CN117686702A - 一种鉴定外泌体的荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定外泌体的荧光探针及其应用，涉及生物检测技术领域，包括两亲性α‑螺旋肽链，所述两亲性α‑螺旋肽链的N端通过疏水性荧光素进行修饰，所述两亲性α‑螺旋肽链的氨基酸序列为LGNIFANLFKGLFGKKE，两亲性α‑螺旋肽链含有多个带正电荷的氨基酸，与外泌体表面富集的负电性磷脂发生很好的静电作用并嵌入到脂质堆积的缺陷中；能够参与细胞过程中膜曲率的动态调节，可以识别并结合膜的高曲率。通过检测疏水性荧光素的荧光信号强度，来定量检测与荧光探针结合的外泌体。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种鉴定外泌体的荧光探针及其应用。
背景技术
外泌体起源自细胞膜向内出芽形成胞内小体，在细胞内经过早期胞内小体、多囊复合体、定向组装、迁移等过程，与细胞膜融合后以外吐方式排出细胞。外泌体直径30-100nm，表面由脂质和蛋白质，内部由核酸和蛋白质等构成。可以反应源细胞的特征。外泌体作为细胞间信息传递的重要媒介，天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。可以作为潜在的生物标志物，在医疗领域发挥重要作用。
现有的外泌体的检测技术主要有Elisa、TEM、Western blotting、NTA等。TEM可以直接分析外泌体的大小和形态，但是样本制作困难且电镜价格高昂；NTA：利用散射光和布朗运动两方的特点，得到悬浊液中粒子的粒径数据。但是操作起来很难。Elisa：需要抗原抗体特异性结合同时酵素标记抗体，酶标仪检测，定量。虽然特异性强，但是抗体标记会花费大量时间，并且抗体价格贵。综上所述，现有的外泌体的主流鉴定方法检测步骤多，检测时间长且价格昂贵。因此，一种高效、简单的外泌体的鉴定方法的开发是很有必要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种鉴定外泌体的荧光探针，解决现有技术中缺少快速与外泌体特异性结合的探针的技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种鉴定外泌体的荧光探针的制备方法，解决了现有技术中缺少制备快速与外泌体特异性结合的探针的技术问题。
本发明的目的之三在于提供一种鉴定外泌体的荧光探针在外泌体鉴定中的应用，解决了现有技术中缺少一种外泌体鉴定中检测步骤少，检测时间短的方法的技术问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，提供了一种鉴定外泌体的荧光探针，包括两亲性α-螺旋肽链，所述两亲性α-螺旋肽链的N端通过疏水性荧光素进行修饰，所述两亲性α-螺旋肽链具有如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
进一步的，所述疏水性荧光素为尼罗红。
第二方面，提供了一种鉴定外泌体的荧光探针的制备方法，包括采用固相Fmoc法合成两亲性α-螺旋肽链，在两亲性α-螺旋肽链上耦连疏水性荧光素，脱除树脂，得到所述鉴定外泌体的荧光探针。
进一步的，所述采用固相Fmoc法合成两亲性α-螺旋肽链包括以下步骤：
A、向固相载体中加入脱Fmoc保护剂，脱除Fmoc保护基团，得到载体树脂；
B、向载体树脂中加入氨基酸、COMU和DIEA配制成溶液，依次按照两亲性α-螺旋肽链的氨基酸顺序进行缩合反应；肽链从C端向N端延伸
C、加入封闭剂，得到两亲性α-螺旋肽链。
进一步的，所述脱Fmoc保护剂由哌啶和DMF胺组成，所述哌啶:DMF的体积比为1:9～3:7；
优选地，所述哌啶:DMF的体积比为1:4。
进一步的，所述氨基酸、COMU和DIEA的摩尔比为1:2:4～1:4:7；
优选地，所述氨基酸、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6。
进一步的，所述封闭剂由无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和二甲基甲酰胺组成，所述无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和DMF胺的体积比为3:4:86～7:8:91；
优选地，所述无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和DMF胺的体积比为5:6:89。
进一步的，所述在两亲性α-螺旋肽链上耦连疏水性荧光素包括在两亲性α-螺旋肽链中加入脱Fmoc保护剂，脱除Fmoc保护基团，加入由疏水性荧光素、COMU和DIEA组成的溶液，得到荧光探针树脂复合物；
所述疏水性荧光素、COMU和DIEA的摩尔比为1:2:4～1:4:7；
优选地，所述疏水性荧光素、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6。
进一步的，所述脱除树脂包括在荧光探针树脂复合物中加入脱树脂试剂，脱去载体树脂，得到权利要求1或2所述的鉴定外泌体的荧光探针；
所述脱树脂试剂由TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚组成，所述TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚的体积比为45:3:2:1～92:7:5:4；
优选地，所述TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚的体积比为90:5:3:2。
第三方面，提供过来一种鉴定外泌体的荧光探针在外泌体鉴定中的应用。
本发明提供的鉴定外泌体的荧光探针及其应用，其中两亲性α-螺旋肽链含有多个带正电荷的氨基酸，能够与外泌体表面富集的负电性磷脂发生很好的静电作用并嵌入到脂质堆积的缺陷中；能够参与细胞过程中膜曲率的动态调节，可以识别并结合膜的高曲率。通过检测疏水性荧光素的荧光信号强度，来定量检测与荧光探针结合的外泌体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的Arf1-NR探针的MALDI-TOF-MS检测图谱；
图2为本发明实施例2提供的Arf1-NR探针与不同粒径大小的人工脂质体特异性结合检测结果；
图3为本发明实施例3提供的Arf1-NR探针的灵敏度检测各浓度荧光曲线图谱；
图4为本发明实施例3提供的Arf1-NR探针的灵敏度检测的标准曲线图；
图5为本发明实施例4提供的Arf1-NR探针鉴定不同来源外泌体的荧光应答结果。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中使用的缩写具有以下含义：
NR：尼罗红。
COMU：1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐。
DIEA：N,N-二异丙基乙胺。
TFA：三氟乙酸。
NMP：N-甲基吡咯烷酮。
DMF：二甲基甲酰。
milk exosome：牛乳外泌体。
外泌体结构的特性在于极小的半径造成的高曲率，以及含量丰富且不同于细胞膜比例的脂质成分，如磷脂酰丝氨酸和神经酰胺。因此，外泌体表面高度弯曲，并且存在大量带负电的不饱和磷脂，如磷脂酰丝氨酸，以及脂质堆积缺陷。
本发明第一方面提供了一种鉴定外泌体的荧光探针，包括两亲性α-螺旋肽链，所述两亲性α-螺旋肽链的N端通过疏水性荧光素进行修饰，所述两亲性α-螺旋肽链的氨基酸序列为LGNIFANLFKGLFGKKE(SEQ ID NO.1)。
两亲性α-螺旋肽链包括18个氨基酸，具有一定的疏水面，由于甲硫氨酸残基(M)容易被氧化，因此在两亲性α-螺旋肽链中使用正亮氨酸(X)代替甲硫氨酸残基(M)，将疏水性色素Nile Red放在疏水面上。Arf1-NR的疏水面插入高曲率膜的外泌体脂质堆积缺陷部分，形成一个很好的结合。
两亲性α-螺旋肽链含有多个带正电荷的氨基酸，与外泌体表面富集的负电性磷脂发生很好的静电作用并嵌入到脂质堆积的缺陷中；能够参与细胞过程中膜曲率的动态调节，可以识别并结合膜的高曲率。通过检测疏水性荧光素的荧光信号强度，来定量检测与荧光探针结合的外泌体。
其中，疏水性荧光素可以是香豆素-6、尼罗红、Cy5.5、IR780、Dil及其他疏水性荧光素。
在一些具体的实施例中，所述疏水性荧光素为尼罗红。
其中，所述荧光探针的结构为：NR-LGNIFANLFKGLFGKKEL，所述荧光探针的分子量为2439。
通过N端修饰尼罗红，当荧光探针与外泌体结合时，能够释放出荧光信号，通过检测NR荧光信号强度，对外泌体进行定量检测。
本发明第二方面提供了一种鉴定外泌体的荧光探针的制备方法，具体包括采用固相Fmoc法合成两亲性α-螺旋肽链，在两亲性α-螺旋肽链上耦连疏水性荧光素，脱除树脂，得到所述鉴定外泌体的荧光探针。
固相Fmoc法能够控制合成的两亲性α-螺旋肽链的氨基酸顺序，合成的两亲性α-螺旋肽链能够与外泌体表面富集的负电性磷脂发生很好的静电作用并嵌入到脂质堆积的缺陷中；参与细胞过程中膜曲率的动态调节，与外泌体结合具有特异性，通过耦联疏水性荧光素能够定性或定量检测外泌体。
在一些具体的实施例中，所述采用固相Fmoc法合成两亲性α-螺旋肽链包括以下步骤：
A向固相载体中加入脱Fmoc保护剂，脱除Fmoc保护基团，得到载体树脂；
B向载体树脂中加入氨基酸、COMU和DIEA配制成溶液，进行缩合反应；重复上述步骤，按照两亲性α-螺旋肽链的氨基酸顺序进行缩合反应，肽链从C端向N端延伸；
D加入封闭剂，得到两亲性α-螺旋肽链。
固相载体为固相多肽合成用树脂，固相多肽合成用树脂带有氨基，比如树脂。
固相载体的用量为100～500mg，具体的可以为但不限于100mg、200mg、300mg、400mg或500mg，也可以为100～500mg之间任意数值。
在一些具体的实施例中，所述脱Fmoc保护剂由哌啶和DMF胺组成，所述哌啶:DMF胺的体积比为1:9～3:7。
其中哌啶:DMF胺的体积比可以为但不限于1:9、1:4、2:5或3:7，也可以为1:9～3:7之间的任意比值。
优选地，哌啶:DMF胺的体积比为1:4。
当哌啶:DMF胺的体积比为1:4时，脱除Fmoc保护基团时间最短，杂质最少，显著提高脱除Fmoc保护基团的效率。
在一些具体的实施例中，所述氨基酸、COMU和DIEA的摩尔比为1:2:4～1:4:7；
优选地，所述氨基酸、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6。
COMU作为催化剂，DIEA作为缩合剂，当氨基酸、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6时，缩合反应效率最高。
在一些具体的实施例中，
所述封闭剂由无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和二甲基甲酰胺组成，所述无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和DMF胺的体积比为3:4:86～7:8:91；
当无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和DMF胺的体积比为5:6:89，封闭效果最佳。
优选地，所述无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和DMF胺的体积比为5:6:89。
在一些具体的实施例中，所述在两亲性α-螺旋肽链上耦连疏水性荧光素包括在两亲性α-螺旋肽链中加入脱Fmoc保护剂，脱除Fmoc保护基团，加入由疏水性荧光素、COMU和DIEA组成的溶液，得到荧光探针树脂复合物；
在一些具体的实施例中，所述疏水性荧光素、COMU和DIEA的摩尔比为1:2:4～1:4:7。
当疏水性荧光素、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6，疏水性荧光素耦合效率最高。
优选地，所述疏水性荧光素、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6。
在一些具体的实施例中，脱除树脂包括在荧光探针树脂复合物中加入脱树脂试剂，脱去载体树脂，得到鉴定外泌体的荧光探针；
所述脱树脂试剂由TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚组成，所述TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚的体积比为90:5:3:2。
制备的鉴定外泌体的荧光探针能够应用在外泌体的鉴定中，荧光探针能够与外泌体结合，通过检测荧光信号强度，实现定性或定量检测外泌体。
本发明第三方面提供了一种鉴定外泌体的荧光探针在外泌体鉴定中的应用，按照以下步骤进行：
制备外泌体荧光光谱标准曲线；
提取待鉴定样品的外泌体；
配置外泌体鉴定体系，如表1所示，混匀后使用分光光度计检测荧光强度；利用标准曲线计算待鉴定样品中外泌体的含量。
表1外泌体鉴定体系
鉴定外泌体的荧光探针在外泌体鉴定中的应用为非诊疗为目的的应用。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1制备鉴定外泌体的荧光探针
本实施例按照以下步骤制备鉴定外泌体的荧光探针，其中，哌啶、DMF胺、无水醋酸和2,6-二甲基吡啶均为分析纯试剂。
固相载体选用树脂(Resin for solid phase peptidesynthesis，Biotage)。
(1)称取固相载体110mg，在酰氨树脂中加入预先配制好的2ml脱Fmoc保护剂，搅拌5分钟，重复3次，进行Fmoc脱保护。
其中，脱Fmoc保护剂由体积比为1:4的哌啶和DMF胺组成。
(2)依次用2ml的DMF、2ml的DCM和2ml的DMF清洗两次。
(3)做kaiser测试，发现树脂变蓝，确认Fmoc保护基被脱去。
(4)合成两亲性α-螺旋肽链：从C端开始合成，以第一个氨基酸Lnle为例，以Lnle、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6的用量加入氨基酸Lnle、COMU和DIEA，溶解在2ml的NMP中，在多肽固相合成机中设置75℃，反应10min。
(5)依次用2ml的DMF、2ml的DCM和2ml的DMF清洗两次。
(6)重复步骤(4)(5)，按照两亲性α-螺旋肽链氨基酸的顺序进行偶联，依次偶联上氨基酸，最后一个氨基酸偶联完成并清洗完成。
(7)加入封闭剂2ml，搅拌5min，重复3次。
其中，封闭剂由体积比为5:6:89的无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和DMF胺组成。
(8)依次用2ml的DMF、2ml的DCM和2ml的DMF清洗两次。
(9)耦连色素：加入2ml脱Fmoc保护剂后，涡旋5分钟，依次用2-3ml的DMF、2-3ml的DCM和2-3ml的DMF清洗。加入由摩尔比为1:3:6的色素尼罗红、COMU和DIEA组成的溶液，避光震荡12h。
(10)重复步骤(9)
(11)依次用2-3ml的DMF、2-3ml的DCM和2-3ml的DMF清洗。
(12)脱去树脂：用甲醇洗净后干燥。加入脱树脂试剂1000-15000μl，震荡3h，滴入10ml冷的乙醚，1ml的TFA贴壁加入，在-20℃放置12h。拿出后离心，去上清液。得到荧光探针。
其中，脱树脂试剂由体积比为90:5:3:2的TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚组成。
(13)用HPLC纯化荧光探针，通过MALDI-TOF-MS测定荧光探针分子量，具体结果如图1所示，荧光探针分子量为2439，确认成功合成荧光探针(Arf1-NR探针)。
实施例2Arf1-NR探针特异性结合情况检测
本实施例通过人工合成的方式，合成了与外泌体结构相似的人工脂质替代外泌体，与合成的Arf1-NR探针进行反应，看Arf1-NR探针的结合效率。
人工脂质使用脂质体挤出仪(Mini-Extruder Set)(Avati Polar Lipids)对齐粒径。具体的包括有三种尺寸的聚碳酸酯膜(Polycarbonate Membrane)；使用脂质体挤出仪以2个叠加方式通过11次来制备。该操作是将热板上的温度保持在50℃附近进行的。制备的合成脂质体在不进行稀释的情况下放入管内保存(4℃)。制备的人工脂质体通过动态光散射法(DLS:ZetasizerNano,OTSUKA ELECTRONICS)计算出粒径分别为100nm、300nm、500nm的人工脂质体。合成的人工脂质稀释成100μM备用。
本实施例采用实施例1制备的Arf1-NR探针，分别对粒径为110nm、320nm、500nm的人工脂质进行检测，检测体系中Arf1-NR探针浓度为2μM。同时设置对比例，为无脂质体(liposome free)。
在5μlArf1-NR探针中加入120μl DMSO制成母液。将母液稀释100倍，吸取50μl放入比色皿中，使用分光光度计(FP6500)测定吸光度。根据Lambert-Beer定律，A＝klc，k(NR)＝30423M-1cm-1，l＝1cm，求出母液的浓度c＝1141μM。
取4只0.2ml离心管，准备好100μM的probe，10×PBS缓冲液，100μM的liposome。
分别按表1中的用量配制完成后，涡旋离心，放入分光光度计的比色皿中上机测试。具体结果如图2所示。
表1Arf1-NR探针鉴定人工脂质体的检测体系用量
Arf1-NR探针对不同粒径的脂质体均能够产生强烈的荧光，但随着脂质粒径的增大，荧光信号越弱，其中对粒径为110nm的人工脂质体荧光信号最强，粒径为110nm的人工脂质体最接近外泌体大小，可知Arf1-NR探针对于外泌体结构的结合效率最高，荧光信号响应值最高，对于其他具有外泌体结构的大粒径脂质体(如实际样品中常与外泌体共存的白蛋白、脂质体、微囊泡细胞碎片)的结合效率相对较低，荧光信号强度较弱，Arf1-NR探针对外泌体鉴定的特异性较好。
外泌体具有脂质双层膜结构，脂质堆积缺陷，即疏水性区域外露的结构。尺寸越小，膜曲率越高，疏水性区域外露的结构就越多。对于尺寸小的外泌体，具有高选择性。随着脂质体的曲率的增加，荧光信号响应值也随之增加。
实施例3Arf1-NR探针的灵敏度检测
本实施例采用实施例1制备的Arf1-NR探针对牛乳中的外泌体进行检测，milkexosome为Bovine Milk Exosome(CSR)，milk exosome的颗粒数为5.05×1013particles/ml。
准备好milk exosome，100μM的probe，10×PBS，超纯水。
按表2中用量分别在0.2ml离心管中配制灵敏度检测体系，涡旋离心，依次放入FP6500的比色皿中，pH＝7.4，25℃，λex＝552nm的条件上机测试,分析434nm波长下的荧光强度。
表2Arf1-NR探针的灵敏度检测体系试剂用量
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| [exosome]109particles/μl | 0 | 4 | 8 | 10 | 15 | 20 |
| exosomeμl | 0 | 4 | 8 | 10 | 15 | 20 |
| probeμl | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 10×PBSμl | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 超纯水μl | 43 | 39 | 35 | 33 | 28 | 23 |
| Totalμl | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
注意：需在混匀后5min内完成上机测试。
检测体系中Arf1-NR探针的浓度为2μM，milk exosome浓度为0～20×109particles/μl，PBS(-)buffer的PH为7.4，温度为25℃，具体结果如图3所示，其中沿箭头方向所示各曲线代表浓度由小到大，依次为1号～6号。可知本探针对于不同细胞来源的外泌体的荧光应答，说明探针对于不同种类的外泌体都有很好的检出灵敏度。
在波长552nm条件下测量，得到荧光光谱(如附图4所示)，通过以下公式计算检出限LOD：
其中σ为0点标准偏差；slope为斜率。检出限为0.73x106个/μl。
实施例4Arf1-NR探针鉴定不同来源的外泌体
本实施例中使用外泌体分别来自于K562、BPH-1、A549、U87MG细胞。起始颗粒数均为1×1012particles/ml。各取1μl用1×PBS稀释成108particles/ml备用。
其中外泌体分别为Lyophilized exosomes from K562 cell culturesupernatant(HNB)、Lyophilized exosomes from BPH-1cell culture supernatant(HNB)、Lyophilized exosomes from U87MG cell culture supernatant(HNB)和Lyophilized exosomes from A549 cell culture supernatant,(HNB)。
准备好不同细胞来源的外泌体，100μM的probe，10×PBS，超纯水。
按表3中用量分别在0.2ml离心管中配制各外泌体的检测体系，涡旋离心，依次放入FP6500的比色皿中，pH＝7.4，25℃，λex＝552nm的条件上机测试。
表3Arf1-NR探针鉴定不同来源外泌体的检测体系用量
注意：需在混匀后5min内完成上机测试。
测试结果如附图5所示，可知本发明提供的Arf1-NR探针对于不同细胞来源的外泌体的荧光应答，说明探针对于不同种类的外泌体都有很好的检出灵敏度。
因此，相比于现有技术中TEM和NTA方法，使用仪器分析大小形态，操作麻烦且仪器价格昂贵；Elisa和Western Blotting方法，通过抗体标记特定的蛋白来检测，操作步骤多，需要花费大量时间，抗体价格贵。本发明提供的鉴定外泌体的荧光探针不需要大型仪器，提取待鉴定样品外泌体后配置检测体系，使用分光光度计即可鉴定。同时本发明人计算得到检出限为0.73x106个/μl，现有技术中ELISA检测极限是106～107particles/μL相比达到了现有技术的检测极限水平，同时由于检测步骤简单，不依赖外泌体膜蛋白质的种类和表现量，可以进行无标记检测所有种类的外泌体。相比ELISA检出的时间至少在3h以上，具备本发明具备检测时间短，检出效率高，灵敏度高的优点。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种鉴定外泌体的荧光探针，其特征在于，包括两亲性α-螺旋肽链，所述两亲性α-螺旋肽链的N端通过疏水性荧光素进行修饰，所述两亲性α-螺旋肽链具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述疏水性荧光素为尼罗红。
3.一种权利要求1或2所述的鉴定外泌体的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括采用固相Fmoc法合成两亲性α-螺旋肽链，在两亲性α-螺旋肽链上耦连疏水性荧光素，脱除树脂，得到所述鉴定外泌体的荧光探针。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述采用固相Fmoc法合成两亲性α-螺旋肽链包括以下步骤：
A、向固相载体中加入脱Fmoc保护剂，脱除Fmoc保护基团，得到载体树脂；
B、向载体树脂中加入氨基酸、COMU和DIEA配制成溶液，依次按照两亲性α-螺旋肽链的氨基酸顺序进行缩合反应；肽链从C端向N端延伸
C、加入封闭剂，得到两亲性α-螺旋肽链。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述脱Fmoc保护剂由哌啶和DMF胺组成，所述哌啶:DMF的体积比为1:9～3:7；
优选地，所述哌啶:DMF的体积比为1:4。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸、COMU和DIEA的摩尔比为1:2:4～1:4:7；
优选地，所述氨基酸、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述封闭剂由无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和二甲基甲酰胺组成，所述无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和DMF胺的体积比为3:4:86～7:8:91；
优选地，所述无水醋酸、2,6-二甲基吡啶和DMF胺的体积比为5:6:89。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述在两亲性α-螺旋肽链上耦连疏水性荧光素包括在两亲性α-螺旋肽链中加入脱Fmoc保护剂，脱除Fmoc保护基团，加入由疏水性荧光素、COMU和DIEA组成的溶液，得到荧光探针树脂复合物；
所述疏水性荧光素、COMU和DIEA的摩尔比为1:2:4～1:4:7；
优选地，所述疏水性荧光素、COMU和DIEA的摩尔比为1:3:6。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述脱除树脂包括在荧光探针树脂复合物中加入脱树脂试剂，脱去载体树脂，得到权利要求1或2所述的鉴定外泌体的荧光探针；
所述脱树脂试剂由TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚组成，所述TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚的体积比为45:3:2:1～92:7:5:4；
优选地，所述TFA、甲基苯基硫醚、1,2-乙二硫醇和苯甲醚的体积比为90:5:3:2。
10.一种权利要求1或2所述的鉴定外泌体的荧光探针在外泌体鉴定中的应用。
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