KR19980069710A

KR19980069710A - 유전자검출법

Info

Publication number: KR19980069710A
Application number: KR1019970008220A
Authority: KR
Inventors: 후쿠다시게히로
Original assignee: 이에츠구히사시; 도아이요우덴시가부시키가이샤
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 1998-10-26
Also published as: DE69713195D1; DE69713195T2; JP3545158B2; JPH09304383A; EP0798388A1; EP0798388B1

Abstract

간편하고 신속하게 증폭후의 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 항원 또는 항체를 결합한 유전자단편을 사용하여 증폭된 두가닥 유전자를, 전기 항원 또는 항체를 인식하는 항체 또는 항원을 결합하 입자, 또는 전기 항원 또는 항체와 특이적으로 결합하는 물질을 결합한 입자와 반응시켜, 입자의 응집정도를 측정함으로써 목적 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 유전자검출법, 및 이 방법을 사용하여 유전자중의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.

Description

유전자검출법

본발명은 증폭한 유전자의 검출방법에 관한 것이며, 면역학, 분자생물학, 진단학 등의 넓은 분야에서의 이용이 가능하다.

근년의 유전자공학의 진보에 따라, 미량의 유전자를 큰폭으로 증폭하는 방법이 다수 고안되고 있다. 이들 방법을 사용함으로써 시료중 미량의 유전자를 증가시키는 것이 가능하게 되었다. 유전자증폭법으로서 가장 잘 알려져 있는 것은 PCR(polymerase chain reaction)법이다. 이 방법은 목적 유전자를 함유하는 영역의 3'말단과 5'말단의 유전자배열에 상보적인 유전자단편(프라이머)을 조제하고, 그것을 유전자의 재료인 염기와 함께 시료와 혼합하고, DNA폴리머라아제라는 유전자합성효소를 작동시켜 목적 유전자를 합성하는 방법이다. 이 방법은, (1)열변성에 의한 DNA두가닥의 분리, (2)프라이머와 어니일링, 및 (3)DNA폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성의 3반응의 반복(통상 20∼40사이클)으로 이루어진다. 이 때 두가닥의 유전자를 열을 가해 외가닥으로 분리하는 것이, 사용하는 DNA폴리머라아제를 내열균유래의 것으로 하는 것에 의해, 1 사이클마다 새롭게 DNA폴리머라아제를 보급하지 않고, 온도변화만에 의한 반응의 반복에 의해 유전자증폭을 행하는 것이 가능하게 되었다. 이 방법을 사용함으로써 목적 유전자를 몇십만배, 몇백만배로도 증폭할 수 있다.

현재는 이 증폭법을 자동적으로 행하는 더멀 사이클러(thermal cyclers)라는 기기도 많이 판매되고 있고, 의학, 진단학, 분자생물학 등의 분야에서 넓게 사용되고 있다.

상술한 바와 같이, 간편하게 유전자를 증폭하는 방법은 확립되어 있으나, 증폭한 유전자를 검출하는 방법으로서는 아직까지도 전기영동법이 그 주류가 되고 있다. 이것은 폴리아크릴아미드 등의 겔에 시료를 첨가하여 전기영동을 행하고 그 후 염색하여 유전자의 유무를 확인하는 방법이며, 노력도 시간도 걸리는 방법이다. 그 때문에 유전자의 증폭은 수시간에 종료하는데도 불구하고, 유전자의 검출공정에 시간이 걸리기 때문에 전체적인 유전자검출에 걸리는 시간은 2, 3일로 돼버린다. 또한 다검체의 처리에는 적합하지 않고, 임상진단 분야에서의 유전자진단법이 보급되지 않는 이유의 하나로서 이 유전자검출법이 노력이 든다는 것이 있다. 근년 HPLC(high performance liquid chromatography·고속 액체 크로마토그래피)나 모세관전기영동으로 증폭한 유전자를 검출하는 것이 시도되고 있으나, 다검체를 처리하고자 할 때 이들 방법은 유효하지 않다.

또한, 유전자를 입자응집법에 의해 검출하고자 하는 시도가 행해지고 있으며, 그 기술이 개시되어 있다. 예를 들면 미국특허 제5,104,791호에서는 목적 유전자에 상보적인 유전자단편을 2종류 준비하고, 이들을 입자에 결합시켜 두고, 이것을 목적 유전자와 결합시켜 응집을 생기게 하고, 이어서 응집형성에 의한 시그널을 측정함으로써 목적 유전자의 존재나 양을 측정하고 있다.

그렇지만, 미국특허 제5,104,791호의 방법에서는 목적 유전자마다 다른 2종류의 유전자단편을 입자에 결합하지 않으면 안된다고 하는 문제를 안고 있다. 또한 이 특허에서는 목적 유전자와 상보적인 관계에 있는 유전자단편을 사용한다는 점에서, 목적 유전자는 외가닥일 필요가 있다. 통상 DNA는 두가닥의 상태로 존재하고, 유전자 증폭법을 사용한 후도 두가닥 유전자로 시료를 얻을 수 있다. 따라서, 이 특허에서는 그 후에 외가닥으로 하는 조작이 필요하고, 외가닥으로 한 후도 시료중에는 상보적인 유전자가 존재하고, 입자상의 유전자단편과 경합적으로 반응하게 된다. 이것은 검출감도의 저하를 초래하고, 측정법으로서는 별로 바람직하지 않다.

한편, 목적 유전자를 인식하는 항체를 사용하여 유전자를 검출하는 것은 원리적으로는 가능하다. 이 방법을 사용해도 입자응집에 의한 유전자의 검출은 가능하기는 하지만, 그 실시는 꽤 곤란할 것으로 예상된다. 유전자는 4종류의 염기배열에 의해 그 정보가 보존되고 있다. 결국 유전자의 구성성분으로서는 4종류의 염기밖에 없기 때문에, 특정 염기배열로 하던지 반응하지 않는 항체를 만드는 것은 곤란하고, 어떤 유전자배열을 인식하는 항체는 그것과 매우 유사한 다른 유전자배열의 부분과도 반응해 버린다. 이 현상을 교차반응이라 하며, 유전자를 인식하는 항체의 큰 문제가 되고 있다. 또한 이 방법에서도 각각의 유전자에 대응한 2종류 이상의 항체를 결합한 개개의 입자를 준비할 필요가 있고, 간편한 방법이라고는 말하기 어렵다.

또한 유전자중에는 돌연변이가 존재하는 경우가 있고, 그 돌연변이가 질병과 깊은 관계가 있는 것은 잘 알려져 있다.

유전자의 변이가 원인으로 발병하는 질병이나 위험인자가 되는 질병은 많이 알려져 있다. 이들 질병으로는 예전에는 탈라세미아(thalassemia)나 혈우병이 있고, 근년에는 가족성 근위축성 측색경화증이나 가족성 알츠하이머병등이 알려져 있다. 이들 질환중에는 유전자의 한 부분, 어떤 경우는 염기배열중의 한 염기가 변이했기 때문에 생기는 질환도 있으며, 이와 같은 것은 점돌연변이라 불려지고 있다. 이와 같은 미소한 변이를 검출하는 방법으로서는 현재 DGGE법이나 SSCP법이나 RFLP법이 사용되고 있다. DGGE(denaturant concentration gradient gel electro- phoresis)법은 변성제 농도구배 겔전기영동이라고 불려지는 방법이며, 점돌연변이가 발생했을 때 두가닥 유전자의 안정성이 변화하는 것을 이용하여, 변성제의 농도구배를 갖는 겔에서 전기영동을 행함으로써 변이를 검출하는 방법이다. 한편 SSCP(single-stranded DNA conformational polymorphic analysis)법은 외가닥DNA 고차구조다형해석법이라고 불려지는 것이고, 외가닥DNA는 그 염기배열에 따라 특유한 고차구조를 취한 것을 이용하여, 증폭한 두가닥 유전자를 외가닥 해리하여 비변성의 폴리아크릴아미드겔전기영동에 걸침으로써 이동도에 차가 생기는 것을 원리로서 검출을 행하는 것이다. 이 방법을 사용함으로써 수백 염기중의 1염기의 변이라도 이동도의 차로서 검출할 수 있다.

또한, 변이의 위치가 일정한 경우는 RFLP(restriction enzyme fragment length polymorphism)법을 실시함으로써 그 변이를 검출할 수 있는 경우가 있다. 이 방법은 제한효소단편길이다형이라고 불려지는 방법이며, 어떤 변이가 일정한 장소에서 일어나고, 그 변이에 따라 그 장소가 어떤 제한효소의 절단부위로 되기도 하고, 정상에서는 절단부위였던 것이 변이에 의해 절단되지 않기도 하는 것을 이용한 것이다. 변이를 함유하는 부위를 사이에 두고 유전자를 증폭하고, 그 산물에 어떤 제한효소를 작용시키는 것으로, 변이의 유무에 따라 절단부위가 출현하기도 하고 소실되기도 하는, 그 변화를 전기영동적으로 검출하는 방법이다.

이들 방법은 1 염기의 변이도 검출할 수 있는 교묘한 방법이지만, 어떠한 검출법도 전기영동에 의한 검출이 주체이며, 신속성, 간편성, 다검체처리성에는 우수하지 않다.

본발명은 간편하고 증폭후의 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 동위원소를 사용하지 않는 안전하고 고감도의 검출계를 제공하는 것을 목적으로 한다.

다시 본발명은 간편하고 신속한 증폭후의 유전자에 함유되는 변이를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 유전자검출법을 나타내는 개략도.

도 2는 전자동면역측정장치를 사용하여 얻어진 입도분포의 예시.

본발명자는 상기 사정을 감안하여, 예의 연구한 결과, 증폭시에 사용하는 유전자단편에 항원 또는 항체를 결합하여, 그 항원 또는 항체를 인식하는 항체 또는 항원을 결합한 입자, 또는 항원 또는 항체와 특이적으로 결합하는 물질을 표면에 결합한 입자를 사용하는 것에서 응집을 생기게 하는 것을 이용하여, 증폭된 유전자를 검출할 수 있는 방법을 밝혀냈다.

다시 본발명자은 상술한 유전자검출법을 이용하여, 증폭된 유전자가 변이를 함유하는 유전자인 경우, 증폭후에 제한효소를 반응시킴으로써, 유전자가 절단되기도 하고 절단되지 않기도 하는 것이 입자의 응집의 대소로서 검출할 수 있음을 밝혀내고, 이것에 의해 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있음을 밝혀냈다.

즉, 본발명은 항원 또는 항체를 결합한 유전자단편을 사용하여 증폭된 두가닥 유전자를 전기 항원 또는 항체를 인식하는 항체 또는 항원을 결합한 입자, 또는 전기 항원 또는 항체와 특이적으로 결합하는 물질을 결합한 입자와 반응시키고, 입자의 응집정도를 측정함으로써 목적 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 유전자검출법을 제공한다.

본발명은 또한, 항원 또는 항체를 결합한 유전자단편을 사용하여 증폭된 두가닥 유전자를 전기 항원 또는 항체를 인식하는 항체 또는 항원을 결합한 입자, 또는 전기 항원 또는 항체와 특이적으로 결합하는 물질을 결합한 입자와 반응시켜, 입자의 응집정도를 측정함으로써 목적 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 유전자검출법에 있어서,

상기 증폭에 사용하는 유전자상에 돌연변이부위가 있을 때, 그 돌연변이부위의 존재에 따라 절단양식이 변화하는 제한효소를 작용시켜, 유전자에 절단의 유무를 생기게 하고, 그 결과 생기는 입자의 응집정도의 변화를 검출함으로써, 유전자의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.

본발명에 의한 유전자검출법의 원리

본발명의 유전자검출법의 원리는 아래와 같다. 또, 본발명의 유전자검출법의 개략을 도 1에 나타낸다.

우선 유전자증폭의 원료가 되는 유전자단편에 미리 항원 또는 항체를 결합해 두고, 그 유전자단편을 프라이머로서 사용하여 어떠한 유전자증폭처리를 행한다. 시료중에 목적 유전자가 존재하면 첨가한 항원 또는 항체결합 유전자단편을 원료로 하여, 유전자 증폭법에 의해 목적 유전자가 대량으로 만들어진다. 증폭된 유전자의 대부분은 항원 또는 항체를 결합한 유전자단편에서 만들어지고 있으므로, 그 양단에는 항원 또는 항체를 결합한 형태로 되어 있다. 또, 항원 또는 항체의 결합위치는 유전자단편의 말단에 한하지 않고, 어느 위치에 1분자 결합하고 있으면 좋다. 말단에 결합하는 경우에는 증폭된 방향과는 반대측에 결합한다.

이 항원 또는 항체에 대하여 친화성을 갖는 항체 또는 항원을 결합한 입자를 유전자증폭후에 시료에 첨가하면, 증폭된 유전자와 반응하여 응집을 일으킨다. 생긴 응집은 육안, 또는 탁도, 흡광도등으로도 측정은 가능하지만, 쉬드 플로우(sheath flow)중에 흐르는 개개의 입자에 레이저광을 조사하여 생기는 산란광의 강도를 측정함으로써도 응집의 정도를 알 수 있다. 이 방법을 사용함으로써, 증폭된 유전자를 보다 고감도로 검출할 수 있다. 또한, 입자 크기를 적당한 것으로 하면, 전기저항법에 의해 측정하는 것도 가능하다. 단 검출기의 눈막힘 등의 문제를 고려하면, 광학적인 방법으로 측정하는 쪽이 바람직하다. 응집입자의 검출은 전자동면역응집측정장치(예를 들면, 도아이요우덴시(사)제, PAMIA-30)를 사용하여 응집 라텍스입자의 크기를 광학적으로 측정함으로써 신속, 고감도, 고정밀도로 행할 수 있다.

돌연변이검출에의 응용

본발명의 유전자의 돌연변이를 검출하는 방법에서는 유전자증폭의 원료가 되는 유전자단편에 항원을 결합하고, 그 유전자단편을 사용하여 어떠한 유전자증폭처리를 행한다. 시료중에 변이를 갖는 부분을 함유하는 목적 유전자가 존재하고 있으면, 첨가한 항원결합 유전자단편을 원료로 하여, 유전자증폭법에 의해 목적 유전자가 대량으로 만들어진다. 증폭된 유전자의 대부분은 항원을 결합한 유전자단편에서 만들어지므로, 그 양단에는 항원을 결합한 형태로 되어 있다. 또한 증폭된 유전자에는 변이부분이 함유되어 있다.

이 항원에 대하여 친화성을 갖는 항체를 결합한 입자를 유전자증폭후의 시료에 첨가하면, 증폭된 유전자와 반응하여 응집을 일으킨다. 생긴 응집은 육안, 또는 탁도, 흡광도등으로도 측정은 가능하지만, 상술한 바와 같이 쉬드 플로우중에 흐르는 개개의 입자에 레이저를 쬐어 생기는 전방산란광강도를 측정하는 것으로도 응집의 정도를 알 수 있다.

이때, 증폭된 유전자중에 돌연변이가 존재함으로써, 정상의 검체이면 절단되는 것이 없는 유전자중에, 어떤 제한효소의 절단부위가 출현한 경우, 그 제한효소를 증폭유전자에 작용함으로써 절단되면 입자의 응집은 저하하고, 절단되지 않으면 입자의 응집에는 변화가 없는 것으로 판명된다. 이와 같이 돌연변이의 존재에 의해 제한효소의 절단부위가 새롭게 생기는 경우만이 아니고, 돌연변이의 존재에 따라, 정상검체에서는 특정의 제한효소로 절단되어 있는 장소가 절단되지 않게 되는 경우도 있다. 따라서 유전자증폭후의 시료에 대하여 제한효소를 작용시킨 것과 작용시키지 않은 것을 조제하고, 그 양쪽에 대하여 응집반응을 조사함으로써 그 유전자내의 돌연변이의 유무를 알 수 있다.

또, 제한효소의 첨가는 항체결합입자와 반응시키기 전이나 후라도 상관없지만, 입자와 반응시키기 전에 첨가하는 쪽이 시판의 입자응집측정장치(예를 들면, 도아이요우덴시(주)의 PAMIA시리즈)를 거의 그대로 사용하므로 유리하다.

본발명의 방법에 의해 검출할 수 있는 돌연변이로서는 가족성 근위축성 측색경화증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 적혈구효소이상증, 혈우병등 종래 RFLP법으로 조사한 것의 대부분이 포함된다. 본발명의 방법에 의해, 종래 전기영동법에 의해 검출하는 RFLP법에 비교하여 훨씬 간편하게 유전자진단을 행할 수 있다.

프라이머로서 사용하는 목적 유전자를 함유하는 영역의 3'말단과 5'말단의 유전자배열과 상보적인 유전자단편에 결합하는 항원 또는 항체로서는 각종의 것을 이용할 수 있으나, 가능한 한 분자량이 작은 쪽이 유전자증폭시에 장애가 되지 않는다. 그 의미에서는 저분자의 항원인 합텐을 결합하는 것이 바람직하다. 합텐의 예로서는 비오틴, FITC(fluorescein isothiocyanate) 등을 들 수 있다.

이하에 항원을 결합한 유전자단편을 사용하는 경우에 대해서 진술한다.

항원을 결합한 유전자단편은 당업계에서 공지의 방법을 사용하여 조제할 수 있다. 예를 들면, 비오틴화 프라이머를 조제하기 위해서는 비오틴화 누클레오티드(BIOTIN dxTM, 와코쥰야쿠고교(주)로부터 입수가능) 및 통상의 누클레오티드를 사용하여, ABI사의 자동합성장치에 의해 합성할 수 있다. 상술한 바와 같이, 비오틴분자는 3'말단과 5'말단에 결합하는 것이 바람직하지만, 이것에 한하지 않고 다음의 증폭반응을 방해하지 않는 한 프라이머의 도중에 결합할 수도 있다. 다시, 올리고누클레오티드 비오틴 라벨링 키트(에이머샴사제) 등을 사용하여 올리고누클레오티드의 말단에 비오틴 1분자를 결합하는 것도 가능하다. 또, 소망의 비오틴화 프라이머는 예를 들면 다카라스조(주)에 합성을 위탁할 수도 있다.

이와 같이 해서 조제한 항원을 결합한 유전자단편을 프라미어로 사용하여 PCR법등으로 유전자를 증폭한다. 유전자증폭은 당업계에서 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 항원결합프라이머, 누클레오티드혼합물, DNA폴리머라아제를 사용하여 퍼킨엘머사의 더말 사이클러를 사용하여 PCR반응을 행해 두가닥 유전자를 얻는다.

별도, 전기 항원을 인식하는 항체 또는 전기 항원과 특이적으로 결합하는 물질을 결합한 입자를 조제한다.

입자로서는 여러 가지 것을 사용할 수 있으나, 쉬드 플로우중에 흘려 분석을 행하는 경우, 입자 크기가 균일한 것이 중요하고, 그 목적을 위하여 입자 크기가 균일한 라텍스입자가 가장 유용하다고 생각된다. 입자 크기에 대해서는 응집비율을 검출할 수 있는 것이면, 특히 제한되지 않는다. 예를 들면 세끼스이가가꾸고교(주)로부터 입수가능한 입자 크기 0.8㎛인 소우프 프리(soap-free)의 폴리스티렌 라텍스등을 사용할 수 있다.

입자표면에 결합하는 항체로서는 여러 가지 것을 사용할 수 있으나, 본발명의 바람직한 양태에서는 증폭된 유전자는 양단에 동일 항원을 갖는 것에서, 그 항원에 대한 단클론항체를 사용할 수 있다. 통상 단일로는 응집법에 사용할 수 없는 단클론항체도, 이 방법을 사용함으로써 1종류로 입자의 응집을 일으킬 수 있게 된다.

상술한 미국특허 제5104791호에서는 목적 유전자에 상보적인 유전자단편을 2종류 사용하여 목적 유전자와 결합시켜 응집을 생기게 한다. 그렇지만 이 방법에서는 목적 유전자마다 다른 2종류의 유전자단편을 입자에 결합하지 않으면 안되는 문제를 안고 있다. 본발명에서는 검출에 사용하는 항체결합입자는 동일한 표지항원을 사용하는 한 1종류로 해결된다는 이점을 가지고 있다. 어떠한 유전자를 검출할 때도 1종류의 입자만으로 검출할 수 있다는 것은 커다란 이점이다.

또한, 본발명에서 사용하는 항체는 목적 유전자에 대한 것은 아니고 임의의 것을 선택할 수 있으므로, 특이성이 높은 것, 또는 측정하고자 하는 시료중에는 판단해서 넣어 이와 같은 항원을 사용하는 것에 의해 목적의 반응을 확실하게 또는 고감도로 행할 수 있는 측정계를 제공하는 것이 가능하다.

또, 본발명에서 사용하는 항원과 특이적으로 결합하는 것이면, 항체에 한하지 않고 입자에 결합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 비오틴-아비딘 또는 스트렙토아비딘, 리간드-수용체, 당사슬-렉틴 또는, 효소-억제자의 특이성 결합을 사용하고, 한쪽을 프라이머에 다른 쪽을 입자에 결합하여 사용할 수 있다. 이때, 항원을 결합한 프라이머가 유전자증폭을 방해하지 않을 필요가 있다.

본발명에서는 상술한 바와 같이, 동일 항원을 프라이머에 결합하는 한, 검출해야 할 목적 유전자가 어떠해도, 검출에 사용하는 항체결합입자는 1종류로 해결된다는 이점을 가지고 있다. 입자상의 항체는 유전자단편에 결합한 항원과 결합하므로, 어떠한 유전자를 검출할 때도 1종류의 입자만으로 검출할 수 있다. 또, 3'말단과 5'말단의 프라이머에 결합하는 항원을 바꿔도 상관없다. 그 경우는 각각의 항원에 대한 항체를 결합한 입자를 준비할 필요가 있다. 시약의 구성을 간단하게 하기 위해서는 프라이머에 결합하는 항원은 동일하게 하는 쪽이 바람직하다.

입자에, 항체 또는 항원과 특이적으로 결합하는 물질을 결합하기 위해서는 당업계에서 공지의 방법, 예를 들면, 물리흡착법, 공유결합법 등을 이용하여 행하는 것이 가능하다. 특히, 물리흡착법은 간단한 조작으로 행할 수 있고, 일반적인 방법으로서는 예를 들면 항체용액을 입자현탁액과 혼합하여, 4℃에서 하룻밤 또는 25℃에서 수시간 반응시켜 행하는 것이 가능하다.

증폭된 두가닥 유전자를 전기 항원을 인식하는 항체 또는 전기 항원과 특이적으로 결합하는 물질을 결합한 입자와 반응시키면, 항원항체반응에 의해 입자의 응집이 생기고, 2량체, 3량체, 4량체 등을 얻을 수 있다. 개개의 응집 또는 미응집입자의 크기를 쉬드 플로우 셀(sheath flow cell)을 통과할 때에 레이저광을 조사하여 생기는 산란광강도를 측정함으로써 응집의 정도를 알 수 있다. 이것들은 예를 들면 상술한 전자동면역측정장치를 사용하면 간편하고 신속하게 측정할 수 있다. 도 2에 이와 같은 전자동면역측정장치를 사용하여 얻어진 입도분포를 예시한다. 응집체의 존재는 시료중에 목적 유전자가 존재하는 것을 나타낸다. 본발명의 방법을 사용하여, 목적 유전자의 존재나 양을 간단하게 측정할 수 있다.

본발명의 유전자검출법을 사용할 수 있는 목적 유전자로서는 DNA뿐만 아니라RNA도 함유한다. 예를 들면 목적 유전자가 mRNA인 경우에는 미리 역전사효소를 사용하여 cDNA를 조제한 후, 유전자증폭을 행하면 좋다.

본발명을 이하의 실시예를 사용하여 상세하게 설명하는데, 본발명의 범위는 이것에 한정되지 않는다.

[실시예]

실시예 1 : 비오틴화 프라이머를 사용한 PCR산물을 검출하는 것에 의한 인간 게놈

DNA의 검출

비오틴화 프라이머의 조제

인간 게놈 DNA중 β글로불린 영역의 DNA(사이키,R.K.등, (1988) 사이언스, 239, 487-491 참조)를 증폭하여, 그 산물을 라텍스응집에 의해 검출했다.

검출하는 시료는 인간의 백혈구이며, 프라이머로는 다카라스조(주)에서 발매되고 있는 β글로불린 프라이머세트 중, PC03과 KM38이라는 프라이머와 동일한 염기배열을 갖고, 그 말단에 비오틴분자를 1분자 결합한 프라이머를 합성하여 비오틴화 프라이머로 사용했다. PC03과 KM38에 의해 증폭된 유전자단편의 크기는 167bp이다.

제작한 프라이머의 염기배열은 아래와 같다.

PC03-Biotin : Biotin-ACACAACTGTGTTCACTAGC

KM38-Biotin : TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-Biotin

상기 비오틴화 프라이머는 ABI사의 자동합성장치를 사용하여 합성했다.

시료조제

시료로서는 인간의 혈액을 사용했다. 항응고제로서 구연산 3나트륨을 사용하며 채취한 혈액을 원심분리(3000rpm. 15분)하고, 버피코트(buffy coat)를 채취했다. 채취한 버피코트를 생리식염수로 희석하여 백혈구수가 10㎕당 약100000, 10000, 1000개의 시료를 작성했다. 백혈구수의 측정에는 자동혈구계수장치 F-800(도아이요우덴시(주))을 사용했다. 혈액중 DNA의 대부분은 백혈구유래이므로, 여기에서 구아니듐 이소티오시아네이트법(분자세포생물학 기초실험법, 난코도)을 사용하여 PCR에 사용하는 DNA샘플을 조제했다.

유전자증폭

PCR은 퍼킨엘머사의 더말 사이클러를 사용하여 행했다.

PCR반응에 사용한 액조성은 아래와 같다 :

완충액(200mM Tris buffer, pH8.4, 15mM MgCl2, 1㎎/㎖ BSA) : 5㎕

정제수 : 39.5㎕

10mM dNTP혼액 : 1㎕

비오틴화 프라이머(각 10μM) : 각 1㎕

PC03-비오틴 :

KM38-비오틴 :

TaqDNA 폴리머라아제(AmpliTaqTM, 다카라스조(주)) : 0.5㎕

추출DNA용액 : 2㎕

PCR반응은 94℃에서 45초, 55℃에서 25초, 72℃에서 3분을 20사이클 행했다.

항비오틴항체결합 라텍스의 조제

입자크기 0.78㎛의 폴리스티렌 라텍스(세끼스이 가가꾸 고교사제)를 10mM PBS, pH7.0 중에 5%(w/v)의 농도로 조제하고, 그것에 항비오틴항체(단클론항체: 바이오디자인사제)를 라텍스분산액 1㎖당 50㎍ 첨가하여 4℃에서 24시간 반응시켰다. 그후 원심(12,000rpm, 10분)을 행하고 1㎎/㎖ BSA를 함유하는 0.1M PBS 완충액을 최초와 동량 첨가하여 입자를 분산시켰다. 다시 한 번 원심처리를 행하여 동일한 완충액중에 분산시켜 항비오틴항체결합 라텍스로 했다.

응집반응

PCR후의 시료 10㎕에 항비오틴항체결합 라텍스입자(0.5%) 10㎕를 첨가하고, 1㎎/㎖의 BSA를 함유하는 0.1M 인산 완충액 80㎕를 가하여 45℃에서 15분간 반응시킨 후 라텍스입자의 응집률을 측정했다. 이 반응 및 측정은 전자동면역측정장치 PAMIA-30(도아이요우덴시(주))을 이용하여 전방산란광강도를 측정했다.

응집률은 전체 입자수에 대한 응집한 입자의 퍼센트로 나타낸다.

측정결과를 이하의 표 1에 나타낸다. 표 1에서 분명한 바와 같이 백혈구수가 10㎕당 1000개의 시료에서도 충분한 응집률이 얻어지고 있다. 또한 백혈구에서의 DNA를 함유하지 않는 시료(PCR에 사용한 액조성에서 추출 DNA(백혈구의 DNA)를 함유하지 않는 것)에서는 라텍스응집이 없고, 백혈구의 DNA를 함유하는 시료에서는 응집이 보인 점에서, 라텍스시약은 PCR산물의 비오틴과 반응함으로써 응집이 생긴 것을 알 수 있다.

[표 1]

실시예 2 : 인간의 헤모글로빈유전자중의 돌연변이의 검출

본발명의 방법을 사용하여 인간의 헤모글로빈유전자의 돌연변이의 검출을 행했다.

비오틴화 프라이머의 조제

프라이머로서는 다카라스조(주)에서 발매되고 있는 β글로불린프라이머세트의 염기배열과 동일한 것을 사용했다. 이것에는 부위가 다른 프라이머가 6종류 판매되고 있고, 그 조합에 따라 9종류 크기의 단편을 증폭할 수 있다.

본실시예에서는 PC03과 PC04라는 프라이머와 동일한 염기배열의 것을 합성하고, 그 말단에 비오틴분자를 1분자 결합한 프라이머를 제작하여 비오틴화 프라이머로 사용했다. PC03과 PC04에 의해 증폭된 유전자단편의 크기는 110bp이다.

제작한 프라이머의 염기배열은 이하와 같다 :

PC03 : Biotin-ACACAACTGTGTTCACTAGC

PC04 : CAACTTCATCCACGTTCACC-Biotin

또, 상기 비오틴화 프라이머는 다카라스조에 합성을 의뢰했다.

시료조제

상술한 프라이머의 조합으로 검출할 수 있는 돌연변이에는 코돈 17 돌연변이체 대립유전자(codon 17 mutant allele)가 있다.

이 돌연변이에서는 넌센스영역에서 A에서 T로의 돌연변이가 일어나 있고, 이 변이에서는 제한효소 Nhe I를 사용하는 것에 의해 RFLP에서의 검출이 가능하다. 즉 정상검체에서는 이 프라이머의 조합으로 가능해 온 PCR산물은 Nhe I에 의해 절단되지 않으므로, 효소반응후에 전기영동을 행해도 밴드는 100bp인 곳에 1개 검출될 뿐이지만, 돌연변이가 일어난 검체에서는 효소에 의해 절단된 부위가 출현하는 것에서 전기영동적으로는 87bp의 밴드가 된다. 헤테로 검체에서는 양쪽의 밴드가 출현하게 된다.

시료의 조제는 Clin, Biochem, 26, 497-503, 1993의 방법에 준하여 행했다. 시료로서는 정상 및 상기 부위에 돌연변이를 갖는 것을 알 수 있는 인간의 혈액을 사용했다. 게놈 DNA의 추출에는 파르마시아(Pharmacia)사의 RapidPrep Genomic DNA Isolation Kits for Blood를 사용하여 PCR에 사용하는 샘플을 조제했다.

유전자증폭

PCR은 퍼킨엘머의 더말 사이클러를 사용해서 행하고, 시약은 다카라스조(주)의 GeneAmp를 사용했다.

PCR반응의 액조성은 이하와 같다 :

완충액(200mM Tris Buffer pH8.4, 15mM MgCl2, 1㎎/㎖ BSA) : 5㎕

정제수 : 39.5㎕

10mM dNTP혼액 : 1㎕

비오틴화 프라이머(각 10μM) : 1㎕

TaqDNA폴리머라아제 : 0.5㎕

PCR반응은 94℃에서 1분, 55℃에서 2분, 68℃에서 2분의 사이클로 35사이클 행했다.

항비오틴항체결합 라텍스의 조제

입자크기 0.78㎛인 폴리스티렌 라텍스를 20mM Tris-buffer, pH7.0중에, 5%(w/v)의 농도로 조제하여, 그것에 항비오틴항체(단클론항체 : 바이오디자인사제)를 라텍스용액 1㎖당 50㎍ 첨가하여 4℃에서 24시간 반응시켰다. 그 후 원심(12,000rpm, 10분)을 행하고 1㎎/㎖ BSA를 함유하는 0.1M PBS용액을 최초와 동량 첨가하여 입자를 분산시켰다. 다시 한번 원심처리를 행하여 동일한 용액중에 분산시켜 항비오틴항체결합 라텍스로 했다.

응집반응

먼저 PCR에 의한 유전자증폭이 행해졌는지 어떤지를 확인하기 위해서, PCR후의 샘플 10㎕에 항비오틴항체결합 라텍스입자(0.5%) 10㎕를 첨가하고, 1㎎/㎖의 BSA를 함유하는 0.1M 인산 완충액 80㎕를 가하여 45℃에서 15분간 반응시킨 후 라텍스입자의 응집률을 측정했다. 측정에는 도아이요우덴시(주)제의 전자동면역측정장치 PAMIA-30을 사용했다.

다음에, 돌연변이의 검출을 행하기 위해서, 동일하게 PCR후의 샘플 10㎕를 취하고, 완충액 10㎕를 첨가한 것과, Nhe I 10유니트를 함유하는 완충액 10㎕를 첨가한 것을 각각 조제하고, 그 양자를 37℃에서 하룻밤 인큐베이트한 것에 대해 각각 상기와 동일한 조작을 행하여 입자와 반응시켜 PAMIA-30에 의한 측정을 행했다.

응집률은 전체 입자수에 대한 응집한 입자수의 퍼센트를 나타낸다.

측정결과를 이하에 나타내는데, 정상검체에서는 제한효소를 반응시켜도 응집률은 변화하지 않았으나, 코돈 17에 돌연변이를 갖는 검체에서는 효소를 반응시키지 않은 샘플의 응집률은 정상검체와 변함이 없지만, 효소를 반응시킴으로써 응집률의 저하가 보였다. 이것은 돌연변이의 검체에서는 변이에 의해 Nhe I의 절단부위가 출현해서, 제한효소에 의해 PCR산물이 잘렸기 때문에, 라텍스에 의한 응집반응이 저하한 것이라고 생각된다. 이것에 의해, 라텍스응집반응을 이용하여 점돌연변이의 검출이 가능하다는 것이 나타났다.

[표 2]

	제한효소를 함유하지 않는 시료	제한효소를 함유하는 시료
정상검체	21.3%	20.4%
돌연변이검체	22.9%	5.6%
응집률(P/T)% : (응집한 입자의 카운트수/전체 입자의 카운트수)×100

본발명을 사용하면, 간편하고 신속하게 또 고정밀도로 증폭후의 유전자를 검출할 수 있다. 본발명의 커다란 이점은 항원을 인식하는 항체 또는 항원과 특이적으로 결합하는 물질을 결합한 입자를 조제해 두면, 목적 유전자의 종류에 상관없이, 이것을 이용하여 목적 유전자의 존재나 양을 측정할 수 있는 점이다. 또한, 본발명의 유전자검출법은 동위체를 사용하지 않으므로 안전하다. 본발명의 유전자검출법은 DNA뿐만 아니고, RNA의 검출에도 사용할 수 있으므로, 에이즈나 간염 등의 많은 병기의 진단, 특히 다수의 시료의 진단을 신속하게 행하는 것에 매우 유용하다.

다시, 본발명의 유전자중의 돌연변이를 검출하는 방법을 사용하면, 종래 RFLP법등으로 검출했던 돌연변이를 훨씬 단시간에 간편하게 검출할 수 있다.

Claims

항원 또는 항체를 결합한 유전자단편을 사용하여 증폭된 두가닥 유전자를, 전기 항원 또는 항체를 인식하는 항체 또는 항원을 결합한 입자, 또는 전기 항원 또는 항체와 특이적으로 결합하는 물질을 결합한 입자와 반응시켜, 입자의 응집정도를 측정함으로써 목적 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 유전자검출법.
항원 또는 항체를 결합한 유전자단편을 사용하여 증폭된 두가닥 유전자를, 전기 항원 또는 항체를 인식하는 항체 또는 항원을 결합한 입자, 또는 전기 항원 또는 항체와 특이적으로 결합하는 물질을 결합한 입자와 반응시켜, 입자의 응집정도를 측정함으로써 목적 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 유전자검출법에 있어서,

상기 증폭에 사용하는 유전자상에 돌연변이부위가 있을 때에, 그 돌연변이부위의 존재에 따라 절단양식이 변화하는 제한효소를 작용시켜, 그 제한효소가 유전자를 선택적으로 절단하게 하고, 그 결과 생기는 입자의 응접정도의 변화를 검출함으로써, 유전자의 돌연변이를 검출하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 입자가 입자크기가 균일한 라텍스인 것을 특징으로 하는 유전자검출법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 쉬드 플로우 셀(sheath flow cell)중에 흐르는 입자에 빛을 조사하여 생기는 산란광의 강도로부터 응집정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 유전자검출법.
제4항에 있어서, 산란광이 전방산란광인 유전자검출법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자단편에 결합하는 것이 항원이며, 입자표면에 결합하는 것이 전기한 항원을 인식하는 항체인 유전자검출법.
제6항에 있어서, 항원이 합텐인 유전자검출법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 항체가 단클론항체인 유전자검출법.
제6항 내지 제8항의 어느 한 항에 있어서, 유전자단편에 결합하는 항원이 1종류이고, 입자표면에 결합하는 항체가 1종류의 단클론항체인 유전자검출법.