CN104874809A - 一种sers基底复合材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于无机功能材料技术领域，特指一种SERS基底复合材料及其制备方法。以氧化石墨烯为模板，硝酸银为前驱体，通过静电吸附作用获得Ag⁺/GO复合物，然后加入氨水调节反应溶液pH值并且与Ag⁺形成Ag-N键，然后加入抗坏血酸将Ag⁺还原成Ag，并且部分还原氧化石墨烯，从而获得Ag/rGO复合物。Ag/rGO复合物中纳米银颗粒尺寸为40~200nm，Ag/rGO复合物具有良好的SERS性能，并且能够探测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；具有生物相容性。b/

Description

一种SERS基底复合材料及其制备方法

技术领域

       本发明属于无机功能材料技术领域，特指一种SERS基底复合材料及其制备方法，采用氧化石墨烯（GO）为模板，硝酸银为前驱体，氨水为pH调节剂，抗坏血酸为还原剂，制备得到可用于细菌检测的Ag/rGO SERS基底。

背景技术

SERS技术是一种十分实用的探测技术，能够通过物质内特殊基团的特征振动峰准确而又灵敏地对物质进行鉴定，并且这样一种测试是无损测试；目前研究人员已经利用SERS技术成功对单分子、蛋白质、DNA以及小分子毒素和细菌等进行了探测，其中对细菌的探测一直是人们研究的重点，因为这有望应用于食品安全的检测中；在长期的SERS研究中，研究人员发现贵金属（Ag、Au、Cu）以及过渡金属（Pt，Pd，Ru，Rh，Fe，Co，Ni等）都具有较好的SERS效应，其中Ag表现出了极强的SERS效应，成为SERS基底研究的热门；但是不同的氧化还原过程会使同一种金属基底具有多种晶体构型，这使得金属基底和检测分子之间会存在多种化学相互作用，这样形成的多种吸附键和诱导键的振动、金属与分子见电荷转移以及金属边缘效应都会对SERS检测造成干扰，使得SERS光谱往往混有金属基底背底，不能作为一种准确的一级结构的分析依据。

石墨烯，具有大比较面积、较大的杨氏模量、极高的载流子迁移率等特点，是一种优良的纳米粒子的载体，得到的复合材料能与细菌紧密接触，提高SERS检测的灵敏度，已有一些研究成功地将Ag纳米颗粒与部分被还原的GO（rGO）复合获得Ag/rGO复合材料，并成功地对单分子（罗丹明6G，结晶紫，叶酸）进行了SERS探测，但关于Ag/rGO对于细菌的探测还鲜有报道；此外，SERS基底的生物活性也一直是研究人员关注的重点，这切实关系到利用SERS基底进行生物探测在食品安全检测中应用的安全性。

       本发明采用GO为模板，硝酸银为前驱体，氨水为pH调节剂，抗坏血酸为还原剂，冰水浴下制备Ag/rGO复合材料，获得了纳米银颗粒粒径为40-200nm的Ag/rGO复合材料；该复合材料具有良好的SERS性能，能够成功对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行探测，并且由于rGO本身是生物相容性材料，复合材料具有良好生物相容性。

发明内容

       本发明的目的在于采用GO为模板，硝酸银为前驱体，抗坏血酸为还原剂，氨水为pH调节剂，冰水浴下制备具有生物相容性的Ag/rGO复合材料，所获得的Ag/rGO中纳米银颗粒尺寸为40~200nm，具有良好的SERS性能，并且能够成功探测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌。

       一种制备Ag/rGO新型SERS基底复合材料的方法，所用原料为：氧化石墨烯（自制）、AgNO₃（分析纯）、抗坏血酸（分析纯）、NH₃·H₂O（10%）、去离子水。

制备工艺为：

（1）将硝酸银水溶液和GO悬浮液混合，室温下磁力搅拌均匀，获得Ag⁺/GO悬浮液；然后调节Ag⁺/GO悬浮液的pH值为9~10.5，再搅拌均匀。

（2）将抗坏血酸水溶液加入Ag⁺/GO悬浮液中，再加入调节体系pH值到9~10.5，磁力搅拌反应后获得Ag/rGO悬浮液。

（3）将获得的Ag/rGO悬浮液离心水洗、冷冻干燥后获得Ag/rGO复合物。

进一步的，硝酸银与GO的质量比为1~4:1；优选为3:1。

进一步的，GO悬浮液的浓度为0.1 mg/mL，硝酸银水溶液的浓度范围1~4 mg/mL，优选值为3mg/mL，硝酸银水溶液与GO悬浮液的体积比为1:10。

进一步的，步骤（1）和（2）中采用NH₃·H₂O调节体系的pH值；NH₃·H₂O中的N可以和Ag形成Ag-N键，有助于反应的进一步进行，并且在碱性条件下，抗坏血酸的还原性会进一步提高。

进一步的，磁力搅拌的反应温度为冰水浴、室温和70℃，优选冰水浴；磁力搅拌反应的时间为150 min；不同温度下，反应成核的速度和核生长速率都是不同的，需要尝试不同温度，以确定最佳温度范围。

进一步的，抗坏血酸水溶液的浓度为4 mg/mL，抗坏血酸水溶液与GO水溶液的体积比为1:5。

       本发明的优点在于利用原位还原法，以GO为模板，硝酸银为原料，具有生物活性的抗坏血酸为还原剂，直接制备得到了Ag/rGO复合材料；这种复合材料以rGO为基体，能够有效地吸附在细菌表面，提高复合材料对细菌的探测能力，能够探测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌；同时，这种复合材料又具有良好的生物相容性，能够安全的使用。

附图说明

图1为实施例1的Ag/rGO与GO的XRD对比图片。

图2为实施例2的不同pH值条件下获得的Ag/rGO的SEM图片；a、b、c分别是pH值为9、10和10.5条件下制备的Ag/rGO复合材料的SEM图。

图3为实施例3的不同温度处理条件下获得的Ag/ rGO的SEM图片；a、b、c分别是温度为冰水浴、室温和70℃条件下制备的Ag/rGO复合材料的SEM图。

图4为实施例4的不同硝酸银用量获得的Ag/rGO的TEM图片；a、b、c、d分别为AgNO₃：GO值为1：1、2：1、3：1和4：1获得的Ag/rGO的TEM图片。

图5为实施例5的复合材料对大肠杆菌的SERS图片。

图6为实施例6的复合材料对金黄色葡萄球菌的SERS图片。

图7为实施例7的复合材料的MTT测试结果统计图。

具体实施方式

实施例1

       将GO配置成浓度为0.1 mg/mL悬浮液并超声至均匀分散；将10 mL，3 mg/mL的硝酸银水溶液和100 mL GO水溶液混合，室温下磁力搅拌30 min，获得Ag⁺/GO悬浮液；然后滴加NH₃·H₂O（10%）调节pH到10，再搅拌10 min；将20 mL抗坏血酸水溶液（4 mg/mL）加入Ag⁺/GO悬浮液中，再加入滴加NH₃·H₂O（10%）调节pH到10，磁力搅拌150 min后获得Ag/rGO悬浮液；将获得的Ag/rGO悬浮液离心水洗3次，冷冻干燥后获得Ag/rGO复合材料。

图1(a)为实施例1中获得的Ag/rGO复合材料的XRD图谱。

图1(a)中，可以明显的观察到4个衍射峰，2θ=38.2°，44.4°，64.7°和77.7°，分别对应面心立方银晶体（JCPDS card No. 04-0783)的(111)、(200)、(220)和(311)晶面。

图1(b)为GO的XRD图谱。

比较a、b两图，可以发现在10.5°处的C（002）重新迁移回26.7°，这是由于在反应过程中GO表面部分含氧官能团被移除，石墨烯片层减小，说明反应过程中，抗坏血酸将GO部分还原成了rGO；XRD结果进一步表明我们成功制备了Ag NPs-rGO粉体。

实施例2

       实施例2主要考察了制备过程中不同pH值对Ag/rGO复合材料结构形貌的影响。

将GO配置成浓度为0.1 mg/mL悬浮液并超声至均匀分散；将10 mL，1mg/mL的硝酸银水溶液和100 mL GO水溶液混合，室温下磁力搅拌30 min，获得Ag⁺/GO悬浮液；然后分别滴加NH₃·H₂O（10%）调节pH为9、10和10.5，再搅拌10 min；将20mL抗坏血酸水溶液（4 mg/mL）加入Ag⁺/GO悬浮液中，再分别加入滴加NH₃·H₂O（10%）再次调节pH为9、10和10.5，磁力搅拌150 min后获得Ag/rGO悬浮液；将获得的Ag/rGO悬浮液离心水洗3次，冷冻干燥后获得Ag/rGO复合材料。

       图2(a-c)分别是pH值为9、10和10.5条件下制备的Ag/rGO复合材料的SEM图；从图中可以看出，随着pH值的增加，rGO表面上吸附的Ag纳米颗粒也会增加，但是随着pH值增加超过10之后，Ag纳米颗粒开始出现明显的团聚现象。SEM结果表明制备过程中pH值10为最佳的。

实施例3

       实施例3主要考察了制备过程中不同温度对Ag/rGO复合材料结构形貌的影响。

将GO配置成浓度为0.1 mg/mL悬浮液并超声至均匀分散；将10 mL，1mg/mL的硝酸银水溶液和100 mL GO水溶液混合，室温下磁力搅拌30 min，获得Ag⁺/GO悬浮液；然后滴加NH₃·H₂O（10%）调节pH到10，再搅拌10min；分别在冰水浴、室温和70℃条件下，将20mL抗坏血酸水溶液（4 mg/mL）加入Ag⁺/GO悬浮液中，再加入滴加NH₃·H₂O（10%）调节pH到10，磁力搅拌150 min后获得Ag/rGO悬浮液；将获得的Ag/rGO悬浮液离心水洗3次，冷冻干燥后获得Ag/rGO复合材料。

       图3(a-c)分别是温度为冰水浴、室温和70℃条件下制备的Ag/rGO复合材料的SEM图；从图中可以看出，随着温度浓度的上升，rGO表面的Ag纳米颗粒开始出现不同程度的团聚现象，并且在70℃时出现了明显的颗粒长大，SEM结果表明制备过程中使用冰水浴是最佳的。

实施例4

       实施例4主要考察了制备过程中不同AgNO₃与GO的配比对Ag/rGO复合材料结构形貌的影响。

将GO配置成浓度为0.1 mg/mL悬浮液并超声至均匀分散；分别将10 mL，1、2、3、4mg/mL的硝酸银水溶液和100 mL GO水溶液混合，室温下磁力搅拌30 min，获得Ag⁺/GO悬浮液；然后滴加NH₃·H₂O（10%）调节pH到10，再搅拌10min；在冰水浴条件下，将20mL抗坏血酸水溶液（4 mg/mL）加入Ag⁺/GO悬浮液中，再加入滴加NH₃·H₂O（10%）调节pH到10，磁力搅拌150 min后获得Ag/rGO悬浮液；将获得的Ag/rGO悬浮液离心水洗3次，冷冻干燥后获得Ag/rGO复合材料。

       图4（a-d）分别为AgNO₃：GO值为1：1、2：1、3：1和4：1获得的Ag/rGO的TEM图片。

比较4a、b、c和d可以发现，随着AgNO₃与GO比例的增加，rGO片层上的Ag纳米颗粒数量是增加的、并且纳米银尺寸也会有增加，AgNO₃与GO比例为1:1时，Ag纳米颗粒粒径为60~80 nm，比例为1:2时，颗粒粒径为40~150nm，比例为1:3时，大颗粒的Ag纳米颗粒粒径为80~170 nm，比例为1:4时，大颗粒粒径为135 nm~200 nm；在AgNO₃与GO比例为1:3时在较大的Ag纳米颗粒周围以及石墨烯褶皱处开始出现尺寸1~5 nm的小Ag纳米颗粒，而当比例上升到1:4时Ag纳米颗粒开始出现明显团聚；研究一般认为，具有良好SERS性能的Ag纳米颗粒尺寸一般在100 nm左右，故TEM结果表明AgNO₃与GO比例为1:3为最佳。

实施例5

       实施例5是利用实施例1中获得的Ag/rGO复合材料，以大肠杆菌作为革兰氏阴性菌的的代表，进行了SERS探测。

SERS样品准备方法如下：首先培养大肠杆菌菌液，使菌液培养至OD值为0.8-1.0即可，如此菌液中含有菌数量约为0.8-1.0×10⁶ cuf/mL，然后接菌；将Ag/rGO复合材料通过超声分散在水中配置成1 μg/mL的悬浮液；将500 μL Ag/rGO悬浮液与500 μL菌液混合，静置30 min，让Ag/rGO与细菌充分接触，离心获得Ag/rGO与细菌混合物，再加入500 μL PBS溶液，重新分散开，以该分散液作为SERS检测样品溶液，检测结果为图5。

在图5中我们可以看到11个明显的特征振动峰，其波数分别是210、659、822、1109、1189、1241、1373、1403、1478、1594和1665 cm^-1；其中659 cm^-1对应的是鸟嘌呤核苷酸的特征振动峰，1109 cm^-1对应的是苯丙氨酸的特征振动峰，1241 cm^-1对应的是蛋白质中N(III)的特征振动峰，1373 cm^-1对应氨基酸中的COO-的特征振动峰，1478 cm^-1对应的是油脂中变形的CH₂振动峰，1404 cm^-1对应的是α氨基酸的特征振动峰，1594 cm^-1对应的是蛋白质中N(II)的特征振动峰，1665 cm^-1对应的是蛋白质中N(I)的特征振动峰；此外，在210 cm^-1的特征振动峰是Ag与NH₃·H₂O形成Ag-N键的特征振动峰；但是，还有两个的特征振动峰（822和1181 cm^-1）还没有文献中查到，这个结果表明，制备的Ag/rGO复合材料是一种良好的SERS基底，能够实现水溶液中的大肠杆菌的检测。

实施例6

实施例6是利用实施例1中获得的Ag/rGO复合材料，以金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性菌的代表，进行了SERS探测，SERS样品准备方法与实施例5相同，结果如图6所示。

观察图6，可以明显的看到12个特征振动峰，波数分别是228、733、929、1017、1245、1334、1374、1441、1548、1599、1665和1705 cm^-1；其中733 cm^-1对应的是腺嘌呤的特征振动峰，1017 cm^-1对应的是苯丙氨酸的特征振动峰，1245 cm^-1对应的是蛋白质中N(III)的特征振动峰，1334 cm^-1对应的是AMP的特征振动峰，1374 cm^-1对应的是氨基酸COO-的特征振动峰，1441 cm^-1对应的是油脂中变形的CH₂振动峰，1594 cm^-1对应的是蛋白质中N(II)的特征振动峰，1665 cm^-1对应的是蛋白质中N(I)的特征振动峰；此外，228 cm^-1的是Ag与NH₃·H₂O形成Ag-N键的特征振动峰；其中，929、1334、1548和1705 cm^-1并没有在相关文献中找到对应特征峰；结果表明，制备的Ag/rGO复合材料也能够实现对水溶液中的金黄色葡萄球菌的检测。

实施例7

实施例7是利用MTT比色法，用人肝癌细胞系 HepG2，对实例1中获得的Ag/rGO复合材料进行生物相容性测试，实验步骤如下：测试Ag/rGO复合材料对于人肝癌细胞系（HepG2）的细胞毒性。

将细胞悬液浓度调整为2×104 cells/ml，并将细胞悬液接种于无菌的96孔板内，其中每孔均加入100 μl细胞悬液；5% CO₂，37 ℃ 孵育，至细胞单层铺满孔底，分别加入浓度梯度的Ag/rGO（10，25，50，75，100 ppm），每孔设置3-5组重复孔，5 % CO₂，37 ℃孵育24小时；每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5 % MTT），继续孵育4 h后，终止培养，取出96孔板小心地吸掉培养基的上清液，小心用PBS冲2-3遍；为了使孔内结晶物充分溶解，向每孔加入150 μl的DMSO，并低速振荡10分钟，在OD490 nm处用酶联检测仪来测量孔内吸光值。

MTT测试结果如图7所示，可以看到在100ppm范围内人体肝癌细胞存活率较高，Ag/rGO复合材料不会对人体肝癌细胞的生长造成影响，进而说明Ag/rGO复合材料具有较好的生物相容性。

Claims (10)

1.一种SERS基底复合材料，其特征在于：所述SERS基底复合材料为Ag/rGO复合物，Ag/rGO复合物中纳米银颗粒尺寸为40~200nm，Ag/rGO复合物具有良好的SERS性能，并且能够探测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；具有生物相容性。

2.如权利要求1所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于：以氧化石墨烯为模板，硝酸银为前驱体，通过静电吸附作用获得Ag⁺/GO复合物，然后加入氨水调节反应溶液pH值并且与Ag⁺形成Ag-N键，然后加入抗坏血酸将Ag⁺还原成Ag，并且部分还原氧化石墨烯，从而获得Ag/rGO复合物。

3.如权利要求2所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）将硝酸银水溶液和GO悬浮液混合，室温下磁力搅拌均匀，获得Ag⁺/GO悬浮液；然后调节Ag⁺/GO悬浮液的pH值为9~10.5，再搅拌均匀；

（2）将抗坏血酸水溶液加入Ag⁺/GO悬浮液中，再加入调节体系pH值到9~10.5，磁力搅拌反应后获得Ag/rGO悬浮液；

（3）将获得的Ag/rGO悬浮液离心水洗、冷冻干燥后获得Ag/rGO复合物。

4.如权利要求3所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于：硝酸银与GO的质量比为1~4:1。

5.如权利要求4所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于：硝酸银与GO的质量比为3:1。

6.如权利要求3所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于：GO悬浮液的浓度为0.1 mg/mL，硝酸银水溶液的浓度范围1~4 mg/mL，硝酸银水溶液与GO悬浮液的体积比为1:10。

7.如权利要求6所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于：硝酸银水溶液的浓度范围3mg/mL。

8.如权利要求3所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中采用NH₃·H₂O调节体系的pH值；NH₃·H₂O中的N能够和Ag形成Ag-N键，有助于反应的进一步进行，并且在碱性条件下，抗坏血酸的还原性会进一步提高。

9.如权利要求3所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于：磁力搅拌的反应温度为冰水浴、室温和70℃，优选冰水浴；磁力搅拌反应的时间为150 min。

10.如权利要求3所述的一种SERS基底复合材料的制备方法，其特征在于：抗坏血酸水溶液的浓度为4 mg/mL，抗坏血酸水溶液与GO水溶液的体积比为1:5。