BR112015021800B1 - sistema e método para medir uma quantidade de um primeiro tipo de células em uma amostra de fluido de sangue - Google Patents

sistema e método para medir uma quantidade de um primeiro tipo de células em uma amostra de fluido de sangue Download PDF

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Abstract

SISTEMAS E MÉTODOS DE EXTENSÃO DE FAIXA DINÂMICA PARA ANÁLISE DE PARTÍCULAS EM AMOSTRAS DE SANGUE. Para a análise de uma amostra que contém partículas de pelo menos duas categorias, como uma amostra contendo células sanguíneas, um contador de partículas sujeito a um limite de detecção é acoplado a um analisador capaz de diferenciar as razões entre os números de partículas, como um analisador visual, e um processador. A primeira categoria de partículas pode estar presente além dos limites da faixa de detecção, enquanto uma segunda categoria de partículas está presente dentro dos respectivos limites da faixa de detecção. A concentração da segunda categoria de partículas é determinada pelo contador de partículas. Uma razão entre as contagens da primeira categoria e da segunda categoria é determinada com o analisador. A concentração das partículas na primeira categoria é calculada no processador com base na razão e na contagem ou concentração de partículas na segunda categoria.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido é um pedido de patente não provisório do, e reivindica o benefício de prioridade para o, Pedido de Patente Provisório US n° 61/799.152 depositado em 15 de março de 2013, cujo conteúdo está aqui incorporado, por referência. Este pedido também está relacionado aos Pedidos de Patente US nos 14/215.834, 14/216.533, 14/216.339, 14/216.811 e 14/217.034; e Pedidos de Patente Internacionais nos (foco automático, célula de fluxo, fluido de revestimento, agente de contraste, hematologia), todos depositados em 17 de março de 2014. O conteúdo de cada um destes depósitos está aqui incorporado, por referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Esta descrição refere-se ao campo dos equipamentos, sis temas, composições e métodos para a análise de partículas, inclusive a formação de imagens de partículas em amostras fluidas, com o uso de dispositivos totalmente ou parcialmente automatizados para discriminar e quantificar partículas como células sanguíneas na amostra. A presente descrição também se refere a um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) útil para analisar partículas em uma amostra de um indivíduo, a métodos para produzir o líquido, e métodos para usar o líquido para detectar e analisar as partículas. As composições, sistemas, dispositivos e métodos úteis para conduzir a análise da amostra de fluido biológico com base em imagem são também divulgados. As composições, sistemas, dispositivos e métodos da presente descrição também são úteis para a detecção, contagem e caracterização de partículas em fluidos biológicos, como os eritrócitos, reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas, e para a contagem diferencial, categorização, subcategorização, caracterização e/ou análise de leucócitos com base em imagem e morfologicamente.
[0003] Análise das células do sangue é um dos exames médicos mais comumente realizados para fornecer uma visão geral da condição de saúde de um paciente. Uma amostra de sangue pode ser extraída do corpo de um paciente e armazenada em um tubo de ensaio contendo um anticoagulante para evitar a coagulação. Uma amostra de sangue total é normalmente composta por três classes principais de células do sangue, incluindo células vermelhas do sangue (eritrócitos), células brancas do sangue (leucócitos) e plaquetas (trombócitos). Cada classe pode ser dividida em subclasses de membros. Por exemplo, cinco tipos ou subclasses principais de células brancas do sangue (WBCs) têm diferentes formatos e funções. As células brancas do sangue podem incluir neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Há também subclasses dos tipos de células vermelhas do sangue. O aparecimento de partículas em uma amostra pode ser diferente de acordo com as condições patológicas, a maturidade das células e outras causas. As subclasses de células vermelhas do sangue podem incluir reticulócitos e células vermelhas do sangue nucleadas.
[0004] Uma contagem de células do sangue que estima a concen tração de células vermelhas do sangue, células brancas do sangue ou plaquetas pode ser feita manualmente ou usando um analisador automático. Quando as contagens das células do sangue são feitas manualmente, uma gota de sangue é aplicada a uma lâmina de microscópio, como um esfregaço fino. Tradicionalmente, o exame manual de um esfregaço de sangue corado, seco, em uma lâmina de microscópio tem sido usado para determinar o número ou quantidades relativas dos cinco tipos de células brancas do sangue. Corantes histológicos e colorações têm sido usados para corar as células ou estruturas celula- res. Por exemplo, o corante de Wright é um corante histológico que tem sido usado para corar esfregaços de sangue para exame ao microscópio de luz. Uma Contagem Completa de Sangue (CBC) pode ser obtida usando um analisador automatizado, um tipo que conta o número de diferentes partículas ou células em uma amostra de sangue com base na impedância ou dispersão dinâmica de luz na medida em que as partículas ou células passam através de uma área de detecção ao longo de um pequeno tubo. A CBC automatizada pode usar instrumentos ou métodos para diferenciar entre diferentes tipos de células que incluem RBCs, WBCs e plaquetas (PLTs), que podem ser contados separadamente. Por exemplo, uma técnica de contagem que requer um volume ou tamanho mínimo de partículas pode ser usada para contar apenas células grandes. Certas células, como as células anormais no sangue não podem ser contadas ou identificadas corretamente. Pequenas células que se aderem umas às outras podem ser erroneamente contadas como uma célula grande. Quando contagens erradas são suspeitas, a revisão manual dos resultados do instrumento pode ser necessária para verificar e identificar as células.
[0005] As técnicas automatizadas para contagem de células do sangue podem envolver citometria de fluxo. A citometria de fluxo envolve o fornecimento de uma trajetória de fluxo estreita, e detecção e contagem da passagem de células sanguíneas individuais. Métodos de citometria de fluxo têm sido usados para detectar as partículas em suspensão em um fluido, como as células em uma amostra de sangue, e para analisar as partículas quanto ao tipo de partícula, dimensão, e distribuição de volume de modo a deduzir a concentração do respectivo tipo de partícula ou volume de partículas na amostra de sangue. Exemplos de métodos adequados para a análise de partículas suspensas em um fluido incluem sedimentação, caracterização microscópica, contagem com base na impedância, e dispersão dinâmica de luz. Estas ferramentas são sujeitas a erros de teste. Por outro lado, a caracterização precisa dos tipos e da concentração de partículas pode ser crítica em aplicações como o diagnóstico médico.
[0006] Nas técnicas de contagem baseadas em imageamento, imagens de dados de pixel de uma amostra preparada que pode estar passando através de uma área de visualização são capturadas com o uso de uma lente objetiva de microscopia acoplada a uma câmera digital. Os dados de imagem de pixel podem ser analisados com o uso de técnicas de processamento de dados, e também exibidos em um monitor.
[0007] Aspectos de sistemas de diagnóstico automatizados com células de fluxo estão divulgados na Patente US n° 6.825.926 concedida a Turner et al. e nas Patentes US nos 6.184.978; 6.424.415; e 6.590.646, todas concedidas a Kasdan et al., que estão aqui incorporadas por referência como se apresentadas completamente na presente invenção.
[0008] Sistemas automatizados que usam impedância ou disper são dinâmica de luz têm sido usados para obter uma contagem completa de sangue (CBC): contagem de leucócitos totais (WBC), volume celular total de eritrócitos (distribuição de RBC), hemoglobina HGB (a quantidade de hemoglobina no sangue); volume médio celular (MCV) (volume médio das células vermelhas); MPV (volume médio de PLT); hematócrito (HCT); MCH (HGB/RBC) (a quantidade média de hemo-globina por eritrócito); e MCHC (HGB/HCT) (a concentração média de hemoglobina nas células). Processos automatizados ou parcialmente automatizados têm sido usados para facilitar a contagem diferencial em cinco partes das células brancas do sangue (leucócitos) e as análises de amostra de sangue.
[0009] Embora tais sistemas e métodos de análise de partículas conhecidos atualmente, juntamente com técnicas de diagnóstico médi- cos relacionadas, possam fornecer benefícios reais para os médicos, clínicos e pacientes, melhorias adicionais são desejáveis. As modalidades da presente invenção fornecem soluções para pelo menos algumas dessas necessidades pendentes.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00010] As modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos para a quantificação das células ou partículas presentes em uma amostra de fluido sanguíneo, usando técnicas de extensão da faixa de detecção ou dinâmica exemplificadoras.
[00011] Por exemplo, as modalidades exemplificadoras compreendem técnicas para a correção de contagens de partículas imprecisas associado a pelo menos uma faixa de detecção, com base em um parâmetro como o volume das partículas. Ao operar o equipamento conforme descrito na presente invenção, as partículas fora da faixa de detecção para a concentração e/ou em volume podem ser detectadas e medidas com precisão.
[00012] Para uso na presente invenção, o termo "limite de detecção" ou "fora da faixa de detecção" associado com um contador de partículas produzido nesta descrição será entendido para abranger uma faixa, dentro da qual a contagem de partículas é mais precisa e/ou fora da qual a contagem de partículas é menos precisa ou mesmo inoperável. Uma faixa de detecção pode incluir um limite de detecção superior e/ou um inferior, tipicamente expresso como uma concentração máxima ou mínima, mas também, possivelmente, expresso como uma frequência máxima ou mínima na qual as partículas são contadas dentro de uma dada tolerância de precisão. Consequentemente, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos para análise paralela de células de fluxo e de impedância de amostras de fluido do sangue para quantificação de contagens de espécies abundantes e/ou esparsas.
[00013] Uma faixa de detecção pode ser baseada na concentração, que pode incluir uma concentração local, e/ou outro critério ou critérios especificados. Por exemplo, pode ser difícil detectar e contar com precisão em um contador de partículas uma partícula como um fragmento ou célula sanguínea menor que uma PLT normal (isto é, tendo um diâmetro menor que 2 μm). Pode ser difícil detectar e contar com preci-são em um contador de partículas uma célula anormal maior que uma célula branca regular (isto é, tendo um diâmetro maior que 15 μm). Além disso, em concentrações elevadas, os RBCs e PLTs podem ser difíceis de contar com precisão. Mesmo após a diluição, os RBCs e as PLTs podem se agregar para formar aglomerações, resultando em leituras falsas das contagens de partículas obtidas com o uso de um contador de partículas. Ademais, é difícil de fornecer uma contagem precisa de algumas células do sangue imaturas ou anormais presentes na amostra em baixas concentrações.
[00014] Como um exemplo, ao usar o equipamento aqui descrito, a faixa de detecção de medição, o limite de detecção superior para WBCs, pode ser estendido até 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, ou 1.000.000 por (unidade de volume) em algumas modalidades. O limite de detecção inferior para PLTs pode ser estendido para menos 20.000, 19.000, 18.000, 17.000, 16.000, 15.000, 14.000, 13.000, 12.000, 11.000, 10.000, 9.500, 9.000, 8.500, 8.000, 7.500, 7.000, 6.500, 6.000, 5.500, 5.000, 4.500, 4.000, 3.500, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500 ou 1.000, ou 500 por μl em algumas modalidades.
[00015] De modo semelhante, as modalidades exemplificadoras abrangem técnicas para corrigir resultados imprecisos obtidos em um contador de partículas através da diferenciação de diferentes classes (incluindo os membros de cada classe) de partículas detectadas em um canal. Conforme descrito aqui, algumas partículas têm morfologia ou volume semelhante e podem ser detectadas em um canal. Por exemplo, PLTs "gigantes", agregados ou aglomerações de PLT e RBCs nucleados podem ser contados como "WBCs" em um canal projetado para detectar WBCs. Além disso, outras espécies, como as células não lisadas, crioglobulina, corpos de heinz, e parasita da malária, podem ser contadas como "WBCs" para produzir uma contagem de WBC maior que a realmente existe na amostra. De modo similar, a elevada concentração de WNCs e PLTs gigantes pode ser contada como "RBCs" e resultar em uma contagem de RBC maior que o valor real. A presença de células vermelhas microcíticas, inclusões de células vermelhas, fragmentos de células brancas, partículas de poeira, hemólise/esquistócitos e mesmo ruídos eletrônicos/elétricos pode resultar em uma contagem de PLTs maior que a real. Por outro lado, as células de sombras nucleares e coagulação dentro da mesma classe ou confusão de uma classe de células com outra classe podem resultar em contagem imprecisa e inferior da classe correspondente de células no contador de partículas.
[00016] Em alguns aspectos dos métodos da presente descrição, uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra em uma concentração acima de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas; e uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro de uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em outros aspectos dos métodos da presente invenção, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra em uma concentração abaixo de uma faixa detectável aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas, e a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro de uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em outros aspectos, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas compreende pelo menos um tipo de células anormais do sangue, células imaturas do sangue, células agregadas do sangue, células do sangue tendo um diâmetro maior que 15 mícrons, e células do sangue tendo um diâmetro menor que 2 mícrons; e a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas compreende células brancas do sangue.
[00017] Ao operar o equipamento como descrito na presente descrição, as partículas que são contadas erroneamente como um outro tipo de partículas em um canal do contador de partículas podem ser medidas separadamente e com precisão. Métodos exemplificadores podem também ser usados para determinar a contagem de partículas ou concentrações de partículas que não podem ser detectadas com precisão no contador de partículas. Estas partículas incluem, mas não se limitam a, partículas fora das faixas de volume normais e/ou partículas presentes em concentrações próximas ou fora da extremidade alta ou baixa de concentrações detectáveis no contador de partículas. De modo semelhante, ao operar um equipamento do sistema descrito, compreendendo especialmente um contador de partículas e um analisador de imagens em combinação com as composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras e PIOAL, como descrito na presente descrição, algumas partículas que podem ser contadas erroneamente como um outro tipo de partículas em um canal do contador de partículas podem ser medidas separadamente e com precisão. Os métodos da presente invenção podem também ser usados em alguns casos para determinar a contagem de partículas ou as concentrações de partículas que não podem ser detectadas com precisão no contador de partículas. Estas partículas incluem, mas não se limitam a, partículas fora de uma faixa de detecção e/ou partículas presentes em concentrações próximas ou além da extremidade alta ou baixa de concentrações detectáveis no contador de partículas. Isto é feito através da aplicação das informações obtidas a partir do analisador de imagem.
[00018] De modo geral, ao operar um equipamento como aqui descrito, por exemplo, usando composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras e fluidos de revestimento de PIOAL, a análise de uma amostra contendo partículas, como células sanguíneas ou outros fragmentos, pode ser realizada em faixas de detecção que estão fora da faixa de detecção nominal para um contador de partículas. De modo semelhante, com o uso dos sistemas e composições descritas, a análise de uma amostra de fluido do sangue pode ser realizada em faixas de detecção estendidas com base em um parâmetro, como a concentração ou volume da partícula. As faixas de detecção estendidas podem estar fora da faixa de detecção para um contador de partículas.
[00019] Em algumas modalidades, um sistema ou equipamento pode incluir um contador de partículas. Em outras modalidades, este contador de partículas tem pelo menos uma faixa de detecção. Em certos aspectos, o analisador e o processador podem ser configurados para fornecer informações adicionais para corrigir erros de teste associados com o contador de partículas e, adicionalmente, determinar a contagem de partículas precisa ou a concentração de diferentes categorias e/ou subcategorias de partículas na amostra. Desde que as informações estejam disponíveis a partir do contador de partículas e do analisador sobre as contagens, uma ou mais razões e/ou distribuição em relação a pelo menos duas das categorias e/ou subcategorias de partículas, então erros nas contagens, categorização e/ou subcategoriza- ção do contador de partículas podem ser corrigidos, e as contagens, categorias e/ou subcategorias podem ser derivadas daquelas que não foram inicialmente relatadas pelo contador de partículas.
[00020] As modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos para a quantificação das células ou partículas presentes em uma amostra de fluido sanguíneo, usando técnicas de extensão da faixa de detecção ou dinâmica exemplificadoras.
[00021] Por exemplo, as modalidades exemplificadoras compreendem técnicas para a correção do número impreciso de partículas associado a pelo menos uma faixa de detecção, com base em um parâmetro como o volume das partículas. Ao operar o equipamento conforme descrito na presente invenção, as partículas fora da faixa de detecção para a concentração e/ou volume podem ser detectadas e medidas com precisão.
[00022] Para uso na presente invenção, o termo "limite de detecção" ou "fora da faixa de detecção" associado com um contador de partículas produzido nesta descrição será entendido para abranger uma faixa, dentro da qual a contagem de partículas é mais precisa e/ou fora da qual a contagem de partículas é menos precisa ou mesmo inoperável. Uma faixa de detecção pode incluir um limite de detecção superior e/ou um inferior, tipicamente expresso como uma concentração máxima ou mínima, mas também, possivelmente, expresso como uma frequência máxima ou mínima na qual as partículas são contadas dentro de uma dada tolerância de precisão. Consequentemente, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos para análise paralela de células de fluxo e impedância de amostras fluidas de sangue para quantificação de contagens de espécies abundantes e/ou esparsas.
[00023] Uma faixa de detecção pode ser baseada na concentração, que pode incluir uma concentração local, e/ou outro critério ou critérios especificados. Por exemplo, pode ser difícil detectar e contar com precisão em um contador de partículas uma partícula como um fragmento ou célula sanguínea menor que uma PLT normal (isto é, tendo um diâmetro menor que 2 μm). Pode ser difícil detectar e contar com preci-são em um contador de partículas uma célula anormal maior que uma célula branca regular (isto é, tendo um diâmetro maior que 15 μm). Além disso, em concentrações elevadas, os RBCs e as PLTs podem ser difíceis de contar com precisão. Mesmo após a diluição, os RBCs e as PLTs podem se agregar para formar aglomerações, resultando em leituras falsas das contagens de partículas obtidas com o uso de um contador de partículas. Ademais, é difícil de fornecer uma contagem precisa de algumas células do sangue imaturas ou anormais presentes na amostra em baixas concentrações.
[00024] Como um exemplo, ao usar o equipamento aqui descrito, a faixa de detecção de medição, o limite de detecção superior para WBCs, pode ser estendido até 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, ou 1.000.000 por (unidade de volume) em algumas modalidades. O limite de detecção inferior para PLTs pode ser estendido para menos 20.000, 19.000, 18.000, 17.000, 16.000, 15.000, 14.000, 13.000, 12.000, 11.000, 10.000, 9.500, 9.000, 8.500, 8.000, 7.500, 7.000, 6.500, 6.000, 5.500, 5.000, 4.500, 4.000, 3.500, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500 ou 1.000, ou 500 por μl em algumas modalidades.
[00025] De modo semelhante, as modalidades exemplificadoras abrangem técnicas para corrigir resultados imprecisos obtidos em um contador de partículas através da diferenciação de diferentes classes (incluindo os membros de cada classe) de partículas detectadas em um canal. Conforme descrito aqui, algumas partículas têm morfologia ou volume semelhante e podem ser detectadas em um canal. Por exemplo, PLTs "gigantes", agregados ou aglomerações de PLT e RBCs nucleados podem ser contados como "WBCs" em um canal projetado para detectar WBCs. Além disso, outras espécies, como as células não lisadas, crioglobulina, corpos de heinz, e parasita da malária, podem ser contadas como "WBCs" para produzir uma contagem de WBC maior que a realmente existe na amostra. De modo similar, a elevada concentração de WNCs e PLTs gigantes pode ser contada como "RBCs" e resultar em uma contagem de RBC maior que o valor real. A presença de células vermelhas microcíticas, inclusões de células vermelhas, fragmentos de células brancas, partículas de poeira, hemólise/esquistócitos e mesmo ruídos eletrônicos/elétricos pode resultar em uma contagem de PLTs maior que a real. Por outro lado, as células de sombras nucleares e coagulação dentro da mesma classe ou confusão de uma classe de células com outra classe podem resultar em contagem imprecisa e inferior da classe correspondente de células no contador de partículas.
[00026] Em alguns aspectos dos métodos da presente descrição, uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra em uma concentração acima de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas; e uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro de uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em outros aspectos dos métodos da presente invenção, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra em uma concentração abaixo de uma faixa detectável aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas, e a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro de uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em outros aspectos, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas compreende pelo menos um tipo de células anormais do sangue, células imaturas do sangue, células agregadas do sangue, células do sangue tendo um diâmetro maior que 15 mícrons, e células do sangue tendo um diâmetro menor que 2 mícrons; e a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas compreende células brancas do sangue.
[00027] Ao operar o equipamento como descrito na presente des- crição, as partículas que são contadas erroneamente como um outro tipo de partículas em um canal do contador de partículas podem ser medidas separadamente e com precisão. Métodos exemplificadores podem também ser usados para determinar a contagem de partículas ou concentrações de partículas que não podem ser detectadas com precisão no contador de partículas. Estas partículas incluem, mas não se limitam a, partículas fora das faixas de volume normais e/ou partículas presentes em concentrações próximas ou fora da extremidade alta ou baixa de concentrações detectáveis no contador de partículas. De modo semelhante, ao operar um equipamento do sistema descrito, compreendendo especialmente um contador de partículas e um analisador de imagens em combinação com as composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras e PIOAL, como descrito na presente descrição, algumas partículas que podem ser contadas erroneamente como um outro tipo de partículas em um canal do contador de partículas podem ser medidas separadamente e com precisão. Os métodos da presente invenção podem também ser usados em alguns casos para determinar a contagem de partículas ou as concentrações de partículas que não podem ser detectadas com precisão no contador de partículas. Estas partículas incluem, mas não se limitam a, partículas fora de uma faixa de detecção e/ou partículas presentes em concentrações próximas ou além da extremidade alta ou baixa de concentrações detectáveis no contador de partículas. Isto é feito através da aplicação das informações obtidas a partir do analisador de imagem.
[00028] De modo geral, ao operar um equipamento como aqui descrito, por exemplo, usando composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras e fluidos de revestimento de PIOAL, a análise de uma amostra contendo partículas, como células sanguíneas ou outros fragmentos, pode ser realizada em faixas de detecção que estão fora da faixa de detecção nominal para um contador de partículas. De modo semelhante, com o uso dos sistemas e composições descritas, a análise de uma amostra de fluido do sangue pode ser realizada em faixas de detecção estendidas com base em um parâmetro, como a concentração ou volume da partícula. As faixas de detecção estendidas podem estar fora da faixa de detecção para um contador de partículas.
[00029] Em algumas modalidades, um sistema ou equipamento pode incluir um contador de partículas. Em outras modalidades, este contador de partículas tem pelo menos uma faixa de detecção. Em certos aspectos, o analisador e o processador podem ser configurados para fornecer informações adicionais para corrigir erros de teste associados com o contador de partículas e, adicionalmente, determinar a contagem de partículas precisa ou a concentração de diferentes categorias e/ou subcategorias de partículas na amostra. Desde que as informações estejam disponíveis a partir do contador de partículas e do analisador sobre as contagens, uma ou mais razões e/ou distribuição em relação a pelo menos duas das categorias e/ou subcategorias de partículas, então erros nas contagens, categorização e/ou subcategoriza- ção do contador de partículas podem ser corrigidos, e as contagens, categorias e/ou subcategorias podem ser derivadas daquelas que não foram inicialmente relatadas pelo contador de partículas.
[00030] Em um aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para medir uma quantidade de um primeiro tipo de células em uma amostra de fluido de sangue. A amostra pode incluir um segundo tipo de células. Métodos exemplificadores incluem determinar uma população do segundo tipo de células em um primeiro volume da amostra mediante passagem do primeiro volume através de um contador de células de hematologia, captura de imagens de um primeiro número dos primeiros tipos de células e um segundo número dos segundos tipos de células pela injeção de um segundo volume da amostra em um fluido de revestimento que flui no interior de uma célula de fluxo de modo a fornecer uma corrente de amostra tendo uma espessura e uma largura maior que a espessura, as imagens capturadas sendo capturadas ao longo de uma trajetória de imagem que atravessa a espessura da corrente da amostra, determinar uma razão entre o primeiro número do primeiro tipo de células e o segundo número dos segundos tipos de células usando as imagens capturadas, e calcular uma medida da quantidade de células do primeiro tipo de células na amostra usando a razão e a população do segundo tipo de células. Em alguns casos, a medida da quantidade de células inclui uma concentração de células para o primeiro tipo de células na amostra de fluido de sangue. Em alguns casos, a medida da quantidade de células inclui uma contagem de células para o primeiro tipo de célula na amostra de fluido de sangue. Em alguns casos, o contador de células tem uma primeira precisão associada com a contagem do primeiro tipo de célula e uma segunda precisão associada com a contagem do segundo tipo de célula, a segunda precisão sendo superior à primeira precisão. Em alguns casos, o contador de células de hematologia tem uma faixa de precisão desejada, a faixa de precisão desejada estendendo- se entre uma população mínima de células no primeiro volume e uma população máxima de células no primeiro volume, sendo que a população determinada do segundo tipo de células no volume está dentro da faixa de precisão desejada, e sendo que a medida da quantidade de células calculada do primeiro tipo de células da amostra está fora da faixa de precisão desejada. Em alguns casos, os métodos incluem determinar uma população do primeiro tipo de células no primeiro volume da amostra como resultado do fluxo do primeiro volume através do contador de células de hematologia, sendo que a população determinada do primeiro tipo de células no primeiro volume está acima ou abaixo de uma faixa de precisão desejada para o primeiro tipo de célu- las, e é diferente da medida da quantidade de células calculada do primeiro tipo de células. Em alguns casos, a população determinada do primeiro tipo de células é zero. Em alguns casos, a população determinada do primeiro tipo de células é maior que zero. Em alguns casos, o contador de células de hematologia inclui um mecanismo sensor que detecta uma alteração na impedância elétrica em resposta a um segundo tipo de células que flui através do contador de células. Em alguns casos, o contador de células de hematologia inclui um mecanismo sensor que detecta uma obstrução de uma trajetória de luz em resposta a um segundo tipo de células que flui através do contador de células. Em alguns casos, o contador de células de hematologia tem um limite mínimo de concentração detectável e um limite máximo de concentração detectável para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de concentração detectável e um limite máximo de concentração detectável para o segundo tipo de células, a população determinada do segundo tipo de células é baseada em um parâmetro de concentração detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células, e o primeiro tipo de células está presente em uma concentração que está abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células. Em alguns casos, o contador de células de hematologia tem um limite mínimo de volume detectável e um limite máximo de volume detectável para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de volume detectável e um limite máximo de volume de- tectável para o segundo tipo de células, a população determinada do segundo tipo de células é baseada em um parâmetro de volume detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células, e o primeiro tipo de células está presente em um parâmetro de volume que está abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células. Em alguns casos, o contador de células de hematologia tem um limite mínimo de tamanho detectável e um limite máximo de tamanho detectável para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de tamanho detectável e um tamanho máximo de volume detectável para o segundo tipo de células, a população determinada do segundo tipo de células é baseada em um parâmetro de tamanho detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células, e o primeiro tipo de células está presente em um parâmetro de tamanho que está abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células. Em alguns casos, a determinação da população do segundo tipo de células no primeiro volume da amostra envolve agrupar juntas as células do primeiro tipo de células e as células do segundo tipo de células. Em alguns casos, os métodos incluem calcular uma medida de quantidade de células do segundo tipo de células na amostra usando a razão e a população do segundo tipo de células. Em alguns casos, a determinação da população do segundo tipo de células no primeiro volume da amostra compreende agrupar juntas as células do primeiro tipo de células e células do segundo tipo de células, sendo que os métodos incluem adicionalmente determinar uma população do primeiro tipo de células no primeiro volume da amostra como resultado do fluxo do primeiro volume através do contador de células de hematologia, e sendo que o cálculo da medida da quantidade de células do primeiro tipo de células na amostra usa a razão, a população do segundo tipo de células, e a população do primeiro tipo de células. Em um outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas para medir uma quantidade de um primeiro tipo de células em uma amostra de fluido de sangue. A amostra pode incluir um segundo tipo de células. Sistemas exemplificadores incluem um contador de células de hematologia tendo um canal e uma saída, a saída acoplada de modo operacional ao canal de modo a gerar sinais indicativos de uma população do segundo tipo de células em um primeiro volume da amostra que flui através do canal, uma célula de fluxo configurada para facilitar o fluxo de uma corrente de amostra, a corrente de amostra tendo um segundo volume da amostra e um fluido de revestimento, e tendo uma espessura e uma largura maior que a espes-sura, um equipamento de imageamento configurado para capturar imagens de um primeiro número do primeiro tipo células e um segundo número do segundo tipo de células, as imagens capturadas sendo capturadas ao longo de uma trajetória de imagem que atravessa a espessura da corrente da amostra, um processador, um módulo de análise de imagens tendo um código legível por máquina que incorpora meio tangível executado no processador para determinar uma razão entre o primeiro número do primeiro tipo de células e o segundo número dos segundos tipos de células usando as imagens capturadas, e um módulo de quantidade de células que compreende um código legível por máquina que incorpora um meio tangível executado no processador para calcular uma medida da quantidade de células do primeiro tipo de células na amostra usando a razão e os sinais indicativos de uma população do segundo tipo de células. Em alguns casos, o processador está acoplado ao contador de células de hematologia para receber sinais indicativos da população do segundo tipo de células. Em alguns casos, o processador está acoplado ao equipamento de imagem para receber as imagens capturadas. Em alguns casos, a célula de fluxo e o equipamento de imagem são componentes de um analisador de hematologia que executa hidrofocalização geométrica e viscosidade combinadas para imageamento das células na amostra de fluido de sangue. Em alguns casos, uma diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento e a amostra de fluido de sangue, em combinação com uma diminuição do tamanho da trajetória de fluxo da cé- lula de fluxo, é eficaz para hidrofocalizar a corrente de amostra em um local de captura de imagem da célula de fluxo.
[00031] O descrito acima e muitos outros recursos e vantagens concomitantes das modalidades da presente invenção serão evidentes e adicionalmente compreendidos por referência à seguinte descrição detalhada quando considerados em conjunto com os desenhos anexos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00032] A Figura 1 é uma ilustração esquemática, em seção parcial e não em escala, mostrando aspectos operacionais de uma célula de fluxo exemplificadora, sistema de foco automático e dispositivo de imageamento de resolução óptica elevada para análise de imagens da amostra usando processamento de imagens digital.
[00033] As Figuras 3A e 3B fornecem vistas em corte adicionais de células de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00034] A Figura 2 é uma ilustração em perspectiva de uma célula de fluxo de acordo com uma modalidade exemplificadora.
[00035] A Figura 3 é uma vista em corte longitudinal média ao longo das linhas 3-3 da célula de fluxo mostrada na Figura 2.
[00036] As Figuras 3A e 3B fornecem vistas em corte adicionais de células de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00037] A Figura 4 ilustra aspectos de um sistema de imageamento de acordo com modalidades da presente invenção.
[00038] As Figuras 4A e 4B representam aspectos de células de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00039] As Figuras 4A-1 e 4A-2 representam vistas em seção transversal do envelope de fluido de revestimento (por exemplo, PIO- AL) e dimensões da corrente de fluido da amostra dentro de uma célula de fluxo de uma porta de saída da cânula e um local de captura de imagens, respectivamente, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00040] As Figuras 4K e 4L mostram uma corrente de amostra que flui através de um local de captura de imagens de uma célula de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00041] A Figura 4O mostra uma comparação entre imagens obtidas usando PIOAL e imagens obtidas usando um fluido de revestimento não PIOAL de acordo com modalidades da presente invenção.
[00042] As Figuras 4P e 4Q mostram uma comparação entre imagens obtidas usando um fluido de revestimento padrão e um fluido de PIOAL exemplificador de acordo com modalidades da presente invenção.
[00043] A Figura 5 é um diagrama de blocos que mostra aspectos adicionais de sistemas e métodos para obtenção da extensão de faixa dinâmica ou de detecção para a análise de partículas em amostras de sangue, de acordo com modalidades da presente invenção.
[00044] A Figura 6 mostra um equipamento exemplificador para a análise de uma amostra de acordo com modalidades da presente invenção.
[00045] A Figura 6A representa aspectos de um contador exemplifi- cador ou módulo de contagem de acordo com modalidades da presente invenção.
[00046] A Figura 6B representa aspectos de um sistema de módulo de acordo com modalidades da presente invenção.
[00047] A Figura 7 representa aspectos de sistemas e métodos para medir uma quantidade de um primeiro tipo de células em uma amostra de fluido de sangue de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00048] A Figura 8 mostra um método para analisar uma amostra que contém partículas de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00049] A Figura 9 ilustra um método de determinação exemplifica- dor da concentração de duas subcategorias de partículas de acordo com as modalidades da presente invenção.
[00050] As Figuras 10A, 10B, 10C, e 10D mostram a detecção de categorias de partículas de acordo com as modalidades da presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00051] A presente descrição refere-se a equipamentos, sistemas, composições e métodos para análise de uma amostra que contém partículas. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um sistema de imageamento de partículas automatizado que compreende um analisador que pode ser, por exemplo, um analisador visual. Em algumas modalidades, o analisador visual pode compreender adicionalmente um processador automatizado para facilitar a análise das imagens.
[00052] De acordo com esta descrição, um sistema que compreende um analisador visual é fornecido para a obtenção de imagens de uma amostra compreendendo partículas em suspensão em um líquido. O sistema pode ser útil, por exemplo, na caracterização de partículas em fluidos biológicos, como na detecção e quantificação de eritrócitos, reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas e leucócitos, incluindo contagem diferencial, categorização e subcategorização e análise de leucócitos. Outros usos semelhantes, como caracterização de células do sangue de outros líquidos são também contemplados.
[00053] A discriminação de células do sangue em uma amostra de sangue é uma aplicação exemplificadora para a qual a matéria objeto da invenção é particularmente bem adequada. A amostra é preparada por técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de image- amento óptico de elevada resolução como uma corrente de amostra delgada em formato de fita a ser imageada periodicamente enquanto a corrente de amostra em formato de fita passa através de um campo de visão. As imagens das partículas (como células do sangue) podem ser distinguidas umas das outras, categorizadas, subcategorizadas e contadas, com o uso de técnicas de processamento programadas com dados de imagem de pixel, quer exclusivamente automaticamente ou com a ajuda humana limitada, para identificar e contar células ou partículas. Além das imagens das células, que podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de recursos incomuns ou críticos das partículas, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria particular da célula ou partícula distinguida nas imagens da amostra registradas.
[00054] As contagens de partículas diferentes encontradas em cada imagem podem ser adicionalmente processadas, por exemplo, usadas para acumular razões precisas e estatisticamente significativas de células de cada uma das categorias e/ou subcategorias distinguidas na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual pode ser diluída, mas as proporções de células em cada categoria e/ou subcategoria estão representadas na amostra diluída, particular-mente depois de inúmeras imagens terem sido processadas.
[00055] O equipamento e os métodos aqui divulgados são úteis para discriminar e quantificar em células em amostras com base em distinções visuais. A amostra pode ser uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de fluido corporal que compreende células brancas do sangue, incluindo, sem limitação, sangue, soro, medula óssea, fluido de lavagem, efusões, exsudados, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal, líquido amniótico. Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, por exemplo, uma amostra de biopsia que foi tratada para produzir uma suspensão de células. A amostra pode também ser uma suspensão obtida a partir de tratamento de uma amostra fecal. Uma amostra pode também ser uma amostra de linhagem de produção ou de laboratório compreendendo partículas, como uma amostra de cultura de células. O termo amostra pode ser usado para se referir a uma amostra obtida de um paciente ou de laboratório ou de qualquer fração, porção ou alíquota da mesma. A amostra pode ser diluída, dividida em porções, ou corada em alguns processos.
[00056] Em um aspecto, os sistemas, composições e métodos da presente descrição surpreendentemente fornecem imagens de alta qualidade de células em um fluxo. Em um aspecto, o analisador visual pode ser usado em métodos da presente descrição para fornecer uma imagem automatizada com base na contagem de WBC diferencial. Em certas modalidades, os métodos da presente descrição referem-se à identificação automatizada de distinções visuais, incluindo recursos morfológicos e/ou anormalidades para determinar, diagnosticar, prog-nosticar, prever e/ou sustentar um diagnóstico de se um indivíduo é saudável ou tem uma doença, condição, anormalidade e/ou infecção e/ou é responsivo ou não responsivo ao tratamento. O sistema pode compreender ainda um contador de partículas em algumas modalidades. As aplicações incluem categorização e/ou subcategorização, e contagem de células em uma amostra de fluido, como uma amostra de sangue. Outros usos semelhantes para a contagem de tipos adicionais de partículas e/ou partículas em outras amostras de fluido são também contemplados. O sistema, composições e métodos da presente invenção podem ser usados para visualização de imagens e categorização e subcategorização em tempo real usando qualquer algoritmo de reconhecimento de partículas automatizado adequado. As imagens capturadas para cada amostra podem ser armazenadas para serem visualizadas em uma data posterior.
[00057] Em um outro aspecto, os equipamentos, composições e métodos da presente invenção fornecem, surpreendentemente, uma imagem com base na categorização e subcategorização e sinalização de células mais precisas, o que reduz a taxa de análise manual em comparação com a taxa de análise manual quando usando analisadores automatizados atuais. Os sistemas, composições e métodos reduzem a taxa de análise manual e permitem que a análise manual seja executada no instrumento. Além disso, os sistemas, composições e métodos da presente descrição também reduzem a porcentagem de amostras sinalizadas durante a análise automatizada como requerendo a análise manual.
[00058] A presente descrição refere-se, ainda, a sistemas, métodos e composições para combinar um contador de contagem completa de sangue (CBC) com um analisador, como um analisador visual, de modo a obter uma CBC e uma imagem com base na contagem diferencial de leucócitos expandida e uma contagem de plaquetas expandida com base na imagem, estendendo, assim, a faixa de detecção eficaz para a contagem de plaquetas.
[00059] Consequentemente, em algumas modalidades, a presente descrição fornece um equipamento e um método para analisar uma amostra contendo partículas, por exemplo, células do sangue. De acordo com esta descrição, um analisador visual é fornecido para a obtenção de imagens de uma amostra compreendendo partículas em suspensão em um líquido. Em algumas modalidades, o analisador visual compreende uma célula de fluxo e um componente de foco automático, em que uma amostra líquida contendo partículas de interesse é obrigada a fluir através de uma célula de fluxo tendo uma janela através da qual uma câmara acoplada a uma lente objetiva captura imagens digitais das partículas. A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido de amostra, como uma amostra de sangue diluída e/ou tratada ou outra amostra de fluido corporal, como aqui descrito, e a uma fonte de um fluido de revestimento transparente, ou líquido de alinhamento de organelas intracelulares e/ou partículas (PIOAL).
[00060] Em uma modalidade, o equipamento também compreende um contador de partículas tendo pelo menos uma faixa de detecção, bem como um analisador, e um processador. O analisador e o processador são configurados para fornecer informações adicionais para corrigir erros de contagem, categorização, e subcategorização associados com o contador de partículas, e, adicionalmente, determinar a contagem de partículas precisa ou a concentração de diferentes categorias e/ou subcategorias de partículas na amostra.
[00061] A presente descrição fornece métodos e composições úteis para alinhamento de organela intracelular e/ou partícula na realização de análise da amostra à base de imagem. Em algumas modalidades, a presente descrição refere-se a métodos e composições para sistema de imageamento e contagem combinados com a capacidade de executar uma contagem completa de sangue (CBC) e um diferencial de leucócitos (WBC) expandido com base na imagem capaz de identificar e contar os tipos de células, como WBCs, RBCs e/ou plaquetas, inclu-indo, por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófi- los, reticulócitos, RBCs nucleados, blastos, promielócitos, mielócitos, ou metamielócitos, e fornecer informações com base na imagem para a contagens e morfologias de WBC, contagens e morfologias de eri- trócitos (RBC) e contagens e morfologias de plaquetas (PLT).
[00062] Em outras modalidades, a presente descrição refere-se a um PIOAL que pode ser usado na análise de partículas com base na imagem, como aqui descrito. A contagem de categoria e/ou subcategoria de células em amostras de sangue é usada na presente descrição como exemplos não limitadores de classificações de amostras que podem ser analisadas. Em algumas modalidades, as células presentes nas amostras também podem incluir células bacterianas ou fúngicas, bem como as células brancas do sangue (leucócitos), as células vermelhas do sangue (eritrócitos) e/ou plaquetas. Em algumas modalida- des, as suspensões de partículas obtidas a partir de tecidos ou aspirados podem ser analisadas.
[00063] A discriminação de células do sangue em uma amostra de sangue é uma aplicação exemplificadora para a qual a matéria objeto da invenção é particularmente bem adequada. A amostra é preparada por técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de image- amento óptico de elevada resolução como uma corrente de amostra em formato de fita a ser imageada periodicamente enquanto a corrente de amostra passa através de um campo de visão. As imagens das partículas (como células do sangue) podem ser distinguidas umas das outras, categorizadas, subcategorizadas e/ou contadas, com o uso de técnicas de processamento programadas com dados de imagem de pixel, quer exclusivamente automaticamente ou com a ajuda humana limitada, para identificar e contar células ou partículas. Além das imagens das células, que podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de recursos incomuns ou críticos das partículas, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria particular da célula ou partícula distinguida nas imagens da amostra registradas. As contagens de partículas diferentes encontradas em cada imagem podem ser adicionalmente processadas, por exemplo, usadas para acumular razões proporcionadas precisas e estatisticamente significativas, ou funções das mesmas de células de cada uma das categorias e/ou subcategorias distinguidas na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual pode também ser altamente diluída, mas as proporções de células em cada categoria e/ou subcategoria estão representadas na distribuição para a amostra diluída, particularmente depois de inúmeras imagens terem sido processadas.
[00064] Em alguns aspectos, as amostras são apresentadas, ima- geadas e analisadas de uma forma automatizada. No caso das amos- tras de sangue, a amostra pode ser substancialmente diluída com água ou solução salina, o que reduz a extensão a que a visualização de algumas células pode ser ocultada por outras células em uma amostra não diluída ou menos diluída. As células podem ser tratadas com agentes que acentuam o contraste de alguns aspectos de células, por exemplo, usando agentes de permeabilização para tornar as membranas celulares permeáveis, e corantes histológicos para aderir e para revelar elementos, como grânulos e o núcleo. Em algumas modalidades pode ser desejável corar uma alíquota da amostra para a contagem e caracterização das partículas que incluem reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas, e para a diferenciação, caracterização e análise de leucócitos. Em outras modalidades, as amostras que contêm eritrócitos podem ser diluídas antes da sua introdução na célula de fluxo e imageamento.
[00065] As particularidades relativas aos equipamentos de preparação de amostras e métodos para a diluição, permeabilização e coloração histológica da amostra, geralmente são realizadas com o uso de válvulas e bombas de precisão operadas por um ou mais controladores programáveis, e não são centrais para a presente descrição. Exemplos podem ser encontrados nas patentes atribuídas a International Remote Imaging Systems, Inc, como US 7.319.907, sobre controles programáveis. De modo semelhante, as técnicas para distinguir entre certas categorias e/ou subcategorias de células por seus atributos, como o tamanho relativo e cor podem ser encontradas no documento US 5.436.978, em conexão com as células brancas do sangue (leucócitos). As divulgações destas patentes são aqui incorporadas por referência.
[00066] Para facilitar a capacidade, velocidade e eficácia pela qual as partículas, como células, são categorizadas e/ou subcategorizadas, é vantajoso fornecer imagens de alta qualidade transparentes das cé- lulas do sangue para análise automatizada pelo sistema de processamento de dados. De acordo com a presente descrição, uma corrente de amostra preparada é disposta em uma fita delgada tendo uma posição estável entre as paredes opostas de uma célula de fluxo. O posicionamento da corrente da amostra e o seu nivelamento em formato de fita delgada podem ser atingidos pelo fluxo entre as camadas de um PIOAL introduzido na célula de fluxo que difere na viscosidade do fluido de amostra e é fluído através de um canal de fluxo simétrico.
[00067] O PIOAL tem uma viscosidade e densidade adequadas, e as vazões no ponto de introdução na célula de fluxo da amostra são de tal modo que o fluido de amostra se nivela em uma fita delgada. A corrente de amostra em formato de fita é transportada juntamente com o PIOAL, para passar em frente de uma porta de visualização, onde uma lente objetiva e uma fonte de luz estão dispostas para permitir a visualização da corrente de amostra em formato de fita. A amostra de fluido é introduzida, por exemplo, injetada em um ponto em que a trajetória de fluxo do PIOAL se estreita simetricamente. Como resultado, a corrente de fluido da amostra é achatada e estendida em uma fita delgada. Um PIOAL desta descrição pode ser usado como o fluido de revestimento com qualquer analisador visual da presente descrição. Em uma modalidade, o PIOAL pode ser introduzido em uma extremidade da célula de fluxo para transportar consigo o fluido de amostra em direção à descarga.
[00068] A dimensão da corrente de amostra em formato de fita na zona de visualização é afetada por adelgaçamento geométrico da trajetória de fluxo de PIOAL e velocidade linear diferencial do fluido da amostra e o PIOAL resultando no adelgaçamento e estiramento da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear inicial diferencial da amostra para PIOAL pode variar de 0,5:1 para 5:1. A seção transversal da trajetória de fluxo de PIOAL pode ser adelgaçada atra- vés da redução da profundidade por um fator de cerca de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, ou 200:1. Em uma modalidade, o adelgaçamento geométrico é 40:1. Em uma modalidade, o adelgaçamento geométrico é 30:1. Os fatores levados em conta são o tempo de trânsito através da célula de fluxo, a taxa desejada de produtividade de amostras, a obtenção de uma espessura de corrente de amostra em formato de fita comparável ao tamanho da partícula, a obtenção de alinhamento de partículas e organelas, a obtenção do conteúdo de partículas de foco, o equilíbrio da pressão, fluxo e viscosidade dentro dos limites operacionais, a otimização da espessura da corrente da amostra em formato de fita, a obtenção de uma velocidade linear desejada, considerações de fabricabilidade e os volumes de amostra e PIOAL necessários.
[00069] O comprimento e volume da cânula e o achatamento da seção transversal podem ser selecionados para reduzir o período de instabilidade de fluxo da amostra, aumentando assim a produtividade. Em algumas modalidades, o período da instabilidade de fluxo pode ser menor que cerca de 3, 2,75, 2,5, 2,25, 2, 1,75, 1,5 1,25, ou menor que cerca de 1 segundo. Um volume menor de cânula pode também reduzir o tempo e o volume de diluente necessário para limpar a cânula entre corridas de amostras. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito através da célula de fluxo é de 1, 2, 3, ou 4 segundos, ou qualquer faixa entre quaisquer dois desses tempos. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito pode ser menor que 4, 3 ou 2 segundos.
[00070] As viscosidades e as vazões do fluido da amostra e do PI- OAL e o contorno da célula de fluxo estão dispostos de tal modo que o fluxo de PIOAL achata e estende o fluxo da amostra para uma fita pla na de forma consistente através da zona de visualização em um local seguro. A corrente de fluido da amostra pode ser compactada para aproximadamente 2 a 3 μm de espessura de fluxo de fluido. Vários tipos de células do sangue têm diâmetros maiores que a espessura fluxo. As forças de cisalhamento na direção paralela à direção do fluxo causam um aumento de uma projeção da imagem de partículas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imagea- mento óptico de alta resolução e/ou fazendo com que as estruturas intrapartícula, por exemplo, as estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos, sejam posicionados, reposicionados, e/ou melhor posicionados para ficarem substancialmente paralelos à direção do fluxo. A profundidade do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução de campo é de até 7 μm, por exemplo, 1 a 4 μm.
[00071] A seção transversal de fluxo de PIOAL, com a corrente de amostra em formato de fita transportada consigo, é constante através de uma zona de visualização na frente de uma porta de visualização através da qual a lente objetiva é dirigida. A lente da objetiva pode ser o componente objetivo de um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou dispositivo de captura de imagens digital. A corrente de amostra em formato de fita segue uma trajetória através da zona de visualização, em uma posição conhecida e repetível dentro da célula de fluxo, por exemplo, a uma distância conhecida e repetível a partir de duas paredes da célula de fluxo, sendo descarregado a jusante.
[00072] As informações ópticas a partir das partículas da amostra são detectadas por uma seção de detecção no analisador, quando a corrente de amostra em formato de fita é transportada através da zona de visualização na frente da porta de visualização, gerando, assim, dados das partículas/células contidas na amostra. O uso deste analisador permite a captura, processamento, categorização e subcategori- zação e contagem de células e/ou partículas contidas em amostras. O líquido de PIOAL pode ser preparado pela adição de agente modificador de viscosidade, agente tampão, agente de ajuste de pH, agente antimicrobiano, modificador de força iônica, tensoativo, e/ou um agente quelante. Os recursos e/ou componentes funcionais exemplificado- res do analisador na presente descrição podem incluir, por exemplo, a capacidade de capturar e/ou processar dados de análise de imagem, processamento de coloração da amostra, processamento de imagens, e/ou identificação de imagens de partícula, contagem, e/ou categoriza- ção e subcategorização.
[00073] Em uma modalidade, a presente descrição é baseada na descoberta surpreendente e inesperada de que a adição de uma quantidade adequada de um agente de viscosidade no PIOAL melhora significativamente o alinhamento das células/partículas em uma célula de fluxo, levando a uma maior porcentagem de células em foco, ou componentes celulares, e imagens de maior qualidade de células e/ou partículas no fluxo. A adição do agente de viscosidade aumenta as forças de cisalhamento sobre as células, como os RBCs, que melhora o ali-nhamento das células em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo, que resulta na optimização da imagem. Isto também resulta no posicionamento, reposicionamento, e/ou melhor posicionamento das estruturas intrapartícula, como as estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos substancialmente paralelos à direção do fluxo, que resulta na otimização da imagem. O agente de viscosidade também reduz o desalinhamento das células, geralmente, mas não se limitando a, células que são menores no diâmetro do que a corrente de fluxo.
[00074] O alinhamento das células que são menores em diâmetro do que a corrente de fluxo, por exemplo, os eritrócitos, pode ser obtido, por exemplo, aumentando-se a viscosidade de PIOAL, ou aumentando-se a razão da velocidade de fluxo. Isto resulta no alinhamento de RBCs paralelo à direção do fluxo. Em algumas modalidades, uma redução no desalinhamento de RBC e/ou aumento no alinhamento de RBC é conseguido pelo aumento da viscosidade de PIOAL.
[00075] A espessura da corrente da amostra em formato de fita pode ser afetada pelas viscosidades relativas e as vazões do fluido de amostra e de PIOAL. A fonte da amostra e/ou a fonte de PIOAL, por exemplo, compreendendo bombas de deslocamento de precisão, pode ser configurada para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em vazões controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita, isto é como uma fita delgada pelo menos tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagem digital.
[00076] A seção transversal de fluxo de PIOAL, com a corrente de amostra em formato de fita transportada consigo, é constante através de uma zona de visualização na frente de uma porta de visualização através da qual o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é direcionado. A corrente de amostra em formato de fita segue uma trajetória através da zona de visualização, em uma distância conhecida e repetível a partir de qualquer uma dentre as paredes da parte frontal e da parte traseira da célula de fluxo sendo descarregada a jusante dessa.
[00077] O termo dispositivo de imageamento óptico de alta resolução pode incluir dispositivos que são capazes de obter imagens de partículas com distinções visuais suficientes para diferenciar recursos e/ou alterações morfológicas. Dispositivos ópticos de alta resolução de imagem exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução óptica de 1 um ou menos, incluindo, por exemplo, 0,4 a 0,5 um, como, por exemplo, 0,46 um.
[00078] Em algumas modalidades, as imagens obtidas em qualquer uma das composições e/ou métodos da presente invenção podem ser imagens digitalizadas. Em algumas modalidades, as imagens são obtidas imagens de microscopia. Em certas modalidades, as imagens podem ser obtidas manualmente. Em outras modalidades, pelo menos uma parte do processo de obtenção das imagens é automatizada. Em algumas modalidades, as imagens podem ser obtidas usando um analisador visual que compreende uma célula de fluxo, um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagens digital, opcionalmente com um recurso de foco automático.
[00079] Em uma modalidade, as imagens fornecem informações sobre os componentes citossólicos, de núcleo celular e/ou nucleares da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas com o componente granular e/ou outros recursos morfológicos das células. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relativas aos componentes citossólicos, nucleares e/ou granulares das células. As imagens e/ou recursos granulares e/ou nucleares são determinantes para a categorização e subcategorização celular tanto de forma independente ou em combinação umas com as outras.
[00080] Em um aspecto dos métodos da presente invenção, as células colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e/ou imageadas são os eritrócitos nucleados. Em ainda um outro aspecto, os métodos da presente invenção referem-se a um método para a realização de categorização e subcategorização de eri- trócitos baseadas na imagem compreendendo: a) formar imagem de uma porção dos eritrócitos; e b) determinar a morfologia dos eritrócitos imageados. Para uso na presente invenção, eritrócitos (RBC) podem incluir, por exemplo, eritrócitos normais ou anormais, reticulócitos, eri- trócitos nucleados, e/ou em células infectadas com malária. Em algumas modalidades, a formação de imagens é realizada usando o equipamento da presente descrição, como um equipamento que compreende um contador de partículas, um analisador visual e um processa- dor.
[00081] Para uso na presente invenção, uma contagem completa de sangue (CBC) exemplificadora pode incluir um painel de teste tipicamente solicitado por um doutor ou outro profissional médico que fornece informações sobre as partículas e/ou células em uma amostra de sangue de um paciente. Exemplos de células que circulam na corrente sanguínea podem ser geralmente divididos em três tipos: incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, células brancas do sangue (por exemplo, leucócitos), células vermelhas do sangue (por exemplo, eri- trócitos), e plaquetas (trombócitos).
[00082] Para uso na presente invenção, contagens anormalmente elevadas ou baixas podem indicar a presença da doença, distúrbio e/ou condição. Dessa forma, a CBC é um dos exames de sangue co- mumente realizados na medicina, uma vez que pode fornecer uma visão geral do estado de saúde geral de um paciente. Consequentemente, a CBC é realizada rotineiramente durante os exames físicos anuais.
[00083] Para uso na presente invenção, tipicamente, um flebotomis- ta coleta a amostra de sangue do sujeito, o sangue é geralmente coletado em um tubo de ensaio contendo tipicamente um anticoagulante (por exemplo, EDTA, por vezes citrato) para impedir sua coagulação. A amostra é, então, transportada para um laboratório. Por vezes, a amostra é retirada por uma picada no dedo usando uma pipeta de Pasteur para processamento imediato por um contador automatizado. Em uma modalidade, a imagem da partícula é capturada enquanto a partícula é envolvida por em um fluido de revestimento ou PIOAL. Em certas modalidades, a amostra de sangue pode ser vista sobre uma lâmina preparada com uma amostra do sangue do paciente sob um microscópio (um filme de sangue, ou esfregaço periférico). Em certas modalidades, a contagem completa de sangue é executada por um analisador automatizado.
[00084] Para uso na presente invenção, em geral, os analisadores de sangue podem aspirar uma quantidade muito pequena de espécime através de um tubo estreito. Os sensores podem detectar a contagem e/ou o número de células que passam através do tubo, e podem identificar o tipo de célula. Sensores exemplificadores podem incluir detectores de luz (por exemplo, visível, UV ou IR) e/ou impedância elétrica. Parâmetros de detecção exemplificadores podem incluir tamanho, volume e/ou recursos celulares. Em certas modalidades, os sensores podem detectar a luz visível e não visível em um espectro de comprimento de onda que varia de cerca de 200 nm a cerca de 10000 nm. Em certas modalidades, os sensores podem detectar um comprimento de onda de entre cerca de 380 nm e 760 nm.
[00085] Para uso na presente invenção, os dados/parâmetros de uma contagem de sangue podem incluir, por exemplo, células vermelhas do sangue totais; hemoglobina - a quantidade de hemoglobina no sangue; hematócrito ou volume celular empacotado (PCV); volume corpuscular médio (MCV) - o volume médio das células vermelhas (anemia é classificada como microcítica ou macrocítica com base em se esse valor está acima ou abaixo da faixa normal esperada. Outras condições que podem afetar MCV incluem talassemia, reticulocitose e alcoolismo); hemoglobina corpuscular média (MCH) - a quantidade média de hemoglobina por eritrócitos, em picogramas; concentração média de hemoglobina corpuscular (MCHC) - a concentração média de hemoglobina nas células; largura da distribuição das células vermelhas do sangue (RDW) - a variação no volume celular da população de RBC; células brancas do sangue totais; granulócitos neutrófilos (pode indicar a infecção bacteriana, tipicamente aumentada em infecções virais agudas). Devido à aparência segmentada do núcleo, os neutrófi- los são muitas vezes chamados de "segs". O núcleo dos neutrófilos menos maduros não é segmentado, mas tem uma banda ou formato alongado. Neutrófilos menos maduros - aqueles que foram recentemente liberados a partir da medula óssea para a corrente sanguínea - são conhecidos como "bandas". Outros dados/parâmetros para uma contagem de sangue podem também incluir, por exemplo, linfócitos (por exemplo, aumentados com algumas infecções virais, como febre glandular, e na leucemia linfocítica crônica (LLC), ou diminuídos pela infecção por HIV); monócitos (podem ser aumentados na infecção bac- teriana, tuberculose, malária, febre maculosa das Montanhas Rochosas, leucemia monocítica, colite ulcerativa crônica e enterite regional; granulócitos eosinófilos (por exemplo, aumentados em infecções para- síticas, asma, ou de reação alérgica); granulócitos basófilos (por exemplo, aumentados em condições relacionadas com medula óssea, como leucemia ou linfoma.
[00086] Para uso na presente invenção, os dados/parâmetros de uma contagem de sangue também podem incluir, por exemplo, os dados associados com plaquetas, incluindo números de plaquetas, informações sobre o seu tamanho e a faixa de tamanhos no sangue; volume médio das plaquetas (MPV) - uma medição do tamanho médio das plaquetas.
[00087] Em um outro aspecto dos métodos da presente invenção, as células colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e/ou imageadas são células anormais, como as células infectadas com malária, linfócitos atípicos. Em alguns aspectos da presente invenção, as células são células anormais que podem ser usadas para identificar, prever, diagnosticar, prognosticar, ou sustentar um diagnóstico de uma condição, doença, infecção e/ou síndrome.
[00088] Em um outro aspecto dos métodos da presente invenção, as células serem plaquetas.
[00089] A menos que expressamente indicado de outro modo, as referências a "partícula" ou "partículas" feitas na presente descrição serão compreendidas para englobar qualquer objeto formado ou discreto disperso em um fluido. Para uso na presente invenção, "partícula" pode incluir todos os componentes detectáveis e mensuráveis (por exemplo, por imagem e/ou outros parâmetros mensuráveis) em fluidos biológicos. As partículas são de qualquer material, qualquer formato e de qualquer tamanho. Em certas modalidades, as partículas podem compreender células. Exemplos de partículas incluem, mas não se limitam a, células, incluindo células do sangue, células fetais, células epiteliais, células-tronco, células tumorais ou bactérias, parasitas, ou fragmentos de qualquer um dos anteriores ou outros fragmentos em um fluido biológico. As células sanguíneas podem ser qualquer célula sanguínea, incluindo quaisquer células normais ou anormais, maduras ou imaturas que potencialmente existem em um fluido biológico, por exemplo, células vermelhas do sangue (RBCs), células brancas do sangue (WBCs), plaquetas (PLTs) e outras células. Os membros também incluem células imaturas ou anormais. Os WBCs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos, pró-mielócitos e blastos. Além disso, para RBCs maduros, os membros de RBCs podem incluir RBCs nu- cleadas (NRBCs) e reticulócitos. As PLTs podem incluir PLTs "gigantes" e nódulos de PLT. As células do sangue e elementos formados estão descritos adicionalmente em outra seção na presente descrição.
[00090] Partículas exemplificadoras podem incluir elementos formados em amostras de fluidos biológicos, incluindo, por exemplo, partículas esféricas e não esféricas. Em certas modalidades, Em certas modalidades, as partículas podem compreender componentes não esféricos. A projeção da imagem de componentes não esféricos pode ser maximizada no plano focal do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução. Em certas modalidades, as partículas não esféricas são alinhadas no plano focal do dispositivo do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução (alinhadas em um plano substancialmente pa ralelo à direção do fluxo). Em algumas modalidades, as plaquetas, re- ticulócitos, RBCs nucleados, e WBCs, incluindo os neutrófilos, linfóci- tos, monócitos, eosinófilos, basófilos, e WBCs imaturas incluindo blas- tos, promielócitos, mielócitos, ou metamielócitos são contados e analisados como partículas.
[00091] Para uso na presente invenção, os parâmetros de partículas detectáveis e mensuráveis podem incluir, por exemplo, índices não baseados em imagem e/ou visuais de tamanho, formato, simetria, contorno e/ou outras características.
[00092] A amostra pode ser uma amostra biológica isolada e/ou preparada, incluindo, por exemplo, uma amostra de fluido corporal, uma amostra de sangue, soro, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal, saliva, fluido seminal, lágrimas, suor, leite, líquido amniótico, fluido de lavagem, aspirado de medula óssea, efusões, ex- sudatos, ou outra amostra obtida de um indivíduo (por exemplo, amostra de biopsia que foi tratada para produzir uma suspensão de células, ou uma amostra de linha de produção ou laboratório compreendendo partículas). Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, por exemplo, uma amostra de biopsia que foi tratada para produzir uma suspensão de células. A amostra pode também ser uma suspensão obtida a partir de tratamento de uma amostra fecal. Uma amostra pode também ser uma amostra de laboratório, química, industrial ou de linha de produção compreendendo partículas, como uma amostra de cultura de células. O termo amostra pode ser usado para se referir a uma amostra obtida de um paciente ou de laboratório ou de qualquer fração, porção ou alíquota da mesma. A amostra pode ser diluída, dividida em porções, ou tratada com um agente de contraste, em alguns processos.
[00093] Os métodos aqui divulgados são aplicáveis a amostras a partir de uma ampla gama de organismos, incluindo mamíferos, por exemplo, humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos), cavalos, vacas ou outros animais de pecuária, cães, gatos ou outros mamíferos mantidos como animais de estimação, ratos, camundongos ou outros animais de laboratório; pássaros, por exemplo, galinhas; répteis, por exemplo, jacaré; peixe, por exemplo, salmão e outras espécies de criação; e anfíbios.
[00094] As amostras podem ser obtidas por qualquer método convencional, por exemplo, excreção, extração, coleta, aspirado, ou uma biopsia. A amostra pode ser de um indivíduo considerado saudável, por exemplo, uma amostra coletada como parte de um exame físico de rotina. A amostra também pode ser de um indivíduo que tem, que está em risco de, ou que é suspeito de ter um distúrbio. O distúrbio pode ser o resultado de uma doença, uma anormalidade genética, uma infecção, uma lesão ou causas desconhecidas. Alternativamente ou em adição, os métodos podem ser úteis para monitorar um indivíduo durante o curso de tratamento para um distúrbio. Quando existem sinais de incapacidade de resposta ao tratamento e/ou terapia, um médico pode escolher um agente alternativo ou adjuvante. Dependendo da condição do indivíduo e do distúrbio particular, se for o caso, as amostras podem ser coletadas uma vez (ou duas vezes, três vezes, etc.), diariamente, semanalmente, mensalmente, ou anualmente.
[00095] As partículas podem variar em função da amostra. As partículas podem ser células biológicas, por exemplo, células do sangue, células fetais, células-tronco, células de tumor ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, as partículas podem ser um agente infeccioso, por exemplo, um vírus ou bactéria.
[00096] Referência a "células do sangue" feita nesta descrição será entendida como abrangendo todas as células normais ou anormais, maduras ou imaturas, que existem potencialmente em um fluido biológico, por exemplo, células vermelhas do sangue do sangue (RBC), cé- lulas brancas do sangue (WBCs), plaquetas (PLTs) e outras células. Em geral, as RBCs, PLTs, e WBCs normais têm um diâmetro de partícula na faixa de 6-8 μm, 2-3 μm, e 8-15 μm, respectivamente. As RBCs, WBCs e PLTs normais estão presentes em amostras de sangue total a partir de pacientes normais em uma faixa de concentração aproximada de 3,9 a 5,7 x 1012 células/L, 1,4 a 4,5 x 1012 células/L, 3,5 a 11 x 1012 células/L, respectivamente. Consulte, Barbara J. Bain, Blood Cells, A Practical Guide, 4a ed, Blackwell Publishing, 2007, 3436.
[00097] A referência a um "elemento formado" será entendida como abrangendo elementos não fluidos presentes em amostras de fluidos biológicos. Os elementos formados incluem, por exemplo, as classes de células do sangue baseadas na classificação científica ou função fisiológica incluindo eritrócitos (RBCs), leucócitos (WBCs) e plaquetas (PLTs), nódulos de WBC, subclasses de leucócitos, que incluem linfó- citos maduros e leucócitos imaturos como monócitos, neutrófilos, eosi- nófilos, basófilos. Os "elementos formados" para uso na presente invenção também incluem partículas, como micro-organismos, bactérias, fungos, parasitas, ou fragmentos dos mesmos ou outros fragmentos celulares. Os principais membros de WBCs incluem, mas não se limitam a, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Os membros também incluem células imaturas ou anormais. Por exemplo, os WBCs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos, pró- mielócitos. Além disso, para RBCs maduros, os membros de RBCs podem incluir RBCs nucleadas (NRBCs) e reticulócitos. As PLTs podem incluir PLTs regulares, e PLTS "gigante" cujo tamanho é próximo ao dos WBCs normais. A referência a um "membro" ou "membros" de uma categoria e/ou subcategoria de partículas feitas na presente descrição será entendida como abrangendo partículas individuais dentro de uma categoria ou subcategoria de partículas.
[00098] A menos que expressamente indicado de outro modo, a referência a uma "categoria" de partículas feitas na presente descrição será entendida como abrangendo um grupo de partículas detectadas usando pelo menos um critério de detecção de medido, detectado ou derivado, como tamanho, formato, textura, ou cor. Em algumas modalidades, os membros de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas contadas pelo equipamento da presente descrição serão o mesmo tipo de elemento formado.
[00099] Tais partículas podem ser detectadas em um "canal". A referência a "canal" feita na presente descrição deverá ser entendida como abrangendo uma porção do contador de partículas que compreende um detector acoplado a uma fonte de sinal, fornecendo uma saída que varia com a maior ou menor detecção de partículas que atende a pelo menos um critério de detecção de canal. Por exemplo, um critério de detecção de canal pode ser baseado no tamanho ou do volume das partículas. Em algumas modalidades, o número de canais em um contador de partículas é um. Em algumas outras modalidades, o número dos canais em um contador de partículas é dois ou mais.
[000100] Uma categoria e/ou subcategoria de partículas detectada em canal de contador de partículas pode compreender diferentes classes e subclasses de partículas, e os membros de partículas agrupados em duas ou mais subclasses. A referência a uma "categoria" de partículas feitas na presente descrição será entendida como abrangendo um agrupamento de partículas que corresponde aos critérios medidos, detectados ou derivados, como tamanho, formato, textura, ou cor. Em algumas modalidades, os membros de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas contadas pelo equipamento da presente descrição serão o mesmo tipo de elemento formado.
[000101] Para uso na presente invenção, o termo dispositivo de ima- geamento óptico de alta resolução pode incluir dispositivos que são capazes de obter imagens de partículas com distinções visuais suficientes para diferenciar recursos e/ou alterações morfológicas. Dispositivos ópticos de alta resolução de imagem exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução óptica de 1 um ou menos, incluindo, por exemplo, 0,4 a 0,5 um, como, por exemplo, 0,46 um.
[000102] Para uso na presente invenção, as composições de agente de contraste de partículas podem ser adaptadas para uso em combinação com um líquido alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) em um analisador visual para analisar partículas em uma amostra de um indivíduo. O PIOAL exemplificador é útil, como um exemplo, em métodos para o reconhecimento automatizado de dife-rentes tipos de partículas em uma amostra de um indivíduo.
[000103] Em um outro aspecto, as células podem ser envolvidas em PIOAL quando as imagens são obtidas. Os líquidos de alinhamento de organelas intracelulares exemplificadores adequados são aqui descritos.
[000104] Para uso na presente invenção, "alinhamento" pode ser caracterizado em parte pelo alinhamento de partículas esféricas e/ou não esféricas. Por exemplo, as partículas, como as partículas não esféricas, podem ser alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo. Em certas modalidades, o alinhamento das partículas não esféricas é caracterizado pela orientação do aumento das partículas em uma projeção de imagem das partículas não esféricas em condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução. As partículas como as partículas esféricas podem ter um aumento na quantidade dos conteúdos intrapartículas em foco das partículas e células, que é eficaz para gerar distinções visuais para a categorização e subcategorização das partículas. As estruturas intrapartículas das partículas, como as partículas esféricas, podem ser posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas para ficarem substancialmente paralelas à direção do fluxo. Por exemplo, as estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos também pode ser posicionadas, reposicionadas, e/ou melhor posicionadas para serem substancialmente paralelas à direção do fluxo.
[000105] A referência a uma "classe" de partículas feitas na presente descrição será entendida como abrangendo um grupo de partículas com base na classificação científica. Por exemplo, Por exemplo, três classes principais de células do sangue existem em uma amostra de sangue total, incluindo RBCs, WBCs e PLTs.
[000106] A referência a um "membro" ou "membros" de partículas feita nesta descrição será entendida como abrangendo partículas em uma categoria ou subcategoria de partículas. Por exemplo, cada categoria de células do sangue pode ser ainda dividida em subcategorias ou membros. Os principais membros de WBCs incluem, mas não se limitam a, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Os membros também incluem células imaturas ou anormais. Por exemplo, os WBCs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos e pró- mielócitos. Além disso, para RBCs maduros, os membros de RBCs podem incluir RBCs nucleadas (NRBCs) e reticulócitos. As PLTs podem incluir PLTs regulares, e PLTs "gigantes" cujo tamanho é próximo ao dos WBCs normais.
[000107] Referência a "células imaturas" será entendida como abrangendo as células em um certo estágio de desenvolvimento, por exemplo, no interior da medula óssea ou logo após a liberação a partir da medula óssea, mas antes do desenvolvimento completo em uma célula madura.
[000108] Referência a "células anormais" será entendida como abrangendo as células com características morfológicas irregulares ou células associadas com uma determinada doença ou condição, ou irregularidades associadas que podem, em alguns casos, ser associa- das com certas doenças ou condições. Exemplos de certas doenças incluem, mas não se limitam a, eritrocitose, policitemia, anemia, eri- troblastopenia, leucocitose, leucopenia, linfocitose, linfocitopenia, gra- nulocitose, granulocitopenia ou agranulocitose, neutrofilia, neutropenia, eosinofilia, eosinopenia, basofilia, basopenia, trombocitose, tromboci- topenia e pancitopenia. Uma classe de células pode aumentar ou diminuir na corrente sanguínea. Em algumas condições, as células anormais muito maiores do que as células brancas regulares existem uma pequena concentração em uma amostra de sangue. As variações no tamanho, formato, cor e/ou estruturas intracelulares podem ser associadas com determinadas doenças ou condições.
[000109] Referência à "contagem" de partículas ou "contagem de partícula" feita na presente descrição será entendida como abrangendo os números de partículas obtidas a partir de um canal de um contador de partículas. Referência à "concentração" de uma classe ou um membro de partículas feita na presente descrição será entendida como significando os números de partículas por unidade de volume (por exemplo, por litro) ou por uma amostra de volume conhecido. Por exemplo, um contador de partículas pode fornecer contagens ou concentrações ou outra função com base na contagem para as categorias de partículas, enquanto um analisador visual pode fornecer contagens, concentrações, razões ou outros parâmetros baseados na concentração para cada categoria ou subcategoria de partículas.
[000110] Referência a "razão" feita na presente descrição será entendida como abrangendo qualquer razão quantitativa e/ou proporcionada de duas categorias/subcategorias, classes ou membros de partículas. Exemplos de uma tal razão incluem, mas não se limitam a, uma razão por concentração, peso, e/ou por números de partículas. Tipicamente a razão diz respeito à fração numérica da contagem de uma categoria, classe ou membro em relação à contagem de outra tal cate- goria, classe ou membro. Em algumas modalidades, determinações usando contagens ponderadas ou pesadas e/ou razões proporcionais também podem ser feitas. Hematologia - Sistema de análise de partículas
[000111] Voltando agora aos desenhos, a Figura 1 mostra esquematicamente uma célula de fluxo exemplificadora 22 para transportar uma amostra de fluido através de uma zona de visualização 23 de um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 em uma configuração para formar imagens de partículas microscópicas em uma corrente de fluxo de amostra 32 com o uso de processamento de imagens digital. A célula de fluxo 22 é acoplada a uma fonte 25 do fluido da amostra que pode ter sido submetida a processamento, como colocada em contato com uma composição de agente de contraste de partículas e aquecimento. A célula de fluxo 22 é também acoplada a uma ou mais fontes 27 de um líquido alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL), como uma solução de glicerol transparente com uma viscosidade que é maior que a viscosidade do fluido de amostra.
[000112] O fluido de amostra é injetado através de uma abertura achatada em uma extremidade distal 28 de um tubo de alimentação de amostra 29, e no interior da célula de fluxo 22, em um ponto em que o fluxo de PIOAL foi substancialmente estabelecido resultando em um fluxo laminar simétrico e estável do PIOAL acima e abaixo da (ou em lados opostos da) corrente de amostra em formato de fita. As correntes de amostra e PIOAL podem ser fornecidas por meio de bombas de medição de precisão que movem o PIOAL com a amostra de fluido injetada ao longo de uma trajetória de fluxo que substancialmente se estreita. O PIOAL envolve e compacta a amostra de fluido na zona 21, onde a trajetória de fluxo se estreita. Consequentemente, a diminuição na espessura da trajetória de fluxo da zona 21 pode contribuir para um foco geométrico da corrente de amostra 32. A fita de fluido de amostra 32 é envolvida e transportada juntamente com o PIOAL a jusante da zona de estreitamento 21, passando em frente de, ou de outro modo, através da zona de visualização 23 do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 onde as imagens são coletadas, por exemplo, usando um CCD 48. O processador 18 pode receber, como entrada, os dados de pixel do CCD 48. A fita de fluido de amostra flui juntamente com o PIOAL a uma descarga 33.
[000113] Conforme mostrado aqui, a zona de estreitamento 21 pode ter uma porção de trajetória de fluxo proximal 21a tendo uma espessura proximal PT e uma porção de trajetória de fluxo distal 21b tendo uma espessura distal DT, de tal modo que a espessura distal DT é menor que a espessura proximal PT. O fluido da amostra pode, portanto, ser injetado através da extremidade distal 28 do tubo de amostra 29 em um local que é distal da porção proximal 21a e proximal à porção distal 21b. Assim, a amostra de fluido pode introduzir o envelope de PIOAL na medida em que a corrente de PIOAL é compactada pela zona 21, sendo que o tubo de injeção de fluido de amostra tem uma porta de saída distal através da qual o fluido da amostra é injetado no fluido de revestimento que flui, a porta de saída distal sendo delimitada pela diminuição do tamanho da trajetória de fluxo da célula de fluxo.
[000114] O dispositivo digital de imageamento óptico de alta resolução 24 com lente objetiva 46 é direcionado ao longo de um eixo óptico que intercepta a corrente de amostra em formato de fita 32. A distância relativa entre a objetiva 46 e a célula de fluxo 33 é variável por operação de uma unidade de motor 54, para resolver e coletar uma imagem digitalizada focalizada em uma matriz de fotodetector.
Célula de fluxo
[000115] Uma modalidade prática da célula de fluxo 22 está ainda representada nas Figuras 2 e 3. Conforme mostrado aqui, a célula de fluxo 22 pode ser acoplada com uma fonte de amostra 25 e também a uma fonte 27 de material de PIOAL. A amostra de fluido é injetada na célula de fluxo 22 através da cânula 29, por exemplo, através de uma porta de saída distal 31 da cânula 29. Tipicamente, o fluido de revestimento de PIOAL não está em um estado de fluxo laminar já que ele se desloca através de uma seção de canal curvo 41 na célula de fluxo a partir da fonte 27 em direção à zona de visualização 23. Entretanto, a célula de fluxo 22 pode ser configurada de modo que o fluido de revestimento de PIOAL é ou torna-se laminar, ou apresenta um perfil de velocidade plana, uma vez que passa pela porta de saída distal 31, onde o fluido de amostra é introduzido no fluido de revestimento que flui. A amostra de fluido e o PIOAL podem fluir ao longo da célula de fluxo 22, em uma direção geralmente indicada pela seta A e, em seguida, para fora da célula de fluxo 22 através da descarga 33. A célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo interno 20 que se estreita de forma simétrica (por exemplo, a zona de transição 21) na direção do fluxo A. A simetria da trajetória de fluxo contribui para um fluxo robusto e centralizado da corrente de amostra. A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra envolvida com o PIOAL através de uma zona de visualização 23 na célula de fluxo, isto é, atrás da porta de visualização 57. Associado com a porta de visualização 57 está um padrão de foco automático 44. A célula de fluxo 22 também tem um assento arredondado ou rebaixado 58, que está configurado para aceitar ou receber uma objetiva de microscópio (não mostrado).
[000116] De acordo com algumas modalidades, o padrão de foco automático 44 pode ter uma posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22, e que está localizada a uma distância de deslocamento do plano da corrente de amostra em formato de fita 32. Na modalidade ilustrada aqui, o foco automático padrão (alvo 44) é aplicado direta- mente à célula de fluxo 22, em um local que é visível em uma imagem coletada através da porta de visualização 57 por um dispositivo de imageamento óptico de alta resolução (não mostrado). A célula de fluxo 22 pode ser construída de uma primeira camada ou seção superior 22a e uma segunda camada ou seção inferior 22b. Um painel de janela transparente ou de vidro 60 está fixo ou integral com a primeira seção 22a. O painel 60 pode definir pelo menos uma porção da trajetória de fluxo da amostra no interior da célula de fluxo. A luz da fonte de luz 42 pode viajar através de uma abertura ou passagem do padrão de foco automático 44 de modo a iluminar as partículas da amostra fluindo no interior da corrente de fluxo 32.
[000117] Em alguns casos, a espessura do painel 60 pode ter um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 150 μm a cerca de 170 μm. Como observado acima, o painel 60 pode definir ou formar parte da trajetória de fluxo ou canal de revestimento (por exemplo, PIAOL). Ao usar um painel delgado 60, é possível colocar a objetiva do microscópio muito perto da fita de fluido da amostra e, consequentemente, obter imagens altamente ampliadas de partículas que fluem ao longo da trajetória de fluxo.
[000118] A Figura 3A representa os aspectos de uma modalidade da célula de fluxo, onde a distância entre o eixo de imagem 355 e a porção da zona de transição distal 316 é de cerca de 8,24 mm. A distância entre a porção distal da zona de transição 316 e a abertura de saída da cânula 331 é de cerca de 12,54 mm. A distância entre a porta de saída da cânula 331 e a entrada de fluido de revestimento 301 é cerca de 12,7 mm. A distância entre a porta de saída da cânula 331 e uma porção da zona de transição proximal 318 é cerca de 0,73 mm. A Figura 3B representa os aspectos de uma modalidade da célula de fluxo, onde a porta de saída da cânula foi transferida para um local mais distal em relação a zona de transição, em comparação com a modali- dade da Figura 3A. Conforme mostrado aqui, a extremidade distal da cânula é avançada para a zona de transição de estreitamento da célula de fluxo, e uma distância entre o eixo de imagem 355 e a porção da zona de transição distal 316 está dentro de uma faixa a partir de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em alguns casos, a distância entre o eixo de imagem 355 e a porção da zona de transição distal 316 é de cerca de 21 mm.
[000119] Com referência novamente à Figura 1, o contorno interno da célula de fluxo (por exemplo, na zona de transição 21) e as vazões de PIOAL e da amostra podem ser ajustadas de tal modo que a amostra é formada em uma corrente em formato de fita 32. A corrente pode ser aproximadamente tão delgada quanto ou mesmo mais delgada que as partículas que estão envolvidas na corrente de amostra em formato de fita. As células brancas do sangue podem ter um diâmetro de cerca de 10 μm, por exemplo. Ao fornecer uma corrente de amostra em formato de fita, com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em formato de fita é estendida pelo fluido de revestimento, ou PIOAL. Surpreendentemente, o estiramento da corrente de amostra em formato de fita ao longo de uma trajetória de fluxo de estreitamento no interior das camadas de PIOAL de viscosidade diferente da corrente de amostra em formato de fita, como uma viscosidade mais elevada, vantajosamente tende a alinhar as partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo e aplicar forças sobre as células, melhorando os conteúdos em foco das estruturas intracelulares das células. O eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 é substancialmente normal (perpendicular) ao plano da corrente da amostra em formato de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita no ponto de imagem pode ser, por exemplo, de 20-200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a veloci- dade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser, por exemplo, de 50-150 mm/segundo.
[000120] A espessura da corrente da amostra em formato de fita pode ser afetada pelas viscosidades relativas e as vazões do fluido de amostra e de PIOAL. A fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do PIOAL, por exemplo, compreendendo bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em vazões controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita 32, isto é, como uma fita delgada, pelo menos, tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24.
[000121] Em uma modalidade, a fonte 27 do PIOAL é configurada para fornecer o PIOAL a uma viscosidade predeterminada. A viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra, e pode ser maior que a viscosidade da amostra. A viscosidade e a densidade do PIOAL, a viscosidade do material de amostra, a vazão do PIOAL e a vazão do material de amostra são coordenadas para manter a corrente de amostra em formato de fita a uma distância de deslocamento a partir do padrão de foco automático, e com características dimensionais predeterminadas, como uma espessura da corrente de amostra em formato de fita vantajosa.
[000122] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear maior que a amostra e uma viscosidade maior que a da amostra, estendendo, assim, a amostra na fita plana. A viscosidade de PIOAL pode ser de até 10 centipoises.
[000123] Com referência também às Figuras 2 e 3, a trajetória de fluxo interno da célula de fluxo se estreita a jusante do ponto de injeção da corrente de amostra em formato de fita para o PIOAL, para produzir um fluxo de espessura da amostra em formato de fita, por exemplo, até 7 μm, e/ou a trajetória de fluxo interno produz uma largu- ra de corrente de amostra em formato de fita de 500 - 3.000 μm. Em modalidades exemplificadoras, conforme representado na Figura 1, a trajetória de fluxo interno da célula de fluxo começa uma zona de transição de estreitamento a montante do ponto de injeção do fluxo de amostra para o PIOAL.
[000124] Em uma outra modalidade a trajetória de fluxo interno se estreita para produzir uma espessura de corrente de amostra em formato de fita de 2 - 4 μm de espessura, e/ou a trajetória de fluxo interno resulta na corrente de amostra em formato de fita de 2000 mm de largura. Estas dimensões são particularmente úteis para a hematologia. A espessura da corrente, neste caso, é menor que o diâmetro de algumas partículas, como as células vermelhas do sangue no seu estado relaxado. Consequentemente, essas partículas podem se tornar reorientadas para voltar a sua dimensão mais ampla ao eixo de ima- geamento, que é útil na revelação de características distintivas.
[000125] A velocidade linear da corrente da amostra em formato de fita pode ser suficientemente limitada para evitar o embaçamento de movimento da imagem digitalizada no tempo de exposição de imagem da matriz de fotodetector. A fonte de luz pode, opcionalmente, ser uma luz estroboscópica que é piscada para aplicar alta amplitude incidente por um breve tempo. Na medida em que o padrão de foco automático 44 e a imagem estão no mesmo campo de visão, a fonte de luz é con-figurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático simultaneamente. Entretanto, em outras modalidades, o campo de visão para o imageamento e para o foco automático pode ser diferente, por exemplo, iluminado e/ou imageado separadamente.
[000126] Os desenvolvimentos em questão têm aspectos de método, bem como de equipamentos. Um método de focalização de um analisador visual compreende a focalização de um dispositivo de imagea- mento óptico de alta resolução 24, que pode ser um dispositivo digital de imageamento óptico de alta resolução ou o dispositivo de captura de imagens digital, em um padrão de foco automático 44 fixo em relação a uma célula de fluxo 22, sendo que o padrão de foco automático 44 está localizado a uma distância de deslocamento 52 a partir de uma corrente de amostra em formato de fita 32. O dispositivo digital de imageamento óptico de alta resolução 24 tem uma objetiva com um eixo óptico, que intersecta a corrente de amostra em formato de fita 32. Uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo 22 é variada pela operação de uma unidade de motor 54, enquanto que a distância ao longo do eixo óptico entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e o ponto de focagem ótimo é conhecida. O dispositivo digital de imageamento óptico de alta resolução é configurado para resolver e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fo- todetector. A unidade de motor é operada para focalização do padrão de foco automático em um processo de foco automático. A unidade de motor é, em seguida, operada através da distância de deslocamento, focalizando, assim, o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução na corrente de amostra em formato de fita.
[000127] O método pode ainda incluir adicionalmente a formação da corrente de amostra em formato de fita para um formato de fita. O formato de fita é apresentado de modo a que o eixo óptico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é substancialmente perpendicular à corrente de amostra em formato de fita, isto é normal ao plano da corrente em formato de fita.
[000128] A Figura 4 representa aspectos de um sistema 400 para imageamento de partículas em uma amostra de fluido de sangue. Conforme mostrado aqui, o sistema 400 inclui um sistema de injeção de amostra de fluido 410, uma célula de fluxo 420, e dispositivo de captura de imagens 430 e um processador 440. A célula de fluxo 420 forne- ce uma trajetória de fluxo 422 que transmite um fluxo do fluido de revestimento, opcionalmente em combinação com o fluido da amostra. De acordo com algumas modalidades, o sistema de injeção de fluido de amostra 410 pode incluir ou ser acoplado com uma cânula ou tubo 412. O sistema de injeção de fluido de amostra 410 pode estar em comunicação fluida com a trajetória de fluxo 422, e pode operar para injetar amostra de fluido 424 através de uma porta de saída distal 413 da cânula 412 e para um fluido de revestimento de fluxo 426 no interior da célula de fluxo 420 de modo a fornecer uma corrente de fluido de amostra 428. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 410 injete fluido de amostra 424 para o fluido de revestimento que flui 426. Conforme mostrado aqui, o fluido de revestimento 426 pode ser introduzido na célula de fluxo 420 por um sistema de injeção de fluido de revestimento 450. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 450 injete fluido de revestimento 426 para a célula de fluxo 420.
[000129] A corrente de fluido de amostra 428 tem uma primeira espessura T1 adjacente ao tubo de injeção 412. A trajetória de fluxo 422 da célula de fluxo tem uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo de tal modo que a espessura da corrente de fluido de amostra 428 diminui a partir da primeira espessura T1 para uma segunda espessura T2 adjacente a um local de captura de imagem 432. O dispositivo de captura de imagem 430 está alinhado com o local de captura de imagem 432 de modo a formar a imagem de uma primeira pluralidade de partículas a partir da primeira amostra de fluido no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420.
[000130] O processador 440 está acoplado com o sistema injetor de amostra de fluido 410, o dispositivo de captura de imagem 430 e, opcionalmente, o sistema de injeção de fluido de revestimento 450. O processador 440 é configurado para interromper a injeção do primeiro fluido de amostra para o fluido de revestimento que flui 426 e começar a injeção do segundo fluido de amostra para o fluido de revestimento que flui 426 de tal modo que os transientes de fluido de amostra são iniciados. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 410 injete o segundo fluido de amostra para o fluido de revestimento que flui 426 de modo que os transientes de fluido de amostra são iniciados.
[000131] Adicionalmente, o processador 440 é configurado para iniciar a captura de uma imagem de uma segunda pluralidade de partículas a partir do segundo fluido de amostra no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420 depois dos transientes do fluido de amostra e dentro de 4 segundos do imageamento da primeira pluralidade as partículas. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o dispositivo de captura de imagem 430 inicie a captura de uma imagem de uma segunda pluralidade de partículas a partir do segundo fluido de amostra no local de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420 depois dos transientes de fluido de amostra e dentro de quatro segundos do imageamento da primeira pluralidade de partículas.
[000132] Conforme mostrado na modalidade da célula de fluxo representada na Figura 4A, uma diminuição no tamanho da trajetória de fluxo (por exemplo, na zona de transição 419a) pode ser definida pelas paredes opostas 421a, 423a da trajetória de fluxo 422a. As paredes opostas 421a, 423a podem se inclinar radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo 422a, geralmente simétrica sobre um plano transversal 451a que bissecciona a corrente de fluido da amostra 428a. O plano 451a pode bisseccionar a corrente de amostra 428a, onde a corrente de amostra tem uma primeira espessura T1, em um local onde o fluxo de amostra 428a sai de uma porção distal 427 da cânula ou tubo de injeção de amostra 412a. De modo similar, o plano 451a pode bisseccionar a 428a a corrente de amostra em que a cor-rente de amostra tem uma segunda espessura T2, em um local em que a corrente de amostra 428a passa o local de captura de imagem 432a. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor de cerca de 150 μm e a segunda espessura T2 tem um valor de cerca de 2 μm. Em tais casos, a taxa de compressão da corrente em fita da amostra é de 75:1. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm e a segunda espessura T2 tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. À medida que o fluido da corrente de amostra flui através da célula de fluxo, a fita se afina na medida em que acelera e é estendida. Dois recursos da célula de fluxo podem contribuir para o adelgaçamento da fita do fluido de amostra. Primeiro, uma diferença de velocidade entre o envelope de fluido de revestimento e a fita de fluido amostra pode funcionar para reduzir a espessura da fita. Em segundo lugar, a geometria cônica da zona de transição pode funcionar para reduzir a espessura da fita.
[000133] Tipicamente, a primeira espessura T1 é muito maior que o tamanho das partículas da amostra e, portanto, as partículas são contidas inteiramente dentro da corrente de fita de amostra. Entretanto, a segunda espessura T2 pode ser menor que o tamanho de certas partículas da amostra, e, portanto, essas partículas podem estender-se para fora do fluido de amostra e para o fluido de revestimento circundante. Conforme mostrado na Figura 4A, a corrente da fita de amostra pode fluir geralmente ao longo do mesmo plano à medida que sai da cânula e viaja em direção ao local de captura de imagem.
[000134] A célula de fluxo pode também fornecer uma distância de separação 430a entre a porção de cânula distal 427 e o local de captura de imagem 432a. De acordo com algumas modalidades, a porção distal 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode ser posicionada a uma distância de separação axial 430a a partir do local de captura de imagem 432a, em que a distância de separação axial 432a tem um valor de cerca de 21 mm. Em alguns casos, a distância de separação axial 430a tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm.
[000135] A distância de separação axial 430a entre o local de captura de imagem e a porta de saída da cânula pode impactar o tempo de transição para a amostra de fluido na medida em que o fluido viaja da porta de saída para o local de captura de imagem. Por exemplo, uma distância de separação axial relativamente mais curta 430a pode contribuir para um tempo de transição mais curto, e uma distância de se-paração axial relativamente mais longa 430a pode contribuir para um tempo de transição mais longo.
[000136] A posição da porta de saída na porção distal da cânula 427a em relação à zona de transição da trajetória de fluxo 419a, ou em relação à porção proximal 415a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a, também pode ter inferência no tempo de transição para o fluido de amostra, na medida em que o fluido viaja da porta de saída para o local de captura de imagem. Por exemplo, o fluido de revestimento pode ter uma velocidade relativamente mais lenta na porção proximal 415a, e uma velocidade relativamente rápida em um local entre a porção proximal 415a e a porção distal 416a. Consequentemente, se a porta de saída da cânula na porção distal 427a está posicionada na porção proximal 415a, vai demorar um longo período de tempo para o fluido da amostra alcançar o local de captura de imagem, não apenas porque a distância de viagem é mais longa, mas também porque a velocidade inicial do fluido de amostra após o mesmo sair da porta distal da cânula é mais lenta (devido à velocidade do fluido de revestimento mais lenta). Dito de outra forma, quanto mais tempo o fluido de amostra está presente na porção mais espessa (por exemplo, perto da porção proximal 415a) da célula de fluxo, mais tempo leva a amostra para alcançar o local de captura de imagem. Por outro lado, se a porta de saída da cânula na porção distal 427a é posicionada em posição distal à porção proximal 415a (por exemplo, em um local central entre a porção proximal 415a e porção distal 416a, conforme representado na Figura 4A), vai demorar um período de tempo menor para o fluido da amostra alcançar o local de captura de imagem, não apenas porque a distância de percurso é mais curta, mas também porque a velocidade inicial do fluido de amostra após o mesmo sair da porta distal da cânula é mais rápida (devido à velocidade mais rápida do fluido de revestimento). Como discutido aqui em outra seção, o fluido de revestimento é acelerado à medida que ele flui através da zona de transição 419a, devido ao estreitamento da área de seção transversal da zona 419a.
[000137] De acordo com algumas modalidades, com um tempo de transição mais curto, mais tempo é disponível para a coleta de imagem no local de captura de imagem. Por exemplo, na medida em que a duração do tempo de transição da ponta distal da cânula para a área de imagem diminui, é possível processar mais amostras em um determinado período de tempo e, relativamente, é possível obter mais imagens em um determinado período de tempo (por exemplo, imagens por minuto).
[000138] Embora existam vantagens associadas com o posicionamento da porção distal da porta de saída da cânula 427 mais perto do local de captura de imagem 432a, é também desejável manter uma certa distância entre a porta e o local de captura. Por exemplo, conforme representado na Figura 3, uma objetiva óptica ou lente frontal de um dispositivo de imageamento pode ser posicionada no assento 58 da célula de fluxo 22. Se a porta de saída 31 da cânula estiver muito perto do assento 58, então, o fluido de amostra pode não ser estabilizado o suficiente depois de ser injetado no fluido de revestimento, de modo a fornecer propriedades de imageamento desejadas no local de captura de imagem. De modo similar, pode ser desejável manter a região de transição afunilada 21, a uma distância a partir da zona de visualização 23, de modo que a região afunilada não interfira com o po-sicionamento do assento 58, que recebe a objetiva do dispositivo de captura de imagem.
[000139] Com continuada referência à Figura 4A, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode ser posicionada em posição distal a uma porção proximal 415a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a. De modo semelhante, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode ser posicionada proximal a uma porção distal 416a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a. Consequentemente, de acordo com algumas modalidades, o fluido amostra de pode ser injetado a partir da cânula de injeção 412a e para dentro da célula de fluxo em um local no interior da zona de transição 419a.
[000140] De acordo com algumas modalidades, a simetria na dimi- nuição do tamanho da trajetória de fluxo (por exemplo, na zona de transição da trajetória de fluxo 419a) opera de modo a limitar o desali- nhamento de partículas na amostra de fluido de sangue. Por exemplo, tal simetria pode ser eficaz para limitar o desalinhamento da orientação do imageamento das células vermelhas do sangue na amostra de fluido de sangue para menos que cerca de 20%.
[000141] De acordo com algumas modalidades, os métodos aqui divulgados são operáveis para a taxa de sinalização durante a análise da contagem de sangue para abaixo de 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5% das amostras.
[000142] De acordo com algumas modalidades, o local de captura de imagem 432a tem um campo de visão 433a de entre cerca de 150 μm x 150 μm e 400 μm x 400 μm. Em alguns casos, o local de captura de imagem 432a tem um campo de visão 433a de cerca de 275 μm x 275 μm. Em alguns casos, o campo de visão pode ser definido em termos de comprimento vezes largura. Se expresso como área superficial, um campo de visão de 275 μm x 275 μm tem uma área de 75.625 μm2. De acordo com algumas modalidades, o campo de visão pode ser determinado pela objetiva do dispositivo de imageamento e a sua ampliação. Em alguns casos, o campo de visão pode corresponder à extensão do campo (área) que é imageada pelos elementos ópticos de coleta (por exemplo, objetiva, lente de tubo, e câmara). Em alguns casos, o campo de visão é muito menor que a porta de visualização da área transparente no local de captura de imagem.
[000143] As Figuras 4A-1 e 4A-2 ilustram os efeitos de hidrofocali- zação na corrente da amostra medida que a mesma se desloca a partir da porta de saída da cânula para o local de captura de imagem. Conforme mostrado na Figura 4A-1, a corrente de amostra pode ter uma altura H(S) de cerca de 150 μm e uma largura W(S) de cerca de 1350 μm. Além disso, o fluxo de revestimento de PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca de 6000 μm e uma largura W(P) de cerca de 4000 μm. Após a hidrofocalização, conforme mostrado na Figura 4A-2, a corrente de amostra pode ter uma altura H(S) de cerca 2 μm e uma largura W(S) de cerca 1350 μm. Adicionalmente, a corrente de revestimento de PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca 150 μm e uma largura W(P) de cerca 4000 μm. Em uma modalidade, a área da seção transversal da corrente de revestimento de PIOAL na saída da cânula é de 40 vezes maior que a área da seção transversal perto do local de captura de imagem.
[000144] De acordo com algumas modalidades, pode ser útil determinar a seção transversal do canal da célula de fluxo no local de captura de imagem. Isto pode corresponder à altura da corrente de revestimento de H(P) de cerca 150 μm e uma largura W(P) de cerca 4000 μm conforme representado na Figura 4A-2. Também pode ser útil determinar a vazão volumétrica do fluido de revestimento e amostra combinados que fluem através da célula de fluxo no local de captura de imagem. Quando a área da seção transversal e a vazão são conhecidas, é possível determinar a velocidade do fluido de amostra e o revestimento combinado no local de captura de imagem.
[000145] De acordo com algumas modalidades, o fluxo da amostra e os fluidos de revestimento através da célula de fluxo podem ser aproximados por um modelo de perfil de placas paralelas. De modo semelhante, a vazão no centro da corrente de fluido de amostra (por exemplo, conforme representado na Figura 4A-2), pode ser cerca de 1,5 vezes a vazão média da corrente de fluido de revestimento e amostra combinadas.
[000146] De acordo com algumas modalidades, a área da seção transversal do fluxo da amostra na saída cânula (por exemplo, W(S) x H(S) na Figura 4A-1) é 40 vezes maior que a área da seção transver- sal do fluxo da amostra no local da imagem (por exemplo, W(S) x H(S) na Figura 4A-2). A vazão volumétrica do fluido de revestimento na área de imageamento pode ser de cerca de 45 μL/segundo. A vazão volumétrica do fluido da amostra na área de imageamento pode ser de cerca de 0,232 μL/segundo. Em alguns casos, a área da seção transversal das correntes de amostra e de revestimento combinadas no local de imageamento é 600.000 μm2. Em alguns casos, a velocidade média da corrente de fluxo no local de imageamento é 75 mm/segundo.
[000147] A vazão ou velocidade pode ser determinada como a taxa que resulta em imagens celulares transparentes e concentradas. As vazões e velocidades exemplificadoras foram descobertas com base em vazões das duas amostras que foram observadas como atingindo certos formatos ou características da fita da corrente de fluxo da amostra no local do imageamento. Por exemplo, na vazão de cerca 75 mm/s (ou dentro de uma faixa de 20-200 mm/s), as células não fluem muito lentas de modo que existem sobreposições de células em imagens consecutivas, e as células não fluem muito rápido de modo que os efeitos de formação de imagem fantasma são criados (imagem embaçada). De modo semelhante, ao evitar as vazões excessivamente altas, é possível conservar mais reagente e amostra. De acordo com algumas modalidades, uma velocidade linear ótima ou desejada pode ser alcançada tanto pela alteração do fluxo volumétrico (taxa de bomba) quanto pelo formato de cânula.
[000148] A velocidade de fluxo da corrente de amostra, através da zona de captura de imagem pode também estar relacionada com o desempenho do dispositivo de captura de imagem em relação à função da célula de fluxo. Por exemplo, se a corrente de amostra flui muito rapidamente, pode ser difícil a obtenção de imagens transparentes de partículas contidas na amostra (por exemplo, a velocidade do obtu- rador do dispositivo de captura de imagem pode ser muito baixa, produzindo, assim, uma imagem embaçada). De modo similar, se a corrente de amostra flui muito lentamente, o dispositivo de captura de imagem pode obter imagens consecutivas de uma mesma partícula (por exemplo, a mesma partícula permanece na estrutura de captura durante duas capturas de imagem). Em algumas modalidades, a velo-cidade da fita da amostra pode ser modulada (por exemplo, por ajuste de qualquer de uma variedade de parâmetros operacionais da célula de fluxo) em relação à taxa de captura de imagem, de modo que haja um fluxo mínimo entre as capturas da estrutura e, consequentemente, uma elevada porcentagem da amostra é imageada.
[000149] De acordo com algumas modalidades, o sistema de análise de partículas e os componentes associados podem ser configurados de modo que à medida em que o fluido de revestimento e a amostra de fluido fluem através da célula de fluxo, o fluido de revestimento pode fluir em uma taxa volumétrica de fluido revestimento de 45 μL/s e a amostra de fluido pode fluir a uma vazão volumétrica de amostra de fluido de 0,232 μL/s (ou dentro de uma faixa de 0,2 a 0,35 μL/s). Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido de amostra é de cerca de 200. Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 70 a 200. Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra é de cerca de 193. Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra é de cerca de 70. Em alguns casos, uma razão entre o volume do fluido de revestimento e o volume da amostra de fluido que flui dentro da célula de fluxo pode estar dentro de uma faixa de 25:1 a 250:1.
[000150] De acordo com algumas modalidades, o sistema e os componentes associados podem ser configurados de modo que o fluido de revestimento e a amostra de fluido fluem através da célula de fluxo 420, o fluido de revestimento pode fluir a uma velocidade de fluido de revestimento de 75 mm/s antes de a área de imageamento e a amostra de fluido pode fluir a uma velocidade de amostra de fluido entre 130 mm/s antes da área de imageamento. Em alguns casos, uma razão entre o volume de fluido de revestimento e o volume da amostra de fluido que flui dentro da célula de fluxo pode estar dentro de uma faixa de 100:1 para 200:1.
[000151] Em alguns casos, uma célula de fluxo pode ter uma razão de compressão mínima de cerca de 50:1 e uma razão de compressão máxima de cerca de 125:1. Em alguns casos, a razão de compressão mínima pode ser de cerca de 30:1 ou 20:1. Esta razão de compressão refere-se à razão das espessuras da corrente de fluxo H(S):H(S) ao se comparar a Figura 4A-1 com a Figura 4A-2. Esta taxa de compressão pode ser influenciada por uma combinação de compressão geométrica (por exemplo, a razão das espessuras de fluido revestimento H(P):H(P) ao se comparar a Figura 4A-1 com a Figura 4A-2, que também pode corresponder geralmente às dimensões da zona de transição afunilada de estreitamento da célula de fluxo 419a mostradas na Figura 4A) e uma compressão hidrodinâmica (por exemplo, também correspondendo a uma diferença na velocidade). De acordo com algumas modalidades, a razão de compressão geométrica é cerca de 40:1.
[000152] A diminuição do tamanho do trajetória de fluxo, correspondente à zona de transição, pode ser definida por uma porção proximal da trajetória de fluxo tendo uma espessura ou altura proximal, e uma porção distal da trajetória de fluxo tendo uma espessura ou altura distal que é menor que a espessura ou altura proximal. Por exemplo, conforme mostrado na vista parcial da Figura 4B, a zona de transição 419b da trajetória de fluxo pode ter um comprimento L entre uma por- ção proximal 415b e uma porção distal 416b, onde a porção proximal 415b tem uma altura proximal 417b e a porção distal 416b tem uma altura distal 418b. Conforme observado em outra seção da presente invenção, o formato ou contorno da zona de transição pode ser curvo ou liso, e, por exemplo, pode ser fornecido no formato de uma curva em S ou uma curva tangente. De acordo com algumas modalidades, a altura proximal 417b tem um valor de cerca de 6000 μm. Em alguns casos, a altura proximal 417b tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 3000 μm a cerca de 8000 μm. De acordo com algumas modalidades, a altura distal 418b tem um valor de cerca de 150 μm. Em alguns casos, a altura distal 418b tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 50 μm a cerca de 400 μm.
[000153] A geometria da zona de transição 419a pode fornecer um primeiro ângulo α1 entre o primeiro contorno de trajetória de fluxo 403b e o plano transversal de bissecção 451b, e um segundo ângulo α2 entre o segundo contorno de trajetória de fluxo 404b e o plano transversal de bissecção 451b. Em alguns casos, o ângulo α1 é cerca de 45 graus e o ângulo α2 é cerca de 45 graus. Em alguns casos, o ângulo α1 tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. Em alguns casos, o ângulo α2 tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. De acordo com algumas modalidades, os ângulos α1 e α2 têm o mesmo valor. Os ângulos α1 e α2 podem ser selecionados de modo a manter um fluxo laminar ou minimizar a turbulência do fluido de amostra, uma vez que o mesmo viaja a partir da porção proximal 415b para a porção distal 416b, que por sua vez pode melhorar o alinhamento das partículas na amostra ao longo do plano transversal 451b. Como observado acima com referência à Figura 4A, os contornos proximal e distal ou porções da zona de transição podem ser curvos ou lisos, em vez de serem em ângulo.
[000154] Conforme mostrado na Figura 4K, uma fita da corrente de amostra R que flui através de um local de captura de imagem 432k de uma célula de fluxo 420k pode ter uma espessura T de cerca de 2 μm. Em alguns casos, a espessura T da fita da corrente de amostra pode ser de até cerca de 3 μm. Tipicamente, as células ou partículas que são menores que a espessura da corrente da amostra irão estar contidas dentro da fita. Uma célula vermelha do sangue (RBC) exemplifica- dora pode estar presente como um disco bicôncavo e pode ter um diâmetro D de entre cerca de 6,2 μm e cerca de 8,2 μm. Além disso, uma célula vermelha do sangue exemplificadora pode ter uma espessura máxima T1 entre cerca de 2 μm e cerca de 2,5 μm e uma espessura mínima T2 de entre cerca de 0,8 μm e cerca de 1 μm. Em alguns casos, as células vermelhas do sangue podem ter uma espessura de até cerca de 3 μm. As plaquetas humanas exemplificadoras de podem variar de tamanho, e também podem ter uma espessura ou diâmetro de cerca de 2 μm. Embora não seja mostrado aqui em escala, a célula de fluxo pode definir uma espessura da trajetória de fluxo H tendo um valor de cerca 150 μm, no local de captura de imagem. Em alguns casos, a espessura de trajetória de fluxo F tem um valor entre 50 μm e 400 μm. Esta espessura de trajetória de fluxo F também pode corresponder à altura distal 418b da porção distal 461b representada na Figura 4B.
[000155] Conforme mostrado na Figura 4K, a razão entre a espessura T da corrente de fluido de amostra e a espessura da partícula (células vermelhas do sangue) é cerca de 1:1. De acordo com isso algumas modalidades, uma razão entre a espessura T da corrente de fluido de amostra no local de captura de imagem e um tamanho de uma das partículas está dentro de uma faixa de 0,25 a 25. Em alguns casos, a espessura T pode ter um valor dentro uma faixa de 0,5 μm a 5 μm. Um diferencial de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra pode ser selecionado de modo a atingir um posicionamento desejado do corrente de amostra da fita dentro da célula de fluxo.
[000156] Como discutido em outra seção da presente invenção, assim como no Pedido de Patente US copendente n° , as diferenças de viscosidade entre o fluido da fita de amostra R e o fluido de revestimento podem operar para alinhar ou orientar as partículas na corrente de amostra, por exemplo, as células vermelhas de sangue, ao longo da direção do fluxo. Quando assim alinhadas, conforme mostrado na Figura 4K, o dispositivo ou câmara de imageamento pode obter imagens das células vermelhas do sangue de tal modo que elas aparecem redondas, porque a superfície principal da célula sanguínea está vol-tada para a câmara. Desta forma, as células vermelhas do sangue assumem um alinhamento que apresenta uma baixa resistência em relação ao fluxo. Consequentemente, as características de viscosidade relativa do fluido de revestimento e da amostra de fluido podem contribuir para uma elevada porcentagem ou número das células vermelhas do sangue voltado para a câmara, melhorando assim a capacidade de avaliação do sistema de análise de partículas.
[000157] De acordo com algumas modalidades, as características de viscosidade do fluido de revestimento operam para limitar o desali- nhamento de partículas na amostra de fluido de sangue. Por exemplo, os diferenciais de viscosidades podem ser eficazes para limitar o desa- linhamento da orientação do imageamento das células vermelhas do sangue (eritrócitos) na amostra de fluido de sangue para menos que cerca de 10%. Ou seja, 90 ou mais eritrócitos de 100 eritrócitos em uma amostra podem ser alinhados de modo que as suas superfícies principais ficam voltadas para o dispositivo de imagem. Uma zona de transição de estreitamento simétrico pode fornecer um valor de 20%. De acordo com algumas modalidades, o fluido de revestimento tem um índice de refração semelhante ao da água (isto é n=1,3330). Em alguns casos, o fluido de revestimento tem um teor de água de cerca de 89%. Além dos efeitos de alinhamento observados como resultado do diferencial de viscosidade, os efeitos de alinhamento são também observados como resultado de uma zona de transição afunilada bilateral. Em alguns casos, observa-se que uma zona de transição afunilada bilateral (isto é simétrica) é duas vezes mais eficaz para alinhar as par-tículas, em comparação com um modelo de zona de transição afunilada assimétrica.
[000158] O alinhamento eficiente dos eritrócitos pode contribuir para um melhor diagnóstico. Em alguns casos, o formato dos eritrócitos imageados pode ser usado para determinar se um paciente do qual a amostra é obtida tem uma doença ou condição fisiológica particular. Por exemplo, os pacientes com a doença das células falciformes apresentam as células do sangue tendo um formato anormal (isto é, no formato de uma foice). Consequentemente, mediante a obtenção de imagens de alta qualidade das células vermelhas do sangue alinhadas, é possível assegurar um diagnóstico preciso. Outras variações dos formatos das células vermelhas do sangue, por exemplo, as células vermelhas do sangue tendo área periférica delgada e uma área central plana grande, através das quais a célula vermelha do sangue parece ter o perfil de um pneu de bicicleta, podem ser imageadas eficazmente usando as presentes técnicas de alinhamento. De modo similar, as células vermelhas do sangue com uma pequena porção central, e uma área periférica espessa, pela qual a célula vermelha do sangue parece ter o perfil de um pneu de camião, podem ser imagea- das para fins de diagnóstico. As técnicas de imageamento melhoradas aqui divulgadas também são úteis para a avaliação de outras características das células vermelhas do sangue, como o teor de hemoglobi-na, o teor em ferro, e similares.
[000159] Sem se ater a qualquer teoria em particular, acredita-se que um diferencial de viscosidade entre a viscosidade do fluido de revestimento e a viscosidade do fluido da amostra produz um perfil parabólico modificado, sendo que o perfil é geralmente parabólico e tem um impacto central, correspondente a uma área central do fluxo, onde a aceleração é aumentada, e o impacto central contribui para alinhamento de partículas da amostra ou organelas entre as partículas. De acordo com algumas modalidades, a diferença de velocidade entre a fita da amostra e o revestimento e a diferença de viscosidade geram forças de cisalhamento para aumentar o alinhamento das organelas ou partículas intracelulares. Aspectos exemplificadores do perfil parabólico do fluido de revestimento são discutidos no Pedido de Patente co- pendente US n°. , cujo conteúdo é aqui incorporado, por re ferência.
[000160] As células brancas do sangue são tipicamente maiores que as células vermelhas do sangue e plaquetas. Por exemplo, os neutrófi- los e eosinófilos exemplificadores podem ter um diâmetro de entre cerca de 10 μm e cerca de 12 μm. Basófilos exemplificadores podem ter um diâmetro de entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Linfócitos exemplificadores de (pequenos) podem ter um diâmetro de entre cerca de 7 μm e cerca de 8 μm, e linfócitos exemplificadores (grandes) podem ter um diâmetro de entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Mo- nócitos exemplificadores podem ter um diâmetro de entre cerca de 12 μm e cerca de 20 μm. A configuração do sistema de análise de partículas, incluindo a interação entre o fluido de revestimento e a fita de fluido de amostra à medida que passam através da célula de fluxo, pode operar para compactar as células brancas do sangue à medida que viajam através do local de captura de imagem 432l, conforme indicado na Figura 4L. Consequentemente, por exemplo, uma porção central da célula branca do sangue (WBC) pode ser posicionada no interior da fita de fluido de amostra R, e as porções periféricas da célula branca do sangue podem ser posicionadas no interior do fluido de revestimento. Consequentemente, na medida em que a célula branca do sangue é transportada através da célula de fluxo pela fita, os lados da célula branca do sangue podem estender-se para dentro do fluido de revestimento.
[000161] De acordo com algumas modalidades, as diferenças de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra podem operar para alinhar as organelas ou outros recursos intracelulares que estão presentes no interior das células, como as células brancas do sangue. Sem se ater a qualquer teoria em particular, acredita-se que as forças de cisalhamento associadas com a viscosidade diferencial entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra podem atuar sobre as células brancas do sangue, de modo a alinhar os recursos intrace-lulares. Em alguns casos, as forças de cisalhamento associadas com os diferenciais de velocidade entre o fluido de revestimento e fluido de amostra podem contribuir para tal alinhamento. Estes efeitos de alinhamento podem ser impactados por um diferencial de tamanho entre as partículas e a fita de fluido de amostra também. Por exemplo, quando as porções das partículas se estendem para fora da fita de fluido de amostra e para dentro do fluido de revestimento circundante, as forças de cisalhamento associadas com a diferença na viscosidade podem ter um efeito pronunciado sobre o alinhamento de recurso intracelular.
[000162] Conforme representado na Figura 4L, as porções de uma célula, como célula branca do sangue podem estender-se para dentro do fluido de revestimento. As modalidades da presente invenção abrangem composições de fluido revestimento que não fragmentam ou lisam a célula, ou de outro modo, comprometem a integridade da membrana celular externa, quando a célula é exposta ao fluido de re- vestimento. Um agente de viscosidade no fluido de revestimento pode operar para manter a viabilidade das células na corrente de fluido de amostra, de modo a deixar a estrutura (por exemplo, formato) e o conteúdo (por exemplo, núcleo) das células intacts quando a membrana ou parede celular atravessa uma interface entre a fita de fluido de amostra e o envelope de fluido de revestimento ou, de outro modo, se estende a partir da corrente de fluido de amostra para o fluido de revestimento que flui.
[000163] Frequentemente, há forças compressivas que atuam sobre as células ou partículas na medida em que elas fluem dentro da fita de fluido de amostra ao longo da célula de fluxo. Consequentemente, as células podem entrar em contato com o fluido de revestimento enquanto que as células estão em um estado comprimido ou, de outro modo, são sujeitas a forças compressivas, como resultado de uma zona de transição de estreitamento. O agente de viscosidade do fluido de revestimento pode operar para proteger as células comprimidas de serem fragmentadas ou destruídas quando elas emergem a partir da fita de fluido de amostra delgada e tornam-se expostas ao fluido de revestimento viscoso, pelo menos até as células atingirem o local de captura de imagem. Consequentemente, a composição de agente de viscosidade do fluido de revestimento pode operar como um protetor celular, ao mesmo tempo, também melhorando o alinhamento das partículas ou conteúdo intrapartícula.
[000164] Com referência às Figuras 4K e 4L, em alguns casos, as porções da célula ou partícula podem estender-se para fora da fita de fluido de amostra delgada R e para dentro do fluido de revestimento circundante. Conforme discutido no Pedido de Patente copendente US n° , o fluido de revestimento pode conter protetores celulares que inibem ou impedem o fluido de revestimento de romper ou lisar as células ou partículas. Por exemplo, o fluido de revestimento pode conter protetores celulares que preservam a integridade estrutural das paredes celulares na medida em que as células são expostas ao ambiente químico do fluido de revestimento. De modo similar, os protetores celulares também podem operar para preservar a integridade estrutural das paredes celulares na medida em que as células experimentam quaisquer forças de cisalhamento induzidas pela geometria da célula de fluxo, e uma diferença na velocidade e/ou viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento. De modo semelhante, os protetores podem proteger as células ou partículas de forças resultantes da diferença na velocidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento. Desta forma, as células mantém a sua viabilidade na medida em que elas atingem o local de captura de imagem.
[000165] As forças de cisalhamento podem ser significativas na interface entre a fita de fluido de amostra e o envelope de fluido de revestimento. De acordo com algumas modalidades, o fluxo dentro da trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ser caracterizado por um perfil de fluxo parabólico. De acordo com algumas modalidades, as partículas que são suficientemente de tamanho grande irão ser submetidas a uma certa quantidade de força de cisalhamento, mesmo quando essas partículas estão completamente contidas dentro de uma única fase de fluido (isto é, quer no interior do envelope de fluido de revestimento, ou alternativamente, no interior da fita de fluido de amostra).
[000166] Em alguns casos, a velocidade do fluido de revestimento pode ser diferente da velocidade do fluido de amostra. Por exemplo, o fluido de revestimento pode estar viajando a 80 mm/segundo e o fluido de amostra pode estar viajando a 60 mm/segundo. Consequentemente, em alguns casos, a amostra de fluido sai da porta de cânula distal a uma velocidade do fluido de amostra, que é mais lenta que a velocidade do fluido de revestimento do envelope circundante. Consequentemente, o fluido de revestimento pode operar para arrastar o fluido de amostra ao longo da trajetória de fluxo da cânula, acelerando, dessa forma, o fluido da amostra e reduzindo a espessura da fita de fluido de amostra. A fita de fluido de amostra mantém a massa e volume total, de modo que na medida em que ele viaja mais rapidamente ele se torna mais delgado. De acordo com algumas modalidades, tanto o fluido de revestimento quanto o fluido de amostra têm uma velocidade entre cerca de 20 e 200 mm/segundo no local de captura de imagem.
[000167] Tipicamente, a velocidade do fluido de amostras aumenta na medida em que a fluido de amostra viaja da porta de saída de cânula para o local de captura de imagem. Em alguns casos, a velocidade do fluido de amostra no local de captura de imagem é 40 vezes a velocidade do fluido de amostra na medida em que ele sai da porta de cânula na porção distal de cânula. De acordo com algumas modalidades, a diminuição da área da seção transversal da fita da amostra é linear com o aumento da velocidade. De acordo com algumas modalidades, se a velocidade de revestimento na saída de cânula é maior que a velocidade da fita da amostra isto também aumentará a velocidade final da fita de amostra na área de imageamento.
[000168] O fluido de revestimento pode operar para aplicar forças de cisalhamento significativas sobre a fita de fluido da amostra e em partículas no interior da fita de fluido da amostra. Algumas forças são paralelas à direção do fluxo, e as partículas também podem encontrar forças que são perpendiculares à direção do fluxo. Frequentemente, na medida em que o fluido de revestimento e o fluido de amostra se aproximam do local ou zona de captura de imagem, os fluidos de amostra e de revestimento viajam na, ou perto da, mesma velocidade. Consequentemente, o contorno ou interface entre os fluidos de amostra e de revestimento à medida que passam pelo local de captura de imagem, podem apresentar forças de cisalhamento inferiores, em comparação com o contorno ou interface na porta de saída de cânula distal ou na zona de transição afunilada. Por exemplo, na zona de transição afunilada, o contorno ou interface entre o envelope de fluido de revestimento e a fita de fluido de amostra pode estar em transição, de tal modo que a fita de amostra que é inicialmente mais lenta e mais espessa torna-se mais rápida e mais delgada, e as partículas no fluido de amostra tornam-se mais alinhadas. Dito de outra maneira, as forças de cisalhamento podem ser proeminentes na zona de transição afunilada, e podem dissipar-se para o local de captura de imagem. As forças de cisalhamento no local de captura de imagem podem ser representadas por um perfil parabólico, e podem ser muito menores do que as forças de cisalhamento na zona de transição afunilada. Consequentemente, as células ou partículas podem experimentar forças de cisa- lhamento mais elevadas à medida que passam através da zona de transição, e forças de cisalhamento mais baixas à medida que passam através do local de captura de imagem. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre os fluidos de amostra e de revestimento pode colocar as células vermelhas do sangue em alinhamento e, assim, em foco. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre os fluidos de amostra e de revestimento pode colocar as organelas das células brancas do sangue em alinha-mento e, assim, em foco. De modo semelhante, os resultados de ima- geamento melhorados podem ser obtidos para os componentes celulares e organelas que estão alinhados e colocados em foco, resultando do estreitamento geométrico da corrente e na diferença de velocidade entre os fluidos de amostras e de revestimento.
[000169] Conforme observado em outra seção da presente invenção, e com referência às Figuras 4K e 4L, na medida em que o fluido de revestimento e o fluido de amostra R fluem através de uma redução no tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição de uma célula de fluxo, e em direção a um local de imageamento 432k ou 432l, um efei- to de hidrofocalização da viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R associado com uma diferença de viscosidade entre a viscosidade do fluido de revestimento e a viscosidade do fluido de amostra, em combinação com um efeito de hidrofocalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R associado com a redução do tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição, fornece um estado de imageamento alvo em pelo menos algumas da pluralidade de partículas no local de imageamento 432k ou 432l.
[000170] Em alguns casos, as modalidades da presente invenção incluem composições para uso com um sistema de hematologia, conforme descrito aqui, como um fluido de revestimento ou partícula e líquido de alinhamento de organela intracelular (PIOAL). Tais fluidos de revestimento ou PIOALs são adequados para uso em um analisador visual de hidrofocalização geométrica e viscosidade combinadas. O PIOAL pode operar para dirigir ou facilitar o fluxo de um fluido de amostra de sangue de uma dada viscosidade através de uma zona de transição de estreitamento de célula de fluxo do analisador visual. O PIOAL pode incluir um fluido que tem uma viscosidade mais elevada do que a viscosidade da amostra. Um efeito de hidrofocalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido de amostra associado com a diferença de viscosidade, em com-binação com um efeito de hidrofocalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido de amostra associado com a zona de transição da célula de fluxo de estreitamento, pode ser eficaz para fornecer um estado de imageamento alvo em pelo menos algumas da pluralidade de partículas em um local de imageamento do analisador visual, mantendo a viabilidade das células no fluido de amostra de sangue.
[000171] A Figura 4M representa um neutrófilo exemplificador 400 m (um tipo de célula branca do sangue) tendo organelas internas, como lóbulos 410m. Como um resultado do diferencial de viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido de revestimento, as organelas internas podem se alinhar no interior da célula, conforme indicado pela Figura 4N. Consequentemente, as organelas intracelulares podem ser efi-cazmente imageadas com um dispositivo de captura de imagem 430m, sem que as organelas se sobreponham umas com as outras. Ou seja, em vez de os lóbulos serem empilhados uns sobre os outros conforme representado na Figura 4M, quando vistos a partir do imageamento ou eixo óptico do dispositivo de captura de imagem, os lóbulos são alinhados e assentados lado a lado conforme representado na Figura 4N. Consequentemente, os lóbulos podem ser visualizados na imagem capturada mais eficazmente. O alinhamento interno de organela é um resultado surpreendente e inesperado do diferencial de viscosidade entre os fluidos de amostra e de revestimento. Consequentemente, os resultados de imageamento melhorado correspondentes ao alinhamento de célula e em foco são alcançados através dos recursos de diferencial de viscosidade, fluxo hidrodinâmico, e compressão geométrica.
[000172] Conforme observado em outra seção da presente invenção, e com referência às Figuras 4M e 4N, na medida em que o fluido de revestimento e o fluido de amostra R fluem através de uma redução no tamanho da trajetória ou zona de transição de uma célula de fluxo, e em direção a um local de imageamento de um dispositivo de captura de imagem 430 m ou 430n, um efeito de hidrofocalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R associado com uma diferença de viscosidade entre a viscosidade do fluido de revestimento e a viscosidade do fluido de amostra, em combinação com um efeito de hidrofocalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido de revestimento e o fluido de amostra R associado com a redução do tamanho da trajetória de fluxo ou zona de transição, fornece um estado de imageamento alvo em pelo menos algumas da pluralidade de partículas no local de ima- geamento. De acordo com algumas modalidades, o estado de image- amento alvo pode corresponder a uma distribuição de estados de ima- geamento.
[000173] Em alguns casos, o estado de imageamento alvo pode envolver uma orientação de estrutura intrapartícula alvo (por exemplo, de alinhamento e/ou posição) em relação a um plano focal no local do imageamento. Por exemplo, conforme representado na Figura 4N, as estruturas internas 410 m (por exemplo, estrutura intracelular, organe- la, lóbulo, ou similares) podem ser orientadas em relação ao plano focal F. Em alguns casos, o alinhamento alvo envolve um alinhamento de estrutura intrapartícula alvo em relação ao plano focal F no local de imageamento, semelhante à relação de alinhamento de partículas representada na Figura 4K-3. Em alguns casos, a posição do alvo envolve uma posição de estrutura intrapartícula alvo em relação a um plano focal no local da imagem, semelhante à relação de posição de partícula representada na Figura 4K-1. Em alguns casos, a orientação-alvo da estrutura intrapartícula pode incluir tanto um alinhamento- alvo em relação ao plano focal quanto também uma posição alvo em relação ao plano focal. Em alguns casos, o estado de imageamento alvo pode envolver uma deformação-alvo no local de imageamento. Por exemplo, conforme representado na Figura 4N, a partícula 400 m tem um formato compactado, em comparação com o formato de partícula representado na Figura 4M. Consequentemente, pode ser visto que a operação da célula de fluxo pode produzir um efeito de compressão lateral sobre os formatos das partículas. De modo semelhante, os recursos intrapartículas podem ser posicionalmente ou direcionalmente orientados (por exemplo, alinhados com respeito ao plano focal F e/ou plano do fluxo da fita) na medida em que a partícula em si é compactada no formato. De acordo com algumas modalidades, uma diferença de velocidade entre os fluidos de revestimento e de amostra pode produzir atrito no interior da corrente de fluxo, e uma diferença de viscosidade entre os fluidos de revestimento e de amostra pode amplificar o atrito hidrodinâmico.
[000174] Qualquer um de uma variedade de técnicas de análise de partículas de hematologia ou do sangue pode ser realizada usando imagens do fluido de amostra que flui através da célula de fluxo. Frequentemente, a análise de imagem pode envolver a determinação de certos parâmetros de células ou partículas, ou medição, detecção, ou avaliação de certos recursos das células ou partículas. Por exemplo, a análise de imagem pode envolver a avaliação de células ou tamanho de partículas, recursos do núcleo celular, recursos do citoplasma celular, recursos de organelas intracelulares e similares. De modo semelhante, as técnicas de análise podem abranger certos métodos de contagem ou de classificação ou testes de diagnóstico, incluindo diferenciais de células brancas do sangue (WBC). Em alguns casos, as imagens obtidas usando a célula de fluxo podem suportar um teste diferencial de WBC em 5 partes. Em alguns casos, as imagens obtidas usando a célula de fluxo podem suportar um teste diferencial de WBC em 9 partes. De modo semelhante, com referência à Figura 4, o processador 440 pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema 400 diferencie diferentes tipos de células com base nas imagens obtidas a partir do dispositivo de captura de imagem. De modo similar, com referência à Figura 6B, o processador 604b pode incluir ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento tendo um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema 600b ou o sistema 642b diferencie diferentes tipos de células com base nas imagens obtidas do dispositivo de captura de imagem. Por exemplo, as técnicas de teste ou de diagnóstico podem ser usadas para diferenciar várias células (por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófi- los, basófilos, metamielócitos, mielócitos, promielócitos e blastos).
[000175] A Figura 4O mostra uma comparação entre imagens obtidas usando PIOAL e imagens obtidas usando um fluido de revestimento não PIOAL. O uso de PIOAL resultou em mais conteúdos celulares em focagem, como os lóbulos, citoplasma, e/ou grânulos. Neste exemplo, um PIOAL que compreende um agente de viscosidade (cerca de 30% de glicerol) foi usado para processar a amostra. O pH foi ajustado para um pH de cerca de 6,8 a 7,2 e a mistura de amostra foi tornada em isotônico (por cloreto de sódio a 0,9%). Os resultados aqui apresentados demonstram a eficácia de um PIOAL exemplificador usado em um analisador de imagem para alinhar as células e organe- las intracelulares.
[000176] As Figuras 4P e 4Q mostram uma comparação entre imagens obtidas usando um fluido de revestimento padrão (Figura P painéis superiores e inferiores) e imagens obtidas usando um fluido de PIOAL exemplificador (Figura 4Q painéis superiores e inferiores). Conforme mostrado aqui, o uso de PIOAL resultou em um alinhamento de RBC melhorado. A amostra foi analisada usando um protocolo de focalização de instrumento (em um alvo exemplificador 44 conforme representado na Figura 1) e o alvo foi colocado em foco por um analisador visual. O sistema de focalização foi então deslocado pela distância de deslocamento 52, resultando em partículas na corrente de amostra em formato de fita que estão em focalização. A amostra de sangue foi previamente diluída usando um diluente de amostra. A amostra fluiu através de uma cânula e ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo gerando, assim, uma corrente de amostra em formato de fita (por exemplo, 2 mícrons de espessura) que estava entre duas camadas de PIOAL ou revestimento padrão (nos controles). O analisador visual gera, então, imagens focalizadas das partículas na corrente de amostra em formato de fita (por exemplo, a cerca de 60 quadros por segundo) a ser usada para a análise. A amostra de sangue é obtida de um indivíduo e processada para análise pelo analisador de sangue. As imagens de RBCs em uma célula de fluxo são capturadas enquanto a amostra é processada usando um fluido de revestimento padrão ou um PIOAL. As porcentagens relativas demonstram uma melhoria significativa no número de RBCs alinhados com base em dados de imagem (por exemplo, 4P e 4Q). O resultado de-monstrou que PIOAL foi eficaz no aumento da porcentagem de alinhamento de RBC enquanto em fluxo na corrente de amostra em formato de fita com os protocolos/instrumento de focalização, conforme descrito aqui.
[000177] Observou-se também que a implementação dos resultados de PIOAL no melhor alinhamento baseou-se no uso de níveis crescentes de glicerol (gly) em células de fluxo simétricas e assimétricas.
[000178] Estes resultados fornecem evidência para a descoberta surpreendente e inesperada de que certas composições de PIOAL têm propriedades inesperadas de alinhamento de células e reposicionamento de estruturas intracelulares quando usadas para realizar a análise de partículas/células com base na imagem. Extensão da faixa dinâmica
[000179] A Figura 5 é um diagrama de blocos que mostra aspectos adicionais de sistemas e métodos para obtenção da extensão de faixa dinâmica ou de detecção para a análise de partículas em amostras de sangue, de acordo com modalidades da presente invenção. Como mostrado aqui, pelo menos um processador digital 18 está acoplado para operar a unidade de motor 54 e para analisar a imagem digitalizada a partir da matriz de fotodetector como coletada em diferentes posições de focalização em relação ao padrão de foco automático alvo 44. O processador 18 é configurado para determinar uma posição do focalização do padrão de foco automático 44, isto é, para autofocaliza- ção no padrão de foco automático alvo 44 e, dessa forma, estabelecer uma distância ótima entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 e o padrão de foco automático 44. Isto pode ser realizado por etapas de processamento de imagem, como aplicando um algoritmo para avaliar o nível de contraste na imagem em uma primeira distância, que pode aplicar-se a toda a imagem ou, pelo menos, em uma borda do padrão de foco automático 44. O processador move o motor 54 para uma outra posição e avalia o contraste nessa posição ou borda, e depois de duas ou mais iterações determinam uma distância óti-ma que maximiza a precisão do foco no padrão de foco automático 44 (ou pode otimizar a precisão do foco, se mudado para aquela posição). O processador baseia-se no espaçamento fixo entre o padrão de foco automático alvo do foco automático 44 e a corrente de amostra em formato de fita, o processador 18 controla então o motor 54 para mover o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 para a distância correta para focalizar na corrente de amostra em formato de fita 32. Mais especificamente, o processador opera o motor para deslocar a distância entre o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução e a corrente de amostra em formato de fita 32 pela distância de deslocamento 52 (consulte a Figura 1) pela qual a corrente de amostra em formato de fita é deslocada a partir do padrão de foco automático alvo 44. Deste modo, o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é focalizado sobre a corrente de amostra em formato de fita.
[000180] De acordo com algumas modalidades, o analisador visual 17 é um analisador exemplificador 17 da Figura 1. O analisador visual 17 pode compreender pelo menos uma célula de fluxo 22 e pelo menos um dispositivo de imageamento 24 como um dispositivo de ima- geamento óptico de alta resolução tendo um sensor de imageamento como uma câmera digital. O analisador visual 17 também pode compreender um injetor de amostra 29. O injetor de amostra 29 é configurado para fornecer a amostra 12 em pelo menos uma célula de fluxo 22. A célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo de PIOAL interna que estreita, por exemplo, simetricamente na direção do fluxo. A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra através de uma zona de visualização na célula de fluxo 22.
[000181] A Figura 5 ilustra o foco automático e outros aspectos do imageamento digital conforme descrito. Tais técnicas podem ser usadas em conjunto com equipamentos para células sanguíneas que não são baseados em imageamento ou talvez são menos relacionados com a imagem que as modalidades descritas, como contadores de células sanguíneas Coulter, também conhecidos como citômetros de fluxo. Tais contadores são conhecidos para detecção e contagem de células do sangue e partículas em fluidos, mas geralmente não por ima- geamento. Em um contador daquele tipo, uma célula de fluxo é disposta para transportar um fluxo de partículas envelopadas em um fluido. A célula de fluxo se estreita para forçar as partículas na trajetória do fluxo em uma fila única. Um par de eletrodos ou outros detectores que abrangem a trajetória de fluxo produzem uma contagem por detecção de uma alteração pulsada na impedância elétrica, ou obstrução de uma trajetória de luz entre a fonte de luz e um fotodetector quando as células passam.
[000182] Os citômetros de fluxo são vantajosos porque um grande número de células ou outras partículas pode ser contado, muito maior que o número de células que pode ser imageado praticamente em um contador visual. Mas os citômetros de fluxo não são tão eficazes na distinção entre as células por tipo, ou permitem distinções entre células normais e anormais, ou distinguem células agrupadas, como nódulos de plaquetas, a partir de células discretas do sangue. Ao operar um analisador, por exemplo, o analisador visual, como descrito, através de um número estatisticamente significativo de quadros de imagem de uma corrente de amostra em formato de fita, uma razão proporcional ou distribuição de tipos de células do sangue pode ser medida. As razões proporcionais determinadas a partir de um analisador visual, ou uma função das mesmas, são aplicadas para as contagens de células do sangue, e maiores números de células do sangue são contados pelo citômetro, embora com menos discriminação ou nenhuma discriminação quanto ao tipo de células, para fornecer uma contagem de sangue total precisa, que explora as vantagens peculiares de ambos os tipos de analisadores.
[000183] De acordo com algumas modalidades, as contagens de partículas podem ser inferida através da aplicação de um algoritmo, por exemplo, um algoritmo com base em uma razão proporcional de contagem de partículas. A Figura 5 ilustra um equipamento exemplifi- cador adaptado para a análise do sangue. Em algumas modalidades, o contador de partículas 15 e o analisador visual 17 podem ser conec-tados em série em vez de em paralelo. O contador de partículas 15 pode ser, por exemplo, um contador de células sanguíneas Coulter, que detecta e conta as células do sangue e partículas nos fluidos. Em um contador daquele tipo, uma trajetória de fluxo (não mostrada) está disposta para transportar um fluxo de partículas envelopadas em um fluido. A trajetória de fluxo se estreita para forçar as partículas na trajetória do fluxo em uma fila única. Um par de eletrodos ou outros detectores que abrangem a trajetória de fluxo produzem uma contagem por detecção de uma alteração pulsada na impedância elétrica, ou obstru- ção de uma trajetória de luz entre a fonte de luz e um fotodetector quando as células passam. O contador de partículas 15 é configurado para contar um grande número de células ou de outras partículas. Mas o contador de partículas 15 pode não ser capaz de distinguir entre os membros em subcategorias de células e/ou distinguir entre células normais e anormais, ou distinguir as células agrupadas, como nódulos de plaquetas, a partir de células discretas do sangue.
[000184] O analisador visual 17 pode também compreender pelo menos uma câmara de contato 25 configurada para fornecer pelo menos uma substância química compreendendo pelo menos um de um diluente, um agente de permeabilização, e um agente de contraste eficaz para gerar distinções visuais para a categorização e/ou subcatego- rização partículas. Por exemplo, conforme mostrado com referência às Figuras 1 e 5, a amostra contatada é introduzida na célula de fluxo através do injetor de amostra 29, e um reagente de alinhamento de organela intracelular ou revestimento é introduzido a partir do injetor 27. Um diluente pode ser usado para diluir a amostra até uma concentração adequada. Um agente de contraste e/ou agente de permeabili- zação é usado para gerar distinções visuais para categorizar e/ou sub- categorizar as partículas. PIOAL é usado para alinhar certos tipos de células ou estruturas celulares em uma direção para uma melhor ima- geamento. Em algumas modalidades, o pelo menos um produto químico pode ser aplicado para contatar uma primeira amostra e, em seguida, a amostra tratada é fornecida sobre o analisador visual 17. O tratamento da amostra com pelo menos a adição de pelo menos um produto químico pode ser realizado à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, um tal tratamento pode ser realizado a uma temperatura, como 10, 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 °C. O tratamento a uma temperatura selecionada pode ser conduzido em uma incubadora que está separada do analisador visual 17, ou em um analisador visual 17, que é de temperatura controlada.
[000185] Em algumas modalidades, o analisador visual pode ter um injetor de agente de contraste para colocar a amostra em contato com um agente de contraste e/ou agente de permeabilização ou tensoativo. Em outras modalidades, a amostra pode ser colocada em contato com o agente de contraste, agente de permeabilização antes da injeção no analisador visual. Em outras modalidades, o analisador visual contém um elemento de aquecimento para aquecer a amostra enquanto está em contato com o agente de contraste e/ou agente de permeabiliza- ção, a uma temperatura controlada durante um tempo controlado. O analisador visual também pode ter um elemento de resfriamento para resfriar a mistura de amostra após a etapa de aquecimento. Métodos e composições de agente de contraste exemplificadores que podem ser usados para o processamento de amostras de fluido do sangue são divulgados no Pedido de Patente Copendente US Número , cujo conteúdo é aqui incorporado, por referência.
[000186] Ao operar o analisador visual 17 conforme descrito, através de um número estatisticamente significativo de quadros de imagem de uma corrente de amostra em formato de fita, uma razão proporcional de células em categorias e/ou subcategorias de células pode ser determinada pelo processador 18. As razões proporcionais determinadas a partir do analisador visual 17 são aplicadas às contagens de células do sangue, e os maiores números de células do sangue são contados pelo contador de partículas 15, embora com menos discriminação ou nenhuma discriminação quanto aos membros dentro de uma categoria e/ou subcategoria de células, para fornecer uma contagem de sangue total precisa que explora as vantagens peculiares tanto do contador de partículas 15 quanto do analisador visual 17.
[000187] Além de fornecer resultados precisos, o equipamento com- preendendo um contador de partículas 15 e um analisador visual 17 oferece vantagens significativas para melhorar a velocidade da análise. Na Figura 5, os resultados precisos de contagem de diferentes células do sangue podem ser produzidos através da tela 63. Durante um processo de análise, o operador pode interagir com o processador 18 através de um terminal 65. Anteriormente, até cerca de 25% a 30% dos resultados foram analisados manualmente através da produção de lâminas com o agente de contraste que foram examinadas ao microscópio por um operador. Em comparação, um método exemplificador usando os equipamentos da presente invenção compreende um CBC em um contador de partículas, e a categorização e/ou subcategoriza- ção das células do sangue de acordo com algumas modalidades. Ao operar o equipamento descrito na presente descrição, as imagens podem ser revistas no analisador visual e as amostras exigirão análise manual menos frequente.
[000188] O motor 54 pode compreender um motor de passo orientado com uma precisão um pouco menor do que os recursos distintivos imageados pelo dispositivo de captura de imagens digital, especialmente os aspectos de células do sangue. Desde que o local do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 esteja ajustado para localizar a posição da objetiva óptica no interior da largura da corrente de amostra em formato de fita, a vista da célula/partícula na corrente da amostra em formato de fita está em focalização. O padrão de foco automático pode ser localizado em uma borda de um campo de visão do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução ou do dispositivo de captura de imagens digital, e não interfere com a visualização por esta razão.
[000189] Ademais, quando o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução é movido sobre a distância de deslocamento e o padrão de foco automático sai de foco, os recursos que aparecem em focali- zação são as células do sangue, em oposição ao padrão de foco automático. De acordo com algumas modalidades, o padrão de foco automático pode ser definido por formatos no campo de visão. Os formatos são formas discretas relativamente delgadas de um tamanho limitado e, portanto, depois de se moverem pela distância de deslocamento, as formas tornam-se substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizadas na corrente de amostra em formato de fita. Uma distância de deslocamento típica pode ser, por exemplo, 50 a 100 μm em uma célula de fluxo dimensionada para aplicações de imagea- mento de hematologia (células do sangue). Em algumas modalidades, o recurso de foco automático mantém o dispositivo de imageamento óptico de alta resolução dentro de 1 μm da distância de focalização ótima.
[000190] As vazões do contorno interno da célula de fluxo e do PIO- AL e da amostra podem ser ajustadas de tal modo que a amostra é formada em uma corrente em formato de fita. A corrente pode ser aproximadamente tão delgada quanto ou mesmo mais delgada que as partículas que estão envolvidas na corrente de amostra em formato de fita. As células brancas do sangue podem ter um diâmetro de cerca de 10 μm, por exemplo. Ao fornecer uma corrente de amostra em formato de fita, com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em formato de fita é estendida pelo fluido de revestimento, ou PIOAL. Surpreendentemente, o estiramento da corrente de amostra em formato de fita ao longo de uma trajetória de fluxo de estreitamento dentro das camadas de PIOAL de viscosidade diferente da corrente de amostra em formato de fita, como uma viscosidade mais elevada, vantajosamente, tende a alinhar as partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo, e aplicar forças sobre as células, melhorando os conteúdos em focalização de estruturas intracelulares de células. O eixo óp- tico do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24 é substancialmente normal (perpendicular) ao plano da corrente da amostra em formato de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita no ponto de imagem pode ser, por exemplo, de 20-200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser, por exemplo, de 50-150 mm/segundo.
[000191] A espessura da corrente da amostra em formato de fita pode ser afetada pelas viscosidades relativas e as vazões do fluido de amostra e de PIOAL. A fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do PIOAL, por exemplo, compreendendo bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em vazões controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita 32, isto é, como uma fita delgada, pelo menos, tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento óptico de alta resolução 24.
[000192] Em uma modalidade, a fonte 27 do PIOAL é configurada para fornecer o PIOAL a uma viscosidade predeterminada. A viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra, e pode ser maior que a viscosidade da amostra. A viscosidade e a densidade do PIOAL, a viscosidade do material de amostra, a vazão do PIOAL e a vazão do material de amostra são coordenadas para manter a corrente de amostra em formato de fita a uma distância de deslocamento a partir do padrão de foco automático, e com características dimensionais predeterminadas, como uma espessura da corrente de amostra em formato de fita vantajosa.
[000193] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear maior que a amostra e uma viscosidade maior que a da amostra, estendendo, assim, a amostra na fita plana. A viscosidade de PIOAL pode ser de até 10 centipoises.
[000194] Na modalidade representada na Figura 5, o mesmo processador digital 18 que é usado para analisar a imagem de pixel digital obtida a partir de matriz de fotodetector também é usado para controlar o motor de auto focalização 54. Entretanto, o dispositivo de image- amento óptico de alta resolução 24 não é autofocalizado para cada imagem capturada. O processo de foco automático pode ser realizado periodicamente ou, por exemplo, quando a temperatura ou outras alterações no processo são detectadas por sensores apropriados, ou quando a análise de imagem detecta uma necessidade potencial para refocalização. É também possível, em outras modalidades, ter a análise de imagem de hematologia realizada por um processador e ter um processador separado, opcionalmente, associado com a sua própria matriz de fotodetector, disposta para lidar com as etapas de autofoca- lização para um alvo fixo 44.
[000195] Na Figura 5, o pelo menos um dito processador digital 18 é configurado para autofocalizar em tempos programados ou em condições programadas ou na demanda dos usuários, e também é configurado para realizar a categorização e subcategorização baseada na imagem das partículas. As partículas exemplificadoras incluem as células, as células brancas do sangue, as células vermelhas do sangue e similares.
[000196] Em uma modalidade, o dito pelo menos um processador digital 18 está configurado para detectar um sinal de reiniciação de foco automático. O sinal de reiniciação de foco automático pode ser desencadeado por uma alteração detectada na temperatura, uma diminuição na qualidade do foco como discernido pelos parâmetros dos dados de imagem em pixels, passagem do tempo, ou entrada de usuário. Vantajosamente, não é necessário recalibrar no sentido de medir a distância de deslocamento 52 para recalibrar. Opcionalmente, o foco automático pode ser programado para se recalibrar a certas frequên- cias/intervalos entre as corridas para controle de qualidade e/ou para manter o foco.
[000197] A distância de deslocamento 52 varia ligeiramente de uma célula de fluxo para outra, mas permanece constante para uma dada célula de fluxo. Como um processo de configuração quando ajuntando um analisador de imagem com uma célula de fluxo, a distância de deslocamento é primeiro estimada e, em seguida, durante as etapas de calibração, em que os aspectos de foco automático e de imageamento são exercidos, a distância de deslocamento exata para a célula de flu-xo é determinada e introduzida como uma constante na programação do processador 18.
[000198] Com referência à Figura 6, um equipamento exemplificador 10 para análise de uma amostra 12 contendo as partículas inclui um contador de partículas 15 tendo pelo menos uma faixa de detecção, um analisador 17, e um processador 18 de acordo com algumas modalidades. O diagrama de blocos da Figura 6 é para o propósito de ilustração. O contador de partículas 15, o analisador 17 e o processa-dor 18 podem ou não ser ligados uns aos outros. Em algumas modalidades, o processador pode ser acoplado ao analisador e/ou contador de partículas. Em outras modalidades, o processador pode ser um componente do analisador e/ou contador de partículas.
[000199] O contador de partículas 15 compreende pelo menos um canal, e é configurado para fornecer uma contagem de partículas de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas. Em algumas modalidades, um contador de partículas 15 compreende pelo menos dois canais para diferentes categorias e/ou subcategorias de partículas. Em algumas modalidades, as partículas são contadas através da detecção de impedância elétrica ou espalhamento de luz da amostra. Um exemplo de um contador de partículas adequado 15 inclui, mas não se limita a, um citômetro de fluxo. Em algumas modalidades, a detecção pode ocorrer em cada uma de uma pluralidade de canais responsivos a diferentes propriedades físicas, quer simultaneamente ou sequencialmente.
[000200] O analisador 17 está configurado para diferenciar diferentes categorias e/ou subcategorias e membros correspondentes de cada categoria e/ou subcategoria de partículas. Exemplos de um analisador adequado 17 incluem, mas não se limitam a, um analisador visual, uma câmera digital, ou qualquer outro analisador de dados de pixel que pode capturar dados de pixel, e está programado para discriminar atributos representados em um arquivo de pixel. O processador 18 e o analisador 17 são configurados para aplicar um algoritmo, como a determinação de uma razão proporcional das contagens de duas categorias ou duas subcategorias de partículas correspondentes, e aplicar tal razão proporcional à contagem de partículas de pelo menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas obtidas no pelo menos um canal do contador de partículas 15. Após a análise dos dados, o processador 18 fornece, na saída 20, uma medida precisa da concentração de cada categoria e cada subcategoria correspondente de partículas na amostra 12.
[000201] Em algumas modalidades, na amostra 12, pelo menos, uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas pode estar presente em uma concentração de fora de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas enquanto pelo menos uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente em uma concentração dentro de uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. A concentração da segunda categoria e/ou subcategoria de partículas é determinada no contador de partículas 15. Uma razão proporcional da primeira categoria e/ou subcategoria para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas é determinada no analisador 17. A concentração de partículas na primeira categoria e/ou subcategoria é calculada no processador 18 pelo menos em parte, através da aplicação de uma tal razão proporcional à concentração da segunda categoria e/ou subcategoria de partículas.
[000202] Em algumas modalidades, uma categoria e/ou subcategoria de partículas detectada no pelo menos um canal de contador de partículas 15 pode compreender pelo menos duas classes de partículas. E cada classe de partículas pode compreender uma pluralidade de subclasses. O contador de partículas 15 é configurado para detectar uma pluralidade de partículas que satisfazem um ou mais critérios de seleção, por exemplo, com base em uma faixa de tamanho predeterminada, e para fornecer uma contagem de partículas do mesmo. Os crité-rios de seleção abrangem membros de pelo menos duas classes de partículas. O analisador 17 e o processador 18 são programados para distinguir os membros das pelo menos duas categorias e/ou subcategorias de partículas. Uma distribuição de cada um dos membros sobre pelo menos duas categorias e/ou subcategorias é determinada no processador 18. O processador 18 usa uma tal distribuição para corrigir a contagem das partículas para os membros de pelo menos uma das pelo menos duas categorias e/ou subcategorias obtidas no contador de partículas 15.
[000203] Mais especificamente, o equipamento 10 pode ser usado para identificar e quantificar diferentes células do sangue, incluindo RBCs, WBCs, PLTs, e outras células do sangue, células fetais, ou células bacterianas, partículas virais, parasitas, cistos, incluindo cistos de parasitas, cristais, ou fragmentos dos mesmos ou outros fragmentos celulares na amostra.
[000204] A Figura 6A representa aspectos de um contador exempli- ficador ou módulo de contagem 600a, de acordo com as modalidades da presente invenção. Tais contadores podem operar para controlar ou executar várias funções mecânicas, assim como funções de medição eletrônica e fotométrica de contagem de células de WBC, RBC e PLT e medições de hemoglobina. Os contadores exemplificadores podem ser usados para preparar as amostras para análise de CBC e para gerar medições do parâmetro de CBC através de conjuntos de banho na abertura (por exemplo, banho de WBC 610a e banho de RBC 620a). De acordo com algumas modalidades, o contador 15 da Figura 6 pode ser representado pelo contador 600a da Figura 6A. De modo similar, de acordo com algumas modalidades, o contador 15 da Figura 5 pode ser representado pelo contador 600a da Figura 6A. De acordo com algumas modalidades, o contador 722 da Figura 7 pode ser representado pelo contador 600a da Figura 6A.
[000205] Os elementos celulares do sangue (por exemplo, eritrócitos, leucócitos e plaquetas) podem ser contados com o uso de métodos de impedância elétrica. Por exemplo, uma amostra de sangue total aspirada pode ser dividida em duas alíquotas e misturada com um diluente isotônico. A primeira diluição pode ser entregue ao banho na abertura de RBC (eritrócitos) 620a, e a segunda pode ser entregue ao banho na abertura de WBC (leucócitos) 610a. Na câmara de eritrócitos, os eri- trócitos e plaquetas podem ser contados e discriminados por impedân- cia elétrica, à medida que as células atravessam as aberturas senso- ras. Por exemplo, partículas entre 2 e 20 fL podem ser contadas como plaquetas, e as maiores que 36 fL podem ser contadas como eritróci- tos. Para o processamento da câmara de leucócitos, um reagente de lise de eritrócitos pode ser adicionado à alíquota de diluição de leucócitos para lisar os eritrócitos e liberar hemoglobina, e, então, os leucócitos podem ser contados pela impedância nas aberturas sensoras do banho de leucócitos. Em alguns casos, os banhos podem incluir múltiplas aberturas. Assim, por exemplo, uma contagem de células sanguíneas usada em uma técnica de enumeração de células sanguínea po- de ser obtida com o uso de um banho em aberturas triplas de eritróci- tos.
[000206] Uma técnica exemplificadora de preparação de amostra de hemograma pode incluir dois processos, coleta da amostra e posicionamento da amostra. A coleta da amostra pode ocorrer quando 165 uL da amostra do paciente são aspirados e direcionados a uma Válvula de Amostragem de Sangue (BSV). Uma BSV pode operar para direcionar volumes específicos da amostra do paciente com os reagentes de processamento para distribui-la aos dois banhos em aberturas tri-plas. A amostra do paciente e os reagentes de processamento podem ser colocados no fundo dos banhos de abertura em um ângulo que, com um desenho redondo, permite que a amostra e os reagentes se misturem completamente sem bolhas de misturação. A amostra pode então ser preparada para medição e análise. De acordo com algumas modalidades, no banho de leucócitos, 6,0 mL (±1,0%) do diluente e 28 uL da amostra podem ser combinados com 1,08 mL (±1,0%) de DxH de lisado de célula para uma diluição final de 1:251. De acordo com algumas modalidades, no banho de eritrócitos, 10 mL (±1,0%) do dilu- ente e 1,6 uL da amostra podem ser combinados para uma diluição final de 1:6250. Depois que a amostra do paciente e os reagentes são misturados, vácuo e corrente de abertura podem ser aplicados às aberturas para as medições de contagem de célula e volume de célula. As contagens de eritrócitos e plaquetas podem também incluir a aplicação de fluxo de arraste para evitar a recirculação de células perto da abertura. Em certas modalidades, a captura de dados para os eritrócitos e as plaquetas pode ser de 20 segundos no máximo e para os leucócitos de 10 segundos no máximo. Em certas modalidades, todos os pulsos analógicos gerados pelos conjuntos de abertura podem ser ampliados por um cartão "pré-amp" e, então, enviados a um cartão analisador condicionador de sinal de hemograma para a conversão de analógico para digital e extração de parâmetros. De acordo com algumas modalidades, um sistema pode ser usado para medir múltiplos parâmetros de cada evento celular, e um processo de extração de parâmetro digital pode ser usado para fornecer medições digitais, como tempo, volume (atributos de pulso incluindo amplitude e largura de pulso), contagem e taxa de contagem e tempo de espera. Tais medições podem ser usadas para edição de pulso, correção de coincidência, registro de contagem, geração de histogramas para leucócitos, eritrócitos e plaquetas, registro do histograma, análise de padrão e correção de interferência e similares.
[000207] A Figura 6B é um diagrama de blocos simplificado de um sistema de módulo exemplificador que ilustra amplamente como os elementos individuais do sistema para um sistema de módulo 600b podem ser implementados de uma forma separada ou integrada. O sistema de módulo 600b pode ser parte de, ou estar em conectividade com um sistema de análise de partículas para imageamento de partículas em um fluido de amostra de sangue, de acordo com as modalidades da presente invenção. O sistema de módulo 600b é bem adequado para a produção de dados ou instruções relacionadas com as técnicas de extensão da faixa dinâmica, recebendo entrada relacionadas com as técnicas de extensão da faixa dinâmica, e/ou processamento de informações ou dados relacionados com as técnicas de extensão da faixa dinâmica, conforme descrito neste documento. Em alguns casos, o sistema de módulo 600b inclui elementos de hardware que são acoplados eletricamente através de um subsistema de barra- mento 602b, incluindo um ou mais processadores 604b, um ou mais dispositivos de entrada 606b como dispositivos de entrada da interface de usuário, e/ou um ou mais dispositivos de saída 608b, como os dispositivos de saída da interface de usuário. Em alguns casos, o sistema 600b inclui uma interface de rede 610b, e/ou uma interface de sistema de analisador/contador 640b que pode receber sinais de e/ou transmitir sinais para um sistema de analisador/contador 642b. Em alguns casos, um sistema de analisador/contador 642b pode incluir um analisador 17 e/ou um contador de partículas 15, conforme representado na Figura 6. Em alguns casos, o sistema 600b inclui elementos de software, por exemplo, mostrados aqui como sendo localizados presentemente dentro de uma memória de trabalho 612b de uma memória 614b, um sistema operacional 616b, e/ou outro código 618b, como um programa configurado para implementar um ou mais aspectos das técnicas apresentadas na presente invenção.
[000208] Em algumas modalidades, o sistema de módulo 600b pode incluir um subsistema de armazenamento 620b que pode armazenar os construtos básicos de programação e dados que fornecem a funcionalidade das várias técnicas apresentadas na presente invenção. Por exemplo, os módulos de software implementando a funcionalidade dos aspectos do método, conforme descrito aqui, podem ser armazenados no subsistema de armazenamento 620b. Esses módulos de software podem ser executados por um ou mais processadores 604b. Em um ambiente distribuído, os módulos de software podem ser armazenados em uma pluralidade de sistemas de computador e executados por processadores da pluralidade de sistemas de computador. O subsistema de armazenamento 620b pode incluir o subsistema de memória 622b e o subsistema de armazenamento de arquivo 628b. O subsistema de memória 622b pode incluir inúmeras memórias incluindo uma memória de acesso aleatório principal (RAM) 626b para armazenamento das instruções e dados durante a execução do programa e uma memória somente de leitura (ROM) 624b na qual as instruções fixas são arma-zenadas. O subsistema de armazenamento de arquivo 628b pode fornecer armazenamento persistente (não volátil) para arquivos de programa e dados e pode incluir meios de armazenamento tangíveis que podem, opcionalmente, incluir dados de amostra, do paciente, tratamento, avaliação, entre outros. O subsistema de armazenamento de arquivo 628b pode incluir uma unidade de disco rígido, uma unidade de disco flexível (disquete) juntamente com meios associados removíveis, uma Memória Somente de Leitura (CD-ROM), uma unidade óptica, DVD, CD-R, CD RW, memória removível de estado sólido, outros cartuchos ou discos de meio removíveis e similares. Uma ou mais dentre as unidades podem estar situadas em locais remotos em outros computadores conectados em outros sítios acoplados ao sistema de módulo 600b. Em alguns casos, os sistemas podem incluir um meio de armazenamento legível por computador ou outro meio de armazenamento tangível que armazena uma ou mais sequências de instruções que, quando executado por um ou mais processadores, pode fazer com que o um ou mais processadores executem qualquer aspecto das técnicas ou métodos apresentados na presente invenção. Um ou mais módulos implementando a funcionalidade das técnicas apresentadas na presente invenção podem ser armazenados pelo subsistema de armazenamento de arquivo 628b. Em algumas modalidades, o software ou código fornecerão o protocolo para permitir que o sistema de módulo 600b se comunique com a rede de comunicação 630b. Opcionalmente, essas comunicações podem incluir comunicações por conexão por discagem ou conexão de Internet.
[000209] É entendido que o sistema 600b pode ser configurado para executar vários aspectos dos métodos da presente invenção. Por exemplo, o módulo ou componente do processador 604b pode ser um módulo de controle de microprocessador configurado para receber sinais ou dados de um módulo ou dispositivo de entrada do sensor 632b, de um módulo ou dispositivo de entrada de interface de usuário 606b, e/ou de um sistema de analisador/contador 642b, opcionalmente, através de uma interface de sistema de analisador/contador 640b e/ou uma interface de rede 610b e uma rede de comunicação 630b. Em alguns casos, o(s) dispositivo(s) de entrada do sensor pode incluir ou ser parte de um sistema de análise de partículas que está equipado para obter imagens de amostras de fluidos de sangue. Em alguns casos, o(s) dispositivo(s) de entrada de interface de usuário 606b e/ou interface de rede 610b pode ser configurado para receber sinais de parâmetros de imagem gerados por um sistema de análise de partículas que está equipado para obter parâmetros de imagem. Em alguns casos, o sistema de analisador/contador 642b pode incluir ou ser parte de um sistema de análise de partículas que está equipado para obter parâmetros de imagem e/ou parâmetros de contagem relacionados com as amostras de fluido de sangue.
[000210] O módulo ou componente do processador 604b pode também ser configurado para transmitir sinais de parâmetros de análise de partículas ou sinais de parâmetros de imagem, opcionalmente processados de acordo com qualquer uma das técnicas aqui apresentadas, para o módulo ou dispositivo de saída de sensor 636b, para o módulo ou dispositivo de saída de interface de usuário 608b, para o módulo ou dispositivo de interface de rede 610b, para o módulo ou dispositivo de interface de rede 640b, ou qualquer combinação dos mesmos. Cada um dos dispositivos ou módulos de acordo com as modalidades da presente invenção pode incluir um ou mais módulos de software em um meio legível por computador que é processado por um processador, ou módulos de hardware, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer um dentre uma variedade de plataformas comumente usa-das, como Windows, MacIntosh e Unix, juntamente com qualquer dentre uma variedade de linguagens de programação comumente usadas, pode ser usada para implementar modalidades da presente invenção.
[000211] Os dispositivos de entrada da interface de usuário 606b podem incluir, por exemplo, um touchpad, um teclado, dispositivos para apontar como um mouse, um trackball, um tablet de gráficos, um es- câner, um joystick, um toque de tela incorporado em uma tela, dispositivos de entrada de áudio como sistemas de reconhecimento de voz, microfones, e outros tipos de dispositivos de entrada. Os dispositivos de entrada de usuário 606b podem também baixar um código executável por computador a partir de um meio de armazenamento tangível ou a partir de uma rede de comunicação 630b, o código incluindo qualquer um dos métodos ou aspectos do mesmo apresentados na presente invenção. Será entendido que o software do terminal pode ser atualizado de tempos em tempos e baixado para o terminal, conforme for adequado. Em geral, o uso do termo "dispositivo de entrada" destina-se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e proprietários e formas para inserir as informações em um sistema de módulo 600b.
[000212] Os dispositivos de saída da interface de usuário 606b podem incluir, por exemplo, um subsistema de exibição, uma impressora, um aparelho de fax, ou exibições não visuais, como dispositivos de saída de áudio. O subsistema de exibição pode ser um tubo de raios catódicos (TRC), um dispositivo de painel plano, como uma tela de cristal líquido (LCD), um dispositivo de projeção, ou similares. O subsistema de exibição pode também fornecer uma exibição não visual, como através de dispositivos de saída de áudio. Em geral, o uso do termo “dispositivo de saída” destina-se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e proprietários e formas para fornecer informações do sistema de módulo 600b para um usuário.
[000213] O subsistema de barramento 602b fornece um mecanismo para deixar os vários componentes e subsistemas do sistema de módulo 600b se comunicarem uns com os outros, conforme intencionado ou desejado. Os vários subsistemas e componentes do sistema de módulo 600b não precisam estar no mesmo local físico, mas podem estar distribuídos em vários locais dentro de uma rede distribuída. Embora o subsistema de barramento 602b seja mostrado esquematicamente como um barramento único, modalidades alternativas do subsistema de barramento podem usar múltiplos barramentos.
[000214] A interface de rede 610b pode fornecer uma interface para uma rede externa 630b ou outros dispositivos. A rede de comunicação externa 630b pode ser configurada para efetuar comunicações, conforme necessário ou desejado, com terceiros. Dessa forma, ela pode receber um pacote eletrônico do sistema módulo 600b e transmitir qualquer informação, conforme necessário ou desejado, de volta para o sistema de módulo 600b. Como mostrado aqui, a rede de comunicação 630b e/ou interface de sistema analisador/contador 642b pode transmitir informações ou receber informações de um sistema analisador /contador 642b que é equipado para obter imagens ou parâmetros de imagem e/ou parâmetros de contagem correspondentes para as amostras de fluido de sangue.
[000215] Além de fornecer essa infraestrutura aos links de comunicações internos ao sistema, o sistema de rede de comunicações 630b pode também fornecer uma conexão com outras redes, como a Internet, e pode compreender uma conexão com fio, sem fio, por modem e/ou por outro tipo de conexão de interface.
[000216] Ficará aparente ao versado na técnica que variações consideráveis podem ser usadas de acordo com requisitos específicos. Por exemplo, hardware personalizado também poderá ser usado e/ou elementos específicos poderão ser implementados no hardware, software (incluindo software portátil, como applets), ou ambos. Adicionalmente, a conexão com outros dispositivos de computação, como dispositivos de entrada/saída de rede, pode ser usada. O próprio sistema de módulo terminal 600b pode ser de diferentes tipos, incluindo um terminal de computador, um computador pessoal, um computador por- tátil, uma estação de trabalho, um computador de rede, ou qualquer outro sistema de processamento de dados. Devido à natureza variável dos computadores e redes, a descrição do sistema de módulo 600b representada na Figura 6B serve apenas como um exemplo específico para propósitos de ilustrar uma ou mais modalidades da presente invenção. Várias outras configurações do sistema de módulo 600b são possíveis tendo mais ou menos componentes que o sistema de módulo representado na Figura 6B. Quaisquer dentre os módulos ou componentes do sistema de módulo 600b, ou quaisquer combinações desses módulos ou componentes, podem ser acoplados ou integrados, ou de outro modo configurados para estar em conectividade com qualquer uma das modalidades do sistema de formação de imagens e/ou de análise partículas apresentadas na presente invenção. Da mesma forma, qualquer um dos componentes de hardware e software discutidos acima pode ser integrado com ou configurado para interfacear com outro sistema de avaliação médica ou de tratamento usado em outros locais.
[000217] Em algumas modalidades, o sistema de módulo 600b pode ser configurado para receber um ou mais parâmetros de imagem de uma amostra de fluido de sangue de em um módulo de entrada. Os dados de parâmetros da imagem podem ser transmitidos para um módulo de avaliação em que os resultados de diagnóstico ou outros podem ser previstos ou determinados com base na análise dos dados de imagem. Os dados de imagem ou de diagnóstico podem ser fornecidos para um usuário do sistema através de um módulo de saída. Em alguns casos, o sistema de módulo 600b pode determinar resultados de diagnóstico para uma amostra de fluido de sangue, por exemplo, usando um módulo de diagnóstico. As informações de diagnóstico podem ser fornecidas a um usuário do sistema através de um módulo de saída. Opcionalmente, certos aspectos de diagnóstico podem ser de- terminados por um dispositivo de saída, e transmitidos a um sistema de diagnóstico ou um subdispositivo de um sistema de diagnóstico. Qualquer um de uma variedade de dados relacionados com as amostras de fluido de sangue ou de pacientes dos quais as amostras são obtidas pode ser introduzida para o sistema de módulo, incluindo a idade, peso, sexo, história de tratamento, história médica, e similares. Os parâmetros dos regimes de tratamento ou avaliações diagnósticas podem ser determinados com base nesses dados.
[000218] De um modo semelhante, em alguns casos, um sistema inclui um processador configurado para receber os dados de imagem de entrada. Opcionalmente, um processador, meio de armazenamento, ou ambos, podem ser incorporados dentro de uma máquina de hematologia ou de análise de partículas. Em alguns casos, a máquina de hematologia pode gerar dados de imagem ou outra informação para entrada no processador. Em alguns casos, um processador, um meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado em um computador, e o computador pode estar em comunicação com uma máquina de hematologia. Em alguns casos, um processador, um meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado em um computador, e o computador pode estar em comunicação remota com um equipamento de hematologia através de uma rede.
[000219] A Figura 7 representa aspectos de sistemas e métodos para medir uma quantidade de um primeiro tipo de células em uma amostra de fluido de sangue, em que a amostra também inclui um segundo tipo de células, de acordo com as modalidades da presente invenção. Conforme mostrado aqui, o método 700 pode incluir a obtenção de um primeiro volume de amostra 720 e um segundo volume de amostra 730 a partir da amostra de fluido de sangue 710. Como indicado na etapa 724, o método pode incluir a determinação de uma população do segundo tipo de células no primeiro volume 720 da amos- tra fluindo o primeiro volume através de um contador de células de hematologia 722. Frequentemente, o contador de células 722 é adequado para a contagem de células com precisão quando há uma quantidade suficiente de um tipo eletricamente distinguível de células na amostra, e não quando a quantidade do tipo de célula excede um certo limite ou limiar. Os contadores de células podem ser usados para contar células vermelhas do sangue ou o número total de outros componentes (por exemplo, componentes grandes) em uma amostra de sangue em um curto período de tempo. Em alguns casos, os contadores de células podem encontrar desafios ao discriminar entre células brancas do sangue e outros componentes (por exemplo, componentes grandes) no sangue, ou pelo fato de que pode haver várias espécies diferentes, mas com um número relativamente pequeno de cada.
[000220] Além disso, o método 700 pode incluir a obtenção de imagens de um primeiro número dos primeiros tipos de células e um segundo número dos segundos tipos de células, conforme indicado pela etapa 732, através da injeção do segundo volume 730 da amostra para um fluido de revestimento que flui no interior de uma célula de fluxo de modo a fornecer uma corrente de amostra tendo uma espessura e uma largura maior que a espessura, as imagens capturadas sendo capturadas ao longo de uma trajetória de imagem que atravessa a espessura da corrente da amostra. Em alguns casos, a captura de imagem 732 pode ser realizada usando um analisador 17 conforme representado na Figura 5 e/ou Figura 6. Em alguns casos, os analisadores podem discriminar eficientemente entre as células brancas do sangue, plaquetas gigantes, e outros componentes grandes na amostra de fluido de sangue. Entretanto, pode haver desafios ao usar tais analisadores para obter uma contagem completa das partículas em uma amostra. Adicionalmente, em alguns casos pode não ser desejável usar o analisador para obter determinadas contagens (por exemplo, uma con- tagem de todas as células vermelhas do sangue) porque tais procedimentos de contagem podem também envolver a execução de uma caracterização das partículas, além de obter a contagem. De acordo com algumas modalidades, o analisador é usado para obtenção de imagens para apenas uma porcentagem ou porção da amostra que é processada através do analisador.
[000221] Conforme representado na Figura 7, o método 700 pode incluir a determinação de uma razão entre o primeiro número do primeiro tipo de células 734 para o segundo número do segundo tipo de células 736, usando as imagens capturadas, como indicado na etapa 738. Os métodos também incluem calcular uma medida de quantidade de células do primeiro tipo de células na amostra usando a razão 738 e a população do segundo tipo de células 724, como indicado na etapa 740.
[000222] De acordo com algumas modalidades, a medida da quantidade de células calculada na etapa 740 é uma concentração de células para o primeiro tipo de células na amostra de fluido de sangue 710. Em alguns casos, a medida da quantidade de células calculada na etapa 740 é uma contagem de células para o primeiro tipo de células na amostra de fluido de sangue 710. Em alguns casos, o contador de células 722 tem uma primeira precisão associada com a contagem do primeiro tipo de células e uma segunda precisão associada com o segundo tipo de células, onde a segunda precisão é superior a ou maior que a primeira precisão. Em alguns casos, (consulte, por exemplo, Figuras 10A e 10B) o contador de células de hematologia 722 tem uma faixa de precisão desejada, e a faixa de precisão desejada estende-se entre uma população mínima de células no primeiro volume 720 e uma população máxima de células no primeiro volume 720, em que a população do segundo tipo de células no volume determinado na etapa 724 está dentro da faixa de precisão desejada, e em que a quantidade de células medida do primeiro tipo de células da amostra calculado na etapa 740 está fora da faixa de precisão desejada.
[000223] Como adicionalmente representado na Figura 7, (e com referência continuada às Figuras 10A e 10B) os métodos podem incluir, opcionalmente, determinar uma população do primeiro tipo de células 726 no primeiro volume da amostra como resultado do fluxo do primeiro volume através do contador de células de hematologia 722. A população determinada do primeiro tipo de células 726 no primeiro volume pode estar acima ou abaixo de uma faixa de precisão desejada para o primeiro tipo de células, e pode também ser diferente da quantidade medida do primeiro tipo de células como calculado na etapa 740. Em alguns casos, (por exemplo, FIG 10A), a população determinada do primeiro tipo de células 726 é zero. Em alguns casos, (por exemplo, Figura 10B), a população determinada do primeiro tipo de células 726 é maior que zero.
[000224] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o contador de células de hematologia 722 pode incluir um mecanismo sensor que detecta uma alteração na impedância elétrica em resposta a um segundo tipo de célula que flui através do contador de células. De acordo com algumas modalidades, o contador de células de hematologia 722 inclui um mecanismo sensor que detecta uma obstrução de uma trajetória de luz em resposta a um segundo tipo de células que flui através do contador de células.
[000225] Em alguns casos, o contador de células de hematologia 722 tem um limite mínimo de concentração detectável e um limite máximo de concentração detectável para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de concentração detectável e um limite máximo de concentração detectável para o segundo tipo de células. A população determinada do segundo tipo de células 724 pode ser baseada em um parâmetro de concentração detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células. O primeiro tipo de células pode estar presente em uma concentração que está quer abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células.
[000226] Em alguns casos, o contador de células de hematologia 722 tem um limite mínimo de volume detectável e um limite máximo de volume detectável para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de volume detectável e um limite máximo de volume detectável para o segundo tipo de células. A população determinada do segundo tipo de células 724 pode ser baseada em um parâmetro de volume detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células. O primeiro tipo de célula pode estar presente em um parâmetro do volume que está quer abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células.
[000227] Em alguns casos, o contador de células de hematologia 722 tem um limite mínimo de tamanho detectável e um limite máximo de tamanho detectável para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de tamanho detectável e um tamanho máximo de volume detec- tável para o segundo tipo de células. A população determinada do segundo tipo de células 724 pode ser baseada em um parâmetro de tamanho detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células. O primeiro tipo de células pode estar presente em um parâmetro de tamanho que está quer abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células. De acordo com algumas modalidades da presente invenção, (consulte as figuras 13b, c), a determinação da população do segundo tipo de células 724 no primeiro volume da amostra inclui agrupar juntas as células do primeiro tipo de células e células do segundo tipo de células. Em alguns casos, os métodos também podem incluir calcular uma medida de quantidade de células do segundo tipo de células na amostra usando a razão e a população do segundo tipo de células. Em alguns casos (por exemplo, conforme representado na Figura 10D), a determinação da população do segundo tipo de células 724 no primeiro volume da amostra inclui agrupar juntas as células do primeiro tipo de células e as células do segundo tipo de células, e determinar uma população do primeiro tipo de células 726 no primeiro volume da amostra como resultado do fluxo do primeiro volume através do contador de células de hematologia 722. A medida da quantidade de células do primeiro tipo de células na amostra como calculado na etapa 740 pode usar a razão 738, a população do segundo tipo de células 724, e a população do primeiro tipo de células 726.
[000228] Em outros aspectos, por exemplo conforme representado na Figura 8 e/ou Figuras 10A e 10B, um método é fornecido para analisar uma amostra que contém partículas. Em tal método, uma amostra é fornecida sobre um contador de partículas tendo limites de detecção, como indicado na etapa 72 no método 70 da Figura 8. Pelo menos uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas pode estar presente na amostra em uma concentração fora de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas, e pelo menos uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro de uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. A concentração da segunda categoria e/ou subcategoria de partículas na amostra é determinada com o contador de partículas, como indicado na etapa 74. A amostra é também fornecida para um analisador para determinar uma razão proporcional da primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas, como indicado na etapa 76. A concentração de partículas na primeira categoria e/ou subcategoria pode ser então calculada, pelo menos em parte, pela aplicação da razão proporcional à concentração da segunda categoria e/ou subcategoria de partículas, como indicado na etapa 78. A Figura 10A mostra a detecção de partículas em uma amostra abaixo da faixa de detecção, e a Figura 10B mostra a detecção de partículas presentes em uma amostra acima da faixa de detecção.
[000229] A Figura 8, portanto, ilustra um método exemplificador 70 de determinação da concentração da primeira categoria de partículas, que está presente em uma amostra em uma concentração fora de uma faixa de detecção de um contador de partículas, de acordo com algumas modalidades. Na etapa 72, referindo-se também às Figuras 6 e 8, uma amostra 12 é fornecida sobre um contador de partículas 15, que tem pelo menos uma faixa de detecção. A amostra 12 inclui partículas, que podem ser dispersas em um fluido. Em algumas modalidades, a primeira categoria de partículas está presente na amostra em uma concentração acima de um limite superior de uma faixa de detecção aplicável para a primeira categoria de partículas. A segunda categoria de partículas está presente na amostra dentro de uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria de partículas. Por exemplo, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas pode incluir WBCs. A segunda categoria de partículas pode incluir plaquetas.
[000230] Em algumas modalidades, a primeira categoria de partículas está presente na amostra em uma concentração abaixo de um limite inferior de uma faixa detectável aplicável à primeira categoria de partículas. A segunda categoria de partículas está presente na amostra dentro de uma faixa de detecção aplicável à segunda categoria de partículas. Por exemplo, a primeira categoria de partículas compreende plaquetas. A segunda categoria de partículas compreende células brancas do sangue.
[000231] Na etapa 74 da Figura 8, a concentração da segunda categoria de partículas na amostra 12 é determinada no contador de partículas 15. O contador de partículas pode compreender pelo menos um canal. A segunda categoria de partículas é medida em um dos canais em algumas modalidades. O contador de partículas pode compreender pelo menos dois canais em algumas modalidades. A primeira categoria de partículas, se a concentração está dentro de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria de partículas, pode ser contada em um outro canal.
[000232] Na etapa 76 da Figura 8, a amostra 12 é fornecida para um analisador, como um analisador visual 17 (por exemplo, conforme representado nas Figuras 5 ou 6), para determinar uma razão proporcional da primeira categoria de partículas para a segunda categoria de partículas. Em algumas modalidades, o analisador visual 17 compreende uma célula de fluxo 22 conectada a um dispositivo de imagea- mento conforme descrito acima. A razão proporcional da primeira categoria de partículas para a segunda categoria de partículas pode ser determinada de acordo com o método descrito aqui. Por exemplo, pelo menos um produto químico, incluindo pelo menos um de um diluente, um agente de permeabilização, e um agente de contraste pode ser introduzido para a amostra. Exemplos de produtos químicos, composições, agentes de contraste, e composições relacionadas que podem ser usados para o processamento de amostras de fluido do sangue são discutidos no pedido de patente copendente US n°. , cujo conteúdo é aqui incorporado, por referência. O agente de contraste pode ser eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam as primeiras categorias e/ou subcategorias da segunda categoria e/ou subcategorias de partículas. A amostra preparada 12B representada na Figura 5 pode ser aplicada a pelo menos uma célula de fluxo 22 em algumas modalidades. Imagens de partículas da amostra preparada 12B são capturadas. Uma análise de imagem é realizada pelo analisador que pode ser um analisador visual 17 e/ou processador 18. Uma razão proporcional da primeira categoria de partículas para a segunda categoria de partículas é então determinada através da análise da pluralidade de imagens da corrente de amostra em formato de fita.
[000233] Na etapa 78 da Figura 8, a concentração de partículas na primeira categoria pode ser então calculada pelo processador 18 (por exemplo, conforme representado na Figura 6), pelo menos em parte, pela aplicação da razão proporcional à concentração da segunda categoria de partículas.
[000234] A presente descrição também fornece métodos para analisar uma amostra contendo partículas. A Figura 9 ilustra um processo exemplificador 80 de determinação da concentração de duas subcategorias de partículas, cujas partículas não podem ser distinguidas pelo contador de partículas, de acordo com algumas modalidades. Na etapa 82, uma amostra (por exemplo, amostra 12 da Figura 6) é fornecida para um contador de partículas (por exemplo, contador de partículas 15 da Figura 6), que tem um critério de detecção que é atendido por pelo menos duas categorias ou subcategorias de partículas que se deseja distinguir. Os resultados do contador de partículas abrangem estas categorias ou subcategorias dentro de uma única contagem na etapa 84 da Figura 9.
[000235] Na etapa 86, a amostra é fornecida para o analisador (como um analisador visual) para determinar uma razão proporcional da primeira categoria ou subcategoria de partículas para a segunda categoria ou subcategoria de partículas. Em algumas modalidades, por exemplo, conforme representado nas Figuras 5 e/ou 6, um analisador visual 17 inclui uma célula de fluxo 22 conectada a um dispositivo de imageamento.
[000236] A razão proporcional da primeira categoria ou subcategoria de partículas para a segunda categoria ou subcategoria de partículas pode ser determinada de acordo com métodos aqui descritos. Pelo menos um produto químico que compreende pelo menos um de um diluente, um agente de permeabilização e um agente de contraste é introduzido na amostra. O agente de contraste é eficaz para gerar dis-tinções visuais para categorização e subcategorização das partículas que diferenciam a primeira categoria ou subcategoria da segunda categoria ou subcategoria de partículas. Conforme representado na Figura 5, a amostra preparada 12B pode ser aplicada a pelo menos uma célula de fluxo 22 em algumas modalidades. Imagens de partículas da amostra preparada 12B são capturadas. Uma análise de imagem é realizada pelo analisador visual e/ou processador 18. Uma razão proporcional da pelo menos primeira subcategoria de partículas para a segunda subcategoria de partículas é então determinada através da análise da pluralidade de imagens.
[000237] Na etapa 88 da Figura 9, a concentração das partículas na primeira categoria ou subcategoria pode ser então calculada pelo processador 18, conforme representado na Figuras 5 ou 6, pelo menos em parte, pela aplicação da razão proporcional à contagem única (por exemplo, etapa 84 da Figura 9) obtida a partir do contador de partículas.
[000238] Em algumas modalidades, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra em uma concentração acima do limite superior de uma faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro da faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Por exemplo, a primeira categoria de partículas compreende células brancas do sangue. A segunda categoria de partículas com-preende plaquetas. Conforme ilustrado na Figura 10B, a contagem de partículas a partir do analisador da presente descrição pode ser usada para corrigir contagens de partículas imprecisas associadas com pelo menos uma faixa de detecção usada pelo contador de partículas, como a concentração, volume e/ou tamanho de partículas. Ao operar o equipamento descrito na presente descrição, as partículas presentes em quantidades acima do limite superior da faixa de detecção podem ser detectadas e medidas com precisão.
[000239] Em algumas modalidades, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra abaixo de um limite inferior de uma faixa detectável de algum parâmetro, por exemplo, concentração, aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas, conforme ilustrado na Figura 10A. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro da faixa de detecção aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Conforme ilustrado na Figura 10A, a razão proporcional da contagem de partículas nas duas categorias e/ou subcategorias do analisador da presente descrição pode ser usada para corrigir as contagens imprecisas do contador de partículas para pelo menos uma categoria e/ou subcategoria. Ao operar o equipamento descrito na presente descrição, as partículas presentes abaixo do limite da faixa de detecção, que não são detectadas pelo contador de partículas, podem ser medidas com precisão.
[000240] Conforme mostrado na Figura 10A, o contador de partículas fornece uma contagem de partículas para a categoria 2. O analisador fornece uma razão proporcional de contagem de partículas para as categorias 1 e 2. Ao multiplicar a razão proporcional vezes a contagem de partículas para a categoria 2, o processo chega na contagem de partículas para a categoria 1. A primeira categoria e/ou subcategoria de partículas pode compreender, por exemplo, plaquetas. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas compreendem células bran cas do sangue. De acordo com algumas modalidades, os sistemas e método de extensões de faixa dinâmica ou de detecção aqui descritos podem ser usados para obter a contagem de plaquetas precisa quando o número de plaquetas contidas na amostra é baixo.
[000241] Em algumas modalidades, o analisador inclui um dispositivo de imageamento e uma célula de fluxo conectados ao dispositivo de imageamento para determinar uma razão proporcional da primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Pelo menos um de um diluente, um agente de permeabilização, um agente de contraste é introduzido para a amostra. O pelo menos um produto químico é eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam as primeira e segunda categorias e/ou subcategorias de partículas. Em uma etapa de determinação tal como uma razão proporcional, a amostra é aplicada a pelo menos uma célula de fluxo presente em algumas modalidades. Uma pluralidade de imagens de partículas da amostra é capturada para fornecer uma estimativa estatisticamente significativa de uma razão de contagem ou proporcional. Uma razão proporcional da pelo menos primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou sub-categoria de partículas é então determinada por contagem das partículas em cada uma das primeira e segunda categorias e/ou subcategorias de partículas.
[000242] Em um outro aspecto, conforme representado na Figura 9 e/ou Figura 10D, um método 80 para a análise de uma amostra que contém partículas é fornecido para corrigir a contagem de partículas obtida em um contador de partículas. Por exemplo, os resultados do analisador, por exemplo, a contagem relativa, da presente descrição podem ser usados para se obter contagens de partículas precisas das categorias e/ou subcategorias de partículas que não podem ser diferenciadas pelo critério de detecção ou critérios usados pelo contador de partículas sozinho.
[000243] Em uma outra modalidade mostrada na Figura 10C, o contador pode fornecer uma contagem substancialmente precisa para uma pluralidade de partículas. A pluralidade de partículas abrange membros de pelo menos duas subcategorias, mas a contagem não distingue entre as subcategorias. A distribuição de cada um dos membros de pelo menos duas subcategorias pode ser determinada com um analisador. A distribuição das subcategorias é a razão proporcional das contagens das subcategorias respectivas para o total. Um processador é programado para distinguir os membros de pelo menos duas subcategorias. Usando a distribuição do analisador e a contagem total de partículas do contador de partículas, por exemplo, conforme representado na Figura 10C, a contagem de partículas para os membros de pelo menos uma das pelo menos duas subcategorias pode então ser determinada pelo processador usando a distribuição de cada um dos membros.
[000244] De acordo com algumas modalidades, conforme representado na Figura 10D, a amostra pode ter duas categorias de partículas presentes. Neste contexto, as categorias podem ser interpretadas de forma a incluir a possibilidade de múltiplas categorias e/ou múltiplas subcategorias. Ao operar o equipamento descrito na presente descrição, a correção pode ser feita para a contagem de partículas onde pelo menos alguns membros de pelo menos uma categoria adicional de partículas são categorizadas ou subcategorizadas incorretamente, pelo contador de partículas, como membros de uma primeira categoria de partículas. Em tal método, a contagem para uma pluralidade de partículas pode ser determinada usando uma faixa predeterminada, por exemplo, faixa de tamanho e/ou de volumes, para fornecer contagens de partículas da mesma com um contador de partículas. A faixa predeterminada agrupa juntos os membros de uma primeira categoria de partículas e pelo menos alguns membros de pelo menos uma segunda categoria de partículas na contagem de partículas. Essas partículas em uma ou mais categorias ou subcategorias, que são incorretamente contadas como uma outra categoria de partículas em um canal do equipamento, podem ser medidas separadamente e com precisão usando o analisador configurado para distinguir uma distribuição das partículas sobre a primeira categoria de partículas e a pelo menos uma segunda categoria de partículas na amostra. A distribuição das categorias e/ou subcategorias é a razão proporcional das contagens das respectivas categorias e/ou subcategorias para o total. O processador usa, então, a distribuição para calcular a contagem de partículas para os membros da primeira categoria e a pelo menos uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Nestas modalidades, conforme ilustrado na Figura 10D, o equipamento e os métodos da presente descrição e a contagem de partículas em cada uma das categorias e/ou subcategoria pode ser corrigida.
[000245] Conforme mostrado na Figura 10D, o contador de partículas pode fornecer uma contagem total substancialmente precisa que compreende duas categorias. Esta contagem pode incluir contagens presumidas para as categorias 1 e 2. Entretanto, a contagem presumida é imprecisa pelo fato de que o contador de partículas classificou erroneamente pelo menos um membro da categoria 2 com a categoria 1. O analisador fornece uma distribuição de contagens de partículas com base em uma amostra menor que do que a usada no contador de partículas, para as categorias 1 e 2, mas o analisador produz uma distribuição precisa. O processador usa essas informações para chegar a uma contagem precisa para ambas as categorias. Este mesmo processo pode ser usado para as amostras contendo mais do que duas categorias e/ou subcategorias de partículas.
[000246] Por exemplo, os membros de diferentes categorias ou sub- categorias de partículas com tamanho ou morfologia semelhante não podem ser categorizados ou subcategorizados com precisão pelo contador de partículas. Por exemplo, as PLTs "gigantes", os agregados de PLT, nódulos, múltiplas plaquetas e RBCs nucleadas podem ser erroneamente contados como WBCs, resultando em uma contagem de WBCs maior que realmente existe na amostra. Como um outro exemplo, as células vermelhas microcíticas, fragmentos celulares, artefatos, e mesmo o ruído eletrônico podem ser erroneamente contados como plaquetas, resultando em uma contagem elevada imprecisa de PLTs.
[000247] Em algumas modalidades, o analisador é um analisador visual que compreende um dispositivo de imageamento e uma célula de fluxo. Como um exemplo, pelo menos um produto químico compreendendo pelo menos um de um diluente, um agente de permeabiliza- ção, um agente de contraste é introduzido para a amostra. O pelo menos um produto químico é eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam a primeira categoria e/ou subcategoria e a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Em uma etapa de determinação de uma tal distribuição, a amostra é aplicada a pelo menos uma célula de fluxo presente em algumas modalidades.
[000248] Na etapa de determinar uma distribuição de cada um dos membros de pelo menos duas categorias e/ou subcategorias de partículas, pelo menos uma parte da amostra é aplicada em pelo menos uma célula de fluxo. O pelo menos um produto químico é eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam os membros das categorias e/ou subcategorias de partículas. Uma pluralidade de imageamento de partículas da amostra é capturada. Uma pluralidade de imagens de partículas da amostra é capturada para fornecer uma estimativa estatisticamente significativa de uma contagem ou razão proporcional. Uma razão proporcional da pelo menos primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas é então determinada por contagem das partículas em cada uma das primeira e segunda categorias e/ou subcategorias de partículas.
[000249] Uma razão proporcional dos membros de cada uma das duas ou mais subcategorias de partículas dentro de uma categoria e/ou subcategoria de partículas, e/ou uma razão proporcional dos membros de uma primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para os membros de pelo menos uma outra categoria e/ou subcategoria de partículas pode ser determinada, com base na pluralidade de imagens de partículas da amostra. Um valor de contagem ou concen-tração para cada categoria e/ou subcategoria de partículas pode ser calculado, estimado, inferido e/ou derivado. Como exemplo, a concentração de subcategorias de partículas pode ser determinada com base na razão proporcional de cada subcategoria de partículas do analisador, e na contagem do número total de partículas na categoria do contador de partículas. Em algumas modalidades, os membros de pelo menos duas subcategorias compreendem pelo menos um tipo de partículas selecionadas de um grupo que consiste em subcategorias de células brancas do sangue, plaquetas e células vermelhas do sangue.
[000250] Consequentemente, em algumas modalidades, o método compreende ainda determinar uma razão proporcional da contagem de partículas em uma categoria e/ou subcategoria de partículas presentes em uma concentração fora de uma faixa de detecção aplicável para uma categoria de partículas do contador das partículas versus a contagem de partículas em uma segunda categoria e/ou subcategoria de partículas que está dentro de uma faixa de detecção aplicável à se-gunda categoria e/ou subcategoria de partículas, com base na pluralidade de imagens de partículas da amostra do analisador e/ou do processador. A concentração na amostra da categoria e/ou subcategoria de partículas fora da faixa de detecção do contador de partículas pode ser então determinada, através da aplicação da razão proporcional à contagem de partículas obtida no contador de partículas. Por exemplo, em algumas modalidades, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra em uma concentração acima de um limite superior da faixa de detecção aplicável à primeira categoria e/ou subcategoria de partículas. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas está presente na amostra dentro da faixa de detecção do contador de partículas (abaixo de um limite superior e acima do limite inferior da faixa de detecção) aplicável à segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Como outro exemplo, quando os critérios, ou critério, de detecção usados pelo contador de partículas categorizarem erroneamente as partículas pelo agrupamento de partículas de uma primeira categoria e/ou subcategoria com partículas de pelo menos uma segunda categoria e/ou subcategoria, a contagem de partículas para as primeira e segunda categorias e/ou subcategorias pode ser corrigida a partir das razões proporcionais das partículas determinadas a partir da pluralidade de imagens das partículas da amostra do analisador e/ou do processador visual.
[000251] A faixa de detecção de medição pode ser limitada em um contador de partículas 15 sozinho na Figura 6. Por exemplo, o limite de detecção superior para WBCs pode ser menor que 100.000 a 200.000 por μL em um contador de partículas 15. O limite de detecção inferior para PLTs pode ser maior que 10.000 por μL. Ao usar o equipamento aqui descrito, a faixa de detecção eficaz de medição pode ser estendida, por exemplo, o limite de detecção superior para WBCs pode ser estendido até cerca de 300.000, 350.000, 400.000, 410.000, 420.000, 430.000, 440.000, 450.000, 460.000, 470.000, 480.000, 490.000, 500.000, 510.000, 520.000, 530.000, 540.000, 550.000, 560.000, 570.000, 580.000, 590.000, 600.000, 610.000, 620.000, 630.000, 640.000, 650.000, 660.000, 670.000, 680.000, 690.000,  700.000, 710.000, 720.000, 730.000, 740.000, 750.000, 760.000, 770.000, 780.000, 790.000, 800.000, 810.000, 820.000, 830.000, 840.000, 850.000, 860.000, 870.000, 880.000, 890.000, 900.000, 910.000, 920.000, 930.000, 940.000, 950.000, 960.000, 970.000, 980.000, 990.000, ou 1.000.000, 1.000.000, 1.010.000, 1.020.000, 1.030.000, 1.040.000, 1.050.000, 1.060.000, 1.070.000, 1.080.000, 1.090.000, 1.100.000, 1.110.000, 1.120.000, 1.130.000, 1.140.000, 1.150.000, 1.160.000, 1.170.000, 1.180.000, ou ao redor do 1.190.000, células por μL, ou qualquer faixa entre quaisquer dois dos valores, em algumas modalidades. O limite de detecção inferior para PLTs pode ser estendido abaixo para 10.000, 9.500, 9.000, 8.500, 8.000, 7.500, 7.000, 6.500, 6.000, 5.500, 5.000, 4.500, 4.000, 3.500, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500 ou 1.000, ou 500, 400, 300, 200, ou 100 células por μL em algumas modalidades.
[000252] O analisador compreende, de preferência, um analisador visual 17 operável para determinar uma razão proporcional da primeira categoria e/ou subcategoria de partículas para a segunda categoria e/ou subcategoria de partículas. Nesta modalidade, a razão proporcional conforme descrito acima pode ser determinada através da análise da pluralidade de imagens de partículas na amostra tomada no analisador visual 17.
[000253] O analisador visual 17 pode ser configurado para introduzir a amostra pelo menos um produto químico compreendendo pelo menos um de um diluente, um agente de permeabilização e/ou um agente de contraste para gerar distinções visuais para a categorização e sub- categorização das partículas. Tais diferenças visuais diferenciam os membros das pelo menos duas categorias. As imagens de partículas da amostra são capturadas. O analisador visual 17 e o processador 18 são configurados para determinar uma razão proporcional de cada categoria ou subcategoria de partículas, através da discriminação entre as imagens das partículas da amostra. A concentração de cada categoria ou subcategoria de partículas é então calculada. Por exemplo, os resultados precisos de WBCs, PLTs gigantes e NRBCs podem ser determinados. Em um contador de partículas, devido ao tamanho ou morfologia semelhante, as PLTs gigantes e NRBc são contados como WBCs. Ao operar o equipamento descrito, a contagem ou concentração de partículas de PLTs gigantes e nRBCs pode ser relatada com precisão.
[000254] Em algumas modalidades, a amostra pode compreender partículas cujo tamanho está fora de uma faixa de tamanho de detecção do contador de partículas 15. O analisador visual 17 e o processador 18 estão configurados para detectar as partículas e determinar uma razão proporcional das partículas fora de uma faixa de tamanho de detecção para partículas dentro da faixa de detecção de tamanho do contador de partículas 15, com base nas imagens das partículas da amostra. A concentração da categoria e subcategoria de partículas fora da faixa de detecção de tamanho do contador de partículas 15 pode ser então calculada.
[000255] Geralmente, os métodos para a análise de uma amostra contendo as partículas são fornecidos para corrigir a contagem de partículas obtida em um contador de partículas. Um método exemplifica- dor pode ser usado para diferenciar diferentes categorias de partículas incluindo as subcategorias correspondentes, que fazem parte da mesma categoria e/ou subcategoria de partículas no contador de partículas 15, por exemplo, como representado nas Figuras 5 e 6. O método pode ser usado para corrigir as contagens de partículas obtidas no contador de partículas 15. Em algumas modalidades, por exemplo, a primeira categoria e/ou subcategoria de partículas compreende um ou mais tipos de células anormais do sangue, células imaturas do sangue, células agregadas do sangue, ou células do sangue dimensi- onadas anormalmente. A segunda categoria e/ou subcategoria de partículas compreende células brancas do sangue. Ao operar o equipamento conforme descrito aqui, as partículas em subcategorias podem ser distinguidas pelo analisador, e as contagens das categorias e/ou subcategorias de partículas obtidas a partir do contador de partículas podem ser corrigidas.
[000256] Uma amostra ou porção da mesma é fornecida para o contador de partículas 15 para detectar as partículas e fornecer contagens de partículas com base em um ou mais critérios de seleção que podem abranger subcategorias de pelo menos duas categorias de partículas. Por exemplo, a categoria de WBC suposta do contador de partículas pode também conter uma pequena quantidade de PLTs gigantes e NRBCs. Essa categoria do contador de partículas pode ainda com-preender subcategorias de células brancas do sangue que não podem ser distinguidas pelo contador de partículas. Outra porção da amostra pode também ser analisada no analisador visual, como descrito abaixo, para resolver estas categorizações errôneas e/ou subcategorizar as subcategorias de WBC indistintas.
[000257] A distribuição de cada uma das pelo menos duas subcategorias ou categorias pode ser determinada no analisador 17, conforme representado na Figura 5. Tal distribuição pode ser apresentada em uma razão numérica, razão proporcional e/ou outra função das contagens relativas. Em algumas modalidades, uma tal distribuição pode ser determinada de acordo com métodos divulgados aqui em um analisador visual 17, compreendendo uma célula de fluxo 22, e um dispositivo de imageamento 24. Como descrito, a amostra 12A, que pode ser uma porção de uma amostra, é aplicada a pelo menos uma célula de fluxo 22. Pelo menos um produto químico compreendendo pelo menos um de um diluente, um agente de permeabilização, um agente de contraste é introduzido para a amostra 12A. Pelo menos uma substância quí- mica que compreende pelo menos um de um diluente, um agente de permeabilização e/ou um agente de contraste é eficaz para gerar distinções visuais que diferenciam as pelo menos duas categorias de partículas, e diferenciam as pelo menos duas subcategorias de pelo menos uma categoria de partículas. Uma pluralidade de imagens de partículas da amostra 12B é capturada. Uma análise de imagem é realizada pelo analisador visual 17 e/ou processador 18.
[000258] Em algumas modalidades, o processador 18 está programado para distinguir os membros das pelo menos duas categorias e/ou subcategorias. Uma razão proporcional da contagem de partículas em cada uma das pelo menos duas subcategorias ou categorias de partículas pode ser determinada, com base na pluralidade de imagens de partículas da amostra. A contagem de partículas para as subcategorias de pelo menos uma das pelo menos duas categorias obtidas a partir do contador de partículas 15 pode então ser corrigida no processador 18, usando a distribuição de cada uma das subcategorias. A concentração de cada subcategoria de partículas pode ser calculada no processador 18, com base na razão proporcional de cada subcategoria de partículas e a contagem das partículas de categoria das partículas obtidas a partir do contador de partículas.
[000259] Os métodos divulgados no presente documento podem também ser usados para diferenciar um ou mais tipos de partículas fora de uma faixa de detecção no contador de partículas 15, de acordo com algumas modalidades. Por exemplo, estas partículas podem ser células do sangue ou outros fragmentos, que são muito grandes ou muito pequenas para serem detectadas no contador de partículas 15. No analisador visual 17 uma razão proporcional das contagens de um tipo de partícula fora de uma faixa de detecção sobre o contador de partícula para outro tipo de partícula dentro da faixa de detecção do contador de partículas pode ser determinada com base na pluralidade de imagens de partículas da amostra. A concentração do tipo de partículas fora da faixa de detecção na amostra, em seguida, pode ser determinada, através da aplicação, pelo menos em parte, da razão proporcional para a contagem de partículas obtida no contador de partículas 15.
[000260] Consequentemente, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos híbridos, por exemplo, que combinam, por exemplo, técnicas de imageamento fotográfico de células e de contagem eletrônica de células, por exemplo, para analisar as células que podem ser difíceis de distinguir eletricamente, ou para analisar as células presentes em quantidades que tornam difícil a obtenção de uma contagem eletrônica precisa das mesmas.
[000261] Cada dos cálculos ou operações aqui descritos pode ser feito com o uso de um computador ou outro processador que tenha hardware, software e/ou firmware. As várias etapas do método podem ser realizadas por módulos, e os módulos podem compreender qualquer uma dentre uma ampla variedade de hardware e/ou software de processamento de dados digitais e/ou analógicos dispostos para executar as etapas do método aqui descritas. Os módulos compreendem opcionalmente hardware de processamento de dados adaptado para executar uma ou mais dessas etapas tendo código de programação de máquina adequado associado ao mesmo, os módulos de duas ou mais etapas (ou porções de duas ou mais etapas) sendo integrados a uma única placa de processador ou separados em diferentes placas de processador em qualquer uma dentre uma ampla variedade de arquiteturas de processamento integrado e/ou distribuído. Esses métodos e sistemas com frequência usarão um meio tangível incluindo código legível por máquina com instruções para executar as etapas do método descrito acima. Os meios tangíveis adequados podem compreender uma memória (incluindo uma memória volátil e/ou uma memória não volátil), um meio de armazenamento (como uma gravação magnética em um disquete, um disco rígido, uma fita, ou similares; em uma memória óptica, como um CD, um CD-R/W, um CD-ROM, um DVD ou similares; ou qualquer outro meio de armazenamento digital ou analógico), ou similares.
[000262] Todas as patentes, publicações de patente, pedidos de patente, artigos de jornal, livros, referências técnicas e similares discutidos na presente revelação estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[000263] Diferentes disposições dos componentes representadas nos desenhos ou descritas acima, assim como os componentes e etapas não mostrados ou descritos, são possíveis. De modo similar, alguns recursos e subcombinações são úteis e podem ser empregados sem referência a outros recursos e subcombinações. As modalidades da invenção foram descritas para propósitos ilustrativos e não restritivos, e modalidades alternativas ficarão aparentes aos leitores desta patente. Em certos casos, as etapas do método ou operações podem ser realizadas ou executadas em diferentes ordens, ou as operações poderão ser incluídas, deletadas ou modificadas. Pode ser entendido que, em determinados aspectos da invenção, um único componente pode ser substituído por múltiplos componentes, e múltiplos componentes podem ser substituídos por um único componente, para fornecer um elemento ou estrutura ou para executar uma determinada função ou funções. Exceto onde essa substituição não é operacional para praticar certas modalidades da invenção, essa substituição é considerada dentro do escopo da invenção. Consequentemente, a presente invenção não se limita às modalidades descritas acima ou mostradas nos desenhos, e várias modalidades e modificações podem ser feitas sem que se afaste do escopo das reivindicações abaixo.

Claims (14)

1. Método para medir uma quantidade de um primeiro tipo de células em uma amostra de fluido de sangue, a amostra (25) incluindo um segundo tipo de células, o método caracterizado pelo fato de que compreende: determinar uma população do segundo tipo de células em um primeiro volume da amostra (720) mediante o fluxo do primeiro volume (720) através de um contador de células de hematologia (722), em que o contador de células de hematologia (722) não compreende um aparelho de imageamento e não visualiza o primeiro volume da amostra (720), e em que o células de hematologia (722) possui uma primeira precisão associada com a contagem do primeiro tipo de células e uma segunda precisão associada com o segundo tipo de células, a segunda precisão sendo superior que a primeira precisão; capturar imagens de um primeiro número dos primeiros tipos de células e um segundo número dos segundos tipos de células mediante injeção de um segundo volume da amostra (730) em um fluido de revestimento (726) que flui no interior de uma célula de fluxo (22, 420) de modo a fornecer uma corrente de amostra (32, 428) tendo uma espessura e uma largura maior que a espessura, as imagens capturadas sendo capturadas ao longo de uma trajetória de imagem que atravessa a espessura da corrente da amostra (32, 428); determinar uma razão entre o primeiro número do primeiro tipo de células e o segundo número dos segundos tipos de células usando as imagens capturadas; e calcular uma medida de quantidade de células do primeiro tipo de células na amostra usando a razão e a população do segundo tipo de células.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a medida da quantidade de células compreende: uma concentração de células para o primeiro tipo de células na amostra de fluido de sangue (25); ou uma contagem de células para o primeiro tipo de células na amostra de fluido de sangue (25).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contador de células de hematologia (722) tem uma faixa de precisão desejada, a faixa de precisão desejada estendendo- se entre uma população mínima de células no primeiro volume e uma população máxima de células no primeiro volume, sendo que a população determinada do segundo tipo de células no volume está dentro da faixa de precisão desejada, e sendo que a medida da quantidade de células calculada do primeiro tipo de células da amostra está fora da faixa de precisão desejada.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente determinar uma população do primeiro tipo de células no primeiro volume da amostra (720) como resultado do fluxo do primeiro volume através do contador de células de hematologia (722), sendo que a população determinada do primeiro tipo de células no primeiro volume (720) está acima ou abaixo de uma faixa de precisão desejada para o primeiro tipo de células, e é diferente da medida da quantidade de células calculada do primeiro tipo de células.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a população determinada do primeiro tipo de células é zero ou maior que zero.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contador de células de hematologia (722) compreende tanto: um mecanismo sensor que detecta uma alteração na impe- dância elétrica em resposta a um segundo tipo de células que flui atra- vés do contador de células (722); ou um mecanismo sensor que detecta uma obstrução de uma trajetória de luz em resposta a um segundo tipo de células que flui através do contador de células (722).
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o contador de células de hematologia (722) tem um limite mínimo de concentração detectável e um limite máximo de concentração detectável para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de concentração detectável e um limite máximo de concentração detectá- vel para o segundo tipo de células, a população determinada do segundo tipo de células é baseada em um parâmetro de concentração detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células, e o primeiro tipo de células pode estar presente em uma concentração que está abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células; ou o contador de células de hematologia (722) tem um limite mínimo de volume detectável e um limite máximo de volume detectá- vel para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de volume de- tectável e um limite máximo de volume detectável para o segundo tipo de células, a população determinada do segundo tipo de células é baseada em um parâmetro de volume detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células, e o primeiro tipo de células está presente em um parâmetro de volume que está abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o contador de células de hematologia (722) tem um limite mínimo de tamanho detectável e um limite máximo de tamanho detec- tável para o primeiro tipo de células, e um limite mínimo de tamanho detectável e um tamanho máximo de volume detectável para o segundo tipo de células, a população determinada do segundo tipo de células se baseia em um parâmetro de tamanho detectado para o segundo tipo de células que está acima do limite mínimo e abaixo do limite máximo para o segundo tipo de células, e o primeiro tipo de células está presente em um parâmetro de tamanho que está abaixo do limite mínimo ou acima do limite máximo para o primeiro tipo de células.
9. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente calcular uma medida de quantidade de células do segundo tipo de células na amostra usando a razão e a população do segundo tipo de células.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a determinação da população do segundo tipo de células no primeiro volume da amostra (720) compreende agrupar juntas as células do primeiro tipo de células e células do segundo tipo de células, e, mais preferencialmente, sendo que o método compreende adicionalmente determinar uma população do primeiro tipo de células no primeiro volume da amostra (720) como resultado do fluxo do primeiro volume através do contador de células de hematologia (722), e sendo que o cálculo da medida da quantidade de células do primeiro tipo de células na amostra usa a razão, a população do segundo tipo de células, e a população do primeiro tipo de células.
11. Sistema para medir uma quantidade de um primeiro tipo de células em uma amostra de fluido de sangue, a amostra incluindo um segundo tipo de células, o sistema caracterizado pelo fato de que compreende: um contador de células de hematologia (722) tendo um canal e uma saída, a saída acoplada de modo operacional ao canal de modo a gerar sinais indicativos de uma população do segundo tipo de células em um primeiro volume da amostra (720) que flui através do canal, sendo que o contador de células de hematologia (722) não compreende um aparelho de imageamento; uma célula de fluxo (22, 420) configurada para facilitar o fluxo de uma corrente de amostra (32, 428), a corrente de amostra (325, 428) compreendendo um segundo volume da amostra (730) e um fluido de revestimento (426), e tendo uma espessura e uma largura maior que a espessura; um equipamento de imageamento (24) configurado para capturar imagens de um primeiro número do primeiro tipo células e um segundo número do segundo tipo de células no segundo volume (730), as imagens capturadas sendo capturadas ao longo de uma trajetória de imagem que atravessa a espessura da corrente da amostra (32, 428); um processador (440) que determina uma razão entre o primeiro número do primeiro tipo de células e o segundo número do segundo tipo de células usando as imagens capturadas que calcula uma quantidade medida da células do primeiro tipo de células na amostra usando a razão e os sinais indicativos de uma população do segundo tipo de células.
12. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o processador (440) está acoplado: ao contador de células de hematologia (722) para receber sinais indicativos da população do segundo tipo de células; ou ao equipamento de imagem (24) para receber as imagens capturadas.
13. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a célula de fluxo (22, 420) e o equipamento de imagem (24) são componentes de um analisador de hematologia que executa hidrofocalização geométrica e viscosidade combinadas para imageamento das células na amostra de fluido de sangue.
14. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que uma diferença entre a viscosidade do fluido de revestimento e da amostra de fluido de sangue, em combinação com uma diminuição do tamanho da trajetória de fluxo da célula de fluxo, é eficaz para hidrofocalizar a corrente de amostra (32, 428) em um local de captura de imagem (432) da célula de fluxo (22, 420).
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