CN110320253A - 一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建 - Google Patents
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Abstract
一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建。本发明中,通过阳极氧化法制备锐钛矿二氧化钛纳米管电极,TiO2纳米管电极通过静电吸附CdTe量子点形成CdTe/TiO2结构,在其表面固定能被前列腺特异性抗原剪切的特定肽,利用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺连接DNA,双螺旋DNA作为载体来固定阿霉素‑CuS复合物,CuS纳米晶体用作信号猝灭剂建立定量检测前列腺特异性抗原的灵敏的基于肽的光致电化学生物传感器。该光致电化学生物传感器具有良好的特异性,稳定性和重现性,在生物分析、疾病诊断和临床生物医学中具有潜在的应用。
Description
技术领域
本发明涉及血液中前列腺特异性抗原(PSA)的检测方法,具体来说是基于具有光电活性的无机半导体材料及一段特定的肽构建一个用于测定血液中PSA含量的光致电化学生物传感器。
背景技术
前列腺特异性抗原是由前列腺分泌的一种丝氨酸蛋白酶,血清中PSA的含量对于前列腺癌的诊断具有很大的作用。一般说来当血清中的PSA的含量少于4.0 ng/mL为正常,当前列腺癌发生时,PSA的含量超过10 ng/mL,根据PSA的多少辅助判断是否患病。迄今为止,很多检测方法比如化学发光法,荧光分析和电化学分析,都被用来测定血液中PSA。然而,这些分析系统通常会受到灵敏度有限的固有缺陷的困扰。因此,需要设计一种具有高灵敏度的检测方案用于检测血液中的PSA。
最近的研究发现使用噬菌体展示技术选择的短结合肽由于其可靠性,成本有效性,稳定性,耐恶劣环境等优点有望被用作生物测定中常规抗体的替代物。在本实验中设计了特异性肽(CEHSSKLQK)作为可被PSA识别和切割的分子识别元件,在PSA存在时特异性切割肽链。
发明内容
本发明的目的是基于光致电化学技术,结合纳米材料及PSA对肽序列特异性剪切的特性,构建了一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器。
为了解决上述问题,本发明通过以下措施来实现:所述的一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建,其特征是包含以下步骤:
(1)通过阳极氧化的方法在钛片上刻蚀并煅烧制备锐钛矿二氧化钛纳米管电极;
(2)步骤(1)中得到的二氧化钛纳米管电极依次浸泡在CdTe QDs溶液和1 % 聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中并用超纯水清洗,重复4次;
(3)将50 μL肽溶液滴加到步骤(2)形成的电极上并在4 ℃条件下孵育8 h, 超纯水清洗后用巯基己醇封闭活性位点;
(4)将步骤(3)修饰的电极浸入1 μmol/L R1溶液中,在 4 ℃条件下孵育8 h,超纯水清洗,随后将电极依次浸入到R2,H1,H2中形成双链DNA;
(5)将步骤(4)中得到的电极浸泡在阿霉素-CuS(Dox-CuS)溶液中,在4 ℃条件下反应7h,超纯水清洗,置于含有0.1mol/L抗坏血酸(AA)的pH 7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中,测定其光电流强度;
(6)将步骤(5)中得到的电极浸泡在不同浓度的PSA溶液或者实际样品中,在4 ℃条件下孵育45 min,超纯水清洗,置于含有0.1mol/L抗坏血酸(AA)的pH 7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中,测量其光电流强度,建立起PSA浓度与光电流强度的关系。
本发明的有益效果
(1)利用特定蛋白识别特定序列肽的技术,能够实现目标物PSA的特异性识别;
(2)利用阿霉素插入双链DNA技术在DNA上固定CuS纳米晶体作为信号猝灭剂,实现光电信号降低;
(3)固定在电极上的肽被前列腺特异性抗原切断后,信号猝灭剂从电极表面离开,使得光电信号明显地增强;
(4)提供了一个灵敏度高,特异性高,稳定性好的基于肽的光电化学传感装置。
所述的一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建具体步骤如下:
(1)本发明所述二氧化钛纳米管电极制备方法:依次用丙酮、乙醇和超纯水中超声清洗钛片各10 min,钛片作为阳极,石墨片作为阴极,包含0.3 wt % NH4F和2.0 vol %水的乙二醇作为电解质溶液,外加恒电压为40 V的条件下氧化2 h,取出钛片并用超纯水清洗,干燥后得到无定型的二氧化钛,在450 ℃条件下煅烧2 h后冷却到室温得到锐钛矿二氧化钛纳米管,二氧化钛纳米管电极的工作区域面积为1cm×1cm。
(2)本发明所述的CdTe负载到二氧化钛纳米管表面方法:将120 mL 5 mmol/L的CdCl2溶液和90 μL巯基丙酸溶液依次加入三颈烧瓶中,用1.0 mol/L的NaOH调节溶液的pH至11.8,在N2保护下反应30 min,将120 mg NaBH4和60 mg Na2TeO3相继加入三颈烧瓶,混合溶液加热到100 °C,N2保护下回流3 h即可获得CdTe量子点,然后用7000 r/min 转速下的离心机离心15 min,重复三次,将得到的沉淀重新分散在超纯水中,将二氧化钛纳米管电极依次浸泡在CdTe溶液和1%聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中各10分钟后并用超纯水清洗,重复四次后得到CdTe/TiO2电极。
(3)将1 mg肽溶解在1 mL的pH 7.4磷酸缓冲液中,加入20 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),混匀后将步骤(2)得到的电极浸入上述溶液中,在4 ℃条件下孵育8 h,超纯水清洗,再浸入1 mmol/L的巯基己醇溶液中,孵育2 h,超纯水清洗。
(4)将20 mg的EDC和10 mg的NHS加入1mL 1μmol/L的R1溶液中,混匀,将步骤(3)得到的电极浸泡在上述溶液中,4 ℃,孵育8 h,超纯水清洗。
(5)将步骤(4)得到的电极浸泡在1mL 1 μmol/L的R2溶液中,在4 ℃条件下孵育1h, 清洗,之后浸入1 mL含1 μmol/L H1,1 μmol/L H2的溶液中,在4 ℃条件下孵育2 h,超纯水清洗,得到双链DNA修饰的电极。
(6)本发明所述的Dox-CuS固定方法:将6 μL巯基乙酸加入50 mL的2 mmol/L的 Cu(NO3)2溶液中,用0.5 mol/L NaOH调pH至9.0,将溶液转移至三颈烧瓶中,通N 2气 30 min,将50 mL 5 mmol/L 的Na2S逐滴地加入到溶液中,N2气保护下反应24 h,用乙醇和超纯水洗涤三次,得到CuS纳米晶产物,分散在超纯水中形成CuS纳米晶溶液,将4 mg EDC和2 mg NHS加入1 mL 的CuS NCs悬浮液中,30 min后,将0.50 mL 15 mmol/L Dox溶液加入上述溶液,4℃下孵育12 h,用乙醇和超纯水洗涤三次后,得到Dox-CuS复合物;将步骤(5)得到的电极浸泡在Dox-CuS复合物溶液中,在4 ℃条件下反应7 h,超纯水清洗。
(7)将步骤(6)中得到的电极浸入含有不同浓度PSA溶液或者实际样品中,4 ℃条件下孵育45 min, 超纯水清洗,置于含有0.1 mol/L抗坏血酸(AA)的pH 7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中,测定其光电流强度。
附图说明
图1 二氧化钛纳米管扫描电镜图像;
图2 前列腺特异性抗原检测光致电化学传感器构建示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的特点,将结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施实例1
一种快速检测PSA的方法,其特征是包含以下步骤:
(1)依次用丙酮、乙醇和超纯水中超声清洗钛片各10 min,钛片作为阳极,石墨片作为阴极,包含0.3 wt % NH4F和2.0 vol %水的乙二醇作为电解质溶液,外加恒电压为40 V的条件下氧化2 h,取出钛片并用超纯水清洗,干燥后得到无定型的二氧化钛,在450 ℃条件下煅烧2 h后冷却到室温得到锐钛矿二氧化钛纳米管,二氧化钛纳米管电极的工作区域面积为1cm×1cm。
(2)将120 mL 5 mmol/L的CdCl2溶液和90 μL巯基丙酸溶液加入三颈烧瓶中,用1.0 mol/L的NaOH调节溶液的pH至11.8,在N2保护下反应30 min,将120 mg NaBH4和60 mgNa2TeO3相继加入三颈烧瓶,混合溶液加热到100 °C,N2保护下回流3 h即可获得CdTe量子点,然后用7000 r/min 转速下的离心机离心15 min,重复三次,将得到的沉淀重新分散在超纯水中,将二氧化钛纳米管电极分别浸泡在CdTe溶液和1%聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中各10分钟后并用超纯水清洗,重复四次,得到CdTe/TiO2电极。
(3)将1 mg肽溶解在1 mL的磷酸缓冲液中,加入20 mg EDC和10 mg NHS,混匀后将电极的工作区域浸入上述溶液中,在4 ℃条件下孵育8 h,超纯水清洗,再浸入1 mmol/L的巯基己醇溶液中,孵育2 h,超纯水清洗。
(4)将20 mg的EDC和10 mg的NHS加入1mL 1μmol/L的R1溶液中,混匀,将肽修饰的电极浸泡在上述溶液中,4 ℃,孵育8 h,超纯水清洗。
(5)将R1修饰的电极浸泡在1mL 1μmol/L的R2溶液中,在4 ℃条件下孵育1 h, 超纯水清洗,然后浸入1 mL含1μmol/L H1,1μmol/L H2的溶液中,在4 ℃条件下孵育2 h,超纯水清洗,得到双链DNA修饰的电极。
(6)将6 μL巯基乙酸加入50 mL的2 mmol/L的 Cu(NO3)2溶液中,用0.5 mol/L NaOH调pH至9.0,转移至三颈烧瓶中,通N 2气30 min,将50mL 5 mmol/L 的Na2S逐滴地加入到溶液中,N2气保护下反应24 h,用乙醇和超纯水洗涤三次,分散在超纯水中形成CuS纳米晶体溶液,将4 mg EDC和2 mg NHS加入1 mL 的CuS NCs悬浮液中,30 min后,将0.50 mL 15mmol/L Dox溶液加入上述溶液,4 ℃下孵育12 h,用乙醇和超纯水洗涤3次,得到Dox-CuS复合物,将双链DNA修饰的电极浸入Dox-CuS复合物溶液中,4 ℃下孵育7 h,超纯水清洗。
(7)将步骤(6)中得到的电极浸入含有不同浓度PSA的溶液中,4 ℃条件下孵育45min,超纯水清洗,测量光电流强度,结果表明在 0.005 到20.00 ng mL-1范围内存在良好线性关系,线性回归方程为ΔI = 0.5080 + 0.1449 lgc PSA (ng/mL) ,相关系数为R=0.991,检测限为0.0015 ng/mL。
因此,该工作实现了高灵敏度、高稳定性地检测PSA。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建
<130> 1
<141> 2019-06-19
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tattaacttt actcc 15
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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Claims (7)
1.本发明的目的为一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建,其特征是包含以下步骤:
(1)通过阳极氧化的方法在钛片上刻蚀并煅烧制备锐钛矿二氧化钛纳米管电极;
(2)步骤(1)中得到的二氧化钛纳米管电极依次浸泡在CdTe QDs溶液和1 % 聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中并用超纯水清洗,重复4次;
(3)将50 μL肽溶液滴加到步骤(2)形成的电极上并在4 ℃条件下孵育8 h, 超纯水清洗后用巯基己醇封闭活性位点;
(4)将步骤(3)修饰的电极浸入1 μmol/L R1溶液 中,在4 ℃条件下孵育8 h,超纯水清洗,之后将电极依次浸入到R2,H1,H2溶液中形成双链DNA;
(5)将步骤(4)中得到的电极浸泡在阿霉素-CuS(Dox-CuS)溶液中,在4 ℃条件下反应7h,超纯水清洗,;
(6)将步骤(5)中得到的电极浸泡在不同浓度PSA溶液或者实际样品中,在4 ℃条件下孵育45 min,超纯水清洗,置于含有0.1 mol/L抗坏血酸(AA)的pH 7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中,测量其光电流强度,建立起PSA浓度与光电流强度的关系。
2.根据权利要求1所述的一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建,其特征在于:步骤(1)中,所述二氧化钛纳米管电极制备方法:依次用丙酮、乙醇和超纯水中超声清洗钛片各10 min,钛片作为阳极,石墨片作为阴极,包含0.3 wt % NH4F和2.0 vol %水的乙二醇作为电解质溶液,外加恒电压为40 V的条件下氧化2 h,取出钛片并用超纯水清洗,干燥后得到无定型的二氧化钛,在450 ℃条件下煅烧2 h后冷却到室温得到锐钛矿二氧化钛纳米管,二氧化钛纳米管电极的工作区域面积为1cm×1cm。
3.根据权利要求1所述的一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建,其特征在于:步骤(2)中,所述的CdTe负载到二氧化钛纳米管表面方法:将120 mL 5 mmol/L的CdCl2溶液和90 μL巯基丙酸溶液依次加入三颈烧瓶中,用1.0 mol/L的NaOH调节溶液的pH至11.8,在N2保护下反应30 min,将120 mg NaBH4 和60 mg Na2TeO3相继加入三颈烧瓶,混合溶液加热到100 °C,N2保护下回流3 h即可获得CdTe量子点,然后用7000 r/min 转速下的离心机离心15 min,重复三次,将得到的沉淀重新分散在超纯水中,将二氧化钛纳米管电极依次浸泡在CdTe溶液和1 %聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中各10分钟后并用超纯水清洗,重复这一过程四次后得到CdTe/TiO2电极。
4.根据权利要求1所述的一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建,其特征在于:步骤(3)中,将1 mg肽溶解在1 mL的pH 7.4磷酸缓冲液中,加入20 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),混匀后将步骤(2)得到的电极浸入上述溶液中,在4 ℃条件下孵育8 h,超纯水清洗,再浸入1 mmol/L的巯基己醇溶液中,孵育2 h,超纯水清洗。
5.根据权利要求1所述的一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建,其特征在于:步骤(4)中,将20 mg的EDC和10 mg的NHS加入1mL 1μmol/L的R1溶液中,混匀,将步骤(3)得到的电极浸泡在上述溶液中,4 ℃,孵育8 h,超纯水清洗,然后将电极浸泡在1mL1 μmol/L的R2溶液中,在4 ℃条件下孵育1 h, 超纯水清洗,之后浸入1 mL含1 μmol/L H1,1 μmol/L H2的溶液中,在4 ℃条件下孵育2 h,超纯水清洗,得到双链DNA修饰的电极。
6.根据权利要求1所述的一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建,其特征在于:步骤(5)中,将6 μL巯基乙酸加入50 mL的2 mmol/L的 Cu(NO3)2溶液中,用0.5mol/L NaOH调pH至9.0,将溶液转移至三颈烧瓶中,通N 2气 30 min,将50mL 5 mmol/L 的Na2S逐滴地加入到溶液中,N2气保护下反应24 h,用乙醇和超纯水洗涤三次,得到CuS纳米晶产物,分散在超纯水中形成CuS纳米晶溶液,将4 mg EDC和2 mg NHS加入1 mL 的CuS NCs悬浮液中,30 min后,将0.50 mL 15 mmol/L Dox溶液加入上述溶液,4 ℃下孵育12 h,用乙醇和超纯水洗涤三次后,得到Dox-CuS复合物;将步骤(4)得到的电极浸泡在Dox-CuS复合物溶液中,在4 ℃条件下反应7 h,超纯水清洗。
7.根据权利要求1所述的一种前列腺特异性抗原检测的光致电化学传感器的构建,其特征在于:步骤(6)中,将步骤(5)中得到的电极浸入含有不同浓度PSA溶液和实际样品中,4℃条件下孵育45 min, 超纯水清洗,置于含有0.1 mol/L抗坏血酸(AA)的pH 7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中,测定其光电流强度。
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