CN110646616B - 一种检测血清中人cTnI的超敏荧光猝灭免疫传感器及检测方法 - Google Patents
一种检测血清中人cTnI的超敏荧光猝灭免疫传感器及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种以血清中人肌钙蛋白I(cTnI)为靶蛋白的超高灵敏度荧光猝灭免疫传感器及检测方法。本发明的主要特点是，所建立的免疫传感器实现了在人血清中对人cTnI的超高灵敏度检测。基于所述的侧流免疫层析平台，本发明中建立了人cTnI为模型靶的荧光猝灭免疫传感器，经计算，对人IgG的检出限为16.26fg/mL，平均6分钟可得结果，实现了对上述目标抗原的超高灵敏度POCT快速免疫分析。相较而言，本发明公布的侧流免疫层析平台实现了保证稳定性与超高灵敏度前提下的低成本、短流程制备。
Description
技术领域
本发明属于免疫层析领域，特别涉及以一种以血清中人肌钙蛋白I(cTnI)为靶蛋白的超高灵敏度非荧光标记免疫分析传感器。
背景技术
急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)是临床上的一种突发性疾病，其发病时除了伴有胸痛、恶心、自体发热以及心律不稳等症状外，体内相应的心梗标志物分布浓度也会有极大幅度的变化，这一变化使心梗标志物成为AMI诊断的关键指标。众多心梗标志物中，心肌肌钙蛋白系列(cTn)被认为是目前公认特异性最高、持续时间最长的心梗诊断指标，其中cTnI能比其他亚型更早地出现最高峰值，出现最高峰值后的稳定程度最优，对早期AMI快速诊断有更重要的意义。AMI发病后6小时以内是介入治疗的黄金时期，POCT技术正能满足这种检测需求，免疫层析技术是其中一种。
免疫层析试纸条作为一种使用要求低，定性结果可视直观，简便快捷的免疫学检测技术，自推出以来至今在POCT领域中占有重要地位，其中经典的胶体金免疫层析试纸条已成为当前世界范围内最成功的商品化免疫层析技术产品。以胶体金试纸条为起点，试纸条技术已在多个方向得到拓展和延伸。
胶体金试纸条虽能通过纳米金颗粒沉聚进行快速显色，从而达到可视化定性即时检测的效果，但其无法以此作为定量手段、完成精准定量测量的缺陷成为试纸条定量检测的应用空白；以填补这一空白为实现目标，纳米金计数技术、磁性微球试纸条技术、荧光试纸条技术、荧光成像技术、色度定量方法等新技术、产品及在试纸条上的应用技术陆续兴起，在一定程度上满足了试纸条定量检测的需求，填补了这部分空白。其中，由于荧光产生方法多样、荧光信号读取方法成熟方便、操作要求低等特点，荧光试纸条成为定量试纸条的主要方向之一，其中又分为荧光增强模式与反向荧光增强模式，其荧光信号分别与测样浓度呈正相关和负相关。反向荧光增强模式的基础是荧光猝灭效应，试样低浓度下荧光信号远强于高浓度试样，以此可建立面对微量/痕量检测的荧光强度数学模型，在微量/痕量检测中具有重要意义。金表面荧光猝灭，是利用胶体金在纳米尺度上与荧光素分子之间的距离，促进荧光素分子的能量向纳米金表面转移，实现荧光素荧光能力降低的效果，其机理尚未明确，主要学说认为是此过程中电荷转移与场效应的共同作用造成了这一现象。
然而，免疫层析试纸条产品由于品质差异，普遍存在假阳性率高、灵敏度较低、检出限较高、定量检测结果不稳定的缺陷，虽然在国内外实验室中已出现多种高灵敏度的定量层析试纸条，但其应用大多仅局限于实验室内小试阶段。因此，本领域急需免疫层析方法产生快速变革，以产生能够在保持原有快速定性、操作简便、成本低廉等一系列优势的基础上，同时具备高灵敏度及定量稳定准确的性能，从而快速打开免疫层析方法的广泛临床应用道路。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于传统荧光标记免疫层析平台上荧光素荧光能力受标记载体有效结合位点限制而影响定量能力、现有荧光素非标记固定过程普遍导致晕染扩散，本发明旨在克服上述两点缺陷，并以荧光发射光谱作为最佳检测手段。
为此，本发明针对侧流层析试纸条上现有荧光产生模式对荧光分子荧光能力的限制，在适用于免疫反应包含抗原抗体体系与层析膜划线涂布的基础上，以异硫氰酸荧光素(FITC)为对象，针对其带电性质设计了一种FITC用的亲核包被型双水相缓冲体系成分(下称双水相缓冲体系)，配制荧光素包被溶液。该荧光素包被体系可形成稳固的化学结构，从而形成用量、强度不受标记载体结合位点限制，保存稳定、不易晕染的FITC荧光信号条带，其后可以根据需要作为侧流层析所需的检测线或质控线使用。
具体涉及一种以血清中人肌钙蛋白I(cTnI)为靶蛋白的超高灵敏度荧光猝灭免疫传感器的制备方法，步骤如下：
A测制AuNPs；
B制备AuNPs标记小鼠抗人cTnI抗体；
C AuNPs标记小鼠抗人cTnI抗体的离心纯化与复溶；
D制备双水相缓冲体系下的FITC溶液，成分同时符合人cTnI抗原与小鼠抗人cTnI抗体在硝酸纤维素膜上包被的需求；
E对样品垫与金标垫进行水化处理和封闭处理；
F对金标垫进行所述AuNPs标记小鼠抗人cTnI抗体的喷涂点样；
G在层析膜上根据需要进行双水相缓冲体系下FITC溶液的涂布划线，设置荧光信号带，干燥；
H根据需要，在G所述的荧光信号带上进行人cTnI抗原、小鼠抗人cTnI抗体的叠层涂布，设置检测线与质控线，干燥；
I将所述层析膜、金标垫、吸水垫与样品垫依次组装在PVC底板上。
采用上述方法制备以血清中人肌钙蛋白I(cTnI)为靶蛋白的超高灵敏度荧光猝灭免疫传感器后，在设定的荧光发射光谱条件中采集荧光信号，以此为依据对检测结果进行表征。上述产品及检测方法具备以下优势：
1)经计算，检出限达到17.26fg/mL，相对于在同一批产品下进行的电学测试和荧光成像灰度测试，灵敏度明显拔高；
2)小试中，本发明由于采用非标记固定流程，相对于传统荧光素标记模式，本发明在每100批产品的制备工艺中，平均可节约800小时的时间成本；在每1500μg有效荧光素固定过程中，平均可节约16000元人民币资金成本
3)相对于现有的层析膜上荧光素非标记固定过程，本发明在保证荧光素及其荧光信号稳定的前提下，解决了荧光素在层析过程中的扩散和晕染，得到了与荧光素标记模式等同的包被固定效果，对实现低成本、短流程的侧流免疫层析平台制备有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。显然，所描述的附图只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。
图1是本方法所述侧流层析平台产品结构示意图。
图2-1、图2-2是本方法实施例1，采用FITC作为荧光信号源，在本方法制备的荧光猝灭免疫传感器上对血清中不同浓度人cTnI进行测试的荧光发射光谱结果。
图2-3是实施例1所述检测线与质控线荧光发射峰值比值。
图3-1是本方法对比例1，采用FITC作为荧光信号源，在本方法制备的荧光猝灭免疫传感器上对血清中不同浓度人cTnI进行测试的紫外场荧光成像结果。
图3-2、图3-3是本方法对比例1，对图3-1进行灰度分析的结果，其结果以检测线与质控线的灰度信号比值表示，其中图3-3是图3-2的线性有效部分。
图4-1是本方法对比例2，在本方法制备的荧光猝灭免疫传感器上对血清中不同浓度人cTnI进行的电阻测试结果，其结果以检测线与质控线的电阻比值表示。
图4-2是图4-1的线性有效部分。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思、技术效果测试进行清楚地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例以FITC作为荧光信号源，针对FITC带电性质特点设计所需双水相缓冲体系，以此为基础制备荧光猝灭免疫传感器并对血清中不同浓度人cTnI进行测试，该测试包括试纸条检测线、质控线的荧光发射光谱表征。
1)配制10m Mmol/L PBST包被液，具体来说是含终体积浓度0.5％的Tween-20、5％的饱和蔗糖、5％的甲醇、2％的BSA，定容于浓度为10mM/L、pH值为7.2的PBS Buffer溶液；
2)以终体积浓度为90％的1)所述10m Mmol/L PBST包被液，10％的5mol/L NH4Cl制备FITC用双水相缓冲体系；
3)以1)所述10m Mmol/L PBST包被液为溶剂，分别制备人cTnI抗原溶液、小鼠抗人cTnI抗体溶液；
4)以2)所述FITC用双水相缓冲体系为溶剂制备FITC溶液；
5)采用点膜划线方法，将4)所述FITC溶液均匀涂布包被于硝酸纤维素膜表面，以此设置检测线/质控线的基底线，42℃下干燥使其稳定，得到FITC荧光条带；
6)采用点膜划线方法，将3)所述人cTnI抗原溶液作为质控线、小鼠抗人cTnI抗体溶液作为检测线均匀覆盖包被于5)所述的FITC荧光条带表面，42℃下干燥使其稳定，得到完成包被处理的硝酸纤维素膜组件；
7)以10mM/L、pH值为7.2的PBS Buffer溶液为处理液对样品垫、金标垫进行水化处理，随后在50℃下干燥；
8)以10％BSA溶液为封闭液对样品垫、金标垫进行封闭处理，随后在42℃下干燥；
9)采用化学还原法制备AuNPs，将体积浓度为0.01％的氯金酸溶液加热至沸，并加入一定量1％柠檬酸三钠制备得到粒径为30nm的AuNPs颗粒，并采用该AuNPs溶液制备AuNPs标记小鼠抗人cTnI抗体溶液，离心纯化备用；
10)采用9)所述的AuNPs标记抗体溶液对金标垫进行喷涂点样处理，在42℃下干燥备用；
11)将6)所述硝酸纤维素膜、9)所述金标垫、吸水垫与8)所述样品垫依次组装在PVC底板上，完成本侧流层析平台以FITC作为荧光信号源应用于人cTnI免疫分析产品的制备。
在上述产品中对含质量浓度分别为0fg/mL、500fg/mL、5pg/mL、50pg/mL、250pg/mL、5ng/mL、25ng/mL人cTnI抗原蛋白的人血清溶液进行测试，在荧光光谱仪上对测试结果进行荧光信号采集。
荧光光谱仪设置参数为激发波长460nm、光电倍增管电压600V、狭缝宽度10nm，分别对试纸条的检测线、质控线进行荧光信号采集，分别得出检测线与质控线的荧光发射光谱，如说明书附图2-1、2-2，并以检测线信号峰值与质控线信号峰值之比说明测试结果的准确性，如说明书附图2-3。
说明书附图2-1、2-2、2-3的结果显示，本产品对人血清中人cTnI抗原蛋白测试的重现性与准确性良好，灵敏度较高，可测荧光强度较高，与背景干扰峰分离明显，有效实现了背景干扰的排除。经计算，该试纸条对人血清中人cTnI抗原蛋白溶液的检出限为17.26fg/mL，线性R2＝0.974。
对比例1：
本对比例在实施例1所得荧光免疫传感器上分别加入同等浓度梯度下人血清中人cTnI抗原样品，从其余工序与实施例1所述保持一致。
对完成样品加入后的试纸条产品在紫外暗场下进行荧光成像，紫外光波长设置为365nm，以表征试纸条层析膜上FITC的包被性能，如说明书附图3-1。说明书附图3-1的结果显示，在试纸条层析膜检测线与质控线上包被的FITC激发状态良好，固定状况稳定，晕染扩散程度低，满足准确定量的测试要求。
对图3-1所示的荧光成像进行灰度分析，得到图3-2，其结果以各浓度下检测线与质控线的灰度信号比值表示。图3-2的结果显示，相较于实施例1的荧光发射光谱测试，本例方法在测试浓度范围内的信号线性范围收窄。如图3-3所示，有效线性范围为10E1 pg/mL-10E1 ng/mL。在线性有效范围内，数据稳定性与实施例1采用的荧光发射光谱持平，线性R2＝0.972，计算检出限为10.069pg/mL，较实施例1更高，说明其灵敏度不如实施例1所述方法。
对比例2：
本对比例在不加入荧光素FITC的前提下，重复实施例1的制备工序，制得依照本方法制备的无荧光素胶体金免疫层析传感器。完成与实施例1所述浓度梯度相同的不同浓度人血清中人cTnI样品加入后，使用万用表对每个试纸条样品的检测线与质控线进行电阻信号测试，以检测线与质控线的电阻测试信号比值为测试结果。
如图4-1所示，相较于实施例1的荧光发射光谱测试与对比例1的荧光成像灰度测试，对比例2方法在测试浓度范围内的信号线性范围进一步缩短。如图4-2所示，有效线性范围仅为10E+1g/mL-10E-3g/mL。但在线性有效范围内，图4-2所示的数据稳定性远超实施例1与对比例1采用的方法，线性R2＝0.999，另一方面，计算检出限为103.86mg/mL，远高于实施例1及对比例1，说明电阻测试方法在灵敏度方面比荧光发射光谱法和荧光成像灰度法高。
Claims (1)
1.一种以血清中人肌钙蛋白I（cTnI）为靶蛋白的超高灵敏度非荧光标记免疫分析传感器的制备方法，其特征为：
1） 配制10 mmol/L PBST包被液: 定容于浓度为10 mmol/L、pH值为7.2的PBS Buffer溶液，得到体积浓度0.5%的Tween-20、5%的蔗糖、5%的甲醇、2%的BSA；
2） 以终体积为90%的1）所述10 mmol/L PBST包被液，10%的5 mol/L NH4Cl制备FITC用双水相缓冲体系；
3） 以1）所述10 mmol/L PBST包被液为溶剂，分别制备人cTnI抗原溶液、小鼠抗人cTnI抗体溶液；
4） 以2）所述FITC用双水相缓冲体系为溶剂制备FITC溶液；
5） 采用点膜划线方法，将4）所述FITC溶液均匀涂布包被于硝酸纤维素膜表面，以此设置检测线和质控线的基底线，42℃下干燥使其稳定，得到FITC荧光条带；
6） 采用点膜划线方法，将3）所述人cTnI抗原溶液作为质控线、小鼠抗人cTnI抗体溶液作为检测线均匀覆盖包被于5）所述的FITC荧光条带表面，42℃下干燥使其稳定，得到完成包被处理的硝酸纤维素膜组件；
7） 以10 mmol/L、pH值为7.2的PBS Buffer溶液为处理液对样品垫、金标垫进行水化处理，随后在50℃下干燥；
8） 以10%BSA溶液为封闭液对样品垫、金标垫进行封闭处理，随后在42℃下干燥；
9） 采用化学还原法制备AuNPs，将体积浓度为0.01%的氯金酸溶液加热至沸，并加入一定量1%柠檬酸三钠制备得到粒径为30nm的AuNPs颗粒，并采用该AuNPs溶液制备AuNPs标记小鼠抗人cTnI抗体溶液，离心纯化备用；
10） 采用9）所述的AuNPs标记抗体溶液对金标垫进行喷涂点样处理，在42℃下干燥备用；
11） 将6）所述硝酸纤维素膜、10）所述金标垫、吸水垫、8）所述样品垫依次组装在PVC底板上。
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