CN101142484A - 靶物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供识别并检测被检试样中所含多种靶物质的方法，该方法包括使固定在支持物上的靶物质和/或没有固定的靶物质与经过标记处理能够对应该靶物质种类进行识别的结合物质接触，生成该靶物质与该结合物质复合物的步骤以及检测生成前述复合物的结合物质中标记的步骤。

Description

靶物质的检测方法
技术领域
本发明涉及利用靶物质和能够与其进行特异结合的物质之间的反应(例如抗原抗体反应)的靶物质检测方法。具体而言涉及识别并检测被检试样中所含多种靶物质的方法。
背景技术
由于确立了单克隆抗体制备技术，则可以得到能够对特定抗原进行特异反应的抗体，开发·改良利用抗原抗体反应特异性检测抗原的分析系统在研究·临床等所有领域都是不可缺少的。这样的分析系统中，通常对与抗原反应的抗体实施特定标记，反应后以检测该标记替代检测抗原。另外迄今为止为了更进一步提高检测灵敏度，对标记种类和检测方法等也正在进行各种研究，例如有使用抗生物素蛋白·生物素系统、荧光色素、放射性同位素的方法，除此之外，作为进一步提高检测灵敏度的方法，还可以列举免疫-PCR法(例如参照T.Sano etal.，Science，vol.258，120-122(1992))、Double Determinant Immuno-PCR法(例如参照“今井浩三、铃木朝子、日野田裕治，免疫-PCRを用いた微量抗原検出法，蛋白質 核酸 酵素，羊土社，1996年，Vol.41，No.5，p.614-617”。)、使用寡核苷酸和DNA树状聚体(デンドリマ)并使用免疫印迹法检测的方法(例如参照“特表2001-503517号”)等。
发明公开
但是上述检测方法，都是仅以被检试样所含的多种靶物质(抗原)中的一种特定靶物质作为检测对象的方法，迄今为止，还没有能够一次识别并检测两种以上特定靶物质的方法。因此当要一次识别、检测两种以上的靶物质时，必须根据其种类分别用不同检测系统进行检测，存在着检测所需时间和劳力方面的效率问题。从实际情况考虑，最近几年要求从被检试样中检测多种靶物质(生物标记、病因物质、病原体等)的情况非常多。例如在临床检查领域中，有癌症的诊断和抗癌剂的药效评价、脑中风和心肌梗塞的诊断和感染症中病原体确定等情况；在食品和环境领域中有确定由残留农药和细菌引起的食品污染物质和确定二英、多氯联苯(PCB)等环境污染物质的情况。因此迫切需要一种能够通过一次检测处理同时检测这些物质的方法。
由此本发明要解决的课题在于提供可以一次识别、检测被检试样中所含多种靶物质的靶物质检测方法。
为了解决上述课题，本发明者进行锐意研究，结果发现如果制备能够与被检试样所含的多种靶物质中待检测的两种以上靶物质分别进行特异结合的物质(结合物质)，进行标记处理使各结合物质能够对应靶物质种类进行识别，通过靶物质与结合物质的特异结合反应生成两种物质的复合物，在其后的检测阶段就可以同时、明确地分别检测各复合物中的固有标记(所谓同时多项目检测)，由此完成了本发明。
即，本发明如下：
(1)一种识别并检测被检试样中所含的多种靶物质的方法，该方法包括：
(i)使固定在支持物上的靶物质和/或没有固定的靶物质与经过标记处理能够对应于所述靶物质的种类进行识别的结合物质接触，生成所述靶物质与所述结合物质的复合物的步骤(以下称为靶物质-结合物质复合物的生成步骤)；以及
(ii)检测生成前述复合物的结合物质中的标记的步骤(以下称为标记检测步骤)。
在本发明方法中前述结合物质中的标记部分至少可以通过衔接子部分固定在该结合物质上。作为所述衔接子部分，可以列举例如选自蛋白质G、蛋白质A、蛋白质L以及蛋白质A和蛋白质G的融合蛋白质的至少一种。
在本发明方法中作为前述结合物质，可以列举例如与作为标记物质的寡核苷酸链生成复合物(寡核苷酸复合物)的物质。另外，作为前述标记处理，可以列举例如对上述寡核苷酸链实施的下述(i)～(ix)的处理。
(i)设置限制酶切割位点的处理
(ii)设置可以通过PCR扩增的区域的处理
(iii)使之使之含有放射性同位素的处理
(iv)使之与荧光色素相结合的处理
(v)使之与酶相结合的处理
(vi)设置光照射切割位点的处理
(vii)设置活性氧切割位点的处理
(viii)使之与经标记的树状聚体相结合的处理
(ix)在碱基种类中设置至少一种不同碱基的处理。
作为检测前述标记的步骤，可以列举例如通过电泳检测由PCR扩增所得的产物的步骤。
在本发明方法中作为前述结合物质，可以列举例如与作为标记物质的寡肽链生成复合物(寡肽复合物)的物质。作为前述标记处理，可以列举例如对上述寡肽链，实施的下述(i)～(vii)的处理。
(i)设置蛋白质分解酶切割位点的处理
(ii)使之使之含有放射性同位素的处理
(iii)使之与荧光色素相结合的处理
(iv)使之与酶相结合的处理
(v)设置光照射切割位点的处理
(vi)设置活性氧切割位点的处理
(vii)使之与经标记的树状聚体相结合的处理。
在本发明方法中作为前述靶物质，可以列举例如抗原；作为上述结合物质，可以列举例如抗体。
(2)用于识别、检测靶物质的试剂盒，其含有经过标记处理，可以对应于靶物质的种类对其进行识别的多种结合物质。
附图的简单说明
图1是表示利用限制酶反应识别、检测抗原的一个实施例的示意流程图。
图2是表示利用免疫-PCR法识别、检测抗原的一个实施例的示意流程图。
图3A是表示利用自由基识别、检测抗原的一个实施例的略图。
图3B是表示利用寡肽核酸链复合抗体识别、检测抗原的一个实施例的略图。
图4是表示在实施例1中利用复合抗体检测时，琼脂糖凝胶电泳后的电泳条带的照片。
图5是表示在实施例1中使用复合抗体进行识别、检测时琼脂糖凝胶电泳后的电泳带的照片。
图6是表示实施例2中的利用Cosmo-i SV1210测定结果的曲线图。曲线图中峰上的数字是表示峰面积(寡核苷酸浓度)的值。
图7是表示利用通过衔接子部分寡肽核酸链复合抗体识别、检测抗原的一个实施例的略图。
图8是表示在实施例3中对通过DNA序列分析仪ABI-3100进行GeneScan分析结果的曲线。
图9是表示在参考例1中用ELISA法检测结果的图示。(a)是表示各孔显色情况的照片，(b)是表示用ELISA法测定的结果的曲线。
图10是表示在参考例1中用本发明检测方法的检测结果(通过(DNA序列分析仪ABI-3100进行GeneScan分析的结果)的曲线。
图11与图10一样是表示用本发明检测方法的检测结果(通过(DNA序列分析仪ABI-3100进行GeneScan分析的结果)的曲线。
图12是表示在参考例2中用本发明检测方法的检测结果(通过(DNA序列分析仪ABI-3100进行GeneScan分析的结果)的曲线。
图13是表示图12所示检测结果的图以及蛋白量(抗原量)和检测值(信号值)相互关系的曲线。
符号说明
1：抗原；2：孔板；3：经标记的抗体；4：经标记的抗体；5：核苷酸链；6：核苷酸链；7：限制酶位点；8：限制酶位点；9：抗原-抗体复合物；10：抗原-抗体复合物；11：核苷酸片段；12：核苷酸片段；13：经标记的抗体；14：经标记的抗体；15：核苷酸链；16：核苷酸链；17：抗原-抗体复合物；18：抗原-抗体复合物；19：F引物；20：R引物；21：核苷酸片段(PCR产物)；22：核苷酸片段(PCR产物)。
实施本发明的最佳方案
以下对本发明的检测方法进行详细说明，但是本发明范围不局限于这些说明，对于除以下示例以外的情况，还可以在不损害本发明宗旨的范围内通过适当的变更来实施。
在本说明书中引用的全部现有技术以及公开公报、专利公报、以及其它专利文献，均作为参考文献，引入本说明书中。
1.发明概述
本发明的检测方法，如前所述是包括靶物质-结合物质复合物的生成步骤和标记检测步骤的方法，首先通过以下4种实施方案举例说明本发明方法的整体概要，接下来分各步骤进行详细说明。以下(1)～(4)的示例，均采用作为靶物质和结合物质的示例的抗原和抗体进行说明，而对于靶物质和结合物质是抗原和抗体以外的情况，本说明也同样适用。
(1)第1实施方案如图1的示意流程图所示，首先在构成支持物的孔板2上固定作为靶物质的多种(图1中为4种)抗原1(图1(a))，作为相对于这些抗原1的结合物质，添加寡核苷酸复合抗体(经标记的抗体)3、4(图1(b))。抗体3是与寡核苷酸链5生成复合物的物质，抗体4是与寡核苷酸链6生成复合物的物质。抗体3、4，分别在其寡核苷酸链5、6中具有共同的限制酶位点7、8(例如EcoRI)等。分别设计(或选择)寡核苷酸链5、6(核苷酸序列)的长度，使它们的自限制酶位点7、8起的末端部分长度互不相同。图1中抗体3的寡核苷酸链长度较短。
接下来通过抗原抗体反应使抗体3、4分别与特定抗原结合，生成抗原-抗体复合物9、10(图1(c))。没有生成该复合物的抗原通过清洗除去(图1(d))。
然后，添加切割限制酶位点7、8的限制酶进行反应，从生成抗原-抗体复合物9、10的抗体3、4中的寡核苷酸链5、6分别得到长度不同的核苷酸片段11、12(图1(e))。通过使用琼脂糖的电泳法识别、检测所得片段的长度(图1(f))。
图1(f)中检测出对应于核苷酸片段11、12的长度不同的2种带。这样就可以确认含4种抗原的被检试样中含有作为检测对象的2种抗原。
(2)第2实施方案如图2的示意流程图所示，首先在构成支持物的孔板2上，固定作为靶物质的多种(图2中为4种)抗原1(图2(a))，作为相对于这些抗原1的结合物质，添加寡核苷酸复合抗体(经标记的抗体)13、14(图2(b))。抗体13是与寡核苷酸链15生成复合物的物质，抗体14是与寡核苷酸链16生成复合物的物质。抗体13、14在寡核苷酸链15、16中均具有能够结合共同PCR引物(F引物19、R引物20)的序列。分别设计(或选择)寡核苷酸链15、16的长度(核苷酸序列)，使得通过PCR(免疫-PCR)扩增的序列(PCR产物)的长度不同。具体如图2(e)(f)所示，αβ间的序列自抗体13的寡核苷酸链15扩增，γδ间的序列自抗体14的寡核苷酸链16扩增，αβ间的序列较短。
接下来通过抗原抗体反应使抗体13、14分别与特定抗原结合，生成抗原-抗体复合物17、18(图2(c))。没有生成该复合物的抗原通过清洗除去(图2(d))。
然后，使用PCR引物(F引物-19、R引物-20)进行PCR(免疫-PCR)(图2(e))，分别从生成抗原-抗体复合物17、18的抗体13、14的寡核苷酸15、16得到作为PCR产物的、长度不同的核苷酸片段21(扩增αβ间的片段)和22(扩增γδ间的片段)(图2(f))。通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法识别、检测所得片段的长度(图2(g))。
图2(g)中检测出对应于核苷酸片段21、22的长度不同的2种带。这样就可以确认含4种抗原的被检试样中含有作为检测对象的2种抗原。
(3)第3实施方案，如图3A的示意图(上)所示，针对特定抗原，制备分别识别该抗原中不同表位的抗体(抗体组)。具体而言，是将一种抗体预先与可通过HRP、氧化氮合酶和光致敏物等产生过氧化物和其它自由基的酶或化学物质复合化。另一种抗体预先借助交联剂与寡核苷酸链等复合化，所述交联剂是能用过氧化物和其它自由基断开的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺-4-叠氮苯甲酸盐(N-hydroxysuccinimide-4-Azidobenzoate(HSAB))。其中，设计另一种抗体中的寡核苷酸链等，使其对应于该抗体识别的抗原的种类具有不同的长度。
首先向固定和/或没有固定在支持物(孔板等)上的多种抗原(靶物质)添加预先制备的抗体(结合物质)。
接下来通过抗原抗体反应使抗体分别与特定抗原结合，生成抗原抗体复合物。没有生成该复合物的抗原或抗体，根据检测目的，通过清洗除去，或者保持未清洗状态。
接下来添加生成过氧化物和其它自由基的试剂。得到含有对应于各抗原的长度不同的寡核苷酸链片段。通过使用琼脂糖凝胶的电泳法和微芯片等识别、检测所得片段的长度。
另外，如果利用该第3实施方案，则如图3A的示意图(下)所示，还可以确认复合物的生成反应。作为该生成反应，可以列举例如细胞膜受体的二倍体化以及细胞内蛋白结合等。利用这些方法可以提供无论是现在还是将来，对诊断癌症及阐明发病机理而言都是很必要的技术。
第3实施方案，其检测环境，无论液相还是固相均可。
(4)第4实施方案，如图3B的示意图所示，首先向固定和/或没有固定在支持物(孔板等)上的多种抗原(靶物质)添加作为结合物质的抗体(经标记的抗体)。该抗体是连接寡肽链部分和寡核苷酸链部分形成杂合链的复合化抗体。设计寡肽链部分使其具有可通过特定蛋白质分解酶切割的部位，并且设计寡核苷酸链部分使其对应于上述抗体识别的抗原种类具有不同的长度。接下来通过抗原抗体反应，使经标记的抗体分别与特定抗原结合，生成抗原抗体复合物。没有生成复合物的抗原或抗体，根据检测目的，通过清洗除去，或者保持未清洗状态。
接下来添加与上述特定蛋白质分解酶复合化的、特异识别所生成的抗原抗体复合物的抗体或补体(C1等)。该抗体或补体与抗原抗体复合物结合，上述蛋白质分解酶切割相邻抗原抗体复合物中的寡肽链部分。结果可以得到含有对应各抗原种类的、长度不同的寡核苷酸链片段。通过使用琼脂糖凝胶的电泳法和测微晶片等识别、检测所得片段的长度。
如果利用该第4实施方案，则与以往的夹心法不同，可以通过识别对应目的抗原的1种表位的抗体检测抗原。
实施方案4，其检测环境，无论液相还是固相均可。
2.靶物质-结合物质复合物的生成步骤
本发明的检测方法是包括使固定在支持物上的多种靶物质和/或没有固定在支持物上的多种靶物质与经过标记处理能够对应该靶物质种类进行识别的结合物质接触，生成靶物质和结合物质复合物的步骤的方法。上述所谓的“结合物质”表示可以与特定靶物质特异结合的物质，可以列举相对于抗原(靶物质)的抗体等。
(1)支持物
作为在本发明中可以使用的支持物，只要是能够固定抗原等靶物质，并且能够使抗体等结合物质(溶液)与该靶物质接触的支持物即可，不受特别限定。作为这样的支持物，通常使用不溶性材质和形状等的支持物。例如优选可用于通过抗原抗体反应进行分析的系统中所用的支持物，具体可以列举塑料多孔板、塑料珠、胶乳珠、磁珠、塑料管、尼龙膜、硝基纤维素膜等。
(2)靶物质
在本发明方法中作为检测对象的靶物质，是被检试样(特别是相同的被检试样)中所含的多种靶物质。该靶物质的种类不受限定。作为这样的靶物质，可以列举例如各种蛋白质(也包括抗体蛋白质)、肽(寡肽、多肽等)、多糖类、糖脂、各种核酸(DNA和RNA)以及其它低分子化学合成物和活体成分等，其中，优选可以构成抗原的物质(即可以获得或产生抗体蛋白质的物质)。作为其它实施方案，还可以以单一种类靶物质为检测对象，使用多种经过标记处理的结合物质，确定靶物质对于何种结合物质具有特异性(也就是确定靶物质的种类)的分析系统。
作为上述被检试样，可以列举例如活体成分(组织和血液)、肉食和蔬菜等食品类、土壤和河水、燃烧废弃物等，无特别限定。
上述被检试样中所含靶物质的种类，只要是多种(至少2种或以上)，则不加以限定。如果按照本发明方法，即使是10种或以上的特定靶物质也能够被明确识别、检测，另外，可以是50种或以上，也可以是100种或以上。
对于上述被检试样中的靶物质浓度，没有限定，如果按照本发明方法，即使每1μL被检试样中靶物质浓度在ng级以下，也可以明确识别、检测特定的靶物质。另外，既可以是pg级以下，还可以是fg级以下。特别是对于经过识别处理的结合物质，当使用下述(i)～(iv)的结合物质(后面将详细叙述)等时，即使是浓度更低的靶物质，也可以以高灵敏度进行识别、检测，其中优选使用(ii)或(iii)的结合物质。
(i)与具有可以用PCR扩增的区域的寡核苷酸链生成复合物的结合物质
(ii)与结合荧光色素的寡核苷酸链或寡肽链生成复合物的结合物质
(iii)与含有放射性同位素或结合了放射性物质的寡核苷酸链或寡肽链生成复合物的结合物质；
(iv)与结合了标记处理树状聚体的寡核苷酸链或寡肽链生成复合物的结合物质。
在本发明的方法中既可以使靶物质固定在支持物上之后与经过标记处理的结合物质(溶液)进行接触，由此使靶物质和结合物质进行特异结合反应，也可以不将靶物质固定在支持物等上进行该反应，或者是配合使用这两种方法，无特别限定。
作为把靶物质固定在支持物上的方法，例如直接把靶物质固定在支持物表面的方法、通过预先把有待与靶物质进行特异结合的抗体固定在支持物表面，然后再使靶物质与该固定的抗体结合，进行间接固定的方法，无特别限定。后者的间接固定方法，可以从作为靶物质的多种物质中预先选择能够作为检测对象的物质，所以可以提高检测灵敏度和检测精度。在后一固定方法中，当其后所用的经过标记处理的结合物质也是抗体时，作为直接固定在支持物上的抗体，通常使用对靶物质(抗原)的识别位点不同于其后将使用的抗体的物质。
将靶物质固定在支持物上时，优选在与经过标记处理的结合物质(溶液)接触之前，按照常规方法，进行封闭。上述直接固定时，优选在该固定后进行封闭；上述间接固定时，优选在对支持物进行抗体固定之后且在结合靶物质之前进行封闭。
(3)结合物质
本发明方法中，使用多种经过标记处理，能对应靶物质种类进行识别的结合物质。对于每种对应特定靶物质的特异结合物质实施1种标记处理，然后在检测阶段确定标记的数量及其种类，通过这种方法确定检测的靶物质数量及其种类。但是并不局限于此，例如还可以对多种结合物质进行相同标记处理，综括检测多种靶物质。
作为本发明方法中可以使用的结合物质，除了可以对特定抗原物质进行特异结合的抗体(抗体蛋白质)以外，可以列举例如能与特定靶基因或核酸分子杂交的单链核酸(DNA、RNA(mRNA等)、合成核酸)、能对特定靶蛋白质进行特异结合的各种蛋白质(抗体除外)、能对特定糖脂进行特异结合的蛋白质(凝血素等)以及能对特定抗体进行特异结合的抗原物质等，其中优选抗体。
当结合物质是抗体时，一般优选使用对特定单一种类抗原(靶物质)具有特异性的单克隆抗体，但是并不受限定。例如也可以使用对于多种特定抗原具有共同特异性的单克隆抗体等。通过使用这种抗体的分析系统，可以通过单一抗体综括检测多种抗原。
在本发明的方法中所谓“使固定在支持物上的靶物质和经过标记处理的结合物质接触”一般表示使该靶物质和该经过标记处理的物质直接接触结合。但是本发明并不限定于此，也包括更广义的使固定在支持物上的靶物质首先与对该靶物质具有特异性的第一结合物质(第一抗体等)结合，接下来与作为对该第一结合物质具有特异性的结合物质的、前述经过标记处理的结合物质接触，结果使前述靶物质和经过标记处理的结合物质间接结合的情况。在该间接结合中对上述第一结合物质还可以结合第二结合物质、第三结合物质、...第n结合物质，这时作为经过标记处理的物质可以使用能与第n结合物质进行特异结合的物质。上述n为1～11，优选1或2。
用于本发明方法的结合物质，优选与作为标记物质的各种核酸链以及肽链等生成复合物的结合物质。当结合物质为抗体时，把该复合物称为“复合抗体”。作为上述核酸链以及肽链等，可以列举例如寡核苷酸链(DAN链、RNA链)、寡肽链以及寡肽核酸链等，这些核酸链或肽链既可以是天然物质，也可以是合成物质。其中优选与寡核苷酸链生成复合物的结合物质(寡核苷酸复合物)，因为它能够进一步获得可以进行高可用性·实用性识别等的效果，例如通过碱基序列和寡核苷酸链长进行的识别、通过结合荧光色素和含有放射性同位素等进行的识别，或者通过PCR扩增片段长度进行的识别。更优选与合成寡核苷酸链生成复合物的结合物质。
对于上述各种核酸链和肽链等的长度，没有特别限定。
例如当使用寡核苷酸链(DNA链、RNA链)时，优选其长度为100～5,000mer，更优选为100～1,000mer，进一步优选为100～500mer。当寡核苷酸链的长度满足上述范围时，容易与结合物质复合化，并且使复合化后的状态稳定，同时还可以获得提高检测灵敏度和缩短检测时间等效果。
当使用寡肽链时，例如优选为10～1,000个氨基酸残基，更优选为10～500个氨基酸残基、进一步优选为10～100个氨基酸残基。当寡肽链的长度满足上述范围时，容易与结合物质复合化，并且使复合化后的状态稳定，同时还能够获得容易对寡肽链进行标记处理等效果。
当使用寡肽核酸链时，例如优选为与10～100个氨基酸残基寡肽链连接的100～5,000mer核酸链(DNA链、RNA链)，更优选核酸链部分为100～1,000mer、进一步优选核酸链部分为100～500mer。当寡肽核酸链的长度满足上述范围时，容易与结合物质复合化，并且使复合化后的状态稳定，同时还能够获得提高检测灵敏度和缩短检测时间等效果。
上述寡核苷酸复合物，例如可以通过使作为标记部分的核苷酸链(DNA链、RNA链)一端与结合物质共价结合的方法等而获得。同样上述寡肽复合物和寡肽核酸复合物，例如可以通过使作为标记部分的寡肽链或寡肽核酸链一端与结合物质进行共价结合的方法等而获得。在这些复合物的制备中寡核苷酸链、寡肽链、以及寡肽核酸链，可以通过例如化学或酶处理(优选化学处理)导入1个或2个以上巯基和氨基(取代基)或生物素(或抗生物素蛋白)等。通过这种方法，容易与结合物质复合化，并且使复合化后的状态更加稳定，提高所得复合物收率，同时，还可以进一步得到提高检测灵敏度和检测效果等效果。
作为制备上述寡核苷酸复合物的方法，可以列举例如(i)使用2价的交联剂把在5，末端添加了氨基和巯基的寡核苷酸链固定在结合物质上的方法(E.Hendrickson et al.，Nucl.Acids Res.，Vol 23(3)，p522-529(1995))以及(ii)预先对结合物质和寡核苷酸链都进行生物素化，使该结合物质和寡核苷酸链混合，同时添加抗生物素蛋白，通过抗生物素蛋白，把寡核苷酸链固定在结合物质上的方法等。
作为上述寡肽复合物和寡肽核酸复合物的制备方法，可以列举例如用2价交联剂把(i)具有氨基和巯基的寡肽链或寡肽核酸链(以下寡肽链等)、(ii)附加了氨基和巯基的寡肽链等固定在结合物质上的方法以及(iii)预先对结合物质和寡肽链等都进行生物素化，对该结合物质和寡肽链等进行混合，同时添加抗生物素蛋白，通过抗生物素蛋白把寡肽链等固定在结合物质上的方法等。
另外，在本发明中，至少通过衔接子部分，使构成标记部分的寡核苷酸链、寡肽链或寡肽核酸与结合物质复合化，可以得到上述各种复合物(参照图7(1))。通过衔接子部分介导的固定，可以更进一步提高该复合物的结构稳定性、更加提高所得复合物的收率，同时获得提高检测灵敏度和检测效果等效果。作为上述衔接子部分，可以列举例如蛋白质G、蛋白质A、蛋白质L以及蛋白质A和蛋白质G的融合蛋白质等各种蛋白质，之所以优选这些衔接子部分是因为特别当结合物质是抗体分子时，它们能够很容易并且稳定地与该抗体结合。
作为含衔接子部分的复合物的制备方法，没有特别限定，优选(i)首先在衔接子部分上结合构成标记部分的寡核苷酸链等，(ii)接下来把衔接子部分固定在结合物质上的方法。
具体是在上述(i)中对衔接子部分进行抗生物素蛋白修饰，使构成标记部分的寡核苷酸链等生物素化，通过将二者混合，使寡肽链等与衔接子部分结合。或者预先对衔接子部分和寡肽链等都实施生物素化，将该衔接子部分与寡肽链等进行混合，同时添加抗生物素蛋白，也可以通过抗生物素蛋白使寡肽链等与衔接子部分结合。当使用前者方法时，衔接子部分的抗生物素蛋白修饰是首先使接头化合物和衔接子部分进行结合反应，然后使抗生物素蛋白与该化合物结合。其中当使用的衔接子部分是蛋白质A、G或L等时，作为接头化合物，例如可以优选使用“磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC))”等。
接下来在上述(ii)中当衔接子部分与结合物质具有结合反应性时，通过使在上述(i)中得到的衔接子部分/标记部分结合体与结合物质混合，可以得到寡核苷酸复合物等各种复合物。另外当衔接子部分和结合物质原本不具有结合反应性时，例如预先对二者实施生物素化，在抗生物素蛋白存在下进行混合等，使用与上述(i)中能够采用的相同方法得到各种复合物。
以下的(3-1)和(3-2)中具体示出关于对寡核苷酸复合物等和寡肽复合物进行标记处理的例子。这些示例均以作为靶物质和结合物质的一个例子的抗原和抗体进行说明，当靶物质和结合物质是抗原和抗体以外的情况时，也可以应用相同的说明。
(3-1)在寡核苷酸复合抗体中的标记处理
使用寡核苷酸复合抗体时，所述的标记处理，既可以对寡核苷酸链本身进行(例如下述(A1)～(A3)，(A6)，(A7)，(A9)的处理等)，也可以借助寡核苷酸链进行(例如下述(A4)，(A5)，(A8)的处理等)，无特别限定。
作为对寡核苷酸链进行的上述标记处理，可优选列举选自下述(A1)～(A9)的至少一种处理。其中，从容易进行标记处理、检测灵敏度高的观点考虑，更优选(A1)，(A2)和(A9)的处理。
(A1)设置限制酶切割位点的处理(参照图1)
(A2)设置可以通过PCR扩增的区域的处理(参照图2)
(A3)使之使之含有放射性同位素的处理
(A4)使之与荧光色素相结合的处理
(A5)使之与酶相结合的处理
(A6)设置光照射切割位点的处理
(A7)设置活性氧切割位点的处理(参照图3A)
(A8)使之与经标记处理的树状聚体相结合的处理
(A9)在碱基种类中设置至少一种不同碱基的处理。
当使用寡肽核酸复合抗体时，对其核酸(寡核苷酸)部分可以实施与上述寡核苷酸复合抗体相同的标记处理。对于各标记处理的实际情况，也同样可以应用后述的具体说明。
在上述(A1)处理时，例如如图1所示，可以通过使该切割后得到的寡核苷酸片段的长度不同于其它抗体标记，或者是从其它抗体标记中得不到上述切割之后的寡核苷酸片段，或者是组合这些方法等进行识别、检测。
使切割后的片段长度不同，具体做法是通过预先合成使与抗体结合的寡核苷酸链长度相对于不同抗体虽然实质相同，但是限制酶切割位点的位置互不相同，或者是通过预先合成使与抗体结合的寡核苷酸链长度本身相对于不同抗体互不相同等方法实施。对于切割后片段的长度差别不加以特别限定，但是从能够以良好灵敏度进行识别、检测的观点考虑，优选10mer或以上，更优选50mer或以上，进一步优选100mer或以上。
在上述(A2)处理时，例如如图2所示，可以通过使作为该PCR产物得到的片段长度不同于其它抗体标记，或者是从其它抗体标记得不到该PCR产物，或者是组合这些方法等进行识别、检测。
使作为PCR产物得到的片段长度不同，具体做法是通过使得即便用相同引物时，引物的结合位置也不同，在各抗体之间可以用PCR扩增的区域宽度(长度)不同的方法等实施。对于PCR产物片段的长度差别不加以限定，但是从能够以良好灵敏度进行识别、检测的观点考虑，优选5mer或以上，更优选10mer或以上，进一步优选50mer或以上。
在上述(A3)处理时，例如可以通过使放射线种类不同于其它抗体标记，或者在其它抗体标记中不放射射线，或者是组合这些方法进行识别、检测。
作为使其使之含有放射性同位素的处理方法，可以列举例如在合成寡核苷酸链时使用含放射性同位素的核酸，或者是用含有放射性同位素的修饰基团(32PO4、35SO4)和H125I等直接标记寡核苷酸链的方法等。
具体而言，作为放射性同位素，可以使用32P、3H、14C、35S、59F、125I等，其中，从提高识别、检测灵敏度的观点考虑，优选将放出β射线的放射性同位素(例如3H和14C等)和放出γ射线的放射性同位素(例如125I等)组合使用。
在上述(A4)处理时，例如可以通过使该荧光色素的最大吸收波长不同于其它抗体标记，或者在其它抗体标记中不结合该荧光色素，或者组合使用这些方法进行识别、检测。
作为使之与荧光色素相结合的处理方法，可以列举例如用荧光色素直接标记寡核苷酸链官能团的方法等。
具体而言，作为荧光色素，可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(RITC)、虫荧光素酶、GFP(还包括荧光强度不同的EGFP)及其衍生物(荧光波长和激发波长不同的YFP和BFP等)等，其中，从提高识别、检测灵敏度的观点考虑，优选使用FITC和RITC的组合、GFP和其衍生物的组合。
在上述(A5)处理时，例如可以通过使用与显色用基质结合生成荧光色素的酶，变化该酶的种类，使荧光色素的最大吸收波长不同于其它抗体标记，或者在其它抗体标记中不结合该酶，或者组合这些方法等进行识别、检测。
作为使之与酶相结合的处理方法，可以列举例如通过蛋白质交联剂使水杨异羟肟酸(サリチルヒドロキサミン)化酶与寡核苷酸链结合的方法等。
具体作为上述酶可以使用碱性磷酸酶、各种过氧化物酶(辣根(西洋青芥辣)过氧化物酶)、β-半乳糖苷酶、黄嘌呤氧化酶等。其中，从提高识别、检测灵敏度的观点考虑，在显色法中优选与致敏物DAB和TMB组合使用。
在上述(A6)处理时，例如可以通过使可切割的光波长不同于其它抗体标记；或预先实施不同的识别处理，使可切割的光波长即使与其它抗体标记相同，但切割后的片段长度也不同；或使其它抗体标记在光照射下不被切割；或者是组合这些方法进行识别、检测。
具体是例如在寡核苷酸链上添加可以通过规定波长光照射而断开的交联剂(2价交联剂等)，然后通过这一接头使寡核苷酸链和抗体结合。作为通过光照射可以断开的交联剂，例如可以使用肟酯衍生物、氨甲酰肟衍生物等。使可以切割的光波长不同于其它抗体标记的情况时，通过使用交联剂等方法实施，该交联剂的可切割光波长不同于其它抗体的交联剂的可切割光波长。这时从获得良好检测灵敏度的观点考虑，作为交联剂，可以将肟酯衍生物和氨甲酰肟衍生物组合使用。另外当使切割后的片段长度不同于其它抗体标记的情况时，可以利用预先使经交联剂结合的寡核苷酸链长度不同的方法等实施。对于切割后片段的长度差别没有特别限定，从能够以良好灵敏度进行检测的观点考虑，优选10mer或以上，更优选50mer或以上，进一步优选100mer或以上。除此之外，作为对切割后的片段实施不同于其它抗体标记的标记处理时，还可以对经交联剂结合的寡核苷酸链实施上述(A3)～(A5)和下述(A8)的处理。
在上述(A7)处理时，例如可以通过实施使切割后的片段长度不同于其它抗体标记的标记进行处理，或使其它抗体标记不能被活性氧切割，或者是组合这些方法进行识别、检测。
具体是在寡核苷酸链上添加通过与活性氧接触可以断开(切割)的交联剂(2价交联剂等)，然后通过该交联剂使寡核苷酸链与抗体结合。作为通过与活性氧接触可以断开的交联剂，例如可以使用N-羟基琥珀酰亚胺-4-叠氮苯甲酸酯等叠氮系交联剂和S-亚硝胺衍生物或N-亚硝胺衍生物等。
当使切割后的片段长度不同于其它抗体标记时，可以通过使经交联剂结合的寡核苷酸链的长度不同于其它抗体等方法实施。对于切割后的片段长度差别没有特别限定，从能够以良好灵敏度进行识别、检测的观点考虑，优选10mer或以上，更优选50mer或以上，进一步优选100mer或以上。除此之外，当对切割的片段实施不同于其它抗体标记的标记进行处理时，还可以对经交联剂结合的寡核苷酸链，实施上述(A3)～(A5)和下述(A8)的处理。
在上述(A8)处理时，例如可以使用实施了下述1种或2种以上标记处理的寡核苷酸树枝状物(DNA树状聚体、RNA树状聚体)等各种树状聚体，所述的标记处理指：使之含有放射性同位素、使之与放射性物质相结合、使之与荧光色素或结合酶等相结合的标记处理。并且使其种类与程度不同于其它抗体标记，或在其它抗体标记中不结合经上述标记处理树状聚体，或者是组合这些方法进行识别、检测。
所谓树状聚体，是含有构成该树状聚体的物质(例如寡核苷酸和DNA等)的树枝状多分枝高分子，规则的分枝骨架结构从中心向外进行三维扩展的物质。树状聚体，在其分枝与分枝之间构成固定化学键的重复结构。通常，该重复次数以“世代”体现，世代越多其体积越大，构成接近球形的结构。
在本发明中与上述标记处理树状聚体一样，也可以使用标记处理树突状物(デンドロン)。所谓树突状物，与树状聚体一样也是树枝状多分枝高分子，但其从中心只向一个方向扩展(延伸)。
作为树状聚体的合成方法，无特别限定。可以列举从中心向外侧合成的分散法、从末端官能团向内侧合成的聚集法以及这些方法的组合等，在树突状物中，也可以列举同样的方法。树状聚体和树突状物的合成路径是相当有规律的，所以不论其(树状聚体和树突状物)内部和外部，都可以把前述标记物质等三维地导入到所希望的位置。
作为使之与经标记处理的树状聚体相结合的处理方法，可以列举例如在树状聚体的末端(最外层)预先设置能与结合在抗体上的寡核苷酸链进行互补结合的序列区域(臂)，在规定条件下进行杂交结合的方法，以及在结合在抗体上的寡核苷酸链的未结合末端预先添加氨基和巯基，利用2价交联剂与树状聚体末端结合的方法。关于结合标记处理树突状物的处理方法也是相同的。
在上述(A9)处理时，首先即使固定在各复合抗体上的寡核苷酸链的长度相同(上述(A1)和(A2)的处理不能识别出其差别的长度)，也要预先设置一处以上不同种类的碱基。并且可以通过使用DNA序列分析仪(例如Applied Biosystems公司制、产品名称：ABI-3100)的分析和使用ABI PRISM 7000序列检测系统(Applied Biosystems公司制)等的实时PCR分析等能够识别1种不同碱基的分析手段对含有该不同种类碱基的PCR扩增片段进行识别、检测。在各核苷酸链中为了在PCR扩增前使构成模板的规定片段游离，还可以预先设置限制酶位点(优选通过同一限制酶进行切割的部位)。该处理时标记的变异可以达到用“[碱基的种类(A，T，G，C等)]×[碱基的长度(碱基数)]”进行计算的组合，可以说该处理是特别适合于同时进行多项目检测的处理。上述变异，通过使用已知的各种变异导入法或在核酸合成阶段设定碱基序列时设置差别等方法很容易设计。
(3-2)寡肽复合抗体中的标记处理
当抗体为寡肽复合抗体时，其标记处理既可以对肽链本身进行(例如下述(B1)、(B2)，(B5)，(B6)的处理等)，也可以由肽链介导进行(例如下述(B3)，(B4)，(B7)的处理等)，无特别限定。
作为对肽链进行的上述标记处理，具体可以优选列举选自下述(B1)～(B7)的至少一种处理。其中，从容易进行标记处理，并且检测灵敏度高的观点考虑，优选(B1)处理。
(B1)设置蛋白质分解酶切割位点的处理
(B2)使之含有放射性同位素的处理
(B3)使之与荧光色素相结合的处理
(B4)使之与酶相结合的处理
(B5)设置光照射切割位点的处理
(B6)设置活性氧切割位点的处理(参照图3A)
(B7)使之与经标记处理的树状聚体相结合的处理。
当使用寡肽核酸复合抗体时，对其寡肽部分可以实施与上述寡肽复合抗体相同的标记处理。对于各标记处理的实际情况，也同样可以应用后述的具体说明。
在上述(B1)处理时，例如是能够通过使该切割后得到的寡肽片段的长度不同于其它抗体标记，或从其它抗体标记得不到该切割之后的寡肽片段，或者是组合这些方法进行识别、检测。
具体要使切割后的片段长度不同，可以通过预先合成使与抗体结合的寡肽链的长度相对于不同抗体虽然实质上相同，但是限制酶切割位点的位置互不相同，或者是通过预先合成使与抗体结合的寡核苷酸链长度本身相对于不同抗体互不相同等方法实施。对于切割后片段的长度差别不加以限定，但是从能够以良好灵敏度进行识别、检测的观点考虑，优选5个氨基酸残基或以上，更优选10个氨基酸残基或以上，进一步优选20个氨基酸残基或以上。
在上述(B2)处理时，例如可以进行与前述(A3)同的操作来识别、检测。
作为使其使之含有放射性同位素的处理方法，可以列举例如在合成寡肽链时使用含有放射性同位素的核酸，或者是用含有放射性同位素的修饰基(32PO4、35SO4)和H125I等直接标记寡肽链的方法等。
作为放射性同位素的具体示例及它们的优选组合也优选与前述(A3)的情况相同。
在上述(B3)处理时，例如可以进行与前述(A4)相同的操作来识别、检测。
作为使之与荧光色素相结合的处理方法，可以列举例如用荧光色素直接标记寡肽链官能团的方法等。
关于荧光色素的具体示例及它们的优选组合也优选与前述(A4)的情况相同。
在上述(B4)处理时，例如可以进行与前述(A5)相同的操作来识别、检测。
作为使之与酶相结合的处理方法，可以列举例如通过蛋白质交联剂使水杨异羟肟酸化酶与寡肽链结合的方法等。
关于上述酶的具体示例以及致敏物的优选组合也优选与前述(A5)的情况相同。
在上述(B5)处理时，例如可以进行与前述(A6)相同的操作来识别、检测。
具体是在寡肽链上添加可以通过规定波长光照射断开(切割)的交联剂(2价交联剂等)，然后通过该交联剂使寡肽链和抗体结合。作为通过光照射可以断开的交联剂，例如可以使用与前述(A6)相同的交联剂。使可切割的光波长不同于其它抗体标记时的情况，还可以含有交联剂组合，实施与前述(A6)时相同的操作。另外，当使切割后的片段长度不同于其它抗体标记时，也可以实施与前述(A6)相同的操作。对于切割后片段的长度差别没有特别限定，可以进行适当设定。除此之外，作为预先对切割后的片段实施不同于其它抗体标记的标记处理时，还可以预先对经交联剂结合的寡肽链，实施上述(B2)～(B4)和下述(B7)的处理。
在上述(B6)处理时，例如可以进行与前述(A7)时相同的操作来识别、检测。
具体是在寡肽链上添加可以通过与活性氧接触而断开(切割)的交联剂(2价交联剂等)，然后通过该交联剂介导使寡肽链和抗体结合。作为可以通过与活性氧接触而断开的交联剂，例如可以使用与前述(A7)相同的交联剂。使切割后的片段长度不同于其它抗体标记时，也可以实施与前述(A7)时相同的操作。对于切割后片段的长度差别没有特别限定，可以进行适当设定。除此之外，作为对切割后的片段实施不同于其它抗体标记的标记处理时，还可以预先对经交联剂介导结合的寡肽链，实施上述(B2)～(B4)和下述(B7)的处理。
在上述(B7)处理时，例如可以进行与前述(A8)时相同的操作来识别、检测。另外与标记处理树状聚体一样也可以使用标记处理树突状物这一点也是相同的。
作为使之与经标记处理的树状聚体相结合的处理方法，可以列举例如预先在树状聚体的末端(最外层)设置能与结合在抗体上的寡肽链进行互补结合的序列区域(臂)，在规定条件下进行杂交结合的方法和预先在结合在抗体上的寡肽链的未结合末端添加氨基和巯基，利用2价交联剂与树状聚体末端结合的方法等。关于结合标记处理树突状物的处理方法也是相同的。
(4)抗原抗体反应
如前所述，使经过标记处理的结合物质(溶液)与固定(涂布)在支持物上的靶物质接触时，通常优选预先用已知的封闭液实施封闭处理，再用PBS等已知的清洗液充分清洗。然后适量添加含有多种经过标记处理的结合物质的溶液，在室温下一边搅拌30～60分钟一边使靶物质和结合物质进行结合反应，生成两种物质的复合物，然后再次充分清洗。
对于使经过标记处理的结合物质(溶液)与没有固定在支持物上的靶物质接触时，通常优选对含有靶物质的被检试样进行适当预处理，除去或减少靶物质以外的杂质。
3.标记检测步骤
本发明的检测方法包括检测生成靶物质-结合物质复合物的结合物质中的标记的步骤。作为检测方法，具体根据前述结合物质的标记处理种类(前述(A1)～(A9)、(B1)～(B7)的标记处理)不同而异，所以按每种处理进行以下说明。
(1)设置限制酶切割位点的处理((A1)处理)
使用寡核苷酸复合物(DNA复合物和RNA复合物)时，按照常规方法添加规定的限制酶溶液，切割寡核苷酸链。得到的片段长度，可以通过使用琼脂糖凝胶的电泳法进行识别、检测。另外，如图7(3)～(5)所示，使用荧光标记的规定引物，通过PCR对上述限制酶处理后的游离片段进行扩增，对于所得扩增片段，通过DNA序列分析仪(例如Applied Biosystems公司制、产品名称：ABI-3100)的GeneScan软件分析，确定峰位置及其高度，可以识别并检测限制酶处理后的游离片段长度。
在上述检测中当由于抗原量少等原因使得限制酶处理后的片段浓度低时，根据需要，优选用旋转柱等对该处理后的反应液进行离心沉淀浓缩。
当使用寡肽核酸复合物时，对于其核酸链(寡核苷酸链)部分也可以采用与上述相同的检测方法。
(2)设置可以用PCR进行扩增区域的处理((A2)处理)时
使用寡核苷酸复合物(DNA复合物或RNA复合物)时，按照常规方法添加设计的规定引物等，通过PCR(约5～30次循环)得到扩增特定片段的PCR产物。可以通过使用琼脂糖凝胶的电泳法识别、检测所得扩增片段的长度。另外，对于作为上述规定引物使用荧光标记引物得到的扩增片段，通过DNA序列分析仪(例如Applied Biosystems公司制、产品名称：ABI-3100)的GeneSean软件分析，确定峰位置及其高度，也可以识别并检测扩增片段的长度。
使用寡肽核酸复合物时，对于其核酸链(寡核苷酸)部分，也可以采用与上述相同的检测方法。
(3)设置蛋白质分解酶切割位点的处理((B1)处理)
使用寡肽复合物时，按照常规方法，添加规定蛋白质分解酶溶液，切割寡肽链后，通过SDS-PAGE等电泳法识别、检测片段长度。当由于靶物质量少等原因使得酶处理后的片段浓度低时，根据需要，优选用旋转柱等对该处理后的反应液进行离心沉淀浓缩。
使用寡肽核酸复合物时，对于其寡肽链部分，也可以采用与上述相同的检测方法。
(4)使之与荧光色素相结合的处理((A3)和(B2)处理)
通过已知的荧光光度计和荧光显微镜等识别、检测规定的荧光波长。
本发明中还可以使用具备半导体激光器和高灵敏度光电二极管等的测定模块器件(モジユ一ルデバイス)(例如日立制作所制，产品名称：コスモアイ；Applied Biosystems公司制、产品名称：ABI-3100)。该器件的特征是可以用短时间分离·确定微量DNA、RNA或肽等，并可以对其进行定量。通过使用该器件，可以进行前所未有的高速(短时间)、高灵敏度并且是同时多项目检测条件的识别、检测。具体是测定时间在120分钟以内(优选60分钟以内，更优选30分钟以内)；检测灵敏度在100～100,000fg/mL(优选100～10,000fg/mL，更优选100～1,000fg/mL)；可以检测的标记数(每片)设为5种以上(优选10种以上，更优选50种以上)。
(5)使之与酶相结合的处理((A4)及((B3)处理)
可以按照已知ELISA法的常规方法，添加显色用基质，生成荧光色素后，通过与荧光色素结合处理相同的方法识别、检测。
(6)使之含有放射性同位素的处理((A5)及((B4)处理)
可以按照已知的射线量测定装置和已知免疫印迹法的常规方法，识别、检测规定的射线种类。
(7)设置光照射切割位点的处理((A6)及((B5)处理)
进行规定波长光的照射，切割寡核苷酸链和寡肽链等(从结合物质分离)。然后通过如使用琼脂糖凝胶的电泳法和SDS-PAGE等电泳法识别、检测所得片段的长度。当由于靶物质量少等原因使得光照射处理后的片段浓度低时，根据需要，优选用旋转柱等对该处理后的反应液进行离心沉淀浓缩。另外对于上述切割后的片段还可以进行与上述(4)～(6)相同的操作进行识别、检测。
(8)设置活性氧切割位点的处理((A7)及((B6)处理)时
首先通过添加HRP(辣根过氧化物酶)及Fe配位化合物等产生并游离自由基的试剂，生成活性氧。该活性氧切割寡核苷酸链和寡肽链(从结合物质分离)。然后通过如使用琼脂糖凝胶的电泳法和SDS-PAG等电泳法识别、检测所得片段的长度。当由于靶物质量少等原因使得切割处理后的片段浓度低时，根据需要，优选用旋转柱等对该处理后的反应液进行离心沉淀浓缩。另外该切割后还可以进行与上述(4)～(6)相同的操作进行识别、检测。
(9)结合标记处理树状聚体处理((A8)及((B7)处理)时
检测方法随在树状聚体上实施的标记处理种类不同而异，具体可以通过与上述各标记处理相同的方法进行识别、检测。对于使用标记处理树突状物时也是一样的。
(10)设置至少一种不同碱基的处理((A9)处理)时
当使用寡核苷酸复合物(DNA复合物和RNA复合物)时，首先按照常规方法，添加规定的限制酶溶液，切割寡核苷酸链。或者以通过限制酶处理得到的游离片段作为模板，通过使用规定引物的PCR(约5～30次循环)得到扩增特定片段的PCR产物。或者不进行上述限制酶处理而将寡核苷酸复合物中的寡核苷酸链，直接作为模板，通过使用规定引物的PCR进行与上述相同的操作得到PCR产物。然后通过前述DNA序列分析仪分析和实时PCR分析等能够识别一个不同碱基的分析手段，根据PCR后扩增片段的碱基序列不同，可以进行识别、检测。
当使用寡肽核苷酸复合物时，对于其核酸链(核苷酸链)部分可以采用与上述相同的检测方法。
(11)上述(1)～(10)的标记检测步骤还可以适当组合已知处理手段进行。作为该处理手段，可以列举例如按照免疫印迹法的常规方法，使用扫描器进行定性·定量的手段以及使用流式细胞分析仪和细胞分离器或适当支持物检测，分离·回收含目的抗原的细胞和化合物等手段等。
4.其它步骤
本发明方法，除了上述各步骤以外，还可以含有其它步骤，并不受特别限定。这些其它步骤，可以通过已知手段·方法实施。
5.识别、检测用试剂盒
本发明标记物质的识别、检测用试剂盒含有作为结构成分的多种经过标记处理可以对应靶物质种类进行识别的结合物质。关于该结合物质的详细情况，同样可以采用在上述本发明检测方法中的说明(具体是前述2.(3)中的说明)。
本发明的试剂盒，可以有效用于实施上述本发明的检测方法，具有很高的可用性。
本发明的试剂盒，还可以包含除上述结构成分以外的其它结构成分。作为其它结构成分，可以列举例如限制酶、DNA聚合酶、PCR引物、dNTP、各种缓冲液、无菌水、Eppendorf管、苯酚氯仿、氯仿、乙醇、核酸共同沉淀剂、各种凝胶(粉末)、自由基的产生和游离试剂(HRP和Fe复合物等)、作为封闭剂的牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin)(BSA)，脱脂乳(Skim milk)，Goat血清等血清成分和各种洗涤剂、DNA嵌入剂等荧光试剂、光反应物质、各种板、叠氮化钠等防腐剂以及实验操作手册(说明书)等，除此之外，根据需要还可以列举各种电泳装置和PCR等实验仪器等。
以下列举实施例更具体说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限定。
[实施例1]
<通过PCR的识别、检测>
1.复合抗体的制备与检测
(1)制备寡核苷酸链
制备101mer寡核苷酸，使用在3’末端结合生物素的序列号1的引物(5-MUSTagRIBio)作为5’引物；使用在5’末端结合FAM的序列号2的引物(3-MUSTag101FAM)作为3’引物，通过PCR进行制备。
制备203mer寡核苷酸，使用在3’末端结合生物素的序列号1的引物(5-MUSTagRIBio)作为5’引物；使用在5’末端结合FAM的序列号3的引物(3-MUSTag203FAM)作为3’引物，通过PCR进行制备。
5-MUSTagRIBio：
Biotin-CGGAATTCGCGGACGAGGAGAAGCTGCCGCCCGGCTGG(序列号1)
3-MUSTag101FAM：
FAM-GCTGGCGTTAGTGATGTGGTTGAA(序列号2)
3-MUSTag203FAM：
FAM-CTGGCTGTGCTTCACCAG(序列号3)
上记各PCR，使用嵌入Pin1的pcDNA3.1(In vitro公司制)作为模板DNA，使用Taq聚合酶作为聚合酶，在下述反应液组成以及反应条件下进行。
反应液组成
模板DNA(100μg/μL)：  1μL
Taq聚合酶：            2.5单位
5’引物(20μM)：       2μL
3’引物(20μM)：       2μL
dNTP(各2.5mM)：        8μL
10×缓冲液：           10μL
无菌水：               适量(约77μL)
合计：                 100μL
反应条件
在以“在95℃下进行1分钟热变性·解离→在55℃下进行1分钟退火→在72℃下进行30秒合成·延伸”为1个周期的循环条件下，共进行30次循环。
上述各PCR后的扩增产物，在PCR后进行离心得到上清，使用MinElute PCR纯化旋转柱(Purification spin column)(キアゲン公司制)或Miniprep柱(Invitrogen公司制)对所得上清进行过滤纯化，得到单一寡核苷酸。
(2)制备生物素化抗体
通过常规方法制备下述2种单克隆抗体。
12CA5(抗HA单克隆抗体)
9E10(抗Myc单克隆抗体)
接下来分别使12CA5和9E10(与生物素)混合，并使抗体与硫代-NHS-LC-生物素(Pierce公司制)的摩尔比达到1∶20，在室温下反应30分钟。使各反应液通过5mL的脱盐柱，回收目的抗体组分，得到2种生物素化抗体。
(3)制备寡核苷酸复合抗体
分别以1∶1的摩尔比在生物素化12C5A中混合101mer寡核苷酸，在生物素化9E10中混合203mer寡核苷酸。接下来在各系统中分别以相对于生物素化抗体为1∶1的摩尔比添加NeutrAvidin(NeutrAvidin)(PIERCE Biotechnology公司制)，在室温下反应15分钟。分别使这些反应液通过5mL的脱盐柱，回收目的组分，得到2种寡核苷酸复合抗体。
(4)抗原特异性和识别、检测能力的检测
对于所得2种复合抗体，对其具有的抗原特异性(抗原抗体反应性)和每种标记识别、检测能力的确认，通过以下操作进行。
首先作为抗原制备HA和Myc的合成肽，按照ELISA法的常规方法制备分别涂有这些合成肽的96孔塑料板。接下来用加有5％牛奶的PBST溶液进行一夜封闭，用PBS充分清洗后，对各板孔适量添加含预先制备的2种寡核苷酸复合抗体的溶液，在室温下一边晃动，一边进行反应1小时。
反应后用PBS对各板分别清洗3次，接下来向孔中添加用EcoRI缓冲溶液制备的EcoRI酶溶液，在37℃下反应2小时，对寡核苷酸复合抗体中的寡核苷酸链进行切割。
然后根据需要用旋转柱进行浓缩回收后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳后检测的带出示在图4中。
结果确认从涂布HA板回收的寡核苷酸片段约为100mer，从涂布Myc板回收的寡核苷酸片段约为200mer。
因此确认通过限制酶处理后的寡核苷酸的片段长度差别可以被识别、检测12CA5和101mer寡核苷酸的复合抗体只与HA进行特异反应，9E10和203mer寡核苷酸的复合抗体只与Myc进行特异反应。
2.使用复合抗体的识别、检测
使用制备的2种复合抗体，按照以下操作进行“抗原抗体反应”和“每种标记的识别、检测”。
按照抗原-抗体反应夹心法的常规方法，制备在作为支持物的粒径1μm磁珠上(BioLabs公司制)结合9E10(抗Myc单克隆抗体)或12CA5(抗HA单克隆抗体)的抗体结合微珠。作为抗原使用自制的HA-GST-Myc合成肽(抗原溶液)。首先在3个微型管内，混合结合9E10的微珠和结合12CA5的微珠，使它们的比率按数量比(粒子数比)分别达到3∶1，1∶1，1∶3，并向其中添加抗原溶液，在室温下进行30分钟孵育。用PBST对它们进行3次充分清洗，再分别适量添加含2种寡核苷酸复合抗体的溶液，在室温下一边晃动，一边进行反应30分钟。反应后，再用PBST充分清洗3次，并进行离心，在得到的残渣中添加序列号1的引物(5-MUSTagRIBio)和序列号2的引物(3-MUSTag101FAM)以及序列号1的引物(5-MUSTagRIBio)和序列号3的引物(3-MUSTag203FAM)(也就是添加序列号1、2和3的引物)，在下述反应液组成以及反应条件下进行PCR。
反应液组成
模板DNA(离心后的残渣)：          各管的残渣量
Taq聚合酶：                      2.5单位
5’引物5-MUSTagRIBio(20μM)：    4μL
3’引物3-MUSTag101FAM(20μM)：   2μL
3-MUSTag203FAM(20μM)：          2μL
dNTP(各2.5mM)：                  8μL
10×缓冲液：                     10μL
无菌水：                         适量(约70μL)
合计：                           100μL
反应条件
在以“在94℃下进行30秒热变性·解离→在60℃下进行30秒退火→在72℃下进行30秒合成·延伸”为1个周期的循环条件下，共进行5次循环。
对于PCR后进行离心得到的上清，进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳后检测的带出示在图5中。
该结果表明在所有数量比的样品中，都看到约100bp及约200bp片段的带，因此可以确认在同一反应槽内可以按每种寡核苷酸标记进行识别、检测。另外可以看到对应于抗体结合微珠数量比的片段量，所以还可以确认能够进行具有数量比依赖性(定量性)的识别、检测。
[实施例2]
<使用微量流体分析装置的识别、检测>
1.制备复合抗体
(1)制备寡核苷酸链
制备300mer寡核苷酸链，使用在3’末端结合生物素的序列号4的引物(5-pcDNA3Bio840)作为5’引物；使用在5’末端结合FAM的序列号5的引物(3-MUSTag1140FAM)作为3’引物，通过PCR进行制备。
制备500mer寡核苷酸，使用在3’末端结合生物素的序列号4的引物(5-pcDNA3Bio840)作为5’引物；使用在、5’末端结合FAM的序列号6的引物(3-MUSTag1340FAM)作为3’引物，通过PCR进行制备。
5-pcDNA3Bio840：
Biotin--CTTACTGGCTTATCGAAA(序列号4)
3-MUSTag1140FAM：
FAM-CATTTTATTAGGAAAGGA(序列号5)
3-MUSTag1340FAM：
FAM-CGCGCTTAATGCGCCGCT(序列号6)
上记各PCR，使用pcDNA3.1(In vitro公司制)作为模板DNA，使用Taq聚合酶作为聚合酶、在下述反应液组成和反应条件下进行。反应液组成
模板DNA(100μg/μL)：    1μL
Taq聚合酶：              2.5单位
5’引物(20μM)：         2μL
3’引物(20μM)：         2μL
dNTP(各2.5mM)：          8μL
10×缓冲液：             10μL
无菌水：                      适量(约77μL)
合计：                        100μL
反应条件
在以“在95℃下进行1分钟热变性·解离→在55℃下进行1分钟退火→在72℃下进行30秒合成·延伸”为1个周期的循环条件下，共进行30次循环。
上述各PCR后的扩增产物，在PCR后进行离心得到上清，使用MinElute PCR纯化旋转柱(キアゲン公司)对所得上清进行过滤纯化，得到单一寡核苷酸。
(2)制备生物素化抗体
进行与实施例1“1.(2)”相同的操作，制备生物素化12CA5和生物素化9E10。
(3)制备寡核苷酸复合抗体
分别以1∶1的摩尔比在生物素化12C5A中混合300mer寡核苷酸，在生物素化9E10中混合500mer寡核苷酸。接下来分别以相对于生物素化抗体为1∶1的摩尔比添加NeutrAvidin(PIERCEBiotechnology公司制)，在室温下反应15分钟。分别使这些反应液通过5mL的脱盐柱，回收目的组分，得到2种寡核苷酸复合抗体。使用凝胶过滤色谙柱(PC12：Pharmacia公司制)对各寡核苷酸复合抗体进行分级，用280nm和210nm同时检测系统，只得到寡核苷酸复合抗体。
2.使用复合抗体的识别、检测
使用制备的2种复合抗体，按照以下操作，进行“抗原抗体反应”和“按每种标记的识别、检测”。
按照抗原-抗体反应夹心法的常规方法，制备作为支持物使用粒径1μm磁珠(BioLabs公司制)，结合12CA5或9E10的抗体结合微珠。使用HA-GST-Myc的合成肽作为抗原。首先在微型管内混合分别结合12C5A或9E10的抗体结合微珠和分别为1、0.1、0.01pmol/μL HA-GST-Myc的合成肽，在室温下孵育30分钟。用PBST对此充分清洗3次，适量添加含2种(经过EcoRI处理，分别游离300mer和500mer寡核苷酸)寡核苷酸复合抗体的溶液，在室温下一边晃动，一边进行反应30分钟。然后在各微管中分别添加适量的EcoRI溶液，在37℃下反应15分钟，切割寡核苷酸复合抗体中的寡核苷酸链，进行离心得到上清，用Cosmo-i SV1210(日立制作所制)对所得上清进行分析。
结果可以分别确认表示通过EcoRI处理得到的300mer和500mer寡核苷酸片段存在的峰对抗原浓度的依赖关系(参照图6)。
另外，使用市售的核酸分析装置时，也确认能够分别检测300mer和500mer寡核苷酸片段存在对抗原浓度的依赖关系(定量)。
[实施例3]
<通过PCR的识别、检测>
1.制备使用衔接子的复合抗体
按照以下顺序，制备在抗体分子中通过作为衔接子部分的“蛋白质G”结合寡核苷酸链的复合抗体。
(1)制备寡核苷酸链
制备100mer寡核苷酸，使用在5’末端结合生物素的序列号7的引物(5-pcDNA3Bio840)作为5’引物；使用序列号8的引物(3-pGEX+MUST100)作为3’引物，通过PCR进行制备。
制备200mer寡核苷酸，使用在5’末端结合生物素的序列号7的引物(5-pcDNA3Bio840)作为5’引物；使用序列号9的引物(3-DGEX+MUST200)作为3’引物，通过PCR进行制备。
制备300mer寡核苷酸，使用在5’末端结合生物素的序列号7的引物(5-pcDNA3Bio840)作为5’引物；使用序列号10的引物(3-pGEX+MUST300)作为3’引物，通过PCR进行制备。
制备400mer寡核苷酸，使用在5’末端结合生物素的序列号7的引物(5-pcDNA3Bio840)作为5’引物；使用序列号11的引物(pGEX+MUST400)作为3’引物，通过PCR进行制备。
制备500mer寡核苷酸，使用在5’末端结合生物素的序列号7的引物(5-pcDNA3Bio840)作为5’引物；使用序列号12的引物(3-pGEX+MUST500)作为3’引物，通过PCR进行制备。
5-pcDNA3Bio840：
Biotin--CTTACTGGCTTATCGAAA(序列号7)
3-pGEX+MUST100：
GGCAAGCCACGTTTGGTG CAGTCGAGGC TGATCAGCGA(序列号8)
3-pGEX+MUST200：
GGCAAGCCACGTTTGGTG TCCTCATTTT ATTAGGAAAG(序列号9)
3-pGEX+MUST300：
GGCAAGCCACGTTTGGTG AGCATGCCTG CTATTGTCTT(序列号10)
3-pGEX+MUST400：
GGCAAGCCACGTTTGGTG CCCGCCGCGC TTAATGCGCC(序列号11)
3-pGEX+MUST500：
GGCAAGCCACGTTTGGTG AAAGCCGGCG AACGTGGCGA(序列号12)
上述各PCR，以pGEX(Pharmacia公司制)作为模板DNA，作为聚合酶使用Taq聚合酶，在下述反应液组成和反应条件下进行。
反应液组成
模板DNA(100μg/μL)：    1μL
Taq聚合酶：              2.5单位
5’引物(20μM)：         2μL
3’引物(20μM)：         2μL
dNTP(各2.5mM)：          8μL
10×缓冲液：             10μL
无菌水：                 适量(约77μL)
合计：                   100μL
反应条件
在以“在95℃下进行1分钟的热变性·解离→在55℃下进行1分钟的退火→在72℃下进行30秒钟的合成·延伸”为1个周期的循环条件下，共计进行30次循环。
上述各PCR后的扩增产物，在PCR后进行离心得到上清，通过MinElute PCR纯化旋转柱(キアゲン公司制)对所得上清进行过滤纯化，得到单一核苷酸。
(2)制备蛋白质G/抗生物素蛋白结合物
(i)制备马来酰亚胺(Maleimide)活化蛋白质G
把5mg蛋白质G溶解到500μL的50mM磷酸钠(pH7.4)中。接下来在50μL DMSO中溶解作为化学修饰剂(化学接头)的磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(以下称为“Sulfo-SMCC”(PIERCE 50mg，#22322，分子量(Molecular Weight)：436.37，间隔臂长(Spacer Arm Length)：11.6；参照下述结构式(I))1mg，并将它添加到上述蛋白质G的溶液中。
将上述添加后的溶液在室温下缓慢搅拌60分钟，使蛋白质G和Sulfo-SMCC反应结合。该结合是Sulfo-SMCC的Sulfo-NHS酯基和蛋白质G的结合。
Figure A20058003771000331
为了除去反应后残留的剩余Sulfo-SMCC，使用通过结合缓冲液进行平衡的脱盐柱，对反应液进行分级分离每500μL为一份。测定各级组分中的溶出蛋白质(马来酰亚胺活化蛋白质G)的浓度，采取峰级的组分。
使用5kDa的微大小的过滤管(pore size filter tube)通过离心，对马来酰亚胺活化蛋白质G进行浓缩，并且将溶液的最终体积(容量)调整至500μL。
(ii)与抗生物素蛋白的结合
使EZ-Link马来酰亚胺活化NeutrAvidin(PIERCE 5mg，#31007，60kDa)溶解于缓冲液(100mM磷酸钠(pH7.6)，5mM EDTA)中。在该溶液中添加马来酰亚胺活化蛋白质G溶液。进行该添加时，要调整到以下数量比，使蛋白质G与抗生物素蛋白的摩尔比(蛋白质G∶抗生物素蛋白)达到1∶3左右。
蛋白质G(22kDa)∶抗生物素蛋白(60kDa)＝1mg∶1mg
对混合后的溶液在4℃下一边缓慢搅拌一边进行反应4小时以上(至约一夜)。
将反应后的溶液加入到凝胶过滤柱(FPLC凝胶过滤(PC12柱))中，从蛋白质G/抗生物素蛋白结合体中采取相当于对1个蛋白质G分子结合2个或3个抗生物素蛋白分子结合物分子量的组分。
(3)制备复合抗体
(i)蛋白质G/抗生物素蛋白结合物和寡核苷酸链的结合
在缓冲液(50mM Tris(pH8.0)，1mM EDTA，0.1M NaCl，0.5％明胶，0.1％Tween20)中对经上述(1)纯化得到的各寡核苷酸链(生物素化oligo和用上述(2)得到的蛋白质G/抗生物素蛋白结合物进行混合、分别使其摩尔比(生物素化oligo∶蛋白质G/抗生物素蛋白结合物达到1∶2左右。在室温下一边对混合溶液搅拌，一边进行反应(生物素-抗生物素蛋白结合反应)30分钟以上，得到寡核苷酸/蛋白质G结合物。
(ii)制备抗体
用常规方法制备下述5种单克隆抗体。
抗Int6抗体(抗小鼠IgG单克隆抗体)
抗HIF1α抗体(抗兔IgG单克隆抗体)
12CA5(抗HA单克隆抗体)
9E10(抗Myc单克隆抗体)
抗β-半乳糖苷酶抗体(抗β-半乳糖苷酶单克隆抗体)
(iii)抗体和衔接子部分的结合
在缓冲液(50mM Tris(pH8.0)，1mM EDTA，0.1M NaCl，0.5％明胶，0.1％Tween20)中，对寡核苷酸/蛋白质G结合物和各种单克隆抗体进行混合，使各自的摩尔比分别达到1∶1。一边搅拌一边在室温下反应1小时或在4℃下反应12小时。具体是抗Int6抗体(抗小鼠IgG单克隆抗体)与结合100mer寡核苷酸的上述结合物混合，抗HIF1α抗体(抗兔IgG单克隆抗体)与结合200mer单核苷酸的上述结合物混合，12CA5与结合300mer寡核苷酸的上述结合物混合，9E10与结合400mer寡核苷酸的上述结合物混合，抗β-半乳糖苷酶抗体(抗β-半乳糖苷酶单克隆抗体)与结合500mer核苷酸的上述结合物混合，并使它们进行反应。分别使各反应液通过5mL脱盐柱，回收目的组分，得到5种寡核苷酸复合抗体。
2.使用复合抗体的识别、检测
使用制备的5种复合抗体，按照以下操作，进行“抗原抗体反应”和“按各标记的识别、检测”。
按照ELISA法的常规方法，在ELISA板的孔中固定5种抗原(小鼠IgG、兔IgG、HA、Myc和β-半乳糖苷酶(各50ng))。封闭，是在孔中添加5％脱脂乳100mM磷酸钠150mMNaCl(pH 7.4)，在室温下静止放置30分钟进行的。在该孔中添加含有5种寡核苷酸复合抗体的溶液20μL，在室温下一边晃动，一边进行反应30分钟。反应后用0.1％NP40，100mM磷酸钠150mMNaCl(pH7.4)充分清洗5次，接下来用100mM磷酸钠150mMNaCl(pH7.4)清洗1次之后，向孔中添加适量EcoRI溶液(10unit/20μL)，在37℃下反应30分钟，使与抗原结合的复合抗体的寡核苷酸链游离。回收含该游离寡核苷酸的上清。
然后在该上清中(也就是以游离寡核苷酸作为模板)，添加序列号13的引物(5-Forw-3)和用FAM色素进行荧光标记的序列号14的引物(3-pGEX-FAM)，在下述反应液组成以及反应条件下进行PCR。
5-Forw-3：TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA(序列号13)
3-pGEX-FAM：FAM-GGCAAGCCACGTTTGGTG  (序列号14)
反应液组成
EcoRI处理后的上清：        5μL
Taq聚合酶：                2.5单位
5’引物5-Forw-3(20mM)：    2μL
3’引物3-pGEX-FAM(20mM)：  2μL
dNTP(2.5mM)：              8μL
10×缓冲液：               10μL
无菌水：                   适量(约73μL)
合计：                     100μL
反应条件
在以“在95℃下进行5分钟热变性·解离→在55℃下进行30秒钟退火→在72℃下进行30秒合成·延伸”为1个周期的循环条件下，共进行15次循环。然后在10μl甲酰胺中溶解1μl反应液，在95下进行5分钟热变性。
对PCR后的反应液进行离心，对于得到的上清，使用DNA序列分析仪ABI-3100(Applied Biosystems公司制)，通过GeneScan软件进行分析，确定各峰位置及其高度。
其结果可以确认表示具有可以与各抗原(小鼠IgG兔IgG HAMyc和β-半乳糖苷酶)进行特异结合的复合抗体的核苷酸片段，即寡长为100mer、200mer、300mer、400mer和500mer的寡核苷酸片段存在的峰(参照图8)。
[参考例1]
<本发明检测方法与以往ELISA法的检测灵敏度比较>
1.制备用于ELISA法的第一抗体
按照常规方法，制备小鼠抗HA抗体及小鼠抗Myc抗体。
2.制备用于本发明检测法的寡核苷酸复合抗体
通过与实施例3“1.”相同的方法，制备“具有200mer寡核苷酸链的12CA5复合抗体”(以下称为复合抗体A)。
具体而言，在实施例3中使用的5种寡核苷酸复合抗体中“具有100mer寡核苷酸链的复合抗体”的制备方法中，使具有200mer寡核苷酸链的寡核苷酸/蛋白质G结合物和抗Int6抗体反应替代具有100mer寡核苷酸链的寡核苷酸/蛋白质G结合物和抗Int6抗体(抗小鼠IgG单克隆抗体)反应，除此之外，进行与实施例3“1.”相同的操作，制备前述复合抗体A。
3.固定抗原
使用HA-GST-Myc的合成肽作为抗原。按照ELISA法的常规方法，按照下述表所示的量在ELISA板的各孔中固定该抗原。在孔中添加5％脱脂乳，100mM磷酸钠，150mMNaCl(pH 7.4)，在室温下静止放置30分钟进行封闭。
各孔中的抗原量
A B C D E F G H
  02列04列 1.3pg 256fg 51fg 10.2fg 2.0fg 410ag 82ag 1.6ag
  01列03列 500ng 100ng 20ng 4ng 800pg 160pg 32pg 6.4pg
4.用ELISA检测
在前述3.的封闭之后用0.1％NP40，磷酸盐缓冲剂盐溶液(pH 7.4)充分清洗3次。
作为第一抗体，分别在板的01列和02列各孔中添加用前述1.制备的小鼠抗HA抗体，在板的03列和04列各孔中添加小鼠抗Myc抗体。
用0.1％NP40，磷酸盐缓冲剂盐溶液(pH 7.4)充分清洗3次，添加HRP标记山羊抗小鼠IgG。
用0.1％NP40，磷酸盐缓冲剂盐溶液(pH 7.4)充分清洗3次，添加基质静止放置。然后用1％SDS终止显色。
对于显色后的板(图9(a))的各孔，将使用ELISA-Reader(415nm)测定的结果出示在图9(b)中。通过该结果确认，用ELISA法的最高灵敏度为抗原量4ng(D的01列孔)。
5.用本发明检测方法检测
在前述3.封闭之后，用0.1％NP40，100mM磷酸钠150mMNaCl(pH7.4)充分清洗3次。
作为第一抗体，分别在板的01列和02列各孔中添加用前记1.制备的小鼠抗HA抗体，在板的03列和04列各孔中添加小鼠抗Myc抗体。
用0.1％NP40，磷酸盐缓冲剂盐溶液(pH 7.4)充分清洗3次后，在板的01和02列各孔中分别添加含用前记2.制备的复合抗体A的溶液20μL，在室温下一边晃动，一边进行反应30分钟。
反应后，用0.1％NP40，100mM磷酸钠150mMNaCl(pH 7.4)充分清洗3次，接下来用100mM磷酸钠150mMNaCl(pH 7.4)清洗1次后，在孔中添加适量的EcoRI溶液(10unit/20μL)，在37℃下反应30分钟，使与抗原结合的复合抗体A的寡核苷酸链游离。回收含该游离寡核苷酸的上清。
然后，在该上清中(也就是以游离寡核苷酸作为模板)添加序列号13的引物(5-Forw-3)和用FAM色素进行荧光标记的序列号14的引物(3-pGEX-FAM)，用与实施例3“2.”相同的反应液组成和反应条件(其中，循环次数为20)进行PCR。
5-Forw-3：TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA(序列号13)
3-pGEX-FAM：FAM-GGCAAGCCACGTTTGGTG  (序列号14)
对PCR后的反应液进行离心，对得到的上清，使用DNA序列分析仪ABI-3100(Applied Biosystems公司制)通过GeneScan软件进行分析，进行峰的检测(确定峰位置及其高度)。
结果如图10和图11所示，表明如果是本发明的检测方法，至少可以有效检测到256fg(B的02列孔)的抗原量。也就是确认了本发明的检测方法(PCR：20次循环)与最大灵敏度4ng的ELISA法相比，检测灵敏度高出约15,000倍。
[参考例2]
<本发明检测方法中的定量性>
1.制备寡核苷酸复合抗体
通过与实施例3“1.”相同的方法，制备“具有100mer寡核苷酸链的9E10复合抗体”(以下称为复合抗体B)。
具体是在实施例3中使用的5种寡核苷酸复合抗体中“具有400mer寡核苷酸链的复合抗体”的制备方法中，使具有100mer寡核苷酸链的寡核苷酸/蛋白质G结合物与9E10反应替代使具有400mer寡核苷酸链的寡核苷酸/蛋白质G结合物与9E10(抗Myc单克隆抗体)反应，除此之外，进行与实施例3“1.”相同的操作，制备前述复合抗体B。
2.固定抗原
按照ELISA法的常规方法，在ELISA板的各孔中分别用不同的量固定作为抗原的Myc肽。具体是在各孔中分别固定50ng、12.5ng、3.1ng、780pg、190pg、48.8pg、12.2pg和3pg的Myc。同时在各孔中还固定Myc以外的抗原(参照下述表)。
抗原                     抗原量/孔
HA肽                     1～5ng
Myc-GST-HA               1～5ng
Int6肽                   1～5ng
HIF肽                    1～5ng
β-半乳糖苷酶蛋白        1～5ng
在各孔中添加5％脱脂乳，100mM磷酸钠，150mMNaCl(pH 7.4)，在室温下静止放置30分钟进行封闭。
3.用本发明检测方法检测
封闭后，用0.1％NP40，100mM磷酸钠150mMNaCl(pH 7.4)充分清洗3次。
在各孔中分别加入含用前述1.制备的复合抗体B的溶液20μL，在室温下一边晃动，一边进行反应30分钟。
反应后用0.1％NP40，100mM磷酸钠150mMNaCl(pH 7.4)充分清洗3次，接下来用100mM磷酸钠150mMNaCl(pH 7.4)清洗1次之后向各孔中添加适量的EcoRI溶液(10unit/20μL)，在37℃下反应30分钟，使与抗原结合的复合抗体B的核苷酸链游离。回收含该游离寡核苷酸的上清。
然后在该上清(也就是以游离寡核苷酸为模板)中添加序列号13的引物(5-Forw-3)和用FAM色素进行荧光标记的序列号14的引物(3-pGEX-FAM)，使用与实施例3“2.”相同的反应液组成和反应条件(其中，循环次数为20)进行PCR。
5-Forw-3：TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA(序列号13)
3-pGEX-FAM：FAM-GGCAAGCCACGTTTGGTG  (序列号14)
对PCR后的反应液进行离心得到上清，对所得上清，使用DNA序列分析仪ABI-3100(Applied Biosystems公司制)，通过GeneScan软件进行分析，进行峰的检测(确定峰的位置及其高度)。把结果出示在图12中。
对于得到的检测结果，以横坐标作为使用的蛋白质量(抗原量：Myc的量)，以纵坐标作为信号值，对各值进行绘图(图13)。对于信号值超过检测极限的值，不进行绘图。结果确认无论抗原的种类如何，按照本发明的检测方法，对特定抗原都可以进行定量检测。
产业上的实用性
如果按照本发明可以提供能够一次识别、检测被检试样中所含多种靶物质的靶物质的检测方法。本发明的方法，特别在癌症的诊断(通过早期发现而提高治愈率)和抗癌剂药效评价、脑中风和心肌梗塞的诊断(通过早期诊断减少后遗症)、感染症中的病原体确定等人的临床检查领域，在家畜和宠物的感染症及其它疾病的诊断、还有对由残留农药和细菌引起食品污染物质的确定以及二英和PCB等环境污染物质确定等的食品和环境领域中可以大大提高检查、诊断效率和评价效率等，是相当有用的。
序列表文本
序列号1：引物
序列号2：引物
序列号3：引物
序列号4：引物
序列号5：引物
序列号6：引物
序列号7：引物
序列号8：引物
序列号9：引物
序列号10：引物
序列号11：引物
序列号12：引物
序列号13：引物
序列号14：引物。
序列表
<110>TOKYO METROPOLITAN ORGANIZATION FOR MEDICAL RESEARCHSYNTHERA TECHNOLOGIES CO.，LTD.
<120>检测靶物质的方法
<130>G07-0031
<140>PCT/JP2005/020402
<141>2005-11-01
<150>JP 2004-318395
<151>2004-11-01
<160>14
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
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ggcaagccac gtttggtg                                    18

Claims (10)

1.一种识别并检测被检试样中所含多种靶物质的方法，该包括：使固定在支持物上的靶物质和/或没有固定的靶物质与经过标记处理、能够对应所述靶物质种类进行识别的结合物质接触，形成所述靶物质与所述结合物质的复合物的步骤，以及检测形成所述复合物的结合物质中的标记的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述结合物质中的标记部分至少通过衔接子部分固定在该结合物质上。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述衔接子部分是选自蛋白质G、蛋白质A、蛋白质L、蛋白质A和蛋白质G的融合蛋白质的至少一种。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其中，所述结合物质是与寡核苷酸链形成复合物的物质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述标记处理是对所述寡核苷酸链进行选自：设置限制酶切割位点的处理、设置可以通过PCR扩增的区域的处理、使之含有放射性同位素的处理、使之与荧光色素相结合的处理、使之与酶相结合的处理、设置光照射切割位点的处理、设置活性氧切割位点的处理、使之与经标记处理的树状聚体相结合的处理和在碱基种类中设置至少一种不同碱基处理的至少一种处理。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，检测所述标记的步骤是通过电泳检测由所述PCR扩增的产物的步骤。
7.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其中，所述结合物质是与寡肽链形成复合物的物质。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述标记处理是对所述寡肽链进行选自：设置蛋白质分解酶切割位点的处理、使之含有放射性同位素的处理、使之与荧光色素相结合的处理、使之与酶相结合的处理、设置光照射切割位点的处理、设置活性氧切割位点的处理和与经标记处理的树状聚体相结合的处理的至少一种处理。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的方法，其中，所述靶物质是抗原，所述结合物质是抗体。
10.用于识别、检测靶物质的试剂盒，其含有经过标记处理的、可以对应于靶物质的种类对其进行识别的多种结合物质。
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Address after: Tokyo, Japan

Applicant after: TOKYO METROPOLITAN INSTITUTE OF MEDICAL SCIENCE

Applicant after: Synthera Technologies Co., Ltd.

Address before: Tokyo, Japan, world valley area, upper North, two, 1, 6

Applicant before: Tokyo Metropolitan Org Med Res

Applicant before: Synthera Technologies Co., Ltd.

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