JPH0737989B2 - 免疫反応の測定方法および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の利用分野） 本発明は、生体物質の微量を検出測定するために適用さ
れる免疫反応の測定方法および装置に関するものであ
る。

（発明の背景） 免疫反応の測定法については、生体物質の微量検出のた
めに用いられる免疫学的手法として近時数多くの研究、
提案がなされており、例えばラジオイムノアツセイ、蛍
光抗体法、酵素抗体法、酵素免疫測定法等々のものが知
られている。

これらの種々の方法は、要するに特異的反応を行なう抗
原、抗体（あるいは抗原体を用いる場合等においても同
じ）のいずれかに標識を結合して抗原−抗体−標識ある
いは抗体−抗原−標識の複合体を生成させ、この複合体
の量を標識を目安として検出定量する方法として代表的
に説明される。複合体は抗原又は抗体の一方をセルの内
壁面に固定することでこの内壁上に結合して生成される
か、あるいはセル内に填加されたビーズ（粒体）の表面
に前記抗原又は抗体の一方を固定してこのビーズ表面で
生成される。

そして前記した標識として放射性物質を用いたラジオイ
ムノアツセイを除く他の方法は、蛍光物質又は発光物質
を標識としてこれを直接光学的に測定するか、あるいは
酵素を標識として用い、この酵素（の活性）を利用して
（基質に生じた変化）蛍光吸光度又は発光を光学的に測
定するものである。

光学的測定の手法は様々であるが、原理的には、試料反
応室であるセルを提供するマイクロタイタプレートある
いは個々の独立のテストカップで形成される反応室（以
下セルという）に対して、セルからの射出光を受ける光
強度測定用の光学系を対向させて行なわれる。

ところで、免疫反応の測定での検出対象は、通常10^-13m
ol/以下というような極めて微少量のものであり、前
記した光学系等に高精度のものを使用するにしても測定
誤差の要因は出来るだけ排除されるべきことは言うまで
もない。

本発明者がかかる観点から種々の検討を加えたところに
よると、前述した免疫反応測定法の一つの手法として知
られる前述したビーズを用いる方法においては、ビーズ
の存在が測定誤差として影響する問題のあることを知見
するに至った。これはセルからの射出光を測定する光学
系の測定領域が、セル内の更に一部に限定されているの
が普通であることから、セル内でのビーズの偏在が測定
に影響（光学系の測定領域内にビーズが存在しているか
否かにより影響）するためと理解された。

（発明の目的） 本発明は以上のような観点から、セル内に填加したビー
ズの表面で免疫反応を行なわせる測定方法において、光
学的測定時の誤差を可及的小ならしめるために有効な方
法、並びにこのために適用される装置を提供することを
目的としてなされたものである。

（発明の概要） 而してかかる目的を達成するためになされた本発明方法
の特徴は、抗原抗体反応の反応室を提供するセル内に填
加した非分散性の磁性ビーズ表面に抗原，抗体及び標識
を結合した複合体を生成させ、このビーズ表面に生成さ
れた複合体の標識の量を、前記セルの底面のうちの一部
を測定領域として光学的測定を行う方法であって、前記
複合体を担持したビーズを外部からの振動磁界の作用に
より前記セル内で振動させて前記測定領域におけるビー
ズの存在確率を平均化させながら、前記光学的測定を行
うことを特徴とするところにある。上記においてビーズ
が「非分散性」であるというのは、粒径の小さい（例え
ばμｍオーダー以下）微粒子が反応液中で懸濁分散する
分散性の性質をもたない例えばmmオーダーであることを
いう。

またかかる方法を好適に実現するための本発明よりなる
装置の特徴は、抗原抗体反応の反応室を提供する有底の
セルと、このセル内に填加されて抗原，抗体及び標識の
結合した複合体の担持表面を提供し、かつ磁性体を含む
ビーズと、該セル底面の一部として設定した測定領域か
らの射出光強度を測定してビーズ表面に担持された標識
の量を検出する光学的測定手段と、セル外部より振動磁
界を作用して測定時における前記測定領域の前記ビーズ
の存在確率を平均化する磁石装置とを備えたことを特徴
とするところにある。

本発明においてセル内でビーズを振動させるようにした
のは、これによってセル内の限定された光学的測定領域
におけるビーズの存在確率を平均化させ、これによりビ
ーズの偏在による誤差をなくすためである。したがって
かかる目的のために与えられるビーズの振動の程度は、
通常10rpm〜800rpm好ましくは60rpm〜360rpmとすること
がよく、振幅はセル内の全域に渡るようにすることが望
ましい。上記振動が10rpm以下では撹拌が不十分で、ま
たビーズの動きによる例えば蛍光強度のゆらぎ（強弱）
が生じ光強度測定の正確さが不安定となる。また上記振
動が800rpm以上ではビーズに振動を及ぼすマグネットの
機械的動きにビーズが追随できなくなって撹拌の効率が
低下する。振動は往復動、円運動、楕円運動、８の字運
動等いずれであってもよい。

本発明においてセル内のビーズのみを振動させるように
したのは、セルを提供するテストカップ等自体を機械的
に振動させるような方法では、内部液状試料のセル外へ
の飛散、ビーズの充分な振動が得にくい等の難点がある
ためである。

本発明装置において用いられるビーズは磁性体（好まし
くは常磁性体）を含み、振動する磁界作用によって移動
されるものであればよいが、好ましくは、例えばMn−Zn
−フェライト等の磁性体粉をポリスチレン、EVA等の合
成樹脂バインダーで結着し、表層としてグリシジルメタ
アクリテートポリマー等のアミノ基、水酸基、エポキシ
基、アルデヒド基等を有するものが好ましい。抗原又は
抗体のビーズ表面への固体は既知の方法に従えばよい。

ビーズに振動する磁界作用を及ぼす磁石装置としては、
簡単には例えば前記テストカップ等の配設位置に近接し
て、磁石の固定されたロッドを往復動させる機構、電磁
石を用い磁界を生じさせる機構などによって構成するこ
とができる。

本発明は、ビーズを用い、かつ光学的な測定を行なう種
々の免疫反応測定法に適用され、具体的に例示すれば、
前述した標識として蛍光物質（フルオレツセイン等）又
は発光物質（イソルミノール、ルミノール等）を用いて
その光強度を測定する方法、あるいは標識として酵素
（β−Ｄ−ガーラクトシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、グルコースオキシターゼ、ペルオキシターゼ）を
用い、この酵素活性の作用を受ける基質の蛍光又は吸光
を測定する方法に適用される。

（発明の実施例） 以下本発明の一実施例について図面に基づき説明する。

第１図の測定光学系の構成概要を示した図、第２図
（ａ）、（ｂ）は振動磁石を作用する磁石装置の構成概
要一例を示した面である。

図において１は搬送路３上に搬送可能にされたテストプ
レートであり、多数のカップ支持用開口２、２…が設け
られている。

４は前記開口２に嵌挿固定支持されたテストカップであ
り、本例のテストカップ４は、たとえば黒鉛含有のポリ
スチレン樹脂から作られた透磁性、不透明体により上方
開放型の円筒体として形成され、反応室であるセルを提
供する。

５はテストカップ４内に填加されたビーズであり、これ
は磁性体を含み、かつ表面に測定対象と特異的に結合す
る第１抗体が既知の方法によって担持固定されている。

６は前記テストプレート１の搬送路９の下側に配置され
たロッドであり、不図示の駆動モータ等によって回転さ
れるカム機構７によって第２矢印方向に所定ストローク
で往復動されるようになってる。そしてこのロッド６、
６…上には各テストカップ４に対向するように多数の磁
石８、８…が図示の如く固着されている。

したがってロッド６の往復動に従って、テストカップ４
内のビーズ５は同方向に円運動、楕円運動、８の字運動
等されることになる。

テストカップ４に対して、本例では第１図に模式的に示
した光学測定装置（例えば公知のマイクロプレート蛍光
自動読取器）を上方側に配置させ、光源光を入射Ａさせ
て射出蛍光Ｂを測定するようになっている。

すなわち第１図に示された公知の光学測定装置は、酵素
を結合した複合体（コンジュゲート）が免疫反応によっ
て表面に固定されているビーズ５および前記酵素の活性
によって光学的に検知可能な変化を生ずる基質溶液８を
充填しているテストカップ４に対し、光源20からの光源
光を、励起側フィルタ21を通しダイクロイックミラー22
から集光レンズ23を経て入射させ、次いでこのテストカ
ップ４から射出光を集光レンズ23、ダイクロイックミラ
ー22、受光側ミラー24を経て受光センサ25で受光し、所
定の信号所理回路（図示せず）で検出光強度を検出する
ようになっている。

以上の構成において、既知の酵素免疫測定法に従い、例
えばビーズ表面に（ビーズ固体の第１抗体（抗HCG））
−（抗原（HCG））−（酵素（アルカリフォスファター
ゼ）で標識された第２抗体（抗HCG））の複合体を生成
させ、遊離の第２抗体等を除去するB/F分離を行なった
後、前記酵素の活性作用を受けて蛍光を生ずる基質溶液
（４−メチルウンベリフェリルリン酸モノエステル）を
填加し、ロッド６の往復動によるビーズ５の振動を与え
ながら前記のように基質に現われた蛍光強度の変化を測
定する。

このようにすれば、テストカップ内の限定された光学的
測定領域に対して振動するビーズの存在確率は、測光時
において平均化され、ビーズがセル内に存在することに
伴って従来生じていた測定誤差の難点は解消されるもの
となる。

また本例においては、ビーズの振動がセル内における基
質の撹拌を与えるために、酵素活性による基質の蛍光強
度の増大が、酵素の存在量に比例して明瞭に現われると
いう効果が得られ、蛍光強度の増大率を目安として酵素
ひいては抗原と定量測定が一層正確に行なえるという利
点もある。

実施例 測定対象物質としてフェリチンを用い、内径8mmの容器
に直径約1mmのビーズを12コ添加して使用した。

ビーズ振動のために使用したロッド６上に固定の磁石
８、８…は、直径5mm,厚さ3mmの円形の希土類磁石を、
第２図（ロ）の状態でピッチ16mm,2列（左右列の磁石の
中心間距離5mm）に配置して構成した。

第一反応40分間は振動（ストローク48mm、80rpm）する
磁石装置下で抗原抗体反応させ、B/F分離後、酵素基質
溶液を加え、前記した振動下、及び比較のため非振動下
で、酵素により分解され生成した蛍光物質（４メチルウ
ンベリフェロン）の量の変化を蛍光強度の増加率で測定
した。

結果は下記第１表、第２表に示した。

振動下測定において測定回数10における再現性（変動係
数CV％，カッコ内は標準偏差）は、フェリチンの０濃度
で7.08％（0.09％）、低（Ｌ）濃度（約50ng/ml）で4.4
5％（0.21％）、中（Ｍ）濃度（約500ng/ml）で4.40％
（1.62％）、高（Ｈ）濃度（約500ng/ml）で3.70％（2.
24％）であった。

これに対して非振動下測定では、各々29.53％（0.34
％）、18.26％（0.84％）、19.11％（5.23％）、10.14
％（4.36％）と再現性が非常に悪くなっている。

また、非振動下では、蛍光物質の生成速度が高濃度領域
で低下し、振動下で示されている直線性が失われる。こ
れらの結果は、ビーズ表面での基質の出入りが十分行な
われていないためである。

以上の結果より、光学的測定時の誤差及び当反応時にお
ける円滑さを増強する効果が明らかである。

なお本実施例においては、酵素を利用した免疫測定法と
して基質の蛍光強度を測定するものを示したが、これは
基質の吸光度を測定する方式であってもよいし、また標
識として酵素でなく、蛍光物質又は発光物質を用いた方
式のものであってもよく、これらのいずれにおいても、
セル内の限定された光学的測定領域におけるビーズの存
在確率が、該ビーズの振動によって平均化されることに
基づく効果は同様に得られる。

（発明の効果） 本発明は以上述べたように、免疫反応が行なわれるセル
内の填加のビースを外部から作用する振動磁界により振
動させて、測定領域におけるビーズの存在確率を平均化
させながら、前記光学的測定を行うようにしたので、ビ
ーズの存在に基づく光学的測定誤差を大幅に低減させる
ことができ、一般に極めて微量な定量を行うこの種の測
定における測定精度を向上させることができ、その利益
は極めて大なるものである。

【図面の簡単な説明】

図面第１図は本発明の一実施例を説明するための光学測
定装置の構成概要一例を示した図、第２図（ａ）、
（ｂ）はビーズ振動装置の構成例を拡大して示した図で
ある。 １……テストプレート、２……開口 ３……搬送路、４……テストカップ ５……ビーズ、６……ロッド ７……カム機構、８……円形の希土類磁石 ９……基質溶液、20……光源 21……励起側フィルタ 22……ダイクロイックミラー 23……集光レンズ、24……受光側フィルタ 25……受光センサ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗原抗体反応の反応室を提供するセル内に
   填加した非分散性の磁性ビーズ表面に抗原，抗体及び標
   識を結合した複合体を生成させ、このビーズ表面に生成
   された複合体の標識の量を、前記セルの底面のうちの一
   部を測定領域として光学的測定を行う方法であって、 前記複合体を担持したビーズを外部からの振動磁界の作
   用により前記セル内で振動させて前記測定領域における
   ビーズの存在確率を平均化させながら、前記光学的測定
   を行うことを特徴とする免疫反応測定方法。
2. 【請求項２】上記標識が酵素であって、この酵素の活性
   で変化する基質の光学的変化を測定することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の免疫反応測定方法。
3. 【請求項３】抗原抗体反応の反応室を提供する有底のセ
   ルと、このセル内に填加されて抗原，抗体及び標識の結
   合した複合体の担持表面を提供し、かつ磁性体を含む非
   分散性のビーズと、該セル底面の一部として設定した測
   定領域からの射出光強度を測定してビーズ表面に担持さ
   れた標識の量を検出する光学的測定手段と、セル外部よ
   り振動磁界を作用して測定時における前記測定領域の前
   記ビーズの存在確率を平均化する磁石装置とを備えたこ
   とを特徴とする免疫反応測定装置。