CN110231476A - 一种固相基质上荧光素与蛋白质混合固载的处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固相基质上荧光素与蛋白质混合固载的处理方法。本发明采用荧光素与蛋白质先后包被于固相基质上相同位置的处理方法，达到两者分层混合固载的处理目标。有别于传统方法中的荧光素标记蛋白质后固载的操作，本方法具备以下优点：（1）免去荧光蛋白等荧光分子复合物的处理流程，节约至少8小时反应时间，大大缩短了操作所需时间周期，并节省产品制备成本；（2）对于最大激发波长与最大吸收波长数值相近的对象，该方法在提高灵敏度、增强可测荧光强度方面，结果令人满意；（3）对于在传统标记方法中荧光信号与背景信号无法分离的对象，该方法能有效实现两者分离，达到消除背景干扰的效果。

Description

一种固相基质上荧光素与蛋白质混合固载的处理方法
技术领域
本发明属于免疫层析领域，特别涉及一种平面固载技术，具体地说是一种固相基质上荧光素与蛋白质混合固载的处理方法。该方法能够在包含但不限于免疫层析膜的固相基质上使指定发射波长范围内的荧光素，或含荧光素的物质产生良好荧光能力。该方法能够应用在荧光免疫层析上。
背景技术
免疫层析试纸条作为一种使用要求低，定性结果可视直观，简便快捷的免疫学检测技术，自推出以来至今在POCT领域中占有重要地位，其中经典的胶体金免疫层析试纸条已成为当前世界范围内最成功的商品化免疫层析技术产品。以胶体金试纸条为起点，试纸条技术已在多个方向得到拓展和延伸。
胶体金试纸条虽能通过纳米金颗粒沉聚进行快速显色，从而达到可视化定性即时检测的效果，但其无法以此作为定量手段、完成精准定量测量的缺陷成为试纸条定量检测的应用空白；以填补这一空白为实现目标，纳米金计数技术、磁性微球试纸条技术、荧光试纸条技术、荧光成像技术、色度定量方法等新技术、产品及在试纸条上的应用技术陆续兴起，在一定程度上满足了试纸条定量检测的需求，填补了这部分空白。其中，由于荧光产生方法多样、荧光信号读取方法成熟方便、操作要求低等特点，荧光试纸条成为定量试纸条的主要方向之一，但现有的荧光产生模式存在不足以满足所有状况下试纸条产生有效荧光信号的需求。
目前荧光试纸条产生荧光的模式主要包括：
1. 荧光物质标记在纳米金或微球等载体颗粒上形成载体颗粒-荧光分子复合物，载体颗粒-荧光分子复合物共同在金标垫片材上固载，在免疫层析的过程中随载体颗粒在检测线、质控线上的沉聚而达到在对应位置产生荧光信号的效果。
2. 荧光物质标记在蛋白/核酸上或两者混合形成荧光复合物，荧光复合物按使用要求在层析膜上构建检测线和质控线，随着免疫层析过程的推进产生信号。
上述两种荧光产生模式均存在相似的问题，即：（1）均需要提前配制荧光蛋白等荧光分子复合物，试纸条制备时间、制备成本和准备流程被大幅增加，不利于快速制备；（2）产生的可测荧光信号强度普遍不高，因此在测量时容易被强度较高、位置相近的干扰信号掩盖，造成灵敏度降低、相对强度下降的后果；（3）对于因荧光信号强度过低而与干扰信号强度存在相当差值的对象，部分荧光信号被屏蔽，在实际的仪器测量中表现为干扰峰与荧光峰难以分离、甚至覆盖了大部分荧光峰，造成严重的背景干扰。
改变试纸条荧光产生模式有助于改善上述问题。目前试纸条上的荧光分子均采用提前结合的方式与蛋白质、核酸或载体颗粒形成荧光复合物，现有模式的荧光分子量受限于荧光分子在结合对象上的结合位点数，其荧光信号强度也受限于荧光复合物对荧光发生的影响。解决这一问题的方法，及新的试纸条荧光产生模式，目前尚无报道。
发明内容
本发明针对试纸条上现有荧光产生模式对荧光分子荧光能力的限制，利用荧光素标记蛋白质需要特定反应条件的机理，结合在一定蛋白质含量下荧光素标记位点受限的反应特点，拟设计一种建立在层析膜等固相载体上的荧光产生模式，即一种层析膜上荧光素与蛋白质混合固载的处理方法。通过对荧光素标记蛋白的机理，对荧光素和蛋白质在层析膜上进行分层固载，消除结合位点数与荧光复合物对荧光分子荧光能力的限制，达到了提高灵敏度，增强可测荧光信号强度，消除背景干扰的效果。
本发明的固相基质上荧光素与蛋白质混合固载的处理方法的具体步骤为：
1） 荧光素在固相基质上的分层固载
采用试纸条层析膜划膜方法，对分散均匀的荧光素溶液在包括但不限于层析膜的固相基质上实施点膜划线操作，使荧光素溶液呈条带型均匀分布在所需位置，得到荧光素溶液分布带。
2） 蛋白质或核酸在固相基质上的分层固载
采用试纸条层析膜划膜方法，对分散均匀的蛋白质溶液或核酸溶液在包括但不限于层析膜的固相基质上实施点膜划线工作，使蛋白质溶液或核酸溶液呈条带型均匀覆盖在步骤1）得到的荧光素溶液分布带上。
所述步骤1）中，荧光素的取用量根据生产或实验需求灵活变动。
所述步骤1）中，荧光素对象适用于所有具备荧光能力，且在溶剂中稳定的荧光物质。
所述步骤2）中，蛋白质、核酸的取用量根据生产或实验需求灵活变动。
所述步骤2）中，蛋白质对象适用于所有满足固相包被要求，且在包被液中稳定的蛋白质溶液。
所述步骤2）中，核酸对象适用于所有满足固相包被要求，且在包被液中稳定的核酸溶液。
本发明方法的优势在于：
1. 免去荧光蛋白等荧光分子复合物的处理流程，节约至少8小时反应时间，大大缩短了操作所需时间周期，并节省产品制备成本。
2. 对于最大激发波长与最大吸收波长数值相近的对象，该方法在提高灵敏度、增强可测荧光强度方面，结果令人满意。
3. 对于在传统标记方法中荧光信号与背景信号无法分离的对象，该方法能有效实现两者分离，达到消除背景干扰的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。显然，所描述的附图只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。
图1是本发明的操作流程示意图。
图2是本发明实施例中实施对异硫氰酸荧光素（FITC）在层析膜上与人IgG进行分层固载操作的荧光发射光谱图。
图3是本发明对比例中实施对异硫氰酸荧光素（FITC）标记人IgG进行点膜划线操作的荧光发射光谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思、技术效果测试进行清楚地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的实施过程步骤如下：
1） 荧光素在固相基质上的分层固载。采用试纸条层析膜划膜方法，对分散均匀的荧光素溶液在包括但不限于层析膜的固相基质上实施点膜划线操作，使荧光素溶液呈条带型均匀分布在所需位置。
2） 蛋白质或核酸在固相基质上的分层固载。采用试纸条层析膜划膜方法，对分散均匀的蛋白质溶液或核酸溶液在包括但不限于层析膜的固相基质上实施点膜划线工作，使蛋白质溶液或核酸溶液呈条带型均匀覆盖在步骤1）所述的荧光素溶液分布带上。
以上反应为实施本发明提供的固相基质上荧光素与蛋白质混合固载处理的一般步骤，在实施例中不作详述。
实施例：
（1） 配制0.01mol/L PBST包被液，具体来说是含终体积浓度0.5%的Tween-20、5%的饱和蔗糖、5%的甲醇、2%的BSA，以及浓度为0.01 mol/L、pH值为7.2的PBS溶液。
（2） 以（1）所述包被液为溶剂制备1mg/mL FITC溶液、1mg/mL 羊抗人IgG蛋白溶液。
（3） 采用点膜划线方法，将（2）所述FITC溶液均匀涂布包被于层析膜表面，42℃下干燥使其稳定。
（4） 采用点膜划线方法，将（2）所述羊抗人IgG蛋白溶液均匀覆盖包被于（3）所述的FITC条带表面，37℃下干燥使其稳定。
采用荧光猝灭方法，分别以含总含量为0μg、5μg、25μg、50μg人IgG蛋白的测试液对层析膜上FITC-羊抗人IgG条带进行处理，在荧光分光光度计上对层析膜上进行荧光信号测试，测试条件为激发波长460nm、光电倍增管电压500V、狭缝宽度10nm，得到图2所述的荧光发射光谱图。其中，0μg样品最高荧光强度峰值3028，5μg样品最高荧光峰强度为0μg样品的43.46%，25μg样品最高荧光峰强度为0μg样品的25.76%，50μg样品最高荧光峰强度为0μg样品的15.71%。以上结果重现性良好，灵敏度较高，可测荧光强度较高，与背景干扰峰分离明显，有效实现了背景干扰的排除。
对比例：
（1） 配制0.01mol/L PBST包被液，具体来说是含终体积浓度0.5%的Tween-20、5%的饱和蔗糖、5%的甲醇、2%的BSA，以及浓度为0.01 mol/L、pH值为7.2的PBS溶液。
（2） 以（1）所述包被液为溶剂制备1mg/mL FITC溶液、1mg/mL 羊抗人IgG蛋白溶液。
（3） 制备FITC标记羊抗人IgG蛋白溶液，具体方法为将（2）所述的 FITC溶液与羊抗人IgG蛋白溶液按羊抗人IgG蛋白：FITC=100μL：15μL的比例混合，4℃避光孵育8h。加入5mol/L的NH4Cl溶液至终浓度为50mmol/L，4℃摇床终止反应2h，即得所需FITC标记羊抗人IgG蛋白溶液，现配现用。
（4） 采用点膜划线方法，将（3）所述FITC标记羊抗人IgG蛋白溶液均匀涂布包被于层析膜表面，37℃下干燥使其稳定。
采用荧光猝灭方法，分别以含总含量为0μg、5μg、25μg、50μg人IgG蛋白的测试液对层析膜上FITC-羊抗人IgG条带进行处理，在荧光分光光度计上对层析膜上进行荧光信号测试，测试条件为激发波长460nm、光电倍增管电压800V、狭缝宽度10nm，得到图3所述的荧光发射光谱图。其中，0μg样品最高荧光强度峰值7740，5μg样品最高荧光峰强度为0μg样品的79.37%，25μg样品最高荧光峰强度为0μg样品的52.86%，50μg样品最高荧光峰强度为0μg样品的11.21%。以上结果灵敏度较低，可测荧光强度较弱，与背景干扰峰无法分离，背景干扰严重。

Claims (1)

1.一种固相基质上荧光素与蛋白质混合固载的处理方法，其特征在于具体步骤为：
1） 荧光素在固相基质上的分层固载
采用试纸条层析膜划膜方法，对分散均匀的荧光素溶液在包括但不限于层析膜的固相基质上实施点膜划线操作，使荧光素溶液呈条带型均匀分布在所需位置，得到荧光素溶液分布带；
2） 蛋白质或核酸在固相基质上的分层固载
采用试纸条层析膜划膜方法，对分散均匀的蛋白质溶液或核酸溶液在包括但不限于层析膜的固相基质上实施点膜划线工作，使蛋白质溶液或核酸溶液呈条带型均匀覆盖在步骤1）得到的荧光素溶液分布带上；
所述步骤1）中，荧光素的取用量根据生产或实验需求灵活变动；
所述步骤1）中，荧光素对象适用于所有具备荧光能力，且在溶剂中稳定的荧光物质；
所述步骤2）中，蛋白质、核酸的取用量根据生产或实验需求灵活变动；
所述步骤2）中，蛋白质对象适用于所有满足固相包被要求，且在包被液中稳定的蛋白质溶液；
所述步骤2）中，核酸对象适用于所有满足固相包被要求，且在包被液中稳定的核酸溶液。
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CN112305230A (zh) * 2020-10-09 2021-02-02 桂林理工大学 一种定量检测降钙素原的免疫层析试纸条及其定量检测方法
CN112305229A (zh) * 2020-10-09 2021-02-02 桂林理工大学 一种定量检测全程c-反应蛋白的免疫层析试纸条及其定量检测方法

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