CN113820301A - 一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法及装置 - Google Patents

一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的装置。该装置通过利用光镊技术形成的三维稳定捕获光阱实现对微球的稳定捕获，利用拉曼技术实现对微球的拉曼光谱信号的原位探测，微球表面根据识别需要修饰有微生物特异性的结合位点或者配体。本发明还提供了一种利用该装置进行微生物种类识别的方法，通过对比不同种类微生物特有的拉曼光谱特性信息，实现微生物的种类识别，识别步骤简便、快速、识别精度高。

Description

一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法及装置
技术领域
本发明涉及微生物种类识别领域，特别涉及一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法及装置。
背景技术
病原微生物是可以导致动物、植物和人类疾病的微生物。常见的病原微生物包括螺旋体、疟原虫、病毒、大肠埃希氏菌和沙门氏菌等，严重危害着人类的健康。为了预防这些病原微生物导致的疾病暴发和尽量减少其持续流行所造成的影响，需要开发一种快速、灵敏且简便的检测方法，在疾病出现的早期阶段准确地识别致病病原微生物种类。
目前，病原微生物的检测识别方法有实时荧光定量聚合酶链式反应法、数字聚合酶链式反应法、生物传感器法、免疫荧光法等。但这些方法都存在各自的问题，如实时荧光定量聚合酶链式反应法对低拷贝基金检测效率低，不满足高灵敏度要求；数字聚合酶链式反应法所用的仪器和试剂昂贵；生物传感器法存在抗体筛选过程复杂、价格昂贵问题；免疫荧光法所用的试剂昂贵、所用荧光色素会对待检样品中目标微生物活性造成影响。
基于拉曼光镊原理的颗粒物捕获与识别系统由于具有可实现非接触式地稳定捕获颗粒物而无基底接触影响、结构简单、识别效率高、应用广泛等优点，成为微生物种类识别技术的重要发展趋势之一。现有技术中，专利号CN 108918351 A公开了一种气溶胶中微粒捕获与拉曼光谱检测装置，该装置存在以下不足：1）在该技术中的气溶胶中微粒捕获与拉曼光谱检测装置是利用中空激光束产生机构将第一激光器产生的激光分为两束圆锥中空激光束，然后需要借助两个显微物镜构建囊结构光学捕获陷阱，实现对气溶胶微粒的光学捕获，光学系统结构复杂，并且，对两束圆锥中空激光束的光路对准调节精度要求高，光路调试难度高；2）在该技术中第一激光器功率为900mW-1400mW，对于需要捕获微米尺寸的液体气溶胶如氯化钠液滴气溶胶时，通常30-50mW捕获功率即可，而该技术中的第一激光器功率太高会加速氯化钠液滴气溶胶中溶剂水的挥发，而对拉曼信号测试造成影响，所以该技术的捕获气溶胶对象受限。专利号CN 105758838 B公开了基于光阱捕获金属纳米颗粒增强拉曼光谱的检测装置，该技术是借助光阱聚集金属纳米颗粒在待测试样品表面实现待测试样品拉曼光谱信号的增强，仅适合于液体环境中的样品原位拉曼光谱快速检测，不适用于大气环境中微生物的拉曼光谱检测。专利号CN 210090310 U公开了光镊-拉曼光谱单粒子检测系统，该系统主要面向液体环境中的单细胞粒子检测，不适用于大气环境中的微生物粒子检测，并且该系统采用的光学一体化设计方案限制了使用者的改造空间，当使用者想同时捕获多个粒子并进行检测时，需要在光路中增加空间光调制器元件，由于光学一体化设计，使得在系统中增加光学元件及后续的光路调试复杂。
因此，亟需研制快速有效的对病原微生物，特别是病毒进行种类识别的装置，加强对疾病的防控和治疗。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法及装置。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案为：一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法，包括以下步骤：
（1）利用光镊技术形成的光阱捕获样品室中的微球，所述的微球表面修饰有微生物特异性的结合位点或者配体，利用拉曼技术实现对微球的拉曼光谱信号的原位探测，得到微球的拉曼光谱信号S1；
（2）保持微球的捕获状态，将经预处理后的混合有微生物的待识别气体导入样品室，待微球与待识别气体充分接触，再次利用拉曼技术对微球的拉曼光谱信号进行原位探测，得到微球的拉曼光谱信号S2；
（3）比较导入混合有微生物的待识别气体前后微球的拉曼光谱信号S1和S2的特征峰变化，根据微生物的拉曼光谱信号特征峰，识别混合有微生物的气体中微生物的种类。
进一步地，所述的微球为聚苯乙烯或二氧化硅微球，所述微球的尺寸为nm量级到µm量级。
进一步地，所述的微球表面修饰有微生物特异性的结合位点或者配体；所述结合位点和配体包括抗体、核酸配体。
进一步地，所述的预处理包括光、电、热或者蒸汽处理。
一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的装置，包括第一激光器、第一半波片、第一准直透镜、第二准直透镜、第一二向色镜、第二二向色镜、高数值孔径物镜、样品室、第一聚焦透镜、照明光源、第三二向色镜、电荷耦合器件CCD、第二激光器、第二半波片、第三准直透镜、第四准直透镜、第一反射镜、第二反射镜、第五准直透镜、针孔、第六准直透镜、陷波滤波器、第二聚焦透镜、光谱仪、电子倍增探测器EMCCD；所述第一激光器出射捕获激光，经过第一准直透镜和第二准直透镜进行扩束准直，依次经过第一二向色镜、第二二向色镜和高数值孔径物镜形成三维稳定捕获光阱，在样品室中捕获微球，第二激光器出射拉曼激发激光，经过第三准直透镜和第四准直透镜进行扩束准直，依次经过第一反射镜、第一二向色镜、第二二向色镜和高数值孔径物镜聚焦在光阱捕获的微球上，激发微球的拉曼光谱信号，微球的拉曼光谱信号依次经过第二二向色镜、第三二向色镜、第二反射镜、第五准直透镜、针孔、第六准直透镜、第二聚焦透镜入射到耦合有电子倍增探测器EMCCD的光谱仪上，通过解算光谱仪的拉曼光谱信号。
进一步地，所述的样品室用于放置微球，同时用于导入待识别气体。
进一步地，所述的用于形成光阱的第一激光器为1064nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器。
进一步地，用于拉曼激发的第二激光器为532nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器。
本发明的有益效果为：本发明利用利用0-2W激光功率可调的光镊可进行不同种类捕获微小样品、并具有对样品非接触无损伤的特性，本发明中形成光阱的激光器所需的能量较低，不会对拉曼信号测试造成影响，捕获对象没有限制，可实现大气中微球的捕获。在此基础上，通过对比微生物结合到微球前后的微球拉曼光谱信号特征峰变化，识别空气中或气溶胶中的微生物的种类，识别快速且识别精度高。此外，该装置中的光阱捕获光路和拉曼信号激发光路共用一个物镜，节省成本的同时，降低了光路系统的复杂性，光路调试简单。并且方便使用者在光路中增加光学元器件以扩增装置的应用功能。本发明提出的利用拉曼光镊技术实现微生物的种类识别是一种新的思路和方法，拓展了拉曼光镊技术的应用，可用于微生物种类识别领域。
附图说明
图1为本发明装置的一种结构示意图；
图2为本发明方法的流程图；
图中，第一激光器1、第一半波片2、第一准直透镜3、第二准直透镜4、第一二向色镜5、第二二向色镜6、高数值孔径物镜7、样品室8、第一聚焦透镜9、照明光源10、第三二向色镜11、电荷耦合器件CCD12、第二激光器13、第二半波片14、第三准直透镜15、第四准直透镜16、第一反射镜17、第二反射镜18、第五准直透镜19、针孔20、第六准直透镜21、陷波滤波器22、第二聚焦透镜23、光谱仪24、电子倍增探测器EMCCD25。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明进行进一步阐述。
本发明公开了一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法及装置。
如图1所示，本发明装置的结构具体为：所述装置包括第一激光器1、第一半波片2、第一准直透镜3、第二准直透镜4、第一二向色镜5、第二二向色镜6、高数值孔径物镜7、样品室8、第一聚焦透镜9、照明光源10、第三二向色镜11、电荷耦合器件CCD12、第二激光器13、第二半波片14、第三准直透镜15、第四准直透镜16、第一反射镜17、第二反射镜18、第五准直透镜19、针孔20、第六准直透镜21、陷波滤波器22、第二聚焦透镜23、光谱仪24、电子倍增探测器EMCCD25；通过所述第一激光器1出射捕获激光，经过第一准直透镜3和第二准直透镜4进行扩束准直，依次经过第一二向色镜5、第二二向色镜6和高数值孔径物镜7形成三维稳定捕获光阱，在样品室8中捕获微球，第二激光器13出射拉曼激发激光，经过第三准直透镜15和第四准直透镜16进行扩束准直，依次经过第一反射镜17、第一二向色镜5、第二二向色镜6和高数值孔径物镜7聚焦在光阱捕获的微球上，激发微球的拉曼光谱信号，微球的拉曼光谱信号依次经过第二二向色镜6、第三二向色镜11、第二反射镜18、第五准直透镜19、针孔20、第六准直透镜21、第二聚焦透镜23入射到耦合有电子倍增探测器EMCCD25的光谱仪24上，通过解算光谱仪24的拉曼光谱信号，识别微生物的种类。
进一步地，所述的用于形成光阱的第一激光器1为1064nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器，用于拉曼激发的第二激光器13为532nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器。
如图2所示，图2为本发明方法的流程图，利用本发明装置识别微生物种类具体包括以下步骤：
（1）将表面修饰有微生物特异性的结合位点或者配体的微球放置于样品室8中，样品室内充有不包含待识别微生物的常温常压空气，用以确保微球与微生物的特异性结合能力。打开第一激光器1，在样品室8内形成光阱，待光阱捕获微球后，利用第二激光器13激发微球的拉曼光谱信号，实现对微球的拉曼光谱信号的原位探测，微球的拉曼光谱信号被光谱仪24探测记录，通过解算光谱仪24的光谱信号得到微球的拉曼光谱信号S1；
（2）将待识别气体导入样品室8，其中待识别气体经过预处理，所述的预处理包括光、电、热或者蒸汽处理，用以去除杂质等干扰因素，暴露微生物结合位点，确保微生物与微球的特异性结合能力。待微球与待识别气体充分接触，接触时间比如为5分钟，具体时间可以根据实际情况进行调节，再次利用第二激光器13激发微球的拉曼光谱信号，得到微球的拉曼光谱信号S2；
（3）由于微球具有与微生物特异性结合的能力，当待识别气体中存在待识别微生物时，微生物被结合在微球表面，从而使得微球的拉曼光谱信号特征峰发生变化，通过比较导入待识别气体前后微球的拉曼光谱信号S1和S2的特征峰变化，根据微生物的拉曼光谱信号特征峰，查找拉曼光谱信号数据库，识别混合有微生物的气体中微生物的种类。
进一步地，所述的微球为聚苯乙烯或二氧化硅微球，微球的尺寸为nm量级到µm量级。
进一步地，所述的微球表面修饰有微生物特异性的结合位点或者配体；所述结合位点和配体包括抗体、核酸配体；
实施例1
本实施例以流感病毒的识别为例。
第一激光器1采用1064nm光纤耦合固态激光器，第二激光器13采用532nm光纤耦合固态激光器，实施过程中激光器输出稳定，即形成三维稳定捕获光阱和用于拉曼激发的光功率。
选用直径为150nm的聚苯乙烯微球作为待捕获的微球。
微球表面修饰有流感病毒结合抗体，因此具有与流感病毒的特异性结合能力。
实施步骤：
（1）将表面修饰有流感病毒特异性结合抗体的聚苯乙烯微球放置于样品室中，样品室内为洁净的常温常压空气，用以确保微球对微生物的特异性结合能力，打开1064nm光纤耦合固态激光器，在样品室内形成三维稳定捕获光阱，待光阱捕获微球后，打开532nm拉曼光纤耦合固态激光器，激发微球的拉曼光谱信号，微球的拉曼光谱信号被光谱仪探测记录，通过解算光谱仪的光谱信号得到微球的拉曼光谱信号S1，该光谱为微球的初始光谱；
（2）将待识别气体导入样品室，其中待识别气体经过预处理，包括光、电、热或者蒸汽处理，用以去除杂质等干扰因素，确保微生物与微球的特异性结合能力，并经过5分钟的充分接触后，再次利用拉曼激光激发微球的拉曼光谱信号，得到微球的拉曼光谱信号S2；
（3）由于微球具有与流感病毒特异性结合的能力，当待识别气体中存在流感病毒时，流感病毒被结合在微球表面，从而改变了微球的拉曼光谱信号特征峰，通过比较导入待识别气体前后微球的拉曼光谱信号S1和S2的特征峰变化，查找拉曼光谱信号数据库，识别混合有微生物气体中微生物的种类是流感病毒。
最后所应说明的是，以上实施例和阐述仅用以说明本发明的技术方案而非进行限制。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，不脱离本发明技术方案公开的精神和范围的，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之中。

Claims (8)

1.一种利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用光镊技术形成的光阱捕获样品室中的微球，所述的微球表面修饰有微生物特异性的结合位点或者配体，利用拉曼技术实现对微球的拉曼光谱信号的原位探测，得到微球的拉曼光谱信号S1；
（2）保持微球的捕获状态，将经预处理后的混合有微生物的待识别气体导入样品室，待微球与待识别气体充分接触，再次利用拉曼技术对微球的拉曼光谱信号进行原位探测，得到微球的拉曼光谱信号S2；
（3）比较导入混合有微生物的待识别气体前后微球的拉曼光谱信号S1和S2的特征峰变化，根据微生物的拉曼光谱信号特征峰，识别混合有微生物的气体中微生物的种类。
2.根据权利要求1所述的利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法，其特征在于，所述的微球为聚苯乙烯或二氧化硅微球，所述微球的尺寸为nm量级到µm量级。
3.根据权利要求1所述的利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法，其特征在于，所述的微球表面修饰有微生物特异性的结合位点或者配体；所述结合位点和配体包括抗体、核酸配体。
4.根据权利要求1所述的利用拉曼光镊进行微生物种类识别的方法，其特征在于，所述的预处理包括光、电、热或者蒸汽处理。
5.一种根据权利要求1所述的方法利用拉曼光镊进行微生物种类识别的装置，其特征在于，包括第一激光器（1）、第一半波片（2）、第一准直透镜（3）、第二准直透镜（4）、第一二向色镜（5）、第二二向色镜（6）、高数值孔径物镜（7）、样品室（8）、第一聚焦透镜（9）、照明光源（10）、第三二向色镜（11）、电荷耦合器件CCD（12）、第二激光器（13）、第二半波片（14）、第三准直透镜（15）、第四准直透镜（16）、第一反射镜（17）、第二反射镜（18）、第五准直透镜（19）、针孔（20）、第六准直透镜（21）、陷波滤波器（22）、第二聚焦透镜（23）、光谱仪（24）、电子倍增探测器EMCCD（25）；所述第一激光器（1）出射捕获激光，经过第一准直透镜（3）和第二准直透镜（4）进行扩束准直，依次经过第一二向色镜（5）、第二二向色镜（6）和高数值孔径物镜（7）形成三维稳定捕获光阱，在样品室（8）中捕获微球，第二激光器（13）出射拉曼激发激光，经过第三准直透镜（15）和第四准直透镜（16）进行扩束准直，依次经过第一反射镜（17）、第一二向色镜（5）、第二二向色镜（6）和高数值孔径物镜（7）聚焦在光阱捕获的微球上，激发微球的拉曼光谱信号，微球的拉曼光谱信号依次经过第二二向色镜（6）、第三二向色镜（11）、第二反射镜（18）、第五准直透镜（19）、针孔（20）、第六准直透镜（21）、第二聚焦透镜（23）入射到耦合有电子倍增探测器EMCCD（25）的光谱仪（24）上，通过解算光谱仪（24）的拉曼光谱信号。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述的样品室（8）用于放置微球，同时用于导入待识别气体。
7.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述第一激光器（1）用于形成光阱；所述第一激光器（1）为1064nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器。
8.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述第二激光器（13）用于拉曼激发；所述第二激光器（13）为532nm波长连续波输出的光纤耦合固态激光器。
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