赤血球の整列は、例えば、ＰＩＯＡＬの粘性を増加させることによって、又は流れの速度比を増加させることによって得られ得る。これは、流れの方向及び焦点面ＦＰ（例えば、図４Ｋに描写される通り）に平行なＲＢＣの整列をもたらす。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ不整列の低減及び／又はＲＢＣ整列の増加は、ＰＩＯＡＬの粘性を増加させることによって達成される。
リボン形状の試料ストリームの厚さは、試料流体及びＰＩＯＡＬの相対的粘性及び流量によって影響され得る。試料の供給源及び／又はＰＩＯＡＬの供給源は、例えば、容積型ポンプを備え、リボン形状の試料ストリーム、すなわち少なくとも高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの視野と同じ幅の細いリボンの寸法を最適化するために、制御可能な流量で試料及び／又はＰＩＯＡＬを提供するように構成され得る。
共に運ばれるリボン形状の試料ストリームを伴う、ＰＩＯＡＬの流れ断面は、そこを通して高光学解像度撮像デバイスが試行される表示ポートの前の表示帯域を通して一定である。リボン形状の試料ストリームは、フローセルの前及び後ろの壁のいずれかからの、既知で再現性のある距離にて、表示帯域を横切る経路をたどり、その下流で排出される。
本開示は、リボン形状の試料ストリームに焦点化するための、高光学解像度撮像デバイスの正確な作動位置自動的を達成するための技術を提供する。フローセル構造は、リボン形状の試料ストリームが、試料流体の流路を画定するフローセルの壁の間の、フローセル内の表示帯域を通過するＰＩＯＡＬの層の間の薄いリボン内に、固定した再現性のある位置を有するように構成される。開示するフローセルの実施形態では、例えば、図１〜４Ｇでは、ＰＩＯＡＬの流路の断面は、遷移帯域にて対称的に狭細化し得、試料は、オリフィスに長方形のルーメンを伴う管等の平坦なオリフィスを通して挿入され得る。狭細流路（例えば、２０：１〜４０：１の比率での断面積における幾何学的狭細化）及び試料の流れと比較して任意により速いＰＩＯＡＬの線速度は、試料断面を約２０：１〜７０：１の比率で平坦化するために協働する。いくつかの実施形態に従い、比率は１０：１〜１００：１の範囲内、５０：１〜１００：１の範囲内、７０：１〜８０：１の範囲内であり得る。いくつかの実施形態に従い、比率は７５：１である。効果的に、流量、粘性、及び形状の組み合わせにより、試料は薄いリボンに形成される。狭細流路（例えば、４０：１の比率での又は２０：１〜７０：１の間の比率での、断面積における幾何学的狭細化）及び試料の流れと比較したＰＩＯＡＬの線速度における差異は、試料断面を約２０：１〜７０：１の比率で圧縮するために協働する。いくつかの実施形態では、断面厚さ比率は４０：１であり得る。いくつかの実施形態では、断面厚さ比率は３０：１であり得る。
結果として、試料及びＰＩＯＡＬの特定の線速度等のプロセス変動は、リボン形状の試料ストリームを流れ内のその位置から移動させる傾向がない。フローセルの構造に対して、リボン形状の試料ストリームの位置は、安定であり再現性がある。
別の態様では、本発明は、本発明の粒子造影剤組成物を含むキットに関する。該キットは、本明細書に記載される方法のうちの任意のものに従う、粒子造影剤組成物の使用についての説明書もまた含み得る。キットは粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）もまた含み得る。キットはまた、プログラム可能な記憶媒体と、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、血小板、網状赤血球、有核ＲＢＣ、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、細菌、真菌、原生生物、原虫、又は寄生虫等の粒子の、画像ベースの識別のための関連するソフトウェアとを含み得る。キットは、等張性緩衝剤及び／又は希釈剤を含み得る、１つ以上の緩衝剤もまた含み得る。キット及び又は緩衝剤は、界面活性剤、ｐＨ調整剤、及び／又は抗菌剤を更に含み得る。他の実施形態では、キットは洗浄又は水洗溶液もまた含み得る。キットは、陽性及び陰性対照のための標準物もまた含み得る。いくつかの実施形態では、標準物は、標準着色細胞試薬を含み得る。キットは、キットの構成要素を移すための、使い捨てマイクロピペット、チップ、又は管等の、使い捨てのものもまた含み得る。キットは、これらのキット構成要素のうちの任意の１つ又はそのうちの２つ以上の任意の組み合わせを含み得る。
血液試料内の血球の弁別は、本発明の実施形態が特に好適である例示的な用途である。試料は、自動化技術によって調製され、薄いリボン形状の試料ストリームとして高光学解像度撮像デバイスに提供され、リボン形状の試料ストリームが視野を横切って流れる間に、周期的に撮像される。粒子（血球等）の画像は、細胞又は粒子を識別及び計数するために、完全に自動的に又はわずかなヒトによる補助を伴い、ピクセル画像データがプログラム化された処理技術を使用して、互いから区別、分類、副分類、及び計数することができる。粒子の異常又は臨界特徴の場合に備えて保存され得使用可能であり得る細胞画像に加え、出力データは、記録された試料画像において区別された細胞又は粒子の、それぞれの特定の分類及び／又は副分類の出現の計数を含む。
それぞれの画像において見られる、異なる粒子の計数は、例えば、全体の試料内のそれぞれの区別された分類及び／又は副分類の細胞の、正確で統計的に有意な比率を蓄積するために使用されることで、更に処理され得る。視覚的弁別に使用された試料は希釈され得るが、それぞれの分類及び／又は副分類における細胞の割合は、希釈した試料において、具体的には多数の画像が処理された後で表される。
本明細書に開示される、装置、組成物、及び方法は、視覚的特質に基づいて試料内の細胞を弁別及び数量化することにおいて有用である。試料は生体試料であり得る、例えば、血液、血清、骨髄、洗浄液、浸出液、滲出液、脳脊髄液、胸膜液、腹膜液、及び羊水を非制限的に含む、白血球を含む体液試料であり得る。いくつかの実施形態では、試料は固体組織試料、例えば、細胞懸濁液を生成するために処理された生検試料であり得る。試料はまた、糞便試料を処理することで得られる懸濁液でもあり得る。試料は、細胞培養試料等の、粒子を含む実験室又は製造ライン試料でもまたあり得る。試料という用語は、患者若しくは実験室から得られる試料、又はその任意の断片若しくは部分標本を指すために使用され得る。試料はいくつかのプロセスにおいて、希釈、部分への分割、又は着色され得る。
一態様では、本開示のシステム、組成物、及び方法は、流れ内の細胞の、驚くべく高い質の画像を提供する。一態様では、視覚分析器は、自動化画像ベースＷＢＣ分画を提供するために、本開示の方法において使用され得る。特定の実施形態では、本開示の方法は、被験者が健康であるか又は疾患、病態、異常、及び／若しくは感染症を有するか、あるいは治療に対して反応性であるか又は非対応性であるかを、判定、診断、予後診断、予測、及び／又はその診断を支持するための、形態特徴及び／又は異常を含む視覚的特質の自動化識別に関する。いくつかの実施形態では、システムは粒子計数器を更に備え得る。用途は、分類及び／又は副分類、並びに血液試料等の流体試料内の細胞の計数を含む。他の流体試料内の粒子及び／又は粒子の追加の種類の計数のための、他の類似する用途もまた企図される。本発明のシステム、組成物、及び方法は、任意の好適な自動化粒子認識アルゴリズムを使用して、リアルタイムの分類及び副分類並びに画像の表示のために使用され得る。それぞれの試料について捕捉した画像は、後日表示するために保存され得る。
別の態様では、本発明の装置、組成物、及び方法は、驚くべくより正確な画像ベースの細胞分類及び副分類、並びに現在の自動化分析器を使用するときの手動表示率と比較した手動表示率を低減する減退を提供する。システム、組成物、及び方法は、手動表示率を低減し、手動表示を器具上で行えるようにする。更に、本開示のシステム、組成物、及び方法はまた、手動表示を必要とする際の自動化分析の間に減退した試料の割合を低減させる。
本開示は、ＣＢＣ及び画像ベースの拡張した白血球分画及び画像ベースの拡張した血小板計数を得、それによって血小板の計数のために効果的な検出範囲を拡大するために、全血計数（ＣＢＣ）計数器を視覚分析器等の分析器と複合するための、システム、方法、及び組成物に更に関する。
結果的に、いくつかの実施形態では、本開示は、粒子例えば、血球を含有する試料を分析するための、装置及び方法を提供する。本開示に従い、視覚分析器が、液体内に懸濁される粒子を含む試料の画像を得るために提供される。いくつかの実施形態では、視覚分析器はフローセル及び自動焦点構成要素を備え、ここにおいて、対象の粒子を含有する液体試料が、そこを通して対物レンズに連結するカメラが粒子のデジタル画像を捕捉する、フローセルを通って流される。本発明の実施形態を使用して実装され得る例示的な自動焦点技術は、同時係属である２０１４年３月１７日出願の米国特許出願第１４／２１６，８１１号に記載され、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。フローセルは、希釈した及び／若しくは処理した血液試料、又は本明細書に記載される他の体液試料等の、試料流体の供給源に、並びに透明なシース液、又は粒子及び／若しくは細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）の供給源に連結する。
一実施形態では、装置はまた、少なくとも１つの検出範囲を有する粒子計数器、並びに分析器、及びプロセッサを備える。分析器及びプロセッサは、粒子計数器に関連する、計数、分類、及び副分類の誤りを正し、更に試料内の粒子の異なる分類及び／又は副分類の正確な粒子計数又は濃度を判定するために、追加の情報を提供するように構成される。
本開示は、画像ベースの試料分析を実行する際の粒子及び／又は細胞内小器官整列に有用な方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、全血計数（ＣＢＣ）並びに、例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、有核ＲＢＣ、芽球、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球を含む、ＷＢＣ、ＲＢＣ、及び／又は血小板等の細胞の種類を識別及び計数することができる、画像ベースの拡張した白血球（ＷＢＣ）分画を行う能力、並びに、ＷＢＣ計数及び形態、赤血球（ＲＢＣ）計数及び形態、並びに血小板（ＰＬＴ）計数及び形態についての画像ベースの情報を提供する能力を伴う、複合した計数及び撮像システムのための方法及び組成物に関する。
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載する画像ベースの粒子の分析において使用され得るＰＩＯＡＬに関する。血液試料内の細胞分類及び／又は副分類計数は、本開示において、分析され得る試料の一種の非制限的な例として使用される。いくつかの実施形態では、試料内に存在する細胞はまた、細菌又は真菌細胞、並びに白血球、赤血球、及び／又は血小板を含み得る。いくつかの実施形態では、組織又は吸引物から得られる粒子懸濁液が分析され得る。
いくつかの態様では、試料は自動化様式で提供、撮像、及び分析される。血液試料の場合は、試料は、好適な希釈剤又は生理食塩水溶液で実質的に希釈され得、これは、非希釈又は希釈がより少ない試料において、いくつかの細胞の表示が他の細胞によって隠され得る程度を低減する。細胞は、いくつかの細胞の態様の造影を増強する薬剤で、例えば、細胞膜を透過性にするために透過剤を、並びに顆粒及び核等の特徴に接着し見えるようにするために組織着色剤を使用することで、処理され得る。いくつかの実施形態では、網状赤血球、有核赤血球、及び血小板を含む粒子の、計数及び特徴付けのために、並びに白血球分画、特徴付け、及び分析のために、試料の部分標本を着色することが望ましいことがある。他の実施形態では、赤血球を含有する試料は、フローセルへの導入及び撮像の前に希釈され得る。
いくつかの実施形態に従い、試料調製装置の詳細及び試料希釈、透過化、及び組織着色の方法は、概して、１つ以上のプログラム可能な制御器によって動作される精密ポンプ及び弁を使用して達成され、本開示の要点ではない。例は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｍｏｔｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．に与えられた、プログラム可能な制御に関する、米国特許第７，３１９，９０７号等の特許において見られる。同様に、相対的大きさ及び色等の属性による、特定の細胞分類及び／又は副分類の間を区別するための技術は、白血球に関連して米国特許第５，４３６，９７８号において見られ得る。これらの特許の開示は、本明細書において参照により組み込まれる。いくつかの実施形態に従い、試料調製技術は、着色、溶解、透過化、及び、同時係属である２０１４年３月１７日出願の米国特許出願第１４／２１６，３３９号に記載されるもの等の、他の処理様相を含み得、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
高光学解像度撮像デバイスという用語は、形態特徴及び／又は変化を判別するために十分な視覚的特質を伴う粒子の画像を得ることができる装置を含み得る。例示的な高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．４〜０．５μｍ、例えば、０．４６μｍ等を含む、１μｍ以下の光学解像度を伴うデバイスを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明の任意の組成物及び／又は方法において得られる画像は、デジタル画像であり得る。いくつかの実施形態では、得られる画像は顕微鏡画像である。特定の実施形態では、画像は手動で得られ得る。別の実施形態では、画像を得るための手順の少なくとも一部は、自動化される。いくつかの実施形態では、画像は、フローセル、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスを備え、任意に自動焦点特徴を伴う視覚分析器を使用して得られ得る。
一実施形態では、画像は細胞質、細胞核及び／又は細胞の核成分に関連する情報を提供する。一実施形態では、画像は顆粒成分及び／又は細胞の他の形態特徴に関連する情報を提供する。一実施形態では、画像は、細胞の細胞質、核、及び／又は顆粒成分に関連する情報を提供する。顆粒及び／又は核画像及び／又は特徴は、細胞分類及び副分類を、独立して、又は互いとの組み合わせの両方において、判定する。
更に別の態様では、本発明の方法は、画像ベースの赤血球分類及び副分類を行う方法に関連し、ａ）赤血球の一部を撮像すること、ｂ）撮像した赤血球の形態を判定することを含む。本明細書で使用されるとき、赤血球（ＲＢＣ）は、例えば、通常又は異常赤血球、網状赤血球、有核赤血球、及び／又はマラリア感染赤血球を含み得る。いくつかの実施形態では、撮像は、粒子計数器、視覚分析器、及びプロセッサを備える装置等の、本開示の装置を使用して行われる。
本明細書で使用されるとき、例示的な全血計数（ＣＢＣ）は、患者の血液試料内の粒子及び／又は細胞についての情報を提供する、典型的に医師又は他の医療専門家によって必要とされる試験板を含み得る。血流内で循環する例示的な細胞は、概して３種類に分けられ、例えば、白血球（white blood cell）（例えば、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））、赤血球（red blood cell）（例えば、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））、及び血小板（platelet）（例えば、血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ））を含むが、これらに限られない。
本明細書で使用されるとき、異常に高い又は低い計数は、疾患、障害、及び／又は病態の存在を示し得る。したがって、ＣＢＣは、患者の全体的な健康状態の外観を提供することができるため、医学の分野で一般的に行われる血液試験のうちの１つである。結果として、ＣＢＣは年に１回の健康診断の間に決まって行われる。
本明細書で使用されるとき、典型的に瀉血専門医は、被験者から血液試料を採取し、血液は概して、凝固を阻止するために典型的に凝固阻止剤（例えば、ＥＤＴＡ、時にはクエン酸）を含有する試験管内に取り込まれる。試料は、その後、実験室に輸送される。試料は、自動化計数器による即時処理のために、パスツールピペットを使用して、指の刺し傷から採取されることもある。一実施形態では、粒子画像は、粒子がシース液又はＰＩＯＡＬ内に包まれている間に取得される。特定の実施形態では、血液試料は顕微鏡下で患者の血液の試料で準備されたスライドガラス上で見られ得る（血液塗抹標本、又は末梢血液スメア）。特定の実施形態では、全血計数は自動化分析器によって行われる。
本明細書で使用されるとき、血液計数のデータ／パラメータは、例えば、総赤血球と、ヘモグロビン、血液内のヘモグロビンの量と、ヘマトクリット又はヘマトクリット値（ＰＣＶ）と、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、赤血球の平均容積（貧血は、この値が予想される通常範囲の上であるか又は下であるかに基づいて、小球性又は大球性に分類される。ＭＣＶに影響し得る他の病態は、地中海貧血症、網状赤血球増加症、及びアルコール依存症を含む）と、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）（ピコグラム単位での赤血球当たりのヘモグロビンの量）と、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）（細胞内のヘモグロビンの平均濃度）と、赤血球粒度分布幅（ＲＤＷ）（ＲＢＣ集団の細胞容積の変動）と、総白血球と、好中性顆粒球（急性ウイルス感染において典型的に増加し、細菌感染を示し得る）と、を含み得る。核の分割した外見のために、好中球は「分割」と称されることがある。成熟度がより低い好中球の核は、分割されないが、帯又は伸長した形状を有する。成熟度がより低い好中球（骨髄から血流へ放出されたばかりのもの）は、「帯」として知られる。血液計数のための他のデータ／パラメータはまた、例えば、リンパ球（例えば、腺熱等のいくつかのウイルス感染症と共に、及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）において増加する、又はＨＩＶ感染によって減少する）と、単球（細菌感染、結核、マラリア、ロッキー山紅斑熱、単球性白血病、慢性潰瘍性大腸炎及び限局性腸炎と、好酸球（例えば、寄生虫性感染症、喘息、又はアレルギー反応において増加する）と、好塩基球（例えば、白血病又はリンパ腫等の骨髄に関連する病態において増加する）とを含み得る。
本明細書で使用されるとき、血液計数のデータ／パラメータはまた、例えば、血小板の数、血液内のそれらの大きさ及び大きさの範囲についての情報、平均血小板容積（ＭＰＶ）−血小板の平均の大きさの測定を含む、血小板に関連するデータも含み得る。
本発明の方法の別の態様では、粒子造影剤組成物に接触した及び／又は撮像した細胞は、マラリア感染細胞、非定型リンパ球等の異常細胞である。本発明のいくつかの態様では、該細胞は、病態、疾患、感染症、及び／又は症候群を、識別、予測、診断、予後診断、又はその診断を支持する、異常細胞である。
本発明の方法の別の態様では、該細胞は血小板である。
別途明示的に示されない限り、本開示内での「粒子」又は「粒子（複数）」への言及は、流体内に分散する任意の個別又は有形体を包含することが理解され得る。本明細書で使用されるとき、「粒子」は、生体液内の、全ての測定可能で検出可能な（例えば、画像及び／又は他の測定可能なパラメータによって）成分を含み得る。粒子は任意の物質、任意の形状、及び任意の大きさである。特定の実施形態では、粒子は細胞を含み得る。粒子の例は、血球、胎児細胞、又は細菌、寄生虫、又は前述のいずれかの断片若しくは生体液内の他の断片を含む細胞を含むが、これらに限られない。血球は、任意の血球であり得、生体液内に潜在的に存在する任意の通常又は異常、成熟又は未熟細胞を含み、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）、及び他の細胞がある。該メンバはまた、未熟又は異常細胞を含む。未熟ＷＢＣは後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球を含み得る。成熟ＲＢＣに加え、ＲＢＣのメンバは、有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）及び網状赤血球を含み得る。ＰＬＴは「巨大な」ＰＬＴ及びＰＬＴ集塊を含み得る。血球及び有形成分は、本開示内の他の箇所に更に記載される。
例示的な粒子は、例えば、球形及び非球形粒子を含む、生体液試料内の有形成分を含み得る。特定の実施形態では、粒子は非球形成分を含み得る。非球形成分の画像投影は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において最大化され得る。特定の実施形態では、非球形粒子は高光学解像度撮像デバイスの焦点面において整列する（流れの方向に実質的に平行な面において整列する）。いくつかの実施形態では、血小板、網状赤血球、有核ＲＢＣ、並びに、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、及び、芽球、前骨髄球、骨髄球、又は後骨髄球を含む未熟ＷＢＣを含むＷＢＣは、粒子として計数及び分析される。
本明細書で使用されるとき、検出可能で測定可能な粒子パラメータは、例えば、大きさ、形状、対称性、輪郭、及び／又は他の特徴の、視覚及び／又は非画像ベースの指数を含み得る。
別の実施形態では、本開示は、例えば、１）視覚分析器内で、光で粒子を照射すること、２）ＰＩＯＡＬ内に包まれた試料粒子のデジタル画像を得ること、及び３）画像情報に基づき粒子を含有する試料を分析することを含む方法において、例えば、本発明のキットを使用した、粒子の撮像方法に関する。他の実施形態では、方法は、処理した試料を照射する前に、粒子を含有する試料を粒子造影剤組成物と接触させることを更に含み得る。
一実施形態では、分析された粒子は、球形粒子、非球形粒子のうちの少なくとも１つ、又は両方を含む。別の実施形態では、粒子は少なくとも１つの球形粒子を含む。更に別の実施形態では、粒子は少なくとも１つの非球形粒子を含む。別の実施形態では、非球形粒子又は非球形成分を有する粒子の画像投影は、流れ方向に実質的に平行な面において最大化される。粒子は、例えば、ＷＢＣ、ＲＢＣ、及び／又は血小板であり得る。一実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも５０％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列する。別の態様では、本発明のＰＩＯＡＬのフローセル内での使用は、非球形粒子のうちの少なくとも９０％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列することを可能にする。
ＰＩＯＡＬに包まれたリボン形状の試料ストリームの厚さよりも小さい細胞の流れは、これらの細胞の流れの方向に実質的に平行な整列をもたらす。本開示の一実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも９２％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列する。更に別の実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも９０％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列する。別の実施形態では、粒子のうちの少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は少なくとも９５％が、実質的に、すなわち流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内に整列する。別の実施形態では、流れの方向に実質的に平行な面において整列する非球形及び／又は球形粒子の割合は、列挙した割合のうちの任意の２つの間の任意の範囲であり得、例えば、少なくとも７５％〜８５％、７５〜８０％、及び７５〜９２％等の他の範囲がある。
ＷＢＣ等の、ＰＩＯＡＬ内に包まれる試料内の大きい細胞の流れの結果である、流れの方向に平行な方向におけるせん断力は、核構造、細胞質構造、若しくは顆粒、又は他の細胞内成分若しくは構造を、流れの方向に平行な面のより近くに、位置付けること、再位置付けすること、及び／又はより良好に位置付けることをもたらす。
一実施形態では、非球形粒子は赤血球を含む。本発明の別の態様では、球形粒子は白血球又は有核赤血球を含む。
本発明の方法の一実施形態では、粒子は非球形粒子である。一実施形態では、分析された粒子は、球形粒子、非球形粒子のうちの少なくとも１つ、又は両方を含む。別の実施形態では、粒子は少なくとも１つの球形粒子を含む。更に別の実施形態では、粒子は少なくとも１つの非球形粒子を含む。別の実施形態では、非球形粒子又は非球形成分を有する粒子の画像投影は、流れの方向に実質的に平行な面において最大化される。該粒子は、例えば、網状赤血球及び有核ＲＢＣを含むＲＢＣ、血小板、及び／あるいは、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、又は、芽球、前骨髄球、骨髄球、若しくは後骨髄球を含む未熟ＷＢＣを含む、ＷＢＣであり得る。一実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも５０％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列する。別の態様では、本発明のＰＩＯＡＬのフローセル内での使用は、非球形粒子のうちの少なくとも９０％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列することを可能にする。
本開示の一実施形態では、画像断面図は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球を含むＷＢＣ、又は、芽球、前骨髄球、骨髄球、若しくは後骨髄球を含む未熟ＷＢＣ内の、差異的に着色した核構造、差異的に着色した細胞質構造、又は差異的に着色した顆粒のうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、球形及び／又は非球形粒子のうちの、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は少なくとも９５％が、高光学解像度撮像デバイスの焦点面又は被写界深度において、核構造、細胞質構造、又は顆粒を有する。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、画像情報は粒子の画像断面図である。いくつかの態様では、画像断面図は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球を含むＷＢＣ、又は、芽球、前骨髄球、骨髄球、若しくは後骨髄球を含む未熟ＷＢＣ内の、差異的に着色した核構造、差異的に着色した細胞質構造、又は差異的に着色した顆粒のうちの少なくとも１つを含む。
一実施形態では、本発明の方法は、自動化、画像ベースのＷＢＣ差異を得る際に有用である、フロー内の焦点化した粒子及び粒子内容物の高い割合を伴う、驚くべく高い質の細胞の画像、並びに被験者が、健康であるか又は疾患、病態、異常、若しくは感染症を有するか、あるいは、治療に対して反応性であるか又は非反応性であるかを、判定、診断、予後診断、予測、又はその診断を支持する際に有用な形態異常の自動化識別を提供する。
別の態様では、本発明の組成物及び方法は、細胞分類及び副分類に基づく、より正確な画像、並びに現在の分析器と比較して手動表示率を大幅に低減する減退を提供する。
本明細書で使用されるとき、例示的な白血球（ＷＢＣ）は、例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球を含む未熟顆粒球、並びに以上白血球を含み得る。本明細書で使用されるとき、赤血球（ＲＢＣ）は、例えば、通常又は異常赤血球、網状赤血球、及び有核赤血球を含み得る。
本明細書で使用されるとき、粘性剤は粘性剤又は粘性変性剤を含み得る。ＰＩＯＡＬ及び粘性剤が混合すると、ＰＩＯＡＬの粘性は粒子の整列を最大化するために変更され、又は、及び／若しくは増加するように、例示的な粘性剤／変性剤は、試料の粘性とは異なる、特徴的な粘性を有する。特定の実施形態では、リボン形状の試料ストリームとＰＩＯＡＬとの間の粘性差異及び／又は速度差異は、流れ内にある際に粒子上で働くせん断力を導入することができ、それによって不整列を低減する、及び／又は粒子を整列させる。
本明細書で使用されるとき、粒子造影剤組成物は、被験者からの試料内の粒子の分析のために、視覚分析器内の、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）との組み合わせでの使用に用いることができる。例示的なＰＩＯＡＬは、例えば、被験者からの試料内の異なる種類の粒子の自動化認識の方法において有用である。
別の態様では、細胞は画像が得られる間にＰＩＯＡＬ内に包まれ得る。好適な例示的な細胞内小器官整列液体は本明細書に開示される。
一実施形態では、本開示は視覚分析器における使用のためのＰＩＯＡＬに関する。特定の実施形態では、ＰＩＯＡＬは、緩衝剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、粘性剤／変性剤、イオン強度変性剤、界面活性剤、キレート剤、及び／又は抗菌剤のうちの少なくとも１つを含み得る。
一態様では、ＰＩＯＡＬは２つ以上の粘性剤／変性剤を含み得る。
一態様では、本発明のＰＩＯＡＬは、約１〜約１０センチポアズの間の粘性を有し得る。一実施形態では、本発明のＰＩＯＡＬは、粘性剤／変性剤を含み得る。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは最大１００％の粘性剤を含む。
本明細書で使用するとき、粘性剤及び／又は粘性変性剤は、約１〜約１０センチポアズの粘性を達成するために好適な、撮像システムにおける使用に適切な、光学的透明性を含む光学特徴を伴う、任意の物質を含み得る。概して、粘性剤又は変性剤は、無毒性かつ生体適合性であり、細胞構造及び内容物を実質的に無傷のままにする。粘性剤及び／又は粘性変性剤は、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、水溶性ポリマー及び／又はデキストランのうちの少なくとも１つを含み得る。一態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、グリセロールであり得る。例えば、一態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、グリセロール誘導体であり得る。例えば、一態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）であり得る。別の例では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、エチレングリコールであり得る。別の例では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）であり得る。別の例では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ポリエチレングリコールであり得る。別の例では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、水溶性ポリマー又はデキストランであり得る。他の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール、水溶性ポリマー又はデキストランのうちの２つ以上を含み得る。粘性剤／変性剤は、撮像システムにおける使用に適切な、光学的透明性を含む、光学特徴を伴う、約１〜約１０センチポアズの粘性を提供するために好適な任意の薬剤を含み得る。
本明細書で使用されるとき、他の例示的な粘性剤／変性剤は、例えば、アカシア、トラガカント、アルギン酸、カラゲナン、ローカストビーンガム、グアーガム、キサンタンガム、アラビアガム、グアーガム、ゼラチン、セルロース、アルギン酸、デンプン、糖、デキストラン等の天然親水コロイド（及び誘導体）と、ゼラチンと、ブドウ糖、果糖等の糖（及び誘導体）と、ポリデキストロースと、デキストランと、ポリデキストランと、サッカリドと、ポリサッカリドと、グリセロール、メチルセルロース、ヒドロキシエチルスターチ（ヘタスターチ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の半合成親水コロイド（及び誘導体）と、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び／又はＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）等の合成親水コロイド（及び誘導体）と、を含み得る。他の細胞適合性粘性剤／変性剤もまた、この目的に好適であると考えられる。
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ＰＩＯＡＬの約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するグリセロールであり得る。例えば、一実施形態では、粘性剤／変性剤は、約５．０％〜約８．０％（ｖ／ｖ）の濃度でＰＩＯＡＬ内に存在し得る。別の態様では、粘性剤／変性剤は、約６．５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。一実施形態では、粘性剤／変性剤は、約６．５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するグリセロールである。
更に別の実施形態では、ＰＩＯＡＬは、約３０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するグリセロール粘性剤／変性剤を含み得る。
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、約０．５〜２．５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在するＰＶＰであり得る。例えば、一実施形態では、粘性剤／変性剤ＰＶＰは、ＰＩＯＡＬ内で約１．０〜約１．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。一実施形態では、ＰＶＰは約１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ＰＶＰ及びグリセロールであり得る。例えば、一実施形態では、グリセロールはＰＩＯＡＬ内で約５％（ｖ／ｖ）の濃度で、約１％（ｗ／ｖ）のＰＶＰとの組み合わせで存在し得る。
一実施形態では、本発明のＰＩＯＡＬは、視覚分析器内で粒子を撮像するために使用され得る。一態様では、視覚分析器は、対称的な流路を伴うフローセル及び自動焦点構成要素を備える。
グリセロール等の、粘性剤及び／又は粘性変性剤／調整剤は、ＰＩＯＡＬ内に含まれ得る。粘性剤、又は粘性変性剤は、導入されると、ＰＩＯＡＬの粘性を所望の範囲に適切に調節することができる。ＰＩＯＡＬの粘性を十分に増加させ、フロー内の細胞の質の高い撮像を可能にする好適な光学特徴を有する、任意の好適な粘性剤が使用され得る。ＰＩＯＡＬは、細胞及び／又は細胞構造を、流れの方向に実質的に平行な単一面に整列させるために、好適な粘性を有し、それによって焦点化された粒子の内容物を部分的に増加させる。
ＰＩＯＡＬは、本開示のあらゆる分析器と共に使用され得る。
本明細書で使用するとき、「グリセロール」という用語は、グリセロール及びグリセロールの誘導体（本明細書で以降グリセロール誘導体と称する）を包含する。グリセロール誘導体の例には、チオグリセロール、ポリグリセロール糖が挙げられる。ポリグリセロールの使用可能な例には、ジグリセロール、ポリグリセリン＃３１０（阪本薬品工業株式会社）、ポリグリセリン＃７５０（阪本薬品工業株式会社）、ポリグリセリン＃５００（阪本薬品工業株式会社）等が挙げられる。
別の実施形態では、本開示のＰＩＯＡＬは、ｐＨ調整剤を更に含む。一態様では、ＰＩＯＡＬ及び／又は試料の最終ｐＨは、約６．０〜約８．０の間である。別の態様では、ＰＩＯＡＬ及び／又は試料の最終ｐＨは、約６．６〜約７．４の間である。一態様では、ＰＩＯＡＬの最終ｐＨは、調製した試料１２Ｂ（図８を参照）と同じｐＨであり得る。
例示的なｐＨ調整剤は、例えば、酸（例は有機酸及び無機酸を含む）、塩基（例はアルカリ金属及びアルカリ土類金属の有機塩基及び水酸化物を含む）を含み得る。例示的な有機酸は、酢酸、乳酸、ギ酸、クエン酸、シュウ酸、及び尿酸を含み得る。例示的な無機酸は、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ホウ酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、及び過塩素酸を含み得る。例示的な有機塩基は、例えば、ピリジン、メチルアミン、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、ヒスチジン、ホスファゼン、及びカチオンの水酸化物を含み得る。アルカリ金属及びアルカリ土類金属の例示的な水酸化物は、例えば、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化ストロンチウム（Ｓｒ（ＯＨ）２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、及び水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、緩衝剤を使用して、ＰＩＯＡＬのｐＨは、好ましくは約６．０〜約８．５に、より好ましくは約７．０〜約８．０に維持される。いくつかの実施形態では、ＰＩＯＡＬのｐＨを調節するために、緩衝剤をＰＩＯＡＬに添加することが好ましい。剤又は剤（複数）がＰＩＯＡＬのｐＨを適切な範囲に調節する限り、任意の好適な緩衝剤又は緩衝剤（複数）が使用され得る。かかる緩衝剤の例には、ＰＢＳ、Ｇｏｏｄの緩衝剤（特に、トリス緩衝剤、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、トリシン、ビシン、ＴＡＰＳ等）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、ベロナールのナトリウム−ＨＣｌ、コリジン−ＨＣｌ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−マレイン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌが挙げられ、これらは単独で又は組み合わせで使用され得る。
別の実施形態では、本発明のＰＩＯＡＬは、結果として生じる製剤のイオン強度を調節するためにイオン強度変性剤を含む。例示的なイオン強度変性剤は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＨＣＯ− ３、硫酸、ピロ硫酸、ピロリン酸（例えば、ピロリン酸カリウム）、クエン酸、カコジル酸、又は他の好適な塩を含み得る。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、等張性であり得る。
界面活性剤が、ＰＩＯＡＬに添加され得る。ＰＩＯＡＬの他の成分と適合性であり、リボン形状の試料ストリーム及び試料内の粒子と適合性である限り、界面活性剤の種類は特に制限されない。界面活性剤は、例えば、カチオン性、アニオン性、非イオン性、及び両性の界面活性剤を含み得る。例示的な界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル型界面活性剤（例えば、ＮＩＳＳＡＮ ＮＯＮＩＯＮ ＮＳ−２４０（ＮＯＦ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル型界面活性剤（例えば、ＲＨＥＯＤＯＬ ＴＷ−０１２０（花王株式会社、登録商標））、ポリオールコポリマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１２７、Ｆ−１２３、Ｆ−１０９、Ｆ−８７、Ｆ−８６、Ｆ−６８、Ｔ−１１０７、Ｔ−１１０２（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、登録商標））、ＭＥＧＡ−８、スクロースモノカプレート、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯを含み得、同様のものが使用され得る。他の界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及びＴｗｅｅｎ ２０を試料及びリボン形状の試料ストリームに適合性の濃度で含み得る。
ＰＩＯＡＬ内の界面活性剤の濃度は、好適には、試料内の細胞等の粒子が影響されない及び／又は実質的に無傷のまま残る濃度のレベルである。具体的には、濃度は、好適には５〜５０００ｍｇ／Ｌ、より好適には１００〜３０００ｍｇ／Ｌである。
試料内に含まれる粒子が分析器で分析されるとき、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、炭酸カルシウム等の非晶質塩が試料内で沈降し得る。これらの非晶質塩を溶解するために、キレート剤がＰＩＯＡＬに添加され得る。キレート剤の添加は、非晶質塩の溶解だけでなく、ＰＩＯＡＬの酸化の抑止もまた可能にする。キレート剤の使用可能な例には、ＥＤＴＡ塩、ＣｙＤＴＡ、ＤＨＥＧ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＥＤＤＡ、ＥＤＤＰ、ＧＥＤＴＡ、ＨＤＴＡ、ＨＩＤＡ、メチル−ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰ、ＮＴＰＯ、ＥＤＤＰＯ等が挙げられる。ＰＩＯＡＬ内のキレート剤の濃度は、好適には０．０５〜５ｇ／Ｌの範囲内である。
別の実施形態では、ＰＩＯＡＬは、１つ以上の抗菌剤を更に含み得る。いくつかの態様では、抗菌剤は、例えば、殺真菌力を有する物質（抗真菌剤）及び／又は殺菌力を有する物質（殺菌剤）であり得る。特定の実施形態では、好適な抗菌剤は、例えば、パラべン、イソチアゾリノン、フェノール樹脂、酸性防腐剤、ハロゲン化化合物、クウォーターニア（quarternia）、及びアルコールを含み得る。例示的なパラベンは、パラベン及びパラベン塩を含み得る。例示的なイソチアゾリノンは、メチルクロロイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、ベンゾイソチアゾリノンＰｒｏＣｌｉｎ １５０、ＰｒｏＣｌｉｎ ２００、ＰｒｏＣｌｉｎ ３００、及びＰｒｏＣｌｉｎ ９５０を含み得る。例示的なフェノール樹脂の種類は、フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、及びフェネチルアルコールを含み得る。例示的な酸性防腐剤は、デヒドロ酢酸、安息香酸、ソルビン酸、サリチル酸、ギ酸、プロピオン酸を含み得る。例示的なハロゲン化化合物は、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１、３−ジオール、クロロアセトアミド、クロロブタノール、クロロキシレノール、クロルフェネシン、ジクロロベンジルアルコール、ヨードプロピニルブチルカルバメート、メチルジブロモグルタロニトリルを含み得る。例示的なクウェターニア（quaternia）は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、ヘキサミジンジイセチオネート、及びポリアミノプロピルビグアニドを含み得る。例示的なアルコールは、エチルアルコール及びイソプロピルアルコールを含み得る。その例としては、トリアジン抗菌剤（例えば、ベンゾイソチアゾロン等）、ピリチオン、ピリジン殺菌剤（例えば、１−ヒドロキシピリジン−２−チオナトリウム等）、２−フェノキシエタノール等が挙げられる。具体的には、Ｐｒｏｘｅｌ ＧＸＬ（Ａｖｅｃｉａ）、ＴＯＭＩＣＩＤＥ Ｓ（ＡＰＩ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等が使用され得る。殺菌及び／又は殺真菌剤は、ＰＩＯＡＬの安定性の改善に役立つ。
一実施形態では、抗菌剤の濃度は、０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）であり得る。該濃度は、０．０３〜０．０５％（ｗ／ｖ）であり得る。
実施形態におけるＰＩＯＡＬを伴う、分析器を使用した分析を受ける試料は、特に制限されない。生体から得られる試料（生体試料）が通常使用される。あるいは、これらの試料は、使用のために、希釈、精製、造影剤との接触等がなされ得る。具体的に、かかる試料の例としては、血液、精液、脳脊髄液等が挙げられ得る。試料は、組織試料に由来する粒子懸濁剤もまた含み得る。実施形態におけるＰＩＯＡＬは、粒子（赤血球、白血球、細菌等）が分析されるときに好適に使用される。
本発明のＰＩＯＡＬは、粒子を撮像する視覚分析器において使用され得る。一態様では、視覚分析器は、好都合なリボン形状の試料ストリームの厚さ等の、所定の寸法特徴を伴う、リボン形状の試料ストリームの流れを維持することができるフローセルを備える。いくつかの実施形態では、フローセルは対称性流路を有し得、自動焦点構成要素との組み合わせで使用され得る。
本開示は、１）試料を粒子造影剤組成物と接触させること、２）調製した粒子を照射すること、３）ＰＩＯＡＬ内に包まれたリボン形状の試料ストリーム内の粒子のデジタル化画像を得ること、及び４）粒子を分類又は副分類するために画像情報を分析することを含む、粒子を撮像する方法に関する。いくつかの実施形態では、粒子は、例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、有核ＲＢＣ，芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、細胞、細菌、寄生虫、粒子状物質、細胞集塊、細胞成分、及び未熟顆粒球を含む、ＷＢＣ、ＲＢＣ、及び／又は血小板のうちの少なくとも１つであり得る。いくつかの実施形態では、血小板、網状赤血球、有核ＲＢＣ、並びに、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、及び、芽球、前骨髄球、骨髄球、又は後骨髄球を含む未熟ＷＢＣを含むＷＢＣは、粒子画像情報に基づいて計数及び分析される。
いくつかの実施形態では、視覚分析器は、対称性又は非対称性流路を伴うフローセル、及び自動焦点構成要素を備える。
一般的な態様では、例示的なＰＩＯＡＬ及びその使用方法は、研究及び／又は医学実験室において見られる自動化分析器との組み合わせで用いられると有用である。例示的な自動化分析器は、ヒト体液試料を含む多数の生体試料内の異なる形態の要素及び／又は他の特徴を、ヒトによる補助を伴い迅速に測定するために設計された器具である。例示的な自動化分析器は、例えば、全血計数（ＣＢＣ）測定を行うことができる、例えば、血液分析器及び／又は細胞計数器を含み得る。例示的な分析器は、試料を、１つずつ、数回に分けて、又は連続的に処理することができる。
一態様では、例示的な分析器／システムは、１つ以上の選択基準を満たす複数の粒子を検出するように、及びその粒子計数を提供するように構成される自動化粒子計数器を備え、ここにおいて選択基準は前記粒子内の少なくとも２つの分類のメンバを包含する。計数器の構成要素を含み得る、プロセッサを備え得る分析器は、該少なくとも２つの分類の粒子を区別するようにプログラム化される。該粒子のそれぞれの分布は分析器を使用して測定される。プロセッサは、該少なくとも２つの分類及び／又は副分類のうちの少なくとも１つのメンバについての粒子計数を補正するために該分布を使用する。いくつかの実施形態では、粒子計数器は、容積、大きさ、形状、及び／又は他の基準に基づく所定の範囲に基づいて、粒子の少なくとも１つの分類及び／又は副分類の粒子計数を提供するように構成される、少なくとも１つのチャネルを備える。例えば、該少なくとも１つの分類及び／又は副分類のメンバは、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、巨大血小板（ＰＬＴ）、及び有核赤血球（ＮＲＢＣ）からなる群から選択された、少なくとも１種類の粒子を含む。粒子計数器上で、類似する大きさ又は他の測定された特徴のために、巨大ＰＬＴ及びＮＲＢＣ等の細胞は、ＷＢＣとして計数され得る。本明細書に記載される装置を動作させることにより、巨大ＰＬＴ及びＮＲＢＣの粒子計数又は濃度を正確に測定することができる。
本明細書に記載される計算又は動作のそれぞれは、ハードウェア、ソフトウェア、及び／又はファームウェアを有する、コンピュータ又は他のプロセッサを使用して、行われ得る。様々な方法工程は、モジュールによって行われ得、該モジュールは、本明細書に記載される方法工程を行うために配置された、幅広い種類のデジタル及び／又はアナログデータ処理ハードウェア及び／又はソフトウェアのいずれかを含み得る。該モジュールは、任意に、関連する適切な機械プログラムコードを有することによって、これらの工程のうちの１つ以上を行うように構成される、データ処理ハードウェアを備え得、２つ以上の工程（又は２つ以上の工程の一部）の該モジュールは、任意の幅広い種類の一体化及び／又は分布処理アーキテクチャにおける、単一のプロセッサボードに一体化されるか、又は異なるプロセッサボードに分割される。これらの方法及びシステムは、多くの場合、上記の方法工程を行うための命令を伴う機械可読コードを実装する、有形の媒体を用い得る。好適な有形媒体は、メモリ（揮発性メモリ及び／又は不揮発性メモリを含む）、記憶媒体（フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、テープ等の磁気記憶と、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ／Ｗ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ等の光メモリと、任意の他のデジタル又はアナログ記憶媒体等）等を含み得る。
本開示において記載される全ての特許、特許公開、特許出願、雑誌論文、本、技術参考資料等は、全目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
図面に描写される又は上に記載される構成要素、並びに図示又は記載されない構成要素及び工程の異なる配置が、可能である。同様に、いくつかの特徴及び部分的組み合わせが有用であり、他の特徴及び部分的組み合わせに言及することなく用いられ得る。本発明の実施形態は、限定的でなく例示的な目的で記載されており、代替の実施形態は本特許の読者に明確となるだろう。特定の場合では、方法工程又は動作は、異なる順で行われる若しくは実行されてよく、又は動作が追加、削除、若しくは修正されてよい。本発明の特定の態様では、要素若しくは構造を提供するために、又は所与の機能若しくは機能（複数）を行うために、単一の構成要素を複数の構成要素に置き換えてよく、複数の構成要素を単一の構成要素に置き換えてよいということが理解され得る。本発明の特定の実施形態を実践するために、かかる置換が動作可能ではないであろう場合を除き、かかる置換は本発明の範囲内であると考えられる。結果的に、本発明は上記又は図面に描写の実施形態に制限されず、下記の請求項の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態及び修正がなされ得る。

Claims (29)

  1. 複合した粘性及び幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して、複数の粒子を撮像するための方法であって、前記粒子が、試料流体粘性を有する血液流体試料内に含まれ、前記方法が、
    シース液を、フローセルの流路に沿って流すこととであって、前記シース液が、所定の粘性差異範囲内の粘性差異で前記試料流体粘性とは異なるシース液粘性を有する、流すことと、
    前記シース液によって包まれる試料流体ストリームを提供するために、前記血液流体試料を、前記フローセル内の前記流れるシース液に注入することと、
    前記粘性差異に関連する、前記シース液と前記試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路の大きさの縮小部に関連する、前記シース液と前記試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、前記シース液内の粘性剤が前記試料流体内の細胞の生存能を保持し、前記細胞が前記試料流体ストリームから前記流れるシース液に伸びるときに、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、撮像部位での前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供するために効果的になるように、前記試料流体及び前記シース液を、前記撮像部位に向かって、流路の大きさの前記縮小部を通して、流すことと、
    前記撮像部位にて前記複数の粒子を撮像することと、を含む方法。
  2. 前記目標撮像状態が、前記撮像部位にて画像を取得するために使用される撮像デバイスの焦点面に対する、前記流れ内の１つ以上の目標粒子の目標配向を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記複数の粒子が、赤血球、白血球、及び血小板からなる群から選択されるメンバを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記複数の粒子が、細胞内構造、小器官、及びローブからなる群から選択されるメンバを含む粒子内構造を有する細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記シース液が、１〜１０センチポアズ（ｃＰ）の粘性を有する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記所定の粘性差異が、約０．１〜約１０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記シース液の前記粘性剤が、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、水溶性ポリマー（複数可）、及びデキストランからなる群から選択されるメンバを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記シース液の前記粘性剤が、約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の濃度でグリセロールを含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記シース液の前記粘性剤が、グリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記シース液の前記粘性剤が、５％（ｖ／ｖ）の濃度でグリセロールを、並びに１％（ｖ／ｖ）の濃度でグリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記複数の粒子が、１組の非球形粒子を含み、前記血液流体試料が、前記撮像部位にて流れの方向を有し、前記１組の非球形粒子のうちの少なくとも９０％が、前記流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内に整列する、請求項１に記載の方法。
  12. 試料流体粘性を有する血液流体試料内の複数の粒子を撮像するためのシステムであって、前記システムが、所定の粘性差異範囲内の粘性差異で前記試料流体粘性とは異なるシース液粘性を有する、シース液との使用のためのものであり、前記システムが、
    流路、及び流体注入管を有するフローセルであって、前記流路が、流路の大きさの縮小部を有する、フローセルと、
    前記シース液の流れを前記フローセルの前記流路に沿って送るために、前記フローセルの前記流路と流体連通するシース液インプットと、
    前記シース液及び前記試料流体が流路の大きさの前記縮小部を通って撮像部位に向かって流れる際に、前記粘性差異に関連する、前記シース液と前記試料流体との間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路の大きさの前記縮小部に関連する前記シース液と前記試料流体との間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、前記細胞が前記試料流体ストリームから流れるシース液に伸びるときに、前記シース液の粘性剤が、前記試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、前記撮像部位での前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供するための、前記血液流体試料の流れを、前記フローセル内を流れるシース液に注入するために前記フローセルの前記注入管と流体連通する血液流体試料インプットと、
    前記複数の粒子を前記撮像部位にて撮像する撮像デバイスと、を備えるシステム。
  13. 前記目標撮像状態が、前記撮像部位にて画像を取得するために使用される撮像デバイスの焦点面に対する、前記流れ内の１つ以上の目標粒子の目標配向を含む、請求項１２に記載のシステム。
  14. 前記複数の粒子が、赤血球、白血球、及び血小板からなる群から選択されるメンバを含む、請求項１２に記載のシステム。
  15. 前記複数の粒子が、細胞内構造、小器官、及びローブからなる群から選択されるメンバを含む粒子内構造を有する細胞を含む、請求項１２に記載のシステム。
  16. 前記所定の粘性差異が、約０．１〜約１０センチポアズ（ｃＰ）の範囲内の絶対値を有する、請求項１２に記載のシステム。
  17. 前記シース液の前記粘性剤が、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、水溶性ポリマー（複数可）、及びデキストランからなる群から選択されるメンバを含む、請求項１２に記載のシステム。
  18. 前記シース液の前記粘性剤が、約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の濃度でグリセロールを含む、請求項１２に記載のシステム。
  19. 前記シース液の前記粘性剤がグリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、請求項１２に記載のシステム。
  20. 前記シース液の前記粘性剤が、５％（ｖ／ｖ）の濃度でグリセロールを、並びに１％（ｗ／ｖ）の濃度でグリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、請求項１２に記載のシステム。
  21. 前記複数の粒子が１組の非球形粒子を含み、前記血液流体試料が、前記撮像部位にて流れの方向を有し、前記１組の非球形粒子のうちの少なくとも９０％が前記流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内に整列する、請求項１２に記載のシステム。
  22. 複合した粘性及び幾何学的流体集束分析器における使用のための、粒子及び細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）であって、前記ＰＩＯＡＬが、前記視覚分析器の狭細フローセル遷移帯域に注入された所与の粘性の血液試料流体の流れを、前記ＰＩＯＡＬによって包まれる試料流体ストリームを生成するように方向付け、前記ＰＩＯＡＬが、
    前記血液試料流体の前記粘性よりも高い粘性を有する流体を含み、
    前記粘性差異に関連する、前記ＰＩＯＡＬ流体と前記試料流体との間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、前記狭細フローセル遷移帯域に関連する、前記ＰＩＯＡＬ液と前記試料流体との間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤が前記試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、前記細胞が前記試料流体ストリームから前記流れるシース液に伸びるときに、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、前記視覚分析器の撮像部位での前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的である、粒子及び細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）。
  23. 前記シース液の前記粘性剤が、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、水溶性ポリマー（複数可）、及びデキストランからなる群から選択されるメンバを含む、請求項２２に記載のＰＩＯＡＬ。
  24. 前記シース液の前記粘性剤が、約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の濃度でグリセロールを含む、請求項２２に記載のＰＩＯＡＬ。
  25. 前記シース液の前記粘性剤が、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、請求項２２に記載のＰＩＯＡＬ。
  26. 前記ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が、１％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項２２に記載のＰＩＯＡＬ。
  27. 前記シース液の前記粘性剤が、グリセロールを更に含む、請求項２２に記載のＰＩＯＡＬ。
  28. 前記シース液の前記粘性剤が、５％（ｖ／ｖ）の濃度でグリセロールを、並びに１％（ｗ／ｖ）の濃度でグリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、請求項２２に記載のＰＩＯＡＬ。
  29. 前記ＰＩＯＡＬが約１〜１０センチポアズ（ｃＰ）の間の粘性を有する、請求項２２に記載のＰＩＯＡＬ。
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