CN112305229A - 一种定量检测全程c-反应蛋白的免疫层析试纸条及其定量检测方法 - Google Patents

一种定量检测全程c-反应蛋白的免疫层析试纸条及其定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量检测全程C‑反应蛋白的免疫层析试纸条及其定量检测方法，包括底板，所述的底板表面由左至右依次搭接粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，各层膜或垫之间局部重叠2‑3mm；所述结合垫含有纳米金标记的抗C‑反应蛋白的第一抗体；所述的硝酸纤维素膜上设有两条背景荧光条带，其中一条背景荧光条带上固定有检测线，另一条背景荧光条带上固定有控制线，所述检测线为抗C‑反应蛋白的包被抗体，所述控制线包被有C‑反应蛋白抗原。本发明与目前常见的检测C‑反应蛋白的方法相比，具有操作简便、快速，便于携带，样品用量小等优点，同时也提高了检测的线性范围和稳定性，可对CRP进行全程定量。

Description

一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条及其定量检 测方法
技术领域
本发明涉及C-反应蛋白检测技术，属于医学检测领域，具体涉及一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条及其定量检测方法。
背景技术
C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是由肝脏合成的血浆蛋白，在胎儿期产生，是经典的急性期反应物，CRP的结构是由五个非共价结合的前驱体组成，它们围绕中心孔对称排列，分子量为11.5万-14万。其生物学功能取决于其识别宿主病原体和受损细胞并通过吞噬细胞作为媒介转导其清除的能力。
人体在出现炎症时，血浆中CRP的浓度可升高10000倍，其浓度可以响应人类急性损伤、感染等炎症类疾病，并且与心血管疾病的进展有关，因此被认为是用于监测心血管疾病和炎症的非特异性早期生物标志物之一。在长久的随访调查研究中显示，CRP与心肌梗死、冠状动脉疾病和心血管疾病等的发生相关联。
全程C反应蛋白包括常规C反应蛋白和超敏C反应蛋白(hs-CRP)，常规C反应蛋白检测范围在20-500mg/L，超敏C反应蛋白的检测范围是小于10mg/L。一次性检测常规C反应蛋白和超敏C反应蛋白的方法被称为全程C反应蛋白的检测。常规C反应蛋白的检测可以为炎症性疾病的诊断、治疗和检测提供信息。针对超敏C反应蛋白的检测可以为监测血清hs-CRP水平、动脉粥样硬化及急性脑梗死(ACI)等心脑血管类疾病的发生、严重程度及预后的评估提供有用的信息。hs-CRP是未来心血管疾病(CVD)的独立预测因子，除此之外，还可以预测发生高血压和糖尿病的风险。在2000年，Paul M等人研究了C-反应蛋白和其他炎症类标志物对女性心血管疾病的预测，在这项研究中发现hs-CRP是心血管疾病风险预测的最重要的预测因子，可用于筛选未来可能发生心血管疾病的人群。
目前，实验室检测C-反应蛋白的方法主要有：酶联免疫吸附法、化学发光免疫法、免疫比浊法、胶体金免疫层析法等。这些方法具有各自的特点和不足之处：
酶联免疫吸附法：该方法特异性较强，无交叉反应，但是操作过程复杂，线性范围较窄。
化学发光免疫法：化学发光免疫是将化学发光系统和免疫反应体系相结合，根据发光强度信号对待测样品的含量进行定性和定量分析的方法。该方法可排除交叉反应，但是检测时间较长，检测步骤复杂且需要专业人员操作。
免疫比浊法：是将样品中的CRP与试剂中的CRP单克隆抗体在特殊稀释剂中结合形成复合物，从而引起稀释系统浊度的改变，并在一定范围内反应液浊度与检测样品中CRP的量呈线性关系。但该方法线性范围较窄，灵敏度较低，仪器较为昂贵且检测样品用量较多。
胶体金免疫层析法：该方法是用一种结合胶体金的抗CRP单克隆抗体和抗CRP的二抗进行检测。该方法具有快速、操作简便、价格较低等优点，但检测灵敏度低，只能进行定性和半定量分析。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条及其定量检测方法，其基于双抗体夹心法与竞争法相结合的免疫层析模式和背景荧光猝灭-免疫层析技术，提供了一种检测范围较宽的定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，该试纸条既可以检测低水平的CRP含量，又具有较高的灵敏度，能够实现全程C-反应蛋白的免疫层析定量检测。
为实现上述发明目的，本发明提出的一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述的底板表面由左至右依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述的硝酸纤维素膜放置在底板的中部，所述的结合垫放置在硝酸纤维素膜的左端，所述的样品垫放置在结合垫的左端，所述的吸水垫放置在硝酸纤维素膜的右端，其中，各层膜或垫之间局部重叠；
所述的硝酸纤维素膜上设有两条背景荧光条带，其中一条背景荧光条带上固定有检测线，另一条背景荧光条带上固定有控制线，所述检测线为抗C-反应蛋白的包被抗体，所述控制线包被有C-反应蛋白抗原。
为进一步实现本发明，所述结合垫按如下步骤制备：
(1)在制备的纳米金溶液中，加入0.1mol/L碳酸钾溶液，用以调节纳米金溶液的pH值，然后进行步骤(2)；
(2)在步骤(1)的溶液中加入20μL待标记的浓度为1mg/mL的C-反应蛋白抗体，漩涡混匀，然后进入步骤(3)；
(3)在步骤(2)的混合溶液中，加入50μL 10％BSA溶液，4℃封闭60min，然后在4℃的条件下，12000rpm离心20min，弃去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶；
(4)将步骤(3)的复合物溶液喷涂到载体膜上，37℃条件下干燥，备用。
为进一步实现本发明，所述纳米金颗粒的直径为20-25nm。
为进一步实现本发明，所述纳米金溶液的pH值为8.0。
为进一步实现本发明，所述磷酸盐缓冲溶液中包含1％BSA。
为进一步实现本发明，所述载体膜为玻璃纤维素膜。
为进一步实现本发明，所述样品垫为玻璃纤维素膜。
为进一步实现本发明，所述各层膜或垫之间重叠2-3mm。
为进一步实现本发明，所述底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫宽度均为3mm。
为进一步实现本发明，所述硝酸纤维素膜的型号为Millipore HATF00010。
为进一步实现本发明，所述背景荧光条带是预先均匀涂布的罗丹明B荧光团。
为进一步实现本发明，所述检测线采用双抗体夹心免疫模式，所述控制线采用竞争免疫模式。
本发明还提出一种用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
用移液枪吸取待测样品，添加至检测C-反应蛋白的免疫层析试纸条的样品垫上；
待测样品发生免疫反应后，检测背景荧光免疫层析试纸条的检测线和控制线上的荧光信号值，分别记为T1和T2，通过相对荧光信号值对待检测样的浓度进行定量分析。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过将罗丹明B荧光素预先均匀固定在NC膜上，并利用胶体金的猝灭作用，实现对背景荧光条带的猝灭，获得相对荧光信号值，从而对待检测样品中的目标物含量进行定量分析，与传统的胶体金免疫层析相比，具有定量准确，降低NC膜上的背景干扰等优势。且该试纸条具有操作简便、快速，便于携带，样品用量小等优点。本发明通过将双抗体夹心法与竞争法相结合的免疫模式应用到背景荧光猝灭免疫层析技术中，提高了CRP检测的线性范围和稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单说明。显然，所描述的附图只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。
图1为本发明的一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例1的CRP标记抗体最佳加样量的优化图；
图3为本发明实施例2的标准曲线图。
图中标记：1-底板、2-样品垫、3-结合垫、4-硝酸纤维素膜、5-吸水垫、6-背景荧光条带。
具体实施方式
本发明公开了一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条及其定量检测方法。
下面结合实施例及附图，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
如图1所示，本发明提出的一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，包括底板1，所述的底板1表面由左至右依次设置有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5；所述的硝酸纤维素膜4放置在底板1的中部，所述的结合垫3放置在硝酸纤维素膜4的左端，所述的样品垫2放置在结合垫3的左端，所述的吸水垫5放置在硝酸纤维素膜4的右端，其中，各层膜或垫之间局部重叠；所述的硝酸纤维素膜4上设有两条背景荧光条带6，其中一条背景荧光条带上固定有检测线T，另一条背景荧光条带上固定有控制线C，所述检测线为抗C-反应蛋白的包被抗体，所述控制线包被有C-反应蛋白抗原。
本实施例中，所述结合垫3按如下步骤制备：
(1)在制备的纳米金溶液中，加入0.1mol/L碳酸钾溶液，用以调节纳米金溶液的pH值，然后进行步骤(2)；
(2)在步骤(1)的溶液中加入20μL待标记的浓度为1mg/mL的C-反应蛋白抗体，漩涡混匀，然后进入步骤(3)；
(3)在步骤(2)的混合溶液中，加入50μL 10％BSA溶液，4℃封闭60min，然后在4℃的条件下，12000rpm离心20min，弃去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶；
(4)将步骤(3)的复合物溶液喷涂到载体膜上，37℃条件下干燥，备用。
本实施例中，所述纳米金颗粒的直径为20-25nm。
本实施例中，所述纳米金溶液的pH值为8.0。
本实施例中，所述磷酸盐缓冲溶液中包含1％BSA。
本实施例中，所述载体膜为玻璃纤维素膜。
本实施例中，所述样品垫为玻璃纤维素膜。
本实施例中，所述各层膜或垫之间重叠2-3mm。
本实施例中，所述底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫宽度均为3mm。
本实施例中，所述硝酸纤维素膜的型号为Millipore HATF00010。
本实施例中，所述背景荧光条带是预先均匀涂布的罗丹明B荧光团。
本实施例中，所述检测线采用双抗体夹心免疫模式，所述控制线采用竞争免疫模式。
实施例1CRP标记抗体最佳加样量的优化
为确定纳米金标记CRP抗体的最佳标记量，我们在400nm-800nm的范围内对复合物进行紫外-可见分光光度扫描，得到最大吸收波长，测定结果如图2所示，以不同浓度复合物测得的吸光度值为纵坐标，以加入8、12、16、20、24、28μL的1mg/mL CRP抗体溶液的浓度为横坐标，作图。从图中可知，当CRP抗体加入量达到16μL及以上时，纳米金混合液的吸光度值几乎保持不变，因此确定稳定纳米金的最适抗体标记量为16μg/1mL纳米金，在此基础上再增加20％，即16×(1+0.2)＝19.2μg，为了添加方便最终确定使用20μg的CRP抗体加入量/1mL纳米金。
实施例2以本发明制得的试纸条检测CRP
采用一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，检测不同浓度的CRP标准样品(取7个不同的浓度，分别为0、0.002、0.02、0.2、2、20、200μg/mL，每个浓度做3个平行样)层析反应一段时间后，采用荧光分析仪检测检测线T1和控制线T2处的荧光信号，获得相对荧光信号值T1/T2，以CRP抗原浓度的对数值为横坐标logC，以T1/T2为纵坐标y，建立方程并拟合成标准曲线。
由图3的标准曲线可以看出，T1/T2信号值与CRP抗原浓度的对数值呈现良好的线性相关性，相关系数R2＝0.990，因此，可以通过该标准曲线对样品中的CRP浓度进行定量分析。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述的底板表面由左至右依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述的硝酸纤维素膜放置在底板的中部，所述的结合垫放置在硝酸纤维素膜的左端，所述的样品垫放置在结合垫的左端，所述的吸水垫放置在硝酸纤维素膜的右端，其中，各层膜或垫之间局部重叠；
所述的硝酸纤维素膜上设有两条背景荧光条带，其中一条背景荧光条带上固定有检测线，另一条背景荧光条带上固定有控制线，所述检测线为抗C-反应蛋白的包被抗体，所述控制线包被有C-反应蛋白抗原，所述检测线采用双抗体夹心免疫模式，所述控制线采用竞争免疫模式。
2.根据权利要求1所述的用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫按如下步骤制备：
(1)在制备的纳米金溶液中，加入0.1mol/L碳酸钾溶液，用以调节纳米金溶液的pH值，然后进行步骤(2)；
(2)在步骤(1)的溶液中加入20μL待标记的浓度为1mg/mL的C-反应蛋白抗体，漩涡混匀，然后进入步骤(3)；
(3)在步骤(2)的混合溶液中，加入50μL 10％BSA溶液，4℃封闭60min，然后在4℃的条件下，12000rpm离心20min，弃去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶；
(4)将步骤(3)的复合物溶液喷涂到载体膜上，37℃条件下干燥，备用。
3.根据权利要求2所述的用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述制备的纳米金溶液的纳米金颗粒直径为20-25nm。
4.根据权利要求2所述的用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述纳米金溶液的pH值为8.0。
5.根据权利要求2所述的用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液中包含1％BSA和5％蔗糖。
6.根据权利要求1所述的用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫和样品垫均为玻璃纤维素膜。
7.根据权利要求1所述的用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫宽度均为3mm。
8.根据权利要求1所述的用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的型号为Millipore HATF00010。
9.根据权利要求1所述的用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条，其特征在于，所述背景荧光条带是预先均匀涂布的罗丹明B荧光团。
10.一种用于定量检测全程C-反应蛋白的免疫层析试纸条的定量检测方法，其特征在于，具体步骤为：
用移液枪吸取待测样品，添加至检测C-反应蛋白的免疫层析试纸条的样品垫上；
待测样品发生免疫反应后，检测背景荧光免疫层析试纸条的检测线和控制线上的荧光信号值，分别记为T1和T2，通过相对荧光信号值对待检测样的浓度进行定量分析。
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