CN106053823B - 一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测方法 - Google Patents

一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106053823B
CN106053823B CN201610236247.2A CN201610236247A CN106053823B CN 106053823 B CN106053823 B CN 106053823B CN 201610236247 A CN201610236247 A CN 201610236247A CN 106053823 B CN106053823 B CN 106053823B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cdznse
ecl
electrode
quantum dots
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610236247.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106053823A (zh
Inventor
邹桂征
张新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN201610236247.2A priority Critical patent/CN106053823B/zh
Publication of CN106053823A publication Critical patent/CN106053823A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106053823B publication Critical patent/CN106053823B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测方法。主要包括(1)双稳定剂包被的CdZnSe量子点的制备，(2)CdZnSe量子点标记二抗(Ab2∣CdZnSe NCs)制备，(3)以CdZnSe量子点为标记物的ECL免疫传感器的制备和(4)免疫传感器的ECL光谱检测四个步骤。本发明方法检测的灵敏度较高，甲胎蛋白抗原检测限达到10.0fg/mL。本发明构建的电化学发光免疫传感器是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合构建的，其他蛋白的干扰小，选择性好。

Description

一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测 方法
技术领域
本发明涉及一种光谱型的电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence,ECL)免疫检测方法，尤其涉及一种以CdZnSe三元量子点为标记物的光谱型ECL免疫检测方法，属于ECL免疫检测技术领域。
背景技术
电致化学发光是一种已在生化分析和临床诊断领域获得广泛应用的分析技术。例如，罗氏公司所开发的基于钌联吡啶/正三丙胺体系的ECL试剂盒已经可以用于肿瘤标志物、激素等80余种项目的临床诊断。研究显示，量子点(NCs或QDs)，如CdTe、CdSe等，能够产生ECL辐射，为构建新型ECL生化分析策略提供了重要的物质基础。例如，Liang等人采用近红外CdTe量子点开发了一种近红外的ECL免疫检测方法，并通过夹心免疫反应制得ECL免疫传感器检测甲胎蛋白(参见：Anal.Chem.2012，84，10645-10649)。Liu等人以双稳定剂包被CdSe量子点修饰玻碳电极为载体构建一种新型单色量子点ECL传感策略，并实现对多巴胺的灵敏检测(参见：Anal.Chem.2014,86,2784-2788)。
由于ECL基础和应用研究通常采用检测辐射总强度的理念提高信噪比、提升ECL分析的灵敏度，传统ECL研究极少涉及相关的光谱信息，基于ECL光谱信息的生化传感研究基本处于空白状态。
同时，尽管三元量子点拥有比二元量子点更为优异的光学特性，基于三元量子点的ECL基础研究尚基本处于空白状态，与之相关的ECL生化分析及应用研究上处于待开发状态。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明采用双稳定剂包被策略制备了水溶性的CdZnSe三元量子点，并以该量子点为标记物提供了一种光谱型ECL检测方法。本发明所构建的光谱型ECL检测方法具有灵敏度高和选择性好的特点。
术语说明：
抗原(Ag)：本发明所述的抗原指：甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，糖类抗原125，糖类抗原15-3，糖类抗原72-4，糖类抗原19-9，前列腺特异性抗原，游离前列腺特异抗原，爱滋病抗原，乙肝表面抗原，乙肝e抗原，甲状腺球蛋白，肌钙蛋白T抗原，肌红蛋白抗原等常规的抗原。
一抗(Ab1)：本发明所述的一抗指：对上述抗原对应产生的抗体，本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
二抗(Ab2)：本发明所述的二抗指：对上述抗原和一抗对应产生的二抗。
本发明的技术方案如下：
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫检测方法，包括步骤如下：
(1)双稳定剂包被的CdZnSe量子点的制备
向氯化镉(CdCl2)溶液加入醋酸锌(Zn(CH3COO)2)和六偏磷酸钠(HMP)，搅拌5min后加入巯基丙酸(MPA)；用NaOH将溶液pH调至8.0，缓慢加入亚硒酸钠(Na2SeO3)溶液；将上述溶液加热回流10min后，加入水合肼(N2H4·H2O)，100℃下加热回流，得到双稳定剂包被CdZnSe量子点溶液，取不同回流时间的溶液，4℃避光放置；
(2)CdZnSe量子点标记二抗的制备(Ab2|CdZnSe NCs)
向双稳定剂包被的CdZnSe量子点溶液中加入含等体积1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的磷酸盐(PBS)缓冲溶液，于室温下反应活化30min，离心(12000r/min，6min)后将沉淀重新分散到PBS缓冲溶液中，加入Ab2，室温下震荡摇匀3h后，加入小牛血清蛋白(BSA)封闭未反应的活性位点；封闭30min后离心，将沉淀重新分散到PBS缓冲溶液中，得量子点标记的二抗(Ab2|CdZnSe NCs)；
(3)以CdZnSe量子点为标记物构建光谱型ECL免疫传感器
a、将玻碳电极(GCE)用0.3μm的抛光粉(α-Al2O3)抛光至镜面，用超纯水洗去电极表面多余的抛光粉，并用氮气吹干；将玻碳电极置入含对氨基苯甲酸(ABA)的缓冲液中，在0.4-1.2V电位区间内、以10mV/s扫速循环伏安扫描两圈，得到表面带有羧基的修饰电极(GCE∣ABA)，用无水乙醇、超纯水依次清洗所得修饰电极；
b、分别取等量EDC、NHS滴涂于步骤(a)所述修饰电极上，活化电极表面的羧基，37℃反应30min后冲洗电极表面三次；将Ab1滴加在GCE∣ABA表面，37℃反应2h，将Ab1以共价偶联的方式固定在电极表面，得GCE∣ABA-Ab1；
c、将GCE∣ABA-Ab1清洗后，向电极表面滴加BSA溶液，37℃反应1h以封闭未反应的活性位点；
d、将步骤(c)得到的电极清洗后，取Ag滴加在电极表面，37℃反应90min，通过抗原抗体特异性结合实现Ag在电极表面的固定，得GCE∣ABA-Ab1<Ag；然后将GCE∣ABA-Ab1<Ag在Ab2∣CdZnSe NCs溶液中37℃孵育90min，将量子点固定在电极表面，形成免疫复合物修饰电极，得GCE∣ABA-Ab1<Ag>Ab2∣CdZnSe NCs(即：三元量子点为标记物的光谱型ECL免疫传感器)；实验前将GCE∣ABA-Ab1<Ag>Ab2∣CdZnSe NCs冲洗三次；
(4)光谱型ECL免疫检测
以步骤(3)制得的三元量子点为标记物的光谱型ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.1mol/L过硫酸铵的PBS缓冲溶液中，对光谱型ECL免疫传感器进行电致化学发光光谱测试。
根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的双稳定剂包被的CdZnSe量子点的制备方法如下：
室温下，将0.20mol/L CdCl2溶液加入到100mL圆底三颈烧瓶中，加超纯水稀释至50mL；依次向三口烧瓶中加入Zn(CH3COO)2和HMP，搅拌5min后加入MPA；用NaOH将溶液pH调至8.0，缓慢加入Na2SeO3溶液，待上述溶液在100℃下加热回流10min后，加入N2H4·H2O；取不同回流时间的溶液，4℃避光放置；其中Cd2+：Zn：Se：HMP：MPA：N2H4·H2O的摩尔比为1：1：(0.05-0.2)：(0.3-0.7)：(2-3)：400。
根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的双稳定剂包被的三元量子点为回流6h的CdZnSe量子点。
根据本发明，优选的，步骤(2)中所述的BSA的体积分数为2％。
根据本发明，优选的，步骤(3)的d中，所述的Ag为甲胎蛋白(AFP)抗原。
根据本发明，优选的，步骤(1)、(2)、(3)中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris～HCl缓冲溶液或B～R缓冲溶液中的一种；所述的磷酸盐缓冲溶液为K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液。
根据本发明，优选的步骤(3)中冲洗电极所用冲洗液为PBST(0.01mol/L PBS缓冲液中含0.02％吐温20,pH 7.4)溶液。
根据本发明，优选的，步骤(4)中对一系列标准浓度的抗原构建的光谱型ECL免疫传感器进行电致化学发光光谱测试，绘制工作曲线，然后根据工作曲线测试待测样品溶液的抗原浓度；
进一步优选的，步骤如下：
i、以步骤(3)制得的三元量子点为标记物的光谱型ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.1mol/L过硫酸铵的PBS缓冲溶液中，对一系列标准浓度的抗原溶液进行电致化学发光光谱测试，绘制工作曲线；
ii、将待测样品溶液按照步骤i中的方法进行电致化学发光光谱测试，根据所得电致化学发光光谱的信号对应工作曲线，得到待测样品溶液中的抗原浓度。
本发明的原理：
本发明采用双稳定剂-巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的三元量子点为标记物，单色性良好。量子点与生物分子反应后，其ECL光谱与其荧光光谱峰位置不变，且对其ECL发光强度影响较小。
本发明采用的双稳定剂包被的三元量子点表面带有羧基，采用1-乙基-3,3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化量子点表面的羧基后，与二抗的氨基反应，将量子点标记到二抗上，采用小牛血清蛋白(BSA)对量子点表面未反应的活性位点进行封闭。
本发明通过电聚合的方法使玻碳电极(GCE)与对氨基苯甲酸(ABA)形成碳氮键将ABA修饰在GCE上，得到表面具有羧基修饰的GCE，与一抗中氨基反应得到表面有一抗修饰的玻碳电极，通过抗原抗体的特异性结合将抗原和量子点修饰的二抗修饰到电极表面。
本发明中电致化学发光光谱测试可参考使用CN201610224510.6公开的设备进行。
本发明的有益效果：
1、本发明方法的选择性高。本发明构建的光谱型电化学发光免疫传感器是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合构建的，因此待测液中的干扰蛋白并不能与抗原第一抗体和第二抗体结合，对本发明检测体系无干扰。
2、本发明方法操作简单，重复性好。对临床早期诊断癌症具有重要的科学意义和应用价值。
3、本发明方法检测的灵敏度较高，甲胎蛋白抗原检测限可达10.0fg/mL。
附图说明
图1为本发明实施例1步骤(1)所制得不同回流时间的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdZnSe量子点的紫外-可见吸收光谱图(a-g:2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h)。
图2为本发明实施例1步骤(1)所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdZnSe量子点的荧光光谱图(a-g:2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h)。
图3为本发明实施例1步骤(1)所制得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的回流时间为6h的CdZnSe量子点的荧光光谱图(a)、紫外-可见吸收光谱图(b)及ECL光谱图(c)。
图4为本发明实施例1制得的甲胎蛋白抗原浓度为100.0pg/mL时以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫传感器的ECL光谱图。
图5为本发明实施例2制得的甲胎蛋白抗原浓度为50.0pg/mL时以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫传感器的ECL光谱图。
图6为本发明实施例3制得的甲胎蛋白抗原浓度为10.0pg/mL时以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫传感器的ECL光谱图。
图7为本发明实施例4制得的甲胎蛋白抗原浓度为5.0pg/mL时以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫传感器的ECL光谱图。
图8为本发明实施例5制得的甲胎蛋白抗原浓度为1.0pg/mL时以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫传感器的ECL光谱图。
图9为本发明实施例6制得的甲胎蛋白抗原浓度为0.50pg/mL时以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫传感器的ECL光谱图。
图10为本发明实施例7制得的甲胎蛋白抗原浓度为0.10pg/mL时以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫传感器的ECL光谱图。
图11为本发明实施例8制得的甲胎蛋白抗原浓度为0.010pg/mL时以CdZnSe量子点为标记物的光谱型电化学发光免疫传感器的ECL光谱图。
图12为试验例1中根据不同浓度AFP抗原(0.10pg/mL～100.0pg/mL)对免疫传感器的ECL光谱信号响应绘制的工作曲线。
具体实施方式
实施例中数据收集方式：紫外-可见吸收光谱由北京普析通用仪器有限公司生产的TU-1901双光束紫外可见分光光度计采集，荧光光谱由天津港东科技发展股份有限公司生产的F-320荧光分光光度计采集。
电化学发光光谱是通过将VersaSTAT 3型电化学分析仪与Acton SP-2300型CCD光栅光谱仪联用的方式采集，所施加的电势窗口为0～-1.6V，扫描速度为50mV/s，初扫向负。可参见：中国专利文件CN201610224510.6公开的设备。
实施例中所采用的甲胎蛋白单克隆抗体、抗原及二抗均购自北京科跃中楷生物科技有限公司。
实施例中所用的缓冲溶液为pH＝7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液)。
实施例1、
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫检测方法，包括步骤如下：
(1)CdZnSe量子点的制备
室温下，将0.80mL 0.20mol/L CdCl2溶液加入到100mL圆底三口烧瓶中，加超纯水稀释至50mL。依次向三口烧瓶中加入27.7mg Zn(CH3COO)2和72.5mg HMP，搅拌5min后加入34.6μL MPA。用6mol/L NaOH将溶液pH调至8.0，缓慢加入1.60mL 20.0mM Na2SeO3溶液，待上述溶液在100℃下加热回流10min后，加入3.67mL N2H4·H2O。取不同回流时间的溶液，4℃避光放置。其中Cd2+：Zn：Se：HMP：MPA：N2H4·H2O的摩尔比为1：1：0.2：0.50：2.5：400。巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdZnSe量子点的紫外-可见吸收光谱图如图1所示，荧光光谱图如图2所示。
(2)CdZnSe量子点标记AFP二抗的制备(Ab2∣CdZnSe NCs)
向100μL 10.0μM CdZnSe量子点中加入50μL含等体积EDC(100mg/mL)、NHS(100mg/mL)的0.10M pH＝6.0的PBS缓冲溶液于室温下反应，活化30min后离心(12000r/min，6min)，将沉淀重新分散于100μL 10mM pH 7.4PBS缓冲液中。将1.5mL 100μg/mL Ab2加入到上述溶液中，室温下震荡摇匀3h后，加入20μL体积分数2％的BSA溶液封闭未反应的活性位点。封闭30min后，将溶液离心后重新分散于100μL 10mM pH 7.4PBS缓冲液中。
(3)以CdZnSe量子点为标记物构建ECL光谱型免疫传感器
以6h CdZnSe量子点为标记物构建免疫传感器的过程如下:
a、将GCE用0.3μm的α-Al2O3抛光粉抛光至镜面，用超纯水洗去电极表面多余的抛光粉，并用氮气吹干。将GCE置入5mL含0.01mol/LABA的PBS(10mM，pH 7.4，10mM KCl为支持电解质)缓冲液中。在0.4-1.2V的电位区间内进行循环伏安扫描，以10mV/s的扫速将ABA在GCE上电聚合2圈。先用无水乙醇再用超纯水清洗修饰后的电极，去除未反应的ABA，此时形成表面带有羧基的修饰电极(GCE∣ABA)。
b、分别取10μL EDC(100mg/mL)、NHS(100mg/mL)滴涂于步骤(a)所述修饰电极上，活化电极表面的羧基，37℃反应30min后用PBST(0.01mol/L PBS缓冲液中含0.02％吐温20,pH 7.4)溶液冲洗电极表面三次。将20μL 10μg/mL Ab1滴加在上述电极表面，37℃反应2h，将Ab1以共价偶联的方式固定在电极表面(GCE∣ABA-Ab1)。
c、用PBST溶液冲洗步骤(b)的电极后，向电极表面滴加20μL 1％(v/v)BSA溶液，37℃反应1h以封闭未反应的活性位点。
d、用PBST溶液清洗上述步骤中(c)电极表面三次，取不同浓度Ag滴加在电极表面，37℃反应90min，通过抗原抗体特异性结合实现Ag在GCE表面的固定(GCE∣ABA-Ab1<Ag)。然后将上述电极在Ab2∣CdZnSe NCs溶液中37℃孵育90min，将量子点固定在电极表面，形成免疫复合物修饰电极(GCE∣ABA-Ab1<Ag>Ab2∣CdZnSe NCs)。实验前用PBST溶液清洗修饰电极三次。
(4)光谱型ECL免疫检测
以步骤(3)制得的三元量子点为标记物的光谱型ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.1mol/L过硫酸铵的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，对100.0pg/mL AFP抗原溶液进行电致化学发光光谱测试。
实施例2、
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫分析策略，步骤同实施例1，不同的是：甲胎蛋白抗原浓度为50.0pg/mL。
实施例3、
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫分析策略，步骤同实施例1，不同的是：甲胎蛋白抗原浓度为10.0pg/mL。
实施例4、
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫分析策略，步骤同实施例1，不同的是：甲胎蛋白抗原浓度为5.0pg/mL。
实施例5、
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫分析策略，步骤同实施例1，不同的是：甲胎蛋白抗原浓度为1.0pg/mL。
实施例6、
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫分析策略，步骤同实施例1，不同的是：甲胎蛋白抗原浓度为0.50pg/mL。
实施例7、
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫分析策略，步骤同实施例1，不同的是：甲胎蛋白抗原浓度为0.10pg/mL。
实施例8、
一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫分析策略，步骤同实施例1，不同的是：甲胎蛋白抗原浓度为0.010pg/mL。
实施例9-21、
如实施例1所述，不同的是：将甲胎蛋白抗原分别用癌胚抗原、糖类抗原125、糖类抗原15-3、糖类抗原72-4、糖类抗原19-9、前列腺特异性抗原、游离前列腺特异抗原、爱滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲状腺球蛋白抗原、肌钙蛋白T抗原、肌红蛋白抗原替代。
试验例1、
根据实施例2-7不同浓度AFP抗原的免疫传感器的ECL光谱信号，绘制工作曲线，如图12所示。可根据工作曲线测试待测样品溶液的抗原浓度。

Claims (6)

1.一种基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫检测方法，包括步骤如下：
（1）双稳定剂包被的CdZnSe量子点的制备
室温下，将0.20 mol/L CdCl2溶液加入到100 mL圆底三颈烧瓶中，加超纯水稀释至50mL；依次向圆底三颈烧瓶中加入 Zn(CH3COO)2和 HMP，搅拌5 min后加入MPA；用NaOH将溶液pH调至8.0，缓慢加入Na2SeO3溶液，待上述溶液在100℃下加热回流10 min后，加入N2H4·H2O；取回流时间为6h的溶液，4℃避光放置；其中Cd2+：Zn：Se：HMP：MPA：N2H4·H2O的摩尔比为1：1：（0.05-0.2）：（0.3-0.7）：（2-3）：400；
（2）Ab2| CdZnSe NCs的制备
向双稳定剂包被的CdZnSe 量子点溶液中加入含等体积EDC和NHS的PBS缓冲溶液，于室温下反应活化30 min，然后离心得沉淀；将沉淀重新分散到PBS缓冲溶液中，加入Ab2，室温下震荡摇匀3 h后，加入BSA封闭未反应的活性位点；封闭30 min后，离心得沉淀，将沉淀重新分散到PBS缓冲溶液中，得Ab2| CdZnSe NCs；
（3）以CdZnSe 量子点为标记物构建光谱型ECL免疫传感器
a、将GCE用0.3 µm的抛光粉抛光至镜面，用超纯水洗去电极表面多余的抛光粉，并用氮气吹干；将玻碳电极置入含ABA的缓冲液中，在0.4-1.2 V电位区间内、以10 mV/s扫速循环伏安扫描两圈，得到GCE∣ABA，用无水乙醇、超纯水依次清洗所得修饰电极；
b、分别取等量 EDC、NHS滴涂于步骤（a）所述修饰电极上，活化电极表面的羧基，37℃反应30 min后冲洗电极表面三次；将Ab1滴加在GCE∣ABA表面，37℃反应2 h，将Ab1以共价偶联的方式固定在电极表面，得GCE∣ABA-Ab1；
c、将GCE∣ABA-Ab1清洗后，向电极表面滴加BSA 溶液，37℃反应1 h以封闭未反应的活性位点；
d、将步骤（c）得到的电极清洗后，取Ag滴加在电极表面，37℃反应90 min，通过抗原抗体特异性结合实现Ag在电极表面的固定，得GCE∣ABA-Ab1<Ag；然后将GCE∣ABA-Ab1<Ag在Ab2∣CdZnSe NCs溶液中37℃孵育90 min，将量子点固定在电极表面，形成免疫复合物修饰电极，得GCE∣ABA-Ab1<Ag> Ab2∣CdZnSeNCs；
（4）光谱型ECL免疫检测
以步骤（3）制得的三元量子点为标记物的光谱型ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.1 mol/L过硫酸铵的PBS缓冲溶液中，对制得的光谱型ECL免疫传感器进行电致化学发光光谱测试。
2.根据权利要求1所述的基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的BSA的体积分数为2%。
3.根据权利要求1所述的基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的PBS缓冲溶液为K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫检测方法，其特征在于，步骤（3）b中冲洗电极所用冲洗液为PBST溶液，PBST溶液的指标如下：
0.01 mol/L PBS 缓冲液中含 0.02% 吐温 20, pH 7.4。
5.根据权利要求1所述的基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫检测方法，其特征在于，步骤（4）中对一系列标准浓度的抗原溶液进行电致化学发光光谱测试，绘制工作曲线，然后根据工作曲线测试待测样品溶液的抗原浓度。
6.根据权利要求1所述的基于CdZnSe量子点的ECL光谱型免疫检测方法，其特征在于，步骤（4）中电致化学发光光谱测试的步骤如下：
i、以步骤（3）制得的三元量子点为标记物的光谱型ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.1 mol/L过硫酸铵的PBS缓冲溶液中，对一系列标准浓度的抗原构建的光谱型ECL免疫传感器进行电致化学发光光谱测试，绘制工作曲线；
ii、将待测样品溶液按照步骤i中的方法进行电致化学发光光谱测试，根据所得电致化学发光光谱的信号对应工作曲线，得到待测样品溶液中的抗原浓度。
CN201610236247.2A 2016-04-15 2016-04-15 一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测方法 Active CN106053823B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610236247.2A CN106053823B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610236247.2A CN106053823B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106053823A CN106053823A (zh) 2016-10-26
CN106053823B true CN106053823B (zh) 2018-03-13

Family

ID=57177542

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610236247.2A Active CN106053823B (zh) 2016-04-15 2016-04-15 一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106053823B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109444403B (zh) * 2018-12-24 2021-07-06 济南大学 一种基于Ru(bpy)32+/Zn-oxalate的免疫传感器的制备方法
CN110501487A (zh) * 2019-09-08 2019-11-26 浙江理工大学 一种基于Au@Zn-MOFs复合材料的电化学免疫传感器的构建方法
CN111139066B (zh) * 2019-12-24 2021-05-07 山东大学 一种广谱型低电位电化学发光体系及其构建方法
CN112147132B (zh) * 2020-09-23 2021-07-09 山东大学 一种光谱型的近红外电化学发光免疫传感器的制备方法
CN117143594A (zh) * 2023-07-20 2023-12-01 三峡国际招标有限责任公司 金属有机骨架富集氮化硼量子点的电致发光材料及其制备的传感器

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100529013C (zh) * 2007-09-27 2009-08-19 上海交通大学 三元量子点CdZnSe的制备方法
CN101235289A (zh) * 2008-01-24 2008-08-06 上海交通大学 水溶性CdZnTe三元量子点的水相合成方法
CN101585515A (zh) * 2009-06-15 2009-11-25 中国医药城泰州纳米生命医学研究院 一种CdxZn1-xSe三元体系量子点的制备方法
US9425253B2 (en) * 2009-09-23 2016-08-23 Crystalplex Corporation Passivated nanoparticles
CN104764737B (zh) * 2015-04-08 2018-04-27 山东大学 一种基于绿光辐射量子点的单色ecl免疫检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106053823A (zh) 2016-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106053823B (zh) 一种基于CdZnSe三元量子点的光谱型电致化学发光免疫检测方法
Zhou et al. Spectrum-resolved triplex-color electrochemiluminescence multiplexing immunoassay with highly-passivated nanocrystals as tags
CN104133069B (zh) 一种双功能标记光电化学传感器的制备方法及应用
CN102362182B (zh) N-(4-氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺功能化纳米金及其制备方法和应用
CN107831198B (zh) 一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白i传感器的制备方法及应用
JPH01500146A (ja) エレクトロ化学ルミネセンスアツセイ
CN105301241B (zh) 用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用
ITMI952049A1 (it) Coloranti fluorescenti della famiglia della solfo benz e indocianina
CN101793899B (zh) 一种检测脑钠肽的光学生物传感器及试剂制备方法
CN102749452B (zh) 一种近红外的电致化学发光免疫检测方法
CN104764737B (zh) 一种基于绿光辐射量子点的单色ecl免疫检测方法
WO2021180132A1 (zh) 基于Fe2O3材料单层光电化学传感器的癌胚抗原检测方法
CN105954339B (zh) 一种基于CeO2@Cu2O/Au@Pt的夹心型免疫传感器的制备方法及应用
Yu et al. An aggregation-induced emission-based indirect competitive immunoassay for fluorescence “turn-on” detection of drug residues in foodstuffs
CN104122309A (zh) 一种环糊精-Cu@Ag电化学免疫传感器的制备及应用
CN101706498A (zh) 一种电致化学发光免疫传感器的制备方法
CN106066324A (zh) 一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法及应用
CN109142748A (zh) 人前列腺特异性抗原检测方法及其试剂盒
Zhong et al. Dual-wavelength responsive photoelectrochemical aptasensor based on ionic liquid functionalized Zn-MOFs and noble metal nanoparticles for the simultaneous detection of multiple tumor markers
CN108445216A (zh) 一种人抗缪勒氏管激素测定试剂盒及其制备方法与应用
CN109142331A (zh) 一种用于癌胚抗原检测的电致化学发光方法及其试剂盒
CN106124487B (zh) 一种基于光谱分辨原理的电致化学发光多组分免疫检测方法
CN101251535B (zh) 基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器及其制法和用途
CN104865240B (zh) 一次性纳米电致化学发光双组份免疫传感器及其制备方法
CN101561393A (zh) 用表面等离子共振技术检测人血清肿瘤标志物的方法以及其中使用的芯片

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20161026

Assignee: Shandong Guochen Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: SHANDONG University

Contract record no.: X2021370000028

Denomination of invention: A spectral electrochemiluminescence immunoassay method based on cdznse ternary quantum dots

Granted publication date: 20180313

License type: Common License

Record date: 20210928

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract