CN109863400A - 固定化分析物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测分析物的方法,其包括a)使所述分析物、捕获剂和固体表面接触以形成连接到固体表面的捕获复合物,b)切割所述捕获复合物中包含的所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键,并且由此从所述捕获复合物释放所述分析物或其片段,和c)检测所述分析物的所述至少一个片段,并且由此检测所述分析物。本发明进一步涉及试剂盒,其包括:i)捕获剂,其结合(在一个实施方案中特异性结合)分析物;和ii)切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的试剂,并且涉及蛋白酶用于释放分析物片段以检测所述分析物的用途,其中所述分析物经由捕获剂与固体表面结合。
Description
本发明涉及用于检测分析物的方法,其包括a) 使所述分析物、捕获剂和固体表面接触以形成连接到固体表面的捕获复合物,b) 切割所述捕获复合物中包含的所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键,并且由此从所述捕获复合物释放所述分析物或其片段,和c) 检测所述分析物的所述至少一个片段,并且由此检测所述分析物。本发明进一步涉及试剂盒,其包含i) 捕获剂,其结合(在一个实施方案中特异性结合)分析物;和ii) 切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的试剂;并且涉及蛋白酶用于释放分析物的片段以检测所述分析物的用途,其中所述分析物经由捕获剂连接到固体表面。
特异性结合分析物的试剂,特别是抗体,已经长时间用于富集分析物。抗体对其同源表位的典型高亲和力通常是有利的,因为它允许检测甚至少量的分析物。然而,当试图从分析物/抗体复合物回收分析物时,高亲和力转变成缺点,因为必须施加非常苛刻的条件。此外,必须施加的条件和缓冲剂通常与下游应用不相容,从而需要改变缓冲剂、沉淀等进一步的步骤,这通常显著降低分析物的回收率。涉及此类方法的示例性应用,特别是在质谱法(MS)领域中,提供在例如Krastins等人(2013), Clinical biochemistry 46: 399-410;Lopez等人(2010), Clinical chemistry 56: 281-290;Peterman等人(2014),Proteomics 14: 1445-1456;Prakash等人(2012), Journal of proteome research 11:3986-3995;Trenchevska等人(2015), Methods (San Diego, Calif) 81: 86-92;Yassine等人(2013), Proteomics Clinical applications 7: 528-540;Popp等人(2015),Biochimica et biophysica acta 1854: 547-558;Zhao等人(2011), Journal ofVisualized Experiments 53: e2812 1-5;和Klee等人 (2014), Am J Clin Pathol 141:527)中。
进一步地,在多肽分析领域中,发现蛋白的糖基化可严重妨碍分析,特别是需要酶促处理此类糖基化蛋白(如蛋白水解,其可能是例如MS方法中需要的)的分析。为了解决这个问题,CA2527650提出了用于鉴定糖基化多肽的逐步方法。该方法的步骤包括用至少一种蛋白酶处理含有糖基化多肽的生物样品以开始肽消化,然后去糖基化,并且随后用至少一种蛋白酶重新消化以产生去糖基化的多肽片段。然后使用质谱法对去糖基化的多肽片段进行测序,并通过与已知序列的数据库进行序列比较来鉴定。
尽管如此,仍然需要有效的方法来提供通过免疫学方法获得的多肽用于下游应用,如例如质谱法。通过具有独立权利要求的特征的本发明的方式和方法解决了这个问题。在从属权利要求中列出了可能以分离的方式或以任何任意组合实现的优选实施方案。
因此,本发明涉及用于检测分析物的方法,其包括:
a) 使所述分析物、捕获剂和固体表面接触以形成连接到固体表面的捕获复合物,
b) 切割所述捕获复合物中包含的所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键,并且由此从所述捕获复合物释放所述分析物或其片段,和
c) 检测所述分析物或其片段,并且由此检测所述分析物。
如下文中使用的,术语“具有”、“包含”或“包括”或其任何任意语法变体以非排他性的方式使用。因此,这些术语可以指其中除了由这些术语引入的特征外,在此上下文中描述的实体中不存在进一步的特征的情形和其中存在一个或多个进一步的特征的情形。作为实例,表述“A具有B”、“A包含B”以及“A包括B”可以指其中除了B,A中不存在其他要素的情形(即,其中A唯一且排他地由B组成的情形),和其中除了B,实体A中存在一个或多个进一步的要素,例如要素C、要素C和D或者甚至进一步的要素的情形。
此外,如下文中使用的,术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“具体地”、“更具体地”、“特别地”、“更特别地”或类似术语与任选的特征结合使用,而不限制进一步的可能性。因此,通过这些术语引入的特征是任选的特征,并不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的,本发明可通过使用可替代的特征进行。类似地,通过“在本发明的实施方案中”或类似表述引入的特征旨在是任选的特征,而对本发明的进一步实施方案没有任何限制,对本发明的范围没有任何限制,并且对将以这样的方式引入的特征与本发明的其它任选或非任选特征组合的可能性没有任何限制。此外,如果没有另外说明,术语“约”涉及具有相关领域中普遍接受的技术精度的指示值,在一个实施方案中涉及指示值±20%,在进一步的实施方案中涉及指示值±10%,在进一步的实施方案中涉及指示值±5%。
在一个实施方案中,本发明的用于检测分析物的方法是体外方法。此外,它可以包括除上文明确提及的那些以外的步骤。例如,进一步的步骤可涉及例如获得包含分析物的样品用于步骤a),或结构修饰,例如在步骤b)之后衍生分析物的至少一个片段。此外,一个或多个所述步骤可以通过自动设备进行。
如本文所用,术语“分析物”是指能够被捕获剂结合(在一个实施方案中特异性结合)并且包含至少一个可切割键的化学化合物。在一个实施方案中,所述可切割键是可被酶切割的键。在一个实施方案中,所述可切割键的切割导致所述分析物以比所述捕获剂对所述分析物的亲和力低至少10倍的亲和力被捕获剂结合,在进一步的实施方案中导致所述分析物以比所述捕获剂对所述分析物的亲和力低至少100倍的亲和力被捕获剂结合。在进一步的实施方案中,所述可切割键的所述切割导致所述分析物的至少一个片段从所述分析物中释放出来;特别是使捕获复合物解离的半衰期降低至小于2分钟的值,在一个实施方案中降低至小于1分钟的值,在进一步的实施方案中降低至小于30秒的值,在进一步的实施方案中降低至小于10秒的值,在进一步的实施方案中降低至小于1秒的值。在进一步的实施方案中,分析物是由受试者的代谢产生或其中消耗的化合物。在一个实施方案中,所述术语涉及特定分析物的至少一个分子,直至所述特定分析物的多个分子。根据本发明的分析物涵盖所有类别的有机或无机化学化合物,包括生物材料(如生物体)所包含的那些。在一个实施方案中,分析物是小分子。在进一步的实施方案中,分析物是大分子;在一个实施方案中是生物大分子,在进一步的实施方案中是多核苷酸或多肽。因此,在一个实施方案中,分析物是具有至少2000u (2000Da;1 u = 1.66×10-27kg)的分子量的化学化合物;在进一步的实施方案中是具有至少5000 u的分子量的化学化合物,在进一步的实施方案中是具有至少10000 u的分子量的化学化合物。在一个实施方案中,分析物是具有2kDa至500kDa的分子量的化学化合物,在一个实施方案中是具有5kDa至250kDa的分子量的化学化合物。
在一个实施方案中,分析物是多肽。如技术人员已知的,多肽,特别是天然多肽,由经由共价肽键连接的氨基酸组成。如技术人员还已知的,氨基酸的侧链可以进一步修饰,例如通过乙酰化、磷酸化和/或糖基化修饰,特别是在真核细胞中。因此,分析物也可以是修饰的多肽,特别是翻译后修饰的多肽,例如糖基化的多肽。然而,本发明还设想分析物是用非天然存在的侧链修饰的多肽,例如PEG化多肽。在一个实施方案中,分析物是PSA。在一个实施方案中,分析物是人PSA (Genbank Acc No NP_001639.1 GI:4502173)或其一种或所有同种型和/或其一种或所有成熟形式。
技术人员理解术语“共价键”。在一个实施方案中,本发明的共价键是可切割的,在一个实施方案中是可酶促切割的。在一个实施方案中,本发明的共价键是可水解的,在进一步的实施方案中是可酶促水解的。在一个实施方案中,共价键涉及至少一个碳原子。在进一步的实施方案中,共价键是C-O或C-N键。因此,在一个实施方案中,本发明的共价键是酯键、糖苷键或酰胺键,特别是肽键。在一个实施方案中,本发明的共价键是肽键。如本文所用,化学分子的“主链共价键”是在分子内形成最长可能的共价键链的共价键。在多肽中,主链共价键是形成多肽内的肽键的键。相应地,“非主链共价键”是从主链共价键分支出来的共价键,或包含在共价键的分支链中。因此,在多肽中,氨基酸侧链内或其修饰内(例如在糖基化侧链中)的共价键,是非主链共价键。
在一个实施方案中,分析物是多肽并且切割所述分析物内的至少一个共价键包括水解(在一个实施方案中酶促水解)所述分析物内的至少一个肽键。在一个实施方案中,切割所述分析物内的至少一个共价键包括使所述分析物与至少一种蛋白酶接触。在一个实施方案中,蛋白酶是已知其底物特异性的蛋白酶。在进一步的实施方案中,蛋白酶是内肽酶,在进一步的实施方案中,蛋白酶是胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,弹性蛋白酶,嗜热菌蛋白酶,蛋白酶K,LysC,GluC,胰蛋白酶或内切蛋白酶ArgC (梭菌蛋白酶),在进一步的实施方案中是胰蛋白酶或内切蛋白酶ArgC (梭菌蛋白酶),在进一步优选的实施方案中,蛋白酶是胰蛋白酶。
如技术人员所理解的,可以使分析物接触多于一种上述切割至少一个共价键的酶,特别接触至少两种、至少三种或至少四种切割至少一个共价键的酶。在一个实施方案中,顺次进行分析物与多于一种切割至少一个共价键的酶的接触;在进一步的实施方案中,同时进行分析物与多于一种切割至少一个共价键的酶的接触,即通过使分析物同时接触至少两种或更多种切割至少一个共价键的所述酶。技术人员知晓在这种情况下如何选择水解条件。然而,技术人员意识到,并非所述酶的所有组合都可以是相容的,例如对于关于反应温度,pH,辅因子或离子的不同要求,并且在不相容的情况下,将考虑顺次处理。因此,在一个实施方案中,例如通过顺次接触,实现分析物与至少一种蛋白酶和至少一种糖苷酶的接触,如本文所述;在进一步的实施方案中,通过同时接触,实现分析物与至少一种蛋白酶和至少一种糖苷酶的接触,如本文所述。此外,在一个实施方案中,例如,通过与相应的蛋白酶顺次接触,实现分析物与多于一种蛋白酶的接触,如本文所述;在进一步的实施方案中,通过与至少两种蛋白酶同时接触,实现分析物与多于一种蛋白酶接触,如本文所述。
根据本发明,所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的切割从捕获复合物释放分析物或其至少一个片段。如本文所用,术语“释放”涉及使分析物、其片段或捕获剂处于导致所述分析物或其片段与捕获复合物解离的状态。因此,在捕获剂连接到固体表面的情况下,分析物或其片段的释放使得所述分析物或其片段能够从固体表面洗脱。因此,在一个实施方案中,在切割至少一个共价键后,分析物或其片段与残留捕获复合物之间的解离常数为至少10-4 mol/l,在一个实施方案中为至少10-3 mol/l,在进一步的实施方案中为至少10-2 mol/l,在另进一步的实施方案中为至少0.1mol/l。在一个实施方案中,所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少两个共价键被切割,例如从多肽释放内部肽。在进一步的实施方案中,切割多个共价键,其中在一个实施方案中,所述多个为至少五个,在进一步的实施方案中为至少十个,在进一步的实施方案中为至少25个共价键。
在一个实施方案中,从所述分析物释放的至少一个片段是所述分析物的特定片段,术语“特定片段”涉及允许通过所述特定片段鉴定所述分析物的片段。技术人员理解通过其片段之一鉴定分析物取决于所选择的检测方法。例如,特定片段可以是在LC中具有特定洗脱时间的片段和/或可以是在MS中提供特定m/z比的片段等。
在一个实施方案中,分析物包含在样品中,在一个实施方案中包含在受试者的样品中。如本文所用,术语“样品”是指怀疑或已知包含分析物的任何样品。根据本发明,设想样品可以是例如食物样品,细胞培养上清液样品,或受试者的组织或体液样品。在一个实施方案中,样品是体液样品,分离细胞样品,来自组织或器官的样品,或从受试者的体外或体内表面获得的洗涤/冲洗液样品。在一个实施方案中,样品是体液,如血液,血浆,血清,尿液,唾液,泪液。在一个实施方案中,样品是粪便样品。样品可以通过众所周知的技术获得,并且在一个实施方案中包括刮擦物,拭子或活检样品。可以通过使用刷子、(棉)拭子、压舌板、冲洗/洗涤液、穿刺活检装置、用针或外科器械的腔穿刺,获得样品。可以通过分离技术如过滤、离心或细胞分选从细胞培养上清液,体液或组织或器官获得分离的细胞和/或无细胞液体。在一个实施方案中,用作本发明中的样品之前,通过技术人员众所周知的方法之一裂解分离的细胞。应当理解,可以进一步处理样品以便实施本发明的方法。在一个实施方案中,样品来源于血液。在一个实施方案中,样品是血液样品或其级分,在进一步的实施方案中是血液、血清或血浆,在一个实施方案中是血清或血浆。
如本文所用,术语“受试者”是指动物,在一个实施方案中是指哺乳动物,如小鼠,大鼠,绵羊,狗,猫,马,猴或牛,并且在一个实施方案中是指人。
如本发明的方法的上下文中使用的术语“接触”是技术人员理解的。在一个实施方案中,该术语是指使化合物(特别是分析物)与另外的化合物(例如捕获剂)物理接触,并且由此使化合物和另外的化合物相互作用。因此,术语“反应混合物”是指任何混合物,其使第一化合物与第二化合物(例如捕获剂与样品)接触,允许所述第一和第二化合物反应。
如本文所用,术语“捕获复合物”是指任何(在一个实施方案中是指非共价的)复合物,其至少包含如本文他处所述的捕获剂和分析物,在一个实施方案中具有本文他处所述的解离常数。因此,在一个实施方案中,分析物与捕获复合物中的捕获剂结合,如下文所述。在一个实施方案中,捕获复合物是特异性捕获复合物,即捕获剂与所述捕获复合物中的分析物特异性结合。
技术人员理解术语使第一化合物与第二化合物“结合”。在一个实施方案中,结合是指如下相互作用,其具有足够高的结合配偶体的亲和力以允许第一结合配偶体结合到固体表面而不显著浸出第二结合配偶体。在一个实施方案中,结合是解离常数小于10-5 mol/l的结合,在一个实施方案中小于10-6 mol/l,在进一步的实施方案中小于10-7 mol/l,在进一步的实施方案中小于10-8 mol/l,在进一步的实施方案中结合是解离常数小于小于10-9mol/l的结合。因此,在一个实施方案中,至少包含捕获剂和分析物的捕获复合物具有小于10-5 mol/l的解离常数,在一个实施方案中小于10-6 mol/l,在进一步的实施方案中小于10-7 mol/l,在进一步的实施方案中小于10-8 mol/l,在进一步的实施方案中至少包含捕获剂和分析物的捕获复合物具有小于10-9 mol/l的解离常数。确定解离常数的方法是技术人员众所周知的,并且包括例如光谱滴定方法,表面等离子体共振测量,平衡透析等。结合可以通过技术人员已知的所有种类的化学相互作用介导。在一个实施方案中,所述相互作用是非共价键。如本说明书中所用的,术语“结合”在一个实施方案中包括间接结合,即第一化合物与第三化合物经由第二化合物结合,其中在一个实施方案中,所述第一和第三化合物分别仅与第二化合物相互作用。在一个实施方案中,结合是直接结合,即化合物的直接相互作用。
在一个实施方案中,分析物特异性结合捕获剂。如技术人员将理解的,术语“特异性结合”或其语法变体用于表示样品中存在的其他化合物(通常为生物分子)不显著结合本发明的配体,特别是捕获剂。在一个实施方案中,捕获剂与除分析物之外的化合物的结合水平导致结合亲和力,其分别为与分析物的亲和力的至多10%或更低,5%或更低,2%或更低,或1%或更低。
如本文所用,术语“捕获剂”是指与本发明的分析物结合的化学分子。因此,在一个实施方案中,捕获剂是基于分析物特异性亲和力的结合剂。在一个实施方案中,捕获剂是有机分子或其复合物,在进一步的实施方案中是生物大分子,特别是多肽或其复合物。在一个实施方案中,捕获剂是抗体、适体、抗运载蛋白(anticalin)或受体,或具有上述活性的上述化合物之一的片段。在一个实施方案中,捕获剂是单克隆抗体。
捕获剂连接到或适于连接到固体表面。如本文所用,术语“固体表面”是指适于结合本发明的捕获剂且适于例如通过物理方式从样品分离的任何合适的固体表面。在一个实施方案中,所述固体表面是珠子(在一个实施方案中是微珠,例如磁性或顺磁性微珠)的表面。在一个实施方案中,所述表面适于改善捕获化合物的结合,例如通过共价或非共价地连接结合捕获剂的亚结构的分子。结合捕获化合物的亚结构的典型分子是,例如抗体、链霉抗生物素蛋白、复合镍离子等。在进一步的实施方案中,固体表面通过共价或非共价键(例如,通过疏水相互作用)结合所述捕获化合物。因此,在一个实施方案中,所述固体表面是多簇板(multi-cluster plate)的表面。在一个实施方案中,将多簇板的表面预处理以增加结合捕获化合物的亲和力和/或容量。合适的预处理是本领域已知的。在进一步的实施方案中,固体表面是例如提供适当表面的移液器吸头的多孔填充物。
如技术人员所理解的,捕获剂可在使所述捕获剂与分析物接触之前,同时或之后连接到固体表面。在一个实施方案中,在使所述捕获剂与分析物接触后,将捕获剂连接到固体表面,例如通过混合所述分析物和所述捕获剂,然后结合到固体表面。如技术人员将理解的,使捕获剂与样品接触并将所述捕获剂结合到固体表面允许特异性地将由所述捕获剂结合的分析物(如果存在)与包含在所述样品中的其他化合物分离。将捕获剂(例如生物分子,通常是多肽)连接到固体表面的方法是本领域众所周知的,并且包括例如通过疏水相互作用的结合,生物素化和经由固定化的链霉抗生物素蛋白的结合,共价结合,抗体-抗原相互作用等,或这些相互作用的组合。
在一个实施方案中,捕获剂也可以是捕获复合物。在另一个实施方案中,捕获剂是抗体,即捕获抗体,特别是单克隆抗体。在一个实施方案中,捕获抗体与生物素共价偶联。因此,在一个实施方案中,捕获剂是固定化的捕获剂,在一个实施方案中是固定化在固体表面上的捕获剂。在进一步的实施方案中,捕获剂经由共价键和/或疏水键固定化在固体表面上;在进一步的实施方案中,捕获剂经由高亲和力相互作用固定化在固体表面上,在一个实施方案中,经由链霉抗生物素蛋白/生物素相互作用固定化在固体表面上。
如本文所用,术语“抗体”包括单克隆抗体,由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们显示出如本文他处所述的所需结合活性。在一个实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中,所述抗体是全长抗体或抗体片段。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列,抗体(免疫球蛋白)可以被分成不同的类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且其中几种可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的,并且通常描述于例如Abbas等人, Cellular and Mol.Immunology, 第4版, W.B. Saunders, Co. (2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其它蛋白或肽的共价或非共价结合形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换地用于指其基本上完整形式的抗体,而不是如下定义的抗体片段。所述术语特别是指具有含有Fc区的重链的抗体。“抗体衍生物”包含完整抗体的一部分,在一个实施方案中包含其抗原结合区。因此,抗体衍生物可以是抗体片段。抗体衍生物的实例包括Fab,Fab',F(ab')2和Fv片段;双体(diabodies);线性抗体;单链抗体分子,纳米抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段,各自具有单个抗原结合位点)和剩余的“Fc”片段(其名称反映了其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段,其具有两个抗原组合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中,双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv (scFv)种类中,一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接,使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚”结构结合。正是以这种构型,每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以限定抗原结合位点。总共六个HVR赋予抗体抗原结合特异性。然而,甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力,尽管亲和力低于完整的结合位点。术语“双体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段,所述片段包含在相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许在相同链上的两个结构域之间配对的接头,迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对,并且产生两个抗原结合位点。双体可以是二价或双特异性的。双体更全面地描述于例如EP 0 404 097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat. Med. 9 (2003) 129-134;和Hollinger等人,PNAS USA 90 (1993) 6444-6448。三体和四体也描述于Hudson等人, Nat. Med. 9(2003) 129-134。
如本文所用,术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即除了可少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)外,所述群体中包含的单个抗体是相同的。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中,这样的单克隆抗体通常包括包含结合分析物的多肽序列的抗体,其中通过包括从多个多肽序列中选择单个分析物结合多肽序列的方法获得分析物结合多肽序列。例如,选择方法可以是从许多克隆(如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的合并物)中选择独特克隆。应当理解,选择的靶标结合序列可进一步改变,例如以改善对靶标的亲和力、将靶标结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的生产、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等,并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外,单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未被其它免疫球蛋白污染。
可以通过使用例如Harlow和Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSHPress, Cold Spring Harbor, 1988中描述的方法,获得抗体或其衍生物。单克隆抗体可以通过最初在Köhler和Milstein, Nature 256 (1975), 495,和Galfré, Meth. Enzymol.73 (1981), 3中描述的技术制备,所述技术包括小鼠骨髓瘤细胞与源自免疫哺乳动物的脾细胞的融合。
如本文所用,术语“检测”是指定性或定量地检测分析物的至少一个特征,在一个实施方案中,定性或定量地检测分析物的结构和/或数量特征。在一个实施方案中,根据本发明的特征是分析物的结构特征,其促进例如通过质谱法检测样品中的分析物。在一个实施方案中,所述特征促进分析物的鉴定和/或定量。典型的有用特征是促进区分所述分析物与样品中存在的化学化合物的特征。在一个实施方案中,检测分析物是确定分析物是否以高于检测方法的检测限的浓度或量存在于样品中。确定给定检测方法的检测限的方法是技术人员已知的,并且包括例如稀释滴定实验。在进一步的实施方案中,检测是半定量或定量地检测分析物的量或浓度。对于定量检测,将检测分析物的绝对或精确量,或将检测分析物的相对量。在不能或不得检测精确量的情况下,可以检测相对量。在所述情况下,可以检测分析物的存在量相对于包含第二量(在一个实施方案中为预定量)的所述分析物的第二样品是增加还是减少。
在一个实施方案中,检测分析物包括将通过切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键而产生的所述分析物的至少一个片段与其他化合物分离。将化学化合物彼此分离(例如分离单个肽)的方法是本领域已知的,并且包括提取,沉淀,离心,色谱法等。在一个实施方案中,通过色谱法(在一个实施方案中,通过液相色谱法(LC)),实现分离所述分析物的至少一个片段。
如技术人员将理解的,选择用于鉴定和/或定量分析物的方法将取决于所选择的测定形式和待检测的分析物或其片段。原则上,合适的方法是技术人员已知的。在一个实施方案中,特别是在分析物是多肽的情况下,该测定是免疫学测定,其中分析物通过免疫学方式与捕获化合物结合,所述捕获化合物可以连接到固体表面。在一个实施方案中,通过检测化合物(例如标记的第二抗体)与所述捕获的分析物的结合,来检测捕获的分析物的量。在一个实施方案中,捕获和/或检测化合物是抗体,并且测定是夹心免疫测定。
在一个实施方案中,通过包括质谱法(MS)的方法鉴定和/或定量分析物。因此,在一个实施方案中,检测分析物包括通过质谱法(MS)检测所述分析物或其片段,在一个实施方案中通过LC-偶联的质谱法(LC-MS)检测所述分析物或其片段。在进一步的实施方案中,特别是在分析物是多肽的情况下,检测包括通过多反应监测(MRM)-MS检测分析物或其片段,在一个实施方案中通过MRM-LC-MS检测分析物或其片段。在一个实施方案中,检测包括MS并检测分析物的片段。在一个实施方案中,分析物是PSA,用胰蛋白酶切割至少一个共价键,并且检测分析物PSA包括检测PSA的至少一个胰蛋白酶片段,在一个实施方案中包括检测至少一个片段,其选自具有756.5Da、463.2Da、609.3Da和1271.7Da的分子量的片段。
本发明的方法包括检测如上所述的分析物或其片段。如技术人员将理解的,该方法可以进一步包括检测分析物的其他片段以及甚至其他分析物,特别是在MS用于检测的情况下。
在一个实施方案中,用于检测分析物的方法包括修饰所述分析物的其他步骤。如本文所用,术语“修饰”分析物是指引起分析物发生结构变化。在一个实施方案中,结构变化是异构化或添加或去除分析物结构的一部分。在一个实施方案中,修饰是衍生分析物,即向分析物添加化学侧链。在进一步的实施方案中,修饰是切割(在一个实施方案中是水解)非主链共价键,特别是去除侧链修饰,例如在多肽中。在一个实施方案中,在切割与所述捕获剂结合的所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的步骤之前,进行切割(在一个实施方案中进行水解)非主链共价键的进一步步骤。在进一步的实施方案中,在所述分析物与所述捕获剂结合的同时,进行至少一个水解非主链共价键的进一步步骤。因此,在一个实施方案中,对捕获复合物进行至少一个水解非主链共价键的进一步步骤。在一个实施方案中,至少一个水解非主链共价键的进一步步骤包括去糖基化步骤,在一个实施方案中,包括与所述捕获剂结合的所述分析物的酶促去糖基化。
在进一步的实施方案中,至少一个水解非主链共价键的进一步步骤包括这样的进一步步骤:使所述分析物接触水解酶(EC 3),在进一步的实施方案中,接触糖基化酶(EC3.2),在进一步的实施方案中,接触糖苷酶(EC 3.2.1),在进一步的实施方案中,接触外切-α-唾液酸酶(EC 3.2.1.18),内切-α-唾液酸酶(EC 3.2.1.129),α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22),β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23),α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24),甘露糖基-寡糖1,2-α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.113),甘露糖基-寡糖1,3-1,6-α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.114),β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25),α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(EC 3.2.1.49),β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(EC 3.2.1.53),α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51),1,2-α-L-岩藻糖苷酶(EC3.2.1.63),1,3-α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.111),1,6-α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.127),β-L-N-乙酰己糖胺酶(EC 3.2.1.52),内切-α-唾液酸酶(EC 3.2.1.129)和/或甘露糖基-糖蛋白内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.96),在进一步的实施方案中,接触内切糖苷酶Endo F3 (内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶F3,例如来自米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)),或来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的EndoS2,其例如作为GlycINATOR®销售。在进一步的实施方案中,至少一个水解非主链共价键的进一步步骤包括使所述分析物与内切糖苷酶Endo F3接触的进一步步骤。
在进一步的实施方案中,至少一个水解非主链共价键的进一步步骤包括这样进一步步骤:使所述分析物接触作用于除肽键之外的碳-氮键的酶(EC 3.5),在进一步的实施方案中,接触作用于线性酰胺的酶(EC 3.5.1),在进一步的实施方案中,接触肽-N4-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶,在进一步的实施方案中,接触内切糖苷酶PNGase F (肽-N-糖苷酶F,例如来自脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum))。在进一步的实施方案中,至少一个水解非主链共价键的进一步步骤包括使所述分析物与内切糖苷酶PNGase F接触的进一步步骤。技术人员能够选择适当的水解酶和适合于修饰分析物的适当水解条件,例如,通过在如上文所述的水解酶存在下温育分析物,并测试是否已发生所需的修饰。技术人员还能够选择合适的反应条件,例如来自文献,来自包装小册子,或通过实验确定合适的条件。
如技术人员将理解的,可以使分析物接触多于一种的上述水解非主链共价键的酶,特别是接触至少两种、至少三种或至少四种水解非主链共价键的酶。在一个实施方案中,顺次进行分析物与多于一种水解非主链共价键的酶的接触;在进一步的实施方案中,同时进行分析物与多于一种水解非主链共价键的酶的接触,即通过使分析物同时与至少两种或更多种的水解非主链共价键的所述酶接触。技术人员知晓在这种情况下如何选择水解条件。然而,技术人员意识到,并非所述酶的所有组合都可以是相容的,例如对于关于反应温度,pH,辅因子或离子的不同要求,并且在不相容的情况下,将考虑顺次处理。
有利地,在本发明的基础工作中发现,可以从捕获复合物中的分析物获得分析物的片段,从而提供获得样品中分析物的特性和/或量的指示,而不必施加本领域中使用的苛刻洗脱条件的可能性。获得的洗脱物可以例如直接用作LC、特别是HPLC的样品。此外,发现当多肽连接到固体表面时,所述多肽的去糖基化可以更有效。
上文做出的定义经过必要修正应用于下文。下文进一步做出的额外定义和解释也经过必要修正应用于本说明书中所述的所有实施方案。
进一步地,本发明涉及试剂盒,其包括:i) 捕获剂,其结合(在一个实施方案中特异性结合)分析物;和ii) 切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的试剂。
如本文所用,术语“试剂盒”是指可以包装在一起或可以不包装在一起的本发明的上述化合物、装置或试剂的集合。试剂盒的组分可以由单独的小瓶(即,作为单独部分的试剂盒)包含或两种或更多种组分可以在单个小瓶中提供。在一个实施方案中,捕获剂和切割至少一个共价键的试剂由单独的小瓶包含。此外,应当理解,本发明的试剂盒在一个实施方案中用于实施上文所述的方法。在一个实施方案中,设想所有组分都以即用方式提供用于实践上述方法。此外,在一个实施方案中,试剂盒含有用于实施所述方法的说明书。说明书可以由用户手册以纸张或电子形式提供。此外,所述手册可以包含用于解释当使用本发明的试剂盒实施上述方法时获得的结果的说明书。在一个实施方案中,所述试剂盒进一步包含缓冲剂,特别是用于从固体支持物洗脱分析物或其片段的洗脱缓冲剂。在一个实施方案中,所述试剂盒进一步包含固体支持物,例如以珠子或基质填充的移液器吸头的形式。上文描述了固体表面的进一步实施方案。在一个实施方案中,所述试剂盒还包含修饰所述分析物的另外试剂,在一个实施方案中,包含切割所述分析物的至少一个非主链共价键的试剂,特别是酶,例如糖苷酶,在一个实施方案中,如上文所述的糖苷酶。在一个实施方案中,切割至少一个非主链共价键的试剂是糖苷酶,在一个实施方案中是内切糖苷酶,在进一步的实施方案中是Endo F3。
本领域技术人员能够产生结合靶标的特异性结合剂,例如抗体,特别是单克隆抗体;或选择本领域已知的对待捕获的目标抗原具有特异性的结合剂,例如商购可得的抗体。上文已经描述了捕获化合物的适当实施方案。因此,在一个实施方案中,捕获化合物是抗体或其片段。在上文还描述了切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的试剂的适当实施方案。因此,在一个实施方案中,切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的试剂是蛋白酶,在一个实施方案中是内肽酶,在进一步的实施方案中是胰蛋白酶。
本发明还涉及酶用于释放分析物片段以检测所述分析物的用途,其中所述分析物经由捕获剂与固体表面结合。
在一个实施方案中,所述用途是如上文所述的用于检测分析物的方法的用途。在一个实施方案中,所述酶是水解酶,在进一步的实施方案中,酶是如上文所述的蛋白酶和/或糖苷酶。
本发明还涉及用于诊断疾病的方法,其包括如上文所述的用于检测分析物的方法的步骤,以及将所确定的分析物的量与参考进行比较、由此诊断疾病的进一步步骤。
在一个实施方案中,本发明的用于诊断疾病的方法是体外方法。此外,它可以包括除上文明确提及的那些以外的步骤。例如,进一步的步骤可涉及例如从受试者获得样品用于步骤a),或结构修饰,例如在步骤b)之后衍生分析物的至少一个片段。此外,一个或多个所述步骤可以通过自动设备进行。
原则上,本发明的用于诊断疾病的方法适用于诊断任何疾病,其中存在于受试者样品中的至少一种分析物的浓度偏离未患有所述疾病的受试者中的所述分析物的浓度,并且其中所述分析物与捕获剂结合。因此,在一个实施方案中,分析物是如上文所述的生物大分子。在一个实施方案中,分析物是多肽。在进一步的实施方案中,分析物是PSA并且所述疾病是前列腺癌。
如本文所用,术语“诊断”是指评估受试者患有疾病或病症或处于发展疾病或病症的风险的概率。因此,所述方法提供了诊断辅助,因为可能需要通过例如医疗从业者进一步加强或确认所述诊断。特别地,如本领域技术人员将理解的,这种评估虽然优选对于100%的待诊断受试者都是正确的,但通常并非如此。在一个实施方案中,所述术语要求统计学上显著部分的受试者可以被鉴定为患有疾病或具有其易感体质。一部分是否是统计学显著的可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具,例如置信区间的确定,p-值确定、Student氏t-检验、Mann-Whitney检验等确定而无需再费周折。细节见于Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选的置信区间是至少50%、至少60%、至少70%、至少80%,至少90%、至少95%。在一个实施方案中,p-值为0.2、0.1、0.05。此外,应该理解,本发明的方法基本上提供了诊断辅助,并且可以包括在其他诊断措施中或由其他诊断措施补充。根据本发明的诊断包括相关疾病或其症状的监测,确认和分类。监测涉及保持跟踪已经诊断的疾病或并发症,例如分析疾病的进展或消退,特定治疗对在疾病期间或成功治疗疾病后出现的疾病或并发症的进展的影响。确认涉及使用其他指标或标记加强或证实已经建立的诊断。分类涉及将根据症状的强度或种类的诊断分配到不同的类别,例如前列腺癌的阶段。如本文所用,处于风险中意味着受试者尚未发展疾病或病症,但尽管如此,将来会有一定可能性发展该疾病或病症。易感体质的诊断有时可以被称为预测受试者将发展疾病的可能性。
术语“参考”是指代表它们的量或值,即分析物的特征型特征的数据,其可以与疾病或病症的存在或不存在相关。在一个实施方案中,此类参考是从已知患有待诊断疾病的受试者或受试者组的样品获得的。所述参考可以例如是从一组这样的样品得到的平均值或平均数。可通过应用本发明的方法获得所述参考。或者,可以从已知未患有待诊断疾病的受试者或受试者组的样品中获得所述参考。此外,参考可以是对表观健康的个体的代表性群体的分析物的相对或绝对量的计算的参考,例如平均值或中值。可以根据本发明确定所述群体的所述个体的分析物的绝对或相对量。如何计算合适的参考值(在一个实施方案中,为平均值或中值)是本领域众所周知的。在前面提及的受试者群体应当包含多个受试者,在一个实施方案中,至少5、10、50、100、1,000或10,000个受试者。应当理解,在一个实施方案中,待通过本发明方法诊断的受试者和所述多个受试者中的受试者属于相同的物种。技术人员知道如何建立参考值,该参考值可以是截止值,正常值的上限,中值或平均值,参考范围等。
鉴于上文,特别设想了以下实施方案:
1. 用于检测分析物的方法,其包括:
a) 使所述分析物、捕获剂和固体表面接触以形成连接到固体表面的捕获复合物,
b) 切割所述捕获复合物中包含的所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键,并且由此从所述捕获复合物释放所述分析物或其片段,和
c) 检测所述分析物或其片段,并且由此检测所述分析物。
2. 实施方案1的方法,其中所述分析物是大分子,在一个实施方案中是生物大分子。
3. 实施方案1或2的方法,其中所述分析物是多核苷酸或多肽,在一个实施方案中是多肽。
4. 实施方案1-3中任一项的方法,其中所述分析物是PSA。
5. 实施方案1-4中任一项的方法,其中所述分析物包含在样品中,在一个实施方案中包含在受试者的样品中。
6. 实施方案1-5中任一项的方法,其中所述样品是血液样品或其级分,在一个实施方案中是血液、血清或血浆,在一个实施方案中是血清或血浆。
7. 实施方案1-6中任一项的方法,其中所述捕获剂是特异性结合所述分析物的试剂。
8. 实施方案1-7中任一项的方法,其中所述捕获剂是大分子,在一个实施方案中是生物大分子,在进一步的实施方案中是抗体或其衍生物,在进一步的实施方案中是抗体或其衍生物。
9. 实施方案1-8中任一项的方法,其中在使所述捕获剂与所述分析物接触的同时使所述捕获剂连接到固体表面。
10. 实施方案1-9中任一项的方法,其中所述捕获剂经由共价键和/或疏水键固定化在固体表面上。
11. 实施方案1-10中任一项的方法,其中所述捕获剂经由高亲和力相互作用固定化在固体表面上,在一个实施方案中经由链霉抗生物素蛋白/生物素相互作用固定化在固体表面上。
12. 实施方案1-11中任一项的方法,其中所述切割至少一个共价键包括水解所述分析物内的至少一个共价键,在一个实施方案中,包括酶促水解所述分析物内的至少一个共价键。
13. 实施方案1-12中任一项的方法,其中切割所述分析物内的至少一个共价键是切割至少一个主链共价键或者是切割至少一个非主链共价键。
14. 实施方案1-13中任一项的方法,其中所述分析物是多肽,并且其中切割所述分析物内的至少一个共价键包括水解所述分析物内的至少一个肽键,在一个实施方案中,包括酶促水解所述分析物内的至少一个肽键。
15. 实施方案1-14中任一项的方法,其中所述切割所述分析物内的至少一个共价键包括使所述分析物接触至少一种蛋白酶,在一个实施方案中接触内肽酶,在进一步的实施方案中接触胰蛋白酶。
16. 实施方案1-15中任一项的方法,其中所述分析物的所述至少一个片段是所述分析物的特定片段。
17. 实施方案1-16中任一项的方法,其中所述方法包括修饰所述分析物的进一步步骤。
18. 实施方案1-17中任一项的方法,其中所述方法包括至少一个衍生所述分析物或其片段的进一步步骤。
19. 实施方案1-18中任一项的方法,其中所述方法包括至少一个水解非主链共价键的步骤,在一个实施方案中,包括至少一个水解非主链共价键的进一步步骤。
20. 实施方案1-19中任一项的方法,其中所述至少一个水解非主链共价键的进一步步骤在切割与所述捕获剂结合的所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个主链共价键的步骤之前进行。
21. 实施方案1-20中任一项的方法,其中在所述分析物与所述捕获剂结合的同时,进行所述至少一个水解非主链共价键的步骤或进一步步骤。
22. 实施方案1-21中任一项的方法,其中所述方法包括至少一个使与所述捕获剂结合的所述分析物去糖基化的步骤,在一个实施方案中,包括至少一个使与所述捕获剂结合的所述分析物酶促去糖基化的步骤;在进一步的实施方案中,包括至少一个使与所述捕获剂结合的所述分析物去糖基化的进一步步骤,在一个实施方案中,包括至少一个使与所述捕获剂结合的所述分析物酶促去糖基化的进一步步骤。
23. 实施方案1-22中任一项的方法,其中所述方法包括使所述分析物接触内切糖苷酶的步骤,在一个实施方案中包括使所述分析物接触Endo F3的步骤;在进一步的实施方案中,包括使所述分析物接触内切糖苷酶的进一步步骤,在一个实施方案中包括使所述分析物接触Endo F3的进一步步骤。
24. 实施方案1-23中任一项的方法,其中所述检测包括将所述分析物的所述至少一个片段与其他化合物分离,在一个实施方案中通过色谱法分离,在进一步的实施方案中通过液相色谱法(LC)分离。
25. 实施方案1-24中任一项的方法,其中所述检测包括通过质谱法(MS)检测所述分析物或其片段,在一个实施方案中,通过LC-偶联的质谱法(LC-MS)检测。
26. 实施方案1-25中任一项的方法,其中所述检测包括通过多反应监测(MRM)-MS检测所述分析物或其片段,在一个实施方案中,通过MRM-LC-MS检测所述分析物或其片段。
27. 试剂盒,其包括:i) 捕获剂,其结合(在一个实施方案中特异性结合)分析物;和ii) 切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的试剂。
28. 实施方案27的试剂盒,其中所述捕获剂是基于分析物特异性亲和力的结合剂,在一个实施方案中选自由抗体(特别是多克隆或单克隆抗体)、适体和受体组成的列表。
29. 实施方案27或28的试剂盒,其中所述捕获剂是抗体或其片段。
30. 实施方案27-29中任一项的试剂盒,其中切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的所述试剂是蛋白酶,在一个实施方案中是内肽酶,在进一步的实施方案中是胰蛋白酶。
31. 实施方案27-30中任一项的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包括至少一种固体支持物。
32. 实施方案27-31中任一项的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包括切割所述分析物的至少一个非主链共价键的试剂,在一个实施方案中包括糖苷酶,在一个实施方案中是内切糖苷酶,在进一步的实施方案中是Endo F3。
33. 实施方案27-32中任一项的试剂盒,其中切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的所述试剂是切割至少一个非主链共价键的试剂,在一个实施方案中是糖苷酶,在进一步的实施方案中是内切糖苷酶,在进一步的实施方案中是Endo F3。
34. 酶用于释放分析物的片段以检测所述分析物的用途,其中所述分析物经由捕获剂与固体表面结合。
35. 实施方案34的用途,其中所述用途是实施方案1-26中任一项的方法的用途。
36. 用于诊断疾病的方法,其包括实施方案1-26中任一项的步骤,和将所确定的分析物的量与参考进行比较、由此诊断疾病的进一步步骤。
37. 实施方案36的方法,其中所述分析物是PSA并且其中所述疾病是前列腺癌。
本说明书引用的所有参考文献就其全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内容通过引用并入本文。
附图说明
图1:总离子流MS谱,其显示如实施例中所述,通过在溶液中去糖基化和蛋白酶处理产生的PSA片段的检测。没有产生具有8.15分钟的洗脱时间的第一片段;通过单独的蛋白水解,产生具有5.80分钟的洗脱时间的第二片段,与去糖基化无关。A)重建的总离子流色谱图(RTICC);B) 岩藻糖基化的PSA糖肽(N(+GlcNAc+Fuc)K)的提取离子流(XIC);C) 总PSA肽(LSEPAELTDAVK,SEQ ID NO:1)的XIC;x轴:以分钟计的洗脱时间,y轴:以计数/秒(cps)计的强度。
图2:总离子流MS谱,其显示如实施例中所示,通过直接在移液器吸头上的去糖基化和蛋白酶处理产生的PSA片段的检测。生成第一和第二片段二者。A)-C)如图1中;x轴:以分钟计的洗脱时间,y轴:以cps计的强度。
以下实施例应仅举例说明本发明。它们无论如何都不应解释为限制本发明的范围。
实施例1:材料
1.1免疫富集
磷酸盐缓冲盐水(PBS, 目录号P4417)来自Sigma。根据如例如EZ-Link®硫代-NHS-LC-生物素化试剂盒(Pierce)中所述的标准方法,内部产生生物素化的抗体片段MAK<PSA>M-36-Fab-Bi mono (批号Bg01MP),其也可作为Roche总PSA Elecsys测试/测定(Roche订单号04641655190)的试剂1 (R1)的组分商购获得。链霉抗生物素蛋白包装的移液器吸头MSIAD.A.R.T.'s,链霉抗生物素蛋白(目录号991STR11),FinnpipetteTM Novus i MultichannelElectronic和移液管支架(目录号991SP12)来自ThermoScientific。PSA CalSet II (Ref.04485220190,批号180 622-02)来自Roche。深孔板96/500 µL蛋白LoBind (目录号951032107)来自Eppendorf。
1.2内切-去糖基化和消化
三氟乙酸ULC/MS (TFA,目录号0020234131BS,批号1048611),冰醋酸(Cas. 64-19-7,批号704681)来自Biosolve。乙酸钠(目录号1.06268.1000,批号A0195768119)来自Merck,碳酸氢铵(ABC, Cas. 1066-33-7,批号0902801004)来自J.T. Baker,胰蛋白酶(目录号T6567,批号SLBH0629V)获得自Sigma,且Endo F3 (目录号E-EF03,批号902.1A)来自QA-Bio。在来自Eppendorf的Thermomixer C中进行37℃的温育,或使用来自Heraeusinstruments的B型6030培养箱。将样品在来自Eppendorf的Concentrator 5301中干燥。
1.3 LC-MS
乙腈ULC/MS (ACN, Cas. 75-05-8,批号1076121)和甲酸99%ULC/MS (目录号0006914143BS,批号1061561)来自Biosolve。色谱系统是来自Agilent的Infinity 1290HPLC,包括二元泵(G4220A),柱温箱(G1316C),自动进样器(G4226A)和恒温器(G1330B)。使用来自Waters的Xbridge Amide柱(130A, 3.5µm, 2.1 x 100mm,部件号186004860,序列号01253526417909,批号0125352641)进行LC-分离。MS是具有来自AB Sciex的Turbo V TM离子源的QTRAP 6500。
实施例2:方法
2.1样品、缓冲剂和溶液的制备:
在来自Pure Aqua的Milli-Q plus装置中纯化水。将来自校准品(Calibrator set)的冻干PSA溶解于1000µl H2O,生成具有大约60ng/ml的PSA浓度的血清溶液。通过将PBS片剂溶解在200ml H2O中来制备10mM PBS。将4995μl的10mM PBS-缓冲剂与5μl吐温20混合。通过使用3316µl 10mM PBS-缓冲剂稀释6µl MAK<PSA>M-36-Fab-Bi mono (5.54mg/ml)来制备0.01µg/µl MAK<PSA>M-36溶液。通过将393mg ABC溶解在50ml H2O中来制备100mM ABC-缓冲剂(pH 7.8)。将409mg乙酸钠溶解于30ml H2O中,用冰醋酸调节至pH 4.5并用H2O定容至50ml,产生100mM乙酸钠缓冲剂(pH 4.5)。将20μg冻干的胰蛋白酶溶解在100µl 100mM ABC-缓冲剂中。将由此产生的30μl胰蛋白酶溶液用30µl 100mM ABC-缓冲剂稀释,从而获得0.2μg/μl和0.1μg/μl胰蛋白酶溶液。通过向1000ml H2O添加1ml甲酸产生洗脱液A。通过向1000ml ACN添加1ml甲酸产生洗脱液B。通过混合40ml ACN,60ml H2O和400µl TFA来制备洗脱缓冲剂。
2.2样品处理
2.2.1免疫富集
对于步骤1-6,将表1第2-3列中所示的体积吸取至深孔板96中。此后,自动将表1第4列中所示的体积在链霉抗生物素蛋白包装的移液器吸头上下吸取。吸取重复表1第5列中所示的次数。
表1:免疫富集
步骤 | 溶液 | 深孔板中的体积[μl] | 吸取体积[μl] | 重复次数 |
1 | 10mM PBS缓冲剂 | 200 | 175 | 20 |
2 | 0.01μg/μl MAK<PSA>M-36 | 125 | 100 | 400 |
3 | 10mM PBS-缓冲剂 | 200 | 175 | 20 |
4 | 60ng/ml 总PSA Cal2 | 100 | 75 | 1000 |
5 | 含0.1%吐温的10mM PBS-缓冲剂 | 200 | 175 | 20 |
6 | H<sub>2</sub>O | 200 | 175 | 20 |
2.2.2内切-去糖基化和消化
根据2.2.1. (捕获复合物的形成)进行免疫富集后,直接在链霉抗生物素蛋白包装的移液器吸头中或在溶液中进行内切-去糖基化,然后进行酶促蛋白水解,如下:
溶液中的酶处理
通过手动上下吸取10μl洗脱缓冲剂20次,使用25μl洗脱缓冲剂,从链霉抗生物素蛋白包装的移液器吸头洗脱分析物。此后,添加20µl 100mM ABC-缓冲剂(pH 7.8),然后添加2µlEndo F3 (5单位/ml),并在37℃以1000rpm搅拌21小时。随后,添加40µl 100mM ABC-缓冲剂(pH 7.8)和5μl胰蛋白酶(0.2μg/μl)并在37℃以1000rpm搅拌21小时。随后,将样品在真空中完全干燥(45℃,2h)。将干燥的剩余物溶解于25μl含40%洗脱液A (v/v)的洗脱液B中,并转移到具有微插入物(microinsert)的玻璃小瓶中。此处理结果的分析的代表性实例显示在图1中;仅检测到具有大约5.80分钟的洗脱时间的片段,其对PSA为诊断性的。
直接在移液器吸头上的酶处理
向0.5ml Lo-Bind管中,吸取8µl 100mM乙酸钠(pH4.5)和2µl Endo F3 (5单位/ml)。将所得溶液手动并完全吸入链霉抗生物素蛋白包装的移液器吸头中。将移液器吸头在Lo-Bind管中保持静置,并在培养箱中在37℃温育21小时。随后,通过自动上下吸取175μl缓冲剂20次,用200µl 100mM ABC-缓冲剂(pH 7.8)洗涤移液器吸头。随后,将10μl胰蛋白酶(0.1μg/μl)吸取到具有微插入物的玻璃小瓶中,并手动和完全吸入移液器吸头中。将移液器吸头在玻璃小瓶中保持静置,并在培养箱中在37℃温育21小时。随后,将移液器吸头的内容物完全转移到微插入物中,并通过手动上下吸取10μl溶液20次,用20μl含10%洗脱液A的洗脱液B洗涤移液器吸头。将洗涤溶液与微插入物的内容物合并。此处理结果的分析的代表性实例显示在图2中;检测到具有大约5.80分钟的洗脱时间的片段和洗脱时间在大约8.15分钟的额外片段,二者对PSA都为诊断性的。
实施例3:LC-MS
3.1 HPLC条件
流速为0.3ml/min,并且梯度开始时洗脱液A的比例为10%;在10分钟内,洗脱液A的比例增加到50%。再过0.1分钟后,洗脱液A的比例增加到70%并保持3.9分钟。随后,洗脱液A的比例在0.1分钟内降至10%并再保持5.9分钟。注射体积为20μl,且柱温箱的温度为50℃。
3.2 MS条件
根据制造商的说明,使用来自AB Sciex的聚丙二醇,ES调谐混合物和调谐混合物溶剂对MS装置进行调谐和校准。在10Da/s的扫描速度,将Q1和Q3的分辨率调整到0.7±0.1 amu的半最大值峰全宽度。测量以正电离模式进行。源参数总结在表2中,并且分析物特异性参数总结在表3中。MRM转换之间的等待时间为5ms。
表2:源参数
气帘气体[psi] | 30 |
碰撞气体[psi] | 12 |
离子喷雾电压[伏特] | 4500 |
温度(℃): | 450 |
离子源气体1 [psi] | 50 |
离子源气体2 [psi] | 70 |
表3:分析物特异性参数
肽 | Q1[Da] | Q3[Da] | 停留时间[ms] | 去簇电势[伏特] | 入口电势[伏特] | 碰撞能量[伏特] | 室出口电势[伏特] |
NK+GlcNAc | 464.240 | 261.100 | 100.0 | 75.000 | 10.000 | 27.000 | 15.000 |
NK+GlcNAc+Fuc(1) | 610.290 | 464.300 | 100.0 | 110.000 | 10.000 | 30.000 | 6.000 |
NK+GlcNAc+Fuc(2) | 610.290 | 261.100 | 100.0 | 100.000 | 10.000 | 39.000 | 11.000 |
LSEPAELTDAVK(1) | 636.840 | 472.200 | 100.0 | 25.000 | 10.000 | 24.000 | 15.000 |
LSEPAELTDAVK(2) | 636.840 | 183.100 | 100.0 | 50.000 | 10.000 | 30.000 | 5.000 |
SVILLGR(1) | 379.250 | 571.200 | 100.0 | 25.000 | 10.000 | 15.000 | 11.000 |
SVILLGR(2) | 379.250 | 458.300 | 100.0 | 35.000 | 10.000 | 15.000 | 11.000 |
实施例4:数据采集和分析
使用来自AB Sciex的Analyst软件1.6.2,使用平滑宽度因子3进行仪器控制,数据采集和处理,以及分析。使用IntelliQuan积分算法自动进行峰积分。
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
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<130> RD12366PC
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<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys
1 5 10
Claims (16)
1.用于检测分析物的方法,其包括:
a) 使所述分析物、捕获剂和固体表面接触以形成连接到固体表面的捕获复合物,
b) 切割所述捕获复合物中包含的所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键,并且由此从所述捕获复合物释放所述分析物或其片段,和
c) 检测所述分析物或其片段,并且由此检测所述分析物,
其中在使所述捕获剂与所述分析物接触的同时使所述捕获剂连接到所述固体表面,且
其中所述方法包括至少一个使与所述捕获剂结合的所述分析物去糖基化的进一步步骤。
2.权利要求1的方法,其中所述分析物是多肽,在一个实施方案中是前列腺特异性抗原(PSA)。
3.权利要求1或2的方法,其中所述分析物包含在样品中,在一个实施方案中包含在受试者的样品中。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述捕获剂是特异性结合所述分析物的试剂。
5.权利要求1-4中任一项的方法,其中所述捕获剂是抗体或其衍生物。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述切割至少一个共价键包括酶促水解所述分析物内的至少一个共价键。
7.权利要求1-6中任一项的方法,其中所述切割所述分析物内的至少一个共价键包括使所述分析物接触至少一种蛋白酶,在一个实施方案中接触内肽酶,在进一步的实施方案中接触胰蛋白酶。
8.权利要求1-7中任一项的方法,其中所述至少一个使所述分析物去糖基化的进一步步骤包括使所述分析物接触内切糖苷酶,在一个实施方案中接触Endo F3。
9.权利要求1-8中任一项的方法,其中所述检测包括通过质谱法(MS)检测所述分析物或其片段,在一个实施方案中通过液相色谱(LC)-偶联的质谱法(LC-MS)检测所述分析物或其片段。
10.试剂盒,其包括:i) 捕获剂,其结合分析物,在一个实施方案中特异性结合分析物;和ii) 切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的试剂,
其中切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的所述试剂是蛋白酶,且
其中所述试剂盒进一步包括至少一种糖苷酶和至少一种固体支持物。
11.权利要求10的试剂盒,其中所述捕获剂是抗体或其片段。
12.权利要求10或11的试剂盒,其中切割所述分析物内和/或所述捕获剂内的至少一个共价键的所述试剂是内肽酶,在进一步的实施方案中是胰蛋白酶。
13.权利要求10-12中任一项的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包括至少一种内切糖苷酶,在进一步的实施方案中包括Endo F3。
14.蛋白酶用于释放分析物片段以检测所述分析物的用途,其中所述分析物经由捕获剂与固体表面结合,并且其中所述分析物在与所述蛋白酶接触之前与内切糖苷酶接触。
15.用于诊断疾病的方法,其包括权利要求1-9中任一项的步骤,和将所确定的分析物的量与参考进行比较,由此诊断疾病的进一步步骤。
16.权利要求15的方法,其中所述分析物是PSA,并且其中所述疾病是前列腺癌。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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