CN105324489A - 多分析物试验 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用全类属抗体来检测样品中的细菌的装置和方法。本发明涉及利用固定于颗粒上的多价结合剂的结合试验，尤其是免疫试验。本发明还涉及增大颗粒的大小提高了筛选的敏感性这一令人惊讶的发现。特别是，本发明提供了用于检测样品中的细菌的侧向流动装置，该装置包括用于样品的流动通道，并且进一步包括对于一种或多种细菌抗原特异性的全类属(pan-generic)结合剂，其中所述全类属结合剂通过衔接物固定于一群特定大小的可检测颗粒上；和捕获结合细菌抗原的颗粒群的捕获结合剂，其中捕获结合剂固定于流动通道上，并且其中可检测颗粒群沿着流动通道排列，使得样品在与捕获结合剂接触之前与可检测颗粒群接触。

Description

多分析物试验
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月4日提交的美国临时专利申请No.61/772,518和61/772,521的益处。将那些申请的每一篇的公开内容全部按引用并入本文中。
发明领域
本发明涉及利用固定于颗粒上的多价结合剂的结合试验，尤其是免疫试验。本发明还涉及增大颗粒的大小提高了筛选的敏感性这一令人惊讶的发现。
发明背景
测试液体样品的细菌污染是各种领域中的重要组成部分，如医学(例如，测试用于输血的血样)、环境安全(例如，测试用于人使用的水样)和食品安全(例如，测试用于食用的食品和饮料样品)。细菌测试的重要性需要快速、灵敏和特异性足够宽泛以检测多种细菌种和属的测试。试验中的实际限制，如检测剂(例如，细菌抗原结合抗体)的量或“阳性”结果的可视性可以控制目前的细菌测试方法来满足这些需求的能力。因此，需要用于快速、宽泛和灵敏地检测细菌的改良试剂、装置和方法。
发明简述
在第一个方面中，本发明提供了用于检测样品中的细菌的侧向流动装置，该装置包括用于样品的流动通道，并且进一步包括对于一种或多种细菌抗原特异性的全类属(pan-generic)结合剂，其中所述全类属结合剂通过衔接物固定于一群特定大小的可检测颗粒上；和捕获结合细菌抗原的颗粒群的捕获结合剂，其中捕获结合剂固定于流动通道上，并且其中可检测颗粒群沿着流动通道排列，使得样品在与捕获结合剂接触之前与可检测颗粒群接触。在一些实施方案中，可检测颗粒是化学发光、发光、荧光、磁或有色颗粒。为了方便，将使用术语“有色颗粒”，但本发明考虑了使用其他形式的可检测颗粒的实施方案。在利用有色颗粒的实施方案中，颗粒可以是金、银或铂颗粒。在一些实施方案中，颗粒直径为约60至约120nm。在一些实施方案中，颗粒直径为约80nm。
在一些实施方案中，全类属结合剂特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原。在一些这样的实施方案中，全类属多克隆抗体结合脂磷壁质酸(LTA)。在一些实施方案中，全类属结合剂特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些这样的实施方案中，全类属多克隆抗体结合细菌脂多糖结构(LPS)。在一些实施方案中，至少一种全类属结合剂特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原而至少一种全类属结合剂特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，全类属结合剂能够结合三个或更多个属的细菌。在一些实施方案中，衔接物是蛋白A、蛋白G或蛋白L。
在一些实施方案中，全类属结合剂是抗体。在一些实施方案中，全类属结合剂包括两种或更多种全类属抗体，其中每种全类属抗体特异性地结合一种或多种细菌抗原。在各种实施方案中，每种全类属抗体固定于有色颗粒的分开亚群上或相同的亚群上。在一些实施方案中，可以将全类属结合剂与一种或多种非全类属的结合剂组合。例如，不是全类属的结合剂可以结合一个或多个种或菌株的细菌，但不是结合到多个属上。
在一些实施方案中，一个或多个颗粒群包括第一个颗粒群和第二个颗粒群。在一些实施方案中，第一个颗粒群具有一种或多种对一种或多种第一个抗原群具有特异性的结合剂，而第二个颗粒群具有一种或多种对一种或多种第二个抗原群具有特异性的结合剂，其中第一个一种或多种抗原群和第二个一种或多种抗原群彼此不同。
在一些实施方案中，全类属抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体以及多克隆和单克隆抗体的组合。在一些实施方案中，全类属抗体是多克隆的，并且结合多种细菌抗原。在一些实施方案中，全类属抗体是多克隆的并且结合多种革兰氏阳性细菌抗原。在一些实施方案中，全类属抗体是多克隆的并且结合多种革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，全类属抗体是多克隆的，并且结合多种革兰氏阴性细菌抗原和革兰氏阳性细菌抗原。在一些实施方案中，至少一种全类属抗体是单克隆全类属抗体和至少一种全类属抗体是多克隆全类属抗体。
在一些实施方案中，全类属抗体特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原。在一些实施方案中，全类属抗体特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，至少一种全类属抗体特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原和至少一种全类属抗体特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，全类属抗体能够结合三个或多个属的细菌。
在一些实施方案中，装置包括至少三种特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原的全类属结合剂，每种全类属结合剂固定于有色颗粒的分开亚群上；和至少三种特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原的全类属结合剂，每种全类属结合剂固定于有色颗粒的分开亚群上。在一些实施方案中，至少一种全类属结合剂是抗体。在一些实施方案中，至少一种全类属抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，颗粒的亚群是不同大小的。在一些实施方案中，颗粒是金、银或铂。在一些实施方案中，至少一些颗粒的直径为约20nm至约120nm。在一些实施方案中，至少一些颗粒是直径约20nm至约120nm的金颗粒。在一些实施方案中，至少一个颗粒群(例如，金颗粒群)包括80nm颗粒。在一些实施方案中，至少一个颗粒群(例如，金颗粒群)包括40nm颗粒。
在一些实施方案中，捕获结合剂是特异性地结合细菌抗原的全类属抗体。在一些实施方案中，捕获结合剂与全类属结合剂相同。在一些实施方案中，捕获抗体固定于样品流动通道上的一个或多个位置中。在一些实施方案中，样品流动通道是吸收膜。在一些实施方案中，吸收膜是硝基纤维素。
在一些实施方案中，将有色颗粒在安置在吸收膜上并且与膜的上表面接触的固体支持物表面内干燥。
在第二个方面中，本发明提供了检测样品中存在或不存在细菌的方法，包括使样品与细菌抗原特异性的全类属结合剂接触，其中全类属结合剂通过衔接物固定于有色颗粒上，并且其中使样品在允许全类属结合剂和细菌抗原之间结合形成结合剂-细菌抗原复合物的条件下与全类属结合剂接触，并且进一步包括使固定的细菌抗原特异性的捕获结合剂在允许固定的捕获结合剂和颗粒-全类属结合剂-细菌抗原复合物之间结合的条件下与有色颗粒接触，其中通过捕获结合剂捕获带有全类属结合剂的有色颗粒表明样品中存在细菌。在一些实施方案中，在进行试验前，将少量可溶性全类属结合剂添加到样品中。如此少量是足以提高系统信号的量。
在一些实施方案中，该方法包括使根据本发明第一个方面的装置在允许捕获抗体结合带有全类属抗体的有色颗粒的条件下与全类属抗体接触，其中通过捕获抗体捕获颗粒表明样品中存在细菌。
在一些实施方案中，样品已经经过预处理。
根据本发明，样品可以是怀疑含有细菌的任何液体样品。在一些实施方案中，样品是生物流体，包括尿液、痰液、脊髓液、腹水、血液和血液制品。在一些实施方案中，样品是怀疑含有细菌的任何样品。在一些实施方案中，样品是血液或血液制品。在一些实施方案中，血液或血液制品选自：全血、白血球、造血干细胞、血小板、红细胞、血浆、骨髓和血清。
在一些实施方案中，血液或血液制品，如血小板，来自用于输血给接受者的捐献者。在一些实施方案中，样品是透析样品。在一些实施方案中，透析样品选自血液透析流体和腹膜透析流体。在一些实施方案中，样品是其中已经保存了组织(如来自用于输血给接受者的捐献者的组织)的流体样品。在一些实施方案中，组织选自：血细胞培养物、干细胞培养物、皮肤和骨和软骨移植物材料。在一些实施方案中，样品是来自肺、支气管肺泡、腹膜或关节内窥镜检查灌洗的样品。在一些实施方案中，样品是环境样品，如水和土壤。在一些实施方案中，样品是食物或饮料。本领域技术人员将认识到在其中样品来源是固体形式的情况中，如土壤或固体食物，样品可以是从固体形式提取的液体或已经与固体形式接触的液体。在一些实施方案中，样品是生物样品，例如，尿液、泪液、痰液或脑脊髓液。
在第三个方面中，本发明提供了用于结合试验中的试剂，包括选自金颗粒、银颗粒和铂颗粒的颗粒，其中颗粒大小为约20nm至约120nm，并且其中颗粒通过衔接物结合多特异性全类属结合剂。在一些实施方案中，颗粒大小约80nm。在一些实施方案中，衔接物选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。在一些实施方案中，衔接物是蛋白A。在一些实施方案中，颗粒是金。
在第四个方面中，本发明提供了检测样品中的物质的方法，包括将样品与根据本发明第三个方面的试剂混合，其中物质与试剂的结合形成可检测的复合物；并且检测复合物。
在第五个方面中，本发明提供了制备具有非常高的衔接物表面密度并且由此具有非常高的结合剂表面密度的颗粒的方法。根据这个方面的方法包括用高浓度的衔接物孵育有色颗粒。
在第六个方面中，本发明提供了利用两个或更多个可检测颗粒群检测多分析物样品中的分析物的基于结合可检测颗粒的结合剂的装置，其中第一个可检测颗粒群是直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个可检测颗粒群为直径大于约60nm至约120nm的颗粒。在某些实施方案中，第一个可检测颗粒群结合到一种或多种对第一个分析物群具有特异性的结合剂上而第二个可检测颗粒群结合到一种或多种对第二个分析物群具有特异性的结合剂上。
在第七个方面中，本发明提供了用于检测样品中的细菌的测向流动装置，该装置包括用于样品的流动通道，并且进一步包括特异性地结合细菌抗原的结合剂，其中结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上。在某些实施方案中，第一个颗粒群包括直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm的颗粒。在进一步的实施方案中，第一个颗粒群结合到一种或多种对第一个分析物群具有特异性的结合剂上而第二个颗粒群结合到一种或多种对第二个分析物群具有特异性的结合剂上。在再进一步的实施方案中，固定于流动通道上的捕获结合剂捕获一个或多个颗粒群。在这些实施方案中，可检测颗粒群沿着流动通道排列，使得样品在与捕获结合剂接触之前与可检测颗粒群接触。
在第八个方面中，本发明提供了检测样品中的分析物的方法，包括使样品与一种或多种对一种或多种分析物具有特异性的结合剂接触。在这些实施方案中，将一种或多种结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上。在某些实施方案中，第一个可检测颗粒群包括直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个可检测颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm的颗粒。在进一步的实施方案中，第一个可检测颗粒群结合到一群对第一个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上而第二个可检测颗粒群结合到一群对第二个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上。在再进一步的实施方案中，使样品在允许结合剂和分析物之间结合的条件下与一种或多种结合剂接触，其中结合剂被分析物结合表明样品中分析物的存在。
在第九个方面中，本发明提供了提高结合试验中检测多分析物样品中的多种分析物与结合颗粒的结合剂的结合的特异性和/或敏感性的方法，包括使样品与一种或多种对一种或多种分析物具有特异性的结合剂接触。在这些实施方案中，一种或多种结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上，其中第一个可检测颗粒群包括直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个可检测颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm的颗粒。在某些实施方案中，第一个可检测颗粒群结合到对第一个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上而第二个可检测颗粒群结合到对第二个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上。在进一步的实施方案中，使样品在允许结合剂和分析物之间结合的条件下与一种或多种结合剂接触，并且结合剂被分析物结合表明样品中分析物的存在。当本发明通过使用不同直径的第一个可检测颗粒群和第二个可检测颗粒群(如上所述)提供提高结合试验的特异性和/或敏感性的方法时，敏感性和/或特异性的提高是与除了使用具有相同直径的第一个可检测颗粒群和第二个可检测颗粒群之外相同的方法相比。
在第十个方面中，本发明提供了用于检测样品中来自多个属的细菌的存在的结合试验，包括用酶处理样品来提高结合试验敏感性的步骤。
附图简述
图1A是说明了使用较大的胶态金颗粒在每个反应不同数量的颗粒下导致捕获线上较高的信号强度的图。图1B是来自模型侧向流动系统中50％稀释系列的40nm(“通用的”)金颗粒的照片，其中在兔子IgG捕获线上捕获了葡萄球菌蛋白A覆盖的颗粒。图1C是来自模型侧向流动系统中50％稀释系列的80nm(“增强的”)金颗粒的一组照片，其中在兔子IgG捕获线上捕获了葡萄球菌蛋白A覆盖的颗粒。
图2是取自模型侧向流动条带的照片。这些结果从8种不同的细菌裂解产物的十倍稀释获得，并且从108储液开始产生，并且将所得到的样品在侧向流动条带中进行处理。
优选实施方案的详述
除非本文中另外限定，本申请中使用的科学和技术术语应当具有本领域技术人员通常理解的含义。本文中描述或参考的技术和程序是公知的并且通常使用本领域公知和常用的常规方法来使用。
本申请中参考的所有出版物、专利和公开的专利申请特意按引用并入本文中。
本文中所述的本发明的每个实施方案可以单独使用或结合本发明的一个或多个其他实施方案。
定义
除非另外特意指出，提供以下针对特定术语的定义，所述术语用于以上书面描述中。
在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或变形，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”将理解为意味着包括所述的整体(或组成部分)或整体(或组成部分)的组，但不排除任何其他整体(或组成部分)或整体(或组成部分)的组。
单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数，除非文中明确另外指出。
术语“包括(including)”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
如本文中使用的，“衔接物”是结合颗粒和结合剂的任何化学部分，包括但不限于，蛋白质、其他生物分子和其他有机化合物。
如本文中使用的，“多价结合剂”是特异性地结合多分析物样品中的物质的结合剂混合物，即，包括多特异性。多价结合剂的一个实例是可以结合超过一种的细菌抗原的多克隆抗体，并且因此是多价的。
如本文中使用的，“多分析物样品”是含有多种具有彼此不同的结合特性的物质的样品，即，含有多种不同结合靶标的样品。作为非限制性实例，多分析物样品可以是含有多种不同细菌或多种不同蛋白质的样品。
如本文中使用的，“特异性地结合”意思是全类属抗体识别并结合特定的抗原或抗原组(例如，多肽、碳水化合物、脂质或糖蛋白)，而没有非特异性地结合样品中的其他分子。同样，由特异性地结合抗原的全类属抗体结合的抗原被称为全类属抗体“特异性地结合”。优选，特异性地结合配体的全类属抗体在水中，在生理条件下，或在关于离子强度(例如，140mMNaCl)和pH(例如，7.2)接近生理条件的条件下，以至少106M-1，更优选至少107M-1，甚至更优选，至少108M-1，并且最优选至少109M-1的亲和性，与配体形成结合。
如本文中使用的，“全类属”结合剂是结合超过一个属的细菌的结合剂。全类属结合剂当用于本发明的装置和方法中时能够检测超过一个属的细菌，例如，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，六个或更多个，七个或更多个，八个或更多个，九个或更多个，十个或更多个，十一或更多个，十二或更多个，十三或更多个，十四或更多个，十五或更多个，十六或更多个，十七或更多个，十八或更多个，十九或更多个，或二十或更多个属的细菌。在一些实施方案中，全类属结合剂是一种或多种全类属抗体，如第一个方面中所述的。在一些实施方案中，全类属结合剂特异性地结合超过一个属的细菌中存在的抗原。作为非限制性实例，特异性地结合两个或更多个属的革兰氏阴性细菌上的脂多糖的抗体是全类属结合剂。同样，特异性地结合两个或更多个属的革兰氏阳性细菌上的脂磷壁质酸(LTA)的抗体是全类属结合剂。这样的全类属结合剂可以是多克隆的或单克隆的。在一些实施方案中，全类属结合剂包括混合物中具有不同特异性的抗体，使得混合物结合超过一个属的细菌。如果它们具有结合细菌组分的能力，其他非抗体分子可以作为全类属结合剂(例如，抗生素，如多粘菌素，结合多个属的革兰氏阴性细菌的脂多糖，以及万古霉素，可以结合革兰氏阳性细菌的细胞壁的组分)。使用合适的衔接物，这些分子可以用作全类属结合剂。
如本文中使用的，“抗原”(例如，革兰氏阴性细菌抗原或革兰氏阳性细菌抗原)用来表示任何结构构象的可以被全类属结合剂特异性地结合的任何分子。抗原上被全类属结合剂结合的位点称为“结合位点”。抗原可以是，但不限于，蛋白质、糖蛋白、碳水化合物或脂质。
如本文中使用的，“革兰氏阳性细菌”意思是当暴露于革兰氏染色时，保留染料并且因此染成蓝-紫色的细菌的菌株、类型、种或属。
如本文中使用的，“革兰氏阴性细菌”意思是当暴露于革兰氏染色时，没有保留染料并且因此没有染成蓝-紫色的细菌的菌株、类型、种或属。本领域技术人员将认识到根据染料的浓度和暴露的长度，革兰氏阴性细菌可能吸收微量的革兰氏染色，并且因此染成浅蓝-紫色。然而，与使用相同配方的革兰氏染色持续相同时间量染成的革兰氏阳性细菌相比，革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌相比，蓝-紫色要浅得多。
如本文中使用的，“血液或血液制品”包括血液或骨髓中发现的任何细胞，以及源自血液或骨髓的任何制品，包括，但不限于，全血、红细胞、血小板、血清、血浆、造血肝细胞和白细胞(包括淋巴细胞)。普通的熟练生物学家将理解不添加抗凝剂，如EDTA或肝素，全血将凝固，使得大部分血细胞在输血中不能用。因此，术语“血液或血液制品”中包括用任何抗凝剂处理过的血液。此外，在特定的血液制品的分离过程中(例如，使用血小板脱落(pheresis)的血小板)、可以将非血液组分，如生理盐水，加入血液中。因此，术语“血液或血液制品”还包括已经添加了任何生物惰性物质(如，生理盐水、水或储存营养液)的血液。
装置
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测样品中的细菌的装置，该装置包括用于样品的流动通道，并且进一步包括全类属抗体，其中全类属抗体是一种或多种细菌抗原特异性的，并且其中全类属抗体通过衔接物固定于一群颗粒上，以及捕获结合细菌抗原的颗粒群的捕获抗体，其中捕获抗体固定于流动通道上，并且其中颗粒群沿着流动通道排列，使得样品在与捕获结合剂接触之前与颗粒群接触。在一些实施方案中，颗粒是有色颗粒。
在某些实施方案中，装置包括两种或更多种全类属抗体，其中每种全类属抗体是一种或多种抗原特异性的。在一些实施方案中，每种全类属抗体固定于分开的颗粒亚群上。在一些实施方案中，有色颗粒直径为约20nm至120nm。在一些实施方案中，有色颗粒直径为约40nm至80nm。在一些实施方案中，一个或多个颗粒群包括第一个颗粒群和第二个颗粒群。在一些实施方案中，第一个颗粒群包括直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm的颗粒。在一些实施方案中，第一个颗粒群包括直径约40nm的颗粒而第二个颗粒群包括直径约80nm的颗粒。在一些实施方案中，第一个颗粒群具有一种或多种对一种或多种第一个抗原群具有特异性的结合剂而第二个颗粒群具有一种或多种对一种或多种第二个抗原群具有特异性的结合剂，其中第一个一种或多种抗原群和第二个一种或多种第二个抗原群彼此不同。在一些实施方案中，第二个颗粒群具有是单克隆抗体的结合剂。在一些实施方案中，颗粒是有色颗粒。在一些实施方案中，颗粒是有色金颗粒。
在某些实施方案中，全类属抗体通过衔接物固定于颗粒上。在一些实施方案中，衔接物是蛋白A、蛋白G或蛋白L。在其中装置或方法包括两种或更多种全类属抗体的实施方案中，将至少一种全类属抗体通过衔接物固定于颗粒上。在一些实施方案中，颗粒是有色颗粒。在一些实施方案中，衔接物是蛋白A。
在一些实施方案中，蛋白A以约1至约10个蛋白A分子/100nm2的表面密度存在于可检测颗粒上。在一些实施方案中，蛋白A以约2至约5个蛋白A分子/100nm2的表面密度存在于可检测颗粒上。
在某些实施方案中，全类属抗体是多克隆抗体、单克隆抗体，或其组合。全类属抗体可以特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原或革兰氏阴性细菌抗原或革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌抗原的组合物。在某些实施方案中，本发明的装置或方法包括至少一种特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原的全类属抗体和至少一种特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原的全类属抗体。在某些实施方案中，本发明的装置或方法包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种结合革兰氏阳性细菌抗原的全类属抗体。在某些实施方案中，本发明的装置或方法包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种结合革兰氏阴性细菌抗原的全类属抗体。在某些实施方案中，本发明的装置或方法包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种、至少十六种、至少十七种、至少十八种、至少十九种，或至少二十种全类属抗体，其中全类属抗体是结合革兰氏阳性细菌抗原的全类属抗体和结合革兰氏阴性细菌抗原的全类属抗体的混合物。在一些实施方案中，将结合革兰氏阴性细菌抗原的抗体固定于与不同于结合革兰氏阳性细菌抗原的抗体的分开颗粒亚群上，使得可以分开地检测革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的存在或不存在。
全类属结合剂可以包括一种或多种多克隆抗体，其中多克隆抗体针对一种抗原或多种抗原。全类属结合剂可以包括一种或多种单克隆抗体或多克隆和单克隆抗体的组合。在一些实施方案中，多克隆抗体和单克隆抗体固定于分开的颗粒亚群上。在包括多种具有不同特异性的单克隆抗体的实施方案中，每种特异性固定于分开的颗粒亚群上。在包括具有不同特异性的多种多克隆抗体的实施方案中，每种特异性固定于分开的颗粒亚群上。在一些实施方案中，颗粒亚群是不同大小、颜色的或两者皆是。
在一些实施方案中，捕获结合剂是多克隆抗体、单克隆抗体，或其组合。在某些实施方案中，捕获抗体是特异性地结合被固定于颗粒上的全类属抗体结合的细菌抗原的全类属抗体。在某些实施方案中，捕获抗体与固定于颗粒上的全类属抗体相同。
在一些实施方案中，本发明提供了一种是侧向流动装置的装置。在一些实施方案中，本发明提供了一种包括一个或多个吸收膜的装置。本领域技术人员将熟知适宜用作这样的装置中的吸收膜的材料。在某些实施方案中，吸收膜是硝基纤维素膜。在一些实施方案中，本发明提供了包括流动通路的装置，在所述流动通路上固定了一种或多种捕获抗体。在某些实施方案中，两种或更多种，三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或十种或更多种捕获抗体固定于流动通路上。在某些实施方案中，捕获抗体固定于流动通路上的一个或多个位置。在某些实施方案中，捕获抗体固定于流动通路上的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个，或十个或更多个的位置。在一些实施方案中，一个或多个位置中的每一个都包括相同的捕获抗体。在一些实施方案中，一个或多个位置中的每一个包括不同的捕获抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种装置，其包括通过衔接物固定于可检测颗粒群上的全类属抗体，其中颗粒在安置在吸收膜上方并且与膜的上表面接触的固体支持物表面内干燥，其中支持物表面和吸收膜之间的接触面积控制颗粒的重建速率和/或重建和接触捕获抗体之间的时间。在一些实施方案中，可检测颗粒是化学发光、发光、荧光、磁或有色颗粒。在利用有色颗粒的实施方案中，颗粒可以是金、银或铂颗粒。在一些实施方案中，颗粒直径为约20至约120nm。在一些实施方案中，颗粒直径为约40至约80nm。
在一些实施方案中，装置包括正对照。在一些实施方案中，装置在流动通道上包括一个表明样品已经流过捕获抗体的位置。
在某些实施方案中，这样的全类属结合剂包括在生理条件下结合革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)结构或革兰氏阳性细菌的脂磷壁质酸(LTA)结构的含表位抗原的抗体。
本发明的装置和方法中有用的全类属抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体，或以上的任何抗原结合片段，包括，但不限于，F(ab)、F(ab’)、F(ab’)2、scFv片段和重组片段。本领域技术人员将理解这些片段用于本发明的装置和方法中时是功能性片段。全类属抗体可以来自非哺乳动物物种，例如，鸡抗体，或来自哺乳动物物种，包括但不限于，兔子、啮齿动物(包括小鼠、大鼠和豚鼠)、山羊、猪、绵羊、骆驼和人类。全类属抗体还可以是人源化抗体或嵌合抗体。
本领域技术人员能够使用标准的本领域已知的技术来制备任何这样的抗体衍生物。例如，Jones等(Nature321:522-525(1986))公开了用来自小鼠抗体的那些替代人抗体的CDR。Marx(Science229；455-456(1985))讨论了具有小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。Rodwell(Nature342：99-100(1989))讨论了源自抗体CDR信息的较低分子量识别元件。Clackson(Br.J.Rheumatol.3052：36-39(1991))讨论了遗传工程化的单克隆抗体，包括Fv片段衍生物、单链抗体、融合蛋白嵌合抗体和人源化啮齿动物抗体。Reichman等(Nature332：323-327(1988))公开了其上已经移植了大鼠超变区的人抗体。Verhoeyen等(Science239:1534-1536(1988))教导了将小鼠抗原结合位点移植至人抗体上。
最优选地，本发明的全类属抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。单克隆和多克隆抗体的产生是生物领域的普通技术人员公知的(参见，例如，Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.，1994)。各种程序可用于生产所需独特靶标抗原的抗体。传统的免疫和收集技术将导致针对靶标细菌物种共有的决定簇(包括全类属决定簇，如LPS和LTA)的多克隆抗体的形成。此外，细胞杂交技术可以用于产生永生性杂交瘤细胞系，该细胞系产生靶标物种的特异性单克隆抗体。
具有用于广泛检测革兰氏阳性细菌的潜在实用性的抗体包括Fisher等，PCT公开No.WO98/57994；Jackson，D.E.等，InfectionandImmunity43:800(1984)；Hamada，S.等，Microbiol.Immunol.28:1009(1984)；Aasjord，P.等，ActaPath.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.C，93:245(1985)；McDaniel，L.S.等，MicrobialPathogenesis3：249(1987)；Tadler，M.B.等，JournalofClinicalLaboratoryAnalysis3:21(1989)；和Stuertz，K等，JournalofClinicalMicrobiology36：2346(1998)中描述的那些。
具有用于广泛检测革兰氏阴性细菌的潜在实用性的抗体包括Nelles，M.J.等，Infect.Immun.46:677(1984)；Teng，N.N.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：1790(1985)；Dunn，D.L.等，Surgery98：283(1985)；DeJongh-Leuvenink，J.等，Eur.J.Clin.Microbiol.5:148(1986)；Bogard，W.C.等，Infect.Immun.55：899(1987)；Pollack，M.等，BacterialEndotoxins:PathophysiologicalEffects，ClinicalSignificance，andPharmacologicalControl.pp.327-338AlanR.Liss，Inc.(1988)；Priest，B.P.等，Surgery106:147(1989)；Tyler，J.W.等，JournalofImmunologicalMethods129：221(1990)；Siegel，S.A.等，Infect.Immun.61：512(1993)；Shelburne，C.E.等，J.Periodont.Res.28：1(1993)；DiPardova，F.E.等，Infect.Immun.61:3863(1993)；和DeKievit，T.R.和Lam，J.S.J.Bacteriol.176：7129(1994)中描述的那些。
可以通过传统技术来完成关于使用哪一种或几种抗体的选择。可以以经验主义形式通过经验主义地测试每种抗体来表征抗体特异性、结合程度和动力学。微滴定筛选形式在文献中有充分证明，来帮助表征任何给定的免疫试验形式中的特异性抗体应答。同样，可以通过执行各种化学结合技术并且针对最佳性能参数筛选所得到的产物来表征可检测标记的抗体的活性。可以相对于来自保留的血小板或红细胞样品的细菌的临床分离物来筛选捕获抗体和可检测标记的抗体，以尽可能接近终产物实施方案地评价最终试验性能。这种实验导致应用于以下描述的各种试验形式中的抗体试剂的选择和优化。
具有针对细菌细胞表面上的交叉属靶标的特异性的单克隆抗体可以用于本发明的装置和方法中。在一些实施方案中，可以利用单克隆抗体的混合物。通过混合在不同的革兰氏阴性和革兰氏阳性种范围中具有广泛特异性的单克隆和/或多克隆抗体制得的多克隆抗体(包括多克隆反义或多克隆混合物)可以用于本发明的装置和方法中。
以上所述的抗体可以按照所述地进行利用或按照需要进行修饰，以产生有用的免疫学试剂。
在一些实施方案中，本发明的结合试验和侧向流动装置中有用的颗粒是金、银或铂颗粒中的一种或多种。颗粒可以是均一大小的，或可以是多个大小。在一些实施方案中，颗粒可以具有10nm至150nm的大小，例如，20nm至50nm，40nm至80nm，或60nm至100nm。示例性颗粒大小包括10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm和150nm。在某些实施方案中，至少一些颗粒的大小为约60nm至约120nm。在某些实施方案中，所有颗粒大小为约20nm至约120nm。在某些实施方案中，颗粒大小为约40至约80nm。在其他实施方案中，颗粒大小为约40nm。在其他实施方案中，颗粒大小为约40nm。还是在其他实施方案中，装置或方法可以包括具有不同大小的颗粒的亚群，例如，40nm颗粒的亚群和80nm颗粒的亚群。在某些实施方案中，装置或方法可以包括40nm颗粒和80nm颗粒，其中单克隆抗体(例如，全类属单克隆抗体)固定于40nm颗粒上而多克隆抗体(例如，全类属多克隆抗体)固定于80nm颗粒上。不同的珠子大小可以用于形成不同的信号，例如，区分结合到不同的靶标上。不希望受到理论的束缚，较小的颗粒大小与单克隆抗体一起使用更好，因为较大量的较小珠子将产生比较少量的较大珠子更大的表面积。对于单克隆抗体，有效的捕获比亲和力重要得多。相比之下，如以下讨论的，使用较大的珠子，亲和力变得更加重要。
在某些实施方案中，颗粒和全类属结合剂之间的衔接物为蛋白质衔接物(例如，蛋白L、蛋白A、蛋白G或蛋白A/G)，或生物素-抗生物素蛋白，抗生物素蛋白链菌素，或中和抗生物素蛋白(neutravidin)，或种特异性抗免疫球蛋白抗体，以固定缀合物上的另一种抗体(例如，抗-兔子免疫球蛋白抗体或抗-小鼠免疫球蛋白抗体)，能够结合重组蛋白质标记物(例如，His标记物或FLAG标记物)的试剂，DNA或DNA-样分子，或合成的免疫球蛋白-结合部分(例如，ProMetricBioSciences模拟配体)。在某些实施方案中，衔接物是蛋白A。不希望受到理论的束缚，单个抗体可以结合两个衔接物，由此提供用于以下讨论的亲和力级联的基础。本领域技术人员还将认识到本发明的衔接物可用于使用固体支持物的各种试验，例如，阵列、ELISA、基于悬臂的系统、SPR和试验中。
本发明提供了衔接物令人惊讶的用途，用于结合结合剂，如抗体。抗体结合衔接物在基于血清或血浆的试验中是不利的，因为这些衔接物可以与样品中的天然抗体相互作用，干扰试验自身中使用的抗体。在此，尽管，本发明的结合剂与衔接物的解离率(offrate)与运行试验(通常20-30分钟)的时限相比可忽略。因此，本发明能够利用衔接物(如蛋白A)，而没有与样品中存在的天然人抗体竞争的问题。
在一些实施方案中，装置是适用于检测血液样品或血液制品样品中的细菌的侧向流动装置，所述装置包括用于样品的流动通道和结合多种细菌抗原的全类属结合剂(例如，如本文中所述的全类属抗体或其功能性片段)，其中全类属结合剂通过衔接物固定于一群80nm金颗粒上，并且进一步包括通过衔接物固定于一群40nm金颗粒上的全类属结合剂(例如，如本文中所述的全类属抗体或其功能性片段)。在进一步的实施方案中，全类属结合剂结合一种或多种革兰氏阳性细菌抗原，一种或多种革兰氏阴性细菌抗原，或两者。在不同的实施方案中，结合革兰氏阳性细菌抗原的全类属结合剂与结合革兰氏阴性细菌抗原的全类属结合剂可以在相同的金颗粒群上或在不同的金颗粒群上(例如，80nm金颗粒)。在某些实施方案中，固定于40nm金颗粒上的全类属结合剂是单克隆抗体而固定于80nm金颗粒上的全类属结合剂是多克隆抗体。在进一步的实施方案中，装置包括固定于装置的流动通道上的捕获结合剂(例如，捕获抗体)，其中金颗粒沿着流动通道排列，使得样品在与捕获结合剂接触之前与有色颗粒群接触。在某些实施方案中，捕获结合剂是全类属结合剂。在其中捕获结合剂是全类属结合剂的实施方案中，捕获结合剂可以与固定于金颗粒上的全类属结合剂相同，或与固定于金颗粒上的全类属结合剂不同。
根据本发明的装置提供了比现有技术更高的敏感性。不希望受到理论的束缚，认为根据本发明的装置提供了更高的敏感性，因为衔接物(例如，蛋白A)启动了亲和力级联。多价抗原可以被超过一个的颗粒结合，由此使颗粒彼此接近。这形成了局部较高浓度的结合剂，其随后引起更多抗原被结合和更多颗粒彼此接近。最终，这种颗粒与颗粒的亲和力引起许多颗粒接近，形成高度可检测的颗粒的聚集。通过抗体-衔接物结合的天然平衡有助于这种聚集。抗体将自然地结合衔接物并从衔接物释放出来。这种现象形成无抗体的结合颗粒的衔接物部分。这些无抗体衔接物可以结合抗体，如已经结合到其他珠子上的衔接物上的那些，由此引发亲和力级联。
在第五个方面中，本发明提供了制备具有非常高的衔接物表面密度并且由此具有非常高的结合剂表面密度的颗粒的方法。根据这个方面的方法包括用高浓度的衔接物孵育可检测颗粒。例如，可以用蛋白A的溶液孵育金、银或铂颗粒，其中溶液具有至少约0.1μg蛋白A的浓度，并且可以高如饱和的蛋白A溶液。可检测颗粒具有特定颗粒材料特征性的光密度(OD)，其可以用于测定溶液中的颗粒浓度。在一些实施方案中，根据本发明的这个方面的方法利用具有约0.1μg/mL至约0.4μg/颗粒的OD单位的蛋白A浓度。
在一些实施方案中，本发明提供了用于检测多分析物样品中的分析物(例如，细菌抗原)的基于结合可检测颗粒的结合剂的装置。在某些实施方案中，装置利用两个或更多个不同大小的可检测颗粒群。例如，第一个可检测颗粒群可以是直径约20nm至约60nm(例如，直径约40nm)的颗粒而第二个可检测颗粒群可以是直径大于约60nm至约120nm(例如，直径约80nm)的颗粒。在特定的实施方案中，第一个可检测颗粒群可以结合一种或多种对第一个分析物群具有特异性的结合剂而第二个可检测颗粒群可以结合一种或多种对第二个分析群具有特异性的结合剂。分析物的第一个群和第二个群可以是相同的分析物或可以是不同的分析物。当分析物群不同时，第一个分析物群的分析物可以以高于第二个分析物群的分析物的浓度存在。不希望受到理论的束缚，申请人假设当尝试检测样品中的稀少分析物时使用较大颗粒通过引发亲和力级联提高敏感性，由此结合分析物的颗粒协同地征募了其他颗粒，形成较大的检测信号。
在一些实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的细菌的侧向流动装置。在某些实施方案中，装置包括用于样品和特异性地结合细菌抗原的结合剂(例如，如本文中所述的抗体或其功能性片段)的流动通道。在某些实施方案中，将结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上。在这些实施方案中，第一个颗粒群可以包括直径为约20nm至约60nm(例如，直径约40nm)的颗粒而第二个颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm(例如，直径约80nm)的颗粒。特别地，第一个颗粒群可以结合一种或多种对第一个分析物群具有特异性的结合剂而第二个颗粒群可以结合一种或多种对第二个分析物群具有特异性的结合剂。分析物的第一个群和第二个群可以是相同的分析物或可以是不同的分析物。当分析物群不同时，第一个分析物群的分析物可以以高于第二个分析物群的分析物的浓度存在。不希望受到理论的束缚，申请人假设当尝试检测样品中的稀少分析物时使用较大颗粒通过引发亲和力级联提高敏感性，由此结合分析物的颗粒协同地征募了其他颗粒，形成较大的检测信号。在某些实施方案中，捕获结合剂能够捕获一个或多个颗粒群，其中捕获结合剂固定于侧向流动装置的流动通道上并且可检测颗粒群沿着流动通道排列，使得样品在与捕获结合剂接触之前与可检测颗粒群接触。
在某些实施方案中，可检测颗粒(第一个群或第二个群)由选自金、银和铂的材料制得。在特定的实施方案中，可检测颗粒是金颗粒。
在某些实施方案中，结合剂通过衔接物(例如，蛋白A、蛋白G或蛋白L)结合到可检测颗粒上。在这些实施方案中，衔接物可以以约1至约10个衔接物分子/100nm2的表面密度存在于可检测颗粒上。
在某些实施方案中，结合到第一个可检测颗粒群上的一种或多种结合剂包括本文中所述的一种或多种抗体(例如，单克隆抗体)，或其功能性片段。在某些实施方案中，结合到第二个可检测颗粒群上的一种或多种结合剂包括本文中所述的一种或多种抗体(例如，多克隆抗体)，或其功能性片段。本领域技术人员将认识到结合剂可以选自多克隆抗体、单克隆抗体、其功能性片段，及其组合，并且抗体可以包括一种或多种全类属抗体。
检测细菌的方法
在一些实施方案中，本发明提供了一种装置和方法，其具有比现有装置和方法更宽的反应性。特别地，所述装置和方法能够检测比现有装置和方法更宽范围的细菌属、细菌种和/或细菌菌株。例如，所述装置和方法能够检测至少100、150、200、250、300、350、400、450或500种不同的细菌。在一些实施方案中，本发明提供了一种方法或装置，其包括能够检测超过1×107、1×106、1×105、1×104、1×103或1×102菌落形成单位(CFU)/mL细菌或相等浓度的源自该细菌水平的抗原的全类属抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种筛选液体样品中细菌的存在的方法。在该方法的不同实施方案中，样品可以是任何生物流体，包括透析样品。在一些实施方案中，透析样品选自血液透析流体和腹膜透析流体。在一些实施方案中，样品是其中已经保存了组织的流体样品。在一些实施方案中，组织选自血细胞培养物、干细胞培养物以及骨和软骨移植物材料。在一些实施方案中，样品是血液或血液制品，包括但不限于全血、白血球、造血干细胞、血小板、红细胞、血浆、骨髓和透析流体，包括使本发明的侧向流动装置与样品接触，并且检测抗体群与样品的结合，其中结合表示样品中存在细菌，而没有结合表示样品中不存在细菌。在某些实施方案中，样品是透析流体，包括血液透析流体和腹膜透析流体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种筛选食物或饮料产品或食物或饮料加工中细菌存在的方法。例如，本发明的方法可以用于测试运送液体(如啤酒或奶)的管线中存在或不存在细菌。该方法还可以用于测试水样中存在或不存在细菌。在一些实施方案中，这些方法包括使本发明的侧向流动装置与饮料样品或水样接触并检测抗体群与样品的结合，其中结合表示饮料或水样中存在细菌，而没有结合表示饮料或水样中不存在细菌。
在本发明的某些实施方案中，在使样品与全类属抗体接触之前或同时，对样品进行处理。优选地，处理暴露了革兰氏阴性细菌抗原或革兰氏阳性细菌抗原上用于全类属抗体的结合位点。例如，可以通过从细菌的细胞壁或细胞膜分裂抗原来暴露细菌抗原上的结合位点，由此暴露结合位点；诱导细菌分泌抗原，由此暴露结合位点；裂解细菌，由此释放胞内细菌抗原，并且因此暴露抗原上的结合位点；或通过诱导细菌抗原上的构象改变，由此暴露结合位点。这样的处理包括通过物理方式机械破坏样品中的细菌细胞，所述物理方式包括，但不限于，超声波处理、煮沸或均质，使用，例如，Dounce均质机。所述处理还可以是使用化合物或组合物的通过化学方式的样品处理，所述化合物或组合物例如为去污剂、碱溶液(用于碱裂解)、酸溶液(用于酸裂解)、EDTA、EGTA、金属离子、阴离子、阳离子、表面活性剂、螯合剂和/或酶(例如，溶葡萄球菌酶、溶菌酶、溶菌酶、labiase、无色肽酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、自溶素、噬菌体编码的裂解酶，及其组合)。处理将暴露革兰氏阴性细菌抗原或革兰氏阳性细菌抗原上针对全类属抗体的结合位点。
在进一步的实施方案中，使样品与酶接触，以提高结合试验的敏感性或有效性。在各种实施方案中，样品可以是怀疑含有细菌的任何液体样品。在一些实施方案中，样品是生物流体，包括尿液、痰液、脊髓液、腹水、血液或血液制品。在一些实施方案中，样品可以是灌洗液或产品，包括用于给药于需要的受试者的血液制品。在一些实施方案中，样品是血液或血液制品。在一些实施方案中，血液或血液制品选自：全血、白血球、造血干细胞、血小板、红细胞、血浆、骨髓和血清。
根据这个实施方案，用一种或多种增加用于结合试验中的本文中所述的结合试剂的靶标的量、可利用性和/或分散的酶处理样品。在各种实施方案中，该处理可以在使样品与结合试剂接触之前(即，预处理样品)或可以使样品同时与酶和结合试剂接触。
根据这个实施方案，结合试剂可以是，但不限于，如本文中所述的抗体或其功能性片段、抗生素、蛋白质、融合蛋白(即，包括两个或更多个蛋白质部分的蛋白质)或化学螯合剂。在某些实施方案中，根据本发明的结合剂是肽、蛋白质或肽模拟物。在一些实施方案中，结合试剂是肽聚糖结合蛋白或β-葡聚糖-结合蛋白，如在蚕幼虫血浆中发现的那些。参见，例如，美国专利7,598,054，将其内容全部按引用引入本文中，用于全部目的。在特定的实施方案中，试验是免疫试验，即，结合试剂是抗体或其功能性片段。
在一些实施方案中，用一种或多种选自溶葡萄球菌酶、溶菌酶、溶菌酶、labiase、脂酶、无色肽酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、自溶素、噬菌体编码的分解酶，及其组合的酶处理样品。
在一些实施方案中，酶是肽聚糖特异性的。在一些实施方案中，一种或多种酶包括细菌细胞壁特异性内肽酶、细菌细胞壁特异性糖苷水解酶，或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种酶是细菌细胞壁特异性内肽酶。作为说明，细菌细胞壁特异性内肽酶可以包括但不限于溶葡萄球菌酶和无色肽酶。在一些实施方案中，细菌细胞壁特异性内肽酶以约200至约0.06单位/ml的浓度存在。在一些实施方案中，处理是使用包括溶葡萄球菌酶的一种或多种酶。在一些实施方案中，溶葡萄球菌酶以约200至约0.06单位/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，一种或多种酶是细菌细胞壁特异性糖苷水解酶。作为说明，细菌细胞壁特异性糖苷水解酶可以包括但不限于溶菌酶和溶菌酶。在一些实施方案中，细菌细胞壁特异性糖苷水解酶以约15至约0.0025mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，处理是使用包括溶菌酶的一种或多种酶。在一些实施方案中，溶菌酶以约15至约0.0025mg/ml的浓度存在。
在一些实施方案中，用于处理样品的酶包括细菌细胞壁特异性内肽酶和细菌细胞壁特异性糖苷水解酶。在一些实施方案中，处理是用溶葡萄球菌酶和溶菌酶。
发明人已经令人惊讶地发现了用溶葡萄球菌酶和溶菌酶处理样品提高了细菌检测免疫试验的敏感性。添加溶葡萄球菌酶和溶菌酶可以将革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌检测的敏感性提高大约10-倍至100-倍。
在一些实施方案中，用包括酶和一种或多种表面活性剂的试剂组合物处理样品。
在一些实施方案中，在检测结合步骤之前，用一种或多种酶(使用或不用表面活性剂)孵育样品。在特定的实施方案中，消除孵育步骤，使得在使样品与酶和结合试剂接触后立即评价结合的存在或不存在的检测。
在一些实施方案中，该方法用于检测血液样品或血液制品样品中的细菌，该方法包括使样品与结合了多种细菌抗原的全类属结合剂(例如，如本文中所述的抗体或其功能性片段，如全类属抗体)接触，其中全类属结合剂通过衔接物固定于一群较大的(例如，80nm)金颗粒上，并且进一步包含通过衔接物固定于一群较小的(例如，40nm)金颗粒上的全类属结合剂(例如，全类属抗体)。在一些实施方案中，较大颗粒具有通过衔接物固定于其上的一种或多种单克隆结合剂。在各种实施方案中，该方法包括在允许全类属结合剂与细菌抗原之间结合的条件下使样品与全类属结合剂接触并且在允许固定化捕获结合剂与带有固定化全类属结合剂的金颗粒之间结合的条件下使固定化捕获结合剂(例如，全类属结合剂，如全类属抗体)与金颗粒接触。在某些实施方案中，全类属结合剂结合一种或多种革兰氏阳性细菌抗原、一种或多种革兰氏阴性细菌抗原，或两者。在各种实施方案中，结合革兰氏阳性细菌抗原的全类属结合剂可以与结合革兰氏阴性细菌抗原的全类属结合剂在相同群或不同群的金颗粒(例如，80nm金颗粒)上。在某些实施方案中，固定于80nm金颗粒上的全类属结合剂是多克隆抗体，而固定于40nm金颗粒上的全类属结合剂是单克隆抗体。在某些实施方案中，固定于80nm金颗粒上的全类属结合剂是单克隆抗体，而固定于40nm金颗粒上的全类属结合剂是多克隆抗体。在其中捕获结合剂是全类属结合剂的进一步的实施方案中，捕获结合剂与固定于金颗粒上的全类属结合剂相同或与固定于金颗粒上的全类属结合剂不同。
在进一步的方面中，本发明提供了包含可检测颗粒的试剂盒，所述的可检测颗粒如有色颗粒，包括金、银或铂颗粒，其中颗粒大小为约20nm至约120nm，并且其中颗粒包含通过衔接物固定于其上的多价结合剂。在一些实施方案中，多价结合剂是全类属结合剂，如用于检测样品中的革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或两者的全类属抗体。在一些实施方案中，颗粒为约80nm。在一些实施方案中，试剂盒包含不同大小的可检测颗粒，如80nm和40nm。在一些实施方案中，试剂盒包含80nm金颗粒，含有或不含40nm金颗粒。试剂盒进一步包含使用可检测颗粒来检测样品中细菌存在的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含在其上固定有捕获全类属抗体的固体表面。在一些实施方案中，固体表面是侧向流动装置的组成部分。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于预处理样品的试剂。
在一些实施方案中，本发明提供了检测样品中的分析物(例如，细菌抗原)的方法，通过使样品与一种或多种分析物特异性的一种或多种结合剂(例如，如本文中所述的抗体或其功能性片段，包括全类属结合剂)接触。在某些实施方案中，将一种或多种结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上。在这些实施方案中，第一个可检测颗粒群包括直径约20nm至约60nm(例如，直径为40nm)的颗粒和第二个可检测颗粒群包括直径大约约60nm至约120nm的颗粒(例如，直径为80nm)。在某些实施方案中，第一个可检测颗粒群结合对第一个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂和第二个可检测颗粒群结合对第二个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂。该方法还包括使样品在允许结合剂和分析物之间结合的条件下与一种或多种结合剂接触，其中结合剂被分析物结合表明样品中分析物的存在。在某些实施方案中，该方法进一步包括使固定的捕获结合剂在允许固定的捕获结合剂和具有结合剂的可检测颗粒之间结合的条件下与可检测颗粒接触。在这些实施方案中，可检测颗粒被捕获结合剂的结合表明样品中分析物的存在。
在一些实施方案中，本发明提供了提高结合试验中检测多分析物样品中的多种分析物(例如，细菌抗原)与结合颗粒的结合剂的结合的特异性和/或敏感性的方法。在这些实施方案中，该方法包括使样品与一种或多种对一种或多种分析物特异性的结合剂(例如，全类属结合剂)接触，其中一种或多种结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上。在某些实施方案中，第一个可检测颗粒群包括直径为约20nm至约60nm(例如，直径为40nm)的颗粒而第二个可检测颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm(例如，直径为80nm)的颗粒。因为第一个颗粒群直径为约20nm至约60nm而第二个可检测颗粒群直径大于约60nm至约120nm，第一个可检测颗粒群和第二个可检测颗粒群不具有相同的直径。在这些实施方案中，第一个可检测颗粒群结合到对第一个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上而第二个可检测颗粒群结合到对第二个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上。当使样品在允许结合剂和分析物之间结合的条件下与一种或多种结合剂时接触，结合剂被分析物结合表明样品中分析物的存在。检测这种结合将告知本领域技术人员样品中分析物的存在。敏感性和/或特异性的提高是与除了使用具有相同直径的第一个可检测颗粒群和第二个可检测颗粒群之外相同的方法相比。
在某些实施方案中，分析物的第一个群和第二个群可以是相同的分析物也可以是不同的分析物。当分析物群不同时，第一个分析物群的分析物可以以高于第二个分析物群的分析物的浓度存在。不希望受到理论的束缚，申请人假设当尝试检测样品中的稀少分析物时使用较大颗粒通过引发亲和力级联提高敏感性，由此结合分析物的颗粒协同地征募了其他颗粒，形成较大的检测信号。
在某些实施方案中，可检测颗粒(第一个群或第二个群)由选自金、银和铂的材料制得。在特定的实施方案中，可检测颗粒是金颗粒。
在某些实施方案中，结合剂通过衔接物(例如，蛋白A、蛋白G、蛋白L或种特异性抗免疫球蛋白抗体)结合到可检测颗粒上。在这些实施方案中，衔接物可以以约1至约10个衔接物分子/100nm2的表面密度存在于可检测颗粒上。
在某些实施方案中，结合到第一个可检测颗粒群上的一种或多种结合到剂包括一种或多种抗体(例如，单克隆抗体)。在某些实施方案中，结合到第二个可检测颗粒群上的一种或多种结合剂包括一种或多种抗体(例如，多克隆抗体)。本领域技术人员将认识到结合剂可以选自多克隆抗体、单克隆抗体、其功能性片段，及其组合，并且抗体可以包括一种或多种全类属抗体。
本领域技术人员将认识到本文中所述的任何实施方案都可以与也在本文中描述的任何其他实施方案或实施方案的组合相结合。
以下实施例打算用来进一步说明本发明的某些实施方案并且不是用来限制本发明的范围。
实施例
实施例1
我们在模型侧向流动系统中测量了从不同大小(40nm和80nm)的金颗粒产生的视觉信号，以确定哪种颗粒产生了最高信号强度应答/颗粒(图1A-1C)。将系统设计成捕获高比例的流过条带的颗粒，以获得通过不同大小的颗粒产生的视觉信号的指示。使用了根据本发明的侧向流动装置。在这个模型中，流动装置利用了Millipore硝基纤维素膜上作为捕获结合剂的成条带的IgG抗体，以及流过条带的蛋白A覆盖的金颗粒。对于加入到反应中的给定数量的颗粒，与通过40nm金颗粒产生的红/粉线相比，80nm金颗粒获得了更高对比强度的紫色线，使得来自80nm珠子的线更易于观察和解释。图1B和1C是分别使用不同数量的40nm和80nm颗粒产生的条带的图像。使用Gelanayzer2010软件分析了图像，以提供针对捕获线强度的数值。图1A显示了信号强度相对于加入反应中的颗粒数量的曲线，证明了通过等量较大金颗粒产生了提高的信号强度。
令人惊讶地，提高颗粒大小也提高了捕获线上产生的视觉上可检测的信号的强度，由此提高了敏感性。然而，更多数量的较小颗粒，其比较大颗粒具有更大的表面积体积比，预期将产生更好的信号和较快的结果。此外，作为实践问题，捕获区域中的金含量是有限的。因此，特别令人惊讶的是较低量的较大颗粒比较高量的较小颗粒产生了更好的结果。
实施例2
为了测试不同大小的金颗粒的有效性，我们使用针对各种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌产生的抗体混合物构建了模型免疫试验系统。我们将抗体结合80nm胶态金(“强化的检测剂”)颗粒并将其性能与40nm胶态金(“通用检测剂”)颗粒进行比较。我们使用缓冲溶液，通过从108CFU/mL开始制备十倍稀释，针对八种生物体中的每一种制备了四个水平的细菌裂解物。对于每个裂解物水平，我们在96-孔平板的孔中混合了20μL通用检测剂颗粒或强化检测剂颗粒(OD5)、20μL细菌裂解物和20μL含有去污剂的运行缓冲剂。将0.5cm量尺插入每个孔中并孵育直至所有液体流入量尺中，所述量尺是从使用相同抗体涂成条带并且碾压成上层吸收芯的Millipore硝基纤维素膜卡片上切割得到的。使用一槽100μL的PBS来清洗量尺，使得可以以1-12等级相对于强度标准(颗粒的沉积稀释)来针对信号强度进行视觉上的分级(表1和图2)。
表1：通用检测剂颗粒vs.强化检测剂颗粒的信号强度
在所有情况中，强化检测剂至少与通用检测剂一样灵敏，并且在许多情况中，与通用检测剂颗粒相比，使用强化检测剂颗粒，信号显著提高。对于一些细菌物种，我们观察到与通用检测剂颗粒相比，使用强化检测剂颗粒时，敏感性至少高一个对数级。
在多重分析物系统中，提高颗粒的大小也提高了抗原/抗体应答中产生的信号强度，由此提高了敏感性。作为实践问题，这是令人惊讶的，因为捕获区域中的金含量是有限的。因此，可以使用更多数量的较小颗粒，并且较小颗粒具有较大的表面积体积比。不希望受到理论的束缚，这种现象的发生似乎是因为每个颗粒存在更多的抗体，由此允许更高的针对抗原的亲合力。在这些实验中，评价了金颗粒、固定方法以及将抗体结合表面的条件。这些研究的结果是每个金颗粒成功固定了大约四倍多的抗体，其产生了相当多的强化检测剂颗粒。
总之，我们已经证明了通过使用较大的、颜色较深的金颗粒提高了针对多个细菌物种的信号强度，导致提高的敏感性和准确度，使得结果更易于阅读。
实施例3
全类属试剂颗粒的合成
将兔子IgG在2-倍浓缩的结合缓冲液中稀释至所需浓度。本领域技术人员将认识到，可以使用适用于IgG结合蛋白A的任何结合缓冲液。用于结合的典型浓度范围为0.1至1μg/ml*OD的金。如果将5mlOD555＝10下的金胶体结合0.1ug/ml*OD的比例，那么IgG在5ml体积中稀释至1.0ug/ml的浓度。将稀释的抗体与等体积的覆盖了蛋白A(sPA)的浓缩至所需的最终颗粒所需浓度两倍的80nm金颗粒混合。在测试前孵育最少一小时，但过夜孵育也将是有利的。

Claims (87)

1.利用两个或更多个可检测颗粒群检测多分析物样品中的分析物的基于结合可检测颗粒的结合剂的装置，其中第一个可检测颗粒群是直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个可检测颗粒群是直径大于约60nm至约120nm的颗粒，其中所述第一个可检测颗粒群结合到一种或多种对第一个分析物群具有特异性的结合剂上而第二个可检测颗粒群结合到一种或多种对第二个分析物群具有特异性的结合剂上。
2.根据权利要求1的装置，其中所述第一个分析物群和第二个分析物群是相同的。
3.根据权利要求1的装置，其中所述第一个分析物群和第二个分析物群是彼此不同的。
4.根据权利要求3的装置，其中所述第一个分析物群的分析物以高于所述第二个分析物群的分析物的浓度存在于所述样品中。
5.根据权利要求1的装置，其中所述可检测颗粒由选自金、银和铂的材料制得。
6.根据权利要求5的装置，其中所述可检测颗粒由金制得。
7.根据权利要求1的装置，其中所述分析物是细菌抗原。
8.根据权利要求1的装置，其中所述结合剂通过衔接物结合到所述可检测颗粒上。
9.根据权利要求8的装置，其中所述衔接物选自蛋白A、蛋白G、蛋白L和种特异性抗免疫球蛋白抗体。
10.根据权利要求9的装置，其中所述衔接物是蛋白A。
11.根据权利要求8的装置，其中所述衔接物以约1至约10个衔接物分子/100nm2的表面密度存在于可检测颗粒上。
12.根据权利要求1的装置，其中结合到第一个可检测颗粒群上的一种或多种结合剂包括一种或多种抗体。
13.根据权利要求12的装置，其中所述抗体是单克隆抗体。
14.根据权利要求1的装置，其中结合到第二个可检测颗粒群上的一种或多种结合剂包括一种或多种抗体。
15.根据权利要求14的装置，其中所述抗体是多克隆抗体。
16.根据权利要求1的装置，其中所述结合剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、其功能性片段，及其组合。
17.根据权利要求16的装置，其中所述多克隆抗体或单克隆抗体包括一种或多种全类属抗体。
18.用于检测样品中的细菌的侧向流动装置，该装置包括用于样品的流动通道，并且进一步包括特异性结合细菌抗原的结合剂，其中所述结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上，其中第一个颗粒群包含直径为约20nm至约60nm的颗粒和第二个颗粒群包含直径大于约60nm至约120nm的颗粒，其中第一个颗粒群结合到一种或多种对第一个分析物群具有特异性的结合剂上而第二个颗粒群结合到一种或多种对第二个分析物群具有特异性的结合剂上；和捕获所述一个或多个颗粒群的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂固定于所述流动通道上，并且其中所述可检测颗粒群沿着所述流动通道排列，使得所述样品在与所述捕获结合剂接触之前与所述可检测颗粒群接触。
19.根据权利要求18的装置，其中所述第一个和第二个分析物群是相同的。
20.根据权利要求18的装置，其中所述第一个和第二个分析物群是彼此不同的。
21.根据权利要求18的装置，其中所述结合剂通过衔接物结合到所述可检测颗粒上。
22.根据权利要求21的装置，其中所述衔接物选自蛋白A、蛋白G、蛋白L和种特异性抗免疫球蛋白抗体。
23.根据权利要求22的装置，其中所述衔接物是蛋白A。
24.根据权利要求21的装置，其中所述衔接物以约1至约10个蛋白A分子/100nm2的表面密度存在于可检测颗粒上。
25.根据权利要求18的装置，其中所述第一个可检测颗粒群直径为约40nm而第二个可检测颗粒群直径为约80nm。
26.用于检测样品中的分析物的方法，包括使所述样品与对一种或多种分析物具有特异性的一种或多种结合剂接触，其中所述一种或多种结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上，其中所述第一个可检测颗粒群包含直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个可检测颗粒群包含直径大于约60nm至约120nm的颗粒，其中所述第一个可检测颗粒群结合到一群对第一个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上而第二个可检测颗粒群结合到一群对第二个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上；并且其中使所述样品在允许所述结合剂和所述分析物之间结合的条件下与所述一种或多种结合剂接触，其中所述结合剂被所述分析物的结合表示所述样品中分析物的存在。
27.根据权利要求26的方法，其中所述第一个和第二个分析物群是相同的。
28.根据权利要求26的方法，其中所述第一个和第二个分析物群是彼此不同的。
29.根据权利要求26的方法，其中所述一种或多种结合剂包括一种或多种全类属结合剂。
30.根据权利要求26的方法，进一步包括使固定化捕获结合剂在允许固定化捕获结合剂和带有结合剂的可检测颗粒之间结合的条件下与可检测颗粒接触，其中所述可检测颗粒被所述捕获结合剂的结合表示所述样品中分析物的存在。
31.根据权利要求26的方法，其中所述第一个分析物群的分析物以高于所述第二个分析物群的分析物的浓度存在于所述样品中。
32.根据权利要求26的方法，其中所述可检测颗粒由选自金、银和铂的材料制得。
33.根据权利要求32的方法，其中所述可检测颗粒由金制得。
34.根据权利要求26的方法，其中所述分析物是细菌抗原。
35.根据权利要求26的方法，其中所述结合剂通过衔接物结合到所述可检测颗粒上。
36.根据权利要求35的方法，其中所述衔接物选自蛋白A、蛋白G、蛋白L和种特异性抗免疫球蛋白抗体。
37.根据权利要求36的方法，其中所述衔接物是蛋白A。
38.根据权利要求35的方法，其中所述衔接物以约1至约10个衔接物分子/100nm2的表面密度存在于所述可检测颗粒上。
39.根据权利要求26的方法，其中所述结合剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、其功能性片段，及其组合。
40.根据权利要求39的方法，其中所述多克隆抗体或单克隆抗体包括一种或多种全类属抗体或其功能性片段。
41.提高结合试验中检测多分析物样品中的多种分析物与结合颗粒的结合剂的结合的特异性和/或敏感性的方法，包括使所述样品与对一种或多种分析物具有特异性的一种或多种结合剂接触，其中所述一种或多种结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上，其中第一个可检测颗粒群包括直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个可检测颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm的颗粒，其中所述第一个可检测颗粒群结合到对第一个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上而所述第二个可检测颗粒群结合到对第二个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上；其中使所述样品在允许所述结合剂和所述分析物之间结合的条件下与所述一种或多种结合剂接触，并且所述结合剂被所述分析物的结合表明所述样品中分析物的存在；和其中敏感性和/或特异性的提高是与除了使用具有相同直径的第一个可检测颗粒群和第二个可检测颗粒群之外相同的方法相比。
42.根据权利要求41的方法，其中所述第一个和第二个分析物群是相同的。
43.根据权利要求41的方法，其中所述第一个和第二个分析物群是彼此不同的。
44.根据权利要求41的方法，其中所述一种或多种结合剂包括一种或多种全类属结合剂。
45.根据权利要求41的方法，进一步包括使固定化捕获结合剂在允许固定化捕获结合剂与带有结合剂的可检测颗粒之间结合的条件下与可检测颗粒接触，其中所述可检测颗粒被所述捕获结合剂的结合表明所述样品中分析物的存在。
46.根据权利要求41的方法，其中所述第一个分析物群的分析物以高于所述第二个分析物群的分析物的浓度存在于所述样品中。
47.根据权利要求41的方法，其中所述可检测颗粒由选自金、银和铂的材料制得。
48.根据权利要求47的方法，其中所述可检测颗粒由金制得。
49.根据权利要求41的方法，其中所述分析物是细菌抗原。
50.根据权利要求41的方法，其中所述结合剂通过衔接物结合到所述可检测颗粒上。
51.根据权利要求50的方法，其中所述衔接物选自蛋白A、蛋白G、蛋白L和种特异性抗免疫球蛋白抗体。
52.根据权利要求51的方法，其中所述衔接物是蛋白A。
53.根据权利要求50的方法，其中所述衔接物以约1至约10个衔接物分子/100nm2的表面密度存在于所述可检测颗粒上。
54.根据权利要求41的方法，其中所述结合剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、其功能性片段，及其组合。
55.根据权利要求54的方法，其中所述多克隆抗体或单克隆抗体包括一种或多种全类属抗体或其功能性片段。
56.权利要求26或41的方法，进一步包括用酶的混合物处理所述样品以提高所述试验的敏感性。
57.权利要求56的方法，其中所述酶的混合物包括一种或多种细菌细胞壁特异性内肽酶和一种或多种细菌细胞壁特异性糖苷水解酶。
58.权利要求57的方法，其中所述细菌细胞壁特异性内肽酶是溶葡萄球菌酶。
59.权利要求57的方法，其中所述细菌细胞壁特异性糖苷水解酶是溶菌酶。
60.权利要求57的方法，其中所述细菌细胞壁特异性内肽酶是溶葡萄球菌酶而所述细菌细胞壁特异性糖苷水解酶是溶菌酶。
61.权利要求57的方法，其中所述细菌细胞壁特异性内肽酶以约0.06mg/ml至约200mg/ml的浓度存在。
62.权利要求57的方法，其中所述细菌细胞壁特异性糖苷水解酶以约0.0025mg/ml至约15mg/ml的浓度存在。
63.权利要求58的方法，其中所述溶葡萄球菌酶以约0.06mg/ml至约200mg/ml的浓度存在。
64.权利要求59的方法，其中所述溶菌酶以约0.0025mg/ml至约15mg/ml的浓度存在。
65.权利要求56的方法，其中所述酶处理进一步包括表面活性剂。
66.权利要求56的方法，其中所述样品的处理在室温下进行。
67.权利要求56的方法，其中所述酶选自溶葡萄球菌酶、溶菌酶、脂酶、溶菌酶、labiase、无色肽酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、自溶素、噬菌体编码的分解酶，及其组合。
68.用于检测样品中来自多个属的细菌的存在的结合试验，包括用酶处理所述样品来提高所述结合试验的敏感性的步骤。
69.权利要求68的试验，其中所述样品选自：尿、痰、脊髓液、腹水、血液、灌洗液、透析流体和血液制品。
70.权利要求68的试验，其中所述药物组合物是选自下组的血液制品：全血、白细胞、造血干细胞、血小板、红细胞、血浆、骨髓和血清。
71.权利要求68的试验，其中所述处理使用两种或更多种酶并且其中至少一种酶是细菌细胞壁特异性内肽酶和其中至少一种酶是细菌细胞壁特异性糖苷水解酶。
72.权利要求71的试验，其中所述内肽酶选自溶葡萄球菌酶和无色肽酶。
73.权利要求72的试验，其中所述内肽酶是溶葡萄球菌酶。
74.权利要求71的试验，其中所述糖苷水解酶选自：溶菌酶和溶菌酶。
75.权利要求74的试验，其中所述糖苷水解酶是溶菌酶。
76.权利要求71的试验，其中所述两种或更多种酶包括溶葡萄球菌酶和溶菌酶。
77.权利要求71或72的试验，其中所述细菌细胞壁特异性内肽酶以约0.06mg/ml至约200mg/ml的浓度存在。
78.权利要求71的试验，其中所述细菌细胞壁特异性糖苷水解酶以约0.0025mg/ml至约15mg/ml的浓度存在。
79.权利要求73或76的试验，其中所述溶葡萄球菌酶以约0.06mg/ml至约200mg/ml的浓度存在。
80.权利要求75或76的试验，其中所述溶菌酶以约0.0025mg/ml至约15mg/ml的浓度存在。
81.权利要求68的试验，其中所述处理进一步包括表面活性剂。
82.权利要求68的试验，其中处理所述样品在室温下进行。
83.权利要求68的试验，其中所述酶选自溶葡萄球菌酶、溶菌酶、溶菌酶、labiase、无色肽酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、自溶素、噬菌体编码的分解酶，及其组合。
84.权利要求68的试验，其中在使样品与结合试剂接触之前使所述样品与所述酶接触。
85.权利要求68的试验，其中使所述样品与所述酶和结合试剂同时接触。
86.权利要求84或85的试验，其中在检测结合存在或不存在之前用所述酶孵育所述样品。
87.权利要求29或30的试验，其中在使所述样品与所述结合剂接触后立即检测结合的存在或不存在。
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