CN100357737C - 特异结合反应测定方法、测定装置以及其中所用试剂盒 - Google Patents

特异结合反应测定方法、测定装置以及其中所用试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种特异结合反应测定方法，对样品中的被测定物质的含量进行测定，包括构建含有上述样品、固定了与上述被测定物质特异结合的特异结合物质的磁性粒子的反应体系的工序(a)；对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；以及利用磁力从上述反应体系中除去由上述被测定物质和上述特异结合物质以及上述磁性粒子构成的凝集复合物的工序(c)。

Description

特异结合反应测定方法、测定装置以及其中所用试剂盒
技术领域
本发明涉及能够对样品中可能含有的被测定物质的含量进行测定的特异结合反应测定方法和该方法中使用的试剂盒以及特异结合反应测定装置。
背景技术
在医疗领域中，为了进行各种各样疾病的诊断以及调查病状的过程，广泛进行对存在于人体液的各种疾病中特征的蛋白质含量的测定。在这些蛋白质含量的测定中，广泛采用利用特异识别作为抗原的靶蛋白的抗体和抗原的反应(抗原抗体反应)的免疫反应测定方法。现在，在免疫反应测定方法中开发了利用各种各样原理的测定方法。
在上述各种各样的免疫反应测定方法中，有人们都了解的为测定样品中被测定物质含量，对通过抗原抗体反应生成的抗原抗体复合物的凝集物(以下称之为凝集复合物)进行检测的免疫散射测浊法(以下略称为散射测浊法)、免疫比浊法(以下略称为比浊法)以及玻片凝集法等测定方法。在抗原抗体反应中，由于凝集复合物的生成使得反应体系中出现混浊。凝集复合物生成引起反应体系中出现的混浊程度与抗原的量和抗体的量有关。根据这一现象，散射测浊法和比浊法是对上述反应体系产生的混浊程度进行光学测定，由其测定值算出抗原的量或抗体的量的方法。具体来说，散射测浊法是根据反应体系中散射的光量的变化，而比浊法是根据反应体系中因散射而减少的透光量的变化测定凝集复合物的方法。一般来说，上述两个测定方法在测定中可以使用同一反应体系。就是说任一方测定方法能够测定的反应体系，另一方测定方法也能进行测定。玻片凝集法是通过将由于凝集复合物生成而出现的混浊或凝集块在载玻片上等通过目视等进行判定的方法。即使是玻片凝集法在测定中也可以使用与散射测浊法、比浊法同样的反应体系。以上列举的三个测定方法由于是抗原和抗体都同样以分散于反应体系中的状态下进行的方法，所以统称为“均一体系的免疫反应测定方法”。
另外在医疗领域中，为了进行各种各样疾病的诊断以及病状过程的调查，要进行多种被测定物质含量的测定。例如在临床检查中作为肾脏过滤能力的指标，要对人尿中含有的总蛋白的含量进行测定，另外作为急性肾小体肾炎、IgA肾症、肾结核、肾梗塞、肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎、前列腺炎等尿道炎症、结石症和肿瘤等的指标，要对人尿中含有的红血球(血红蛋白)的含量进行测定(例如，参照非专利文献1)。另外下述专利文献1概括了作为用于对多种被测定物质进行测定的均一体系的免疫反应测定方法，对每个被测定物质都准备不同的反应容器，一个一个地分别测定各被测定物质的方法。
而在本说明书中将利用样品中含有的被测定物质和与被测定物质特异结合的特异结合物质的反应，测定样品中被测定物质含量的方法称之为“特异结合反应测定方法”。上述的免疫反应测定方法也是特异结合反应测定方法的一种。
[专利文献]特开平5-2024号公报
[非专利文献1]金井泉原著、金井正光编著、「临床检查法提要」、修订第31版、金原出版株式会社、1998年、156页、179-181页。
然而，用上述以往方法对多种被测定物质进行测定时，需要准备与被测定物质数相同数目的反应容器，测定需要大量的样品。
发明内容
本发明是借鉴上述情况完成的发明，目的在于提供在一个反应容器内可对多个被测定物质进行测定的特异结合反应测定方法、方法中使用的试剂盒以及特异结合反应测定装置。
本发明的特异结合反应测定方法是对测定样品中被测定物质含量进行测定的特异结合反应测定方法，包括：构建含有上述样品、固定了与上述被测定物质特异结合的特异结合物质的磁性粒子的反应体系的工序(a)；对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；利用磁力从上(a)；对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；在所述工序(b)之后，利用磁力从上述反应体系中除去含有上述被测定物质和上述特异结合物质以及上述磁性粒子的凝集复合物工序(c)。
按照本发明，在测定后的工序(c)中，通过利用磁力可以从上述反应体系中除去存在于反应体系中的磁性粒子、含有被测定物质和特异结合物质以及磁性粒子的凝集复合物。特别是在本发明中，由于利用磁力完全不会给反应体系带来化学方面的影响。因此，可以利用测定后的反应体系，通过各种测定方法对样品中含有的其他成分进行测定。
另外以往对2种被测定物质进行测定时，需要准备与被测定物质数相同数目的反应容器。然而利用本发明，如果有一个可构建反应体系的反应容器，那么可以利用该容器对2种被测定物质进行测定。因此测定需要的样品量可以非常少。由于这一原因，例如在医疗领域中，可以减少从患者探集的样品量，减轻患者的负担。
上述光学特性可以是散射光强度或透射光量。
上述磁性粒子的直径最好是处于大约0.05～2μm范围内。
在上述工序(c)中优选从上述反应体系中除去残存于上述反应体系中的上述磁性粒子。
本发明的特异结合反应测定方法是对样品中第1被测定物质和第2被测定物质的含量进行测定的特异结合反应测定方法，包括：构建含有上述样品、固定了与上述第1被测定物质特异结合的第1特异结合物质的磁性粒子的反应体系的工序(a)；在上述工序(a)后，对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；在所述工序(b)之后，利用磁力从上述反应体系中收集含有上述第1被测定物质、上述第1特异结合物质和上述磁性粒子的凝集复合物的工序(c)；向上述反应体系中添加对上述第2被测定物质特异结合的第2特异结合物质的工序(d)；以及在上述工序(d)后，对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(e)，所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
依据本发明，在对第2被测定物质进行测定时，由于反应体系中含有被测定物质和特异结合物质以及磁性粒子的凝集复合物引起的反应体系的光学特性的变化可以通过利用磁力消除。特别是由于利用磁力完全不会给反应体系带来化学方面的影响。因此，如果利用本发明的特异结合反应测定方法在对第2被测定物质进行测定时，测定值的可靠性也会很高的。
而以往对2种被测定物质的含量进行测定时，需要准备与被测定物质种类数相同的2个反应容器，然而利用本发明，只要有一个可构建反应体系的反应容器，那么利用该容器可以对2种被测定物质的含量进行测定。因此测定需要的样品量可以非常少。由于这一原因，例如在医疗领域中，可以减少从患者探集的样品量，减轻患者的负担。
在上述工序(d)中，反应体系最好是含有2～6重量％的聚乙二醇。
上述第2特异结合物质最好是由与上述第2被测定物质特异结合的抗原或抗体以及固定了上述抗原或抗体的非磁性粒子构成。
上述磁性粒子的直径大约在0.05～2μm范围内最好，而上述非磁性粒子的直径大约在0.05～2μm范围内最好。
上述的第1被测定物质和上述第2被测定物质的组合可以是人血红蛋白和人白蛋白的组合。
在上述工序(c)中优选除去残存于上述反应体系中的上述磁性粒子。
本发明另外的特异结合反应测定方法是对样品中n种(n为2以上的整数)的被测定物质的含量进行测定的特异结合反应测定方法，包括：构建含有上述样品、固定了与未测定的被测定物质中的一种物质特异结合的特异结合物质的磁性粒子的反应体系的工序(a)；在上述工序(a)后；对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；在所述工序(b)之后，利用磁力从上述反应体系中除去含有上述一种被测定物质和上述特异结合物质以及上述磁性粒子的凝集复合物的工序(c)；在上述工序(c)后，进行判断的工序(d)，以便使在上述工序(b)不到第(n-1)次时，再次进入到工序(a)；向上述反应体系中添加与上述反应体系中剩下的一种未测定物质特异结合的特异结合物质的工序(e)；以及在上述工序(e)后，对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(f)，所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
依据本发明，在光学特性测定后通过利用磁力可以除去含有被测定物质和特异结合物质以及磁性粒子的凝集复合物。由于利用磁力完全不会给反应体系带来化学方面的影响。由于这个原因，在对多个被测定物质进行测定时，由于先形成的凝集复合物的影响几乎被排除，所以在测定光学特性时，每次测定值的可靠性高。
以往对2种以上被测定物质的含量进行测定时，需要准备与被测定物质种类相同个数的反应容器，然而利用本发明，只要有一个可构建反应体系的反应容器，就可以利用该容器对2种以上被测定物质的含量进行测定。因此测定需要的样品量可以非常少。由于这一原因，例如在医疗领域中，可以减少从患者探集的样品量，减轻患者的负担。
在上述工序(c)中优选从上述反应体系中除去残存于上述反应体系中的上述磁性粒子。
本发明另一个特异结合反应测定方法是对样品中n种(n为2以上的整数)的被测定物质的含量进行测定的特异结合反应测定方法，包括：构建含有上述样品、固定了与未测定的被测定物质中的一种特异结合的特异结合物质的磁性粒子的反应体系的工序(a)；在上述工序(a)后，对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；在所述工序(b)之后，向反应体系添加含有可与由上述一种被测定物质和上述特异结合物质构成的凝集复合物结合的物质和磁性粒子的磁性复合物的工序(c)；利用磁力从上述反应体系中除去结合上述磁性复合物的上述凝集复合物的工序(d)；在上述工序(d)后进行判断的工序(e)，以便使在上述工序(b)不到第(n-1)次时，再次进入到工序(a)；向上述反应体系中添加与上述反应体系中剩下的一种未测定物质特异结合的特异结合物质的工序(f)；以及在上述工序(e)后，对上述反应体系的光学特性进行测定的工序(g)，所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
依据本发明，在光学特性测定后可以利用磁力除去含有被测定物质和特异结合物质的凝集复合物。由于利用磁力完全不会给反应体系带来化学方面的影响。由于这个原因，在对多个被测定物质进行测定时，由于先形成的凝集复合物的影响几乎被排除，所以在进行光学特性测定时，每次测定值的可靠性高。
而以往对2种以上被测定物质的含量进行测定时，需要准备与被测定物质的种类数相同个数的反应容器，然而利用本发明，只要有一个可构建反应体系的反应容器，就可以利用该容器对2种以上被测定物质的含量进行测定。因此测定需要的样品可以非常少。由于这一原因，例如在医疗领域中，可以减少从患者探集的样品量，减轻患者的负担。
在上述工序(d)中优选从上述反应体系中除去没有与上述凝集复合物结合的上述磁性复合物。
本发明的试剂盒是用于对样品中第1被测定物质以及第2被测定物质的含量进行测定的试剂盒，其中含有：固定了与上述第1被测定物质特异结合的第1特异结合物质的磁性粒子以及与上述第2被测定物质特异结合的第2特异结合物质，所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
如果在特异结合反应测定方法中利用本发明的试剂盒，只要有一个可构建反应体系的反应容器，就可以利用该容器对2种以上被测定物质的含量进行测定。因此测定需要的样品量可以非常少。
上述磁性粒子的直径大约在0.05～2μm范围内最好。
上述第2特异结合物质最好是由与上述第2被测定物质特异结合的抗原或抗体以及固定了上述抗原或抗体的非磁性粒子构成。
本发明的另外试剂盒是用于对样品中n种(n为2以上的整数)的被测定物质的含量进行测定的试剂盒，其中含有：与上述n种被测定物质中的一种被测定物质特异结合的一种特异结合物质；分别固定了与上述n种被测定物质中剩下的(n-1)种被测定物质特异结合的特异结合物质的(n-1)种磁性粒子。
如果在特异结合反应测定方法中利用本发明的试剂盒，只要有一个可构建反应体系的反应容器，利用该容器就可以对2种以上被测定物质的含量进行测定。因此测定需要的样品量可以非常少。
本发明的另外试剂盒是用于对样品中n种(n为2以上的整数)的被测定物质的含量进行测定的试剂盒，其中含有：分别与上述n种被测定物质特异结合的n种特异结合物质；含有可与由上述n种被测定物质中的(n-1)种被测定物质和与这些物质对应的(n-1)种特异结合物质构成的凝集复合物结合的物质以及固定有上述物质的磁性粒子的磁性复合物，所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
如果在特异结合反应测定方法中利用本发明的试剂盒，只要有一个可构建反应体系的反应容器，就可以利用该容器对2种以上被测定物质的含量进行测定。因此测定需要的样品量可以非常少。
本发明的特异结合反应测定装置，其中备有室、将光对照上述室进行照射的光源、对来自上述反应体系的散射光或透射光进行检测的光检测器、上述室中含有磁性粒子时利用磁力从上述室内除去上述磁性粒子的除去手段。
利用本发明可以得到非常适用于本发明上述特异结合反应测定方法的特异结合反应测定装置。
附图说明
图1是表示本发明的一实施方式中的免疫反应测定方法的流程图。
图2(a)～(c)是表示图1所示免疫反应测定方法的各个工序中反应体系模式图。
图3是表示本发明其他实施方式中的免疫反应测定方法的流程图。
图4(a)和(b)是表示图3所示免疫反应测定方法中反应体系模式图。
图5是表示本发明另一实施方式中的免疫反应测定方法的流程图。
图6是表示本发明的又一实施方式中的免疫反应测定方法的流程图。
图7(a)和图7(b)是表示图6所示免疫反应测定方法中反应体系模式图。
图8是表示本发明一实施方式中的测定装置构成的模式图。
图9是表示图8的测定装置的一部分配置关系的图。
图10是表示本发明其他实施方式中的测定装置构成的模式图。
图11是表示图10的测定装置的一部分配置关系的图。
图12是表示图10的测定装置的一部分配置关系的图。
图中：1样品，2被测定物质，2a第1被测定物质，2b第2被测定物质，3特异结合物质，3a第1特异结合物质，3b第2特异结合物质，4、4a、4c磁性粒子，4b、5、5a、5c凝集复合物，6磁铁，7抗体，8磁性复合物，100、200测定装置，101、201光源，102、202室，103、203室架，104、204光检测器，105永久磁铁，106罩，107臂，108、208除去手段，202a排出口，205电磁铁，206容器，207阀。
在以下各实施方式中，利用附图对作为特异结合反应测定方法之一的免疫反应测定方法进行说明。为了简单起见，各实施方式中共同的构成要素赋予相同的参照符号。
(实施方式1)
图1是表示本实施方式的免疫反应测定方法的流程图。图2(a)～(c)是表示本实施方式的免疫反应测定方法各工序中反应体系模式图。
首先，在图1所示的工序St1中，就象图2(a)表示的那样，构建含有要对被测定物质2的含量进行测定的样品1和固定了与被测定物质2特异结合的特异结合物质3的磁性粒子4的反应体系。作为样品1，例如可以是血液、尿等体液原样，或将这些样品与缓冲液混合后的混合液。而被测定物质2是抗原时，特异结合物质3是抗体，当被测定物质2是抗体时，特异结合物质3是抗原。
利用这样的体系，当样品中含有被测定物质2时，就象图2(b)表示的那样，通过被测定物质2与特异结合物质3的抗原抗体反应，生成由被测定物质2和特异结合物质3以及磁性粒子4构成的凝集复合物5。当样品中不含有被测定物质2时，就不产生由被测定物质2与特异结合物质3的抗原抗体反应生成凝集复合物5。
接下来在图1所示的工序工序St2中，对反应体系的光学特性进行测定。此时，当上述工序St1中有凝集复合物5产生时，上述反应体系中出现混浊，散射光强度和透射光量等都发生变化。因此通过测定散射光强度或透射光量等可以估算反应体系混浊的程度。在此最好是一边以测定前的样品1作为基准，一边对上述反应体系的光学变化量、即散射光强度或透射光量的变化量进行测定。另外将样品1与缓冲液混合之后构建反应体系时，以缓冲液作为基准也可以。
接下来在图1所示的工序St3中，利用磁力(具体如图2(c)所示的磁铁6)可以回收由被测定物质2和特异结合物质3以及磁性粒子4构成的凝集复合物5，以及没有形成凝集复合物5的磁性粒子，将他们从反应体系中除去。
在免疫反应测定方法中，由于凝集复合物生成使得反应体系中出现的混浊程度依赖于抗原的量和抗体的量。根据这一现象通过本实施方式对上述反应体系的光学特性进行测定，从其测定值可以算出被测定物质2的含量。
另外通过本实施方式，在测定后利用磁力可以将反应体系中存在的磁性粒子、由被测定物质2和特异结合物质3以及磁性粒子4构成的凝集复合物5从反应体系中除去。在本实施方式中由于利用磁力，完全不会对反应体系带来化学方面的影响。因此，可以利用测定后的体系，通过各种测定方法对样品1中含有的其他成分进行测定。
而以往对2种被测定物质的含量进行测定时，需要准备与被测定物质数相同的2个反应容器，然而依据本实施方式，只要有一个可构建反应体系的反应容器，就可以利用该容器对2种被测定物质的含量进行测定。因此依据本实施方式，测定需要的样品量可以非常少。由于这一原因，例如在医疗领域中，可以减少从患者探集的样品量，减轻患者的负担。另外，在本实施方式中也可以利用pH3.0以下酸性条件阻碍抗原抗体反应现象，以便从反应体系除去的凝集复合物5和磁性粒子(没有图示)中，以被固定的抗体或抗原具有反应性的状态对磁性粒子进行回收、再利用。或者，通过用强酸或强碱处理、基于表面活性剂清洗，将固定在磁性粒子上的抗体或抗原完全除去，将别的抗体或抗原固定在该磁性粒子上也可以。
在本实施方式的免疫反应测定方法中使用的磁性粒子4最好是在反应体系中不溶的。作为磁性粒子4的具体例子，如铁氧体粒子、铁氧体胶体粒子、含有铁氧体的胶乳粒子等。这样的磁性粒子可以自己制作。特别是通过对菌体内含有0.05～0.1μm的磁性粒子的磁性细菌进行培养使菌数增加，用法式压力机等进行破碎之后，用磁铁收集分离、取出菌体内的磁性粒子，可以得到具有大致均一直径的磁性粒子。利用磁性细菌得到磁性粒子的方法更详细地记载于特开2000-346843号公报。
由磁性细菌得到的磁性粒子用脂质双层膜包被。这样做后，在水溶液等溶液等中的分散性良好，而且也适用于对作为特异结合物质的抗体等蛋白质进行固定。
在本实施方式中使用的磁性粒子4的直径，从容易均一分散于水溶液中的观点、能够对用于定量基于抗原抗体反应生成的凝集复合物的散射光强度或透射光量的变化量进行检测的观点出发，最好是0.05～2μm。
在本实施方式中，例举了用于收集磁性粒子的产生磁力的磁铁6，更具体地讲该磁铁6可以是永久磁铁、电磁铁等。
在本实施方式的免疫反应测定方法的反应体系中，根据其用途等可以添加该领域中众所周知的任意成分。例如，为了减少被测定物质2以及特异结合物质3的各自的自身凝集引起的非特异性凝集，在本实施方式中，也可以向反应体系中添加Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、蔗糖甘油单月桂酸酯、CHAPS等表面活性剂。上述表面活性剂在反应体系中的含量从抗原抗体反应障碍少的观点出发，0.3重量％以下比较好，0.1重量％以下更好。
在本实施方式的免疫反应测定方法中，作为在工序St2中进行测定的光学特性，既可以对散射光强度的变化进行测定(散射测浊法)，也可以对来自反应体系的透射光量的变化进行测定(比浊法)。
在本实施方式中，被测定物质没有特别限定，只要是利用抗原抗体反应能够测定的物质都可以。例如蛋白质、核酸、脂类、细菌、病毒以及半抗原等。特别是本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒适合以往在临床检查中利用抗原抗体反应测定的测定对象即蛋白质的测定。作为蛋白质例如可以是LH(促黄体素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人绒毛膜促性激素)等激素，以及各种免疫球蛋白类和亚类、补体成分、各种传染病的标志物、CRP、白蛋白、血红蛋白、类风湿因子以及血型抗原等。
本实施方式中使用的抗体没有特别限定，只要是通过与抗原特异结合，可与抗原形成凝集复合物的抗体，没有特别限定。例如无论是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的哪一类抗体，还是这些抗体的混合物都可以。另外无论是多克隆抗体，还是单克隆抗体都可以，即使是他们的混合物也可以。其中IgG抗体最好，这是由于IgG抗体具有难于产生非特异反应的性质，另外由于销售的产品比较多、容易买到的缘故。另外抗体来自动物的种类也没有特别限定，但由于来自兔、山羊、小鼠的抗体比较容易获得，使用的例子也比较多，所以比较好。
而在本实施方式中，作为特异结合反应测定方法，虽然对利用抗原抗体反应的免疫反应测定方法进行了说明，也可以通过利用抗原抗体反应以外的发生特异结合的反应使凝集复合物生成，进行测定。利用抗原抗体反应以外的发生特异结合的反应时，被测定物质和特异结合物质的组合如配体和受体的组合，单链DNA(被测定物质)与含有与该单链DNA互补序列的各种DNA片段之间的组合等。
作为配体和受体组合的例子，如可作为配体的分子和对该分子具有多个结合部位的变构蛋白的组合。当在作为配体的分子内只存在一个与变构蛋白结合的部位时，如果通过在与变构蛋白结合部分以外的部位将作为配体的分子固定在磁性粒子上，就可以使作为配体的分子和变构蛋白之间的凝集复合物生成。
另外，在将单链DNA作为被测物质、将各种DNA片段作为特异结合物质时，只要以能够互补结合在作为被测物质的单链DNA上的状态将各种DNA片段固定在磁性粒子上即可。
(实施方式2)
在本实施方式中，参照图，对可以测定2种被测定物质含量的免疫反应测定方法进行说明。
图3是表示本实施方式的免疫反应测定方法的流程图。图4(a)和4(b)是表示本实施方式的免疫反应测定方法中反应体系模式图。
首先在图3表示的St21中，构建含有要对第1被测定物质以及第2被测定物质的含量进行测定的样品和固定了与第1被测定物质特异结合的第1特异结合物质的磁性粒子的反应体系。作为样品，例如可以是血液、尿等体液原样，或将这些样品与缓冲液混合后的混合液。而被测定物质1是抗原时，第1特异结合物质是抗体，当被测定物质1是抗体时，第1特异结合物质是抗原。
利用这样的体系，就象图4(a)表示的那样，当样品中含有第1被测定物质2a时，通过第1被测定物质2a与第1特异结合物质3a的抗原抗体反应，生成由第1被测定物质2a与第1特异结合物质3a以及磁性粒子4a构成的凝集复合物5a。当样品中不含有第1被测定物质2a时，就不会由第1被测定物质2a与第1特异结合物质3a的抗原抗体反应生成凝集复合物5a。
接下来在图3所示的工序工序St22中，对反应体系的光学特性进行测定。此时，当上述工序St21中有凝集复合物5a产生时，上述反应体系中出现混浊，散射光强度或透射光量等都发生变化。因此通过测定散射光强度或透射光量等可以估算反应体系混浊的程度。在此最好是一边以测定前的样品作为基准，一边对上述反应体系的光学上的变化量、即散射光强度或透射光量的变化量进行测定。另外将样品与缓冲液混合之后构建反应体系时，以缓冲液作为基准也可以。
接下来在图3所示的工序St23中，利用磁力可以收集由第1被测定物质2a与第1特异结合物质3a以及磁性粒子4a构成的凝集复合物5a；以及没有形成凝集复合物5a的磁性粒子。此时，可以将凝集复合物5a以及磁性粒子从反应体系中除去，另外为了不妨碍后述的工序St25中的反应体系的光学特性测定，也可以集中放置在构建反应体系的反应容器内的一个地方。
然后，在图3所示的工序St24中，向反应体系添加与第2被测定物质特异结合的第2特异结合物质。例如第2被测定物质是抗原时，第2特异结合物质是抗体，当第2被测定物质是抗体时，第2特异结合物质是抗原。
利用这样的体系，就象图4(b)表示的那样，当样品中含有第2被测定物质时，通过第2被测定物质2b与第2特异结合物质3b的抗原抗体反应，生成由第2被测定物质2b与第2特异结合物质3b构成的凝集复合物4b。不用说，当样品中不含有第2被测定物质2b时，就不会由第2被测定物质2b与第2特异结合物质3b的抗原抗体反应生成凝集复合物4b。
接下来在图3所示的工序St25中，对反应体系的光学特性进行测定。此时，当上述工序St24中有凝集复合物4b产生时，上述反应体系中出现混浊，散射光强度和透射光量等都发生变化。因此通过测定散射光强度或透射光量等可以估算反应体系混浊的程度。在此最好是一边以测定前的样品作为基准，一边对上述反应体系的光学上的变化量、即散射光强度或透射光量的变化量进行测定。另外将样品与缓冲液混合之后构建反应体系时，以缓冲液作为基准也可以。
特别是在上述工序St23中，就象图4(b)表示的那样，由于利用磁力可以收集凝集复合物5a以及没有形成凝集复合物5a的磁性粒子，所以在本工序中对反应体系的光学特性进行测定时，可以测定只由凝集复合物4b引起的散射光强度和透射光量等的变化。
特别是利用本实施方式，在对第2被测定物质2b进行测定时，利用磁力可以消除掉由反应体系中存在的磁性粒子4a以及由被测定物质2a、特异结合物质3a和磁性粒子4a构成的凝集复合物5a引起的反应体系的光学变化。由于利用磁力，完全不会对反应体系带来化学方面的影响。因此，利用本实施方式的免疫反应测定方法，在对第2被测定物质2b进行测定时，测定值的可靠性也很高。
而以往对2种被测定物质的含量进行测定时，需要准备与被测定物质种类数相同的2个反应容器，然而依据本实施方式，只要有一个可构建反应体系的反应容器，利用该容器就可以对2种被测定物质的含量进行测定。因此按照本实施方式，测定需要的样品量可以非常少。由于这一原因，所以例如在医疗领域中，可以减少从患者探集的样品量，减轻患者的负担。
另外，在本实施方式中也可以利用pH3.0以下酸性条件阻碍抗原抗体反应现象，以便从反应体系除去的凝集复合物和磁性粒子中，以被固定的抗体或抗原具有反应性的状态对磁性粒子进行回收、再利用。或者，通过用强酸或强碱处理、基于表面活性剂清洗，将固定在磁性粒子上的抗体或抗原完全除去，将别的抗体或抗原固定在该磁性粒子上也可以。
以下对本实施方式的免疫反应测定方法中使用的试剂盒进行说明。一边参照图4(a)和(b)，一边进行说明。
本实施方式的免疫反应测定方法中使用的试剂盒含有固定了与上述第1被测定物质2a特异结合的第1特异结合物质3a的磁性粒子4a以及与上述第2被测定物质2b特异结合的第2特异结合物质3b。
当第1被测定物质2a是抗原时，第1特异结合物质3a为抗体；当第1被测定物质2a是抗体时，第1特异结合物质3a为抗原。另外当第2被测定物质2b是抗原时，第2特异结合物质3b为抗体；当第2被测定物质2b是抗体时，第2特异结合物质3b为抗原。
如果将本实施方式的试剂盒用在本实施方式的免疫反应测定方法中，只要有一个可构建反应体系的反应容器，利用该容器就可以对2种被测定物质的含量进行测定。因此使用本实施方式的试剂盒，测定需要的样品量可以非常少。
特别是就象图4(b)表示的那样，在对第2被测定物质2b进行测定时，可以利用磁力消除掉由反应体系中存在的磁性粒子4a以及由被测定物质2a、特异结合物质3a和磁性粒子4a构成的凝集复合物5a引起的反应体系的光学变化。由于利用磁力，完全不会对反应体系带来化学方面的影响。因此，利用本实施方式的免疫反应测定方法，在对第2被测定物质2b进行测定时，测定值的可靠性也很高。
在本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒中使用的磁性粒子4a最好是在反应体系中不溶的。作为磁性粒子4a的具体例子，如铁氧体粒子、铁氧体胶体粒子、含有铁氧体的胶乳粒子等。这样的磁性粒子可以自己制作。特别是通过对菌体内含有0.05～0.1μm的磁性粒子的磁性细菌进行培养使菌数增加，用法式压力机等进行破碎之后，用磁铁收集分离、取出菌体内的磁性粒子，可以得到具有大致均一直径的磁性粒子。利用磁性细菌得到磁性粒子的方法更详细地记载于特开2000-346843号公报。
由磁性细菌得到的磁性粒子用脂质双层膜包被。因此在水溶液等溶液中的分散性良好，而且也适用于对作为特异结合物质的抗体等蛋白质进行固定。
在本实施方式中使用的磁性粒子4a的直径从均一分散于水溶液中容易的观点、能够对用于定量基于抗原抗体反应的凝集复合物的散射光强度或透射光量的变化量进行检测的观点出发，最好是0.05～2μm。
在本实施方式中，例举了用于收集磁性粒子的产生磁力的磁铁6，更具体地讲该磁铁6可以是永久磁铁、电磁铁等。
在本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒中作为第2特异结合物质3b，例如可以是抗原或抗体，但不限定于这些。特别是第2特异结合物质3b最好是固定了与第2被测定物质2b发生抗原抗体反应的抗原或抗体的非磁性粒子。这样在对第2被测定物质2b进行测定时(即工序St25)的光学特性的变化范围与测定第1被测定物质2a时(即工序St22)的光学特性的变化范围没有太大的变化。因此，测定使用的装置的调整变得容易。另外第2被测定物质2b的抗原抗体反应的进行完全不受到来自磁力的影响也是最理想的理由。
作为非磁性粒子，如玻璃粒子、石墨粒子、胶体金粒子、胶乳粒子等。其中从稳定性高、容易获得具有各种各样直径的粒子的观点看，胶乳粒子比较好，特别是对蛋白质吸附性好的聚乙烯胶乳粒子更好。
对于上述非磁性粒子要求容易均一分散到溶液中，以及对用于由抗原抗体反应形成的凝集复合物进行定量的散射光强度和透射光量的变化量可进行检测。因此上述非磁性粒子的直径最好是0.05～2μm，从与使用磁性粒子4a时的测定和光学特性的变化范围做到同等的观点出发，如果与磁性粒子4a的直径同等更好。
在本实施方式的免疫反应测定方法的反应体系中，根据其用途可以添加该领域众所周知的任意成分。例如当第2特异结合物质3b不是固定了抗原或抗体的非磁性粒子时，在工序St24中也可以向反应体系加入聚乙二醇。而为了向工序St24中反应体系添加聚乙二醇，可以向试剂盒中附加聚乙二醇。聚乙二醇的含量相对于反应体系2～6重量％比较好，4重量％更好。反应体系中含有上述浓度的聚乙二醇时，第2被测定物质2b和第2特异结合物质3b各自的自身凝集引起的非特异凝集变少，测定灵敏度提高。
另外为了减少在工序St22和工序St25中第1被测定物质2a、第1特异结合物质3a、第2被测定物质2b以及第2特异结合物质3b各自的自身凝集引起的非特异凝集，在本实施方式中，也可以向反应体系中添加Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、蔗糖甘油单月桂酸酯、CHAPS等表面活性剂。上述表面活性剂在反应体系中的含量从减少抗原抗体反应的障碍观点出发，0.3重量％以下比较好，0.1重量％以下更好。
在本实施方式的免疫反应测定方法中，作为在工序St22和工序St25中进行测定的光学特性可以测定散射光强度的变化(散射测浊法)，也可以测定来自反应体系的透射光量的变化(比浊法)。
在本实施方式中，第1被测定物质2a以及第2被测定物质2b没有特别限定，只要是利用抗原抗体反应能够测定的物质都可以。例如蛋白质、核酸、脂类、细菌、病毒以及半抗原等。特别是本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒适用于以往在临床检查中利用抗原抗体反应进行测定的对象即蛋白质的测定。作为蛋白质例如可以是LH(促黄体素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人绒毛膜促性激素)等激素，以及各种免疫球蛋白类和亚类、补体成分、各种传染病的标志物、CRP、白蛋白、血红蛋白、类风湿因子以及血型抗原等。例如，在本实施方式中，如果将第1被测定物质2a以及第2被测定物质2b分别定为人血红蛋白和人白蛋白，可以提供适于肾脏疾病初期筛选的测定结果。这是由于尿中的人血红蛋白容易成为急性肾小体肾炎、IgA肾症、肾结核、肾梗塞、肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎、前列腺炎等尿道炎症的指标，尿中的人白蛋白容易反映出尿中的蛋白质总量的变化，因此可以进行肾功能的评价。
本实施方式中使用的抗体只要是通过与抗原特异结合，能够与抗原形成凝集复合物的就可以，没有特别限定。例如可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的任一类抗体，也可以是这些抗体的混合物。另外无论是多克隆抗体还是单克隆抗体都可以，即使是他们的混合物也可以。其中IgG抗体最好，这是由于IgG抗体具有难于产生非特异反应的性质，另外由于销售的产品比较多、容易买到的缘故。另外抗体来自动物的种类也没有特别限定，但由于来自兔、山羊、小鼠的抗体比较容易获得，使用的例子也比较多，所以比较好。
另外在本实施方式中，作为特异结合反应测定方法虽然对利用抗原抗体反应的免疫反应测定方法进行了说明，也可以通过利用抗原抗体反应以外的发生特异结合的反应使凝集复合物生成，进行测定。利用抗原抗体反应以外的发生特异结合的反应时，被测定物质和特异结合物质的组合如配体和受体的组合，单链DNA(被测定物质)与含有与该单链DNA互补序列的各种DNA片段之间的组合等。
作为配体和受体组合的例子，如可作为配体的分子和对该分子具有多个结合部位的变构蛋白的组合。在作为配体的分子内只存在一个与变构蛋白结合的部位时，如果通过在与变构蛋白结合部分以外的部位将作为配体的分子固定在磁性粒子、非磁性分子等上，就可以使作为配体的分子和变构蛋白之间的凝集复合物生成。
另外，在将单链DNA作为被测物质、将各种DNA片段作为特异结合物质时，只要以能够互补结合在作为被测物质的单链DNA上的状态将各种DNA片段固定在磁性粒子、非磁性粒子等上即可。
(实施方式3)
在本实施方式中一边参照附图，一边对将上述实施方式2的免疫反应测定方法扩展到能够对多种被测定物质的含量进行测定的免疫反应测定方法进行说明。
图5是表示本实施方式的免疫反应测定方法的流程图。
首先，在图5所示的工序St31中，构建含有要对n种(n为2以上的整数)被测定物质的含量进行测定的样品和固定了与未测定的被测定物质中的一种特异结合的特异结合物质的磁性粒子的反应体系。作为样品例如可以是血液、尿等体液原样，或将这些样品与缓冲液混合后的混合液。而被测定物质是抗原时，特异结合物质是抗体，当被测定物质是抗体时，特异结合物质是抗原。
利用这样的体系，当样品中含有被测定物质时，通过被测定物质与特异结合物质的抗原抗体反应，生成与上述实施方式2的图4(a)所示的凝集复合物5a相同的由被测定物质和特异结合物质以及磁性粒子构成的凝集复合物。当样品中不含有被测定物质时，就不会由被测定物质与特异结合物质的抗原抗体反应生成凝集复合物。
接下来在图5所示的工序St32中，对反应体系的光学特性进行测定。此时，当上述工序St31中有凝集复合物产生时，上述反应体系中出现混浊，散射光强度或透射光量等都发生变化。因此通过测定散射光强度或透射光量等可以估算反应体系混浊的程度。在此最好是一边以测定前的样品作为基准，一边对上述反应体系的光学方面的变化量、即散射光强度或透射光量的变化量进行测定。另外将样品与缓冲液混合之后构建反应体系时，以缓冲液作为基准也可以。
接下来在图5所示的工序St33中，利用磁力可以从反应体系中除去由被测定物质和特异结合物质以及磁性粒子构成的凝集复合物，以及没有形成凝集复合物的磁性粒子。
接下来，在图5所示的工序St34中，对上述工序St32是否是第(n-1)次进行判断。此时当上述工序St32是第(n-1)次时，向工序St35进行。当上述工序St32不到第(n-1)次时，再度进行工序St31。就是说，在上述工序St32达到第(n-1)次之前，反复进行工序St31～St33。通过这样操作，n种被测定物质中的(n-1)种被测定物质从反应体系中被除去。
接下来，在图5所示的工序St35中，向反应体系中添加与上述反应体系中剩下的一种未测定的被测物质特异结合的特异结合物质。此时，例如被测定物质是抗原时，特异结合物质为抗体，如果被测定物质是抗体时，特异结合物质为抗原。
利用这样的体系，当样品中含有被测定物质时，通过被测定物质与特异结合物质的抗原抗体反应，生成与上述实施方式2的图4(b)表示的凝集复合物4b相同的由被测定物质与特异结合物质构成的凝集复合物。不用说，当样品中不含有被测定物质时，就不会由被测定物质与特异结合物质的抗原抗体反应生成凝集复合物。
接下来在图5所示的工序St36中，对反应体系的光学特性进行测定。此时，当上述工序St35中有凝集复合物产生时，上述反应体系中出现混浊，散射光强度和透射光量等都发生变化。因此通过测定散射光强度或透射光量等可以估算反应体系混浊的程度。在此最好是一边以测定前的样品作为基准，一边对上述反应体系的光学上的变化量、即散射光强度或透射光量的变化量进行测定。另外将样品与缓冲液混合之后构建反应体系时，以缓冲液作为基准也可以。
特别是在上述工序St33中，由于利用磁力可以收集凝集复合物以及没有形成凝集复合物的磁性粒子，所以在本工序中对反应体系的光学特性进行测定时，可以测定只由凝集复合物引起的散射光强度和透射光量等的变化。
依据本实施方式，在光学特性测定后利用磁力消除掉了由被测定物质和特异结合物质以及磁性粒子构成的凝集复合物引起的反应体系的光学变化。由于利用磁力，完全不会对反应体系带来化学方面的影响。因此，在对多个被测定物质进行测定时，由于几乎排除了先前形成的凝集复合物的影响，所以在进行光学特性测定时，每次测定值的可靠性都很高。
特别是以往对2种以上被测定物质的含量进行测定时，需要准备与被测定物质种类数相同个数的反应容器，然而依据本实施方式，只要有一个可构建反应体系的反应容器，利用该容器就可以对2种以上被测定物质的含量进行测定。因此按照本实施方式，测定需要的样品量可以非常少。由于这一原因，所以例如在医疗领域中，可以减少从患者探集的样品量，减轻患者的负担。
另外，在本实施方式中也可以利用pH3.0以下酸性条件阻碍抗原抗体反应现象，以便从反应体系除去的凝集复合物和磁性粒子中，以被固定的抗体或抗原具有反应性的状态对磁性粒子进行回收、再利用。或者，通过用强酸或强碱处理、以及基于表面活性剂清洗，将固定在磁性粒子上的抗体或抗原完全除去，将别的抗体或抗原固定在该磁性粒子上也可以。
以下对本实施方式的免疫反应测定方法中使用的试剂盒进行说明。
在本实施方式的免疫反应测定方法中使用的试剂盒含有分别固定了与(n-1)种被测定物质特异结合的特异结合物质的磁性粒子以及与剩下的一种未测定的被测定物质特异结合的特异结合物质。
如果将本实施方式的试剂盒用在本实施方式的免疫反应测定方法中，只要有一个可构建反应体系的反应容器，就可以利用该容器就可以对2种以上的被测定物质的含量进行测定。因此使用本实施方式的试剂盒，测定需要的样品量可以非常少。
作为在本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒中使用的磁性粒子以及用于回收磁性粒子的磁铁6可以使用与上述实施方式2中说明的完全相同的磁性粒子和磁铁。
另外在本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒中，作为图5所示的工序St35中添加的特异结合物质，最好是固定了与反应体系剩下的一种未测定的被测定物质发生抗原抗体反应的抗原或抗体的非磁性粒子。这样在工序St36中的被测定物质测定中的光学特性的变化范围与工序St32中的(n-1)种被测定物质测定中的光学特性的变化范围没有太大的变化。因此，测定使用的装置的调整变得容易。
作为非磁性粒子可以使用与上述实施方式2叙述的完全相同的非磁性粒子。即上述非磁性粒子的直径最好是0.05～2μm，如果与上述的磁性粒子的直径同等更好。
在本实施方式的免疫反应测定方法的反应体系中，根据其用途可以添加该领域众所周知的任意成分。例如当特异结合物质不是固定了抗原或抗体的非磁性粒子时，在工序St35中可以向反应体系加入聚乙二醇。而为了向工序St35中反应体系添加聚乙二醇，可以在试剂盒中附加聚乙二醇。聚乙二醇的含量相对于反应体系，2～6重量％比较好，4重量％更好。反应体系中含有上述浓度的聚乙二醇时，在工序St36中，各个被测定物质或各个特异结合物质各自的自身凝集引起的非特异凝集减少，测定灵敏度提高。
另外为了减少在工序St32和工序St36中由于各被测定物质以及各特异结合物质各自的自身凝集引起的非特异凝集，在本实施方式中，也可以向反应体系中添加Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、蔗糖甘油单月桂酸酯、CHAPS等表面活性剂。上述表面活性剂在反应体系中的含量从减少抗原抗体反应的障碍观点出发，0.3重量％以下比较好，0.1重量％以下更好。
在本实施方式的免疫反应测定方法中，作为在工序St32和工序St36中进行测定的光学特性可以测定散射光强度的变化(散射测浊法)，也可以测定来自反应体系的透射光量的变化(比浊法)。
在本实施方式中，n种各被测定物质没有特别限定，只要是利用抗原抗体反应能够测定的物质都可以。例如蛋白质、核酸、脂类、细菌、病毒以及半抗原等。特别是本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒适用于以往在临床检查中利用抗原抗体反应进行测定的对象即蛋白质的测定。作为蛋白质例如可以是LH(促黄体素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人绒毛膜促性激素)等激素，以及各种免疫球蛋白类和亚类、补体成分、各种传染病的标志物、CRP、白蛋白、血红蛋白、类风湿因子以及血型抗原等。
本实施方式中使用的抗体只要是通过与抗原特异结合，能够与抗原形成凝集复合物的就可以，没有特别限定。例如可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的任一类抗体，也可以是这些抗体的混合物。另外无论是多克隆抗体还是单克隆抗体都可以，即使是他们的混合物也可以。其中IgG抗体最好，这是由于IgG抗体具有难于产生非特异反应的性质，另外由于销售的产品比较多、容易买到的缘故。另外抗体来自动物的种类也没有特别限定，但由于来自兔、山羊、小鼠的抗体比较容易获得，使用的例子也比较多，所以比较好。
在本实施方式中，作为特异结合反应测定方法虽然对利用抗原抗体反应的免疫反应测定方法进行了说明，也可以通过利用抗原抗体反应以外的发生特异结合的反应使凝集复合物生成，进行测定。利用抗原抗体反应以外的发生特异结合的反应时，被测定物质和特异结合物质的组合如配体和受体的组合、单链DNA(被测定物质)与含有与该单链DNA互补序列的各种DNA片段之间的组合等。
作为配体和受体组合的例子，如可作为配体的分子和对该分子具有多个结合部位的变构蛋白的组合。在作为配体的分子内只存在一个与变构蛋白结合的部位时，如果通过在与变构蛋白结合部分以外的部位将作为配体的分子固定在磁性粒子、非磁性分子等上，就可以使作为配体的分子和变构蛋白的凝集复合物生成。
另外，在将单链DNA作为被测物质、将各种DNA片段作为特异结合物质时，只要以能够互补结合在作为被测物质的单链DNA上的状态将各种DNA片段固定在磁性粒子上即可。
(实施方式4)
在本实施方式中一边参照附图一边对能够对多种被测定物质的含量进行测定的另外的免疫反应测定方法进行说明。
图6是表示本实施方式的免疫反应测定方法的流程图。图7(a)和7(b)是表示本实施方式的免疫反应测定方法中反应体系模式图。
首先，在图6所示的工序St41中，构建含有要对n种(n为2以上的整数)被测定物质的含量进行测定的样品和固定了与未测定的被测定物质中的一种特异结合的特异结合物质的反应体系。作为样品例如可以是血液、尿等体液。被测定物质是抗原时，特异结合物质是抗体，当被测定物质是抗体时，特异结合物质是抗原。
利用这样的体系，就象图7(a)所示的那样，当样品中含有一种被测定物质2a时，通过被测定物质2a与特异结合物质3a的抗原抗体反应，生成由被测定物质2a与特异结合物质3a构成的凝集复合物5c。当样品中不含有被测定物质2a时，就不会由被测定物质2a与特异结合物质3a的抗原抗体反应生成凝集复合物5c。
接下来在图6所示的工序工序St42中，对反应体系的光学特性进行测定。此时，当上述工序St41中有凝集复合物产生时，上述反应体系中出现混浊，散射光强度和透射光量等都发生变化。因此通过测定散射光强度或透射光量等可以估算反应体系混浊的程度。在此最好是一边以测定前的样品作为基准，一边对上述反应体系的光学的变化量、即散射光强度或透射光量的变化量进行测定。另外将样品与缓冲液混合之后构建反应体系时，以缓冲液作为基准也可以。
接下来，在图6所示的工序St43中，将由能够与由上述一种被测定物质和特异结合物质构成的凝集复合物结合的物质(例如能够与凝集复合物中含有的抗体结合的抗体)和磁性粒子构成的磁性复合物添加到反应体系中。通过这样操作，如图7(b)表示的那样，由抗体7和磁性粒子4c构成的磁性复合物8结合在凝集复合物5c上。
接下来在图6所示的工序St44中，利用磁力可以从反应体系中除去结合了磁性复合物的凝集复合物和没有与凝集复合物结合的磁性复合物。通过这样操作，如图7(b)表示的那样，通过磁力，凝集复合物5c与磁性复合物8一起被除去，反应体系内剩下了另一被测定物质2b。
接下来，在图6所示的工序St45中，对上述工序St42是否是第(n-1)次进行判断。此时当上述工序St42是第(n-1)次时，向工序St46进行。当上述工序St42不到第(n-1)次时，再度进行工序St41。就是说，在上述工序St42达到第(n-1)次之前，反复进行工序St41～St44。通过这样操作，n种被测定物质中的(n-1)种被测定物质从反应体系中被除去。
接下来，在图6所示的工序St46中，向反应体系中添加与上述反应体系中剩下的一种未测定的被测定物质特异结合的特异结合物质。此时，例如被测定物质是抗原时，特异结合物质为抗体，如果被测定物质是抗体时，特异结合物质为抗原。
通过这样操作，当样品中含有被测定物质时，通过被测定物质与特异结合物质的抗原抗体反应，生成与上述实施方式2的图4(b)表示的的凝集复合物4b相同的由被测定物质与特异结合物质构成的凝集复合物。不用说，当样品中不含有被测定物质时，就不会由被测定物质与特异结合物质的抗原抗体反应生成凝集复合物。
接下来在图6所示的工序St47中，对反应体系的光学特性进行测定。此时，当上述工序St46中有凝集复合物产生时，上述反应体系中出现混浊，散射光强度和透射光量等都发生变化。因此通过测定散射光强度或透射光量等可以估算反应体系混浊的程度。在此最好是一边以测定前的样品作为基准，一边对上述反应体系的光学上的变化量、即散射光强度或透射光量的变化量进行测定。另外将样品与缓冲液混合之后构建反应体系时，以缓冲液作为基准也可以。
特别是在上述工序St44中，由于利用磁力可以收集凝集复合物以及磁性复合物，所以在本工序中对反应体系的光学特性进行测定时，可以测定只由凝集复合物引起的散射光强度和透射光量等的变化。
依据本实施方式，在光学特性测定后利用磁力可消除掉由被测定物质和特异结合物质构成的凝集复合物。由于利用磁力，完全不会对反应体系带来化学方面的影响。因此，在对多个被测定物质进行测定时，由于几乎排除了先前形成的凝集复合物的影响，所以在进行光学特性测定时，每次测定值的可靠性都很高。
特别是以往对2种以上被测定物质的含量进行测定时，需要准备与被测定物质种类数相同个数的反应容器，然而依据本实施方式，只要有一个可构建反应体系的反应容器，利用该容器就可以对2种以上被测定物质的含量进行测定。因此按照本实施方式，测定需要的样品量可以非常少。由于这一原因，所以例如在医疗领域中，可以减少从患者探集的样品量，减轻患者的负担。
另外，在本实施方式中也可以利用pH3.0以下酸性条件阻碍抗原抗体反应现象，以便从反应体系除去的凝集复合物中，以被固定的抗体或抗原具有反应性的状态对磁性粒子进行回收、再利用。或者，通过用强酸或强碱处理、以及基于表面活性剂清洗，将固定在磁性粒子上的抗体或抗原完全除去，将别的抗体或抗原固定在该磁性粒子上也可以。
以下对本实施方式的免疫反应测定方法中使用的试剂盒进行说明。
本实施方式的免疫反应测定方法中使用的试剂盒含有分别与n种被测定物质特异结合的特异结合物质、以及由可与由(n-1)种被测定物质和与其对应的特异结合物质构成的各个凝集复合物结合的物质(例如能够与凝集复合物含有的抗体结合的二次抗体)和固定了上述物质的磁性粒子构成的磁性复合物。
如果将本实施方式的试剂盒用在本实施方式的免疫反应测定方法中，只要有一个可构建反应体系的反应容器，利用该容器就可以对2种以上的被测定物质的含量进行测定。因此使用本实施方式的试剂盒，测定需要的样品量可以非常少。
作为在本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒中使用的磁性粒子以及用于收集磁性粒子的磁铁6可以使用与上述实施方式2中说明的完全相同的磁性粒子和磁铁。
作为在本实施方式中使用的能够与凝集复合物特异结合的磁性复合物，可以使用磁性粒子上固定了与各凝集复合物的生成中使用的抗体特异结合的抗体、或者与凝集复合物生成中使用的抗体不同的部位特异结合的抗体、或与凝集复合物的特定的结构特异结合的抗体等的磁性复合物。
另外在本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒中作为图6所示的工序St46中添加的特异结合物质最好是固定了与反应体系剩下的一种未测定的被测定物质发生抗原抗体反应的抗原或抗体的非磁性粒子。通过这样操作，在工序St47中的被测定物质测定的光学特性的变化范围与工序St42中的(n-1)种被测定物质测定的光学特性的变化范围没有太大的变化。因此，测定使用的装置的调整变得容易。
作为上述非磁性粒子可以使用与上述实施方式2叙述的完全相同的非磁性粒子。即上述非磁性粒子的直径最好是0.05～2μm，如果与上述的磁性粒子的直径等同更好。
在本实施方式的免疫反应测定方法的反应体系中，根据其用途可以添加该领域众所周知的任意成分。例如当特异结合物质不是固定了抗原或抗体的非磁性粒子时，在工序St46中可以向反应体系加入聚乙二醇。而为了向工序St46中反应体系添加聚乙二醇，可以在试剂盒中附加聚乙二醇。聚乙二醇的含量相对于反应体系2～6重量％比较好，4重量％更好。反应体系中含有上述浓度的聚乙二醇时，在工序St47中，被测定物质或特异结合物质各自的自身凝集引起的非特异凝集减少，测定灵敏度提高。
另外为了减少在工序St42和工序St47中由于各被测定物质以及各特异结合物质各自的自身凝集引起的非特异凝集，在本实施方式中，也可以向反应体系中添加Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、蔗糖甘油单月桂酸酯、CHAPS等表面活性剂。上述表面活性剂在反应体系中的含量从减少抗原抗体反应的阻碍观点出发，0.3重量％以下比较好，0.1重量％以下更好。
在本实施方式的免疫反应测定方法中，作为在工序St42和工序St47中进行测定的光学特性可以测定散射光强度的变化(散射测浊法)，也可以测定来自反应体系的透射光量的变化(比浊法)。
在本实施方式中，n种各被测定物质没有特别限定，只要是利用抗原抗体反应能够测定的物质都可以。例如蛋白质、核酸、脂类、细菌、病毒以及半抗原等。特别是本实施方式的免疫反应测定方法以及试剂盒适用于以往在临床检查中利用抗原抗体反应进行测定的对象即蛋白质的测定。作为蛋白质，例如可以是LH(促黄体素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人绒毛膜促性激素)等激素，以及各种免疫球蛋白类和亚类、补体成分、各种传染病的标志物、CRP、白蛋白、血红蛋白、类风湿因子以及血型抗原等。
本实施方式中使用的抗体只要是通过与抗原特异结合，能够与抗原形成凝集复合物的就可以，没有特别限定。例如可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的任一类抗体，也可以是这些抗体的混合物。另外无论是多克隆抗体还是单克隆抗体都可以，即使是他们的混合物也可以。其中其中IgG抗体最好，这是由于IgG抗体具有难于产生非特异反应的性质，另外由于销售的产品比较多、容易买到的缘故。另外抗体来自动物的种类也没有特别限定，但由于来自兔、山羊、小鼠的抗体比较容易获得，使用的例子也比较多，所以比较好。
在本实施方式中，作为特异结合反应测定方法虽然对利用抗原抗体反应的免疫反应测定方法进行了说明，也可以通过利用抗原抗体反应以外的发生特异结合的反应使凝集复合物生成，进行测定。利用生成抗原抗体反应以外的发生特异结合的反应时，被测定物质和特异结合物质的组合如配体和受体的组合、单链DNA(被测定物质)与含有与该单链DNA互补序列的各种DNA片段之间的组合等。
作为配体和受体组合的例子，如可作为配体的分子和对该分子具有多个结合部位的变构蛋白的组合。在作为配体的分子内只存在一个与变构蛋白结合的部位时，如果通过在与变构蛋白结合部分以外的部位将作为配体的分子固定在磁性粒子、非磁性分子等上，就可以使作为配体的分子和变构蛋白的凝集复合物生成。
另外，在将单链DNA作为被测物质、将各种DNA片段作为特异结合物质时，只要以能够互补结合在作为被测物质的单链DNA上的状态将各种DNA片段固定在磁性粒子、非磁性粒子上即可。
(实施方式5)
在本实施方式中，一边参照附图一边对用于实施上述实施方式1～4的免疫反应测定方法的测定装置进行说明。
首先，参照图8对测定装置100进行说明。图8是表示本发明一实施方式中的测定装置100的构成模式图。
本实施方式的测定装置100就象图8所示的那样，备有光源101、室(反应容器)102、保持室102的室架103、对来自室102的光进行检测的光检测器104和除去手段108。
配置光源101，使其输出光对着室102。
光检测器104对来自构建在室102内的反应体系的散射光或透射光进行检测。
除去手段108是用于在上述实施方式1～4中利用磁力从反应体系中收集和除去磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物等的装置。在测定装置100中除去手段108由永久磁铁105、用于保护永久磁铁105的罩106、以及设置了永久磁铁105和罩106的臂107构成。
在此参照图9对除去手段108的操作进行说明。图9是表示测定装置100中室102和除去手段108的配置关系的图。
就象图9所示的那样，臂107可以使永久磁铁105和罩106下降，插入到室102的内部，也可以使其上升，从102室内部提起。因此，向反应体系内导入永久磁铁105和罩106，使反应体系内的磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物附着在罩106的表面。然后当反应体系的混浊大致消失时，将臂由室102中提上来。通过这样操作，就可以从反应体系内收集和除去磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物。而附着在罩上的磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物等可以用机械的方法使其脱离。例如，将永久磁铁105从罩106中拔出后，通过清洗等除去附着在罩106上的可回收的磁性粒子，或将罩106做成一次性的产品。另外用电磁铁取代永久磁铁时，可以通过电磁铁的磁力发生的开一关(ON-OFF)进行磁性粒子的收集和除去。
接下来，参照图10对测定装置200进行说明。图10是表示本实施方式的测定装置200的构成模式图。
本实施方式的测定装置就象图10表示的那样，备有光源201、备有排出口202a的室(反应容器)202、保持室202的室架203、对来自室202的光进行检测的光检测器204和除去手段208。
配置光源201，使其射出的光对着室202。
光检测器204对来自构建在室202内的反应体系的散射光或透射光进行检测。
除去手段208是用于在上述实施方式1～4中利用磁力从反应体系中收集和除去磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物等的装置。在测定装置200中除去手段208设置了电磁铁205、用于贮存来自室202排出口202a的排出物的容器206以及与室202排出口202a连接并可开闭的阀207。在此参照图11对除去手段208的操作进行说明。图11是表示测定装置200中室202和除去手段208的配置关系的图。
阀207就象图11所示的那样，与室202排出口202a连接。在这一状态下，向电磁铁205通电，室202内的反应体系中的磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物等由排出口202a通过阀207移动到容器206。然后当反应体系的混浊大致消失时，关闭阀207，停止向电磁铁205通电。通过这样操作，就可以从反应体系内收集和除去磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物。而贮存在容器206的磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物等可以通过清洗除去。或者将容器206做成一次性产品。
另外在测定装置200中也可以设置与室202相连的排出用的配管来取代容器206。
另外在测定装置200中，也可以设置图12所示的除去手段208’来取代除去手段208。就象图12所示的那样，除去手段208’设置了永久磁铁105、保持永久磁铁105的臂107、用于贮存来自室202排出口202a的排出物的容器206以及与室202排出口202a连接并可开闭的阀207。
就象图12所示的那样，臂107可使永久磁铁105上下移动。因此将永久磁铁105靠近容器206，就可以使反应体系内的磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物排出到容器206内。然后当反应体系的混浊大致消失时，关闭阀207，使永久磁铁105离开容器206。通过这样操作，就可以从反应体系内收集和除去磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物。而贮存在容器206的磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物等通过清洗就可以除去。或者将容器206做成一次性的。
对于使用含有永久磁铁105的除去手段108和208’的场合，在对反应体系的光学特性进行测定时，要预先使永久磁铁105在离开室202的地方待机，在测定结束后再使除去手段108和208’操作，以便收集和除去室202内的磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物等。
在使用含有电磁铁205的除去手段108时，可以将电磁铁205配置在室202附近。这是因为电磁铁205在不通电的状态下几乎不产生磁力。因此对光学特性进行测定时，最理想的是使除去手段108和208’操作做到不通电就不产生磁力，测定结束后通电产生磁力，这样就可以除去室202内的磁性粒子、磁性复合物以及凝集复合物等。上述任一种场合，都是为了在对反应体系的光学特性进行测定时尽可能地减少磁力对抗原抗体反应的影响。
此时，最好是预先用与反应体系同样的缓冲液充满容器206。通过这样操作，可以减少室202内的反应体系的体积变化。而由于室202内的反应体系的体积的变化小，在对反应体系的光学特性进行测定时，也可以只考虑在测定中追加的试剂的容量。因此，从光学特性的测定值推定被测定物质的浓度变得容易。
实施例
以下对本发明的实施例进行详细说明。而以下给出的实施例并不限定本发明。
在本实施例中表示了上述实施方式2中的第1被测定物质为人血红蛋白，第2被测定物质为人白蛋白，第1特异结合物质为抗人血红蛋白抗体，第2特异结合物质为抗人白蛋白抗体，在非磁性粒子上没有固定第2特异结合物质时的试剂的构成方法。
另外在本实施例表示的缓冲液等的制备中使用了经Milli-Q SP TOC(Millipore制造)过滤的纯水。而没有特别记载的盐、缓冲剂等试剂都为和光纯药工业制造的产品，聚乙二醇6000使用1级试剂，而其他的试剂使用特级试剂。
作为第1特异结合物质的抗人血红蛋白抗体以及作为第2特异结合物质的抗人白蛋白抗体的制备如下。
首先，抗人血清白蛋白抗体是使用蛋白A柱层析从免疫了人白蛋白(和光纯药工业制造)的兔子探集的抗血清中对IgG级分进行纯化后制备的。填充在柱子中的蛋白A固定化胶使用Amersham Pharmacia制造的胶。纯化中使用的平衡缓冲液是组成为1.5M甘氨酸、3.0MNaCl，pH8.9的缓冲液，洗脱缓冲液液使用pH4.0的0.1M柠檬酸缓冲液。
纯化象下述那样进行。使容量为充填到柱子凝胶容量5倍的平衡缓冲液流过柱子，对柱子进行平衡后，将容量为柱子总容量10～20％的含有抗体的抗血清用平衡缓冲液稀释2倍后上到柱子上，使血清中的抗体结合在蛋白A上。然后，加平衡缓冲液洗柱子，一直洗到没有吸附于蛋白A上的血清成分再从柱子中出来为止。然后加洗脱缓冲液，将结合于蛋白A的抗体洗脱下来。洗脱出来的抗体级分装入分级分子量1万的透析袋中，用约100倍容量的组成为0.05M 3-(N-吗啉代)丙磺酸(Dojin制造，以下略称为MOPS)、0.15M NaCl、0.04重量％NaN3的pH7.4缓冲液透析数次，更换缓冲液成分。然后通过280nm吸光度测定来推定抗体浓度，用在透析使用的同样缓冲液进行调整，将抗体浓度调到3.0mg/ml，该溶液作为抗人白蛋白抗体溶液。抗体浓度并不限定于这个浓度。制作的抗体溶液虽然可以保存在室温下，但从防止抗体变性的角度出发，在更低的温度下保存好，保存在4℃更好。
抗人血红蛋白抗体通过使用蛋白A柱层析从做了人血红蛋白(SIGMA，Cat.No.H-7379)免疫的兔子探集的抗血清中对IgG级分进行纯化后，固定在磁性粒子上制备的。填充在柱子中的蛋白A固定化胶使用Amersham Pharmacia制造的胶。纯化中使用的平衡缓冲液使用pH7.0的0.02M Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，洗脱缓冲液使用pH2.7的0.1M甘氨酸缓冲液。透析使用的缓冲液的组成为0.05M MOPS、0.15M NaCl、0.04重量％NaN3，pH为7.4。有关利用柱层析的纯化操作、以及通过透析更换缓冲液的方法使用与制备抗人白蛋白抗体同样的方法。
然后通过280nm吸光度测定推定抗体浓度，用在透析使用的同样缓冲液进行调整，将抗体浓度调到3.0mg/ml，该溶液作为用于抗人血红蛋白抗体向磁性粒子固定的抗血红蛋白抗体溶液。
虽然磁性粒子可以制备，但也可以利用市场销售的产品。在本实施例中，使用含有粒径为1～2μm的铁的聚苯乙烯胶乳粒子-Polysciences公司制造的商品名为Polystyrene Superparamagnetic Microspheres，1-2μ(Cat.No.18190)。抗体向磁性粒子的固定如下进行。
将2.5重量％的磁性粒子0.5ml加到微量管中，然后向管中加入0.5ml的组成为0.05M MOPS、0.04重量％NaN3，pH为7.4的缓冲液，使磁性粒子悬浮，然后用离心机(TOMI精工制造，型号MRX-150)于12,000rpm下离心30分钟，使磁性粒子沉淀，除去上清。
然后再向管中加1ml的组成为0.05M MOPS、0.04重量％NaN3，pH为7.4的缓冲液，使磁性粒子悬浮，于12,000rpm下离心30分钟，使磁性粒子沉淀，除去上清。再度反复进行该磁性粒子的悬浮、以及离心沉淀。
然后加入0.9ml的组成为0.05M MOPS、0.04重量％NaN3，pH为7.4的缓冲液，使磁性粒子悬浮，加入0.1ml上述制备的用于向磁性粒子固定的抗血红蛋白抗体溶液。然后用旋转器(TAITEC公司制造、型号RT-50)搅拌过夜。搅拌后，于12,000rpm下离心30分钟，再度使磁性粒子沉淀，除去上清。再加入组成为0.05M MOPS、1重量％钠酪蛋白、0.04重量％NaN3，pH为7.4的缓冲液，使磁性粒子悬浮，用旋转器搅拌30分钟。搅拌后，于12,000rpm下离心30分钟，再度使磁性粒子沉淀。共计反复进行3次该磁性粒子的悬浮、以及离心沉淀，对没有固定抗体的磁性粒子的表面进行封闭。
再加入组成为0.05M MOPS、0.15M NaCl、0.04重量％NaN3、5体积％甘油、pH为7.4的缓冲液，使磁性粒子悬浮。而固定中使用的抗体浓度以及磁性粒子的浓度并不限定于上述值。制作的抗体溶液虽然可以保存在室温下，但从防止抗体变性的角度出发，在更低的温度下保存好，保存在4℃更好。
为了测定人血红蛋白，作为加入到反应体系的第1缓冲液制备组成为0.05M MOPS、0.04重量％NaN3、pH为7.4的缓冲液，作为用于测定人白蛋白而加入到反应体系的第2缓冲液制备组成为0.05M MOPS、8.6重量％聚乙二醇6,000、0.04重量％NaN3、pH为7.4的缓冲液。制作的各个缓冲液保存在室温下。
通过将象上述那样构成的固定了抗人血红蛋白抗体(第1特异结合物质)的磁性粒子、抗人白蛋白抗体(第2特异结合物质)、各个缓冲液进行组合，可以构成免疫反应用试剂。
以下给出了上述构成的试剂的使用方法。首先，将含有2种被测定物质(人血红蛋白和人白蛋白)的样品、固定了抗人血红蛋白抗体(第1特异结合物质)的磁性粒子、第1缓冲液进行混合，构建反应体系。然后对反应体系的光学特性进行测定。测定结束后，通过磁力，将由血红蛋白(第1被测定物质)、抗人血红蛋白抗体(第1特异结合物质)和磁性粒子构成的凝集复合物、以及没有形成凝集复合物的磁性粒子进行收集，消除反应体系的混浊。
接下来将抗人白蛋白抗体(第2特异结合物质)溶液和第2缓冲液混合在反应体系中。然后对反应体系的光学特性进行测定。通过以上操作程序可以知道样品中的被测定物质的浓度。
另外虽然本实施例中没有给出，但也可以使抗人血清白蛋白抗体(第2特异结合物质)固定于胶乳、胶体金等非磁性粒子上。例如使抗体向胶乳粒子固定的方法可以直接运用上述叙述的在磁性粒子中使用的方法。
另外在本实施例中，虽然是用钠酪蛋白对没有固定抗体的粒子表面进行了封闭，但也可以用明胶、脱脂乳等代替钠酪蛋白。使用的浓度可以与钠酪蛋白一样。
另外在本实施例中为了构建反应体系，对每个被测定物质都准备了缓冲液，也可以通过添加了聚乙二醇等水溶性高分子的一类缓冲液构成各个反应体系。
另外抗体溶液的缓冲剂成分和pH只要对通过抗原和抗体的结合发生的免疫反应不带来坏的影响，并不限定于上述组成和pH。
另外为了取出红血球中含有的血红蛋白，向反应体系中添加例如氯化钾等溶血剂，或在试剂盒中附加含有溶血剂的溶液也可以。
以上，利用本发明的免疫反应测定方法和试剂盒，可以在一个反应容器内对2种被测定物质进行测定。
本发明可以提供能够在一个反应容器内对2种以上被测定物质进行测定、能够减少测定需要的样品的特异结合反应测定方法和该方法中使用的试剂盒以及测定装置。
本发明的特异结合反应测定方法、该方法中使用的试剂盒以及特异结合反应测定装置可用于各种各样疾病的诊断以及病状过程的调查。例如，如果将本发明的构成作为对来自一个样品的人血红蛋白和人白蛋白进行测定的构成，可用于肾脏疾病的诊断。

Claims (15)

1.一种特异结合反应测定方法，对样品中第1被测定物质和第2被测定物质的含量进行测定，包括以下工序：
构建含有所述样品、固定了与所述第1被测定物质特异结合的第1特异结合物质的磁性粒子的反应体系的工序(a)；
在所述工序(a)后，对所述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；
在所述工序(b)之后，利用磁力从所述反应体系中收集含有所述第1被测定物质和所述第1特异结合物质以及所述磁性粒子的凝集复合物的工序(c)；
向所述反应体系中添加与所述第2被测定物质特异结合的第2特异结合物质的工序(d)；
在所述工序(d)后，对所述反应体系的光学特性进行测定的工序(e)，
所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
2.根据权利要求1所述的特异结合反应测定方法，其中，在所述工序(d)中，反应体系含有2～6重量％的聚乙二醇。
3.根据权利要求1所述的特异结合反应测定方法，其中，所述第2特异结合物质由与所述第2被测定物质特异结合的抗原或抗体以及由固定了所述抗原或抗体的非磁性粒子构成。
4.根据权利要求3所述的特异结合反应测定方法，其中，
所述磁性粒子的直径在0.05～2μm范围内，
所述非磁性粒子的直径在0.05～2μm范围内。
5.根据权利要求1所述的特异结合反应测定方法，其中，
所述的第1被测定物质和所述第2被测定物质的组合是人血红蛋白和人白蛋白的组合。
6.根据权利要求1所述的特异结合反应测定方法，其中，在所述工序(c)中收集残存于所述反应体系的所述磁性粒子。
7.一种特异结合反应测定方法，对样品中n种、其中n为2以上的整数的被测定物质的含量进行测定，包括以下工序：
构建含有所述样品、固定了与未测定的被测定物质中的一种特异结合的特异结合物质的磁性粒子的反应体系的工序(a)；
在所述工序(a)后，对所述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；
在所述工序(b)之后，利用磁力从所述反应体系中除去含有所述一种被测定物质和所述特异结合物质以及所述磁性粒子的凝集复合物的工序(c)；
在所述工序(c)后，进行判断的工序(d)，以便使在所述工序(b)不到第(n-1)次时，再次进入到工序(a)；
向所述反应体系中添加与所述反应体系中剩下的一种未测定的被测定物质特异结合的特异结合物质的工序(e)；
在所述工序(e)后，对所述反应体系的光学特性进行测定的工序(f)，
所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
8.根据权利要求7所述的特异结合反应测定方法，其中，
在工序(c)中，从所述反应体系除去残存于所述反应体系中的所述磁性粒子。
9.一种特异结合反应测定方法，对样品中n种、其中n为2以上的整数的被测定物质的含量进行测定，包括以下工序：
构建含有所述样品、固定了与未测定的被测定物质中的一种特异结合的特异结合物质的磁性粒子的反应体系的工序(a)；
在所述工序(a)后，对所述反应体系的光学特性进行测定的工序(b)；
在所述工序(b)之后，向反应体系添加含有可与由所述一种被测定物质和所述特异结合物质构成的凝集复合物结合的物质和磁性粒子的磁性复合物的工序(c)；
利用磁力从所述反应体系中除去结合了所述磁性复合物的所述凝集复合物的工序(d)；
在所述工序(d)后，进行判断工序的(e)，以便使在所述工序(b)不到第(n-1)次时，再次进入到工序(a)；
向所述反应体系中添加与所述反应体系中剩下的一种未测定的被物质特异结合的特异结合物质的工序(f)；
在所述工序(e)后，对所述反应体系的光学特性进行测定的工序(g)，
所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
10.根据权利要求9所述的特异结合反应测定方法，其中，在所述工序(c)中，从所述反应体系中除去没有与所述凝集复合物结合的所述磁性复合物。
11.一种试剂盒，用于对样品中第1被测定物质以及第2被测定物质的含量进行测定，含有：
固定了与所述第1被测定物质特异结合的第1特异结合物质的磁性粒子；以及
与所述第2被测定物质特异结合的第2特异结合物质，
所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，
所述磁性粒子的直径在0.05～2μm范围内。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，
所述第2特异结合物质，由与所述第2特异结合物质特异结合的抗原或抗体以及固定了所述抗原或抗体的非磁性粒子构成。
14.一种试剂盒，用于对样品中n种、其中n为2以上的整数的被测定物质的含量进行测定，含有：
与所述n种被测定物质中的一种被测定物质特异结合的一种特异结合物质；
分别固定有与所述被测定物质中剩下的(n-1)种被测定物质特异结合的特异结合物质的(n-1)种磁性粒子，
所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
15.一种试剂盒，用于对样品中n种、其中n为2以上的整数的被测定物质的含量进行测定，含有：
分别与所述n种被测定物质特异结合的n种特异结合物质，
由可与由所述n种被测定物质中的(n-1)种被测定物质和与这些物质对应的(n-1)种特异结合物质构成的凝集复合物结合的物质、以及固定有所述物质的磁性粒子构成的磁性复合物，
所述被测定物质与对该被测定物质特异结合的所述特异结合物质的组合，是抗原与抗体的组合、以及单链DNA与具有与该单链DNA互补的序列的DNA片段之间的组合中的至少一种组合。
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