JPWO2008007773A1 - 微粒子の検体検出活性の確認方法 - Google Patents

微粒子の検体検出活性の確認方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、二種以上のリガンドを含む標準検体と、各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子とを混合して、生じた凝集物の光学的性質を検出することを特徴とする微粒子の検体検出活性の確認方法、および前記標準検体と前記微粒子とを備えることを特徴とする検体検出キット、並びに前記確認方法で微粒子の検体検出活性の確認を行った後、該微粒子中の受容体と特異的に結合する二種以上のリガンドを含む検体と該微粒子とを混合して、生じた凝集物の光学的性質を検出し、次いで前記微粒子の検体検出活性の確認を再度行うことを特徴とする検体の定量方法であり、核酸等をはじめとする生体関連物質の検体の検出に好適な試薬の検体検出活性の確認方法および該確認方法を利用する検体の定量方法ならびに該試薬を含む検体検出キットの提供に関する。

Description

本発明は、核酸等の検体の検出に好適な微粒子の検体検出活性の確認方法および該確認方法を利用する検体の定量方法ならびに該微粒子を含む検体検出キットに関する。
本願は、2006年7月13日に、日本に出願された特願2006−192741号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
従来、測定対象物としての検体を検出する方法としては、検体を検体検出試薬である分散性微粒子と特異的に結合させて検出する方法が知られている。例えば、濃度既知のタンパク質を標準検体として、タンパク質を定量する方法が知られている(特許文献1参照)。具体的には、例えば、健康診断等で行われる血液検査において、各検査項目を測定する時に、標準血清が標準検体として使用されている。
一方、検体が核酸である場合の検体検出方法も提案されている(特許文献2参照)が、前述のタンパク質定量法で用いるような、標準検体が定められていない。
また、核酸を標準検体として用いる方法としては、例えば、人工的な合成ポリヌクレオチドを核酸増幅工程の標準検体とする方法(特許文献3参照)、遺伝子発現分析においてゲノムDNAの遺伝子を基に標準検体を調製する方法(特許文献4参照)が報告されている。
そして、このような検体検出方法においては、検体検出試薬が正常な検出活性を有していることが必要である。
特開平6−167495号公報 特許第3545158号公報 特開2003−265190号公報 特表2004−532034号公報
しかし、特許文献3および4に記載されている標準検体は、リアルタイムPCR等の核酸増幅工程における核酸増幅量を確認するために用いられる。そして、標準検体の種類に応じて、検出するシグナルが蛍光、発光、電気泳動、凝集、吸光度等種々の場合がある。特許文献3および4に記載されている方法は、検出方法および検出システムの変更が必要で、汎用性が低いという問題点がある。そして、検体である核酸を分散性微粒子と特異的に結合させて検出する場合、適切な標準検体はこれまで報告されていない。また、生体由来の遺伝子を標準検体として用いる場合には、その保存状態および検出工程における条件次第で、分解したり、精製が困難であったり、異物混入が起こったりする可能性がある。
このように、汎用性のある核酸検出用の適切な標準検体が無いため、標準検体および検体の検出に用いる試薬が正常な検出活性を有しているか確認することが困難であり、核酸検出値の更正も困難であるという問題点がある。
そこで、分解や異物混入等の怖れが無い標準検体、およびその簡便な使用法やキットがあれば、上記課題を解決する事ができる。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、核酸等をはじめとする生体関連物質の検体の検出に好適な試薬の検体検出活性の確認方法および該確認方法を利用する検体の定量方法ならびに該試薬を含む検体検出キットを提供することを課題とする。
上記課題を解決するため、本願に係る第1の発明は、二種以上のリガンドを含む標準検体と、各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子とを混合して、生じた凝集物の光学的性質を検出する微粒子の検体検出活性の確認方法である。
本願に係る第2の発明は上記第1の発明において、前記標準検体と前記微粒子との混合を緩衝液中で行う微粒子の検体検出活性の確認方法である。
本願に係る第3の発明は上記第2の発明において、前記標準検体と前記緩衝液とを混合してから、該混合液に前記微粒子を添加する微粒子の検体検出活性の確認方法である。
本願に係る第4の発明は上記第2の発明において、前記微粒子と前記緩衝液とを混合してから、該混合液に前記標準検体を添加する微粒子の検体検出活性の活性確認方法である。
本願に係る第5の発明は上記第1〜4の発明において、前記微粒子が磁性微粒子であり、生じた凝集物に磁力を印加する微粒子の検体検出活性の確認方法である。
本願に係る第6の発明は上記第1〜5の発明において、前記標準検体と前記微粒子とを、4〜40℃で混合する微粒子の検体検出活性の確認方法である。
本願に係る第7の発明は上記第1〜6の発明において、微粒子の検体検出活性の確認方法で検出された標準検体の検出値を、該標準検体と同一種類かつ同濃度である標準検体の既知の検出値と比較する微粒子の検体検出活性の確認方法である。
本願に係る第8の発明は上記第1〜6の発明において、微粒子の検体検出活性の確認方法を、濃度既知の標準検体を用いて任意の時間経過ごとに行う微粒子の検体検出活性の確認方法である。
本願に係る第9の発明は上記第1〜6の発明の方法において、微粒子の検体検出活性の確認を行った後、該微粒子中の受容体と特異的に結合する二種以上のリガンドを含む検体と該微粒子とを混合して、生じた凝集物の光学的性質を検出し、次いで前記微粒子の検体検出活性の確認を再度行う検体の定量方法である。
本願に係る第10の発明は上記第1〜6の発明の方法において、同一種類でかつ既知の異なる複数濃度の標準検体を用いて微粒子の検体検出活性の確認を行い、標準検体検出値と標準検体濃度との関数を導出し、該標準検体中のリガンドと同一種類かつ同一数のリガンドを含む検体と該微粒子とを混合した時の検体検出値と前記関数とから、検体を定量する検体の定量方法である。
本願に係る第11の発明は、二種以上のリガンドを含む標準検体と、各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子とを備える検体検出キットである。
本願に係る第12の発明は、二つ以上のリガンドを含む二種以上の混合した標準検体と、各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子を備える検体検出キットである。
本願に係る第13の発明は上記第11または12の発明において、前記標準検体中のリガンドがハプテンである検体検出キットである。
本願に係る第14の発明は上記第11〜13の発明において、前記標準検体中のリガンドの種類が、検体中のリガンドの種類と同じである検体検出キットである。
本願に係る第15の発明は上記第11〜14の発明において、前記標準検体中のリガンドの数および種類が、検体中のリガンドの数および種類と同じである検体検出キットである。
本願に係る第16の発明は上記第11〜15の発明において、前記標準検体が、検体と同じ種類である検体検出キットである。
本願に係る第17に記載の発明は上記第11〜16の発明において、前記標準検体中のリガンドが、分子量180〜60000の分子からなる検体検出キットである。
本願に係る第18の発明は上記第11〜17の発明において、前記標準検体中のリガンドが、少なくとも0〜100℃の温度範囲で、前記微粒子中の受容体との特異的結合能を有する検体検出キットである。
本願に係る第19の発明は上記第11〜18の発明において、前記標準検体中のリガンドが、蛍光物質、ジゴキシゲン、アミノ酸残基数が6以上のポリペプチド、単糖が2以上結合した糖鎖、ビオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、ヒアルロン酸(HA)、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、配列番号1で表されるペプチドおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる一種以上である検体検出キットである。
本願に係る第20の発明は上記第11〜19の発明において、前記標準検体中に、鎖状構造を有する高分子物質が含まれる検体検出キットである。
本願に係る第21の発明は上記第20の発明において、前記高分子物質が水溶性である検体検出キットである。
本願に係る第22の発明は上記第20または21の発明において、前記高分子物質が、その主鎖または側鎖の末端に前記リガンドを有する検体検出キットである。
本願に係る第23の発明は上記第20〜22の発明において、前記高分子物質が、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリアクリル酸誘導体、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアミドおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる一種以上である検体検出キットである。
本願に係る第24の発明は上記第20〜23の発明において、前記高分子物質の主鎖の長さが15〜200nmである検体検出キットである。
本願に係る第25の発明は上記第20〜24の発明において、前記標準検体と前記微粒子との混合に用いる溶液中において、前記高分子物質が直鎖状である検体検出キットである。
本願に係る第26の発明は上記第11〜25の発明において、前記標準検体の分子の長さが、検体の分子の長さに対して80〜120%である検体検出キットである。
本願に係る第27の発明は上記第11〜26の発明において、前記標準検体が、既知の異なる複数濃度で備えられている検体検出キットである。
本願に係る第28の発明は上記第27の発明において、前記複数の標準検体の濃度が1pM〜1μMの範囲である検体検出キットである。
本願に係る第29の発明は上記第11〜28の発明において、前記微粒子の粒径が0.1〜10μmである検体検出キットである。
本願に係る第30の発明は上記第11〜29の発明において、前記微粒子が磁性微粒子である検体検出キットである。
本願に係る第31の発明は上記第30の発明において、前記磁性微粒子の粒径が0.1〜20μmである検体検出キットである。
本願に係る第32の発明は上記第11〜31の発明において、前記標準検体と前記微粒子との混合に用いる溶液が備えられている検体検出キットである。
本発明によれば、核酸等をはじめとする生体関連物質の検体の検出に好適な微粒子の検体検出活性を、簡便で迅速且つ精度良く確認することができる。そして検体を、簡便で迅速且つ精度良く検出することができる。例えば、血液中あるいは凍結または固定化処理した組織検体中に含まれる核酸、あるいは該核酸を処理した検体の検出に本発明は好適である。したがって本発明は、例えば、臨床検査の簡便化と迅速化に有用であり、さらに検体の簡易検査から全自動分析に至るまで、幅広く応用することも可能である。
標準検体を調製する方法を示す概念図である。 標準検体を調製する方法を示す概念図である。 標準検体を調製する方法を示す概念図である。 標準検体を調製する方法を示す概念図である。 受容体が結合された微粒子を示す図である。 受容体が結合された微粒子を示す図である。 標的核酸と連結されて凝集を生じる時の微粒子を示す概念図である。 両5’末端がビオチンで修飾されたPCR産物を示す図である。 両5’末端がFITCで修飾されたPCR産物を示す図である。 一方の5’末端がビオチンで、他方の5’ 末端がFITCでそれぞれ修飾されたPCR産物を示す図である。
符号の説明
30 標準検体
31 第一のリガンド
32 第二のリガンド
33 第一の微粒子
331 第一の受容体
34 第二の微粒子
341 第二の受容体
以下、本発明について、詳しく説明する。なお、以下においてリガンドとは、特に断りのない限り標準検体に含まれるリガンドを指すものとする。
本発明において、標準検体とは、二種以上のリガンドを含み、主として一分子または複数分子からなる一会合体である。そして微粒子とは、分散性微粒子であって、標準検体中の各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子を用いる。ここで光学的に区別できるとは、具体的には例えば、色が異なること、すなわち光の吸収・反射・散乱、発光、蛍光等の波長が異なること、あるいは粒径が異なること、形状が異なること、材質が異なること等を指す。例えば、微粒子の色および濃度が同じであっても、微粒子の粒径が異なれば光の透過率が異なるので、これら微粒子を光学的に区別可能となる。また、微粒子の形状が異なれば光散乱の程度が異なるので、これら微粒子を光学的に区別可能となる。また、微粒子の材質が異なれば、微粒子の表面物性が異なることで光学特性が異なるので、これら微粒子を光学的に区別可能となる。本発明において用いる微粒子には、ここに挙げたものをはじめ、光学的に区別できる要素を複数有しているものを用いることもできる。そして、微粒子はリガンドおよび受容体を介して前記標準検体と結合するのであり、一つの微粒子に複数の標準検体が結合し、さらに標準検体のそれぞれが他の微粒子と結合することによって、多数の微粒子が互いに連結された結果、微粒子の凝集が生じる。以下において、標準検体と微粒子との結合とは、特に断りの無い限り、前述のリガンドおよび受容体を介した結合のことを指す。
なお、本発明において特異的な結合とは、例えば、DNAやRNAの相補的なヌクレオチド配列間の安定な二重鎖の形成(ハイブリダイゼーション)や、抗原と抗体あるいはビオチンとアビジン等のように、特定の物質間で選択的に形成される、特異性の高い分子間力に基づく結合を意味する。
そして、生じた凝集物の光学的性質を検出することで、微粒子の検体検出活性が正常であるか否かの確認を行う。光学的性質の検出は、具体的には、例えば、紫外可視赤外領域の透過率または吸光度の測定、蛍光測定、発光測定、光学顕微鏡観察等により行うことができ、その検出値により、微粒子の検体検出活性を判断する。
微粒子の検体検出活性が正常であれば、生じた凝集物の光学的性質は、標準検体と結合すべきすべての種類の微粒子の光学的性質を反映する。一方、生じた凝集物の光学的性質が、標準検体と結合すべき微粒子のいずれかの種類の光学的性質を反映していなければ、光学的性質が反映されていない微粒子に検体検出活性の異常がある。例えば、光学的に区別できる二種以上の微粒子として、色の異なる微粒子を用いた場合、これら微粒子の検体検出活性に異常がなければ、生じた凝集物の色はこれらすべての微粒子の色の混色となる。しかし、いずれかの微粒子の検体検出活性に異常があれば、凝集物の色は、用いたすべての微粒子の色の混色とならない。
標準検体には、検出対象の検体の種類に応じて種々のものを選択して用いることができるが、生体関連物質が好適である。生体関連物質とは、生体から抽出、単離等された物質であり、生体から直接抽出されたものだけでなく、これらを化学処理あるいは化学修飾等したものも含まれる。例えば、核酸、タンパク質等およびこれらの化学処理物あるいは化学修飾物等を挙げることができる。例えば、核酸であれば、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを含む全ての核酸および核酸類似体を挙げることができ、天然に存在する核酸であっても、人工的に合成された核酸であってもよい。タンパク質であれば、例えば、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、複数のエピトープを有するタンパク質を挙げることができ、天然に存在するタンパク質であっても、人工的に合成されたタンパク質であってもよい。なかでも、本発明においては核酸が好適である。また、ここに挙げたもの以外の水溶性高分子化合物も、好適に用いることができる。本発明において標準検体とは、生体関連物質に、微粒子中の受容体と特異的に結合するリガンドが含まれたものである。
リガンドを含む標準検体は、従来公知の方法により調製することができる。一例として、図1を用いて、二種のリガンドを含む核酸である標準検体30の調製方法について説明すると、(i)対象となる核酸10に、光やプラチナを用いてあるいはリンカーを介して該核酸の塩基および/または5’末端に第一のリガンド31および第二のリガンド32を共有結合させる方法(図1A)、一例を挙げると、核酸の5’末端の塩基のアミノ基と、リガンドのカルボキシル基とを共有結合させる方法;(ii)核酸合成時に第一のリガンド31を結合させた第一のプライマー11、および第二のリガンド32を結合させた第二のプライマー12を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により塩基配列を伸長させる方法(図1B);(iii)PCR法において、第一のリガンド31を結合させたヌクレオチド13を少なくとも一つ、および第二のリガンド32を結合させたヌクレオチド14を少なくとも一つ、それぞれ取り込ませながら塩基配列を伸長させる方法(図1C);(iv)ターミナルデオキシジルトランスフェラーゼを用いて、第一のリガンド31または第二のリガンド32を結合させたヌクレオチドを、核酸の3’末端にテーリングする方法(図1D)等の各種方法を挙げることができる。
生体試料または任意の被検体等のように、対象となる核酸が他の核酸と共に存在する試料を用いる場合は、前記(ii)および(iii)の方法が好適である。対象となる核酸が単独で存在する場合には、何れの方法を用いてもよい。なお、例えば、生体試料等に含まれる対象となる核酸は、PCR法によって増幅させてから標準検体の調製に供しても良いが、増幅させずにそのまま標準検体の調製に供してもよい。
図1においては、標準検体として、二種のリガンドを含む二本鎖の核酸を調製する例を示しているが、前記(i)および(iv)の方法は、標準検体として、二種のリガンドを含む一本鎖の核酸を調製する場合にも適用することができる。そして、(i)〜(iv)の方法はいずれも、二種以上のリガンドを含む核酸の調製にも適用することができる。
核酸以外の、例えば、タンパク質、核酸およびタンパク質以外の水溶性高分子化合物等を標準検体に用いる場合にも、リガンド中の官能基を、これらタンパク質、水溶性高分子化合物等に含まれる官能基と共有結合させるなど、従来公知の手法により、標準検体を調製することができる。
リガンドは、微粒子中の受容体と特異的に結合するものであれば、特に限定されないが、好ましいものとして例えば、親水性有機化合物、ハプテン、ジゴキシゲン、フルオロセイン、アレクサ、フルオロセインイソチオシアネート(FITC)、2,4−ジニトロフェノール(DNP)、テトラメチルローダミン(TAMRA)、アミノ酸残基数が6以上のポリペプチド、単糖が2以上結合した糖鎖、ビオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、ヒアルロン酸(HA)、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、配列番号1で表されるペプチド(Flag)およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる一種以上を挙げることができる。
ビオチン、ジゴキシゲン、フルオロセイン、アレクサ、DNPなどは市場からの入手が容易で低価格という利点がある。また、糖鎖やペプチドは化学構造のデザインに自由度が高く、複数種類をそろえることが容易であるという利点がある。
標準検体中のリガンドの数は、一種につき一つでも複数でも良く、標準検体の検出方法に応じて選択すれば良い。また、リガンドを設ける標準検体中の位置も、リガンドと受容体との特異的結合が妨げられない限り特に限定されず、標準検体の調製のし易さを考慮して、適宜選定すれば良い。例えば、標準検体が核酸である場合には、その5’末端部位が好適である。
また、標準検体が複数分子からなる一会合体である場合には、該会合体中の一分子だけにリガンドが含まれていても良いし、複数分子にリガンドが含まれていても良い。
リガンドは、標準検体と微粒子との混合で汎用される温度範囲、すなわち、少なくとも0〜100℃の温度範囲で、前記微粒子中の受容体との特異的結合能を有することが好ましい。より好ましくは4〜40℃であり、さらに好ましくは18〜38℃の温度範囲である。
後述するように、本発明の微粒子の検体検出活性の確認方法を利用することで、検出対象の検体の定量を行うことができる。
この場合、標準検体中のリガンドの種類は、検体中のリガンドの種類と同じであることが好ましく、標準検体中のリガンドの数および種類がいずれも、検体中のリガンドの数および種類と同じであることがより好ましい。このようにすることで、検定の定量をより高精度に行うことができる。
標準検体は、その中に鎖状構造を有する高分子物質を含むものが好ましい。具体的には、標準検体中にその一部として鎖状構造を有する高分子物質が含まれているものでも良いが、標準検体自体が鎖状構造を有する高分子物質であることがより好ましい。そして、主鎖または側鎖の末端に前記リガンドを有する高分子物質は、その調製が容易であり、標準検体中のリガンドの数を規定し易いことから、好適に用いられる。
前記高分子物質としては、好ましいものとして、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリアクリル酸誘導体、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアミドおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる一種以上のものが挙げられる。このような高分子物質としては、例えば、鎖状構造の末端にリガンドが結合されたポリエチレングリコール、ポリペプチドおよびポリサッカライド等を挙げることができる。また、リガンドが結合された合成ポリヌクレオチドも調製が容易であり、前述のように、5’末端にリガンドが結合されたプライマーを用いて、PCR法を行うことで、5’末端にリガンドが結合された核酸を容易に得られる。これら5’末端にリガンドが結合された核酸はいずれも、調製が容易で、標準検体中のリガンドの数の規定も容易なものの一例である。
前記高分子物質の主鎖の長さは、15〜200nmであることが好ましい。より好ましくは20〜180nmであり、さらに好ましくは45〜100nmである。主鎖が核酸である場合には、核酸塩基数は500塩基対(bp)以下であることが好ましく、50〜250bpであることがより好ましい。より好ましくは55〜200bpであり、さらに好ましくは58〜120bpである。リガンドが含まれている分子の分子長は、リガンドと受容体との間の特異的結合の形成し易さに影響を及ぼすため、高分子物質にリガンドが結合されている場合には、主鎖の長さをこのようにすることで、特異的結合の形成が容易となる。
また、本発明においては標準検体として生体関連物質が好適であり、このような生体関連物質をはじめとする水溶性物質を標準検体として用いる際は、前記高分子物質は水溶性であることが好ましい。
また、前記標準検体と前記微粒子との混合に用いる溶液中において、前記高分子物質は直鎖状であることが好ましい。直鎖状ではなく、例えば環状等であると、リガンドが該溶液中において露出されにくく、受容体との特異的結合が困難になる場合がある。
標準検体の分子の長さは、検出対象である検体の分子の長さと同程度であることが好ましい。具体的には、標準検体の分子の長さは、検体の分子の長さに対して80〜120%であることが好ましい。より好ましくは90〜110%であり、さらに好ましくは95〜105%である。このようにすることで、検体の定量をより高精度に行うことができる。
前記特異的結合を、抗原および抗体間等で形成する場合、リガンドには特異的結合を可能とする適度な大きさが必要である。例えば、分子量180〜60000の分子からなるリガンドが好ましい。より好ましくは180〜10000であり、さらに好ましくは180〜1000の分子量である。
本発明で用いる微粒子とは分散性微粒子のことであり、例えば、コロイド粒子のように溶液中で分散する微粒子を意味し、ラテックス粒子が好適に用いられるが、これに限定されない。
そして、微粒子には、標準検体中の各リガンドと特異的に結合する受容体が含まれる。
受容体としては、例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジン等を用いることができるが、これらに限定されない。なかでも、タンパク質、特に抗体が好適に用いられる。
微粒子に含まれる受容体は一種でも良いが、二種以上として微粒子が標準検体中の複数種類のリガンドと結合できるようにしても良い。
図2に本発明で用いる微粒子の一例を示す。ここで示しているのは、第一のリガンドおよび第二のリガンドの二種のリガンドを含む標準検体の検出に用いる微粒子である。図2Aは、第一のリガンドと特異的に結合する第一の受容体331のみを複数含む第一の微粒子33を示す図であり、図2Bは、第二のリガンドと特異的に結合する第二の受容体341のみを複数含む第二の微粒子34を示す図である。なお、図2Aおよび図2Bはいずれも平面図であり、第一の受容体331および第二の受容体341はいずれも6個図示されているが、必ずしも6個に限定されない。また、第一の微粒子33と第二の微粒子34は、互いに光学的に区別可能な微粒子である。
微粒子の粒径は、0.1μm〜10.0μmであることが好ましい。より好ましくは0.1μm〜1μmであり、さらに好ましくは0.1μm〜0.35μmである。このような粒径の微粒子を用いれば、安定した凝集物が得られ易い。
ラテックス粒子は主にポリスチレンから成り、親水性と分散性とを高めるためメタクリル酸が共重合されている。ラテックス粒子には、表面に官能基がないプレーンタイプと官能基を有する官能基タイプがある。プレーンタイプの表面の荷電はメタクリル酸の存在のため負の電荷を有しており、タンパク質分子中の正の電荷を持つ領域とイオン結合することができる。また、タンパク質分子と疎水結合させることも可能である。プレーンタイプのラテックス粒子はタンパク質と混合するだけでタンパク質を吸着するので、タンパク質の固定操作が容易である。受容体としては、後述のように種々のものを用いることができるが、各種タンパク質を用いる場合に、このように、微粒子としてプレーンタイプのラテックス粒子が好適に用いられる。
官能基を有するラテックス粒子は、表面にカルボキル基やアミノ基等が露出するように設計されており、様々なタイプの官能基タイプラテックス粒子が利用可能である。官能基タイプラテックス粒子に受容体を結合させる場合は、官能基タイプラテックス粒子中の官能基と、受容体の官能基を結合させれば良く、従来公知の方法を適用することができる。例えば、水溶性カルボジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させるEDAC方法、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)とN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)とをあらかじめ混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる方法、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する方法、活性化したアルデヒド基やトシル基と受容体中の官能基を結合する方法等がある。本発明においては、本発明の効果を損なわない範囲で従来公知のいかなる方法を用いてもよいが、特にEDAC法が好ましい。そして、プレーンタイプのラテックス粒子同様、受容体として各種タンパク質を用いる場合に、官能基タイプラテックス粒子は好適に用いられる。
なお、ラテックス粒子以外の微粒子であっても、微粒子の種類に応じて、従来公知の方法によって受容体を結合することができる。
また微粒子は、光学的に区別できる二種以上の微粒子を用いるが、微粒子への光学的性質の付与は、従来公知の方法に従って行うことができる。例えば、色の異なる微粒子を用いる場合には、あらかじめそれぞれの色に染色済みの前記材質を成型して微粒子を作製しても良く、微粒子成型後にそれぞれの色に染色して作製しても良い。粒径の異なる微粒子、形状の異なる微粒子を用いる場合には、それぞれ所定の粒径、所定の形状に成型して作製すれば良い。そして、材質の異なる微粒子を用いる場合には、所定の材質を用いて作製すれば良い。さらに、このように粒径、形状、材質が異なる成型済みの微粒子表面に、ポリマー等のコーティング処理を施しても良い。
本発明においては、微粒子として磁性微粒子を用いることもできる。この場合、生じた凝集物に磁力を印加することで、該凝集物の集積、溶液との分離、および余雑な共雑物の除去が容易となり、凝集物の光学的性質の確認が一層容易となる。
用いる磁性微粒子としては、例えば、四三酸化鉄(Fe3 4 )、三二酸化鉄(γ−Fe2 3 )、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属あるいはコバルト、ニッケル、マンガンなどを含む合金からなる磁性微粒子、またはこれら磁性微粒子を内部に含んだポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、若しくはポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ(2−オキシエチルアクリレート)、ポリ(2−オキシエチルメタクリレート)、ポリ(2,3−ジオキシプロピルアクリレート)、ポリ(2,3−ジオキシプロピルメタクリレート)、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、または前記重合体のモノマーの2−4種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソーム、あるいは前記磁性微粒子をラテックス、ゼラチン、リポソームなどの表面に固定化した粒子などが挙げられる。磁性微粒子への光学的性質の付与は、前述の方法を適用することができる。
磁性微粒子の粒径は特に限定されないが、0.1μm〜20μmであることが好ましい。より好ましくは0.1μm〜1μmであり、さらに好ましくは0.1μm〜0.35μmである。
磁性微粒子に、受容体を結合する方法としては、該受容体を物理的に吸着させる方法、あるいは化学的に担持させる方法が挙げられる。
物理的に吸着させる方法としては、例えば、磁性微粒子に、受容体を直接吸着させて固定化する方法、受容体をアルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定化する方法が挙げられる。
化学的に担持させる方法としては、例えば、磁性微粒子の表面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などの各種官能基を活性化して、受容体上の各種官能基と結合させて、直接磁性微粒子上に受容体を固定化する方法;磁性微粒子と受容体とをスペーサー分子を介して化学結合させることで固定化する方法;アルブミンなどの他のタンパク質に受容体を化学結合させた後、該タンパク質を磁性微粒子に化学結合させる方法が挙げられる。ここで化学結合させる方法は、いずれも従来公知の方法を適用すれば良い。また前記スペーサー分子としては、例えば、アルキル鎖、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリサッカライド、ポリアクリル酸誘導体、ポリアミド等が挙げられる。
標準検体と微粒子とを混合した時に凝集物が生じる過程について、二種のリガンドを含む核酸を標準検体として用いた場合を例に採り、図3を用いて詳しく説明する。
図3中、符号30は標準検体であり、標準検体30の一方の5’末端には第一のリガンド31が結合され、他方の5’末端には第二のリガンド32が結合されている。また、符号33は、第一の微粒子であり、第一のリガンド31と特異的に結合する第一の受容体331のみを複数含んでいる。そして、符号34は、第二の微粒子であり、第二のリガンド32と特異的に結合する第二の受容体341のみを複数含んでいる。標準検体30は、第一のリガンド31と第一の受容体331との結合を介して第一の微粒子33と結合し、第二のリガンド32と第二の受容体341との結合を介して第二の微粒子34と結合している。そして、ここでは図示を省略しているが、前記第一の微粒子33および第二の微粒子34はそれぞれ、リガンドと受容体との結合を介して複数の標準検体と結合し、これら複数の標準検体もまたそれぞれ第一の微粒子および第二の微粒子と結合する。このようにして、多数の微粒子が互いに連結された結果、微粒子の凝集が生じる。なお、図3において受容体から延ばされた点線は、結合された標準検体を簡易的に表している。そして、第一の受容体331および第二の受容体341はいずれも6個図示されているが、必ずしも6個に限定されない。
また、第一の微粒子33と第二の微粒子34は、互いに光学的に区別可能な微粒子であり、生じる凝集物は、これら微粒子の光学的性質をいずれも反映した凝集物である。
標準検体が複数種類あり、例えば、標準検体に含まれる二種以上のリガンドが、これら標準検体の種類ごとに異なる場合には、複数種類のうちの一種の標準検体に含まれるリガンドと特異的に結合する受容体を含む微粒子のみを混合に供すれば、当該一種の標準検体を選択的に検出することができる。同様に、標準検体中の二種以上のリガンドと特異的に結合する受容体を含む微粒子を、各標準検体ごとに調製し、これら微粒子を混合に供すれば、複数種類の標準検体を同時に検出することができる。
このように、混合に供する微粒子を適宜選択すれば、標準検体を単独で、あるいは複数種類を同時に検出することができる。
なお、本発明における標準検体または検体の検出とは、標準検体または検体を微粒子と結合させて生じた凝集物の光学的性質を検出することを指す。
また、標準検体中の二種以上のリガンドは、前述のように標準検体の種類ごとに全て異なるリガンドを用いても良いが、二種以上のうちの例えば一種のリガンドを、複数種類の標準検体の間で共通のリガンドとしても良い。このようにすることで、検出工程を簡略化することができる。
さらに、微粒子の凝集反応は2種以上の標準検体を混合した条件においても特異的である。そのため、2種以上の標準検体を混合し、これを用いて任意の微粒子が凝集するとき、凝集素となる1種類の標準検体の反応は、他の種類の標準検体により阻害されない。よって、2種以上の標準検体を混合することで、複数種の微粒子を検出・測定できる共通化した標準検体を提供することができる。標準検体の共通化により、検体の数や準備の手間を削減することができる。
標準検体と微粒子との混合を行う時の温度、時間、用いる溶液は、リガンド−受容体の組み合わせの種類等を考慮し、状況に応じて適宜選択すれば良い。
標準検体として生体関連物質等の水溶性物質を用いる場合には、緩衝液等の水溶液を用いることが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸、トリス、HEPES、MOPS、MOPSO、CHAPS、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Earle、Hanks等が挙げられる。そして、例えば、標準検体が核酸である場合には、微粒子との混合は、緩衝液中において4〜40℃で、5〜30分行うことが好ましい。より好ましくは15〜40℃であり、さらに好ましくは18〜28℃、または36〜38℃の温度範囲である。18〜28℃は室温であり、36〜38℃は生体反応の一般的な至適温度である。
同じ種類の標準検体および微粒子を用いて、標準検体の検出を複数回行う場合には、より高精度な検出値を得るために、標準検体と微粒子との混合は同一条件で行うことが好ましい。
一方、混合を行う時間を変えて標準検体の検出値の経時変化を追跡することで、標準検体と微粒子との結合による凝集物生成の終了点を確認することもできる。
標準検体と微粒子との混合は、溶液中で行う限り、その混合方法は特に限定されない。
例えば、溶液中に標準検体溶液および微粒子を添加しても良いし、溶液中に標準検体溶液および微粒子分散液を添加しても良い。また、標準検体溶液および微粒子分散液を混合するだけでも良い。なかでも、標準検体溶液および微粒子分散液を調製し、これらを混合に供することが好ましい。溶液中に標準検体溶液および微粒子分散液を添加する場合には、標準検体溶液および微粒子分散液の調製に用いる溶液は、これらの添加を行う溶液と同種類であることが好ましい。溶液としては、前記緩衝液を用いることが好ましい。
標準検体と微粒子とを混合する場合、混合を行う溶液中での標準検体または微粒子の濃度が高過ぎると、標準検体と微粒子との結合が阻害されることがプロゾーン効果として知られている。したがって、凝集物の光学的性質を高精度に検出するためには、標準検体および微粒子の混合前に、標準検体溶液および/または微粒子分散液の濃度を調製して、標準検体と微粒子との結合が適切に行なわれるようにすることが好ましい。例えば、具体的には、標準検体と緩衝液とを混合して濃度調製してから、該混合液に微粒子を添加する方法、あるいは微粒子と緩衝液とを混合して濃度調製してから、該混合液に標準検体を添加する方法が好ましい。微粒子は微粒子分散液として、標準検体は標準検体溶液として用いることがより好ましい。
混合に供する標準検体と微粒子との量関係としては、例えば、微粒子の濃度が0.001〜0.2質量%である場合には、標準検体の濃度は1pM〜1μMであることが好ましい。
前述のように標準検体と微粒子とを混合して、生じた凝集物の光学的性質を検出することで、微粒子の検体検出活性を確認することができる。そして、この時の標準検体の検出値を、該標準検体と同一種類かつ同濃度である標準検体の既知の検出値と比較することで、微粒子の検体検出活性の確認を容易に行うことができる。
例えば、微粒子の製造ロットごとに、各ロットの微粒子を用いた時の標準検体の検出値を、該標準検体と同一種類かつ同濃度である標準検体の既知の検出値と比較することで、製造ロット間における微粒子の検体検出活性のばらつきの有無を確認することができる。
同様に、販売先で保存中の微粒子を用いた時の標準検体の検出値を、微粒子製造元が保有している標準検体の既知の検出値と比較することで、販売先で保存中の微粒子の検体検出活性の異常の有無を確認することができ、不良品微粒子の使用を未然に防止することができる。このように、本発明の検体検出活性の確認方法は、微粒子の品質管理に有効である。
また、濃度既知の標準検体を用いて、任意の時間経過ごとに微粒子の検体検出活性の確認を行うことで、定期的に微粒子の検体検出活性が正常であるか否かを確認することができる。ここで、微粒子の検体検出活性の確認を行う時期は、目的に応じて任意に設定すれば良い。
この場合、例えば、検体検出活性の確認と並行して、この確認に用いた光学的に区別可能な微粒子を、それぞれ単独で検体検出に用いて検出値を確認すれば、検体検出活性の低下が見られた場合に、この活性低下がどの微粒子に起因するものかを特定することができる。
本発明の検体検出キットは、ここまでに述べたような、二種以上のリガンドを含む標準検体と、各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子とを備える。微粒子は微粒子分散液として、標準検体は標準検体溶液として備えられていることが好ましい。
そして、標準検体と微粒子との混合に用いる溶液もあわせて備えられていると好適である。
このような検体検出キットを用いれば、標準検体および微粒子の調製をその都度行う必要がなくなり、微粒子の検体検出活性の確認手順や、検体の定量手順を簡略化することができる。
また、検体検出キットには、標準検体および微粒子が、既知の異なる複数濃度で備えられていると好適である。この場合、標準検体については、使用頻度が比較的高い1pM〜1μMの濃度範囲に調製されていることが好ましい。より好ましくは10pM〜500nMであり、さらに好ましくは100pM〜100nMの標準検体濃度である。
このような検体検出キットを用いれば、微粒子の検体検出活性の確認手順や、検体の定量手順を大幅に簡略化できるだけでなく、さらに、標準検体および微粒子の濃度調整に伴う濃度のばらつきなど、品質のばらつきを低減することもできる。また、標準検体あるいは微粒子が濃度ごとに分割されて備えられているので、異物混入や分解などの危険性も低減できる。
一方、本発明の微粒子の検体検出活性の確認方法を利用することで、検体の定量を高精度に行うことができる。すなわち、微粒子の検体検出活性の確認を行った後、該微粒子中の受容体と特異的に結合する二種以上のリガンドを含む検体と該微粒子とを混合して、生じた凝集物の光学的性質を検出し、次いで前記微粒子の検体検出活性の確認を再度行う。
この時に、標準検体の検出値が、検体検出の前後いずれにおいても正常であれば、検体の定量が、検体検出活性の正常な微粒子で高精度に行われたことを保証できる。
また、同一種類でかつ既知の異なる複数濃度の標準検体を用いて微粒子の検体検出活性の確認を行い、標準検体検出値と標準検体濃度との関数を導出し、該標準検体中のリガンドと同一種類のリガンドを含む検体と該微粒子とを混合した時の検体検出値と前記関数とから、検体を定量することもできる。この時さらに、検体に含まれる各リガンドの数は、標準検体と同じであることが好ましい。また、標準検体の分子の長さは、検体と同程度であることが好ましい。
これら定量に供する検体は、標準検体と異なる種類でも良いが、標準検体と同一種類である方が、凝集物の生成過程が同じとなって検出がより高精度になるため好ましい。また、検体を用いた時の、凝集物の光学的性質の検出は、標準検体を用いた場合と同様に行うことができるので、ここではその説明は省略する。
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
(実施例1)(1)配列番号2に示す塩基配列の5’末端をビオチンで修飾したプライマー、配列番号3に示す塩基配列の5’末端をFITCで修飾したプライマー、鋳型として配列番号4に示す塩基配列からなる56bpの合成DNAをそれぞれ用いて、両5’末端がビオチンで修飾されたPCR産物、両5’末端がFITCで修飾されたPCR産物、一方の5’末端がビオチンで、他方の5’末端がFITCでそれぞれ修飾されたPCR産物をそれぞれ得た後、トリス緩衝液を用いてこれらの濃度を100pM、1nM、10nM、100nM、1μMに調製した。また、両5’末端がビオチンで修飾されたPCR産物、両5’末端がFITCで修飾されたPCR産物を混合し、各PCR産物がそれぞれ上記濃度となるよう調製した。これらのPCR産物は、検出される検体として用いられる。図4A、図4B並びに図4Cに図示されるように、検体となる物質の両末端に、2つのリガンドが修飾される。図4Aは両5’末端がビオチンで修飾されたPCR産物、図4Bは両5’末端がFITCで修飾されたPCR産物を示し、図4Cは一方の5’末端がビオチンで、他方の5’ 末端がFITCでそれぞれ修飾されたPCR産物を示す。図4Aおよび図4Bに示すような、同一のリガンドが両5’末端に修飾された物質も、図4Cに示すような物質と同様に、標準検体として用いることができる。
(2)光の主要な吸収波長が800nmである抗ビオチン抗体感作ビーズ(P1)および光の主要な吸収波長が450nmである抗FITC抗体感作ビーズ(P2)を、それぞれ反応緩衝液(pH7.2のPBS緩衝液)を用いて0.04質量%に希釈し、96ウェルプレートに100μlずつ分注した。
(3)次いで450nm、800nmにおける溶液の吸光度を測定した。
(4)分注したビーズ溶液のうち、P1を含むものには両5’末端がビオチンで修飾されたPCR産物(図4A)、P2を含むものには両5’末端がFITCで修飾されたPCR産物(図4B)をそれぞれウェルごとに5μl加えた。そして、ピペッティング操作にて撹拌した。
同様に、両5’末端がビオチンで修飾されたPCR産物(図4A)および両5’末端がFITCで修飾されたPCR産物(図4B)を混合した溶液をP1またはP2のビーズ溶液に5μl加え、ピペッティング操作にて撹拌した。
(5)PCR産物を加えて5分後の、450nm、800nmにおける溶液の吸光度を測定した。
(6)上記(3)および(5)の吸光度の差を算出して吸光度変化量を求めた。結果を表1に示す。
(7)P1およびP2を混合したものを、反応緩衝液(pH7.2のPBS緩衝液)を用いて0.04質量%に希釈し、96ウェルプレートに100μlずつ分注した。
(8)次いで650nmにおける溶液の吸光度を測定した。
(9)分注したP1およびP2を含むビーズ溶液中に、一方の5’末端がビオチンで、他方の5’末端がFITCでそれぞれ修飾されたPCR産物である標準検体(図4C)を5μl加え、ピペッティング操作にて撹拌した。
(10)標準検体を加えて5分後の、650nmにおける溶液の吸光度を測定した。
(11)上記(8)および(10)の吸光度の差を算出して吸光度変化量を求めた。結果を表1に示す。
(12)吸光度を測定したビーズ溶液のうち、用いたPCR産物の濃度が100nMのビーズ溶液については、さらに37℃で1ヶ月保存した後に吸光度を測定し、(6)および(11)と同様に吸光度変化量を求めた。結果を表2に示す。
(13)また前記(1)にて得られた、一方の5’末端がビオチンで、他方の5’ 末端がFITCでそれぞれ修飾されたPCR産物(図4C)の濃度を10nM、5nM、2.5nM、1.25nMに調製した。
(14)さらに、前記(1)を同様の材料および手法を用いて、濃度未知のPCR産物を得た。
(15)前記(13)および前記(14)にて得られたPCR産物を前記(7)〜(11)と同様の手順で吸光度変化量を求めた。また測定後に再度、10nMのPCR産物を測定した。結果を表3に示す。
表1の結果から、一方の5’末端がビオチンで、他方の5’末端がFITCでそれぞれ修飾されたPCR産物である標準検体、抗ビオチン抗体感作ビーズ(P1)および抗FITC抗体感作ビーズ(P2)を用いて、本発明の方法により、ビーズ(P1、P2)の検体検出活性が正常であることが確認された。
また、表2の結果のうち、1ヶ月保存後のP1+P2の吸光度変化量が減少していることから、ビーズ試薬の検体検出活性が低下していることが確認された。そして、1ヶ月保存後の吸光度変化量とPCR産物調製直後の吸光度変化量とを比較すると、P2の場合ほぼ同じであるのに対し、P1では1ヶ月保存後に大きく減少していることが判った。すなわち、ビーズ試薬の検体検出活性の低下は、P1に起因していることが確認された。このように、検体検出活性の確認に用いた光学的に区別可能な微粒子を、それぞれ単独で検体検出に用いて検出値を比較することにより、検体検出活性の低下がどの微粒子に起因するものか確認することができた。
さらに、表3の結果より導出されるPCR濃度と吸光度変化量との関数は、Y=20.3X−1.23(Y=PCR産物濃度[nM]、X=吸光度変化量)となり、この導出された関数に濃度未知のPCR検体の測定値を代入すると、7.95nMとなる。このように、導出されるPCR濃度と吸光度変化量との関数より、濃度未知の検体を定量することができた。加えて、濃度未知の検体を測定した後、再度10nMの検体を測定したところ、濃度未知の検体を測定する前の吸光度変化量と同程度であった。このことから、濃度未知の検体を測定する前後で、ビーズの検体検出活性が正常であることを間接的に確認することができた。
尚、2種類の標準検体を混合した場合の測定結果を表4に示す。両5’末端をビオチンで修飾された標準検体と、両5’末端をFITCで修飾された標準検体の2種類の標準検体を混合した場合においても、特異的な反応による微粒子の吸光度変化量は1種類の標準検体を単独で用いた場合と、同様の傾向を示した。
このことから、リガンドが異なる二種以上の標準検体を混合した場合においても、一種類の標準検体を単独で用いた場合と同様の結果が得られることが分かった。
本発明は、臨床検査の簡便化、迅速化等に好適であり、医療関連分野において有用である。

Claims (32)

  1. 二種以上のリガンドを含む標準検体と、各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子とを混合して、生じた凝集物の光学的性質を検出する微粒子の検体検出活性の確認方法。
  2. 前記標準検体と前記微粒子との混合を緩衝液中で行う請求項1に記載の微粒子の検体検出活性の確認方法。
  3. 前記標準検体と前記緩衝液とを混合してから、該混合液に前記微粒子を添加する請求項2に記載の微粒子の検体検出活性の確認方法。
  4. 前記微粒子と前記緩衝液とを混合してから、該混合液に前記標準検体を添加する請求項2に記載の微粒子の検体検出活性の活性確認方法。
  5. 前記微粒子が磁性微粒子であり、生じた凝集物に磁力を印加する請求項1
    〜4のいずれか一項に記載の微粒子の検体検出活性の確認方法。
  6. 前記標準検体と前記微粒子とを、4〜40℃で混合する請求項1〜5のいずれか一項に記載の微粒子の検体検出活性の確認方法。
  7. 請求項1〜6のいずれか一項に記載の微粒子の検体検出活性の確認方法で検出された標準検体の検出値を、該標準検体と同一種類かつ同濃度である標準検体の既知の検出値と比較する微粒子の検体検出活性の確認方法。
  8. 請求項1〜6のいずれか一項に記載の微粒子の検体検出活性の確認方法を、濃度既知の標準検体を用いて任意の時間経過ごとに行う微粒子の検体検出活性の確認方法。
  9. 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法で微粒子の検体検出活性の確認を行った後、該微粒子中の受容体と特異的に結合する二種以上のリガンドを含む検体と該微粒子とを混合して、生じた凝集物の光学的性質を検出し、次いで前記微粒子の検体検出活性の確認を再度行う検体の定量方法。
  10. 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法で、同一種類でかつ既知の異なる複数濃度の標準検体を用いて微粒子の検体検出活性の確認を行い、標準検体検出値と標準検体濃度との関数を導出し、該標準検体中のリガンドと同一種類かつ同一数のリガンドを含む検体と該微粒子とを混合した時の検体検出値と前記関数とから、検体を定量する検体の定量方法。
  11. 二種以上のリガンドを含む標準検体と、各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子とを備える検体検出キット。
  12. 二つ以上のリガンドを含む二種以上の混合した標準検体と、各リガンドと特異的に結合する受容体を含み光学的に区別できる二種以上の微粒子を備える検体検出キット。
  13. 前記標準検体中のリガンドがハプテンである請求項11または12に記載の検体検出キット。
  14. 前記標準検体中のリガンドの種類が、検体中のリガンドの種類と同じである請求項11〜13に記載の検体検出キット。
  15. 前記標準検体中のリガンドの数および種類が、検体中のリガンドの数および種類と同じである請求項11〜13に記載の検体検出キット。
  16. 前記標準検体が、検体と同じ種類である請求項11〜15のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  17. 前記標準検体中のリガンドが、分子量180〜60000の分子からなるものである請求項11〜16のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  18. 前記標準検体中のリガンドが、少なくとも0〜100℃の温度範囲で、前記微粒子中の受容体との特異的結合能を有する請求項11〜17のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  19. 前記標準検体中のリガンドが、蛍光物質、ジゴキシゲン、アミノ酸残基数が6以上のポリペプチド、単糖が2以上結合した糖鎖、ビオチン、タンパク質、ポリヒスチジン、ヒアルロン酸(HA)、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、配列番号1で表されるペプチドおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる一種以上である請求項11〜18のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  20. 前記標準検体中に、鎖状構造を有する高分子物質が含まれる請求項11〜19いずれか一項に記載の検体検出キット。
  21. 前記高分子物質が水溶性である請求項20に記載の検体検出キット。
  22. 前記高分子物質が、その主鎖または側鎖の末端に前記リガンドを有する請求項20または21に記載の検体検出キット。
  23. 前記高分子物質が、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリアクリル酸誘導体、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアミドおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる一種以上である請求項20〜22のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  24. 前記高分子物質の主鎖の長さが15〜200nmである請求項20〜23のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  25. 前記標準検体と前記微粒子との混合に用いる溶液中において、前記高分子物質が直鎖状である請求項20〜24のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  26. 前記標準検体の分子の長さが、検体の分子の長さに対して80〜120%である請求項11〜25のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  27. 前記標準検体が、既知の異なる複数濃度で備えられている請求項11〜26のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  28. 前記複数の標準検体の濃度が1pM〜1μMの範囲である請求項27に記載の検体検出キット。
  29. 前記微粒子の粒径が0.1〜10μmである請求項11〜28のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  30. 前記微粒子が磁性微粒子である請求項11〜28のいずれか一項に記載の検体検出キット。
  31. 前記磁性微粒子の粒径が0.1〜20μmである請求項30に記載の検体検出キット。
  32. 前記標準検体と前記微粒子との混合に用いる溶液が備えられている請求項11〜31のいずれか一項に記載の検体検出キット。
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