CN111307782A - 一种基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法 - Google Patents

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杨媛如
陈冠宇
杨云瑞
田地
邱春玲
姚立
李春生
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    • G01N1/2813—Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on

Abstract

本发明涉及一种基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，包括以下步骤：制备用于承载细菌样品的基底；将细菌样品溶液滴涂于基底的PTFE涂层上；对滴涂细菌样品后的基底进行干燥处理，得到载有细菌样品的基底；将载有细菌样品的基底置于细菌快速检测系统的样品台上，细菌快速检测系统对细菌样品进行基于激光诱导击穿光谱的快速检测。本发明通过制备具有超疏水PTFE涂层的基底，在基底表面构筑PTFE超疏水微纳米结构，调节基底的表面能，利用PTFE超疏水微纳米结构对食源性细菌进行有效富集，提升LIBS检测信号强度，降低检出限，同时结合LIBS检测方法快速、原位检测的优势，实现对于低浓度下食源性细菌的高效、快速检测。

Description

一种基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法。
背景技术
随着食源性疾病发病率的显著上升，食源性细菌感染已被认为是全球公共卫生的一大威胁。常见食源性病原体如单核增生李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌，它能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。受污染的家禽、猪肉和牛肉产品是李斯特菌爆发的主要原因。传统的食源性致病菌的鉴定方法主要包括平板培养和菌落计数、聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验。但这些传统的检测方法步骤多、耗时长、灵敏度有限，因此迫切需要一种简便、快速、灵敏的方法来检测食源性致病菌，从而有效地预防和控制食源性疾病的发生。
发明内容
基于此，有必要针对传统的食源性致病菌的鉴定方法存在的步骤多、耗时长、灵敏度有限的问题，提供一种基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法。
为解决上述问题，本发明采取如下的技术方案：
一种基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，包括以下步骤：
一、制备用于承载细菌样品的基底，所述基底的制备方法包括以下步骤：
步骤1：对基片进行紫外光处理；
步骤2：对经过紫外光处理后的基片进行丙酮溶液与甲醇溶液交替的超声处理；
步骤3：将PTFE悬浮分散液旋涂于超声处理后的基片表面，制备PTFE涂层；
步骤4：将制备PTFE涂层后的基片置于马弗炉或者真空烘箱中进行热处理；
步骤5：基片热处理后以梯度降温或者自然降温的方式冷却至室温，得到所述基底；
二、将细菌样品溶液滴涂于所述基底的PTFE涂层上；
三、对滴涂细菌样品后的基底进行干燥处理，得到载有细菌样品的基底；
四、将载有细菌样品的基底置于细菌快速检测系统的样品台上，所述细菌快速检测系统对细菌样品进行基于激光诱导击穿光谱的快速检测；
所述细菌快速检测系统包括固体激光器、第一反射镜、第二反射镜、扩束器、二向色镜、第一聚焦透镜、第二聚焦透镜、CCD相机、准直镜、增强型接收探头、光纤、光谱仪、带镜头的增强电荷耦合探测器和计算机，所述固体激光器产生的高能激光束通过所述第一反射镜和所述第二反射镜后进入所述扩束器，经过所述扩束器后被所述二向色镜反射，通过第一聚焦透镜聚焦到载有细菌样品的基底的表面上，激发细菌样品的等离子体发射光谱，所述光谱仪收集经所述准直镜、所述增强型接收探头和所述光纤入射的等离子体发射光谱并将采集到的光谱信息发送至所述计算机；
所述细菌样品的反射光谱依次经过所述第一聚焦透镜、所述二向色镜和所述第二聚焦透镜后入射至所述CCD相机，所述CCD相机实时采集载有细菌样品的基底表面图像并将采集的表面图像发送至所述计算机；
所述带镜头的增强电荷耦合探测器根据所述固体激光器的触发进行时间同步和等离子体瞬态图像采集并将所述等离子体瞬态图像发送至所述计算机；
所述计算机用于设置等离子体瞬态图像采集的延时时间并存储所述等离子体瞬态图像和载有细菌样品的基底的表面图像，以及对所述光谱信息进行处理，生成并存储细菌样品的光谱强度图像。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过制备具有超疏水PTFE涂层的基底，在基底表面构筑PTFE超疏水微纳米结构，利用PTFE超疏水微纳米结构对食源性细菌进行有效富集，提升LIBS检测信号强度，降低检出限，同时结合LIBS检测方法快速、原位检测的优势，实现对于低浓度下食源性细菌的高效、快速检测。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例中细菌快速检测系统的结构示意图；
图2为本发明其中一个实施例中基底的制备方法流程图；
图3为方案三制备的基底的扫描电镜图片；
图4为基于方案三制备的基底的李斯特菌光谱强度图像；
附图标记说明：
1、固体激光器；2、第一反射镜；3、第二反射镜；4、扩束器；5、二向色镜；6、第一聚焦透镜；7、第二聚焦透镜；8、CCD相机；9、准直镜；10、增强型接收探头；11、光纤；12、光谱仪；13、带镜头的增强电荷耦合探测器；14、计算机；15、基底；16、细菌样品。
具体实施方式
下面将结合附图及较佳实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
在其中一个实施例中，本发明公开一种基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，该方法包括以下步骤：
一、制备用于承载细菌样品的基底15；
二、将细菌样品溶液滴涂于基底15的PTFE涂层上；
三、对滴涂细菌样品后的基底15进行干燥处理，得到载有细菌样品16的基底15；本步骤中的干燥处理可以选择烘干处理或者冻干处理；
四、将载有细菌样品16的基底15置于细菌快速检测系统的样品台上，细菌快速检测系统对细菌样品16进行基于激光诱导击穿光谱的快速检测。
如图1所示，细菌快速检测系统包括固体激光器1、第一反射镜2、第二反射镜3、扩束器4、二向色镜5、第一聚焦透镜6、第二聚焦透镜7、CCD相机8、准直镜9、增强型接收探头10、光纤11、光谱仪12、带镜头的增强电荷耦合探测器13和计算机14。
具体地，固体激光器1产生的高能激光束通过聚焦光路前端设置的第一反射镜2和第二反射镜3后进入扩束器4，经过扩束器4后被与激光呈45°放置的二向色镜5反射，进入共轴聚焦光路，其中第一反射镜2和第二反射镜3的作用在于通过微调反射镜片角度来间接调节高能激光束进入光路系统时的位置和角度，使高能激光束能够与光学镜片中心轴线重合度更好。被二向色镜5反射的高能激光束入射至载有细菌样品16的基底15的表面上，进而激发基底15表面上细菌样品16的等离子体发射光谱，光谱仪12用于对等离子体发射光光信号进行分光处理形成光谱数据，光谱仪12收集经准直镜9、增强型接收探头10和光纤11入射的等离子体发射光谱并将采集到的光谱信息发送至所述计算机14，计算机14对光谱信息进行处理，生成并存储细菌样品16的光谱强度图像。
细菌样品16的反射光谱沿着图1所示z轴方向依次经过第一聚焦透镜6、二向色镜5和第二聚焦透镜7后入射至CCD相机8，CCD相机8实时采集载有细菌样品16的基底15表面图像并将采集的表面图像发送至计算机14，计算机14对载有细菌样品16的基底15的表面图像进行存储。
带镜头的增强电荷耦合探测器13根据固体激光器1的触发进行时间同步和等离子体瞬态图像采集并将等离子体瞬态图像发送至计算机14，计算机14用于设置等离子体瞬态图像采集的延时时间并存储等离子体瞬态图像。计算机14通过和仪器上位机软件直接通讯实现了对不同部件的统一控制和数据传输，实现设置等离子体瞬态图像采集的延时时间并存储等离子体瞬态图像等功能。进一步地，本实施例中的固体激光器1包括激光头和激光驱动电源，其中激光驱动电源将低输入电压转换为高压脉冲以驱动激光头输出激光脉冲，激光脉冲的基波长为1064nm，脉冲宽度为9ns，无源Q开关，传递的最大能量超过100mJ，重复频率通常为5Hz。优选地，固体激光器1为Nd:YAG激光器。
进一步地，扩束器4包括双凹透镜4-1和平凸透镜4-2，双凹透镜4-1的焦距为-200mm，平凸透镜4-2的焦距为100mm。通过调节双凹透镜4-1与平凸透镜4-2的间距，可以间接改变激光聚焦位置。扩束器4的作用在于扩展激光光束直径，减小激光光束发散角，提升激光准直度，使激光被聚焦的更小，提升激光聚焦样品表面上的功率密度，从而达到更容易激发等离子体的目的。
本实施例中基底15的制备方法包括以下步骤，如图2所示：
步骤1：对基片进行紫外光处理；基片的材质可以为玻璃或者单晶硅等；
步骤2：对经过紫外光处理后的基片进行丙酮溶液与甲醇溶液交替的超声处理，以清洗经过紫外光处理后的基片；例如，交替超声处理时，每次丙酮溶液和甲醇溶液的超声时间为30min；
步骤3：将PTFE悬浮分散液旋涂于超声处理后的基片表面，制备PTFE涂层；
在本步骤中，可以利用旋涂匀胶机将PTFE悬浮分散液旋涂于超声处理后的基片表面，旋涂匀胶机的转速设置为3000rpm，旋涂时间设置为120s，以制备厚度均匀的PTFE涂层。
进一步地，本步骤中PTFE悬浮分散液的浓度为15mg/ml，在将PTFE悬浮分散液旋涂于超声处理后的基片表面之前，先对PTFE悬浮分散液进行超声处理，超声时间可以根据实际需要设定，使得PTFE悬浮分散液充分分散。
步骤4：将制备PTFE涂层后的基片置于马弗炉或者真空烘箱中进行热处理，以对PTFE涂层进行烧结；
热处理时按照以下顺序调节马弗炉或者真空烘箱的温度：
a)以5℃/min的速率梯度升温至100℃；
b)温度为100℃条件下保持12h；
c)以5℃/min的速率继续升温至250℃；
d)温度为250℃条件下保持2h；
e)降温至100℃。
优选地，热处理的最高温度为200～350℃。
步骤5：基片热处理后以梯度降温或者自然降温的方式冷却至室温，最终得到基底15。
激光诱导击穿光谱(Laser-Induced Breakdown Spectroscopy，LIBS)为从气体、液体和固体中获得原子发射光谱提供了一种快速、相对无损的手段。激光诱导击穿光谱学可以直接检测样品，其原理是利用高功率激光脉冲在样品表面诱导高温等离子体，然后通过可见光谱学同时观察组成样品的各种元素。由于可以快速获取大量的标准试验数据，因此LIBS非常适合于化学计量分析，进行快速的病原体识别和分类，定性以及定量分析。
聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE)具有耐溶剂、高润滑不粘性、电绝缘性和良好的抗老化能力、耐温优异，其在原子能、国防、航天、电子、电气、化工、机械、仪器、仪表、建筑、纺织、金属表面处理、制药、医疗、纺织、食品、冶金冶炼等工业中广泛用作耐高低温、耐腐蚀材料，绝缘材料，防粘涂层等，使之成为不可取代的产品。此外，PTFE还是一种经典的疏水材料，具有极低的表面能。本发明通过对于PTFE悬浮分散液的热处理，构筑纳米结构，更进一步提升了其疏水性能。采用该种基底与LIBS检测方法相结合的方式，可以对食源性细菌例如单核增生李斯特菌等进行有效富集，提升LIBS检测信号强度，从而降低检出限，实现对于低浓度下食源性细菌的高效、快速检测。
本实施例所提出的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法通过制备具有超疏水PTFE涂层的基底，在基底表面构筑PTFE超疏水微纳米结构，调节基底的表面能，对食源性细菌进行有效富集，从而提升LIBS检测信号强度，降低检出限，同时结合LIBS检测方法快速、原位检测的优势，实现对于低浓度下食源性细菌的高效、快速检测。
为进一步证明本发明所提出的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法的有效性，下面分别在三种不同条件下对基底进行制备，并以单核增生李斯特菌作为模型靶点来验证激光诱导击穿光谱法的性能，以获得实验效果最优的方案。
方案一、对硅片进行紫外光处理，丙酮与甲醇溶液交替超声，每次超声处理30min。将配置好的PTFE悬浊液浓度10mg/ml，在旋涂匀胶机上进行旋涂制备涂层，转速1000rpm，旋涂时间60s。将上述基底置于马弗炉中，在氮气保护下进行热处理，加热温度200℃，梯度升温5℃/min，在200℃条件下加热12小时后，停止加热，自然冷却至室温。将50μl灭活的浓度为1x107CFU/ml的李斯特菌菌液加在基底上，而后放入60℃烘箱中烘干。
方案二、对硅片进行紫外光处理，丙酮与甲醇溶液交替超声，每次超声处理30min。将配置好的PTFE悬浊液浓度20mg/ml，在旋涂匀胶机上进行旋涂制备涂层，转速3000rpm，旋涂时间120s。将上述基底置于真空烘箱中，真空条件下，加热温度100℃，梯度升温5℃/min，保持2h，继续升温，升温速度5℃/min，在200℃条件下加热12h后，降温至100℃，再自然冷却至室温。将50μl灭活的浓度为1x107CFU/ml的李斯特菌菌液加在基底上，而后放入60℃烘箱中烘干。
方案三、对硅片进行紫外光处理，丙酮与甲醇溶液交替超声，每次超声处理30min。将配置好的PTFE悬浊液浓度15mg/ml，先超声1h，使其充分分散，在旋涂匀胶机上进行旋涂制备涂层，转速3000rpm，旋涂时间120s。将上述基底置于真空烘箱中，真空条件下，加热温度100℃，梯度升温5℃/min，保持12h，继续升温，升温速度5℃/min，在250℃条件下加热2h后，降温至100℃，再自然冷却至室温。将50μl灭活的浓度为1x107CFU/ml的李斯特菌菌液加在基底上，而后放入60℃烘箱中烘干。
实验研究发现，方案三对于单核增生李斯特菌的检测性能最优。图3所示为方案三制备得到的基底的扫描电镜图片，该扫描电镜图片利用蔡司(ZEISS)扫描电镜拍摄，扫描电镜的参数为：加速电压EHT＝1.00kV，放大倍数Mag＝2.00K，工作距离WD＝5.0mm，探测器Signal A＝SE2。从图3中可以看出，通过系列处理，PTFE在硅片表面形成了几微米的片层结构，上述结构进一步的降低了基底的表面能，有利于细菌富集。
图4所示为细菌快速检测系统对方案三获得的基底进行李斯特菌检测后得到的光谱强度图像，图中横坐标为波长(nm)，纵坐标为强度(a.u.)，从图4中可以清晰的看到此波段的钙Ca、铁Fe、钠Na、氢H、钾K、氧O等元素谱线强度较强且谱线间无重叠现象，波峰明显，表明方案三制备的基底对于细菌样品的光谱强度增强效果最优。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、制备用于承载细菌样品的基底(15)，所述基底(15)的制备方法包括以下步骤：
步骤1：对基片进行紫外光处理；
步骤2：对经过紫外光处理后的基片进行丙酮溶液与甲醇溶液交替的超声处理；
步骤3：将PTFE悬浮分散液旋涂于超声处理后的基片表面，制备PTFE涂层；
步骤4：将制备PTFE涂层后的基片置于马弗炉或者真空烘箱中进行热处理；
步骤5：基片热处理后以梯度降温或者自然降温的方式冷却至室温，得到所述基底(15)；
二、将细菌样品溶液滴涂于所述基底(15)的PTFE涂层上；
三、对滴涂细菌样品后的基底(15)进行干燥处理，得到载有细菌样品(16)的基底(15)；
四、将载有细菌样品(16)的基底(15)置于细菌快速检测系统的样品台上，所述细菌快速检测系统对细菌样品(16)进行基于激光诱导击穿光谱的快速检测；
所述细菌快速检测系统包括固体激光器(1)、第一反射镜(2)、第二反射镜(3)、扩束器(4)、二向色镜(5)、第一聚焦透镜(6)、第二聚焦透镜(7)、CCD相机(8)、准直镜(9)、增强型接收探头(10)、光纤(11)、光谱仪(12)、带镜头的增强电荷耦合探测器(13)和计算机(14)，所述固体激光器(1)产生的高能激光束通过所述第一反射镜(2)和所述第二反射镜(3)后进入所述扩束器(4)，经过所述扩束器(4)后被所述二向色镜(5)反射，通过第一聚焦透镜(6)聚焦到载有细菌样品(16)的基底(15)的表面上，激发细菌样品(16)的等离子体发射光谱，所述光谱仪(12)收集经所述准直镜(9)、所述增强型接收探头(10)和所述光纤(11)入射的等离子体发射光谱并将采集到的光谱信息发送至所述计算机(14)；
所述细菌样品(16)的反射光谱依次经过所述第一聚焦透镜(6)、所述二向色镜(5)和所述第二聚焦透镜(7)后入射至所述CCD相机(8)，所述CCD相机(8)实时采集载有细菌样品(16)的基底(15)表面图像并将采集的表面图像发送至所述计算机(14)；
所述带镜头的增强电荷耦合探测器(13)根据所述固体激光器(1)的触发进行时间同步和等离子体瞬态图像采集并将所述等离子体瞬态图像发送至所述计算机(14)；
所述计算机(14)用于设置等离子体瞬态图像采集的延时时间并存储所述等离子体瞬态图像和载有细菌样品(16)的基底(15)的表面图像，以及对所述光谱信息进行处理，生成并存储细菌样品(16)的光谱强度图像。
2.根据权利要求1所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，
所述固体激光器(1)包括激光头和用于驱动所述激光头输出激光脉冲的激光驱动电源，所述激光脉冲的基波长为1064nm，脉冲宽度为9ns。
3.根据权利要求1或2所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，
所述扩束器(4)包括双凹透镜(4-1)和平凸透镜(4-2)，所述双凹透镜(4-1)的焦距为-200mm，所述平凸透镜(4-2)的焦距为100mm。
4.根据权利要求1或2所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，
利用旋涂匀胶机将PTFE悬浮分散液旋涂于超声处理后的基片表面，所述旋涂匀胶机的转速设置为3000rpm，旋涂时间设置为120s。
5.根据权利要求1或2所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，
所述PTFE悬浮分散液的浓度为15mg/ml，在将PTFE悬浮分散液旋涂于超声处理后的基片表面之前，先对所述PTFE悬浮分散液进行超声处理。
6.根据权利要求1或2所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，热处理时按照以下顺序调节马弗炉或者真空烘箱的温度：
a)以5℃/min的速率梯度升温至100℃；
b)温度为100℃条件下保持12h；
c)以5℃/min的速率继续升温至250℃；
d)温度为250℃条件下保持2h；
e)降温至100℃。
7.根据权利要求1或2所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，
热处理的最高温度为200～350℃。
8.根据权利要求1或2所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，
所述干燥处理为烘干处理或者冻干处理。
9.根据权利要求1或2所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，
所述固体激光器(1)为Nd:YAG激光器。
10.根据权利要求1或2所述的基于激光诱导击穿光谱的细菌快速检测方法，其特征在于，
所述基片的材质为玻璃或者单晶硅。
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