CN113702638A - 一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒 - Google Patents
一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113702638A CN113702638A CN202110973866.0A CN202110973866A CN113702638A CN 113702638 A CN113702638 A CN 113702638A CN 202110973866 A CN202110973866 A CN 202110973866A CN 113702638 A CN113702638 A CN 113702638A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cuins
- monoclonal antibody
- zns
- cea
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 title claims abstract 19
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 25
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims abstract description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 4
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 abstract description 2
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 45
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 45
- 229910052984 zinc sulfide Inorganic materials 0.000 description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 6
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- PSCMQHVBLHHWTO-UHFFFAOYSA-K indium(iii) chloride Chemical compound Cl[In](Cl)Cl PSCMQHVBLHHWTO-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- NBOMNTLFRHMDEZ-UHFFFAOYSA-N thiosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1S NBOMNTLFRHMDEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940103494 thiosalicylic acid Drugs 0.000 description 3
- -1 1- (3-methylenepropyl) -ethylcarbodiimide hydrochloride Chemical compound 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005083 Zinc sulfide Substances 0.000 description 2
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 229910052979 sodium sulfide Inorganic materials 0.000 description 2
- GRVFOGOEDUUMBP-UHFFFAOYSA-N sodium sulfide (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[S-2] GRVFOGOEDUUMBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 2
- DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N zinc;sulfide Chemical compound [S-2].[Zn+2] DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNXGGWNCFXZSAI-UHFFFAOYSA-N 2-morpholin-2-ylethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCC1CNCCO1 HNXGGWNCFXZSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DSSYDPGRYHVFLK-UHFFFAOYSA-N [S--].[S--].[Zn++].[Zn++] Chemical compound [S--].[S--].[Zn++].[Zn++] DSSYDPGRYHVFLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒,该试剂盒包括:生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米材料标记的CEA单抗二、双元激发液。双元激发液由Tris‑HCl、N2H4·H2O及H2O2组成。CuInS2@ZnS纳米晶可在双元激发液的激发下可以产生闪光型化学发光,发光波段位于近红外区。该试剂盒基于CuInS2@ZnS纳米晶可产生闪光型化学发光的原理实现CEA抗原的检测,本发明的试剂盒检测速度快,灵敏度高,稳定性好,材料合成方法简单、成功率高、光稳定性好,且化学发光波段位于近红外区。该试剂盒在50pg/mL‑100ng/mL的浓度范围内表现出良好的线性关系,检测限为30pg/mL,具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域,涉及一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒。
背景技术
化学发光免疫检测包含免疫化学反应和化学发光反应。化学发光免疫检测是指将化学发光物质标记在抗原或抗体上,抗原与抗体特异性结合形成免疫复合物,化学发光物质经激发液激发后形成激发态中间体,其返回基态的过程中能量以光子的形式释放出来,利用光子计数器或其他仪器检测发光强度,待测物质浓度可与发光强度成一定关系从而实现检测目的。
目前市场上用于化学发光免疫检测的化学发光物质分为辉光型和闪光型,相比辉光型,闪光型化学发光免疫检测能够实现短时间内的快速检测,应用较广。最常用的闪光型化学发光物质为吖啶酯类化合物,在含有H2O2的碱性条件下,首先生成有张力且不稳定的二氧乙烷,而后快速分解并释放光子,产生430nm的化学发光辐射。然而,吖啶酯类物质见光易分解,且合成工序较为复杂。
CuInS2@ZnS纳米晶合成方法快速简单,光稳定性好,且能够与特定激发液产生近红外区的闪光型化学发光,在化学发光免疫检测领域具有良好的应用前景。本发明的发明人前期专利文件公开了一种兼有光致发光和化学发光特性的CuInS2@ZnS纳米材料的制备方法(CN111944521A)和一种制备具有化学发光特性的羧基化CuInS2@ZnS纳米材料的通用型方法(CN112940719A)。皆是以CuInS2@ZnS纳米材料作发光物,以水合肼作共反应剂,可在近红外区产生化学发光辐射。然而,如果要将上述体系应用到化学发光免疫检测领域,该体系的发光强度还远远不够,且发光时间较长,不利于快速检测。
因此,开发具有光稳定性的闪光型化学发光体系的化学发光免疫检测试剂盒,具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足,尤其是现有的闪光型化学发光免疫检测试剂盒光稳定性较差,合成工艺复杂的不足,本发明提供一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫检测试剂盒。
术语解释:
CEA:癌胚,英文名为carcinoembryonic antigen,简称CEA。
MES:2-吗啉乙磺酸,英文名为2-(4-Morpholino)ethanesulfonic acid,简称MES。
EDC:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,英文名为1-(3-Dimethylaminopropyl)-ethylcarbodiimide hydrochloride,简称EDC。
磺基-NHS:N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐,英文名为Hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonicacid sodium salt,简称磺基-NHS。
本发明的技术方案如下:
一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒,包括:
生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二、双元激发液;
所述的双元激发液包含Tris-HCl、N2H4·H2O和H2O2。
根据本发明,优选的,所述的CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二是通过CEA单抗二上的氨基与CuInS2@ZnS纳米晶上的羧基偶联反应得到;
进一步优选的,制备过程包括步骤如下:
将CuInS2@ZnS纳米晶离心后复溶于三倍原体积pH为6.0的0.1mol/L MES溶液中,每毫升CuInS2@ZnS原液中加入5.8μL 1mg/mL EDC、16.3μL 1mg/mL磺基-NHS,活化羧基15-40分钟;每毫升CuInS2@ZnS原液中加入2μL巯基乙醇终止未反应的EDC,加入CEA单抗二使其浓度为1μg/mL,混匀常温反应2小时,利用CEA单抗二上的氨基与CuInS2@ZnS纳米晶上的羧基偶联反应,离心3次以除去未反应的CEA单抗二;加入甘氨酸封闭CuInS2@ZnS纳米晶上未反应的羧基,4℃保存备用。
根据本发明,优选的,所述的0.1mol/L MES溶液配制方法如下:称取MES和NaCl使其浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L,用6mol/L的NaOH溶液调节pH为6.0。
根据本发明,优选的,双元激发液中:Tris浓度为0.1mol/L,N2H4·H2O浓度为10mmol/L,HCl调节pH为7.0,H2O2的浓度为1mol/L。
根据本发明,优选的,双元激发液中的Tris浓度为0.05-0.2mol/L,最优选0.1mol/L;N2H4·H2O浓度为5-30mmol/L,进一步优选10-20mmol/L;H2O2的浓度为0.01mol/L以上,进一步优选0.5mol/L以上,更优选1-2mol/L。
根据本发明,优选的,生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二的质量比为1:20:1。
根据本发明,所述的CuInS2@ZnS纳米晶可按照现有技术制备得到,可参考CN112940719A。以硫代水杨酸和柠檬酸钠作双配体,以氯化铜、氯化铟、硫化钠、醋酸锌和硫脲为原料,通过一锅法制备。
根据本发明,生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CEA单抗二、CEA抗原为常规市购产品,北京科跃中楷生物技术有限公司有售。
根据本发明,利用上述基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒,进行化学发光免疫检测的方法,包括步骤如下:
将生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二混合后反应形成磁性复合物悬浮液,将磁性复合物悬浮液置于磁场中磁分离,洗涤磁性复合物,转移至样品池内,待激发液激发;
将新制双元激发液快速注入到样品池中,采集化学发光信号。激发液注入到样品池后,与CuInS2@ZnS纳米晶反应产生化学发光。注入瞬间即可产生化学发光,且发光时间一般为1-10秒,属于闪光型化学发光体系,化学发光辐射波段位于近红外区,750-790nm,化学发光强度强;
优选的,总量为1μmol的CuInS2@ZnS纳米晶制备的检测试剂盒,瞬时发光强度可达500k以上。
根据本发明,优选的,生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二混合后反应时间为30-60分钟,反应温度为常温。
本发明的原理:
本发明的化学发光免疫检测试剂盒,以CuInS2@ZnS纳米晶作发光物,以水合肼作共反应剂,H2O2作为反应增强剂。在没有H2O2的条件下,CuInS2@ZnS纳米晶与水合肼可以进行化学反应产生化学发光,但是其发光强度很低,发光时间很长,50s仍有化学发光产生,不利于化学发光免疫检测。发明人发现H2O2的加入,将会大大增强CuInS2@ZnS纳米晶与水合肼的反应剧烈程度,不但使其快速反应完成,而且反应的化学发光在短时间内容释放,使得化学发光强度大大提高。
本发明的有益效果如下:
1.与传统闪光型化学发光物质吖啶酯类相比,本发明的发光物质CuInS2@ZnS纳米晶合成方法简单,制备反应条件温和,制备成功率高,且所需时间短,可以在短时间内大量合成。
2.传统闪光型化学物质吖啶酯类化合物见光易分解,需避光储存,本发明的发光物质CuInS2@ZnS纳米晶在水中具有良好的稳定性,对光耐受性强,见光不分解。
3.本发明的化学发光免疫检测试剂盒的化学发光物质CuInS2@ZnS纳米晶,可与水合肼在近红外区产生化学发光辐射,波长为750-790nm。CuInS2@ZnS纳米晶具有荧光辐射性能,荧光波长位于660-700nm,光稳定性好。
4.本发明的化学发光免疫检测试剂盒,发光强度强,总量为1μmol的CuInS2@ZnS纳米晶制备的检测试剂盒,瞬时发光强度可达500k以上;发光时间短,发光时间为1-10秒,属于闪光型强化学发光免疫检测试剂盒。
5.本发明的化学发光免疫检测试剂盒检测速度快,灵敏度高,稳定性好,在50pg/mL-50ng/mL的浓度范围内表现出良好的线性关系,检测限为30pg/mL,具有极好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中CEA抗原校准品标准曲线图。
图2为实施例1中CEA抗原浓度为1nmol/L时的化学发光光强曲线。
图3为实施例1中CEA抗原浓度为1nmol/L时的化学发光光谱曲线。
图4为对比例1中CEA抗原浓度为1nmol/L时的化学发光光强曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明,但不限于此。
本发明实施例所用N2H4·H2O质量分数为50%,H2O2质量分数为30%,生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CEA单抗二、CEA抗原均购自北京科跃中楷生物技术有限公司。
实施例中发光曲线由西安瑞迈检测仪器有限公司生产的多功能化学发光检测仪采集获得,标准品光强由曲线的积分面积求出。
实施例中CuInS2@ZnS纳米晶,参考CN112940719A公开的方法制备得到。即:一锅法合成硫代水杨酸、柠檬酸钠双稳定剂包被的CuInS2@ZnS纳米晶,包括步骤如下:
(1)称取0.024g硫代水杨酸加入100mL三口烧瓶中,加10mL去离子水搅拌溶解,再加入30mL去离子水;
(2)向步骤(1)中依次加入800μL浓度为0.04mol/L柠檬酸钠溶液、2mL浓度为0.01mol/L的氯化铜溶液、80μL浓度为1mol/L的三氯化铟溶液,搅拌反应5min;
(3)向步骤(2)中加入124μL浓度为1mol/L的硫化钠溶液,95℃加热回流45min;
(4)向步骤(3)中加入4mL硫化锌溶液,95℃继续回流40min,即得,在4℃环境下保存。
所述的硫化锌溶液为浓度为0.04mol/L醋酸锌和浓度为0.04mol/L硫脲反应得到,调节pH至5.7-6.3。
实施例1
一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫检测试剂盒,包括:
生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二、双元激发液;
所述的双元激发液包含Tris、HCl和N2H4·H2O以及H2O2。
CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二,按如下方法制备得到:
取1毫升制得的CuInS2@ZnS纳米晶离心三次后复溶于3毫升pH为6.0的0.1mol/L的MES溶液中,加入5.8μL 1mg/mL EDC、16.3μL 1mg/mL磺基-NHS活化羧基15-40分钟。再加入2μL巯基乙醇终止未反应的EDC。加入300μL10μg/mL的CEA单抗二,混匀常温反应2小时,利用CEA单抗二上的氨基与CuInS2@ZnS纳米晶上的羧基偶联反应。离心3次以除去未反应的CEA单抗二。加入3μL 1%的甘氨酸封闭CuInS2@ZnS纳米晶上未反应的羧基。4℃保存待用。
上述所述的0.1mol/L MES溶液配制方法如下:称取0.6398gMES和0.8775gNaCl溶于30mL去离子水,用6mol/L的NaOH溶液调节pH为6.0。
所述的双元激发液:包含Tris、HCl和N2H4·H2O,配制10mL 0.1mol/L的Tris溶液,加入11.8μL水合肼,用浓HCl调节pH为7.0。取其中8.5mL与1.5mL质量浓度为30%的H2O2混合制得双元激发液。
利用上述基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒,进行化学发光免疫检测的方法,包括步骤如下:
取50μL1μg/mL的生物素标记的CEA单抗一、50μL10μg/mL制备的CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二、10μL0.1mg/mL链霉亲和素标记的磁珠、10μLCEA抗原标准溶液,常温下混合反应30-60分钟,形成磁性复合物悬浮液,将磁性复合物悬浮液置于磁场中,磁分离2分钟,多次洗涤磁性复合物,转移至特定样品池内,待激发液激发;
然后快速注入200μL激发液到样品池中,采集化学发光信号,计算积分面积。采集信号时间为3-5s,其化学发光波段位于近红外区,在760nm左右。
CEA抗原标准溶液按如下方法配置:
将购置的CEA抗原按30pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL的比例制备模拟血清中CEA标准品,具体操作为:
以磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制0.1mol/L pH为7.0的标准品缓冲液,以标准品缓冲液制备浓度梯度为0pg/mL、30pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、10000pg/mL、50000pg/mL、100000pg/mL、500000pg/mL的11个标准品浓度,其中0pg/mL为标准品缓冲液。
检测得到的标准曲线图如图1所示。由图1可知,该化学发光检测试剂盒在抗原浓度为50-100000pg/mL的范围内表现出良好的线性关系,完全满足临床上的CEA抗原检测范围,信噪比和灵敏度高,检测限低至30pg/mL,表现出优异的传感性能。
对比例1
如实施例1所述,不同的是:
采用的激发液为单元激发液,即不加入H2O2,其他条件不变。此时几乎检测不到化学发光信号,因此无法应用于化学发光免疫检测,如图4所示。
Claims (7)
1.一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:
生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二、双元激发液;
所述的双元激发液包含Tris-HCl、N2H4·H2O和H2O2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二是通过CEA单抗二上的氨基与CuInS2@ZnS纳米晶上的羧基偶联反应得到。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述的CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二制备过程包括步骤如下:
将CuInS2@ZnS纳米晶离心后复溶于三倍原体积pH为6.0的0.1mol/L MES溶液中,每毫升CuInS2@ZnS原液中加入5.8μL 1mg/mL EDC、16.3μL 1mg/mL磺基-NHS,活化羧基15-40分钟;每毫升CuInS2@ZnS原液中加入2μL巯基乙醇终止未反应的EDC,加入CEA单抗二使其浓度为1μg/mL,混匀常温反应2小时,利用CEA单抗二上的氨基与CuInS2@ZnS纳米晶上的羧基偶联反应,离心3次以除去未反应的CEA单抗二;加入甘氨酸封闭CuInS2@ZnS纳米晶上未反应的羧基,4℃保存备用。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述的0.1mol/L MES溶液配制方法如下:称取MES和NaCl使其浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L,用6mol/L的NaOH溶液调节pH为6.0。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,双元激发液中的Tris浓度为0.05-0.2mol/L,优选0.1mol/L;N2H4·H2O浓度为5-30mmol/L,优选10-20mmol/L;H2O2的浓度为0.01mol/L以上,优选0.5mol/L以上。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二的质量比为1:20:1。
7.权利要求1所述的基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒,进行化学发光免疫检测的方法,包括步骤如下:
将生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CuInS2@ZnS纳米晶标记的CEA单抗二混合后反应形成磁性复合物悬浮液,将磁性复合物悬浮液置于磁场中磁分离,洗涤磁性复合物,转移至样品池内,待激发液激发;
将新制双元激发液快速注入到样品池中,采集化学发光信号。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110973866.0A CN113702638B (zh) | 2021-08-24 | 2021-08-24 | 一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110973866.0A CN113702638B (zh) | 2021-08-24 | 2021-08-24 | 一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113702638A true CN113702638A (zh) | 2021-11-26 |
CN113702638B CN113702638B (zh) | 2024-02-27 |
Family
ID=78654381
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110973866.0A Active CN113702638B (zh) | 2021-08-24 | 2021-08-24 | 一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113702638B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114384246A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-04-22 | 山东大学 | 一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒 |
CN115343484A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-11-15 | 山东大学 | 一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法 |
Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009028592A1 (ja) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 蛍光体、及びその製造方法 |
US20140242676A1 (en) * | 2013-02-01 | 2014-08-28 | Los Alamos National Security, Llc | Artificial leaf-like microphotobioreactor and methods for making the same |
CN104374764A (zh) * | 2013-08-15 | 2015-02-25 | 中国科学技术大学 | 一种分析探针、其制备方法和用途 |
WO2016127301A1 (zh) * | 2015-02-10 | 2016-08-18 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | rT3化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法和应用 |
WO2018000447A1 (zh) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 脂联素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用 |
CN108761061A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-11-06 | 福建医科大学 | 一种基于多巴胺修饰的三元量子点的间接免疫荧光检测疾病标志物的方法 |
US20190002759A1 (en) * | 2017-06-02 | 2019-01-03 | Nexdot | Luminescent particles comprising encapsulated nanoparticles and uses thereof |
CN109239357A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-18 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | Ⅳ型胶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
CN110736739A (zh) * | 2018-07-18 | 2020-01-31 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 一种均相化学发光检测试剂盒及其应用 |
CN111944521A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-11-17 | 山东大学 | 一种兼有光致发光和化学发光特性的CuInS2@ZnS纳米材料的制备方法 |
CN112147132A (zh) * | 2020-09-23 | 2020-12-29 | 山东大学 | 一种光谱型的近红外电化学发光免疫传感器的制备方法 |
CN112379092A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-02-19 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒及其制备方法 |
CN112683972A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-20 | 山东大学 | 一种低电位的电化学发光核酸检测方法 |
CN112858416A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-05-28 | 山东大学 | 一种无共反应剂型电化学发光免疫传感器的制备方法 |
CN112940719A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-06-11 | 山东大学 | 一种制备具有化学发光特性的羧基化CuInS2@ZnS纳米材料的通用型方法 |
CN112986221A (zh) * | 2017-12-15 | 2021-06-18 | 利多(香港)有限公司 | 检测样品中待测物的方法及其试剂盒 |
-
2021
- 2021-08-24 CN CN202110973866.0A patent/CN113702638B/zh active Active
Patent Citations (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009028592A1 (ja) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 蛍光体、及びその製造方法 |
US20140242676A1 (en) * | 2013-02-01 | 2014-08-28 | Los Alamos National Security, Llc | Artificial leaf-like microphotobioreactor and methods for making the same |
CN104374764A (zh) * | 2013-08-15 | 2015-02-25 | 中国科学技术大学 | 一种分析探针、其制备方法和用途 |
WO2016127301A1 (zh) * | 2015-02-10 | 2016-08-18 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | rT3化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法和应用 |
WO2018000447A1 (zh) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 脂联素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用 |
US20190002759A1 (en) * | 2017-06-02 | 2019-01-03 | Nexdot | Luminescent particles comprising encapsulated nanoparticles and uses thereof |
CN112986221A (zh) * | 2017-12-15 | 2021-06-18 | 利多(香港)有限公司 | 检测样品中待测物的方法及其试剂盒 |
CN108761061A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-11-06 | 福建医科大学 | 一种基于多巴胺修饰的三元量子点的间接免疫荧光检测疾病标志物的方法 |
CN110736739A (zh) * | 2018-07-18 | 2020-01-31 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 一种均相化学发光检测试剂盒及其应用 |
CN109239357A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-18 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | Ⅳ型胶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
CN111944521A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-11-17 | 山东大学 | 一种兼有光致发光和化学发光特性的CuInS2@ZnS纳米材料的制备方法 |
CN112147132A (zh) * | 2020-09-23 | 2020-12-29 | 山东大学 | 一种光谱型的近红外电化学发光免疫传感器的制备方法 |
CN112379092A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-02-19 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 用于早期肺癌筛查的自身抗体联合检测免疫化学发光试剂盒及其制备方法 |
CN112683972A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-20 | 山东大学 | 一种低电位的电化学发光核酸检测方法 |
CN112858416A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-05-28 | 山东大学 | 一种无共反应剂型电化学发光免疫传感器的制备方法 |
CN112940719A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-06-11 | 山东大学 | 一种制备具有化学发光特性的羧基化CuInS2@ZnS纳米材料的通用型方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114384246A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-04-22 | 山东大学 | 一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒 |
CN114384246B (zh) * | 2022-01-14 | 2023-10-13 | 山东大学 | 一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒 |
CN115343484A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-11-15 | 山东大学 | 一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113702638B (zh) | 2024-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4259313A (en) | Fluorescent labels | |
US4283382A (en) | Fluorescent labels comprising rare earth chelates | |
CA1113392A (en) | Luminescent immunoassay | |
CN113702638B (zh) | 一种基于CuInS2@ZnS纳米晶定量检测CEA抗原的化学发光免疫试剂盒 | |
EP1797224B1 (en) | Synthesis of highly luminescent colloidal particles | |
EP0142301B1 (en) | Methods of assay | |
US20090197349A1 (en) | Electrochemiluminescence of rare earth metal chelates | |
EP0002963B1 (en) | Aqueous stabilized fluorescent labels, proteins labelled therewith and methods of use | |
Wu et al. | A new europium β-diketone chelate for ultrasensitive time-resolved fluorescence immunoassays | |
JP3890019B2 (ja) | 生物分析的アッセイ | |
EP3798616A1 (en) | Chemical luminescence analysis and measurement method, system using same, and kit | |
JPH0665271A (ja) | 発光性金属キレート標識及び検出手段 | |
WO1991000511A1 (en) | Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques | |
CN109470860B (zh) | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 | |
JPH06186164A (ja) | 電気化学的ルミネッセンス性レニウム モイエティ及びそれらの使用方法 | |
EP3341726B1 (en) | Immunoassay with enhanced sensitivity | |
CN114384246B (zh) | 一种以CdTe量子点为发光标记物定量检测CEA抗原的化学发光免疫分析试剂盒 | |
CN109856076B (zh) | 检测细胞的组合物及检测方法 | |
JP3185215B2 (ja) | 免疫測定法 | |
CN110618280A (zh) | 一种促甲状腺素测定试剂盒及其制备方法 | |
JPH0758291B2 (ja) | アナライトが存在可能な媒体中のアナライトをルミネセンスによって検出および/または測定するための均質方法およびその方法に使用するキット | |
CN115343484B (zh) | 一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法 | |
JP2997747B2 (ja) | 試料中の物質の測定法 | |
WO2013113153A1 (zh) | 一种荧光分析方法 | |
EP3798615B1 (en) | Chemiluminescence analytical method and system and kit using same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |