CN110146486B - 一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，具体包括以下步骤：步骤1：清洗硅片将其放入真空物理气相沉积设备中；步骤2：将Ta元素的质量百分数为8.8％～84.2％制备的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面；步骤3：测试病原菌活性，使用菌落计数法分析测试得出所述病原菌的存活率为22％～97％；步骤4：对Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的病原菌进行病原菌原位SERS检测。本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，可保证检测过程中病原菌的活性，同时提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于细菌分析传感技术领域，具体涉及一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法。
背景技术
研究表明：表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering，SERS)是一种超灵敏分析技术，可无损、无标记、原位检测不同种类的生物分子，提供该类分子的化学结构信息(Chang Chen，Yi.Li，Sarp.Kerman，Pieter.Neutens，Kherim.Willems，Sven.Cornelissen，Liesbet.Lagae，Tim.Stakenborg，Pol.Van.Dorpe1.Nature.communications，2018，9，1733)，SERS利用等离子体基底表面产生的局域表面等离子体共振(LSPR)效应，产生局部电磁场(EM)增强及SERS信号的增强。该技术能够通过特异性指纹谱原位识别与等离子体纳米结构接触或接近的分析物，灵敏度可达到单分子水平。SERS技术具备多目标分析能力，样品需求量极少，且能够获得空间分辨率极高的生物图像信号，对于细菌化学通信分子的原位检测，其传感性能主要取决于等离子体基底材料的微观结构，细菌或者细菌分泌的活性通信化合物与细菌的生存传播机制、多重耐药性及抗吞噬性密切相关，因此，开发活性病原菌的无损、原位检测方法具有迫切需求，因此，设计并构建信号灵敏度高、特异度强、稳定性良好、生物兼容性优异的等离子体微纳SERS传感界面是亟待解决的关键问题；
作为一种改进，目前出现了Ag纳米界面用于检测病原菌，虽然Ag纳米结构光学界面比较大且成本低廉，但是，Ag纳米结构化学稳定性较差且杀菌能力极强，阻碍了活性病原菌在Ag微纳界面的高灵敏、高稳定原位SERS测，综上所述，目前Ag微纳界面用于检测病原菌的方法存在不能保持检测过程中病原菌的活性、且检测效率较低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，解决了目前Ag微纳界面用于检测病原菌的方法存在不能保持检测过程中病原菌的活性、且检测效率较低的问题。
本发明所采用的技术方案是，
一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，具体包括以下步骤：
步骤1：清洗，
将清洁后的硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中浸泡5～20分钟，取出浸入后的硅片放入去离子水中浸泡5～15分钟，然后取出浸泡后的硅片并用纯度为97％～99％的氮气吹干，随后将吹干的硅片放入真空物理气相沉积设备中；
步骤2：制备Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，
在所述真空物理气相沉积设备中进行Ta和Ag元素共沉积，其中Ta元素的质量百分数为8.8％～84.2％，即可制备出的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面；
步骤3：测试病原菌活性，
将病原菌置于所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，对所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面的病原菌进行病原菌活性测试，控制时间为1～12小时后，使用菌落计数法分析测试得出所述病原菌的存活率为22％～97％；
步骤4：检测，
对步骤3中所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的病原菌进行病原菌原位SERS检测。
本发明的特点还在于，
步骤1中所述硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中的时间为5～15分钟，放入去离子水中浸泡时间为5～10分钟。
步骤2中所述钽的质量百分数为8.8％～27.3％，所述步骤3中，测得病原菌的存活率为58.0％～95.0％。
步骤2中所述钽的质量百分数为58.4％～84.2％，所述步骤3中，测得病原菌的存活率为64.0％～97.0％。
步骤3中，所述控制时间为1～8小时。
步骤4中，对所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的病原菌进行SERS光谱测试及SERS成像。
本发明的有益效果是，本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，通过在Ag微纳界面中掺杂钽(Ta)元素，形成Ta@Ag双金属界面，抑制纯Ag界面极强的杀菌活性，通过Ta元素掺杂质量分数的调控，有效调控Ta@Ag双金属界面的抑菌效果，实现活性病原菌在Ta@Ag界面的原位SERS检测，本发明保证了检测过程中病原菌的活性，同时提高了检测的效率。
附图说明
图1是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中钽元素掺杂质量百分数8.8％的Ta@Ag双金属微纳复合界面原子力显微镜成像图；
图2是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中钽元素掺杂质量百分数30.6％的Ta@Ag双金属微纳复合界面原子力显微镜成像图；
图3是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中钽元素掺杂质量百分数84.2％的Ta@Ag双金属微纳复合界面原子力显微镜成像图；
图4是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中纯Ag微纳界面原子力显微镜成像图；
图5是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中Ta@Ag双金属微纳复合界面XPS元素扫描图；
图6是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中当Ta元素掺杂质量百分数为I：0，II：8.8％，III：30.6％，IV：84.2％时用菌落计数法分析不同微纳界面的大肠杆菌活性示意图；
图7是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中当Ta元素掺杂质量百分数为I：0，II：8.8％，III：30.6％，IV：84.2％时不同微纳界面大肠杆菌活性分析柱状统计图；
图8是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中Ta@Ag双金属微纳传感界面的4-MPBA检测SERS图谱；
图9是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中Ta@Ag双金属微纳传感界面的大肠杆菌检测SERS图谱；
图10是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中当Ta元素掺杂质量分数为8.8％时的Ta@Ag双金属微纳传感界面大肠杆菌SERS成像图；
图11是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中当Ta元素掺杂质量分数为30.6％时的Ta@Ag双金属微纳传感界面大肠杆菌SERS成像图；
图12是本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法中当Ta元素掺杂质量分数为84.2％时的Ta@Ag双金属微纳传感界面大肠杆菌SERS成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，具体包括以下步骤：
步骤1：清洗，
将清洁后的硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中浸泡5～20分钟，取出浸入后的硅片放入去离子水中浸泡5～15分钟，然后取出浸泡后的硅片并用纯度为97％～99％的氮气吹干，随后将吹干的硅片放入真空物理气相沉积设备中；
步骤2：制备Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，
在所述真空物理气相沉积设备中进行Ta和Ag元素共沉积，其中Ta元素的质量百分数为8.8％～84.2％，即可制备出的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面；
步骤3：测试病原菌活性，
将病原菌置于所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，对所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面的病原菌进行病原菌活性测试，控制时间为1～12小时后，使用菌落计数法分析测试得出所述病原菌的存活率为22％～97％；
步骤4：检测
对步骤3中所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的病原菌进行病原菌原位SERS检测。
钽(Ta)是一种在医疗器械中使用并可直接接触或植入人体的金属生物材料，其生物相容性、耐腐蚀性、断裂韧性极为优异。Ta元素掺杂是改善各种植入式医疗器械生物相容性的理想选择。研究发现：Ta修饰的微纳界面可激活粘着斑激酶，产生良好的细胞表面相互作用(Yu Zhu，Yingxin Gu，Shichong Qiao，Linyi Zhou，Junyu Shi，HongchangLai.Journal of Biomedical Materials Research Part A，2017，105，871-878)，金属Ta氧化形成的五氧化二钽(Ta2O5)纳米层具有良好的细菌吸附能力(Alireza Meidanchia，Azadeh Jafarib，Optics&Laser Technology，2019，111:89-94)。发展Ag@Ta微纳仿生拓扑传感界面可以提高Ag微纳结构的化学稳定性，降低Ag微纳界面极强的抑菌活性，并可增强SERS检测的灵敏度及特异度。
本发明通过Ta元素掺杂并精确调控等离子体微纳结构，构建出Ta@Ag等离子体微纳仿生拓扑传感界面，从而提高SERS信号的灵敏度、特异度、稳定性及病原菌相容性。通过保持病原菌在Ta@Ag等离子体界面的生物活性，进行灵敏、特异的活性病原菌的原位SERS分析。
下面通过具体的实例对本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法进行详细说明。
实施例1
本实施例提供一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，具体包括以下步骤：
步骤1：清洗，
将清洁后的硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中浸泡10分钟，取出浸入后的硅片放入去离子水中浸泡10分钟，然后取出浸泡后的硅片并用纯度为99％的氮气吹干，随后将吹干的硅片放入真空物理气相沉积设备中；
步骤2：制备Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，
在所述真空物理气相沉积设备中进行Ta和Ag元素共沉积，其中Ta元素的质量百分数为8.8％，即可制备出的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，此外，如图1和图5所示，从图中可以看出复合界面主要成分为Ta和Ag两种元素，Ta@Ag界面粗糙度较高，晶粒尺寸约为170nm；
步骤3：测试病大肠杆菌活性，
将大肠杆菌置于所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，对所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面的大肠杆菌进行病大肠杆菌活性测试，控制时间为3小时后，使用菌落计数法分析测试得出所述大肠杆菌的存活率为95％，如图6和图7中的(II)所示，从图中可以看出Ta元素的质量百分数为8.8％的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面具有良好的病原菌相容性；
步骤4：检测
对步骤3中所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的大肠杆菌进行大肠杆菌SERS光谱测试，如图8和图9所示，从图中可以看出Ta元素的质量百分数为8.8％的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，大肠杆菌SERS检测效果良好；由图10所示SERS成像图可以看出，Ta元素的质量百分数为8.8％的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，大肠杆菌SERS成像效果良好。
实施例2
本实施例提供一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，具体包括以下步骤：
将清洁后的硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中浸泡15分钟，取出浸入后的硅片放入去离子水中浸泡5分钟，然后取出浸泡后的硅片并用纯度为97％的氮气吹干，随后将吹干的硅片放入真空物理气相沉积设备中；
步骤2：制备Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，
在所述真空物理气相沉积设备中进行Ta和Ag元素共沉积，其中Ta元素的质量百分数为30.6％，即可制备出的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，如图2所示，从图中可以看出Ta@Ag界面粗糙度较低，晶粒尺寸约为134nm；
步骤3：测试病大肠杆菌活性，
将大肠杆菌置于所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，对所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面的大肠杆菌进行大肠杆菌活性测试，控制时间为4小时后，使用菌落计数法分析测试得出所述大肠杆菌的存活率为22％，如图6和图7中的(III)所示，当Ta元素掺杂质量分数由8.8％提升至30.6％时，大肠杆菌孵育后的存活率有所下降；
步骤4：检测
对步骤3中所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的大肠杆菌进行大肠杆菌SERS成像，如图11所示，大肠杆菌SERS成像效果一般；
实施例3
本实施例提供一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，具体包括以下步骤：
将清洁后的硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中浸泡20分钟，取出浸入后的硅片放入去离子水中浸泡15分钟，然后取出浸泡后的硅片并用纯度为99％的氮气吹干，随后将吹干的硅片放入真空物理气相沉积设备中；
步骤2：制备Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，
在所述真空物理气相沉积设备中进行Ta和Ag元素共沉积，其中Ta元素的质量百分数为84.2％，即可制备出的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，如图3所示，从图中可以看出Ta@Ag界面粗糙度较低，晶粒尺寸约为50nm；
步骤3：测试病大肠杆菌活性，
将大肠杆菌置于所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，对所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面的大肠杆菌进行大肠杆菌活性测试，控制时间为6小时后，使用菌落计数法分析测试得出所述大肠杆菌的存活率为97％，如图6和图7(IV)中的所示；当Ta元素掺杂质量分数由30.6％提升至84.2％时，大肠杆菌孵育后的存活率有所提高；
步骤4：检测
对步骤3中所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的大肠杆菌进行大肠杆菌SERS成像，如图12所示，大肠杆菌SERS成像效果良好。
对比实施例
步骤1：清洗，
将清洁后的硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中浸泡10分钟，取出浸入后的硅片放入去离子水中浸泡10分钟，然后取出浸泡后的硅片并用纯度为99％的氮气吹干，随后将吹干的硅片放入真空物理气相沉积设备中；
步骤2：制备Ag等离子体微纳复合传感界面，
在所述真空物理气相沉积设备中进行Ag元素沉积，即可制备出的Ag等离子体微纳复合传感界面，如图4所示，由图可见纯Ag微纳界面表面粗糙度较高，晶粒尺寸较大；
步骤3：测试病大肠杆菌活性，
将大肠杆菌置于所述Ag等离子，对所述Ag等离子体微纳复合传感界面的大肠杆菌进行大肠杆菌活性测试，控制时间为7小时后，使用菌落计数法分析测试得出所述大肠杆菌的存活率为0％，如图6和图7中的(I)所示；当使用纯Ag等离子体微纳复合传感界面时，大肠杆菌孵育7小时后的存活率为0％。
因此，可以得出当掺杂入Ta元素形成Ta@Ag双金属界面后，大肠杆菌孵育后的存活率显著升高。
本发明一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，通过精确调控Ta元素掺杂质量分数，抑制纯Ag微纳界面极强的杀菌活性，并将Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面应用于活性病原菌、活性病原菌功能基团、活性病原菌代谢物等的原位、快速、无损SERS检测及实时监控，以及用于药物药效分析及抑菌药物的快速筛选，能有效提高检测效率，减少分析周期，是一种新的活性病原菌分析方法，可推广使用。
Claims (5)
1.一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1：清洗，
将清洁后的硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中浸泡5~20分钟，取出浸入后的所述硅片放入去离子水中浸泡5~15分钟，然后取出浸泡后的所述硅片并用纯度为97%~99%的氮气吹干，随后将吹干的所述硅片放入真空物理气相沉积设备中；
步骤2：制备Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，
在所述真空物理气相沉积设备中进行Ta和Ag元素共沉积，其中Ta元素的质量百分数为8.8%~84.2%，即可制备出的Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面；
步骤3：测试病原菌活性，所述病原菌为大肠杆菌；
将病原菌置于所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面，对所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面的病原菌进行病原菌活性测试，控制时间为1~12小时后，使用菌落计数法分析测试得出所述病原菌的存活率为22%~97%；
步骤4：检测
对步骤3中所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的病原菌进行病原菌原位SERS检测；
对所述Ta@Ag等离子体微纳复合传感界面中的病原菌进行SERS光谱测试及SERS成像。
2.根据权利要求1所述的一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，其特征在于，所述步骤1中所述硅片衬底浸入乙醇、丙酮溶液中的时间为5~15分钟，放入去离子水中浸泡时间为5~10分钟。
3.根据权利要求1所述的一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，其特征在于，所述步骤2中所述Ta元素的质量百分数为8.8%~27.3%，所述步骤3中，测得病原菌的存活率为58.0%~95.0%。
4.根据权利要求1所述的一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，其特征在于，所述步骤2中所述Ta元素的质量百分数为58.4%~84.2%，所述步骤3中，测得病原菌的存活率为64.0%~97.0%。
5.根据权利要求1所述的一种基于Ta@Ag微纳界面的活性病原菌原位检测方法，其特征在于，所述步骤3中，所述控制时间为1~8小时。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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