CN105579849A - 在用于检测多聚靶分子的基于颗粒的测试中防止聚集的试剂、方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在用于检测样品中包含两个或多个类似或相同表位的多表位靶分析物和/或用于确定样品中多表位靶分析物的浓度的测试中防止检测颗粒聚集的方法，其中所述方法包括应用能够特异性结合到多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体的步骤，其特征在于所述第一捕获实体阻断至少一个表位结合到检测颗粒。本发明进一步涉及其中多表位靶分析物的检测包括使用第二捕获实体的方法，所述第二捕获实体可以如第一捕获实体那样特异性结合到多表位靶分析物的相同或相似表位。还预期到用于检测所述多表位靶分析物的方法，该方法在包括传感器表面的系统中的执行并且使用第一捕获实体以阻断至少一个表位结合到检测颗粒，诸如磁检测颗粒。

Description

在用于检测多聚靶分子的基于颗粒的测试中防止聚集的试 剂、方法和设备
技术领域
本发明涉及在用于检测样品中包含两个或多个类似或相同表位的多表位靶分析物和/或用于确定样品中多表位靶分析物的浓度的测试中防止检测颗粒聚集的方法，其中所述方法包括应用能够特异性结合到多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体的步骤，其特征在于所述第一捕获实体阻断至少一个表位结合到检测颗粒。本发明进一步涉及其中多表位靶分析物的检测包括使用第二捕获实体的方法，所述第二捕获实体可以如第一捕获实体那样特异性结合到多表位靶分析物的相同或相似表位。还预期到用于检测所述多表位靶分析物的方法，在包括传感器表面的系统中执行该方法以及使用第一捕获实体以阻断至少一个表位结合到检测颗粒，诸如磁检测颗粒。
背景技术
对普遍且有效的医疗护理的需求使得体外诊断学的世界朝向集成随机访问和床旁护理(point-of care)解决方案发展。此类解决方案的实现要求较高：测试需要是快速、灵敏、定量且准确的。此外，在其上执行测试的平台需要易于使用且简洁。
亲和力测定使用生物分子来从样品中捕获特异性靶分子并且允许确定其浓度。通常，通过将涂敷有捕获分子的纳米颗粒或微粒分散至样品流体中来实现亲和力捕获(Luchini 等人, 2008, Nano Lett., 8(1), 350 - 361)。因此，典型的基于亲和力的测定在海量应用中使用，诸如诊断学测定、在研究中检测生物分子，诸如蛋白、肽和核酸，由此使用亲和分子，诸如例如抗体，其通常通过对特定生物分子的高结合亲和力来表征。原则上，官能化的颗粒，例如磁颗粒，被吸引至传感器表面，在那里颗粒可以间接（即借助于捕获的分析物）或直接结合到捕获探针，诸如印刷在表面上的抗体。结合的颗粒数目与样品中存在的靶分子的数量正相关或反相关。通常，在此类生物传感器应用中，可以使用对接近表面的颗粒灵敏的任何技术来检测颗粒；通常此类技术基于光学检测，诸如检测散射光或受抑全内反射（FTIR），如例如Bruls 等人, Lab Chip, 2009, 9. 2504-3510中所述。
然而，如现有技术中描述的此类亲和力测定的重要缺点是这一事实，即在靶分子以多聚形式存在或提供大量相似或相同表位的情况下，多个颗粒可以结合到同一靶分子，其可导致形成珠粒-靶聚集体，即以群聚。这可能显著减低颗粒（例如磁颗粒）的数目，所述颗粒可能与表面紧密接触并且因此可能降低测定的灵敏度。此外，此类聚集过程可以以不可重现的方式发生，因此导致测定结果不准确。
因此，存在提供在多聚或多表位靶分子存在的情况下防止颗粒群聚的手段和方法的需求。
发明内容
本发明针对这些需求并且提供在多聚或多表位靶分子存在的情况下防止颗粒群聚的手段和方法。上述目标具体通过在用于检测样品中包含两个或多个相似或相同表位的多表位靶分析物和/或用于确定样品中所述多表位靶分析物的浓度的测试中防止检测颗粒聚集的方法来实现，其中所述方法包括应用能够特异性结合到所述多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体的步骤，其特征在于所述第一捕获实体阻断至少一个表位结合到检测颗粒。此类第一捕获实体的采用导致大部分相似或相同表位覆盖在靶分析物上并且仅留下一小部分或单一表位。这些少数表位是自由的并且可以随后或同时通过能够与检测颗粒相互作用的另外捕获实体而结合。由此，有效地防止以其他方式几乎不可避免的检测颗粒的群聚。这导致测定或相应的检测方法的灵敏度的显著增加，并且还改进测定/检测方法的再现性，因而增加测定/检测方法准确性。
在优选的实施方案中，如上所提及的所述多表位靶分析物的检测因而包括使用第二捕获实体，其可以如第一捕获实体那样特异性结合到多表位靶分析物的相同或相似表位，其中第二捕获实体包含准许第二捕获实体结合到检测颗粒的标记。
在本发明的仍另一优选的实施方案中，多表位靶分析物的检测包括使用第二捕获实体，其可以如第一捕获实体那样特异性结合到多表位靶分析物的相同或相似表位，并且其中第二捕获实体存在于检测颗粒上。
在进一步的方面中，本发明涉及用于检测样品中多表位靶分析物和/或用于确定样品中多表位靶分析物的浓度的方法，其包括以下步骤：
- 应用可以特异性结合到多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体，其特征在于第一捕获实体阻断至少一个表位结合到检测颗粒；
- 应用第二捕获实体，其可以如第一捕获实体那样特异性结合到多表位靶分析物的相同表位，其中第二捕获实体包含准许第二捕获实体结合到如上文定义的检测颗粒的标记，或其中第二捕获实体存在于如上文定义的检测颗粒上；以及
- 利用能够结合到第二捕获实体上所存在的标记的检测颗粒或利用包含能够特异性结合到多表位靶分析物的表位的第二捕获实体的检测颗粒来检测多表位靶分析物，
其中防止所述检测颗粒聚集。
在如上定义的方法的优选实施方案中，测试中待使用的第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量取决于以下来制定
（i）待使用的检测颗粒的数目；
（ii）用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；
（iii）多表位靶分析物上相似或相同表位的数目；
（iv）待测量的多表位靶分析物的浓度范围；
（v）第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力；
（vi）第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力；和/或
（vii）检测颗粒上标记的结合位点的数目。
在使用如上文定义的第一和第二捕获实体的方法的仍另一优选的实施方案中，在用于检测样品中多表位靶分析物和/或用于确定样品中多表位靶分析物的浓度的测试中待使用的第一与第二捕获实体的比例为n-1至1，其中n为多表位靶分析物上相同表位的数目。
在方法的进一步优选的实施方案中，使包含多表位靶分析物的样品在添加检测颗粒之前与第一和/或第二捕获实体接触。
在本发明的另一优选实施方案中，第一捕获实体和/或第二捕获实体为抗体、抗体片段（诸如Fab片段）、DNA分子、RNA分子或非免疫球蛋白。
在进一步优选的实施方案中，非免疫球蛋白为经设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）、affibody分子、adnectin、anticalin、affilin、avimer、knottin、fynomer、phylomer或kunitz域肽。
在仍另一优选的实施方案中，如上所提及的样品中多表位靶分析物的检测和/或样品中多表位靶分析物浓度的确定在系统中执行，包括以下步骤：
- 结合多表位靶分析物至检测颗粒，
- 使结合到多表位靶分析物的检测颗粒与系统的传感器表面接触；
- 允许多表位靶分析物的不同（非相同或不相似的）表位通过系统的传感器表面上所存在的第三捕获实体而结合；以及
- 检测传感器表面上剩余的颗粒。
在特别优选的实施方案中，检测颗粒是磁颗粒。
在进一步优选的实施方案中，样品中多表位靶分析物的检测和/或样品中多表位靶分析物浓度的确定在光磁系统中执行，并且光学检测在静止的样品流体中。
在优选的实施方案中，如本文上述定义的方法另外包括在检测之前磁致动磁颗粒的步骤。
在进一步的方面中，本发明涉及使用可以特异性结合到包含两个或多个相似或相同表位的多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体以阻断至少一个表位结合到检测颗粒。特别优选的是检测颗粒为磁检测颗粒。
在如本文上述定义的方法或用途的特别优选的实施方案中，多表位分析物是CRP或D-二聚体。
附图说明
图1示出FTIR检测的原理。来自光源的光进入筒，从筒/流体界面反射并且在检测器上成像。如果颗粒存在于该界面上所产生的渐逝场中，则反射光强度降低。
图2示出使用Magnotech技术的夹心免疫测定。在区段（1）中，涂敷有针对靶的一级抗体的磁颗粒分散于样品液体中并且结合靶。在区段（2）中，顶部和底部线圈以脉冲方式致动磁颗粒，导致结合至传感器表面，在那里二级抗体可以结合到所结合的靶分子。在区段（3）中，从传感器表面去除未结合的颗粒，并且使用渐逝场检测所结合的颗粒。
图3示出用于磁颗粒夹心测定的反应图示。两个不同的捕获分子（以不同灰影指示）可以结合到靶分子上的不同表位。
图4提供五聚靶分子（例如CRP）的示意图。黑色半圆描绘第一捕获分子（涂敷在磁颗粒上）的结合位点，灰色半圆代表第二捕获分子（涂敷在传感器表面上）的结合位点。
图5示出群聚过程的示意图，其由存在相同靶分子/复合体上的磁颗粒上的捕获分子的多个结合位点所导致。
图6描绘反应图示，其描述了多聚靶（黑色五聚体）的夹心免疫测定。靶与捕获分子的混合物反应，其中一部分携带独特标记（正方形）。所形成的复合体随后与可以结合到标记的捕获分子官能化的磁颗粒反应。最后，具有捕获的靶分子的磁颗粒与传感器表面接触，在那里另一捕获分子（浅灰色）可以结合到靶分子上的不同表位。
图7示出在一次性筒中免疫测定发生的不同过程的图示。
具体实施方式
本发明涉及在多聚或多表位靶分子存在的情况下防止颗粒群聚的手段和方法。
尽管本发明将关于具体实施方案进行描述，但是该描述不应理解为限制性含义。
在详细描述本发明的示例性实施方案之前，给出对于理解本发明重要的定义。
如本说明书和所附权利要求中所用的，“一个”和“一种”的单数形式也包括相应复数，除非上下文另外明确地说明。
在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”指本领域技术人员将理解以仍旧确保所讨论的特征的技术效果的精确度的区间。该术语通常指示从所示数值的±20 %、优选地±15 %、更优选地±10 %、并且甚至更优选地±5 %的偏差。
应理解术语“包含”不是限制性的。对于本发明的目的，术语“由……组成”理解为术语“包含”的优选实施方案。如果下文中将组定义为包含至少一定数目的实施方案，则这意指还涵盖优选仅由这些实施方案组成的组。
此外，说明书和权利要求中术语“第一”、“第二”、“第三”或"(a)"、"(b)"、"(c)"、"(d)"等用于在相似要素之间进行区分并且不一定用于描述相继次序或时间次序。应理解如此所用的术语在合适情况下可互换并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或所示的其他顺序操作。
在术语“第一”、“第二”、“第三”或"(a)"、"(b)"、"(c)"、"(d)"、"i"、"ii"等涉及方法或用途或测定的步骤的情况下，在步骤之间不存在时间或时间间隔相干性，即步骤可以同时进行或可以在此类步骤之间存在秒、分钟、小时、天、周、月或甚至年的时间间隔，除非如上下文所述的本申请中另有说明。
应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案、试剂等，因为这些可以改变。还应理解本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在限定仅由所附权利要求限定的本发明的范围。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如上文已经所述的，本发明在一方面涉及在用于检测样品中包含两个或多个相似或相同表位的多表位靶分析物和/或用于确定样品中所述多表位靶分析物的浓度的测试中防止检测颗粒聚集的方法，其中所述方法包括应用能够特异性结合到所述多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体的步骤，其特征在于所述第一捕获实体阻断至少一个表位结合到检测颗粒。
如本文所用的术语“检测颗粒”意指小的、局部化的物体，物理性质，诸如体积或质量，可以归因于它。在本发明的上下文中，检测颗粒包含本领域技术人员已知的任何合适的材料或由其组成，例如检测颗粒可以包含无机或有机材料，或由其组成或基本上由其组成。通常，检测颗粒可以包含金属或金属合金、或有机材料，或由其组成或基本上由其组成，或者包含碳水化合物要素，或由其组成或基本上由其组成。预期到的材料的示例包括琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和铁磁金属、合金或复合材料。特别优选的是磁或铁磁金属、合金或组合物。本发明中有用的特别优选的检测颗粒是超顺磁颗粒。如本文所用的术语“超顺磁”描述磁性形式，其以小的铁磁或铁磁纳米颗粒呈现。本领域已知在足够小的纳米颗粒中，在温度影响下磁化可以随机翻转方向。两次翻转之间的时间称为Néel弛豫时间。在不存在外部磁场的情形下，当用于测量纳米颗粒的磁化的时间比Néel弛豫时间长得多时，磁化呈现为平均为零，即处于顺磁状态。在这种状态下，外部磁场能够将纳米颗粒类似地磁化为顺磁体。然而，磁化率比顺磁体的那些要大得多。
在本发明的具体实施方案中，磁颗粒可以为含铁的磁颗粒。在其他实施方案中，磁颗粒可以包含氧化铁，如Fe3O4或Fe2O3或铁铂。还预期到具有Ni、Co和Cu的合金或包含这些元素的颗粒。在进一步的实施方案中，磁颗粒可以包含一定数量的超顺磁珠粒，例如以重量计10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或不超过90％。此类珠粒可以例如包含具有聚合物涂层的封装，因而提供大小约200-300 nm的珠粒。在优选的实施方案中，包含于磁颗粒中的材料可以具有尽可能高的每体积饱和矩，因而允许最大化梯度相关的力。
在进一步优选的实施方案中，颗粒材料可以具有特定的性质。例如，材料可以是疏水性的或亲水性的。在进一步特定的实施方案中，颗粒为塑料颗粒。塑料检测颗粒的示例包括胶乳或聚苯乙烯珠粒，例如通常用于纯化的那些。在仍另一个实施方案中，颗粒可以是细胞状检测颗粒，例如具有生物或半生物结构，其存在于生物系统中或具有生物系统或部分生物系统的形式和/或功能。
此外，检测颗粒可以基本上在其转运和性质方面作为完整单元来行使功能。颗粒因而可以是对称的，球状的，基本上球状或球形的，或者是不规则的、不对称的形状或形式。
本发明预期的检测颗粒的大小的范围可以为50 nm至50 µm。优选的是以纳米和微米范围高至若干微米的检测颗粒。在进一步优选的实施方案中，检测颗粒直径大于100 nm。如本文所用的术语“直径”指经过颗粒中心的任何直线段，并且其端点在检测颗粒表面上。在非球形或半球形检测颗粒的情况下，直径理解为经过颗粒中心的最大和最短直线段的平均直径，并且其端点在检测颗粒表面上。特别优选的是检测纳米颗粒，例如检测颗粒直径为约100 nm至10微米，更优选地为100 nm至3 µm，甚至更优选地为300 nm-1000 nm，例如300nm、310 nm、320 nm、330 nm、340 nm、350 nm、360 nm、370 nm、380 nm、390 nm、400 nm、410nm、420 nm、430 nm、440 nm、450 nm、460 nm、470 nm、480 nm、490 nm、500 nm、510 nm、520nm、530 nm、540 nm、550 nm、560 nm、570 nm、580 nm、590 nm、600 nm、620 nm、650 nm、670nm、700 nm、720 nm、750 nm、770 nm、800 nm、820 nm、850 nm、870 nm、900 nm、920 nm、950nm、970 nm、1000 nm，或其中任何值。甚至更优选的为具有约500 nm直径的检测纳米颗粒。在特别优选的实施方案中，检测颗粒的材料是磁性材料。在进一步特别优选的实施方案中，检测颗粒是磁纳米颗粒。在本发明特别优选的实施方案中，材料或颗粒（例如纳米颗粒）可以是超顺磁检测颗粒，其可以例如分散于水溶液中。
在优选的实施方案中，检测颗粒可以在其表面上包含实体，其允许直接或间接检测如本文定义的靶分析物。例如，检测颗粒可以包含一个或多个捕获或结合实体，其能够特异性结合到如本文定义的靶分析物。还预期到以下可能性：检测颗粒包含一个或多个结合实体，其能够或者间接结合到如本文定义的靶分析物，例如经由另外的相互作用物或中间链接分子等。检测颗粒上的此类另外的结合实体可以理解为本发明上下文中的第三捕获实体，其在下文进一步定义。在某些实施方案中，检测颗粒可以包含捕获实体（例如第三捕获实体）的涂层，例如抗体或抗体片段或类似结合分子的涂层，优选如下文详细定义的此类要素的涂层。在特定的实施方案中，检测颗粒可以涂敷有抗生物素蛋白或链霉抗生物素相互作用物或被其覆盖，或者被生物素相互作用物覆盖。此类分子因此可以允许与可能存在于靶分析物上的生物素或抗生物素蛋白分子的相互作用，例如经由生物素或抗生物素蛋白标记的抗体或任何其他生物素或抗生物素蛋白标记的捕获实体的之前结合。可用作相互作用物分子的相互作用对的进一步优选的示例为生物素/抗生物素蛋白、任何抗体/抗原对，例如抗FITC、FITC，抗德克萨斯红/德克萨斯红，抗地高辛/地高辛，以及核酸互补链。使用核酸互补链是有利的，这是由于高度的多重性(multiplexing)和几乎无限的特定组合。进一步预期的是技术人员已知的任何合适的相互作用对。
如在检测颗粒的上下文中所用的术语“聚集”意指两个或多个检测颗粒相互连接并形成颗粒的聚集体，其阻止所参与颗粒的自由移动和离解。聚集可以是平坦的或二维聚集，其中基本上所有颗粒以单个层或维度提供，或者其可以是三维聚集，其中颗粒组装为颗粒的块或群簇。聚集例如可以由存在多表位靶分析物或任何链接实体或结合分子（其能够同时与两个或多个检测颗粒相互作用）而引起。聚集的说明性示例（然而其不应理解为限制性的）提供于图5中。
如本文所用的术语“多表位靶分析物”是指样品中存在的任何物质，其可以根据本发明的方法来检测或测量，例如捕获和可能地隔离，其包含两个或多个相似或相同的表位。因此，靶分析物可以是生物靶标，诸如细胞，例如包括细菌或古菌细胞的原核细胞，或者包括真菌、植物、动物、哺乳动物和人细胞的真核细胞；蛋白，例如受体、配体、生长因子、酶、转录因子或这些中的任何片段；肽；病毒；激素；核酸，例如DNA分子或RNA分子；或本领域技术人员已知的包含两个或多个相似或相同表位的任何其他合适的生物实体。在特定的实施方案中，靶分析物可以是病原菌、革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。可以作为靶分析物捕获的细菌示例为大肠杆菌、分枝杆菌、志贺氏菌、疏螺旋体、沙门氏菌、肠球菌、葡萄球菌、链球菌或肺炎球菌。靶进一步可以是化学靶分析物，诸如小分子或药物分子。在典型的实施方案中，靶分析物可以是作为二聚体（例如同二聚体）、三聚体或多聚体存在的蛋白。它可以进一步典型地为蛋白复合体，其由2个或多个相同蛋白的拷贝组成，或者包含含有2个或多个亚基重复的蛋白。此类靶分析物的示例为免疫球蛋白，如IgG、IgM等，或者含有相同序列的多个重复的核酸序列等。
如本文所用的术语“相似或相同表位”是指可由第一捕获实体识别的靶分析物上抗原确定簇的存在。
靶分析物上存在的抗原确定簇或表位可以是构象表位或线性表位。构象表位可以具有基于实体（例如蛋白）的三级结构的限定的3D结构或形状，即包含分子（例如蛋白）的一级序列的不同区。线性表位可以是一定长度的连续蛋白序列，例如约8-11个氨基酸之间或约13-17个氨基酸之间。抗原确定簇因此可以在序列和/或结构方面进一步相似。在该上下文中的相似性意指表位可由相同结合或捕获实体如分析物上的其他表位一样来识别，即通过如本文定义的第一捕获实体。在优选的实施方案中，相似表位可以由相同抗体（优选地相同单克隆抗体）识别。相似表位可以例如是一定长度的连续蛋白序列，例如约8-11个氨基酸之间、或约13-17个氨基酸之间，其中1、2或3个氨基酸被交换或修饰。相同表位可以例如是一定长度的连续蛋白序列，例如约8-11个氨基酸之间、或约13-17个氨基酸之间，其示出完全序列同一性。相似表位可以进一步为基于三级结构而具有3D结构和/或形状的构象表位，其示出与其他表位的3D结构和/或形状的高度相似性，例如与其他表位的3D结构和/或形状多于85％、90％或95％的相似性。相同表位可以是基于三级结构而具有与其他表位的3D结构和/或形状相同的3D结构和/或形状的构象表位。
靶分析物可以至少包含多于一个此类相似或相同表位。例如，分析物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、150个等或更多个所述相似的相同表位。因此，所有这些表位可以由第一捕获实体（例如免疫系统的元件，诸如抗体）、或由包含抗体的相互作用表面或部分的实体或包含抗体的实体或其任何子形式或衍生物、或由另外的分子（其能够特异性结合到如本文所提及的分子结构或表位）所识别。靶分析物可以在特定实施方案中进一步包含相似或相同表位，例如2个相同表位和1、2、3、4、5个等表位，其与所述2个相同表位相似（且也彼此相似）。此外，靶分析物可以包含一个或多个另外的表位，其与如上定义的多表位不相同或相似。因此，此类二级表位可以不被如上文定义的第一捕获实体所特异性地可检测，例如被相同的抗体或包含抗体的实体或被包含抗体的相互作用表面或部分的实体或被另外的分子（其能够特异性结合到分子结构）所特异性地可检测。优选地，在能够结合到靶分析物的相似或相同表位的捕获实体与如上提及的（多个）二级非相似表位之间，或者在能够结合到如上提及的（多个）二级非相似表位与上文提及的靶分析物的相似或相同表位之间，也不存在交叉反应性或低特异性结合。
如本文所用的术语“第一捕获实体”是指免疫系统的元素，例如抗体，或包含抗体的实体，或包含抗体的相互作用表面或部分的实体，例如确定给定抗体的抗原特异性的高变环或抗体的1、2、3、4、5或6个CDR或其任何子形式或衍生物，或者涉及任何其他分子，其能够特异性结合到分子结构或表位。第一捕获实体可以进一步不涉及免疫球蛋白分子或抗体，但是通过不同的、可选机制提供其特异性结合能力。
在优选的实施方案中，所述第一捕获实体为抗体，抗体片段，例如Fab片段，或核酸或非免疫球蛋白。
本发明上下文中所用的“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以为任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类别（例如IgG1、IgG2、IgG3、lgG4、lgA1和IgA2）或亚类的免疫球蛋白分子。本发明的抗体可以以靶分子的（多个）表位或（多个）部分的方式进行描述或说明，例如本发明的多肽，它们针对其识别或特异性结合。特定表位及其与抗体的相互作用将是本领域技术人员已知的。如本文所用的术语“特异性结合”是指免疫特异性检测和结合抗体到抗原表位。术语“特异性结合”基本上排除非特异性结合，但是不一定排除与其他抗原（具体与包含由本发明抗体检测的相同抗原表位的抗原）的交叉反应性。换言之，与其他表位的交叉反应性应排除，而根据本发明的特异性结合抗体将预期到结合至相似或几乎相同的表位。
抗体可以是特异性结合靶分析物的抗体，例如本文提及的蛋白结构、细胞或病毒表面结构、化学分子或药物、酶或任何其他靶。抗体可以是多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体、单链抗体，或构成Fab片段、Fab'片段、由Fab表达库产生的片段、F(ab’)2、Fv、二硫键链接的Fv、微抗体、双抗体、scFv、sc(Fv)2、完整免疫球蛋白分子、小模块免疫药物(SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含VHH的抗体、抗独特型(抗Id)抗体、上述中任何的任何（多个）表位结合片段。优选是单克隆抗体。抗体可以进一步为人抗原结合抗体片段并且可以包括Fab、Fab'和F (ab')2、Fv、单链Fvs (scFv)、sc(Fv)2、单链抗体、二硫键链接的Fv(sdFv)以及包含VL或VH域的片段。
根据本发明的抗体可以来自包括鸟类和哺乳动物的任何动物来源。优选地，抗体为人、鼠（例如小鼠和大鼠）、驴、猴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。
根据本发明的抗体优选是单特异性抗体。
核酸分子例如可以是DNA或RNA或PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子、或其任何混合物或组合、或与其他标记或表位的任何混合物或组合。术语“PNA”涉及肽核酸，即类似于DNA或RNA的人工合成聚合物，其用于生物研究和医学治疗中，但是已知其非天然存在。PNA主链通常由肽键链接的重复N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元构成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键链接至主链上。PNA通常描述为像肽，具有第一（左侧）位的N末端和右侧的C末端。尽管DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖主链，但是PNA主链是由肽键链接的重复N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元构成。本领域已知PNA低聚物还示出在结合到互补DNA中的更大特异性。进一步细节可以来源于任何合适的文献或教科书，例如Nielsen PE, Egholm M (1999), AnIntroduction to Peptide Nucleic Acid, Curr.Issues Mol.Biol.1 (2):89–104。术语“CNA”涉及氨基环己基乙烷酸核酸。此外，该术语涉及环戊烷核酸，即包含例如2'-脱氧碳环鸟苷的核酸分子。术语“HNA”涉及己糖醇核酸，即从标准核碱基和磷酸化1,5-失水己糖醇主链构建的DNA类似物。术语“LNA”涉及锁核酸。通常，锁核酸是修饰的并且因此为不可接近的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分可以被连接2'和4'碳的额外桥接所修饰。此类桥接锁住3'-内结构构象中的核糖。锁住的核糖构象增强碱基堆积和主链预组织。这可以显著增加热稳定性，即低核苷酸的解链温度。术语“ANA”涉及树胶糖酸核酸或其衍生物。本发明上下文中优选的ANA衍生物为2'-脱氧-2'-氟代-β-D-阿糖核苷(2'F-ANA)。
如本文所用的术语“非免疫球蛋白”是指能够特异性结合到靶分子（诸如核糖体蛋白）的高亲和力蛋白的组，但是不包含免疫球蛋白域或元素。非免疫球蛋白可以提供若干不同的结合机制并且优选具有对如上文定义为抗体的靶结构（诸如核糖体蛋白）的相似亲和力。
可用于本发明上下文中的非免疫球蛋白的优选示例包括包含锚蛋白重复的蛋白结构。通常，在经设计的锚蛋白重复蛋白（DARPins）中存在三个、四个或优选五个重复锚蛋白基序。这些可以形成具有大潜在靶相互作用表面的稳定蛋白域。进一步细节可来自于例如Binz 等人, 2003, J. Mol.Biol.; 332(2):489-503。
高亲和力非免疫球蛋白的进一步优选示例为affibody分子，即基于蛋白A的Z域（免疫球蛋白G结合域）的蛋白。与抗体相反，affibody分子通常由α螺旋构成并且缺乏二硫桥接。它们可以在各种宿主细胞中以可溶且蛋白水解稳定的形式表达。affibody分子可以进一步与其他蛋白融合。进一步细节可来自于例如Nord 等人, 1997, Nat. Biotechnol.;15(8):772-777。
根据本发明的高亲和力非免疫球蛋白的组还包含adnectins。adnectins基于人纤连蛋白的结构，尤其是其胞外III型域，其具有与抗体可变域相似的结构，包含形成桶的七个β折叠和对应于三个互补性确定区域的每一个侧面上的三个暴露环。adnectins通常缺少中心二硫键和金属离子的结合位点。它们是IgG型抗体小大的约1/15并且与抗体的单一可变域大小相当。通过修饰第二和第三β折叠之间以及第六和第七折叠之间的环，可以定制adnectins以产生和/或增加对靶分析物的特异性。进一步细节可以来自于例如Koide和Koide, 2007, Methods Mol.Biol.; 352:95-109。
进一步优选的示例是抗体模拟anticalin，其来源于人脂质运载蛋白。anticalin通常具有结合蛋白抗原以及小分子抗原的特性。它们由8个反平行β折叠（由环和附连的α螺旋连接）形成的桶结构构成。结合位点处的氨基酸诱变可以允许改变分子的亲和力和选择性。进一步细节可以来自于例如Skerra, 2008, FEBS J., 275 (11):2677-83。
另一优选的示例是affilin，即具有选择性结合抗原能力的遗传工程化蛋白，其结构上来源于γ-B晶体蛋白或泛素。affilin通常通过修饰γ-B晶体蛋白或泛素的近表面氨基酸来构建并且通过显示技术（诸如噬菌体显示）来隔离。基于晶体蛋白和泛素的affilin的分子量通常分别为IgG抗体的约八分之一或十六分之一。这可以导致高至90°C的热稳定性以及对酸和碱的改善的稳定性。进一步细节可以来自于例如Ebersbach 等人, 2007 JMol Biol.; 372(1):172-185 或来自于Hey 等人, 2005, Trends Biotechnol.; 23(10):514-522。
高亲和力非免疫球蛋白的组还包含avimer，即能够经由多个结合位点特异性结合到某些抗原的人工蛋白。通常，各个avimer序列来源于各种膜受体的A域并且具有刚性结构，通过二硫键和钙来稳定。每一个A域可以结合到靶分子的某一表位。结合到相同靶分子的不同表位的域的组合可以增加对该靶的亲和力。进一步细节可以来自于例如 Silverman 等人, 2005, Nat. Biotechnol.; 23(12):1556-61。
进一步优选的示例包括knottin，即特征在于特殊二硫化物到二硫化物结的富含二硫化物的小蛋白。该结通常在一个二硫桥接与两个其他二硫化物所形成的大环和互连主链交叉（二硫化物III-VI穿过二硫化物I-IV和II-V）时获得。knottin肽可以示出为以高亲和力（约10-30 nmol/L）结合到整联蛋白受体。knottin支架可以因此用于设计能够结合根据本发明的检测部分的高亲和力分子。进一步细节可以来自于例如 Kimura等人, 2009,Cancer Res., 69; 2435。
高亲和力非免疫球蛋白的组另外包含fynomer，即Fyn SH3导出蛋白。Fyn是Src家族酪氨酸激酶的59-kDa成员。Fyn SH3域包含63个残基，并且其氨基酸序列在人、小鼠、大鼠和猴之间完全保守。fynomer通常由两个反平行β折叠构成并且含有两个柔性环（RT和n-Src环）以与其他蛋白和靶相互作用。进一步细节可以来自于例如Grabulovski 等人, 2007,Journal of Biological Chemistry, 282 (5):3196-3204。
高亲和力非免疫球蛋白分子的仍另一个优选的实例是phylomer肽。phylomer肽是在进化上不同微生物的基因组中编码的天然存在蛋白的生物活性片段，其部分来源于极端环境并且已经经过数百万年的进化，从而提供能够结合到生物分子的许多不同且稳定的结构。进一步细节可以来自于例如Watt, 2009, Future Med.Chem., 1(2):257-265。
优选的高亲和力非免疫球蛋白分子的组还包含kunitz域肽。kunitz域是kunitz型蛋白酶抑制剂的活性域。它们通常具有约50-60个氨基酸的长度和6 kDa的分子量。kunitz型蛋白酶抑制剂的示例是抑肽酶、阿尔茨海默病淀粉状前体蛋白（APP）和组织因子途径抑制物（TFPI）。kunitz域作为独立的肽是稳定的并且能够识别特定靶（诸如蛋白结构）并且可以因此用于设计能够结合根据本发明的检测部分的高亲和力分子。进一步细节可以来自于例如Nixon和Wood, 2006, Curr.Opin.Drug Discov.Devel., 9(2), 261-268。
优选的是第一捕获实体为如上所述的经设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）、affibody分子、adnectin、anticalin、affilin、avimer、knottin、fynomer、phylomer或kunitz域肽。
第一捕获实体适合阻断所述多表位靶分析物的至少一个表位。阻断的表位优选为以相似或相同形式以两个或多个拷贝存在于靶分析物上的表位。如本文所用的术语“阻断”意指表位结合到第一捕获实体和/或被其覆盖，使得表位不再能够与另外的捕获实体相互作用。阻断优选避免检测颗粒上所存在的捕获实体与如本文定义的靶分析物的结合。然而，本发明还预期到进一步的情形，其中阻断可以不涉及与检测颗粒的直接相互作用。
阻断可以优选为靶分析物上相似或相同表位的部分阻断。例如，第一捕获实体可以结合到靶分析物上所存在的相似或相同表位的约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或这些值之间的任何值。表位的剩余部分可以在阻断步骤之后可自由接近。还预期到以下阻断，其导致样品中所有靶分析物的子部分的所有表位的完全阻断以及样品中靶分析物的剩余部分的部分阻断。
阻断可以是永久性阻断或可逆阻断。永久性阻断可以例如包括另外的固定步骤，诸如交联或UV处理。可逆阻断可以是可通过改变第一捕获实体的浓度、通过应用影响捕获实体到靶分析物的结合的化学品、或通过施加机械力（例如通过搅动靶分析物）而克服的阻断。
如本文所用的“样品”是指任何样品，其包括如本文定义的靶分析物。此类样品可以例如包括体液样品。例如，体液可以来源于或包含以下各项：粪便、全血、血清、血浆、泪液、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖器液、乳腺液、乳汁、初乳、胎盘液、羊水、汗液、滑液、腹水、脑脊液、胆汁、胃液、房水、玻璃体液、胃肠液、渗出物、漏出液、胸膜液、心包液、精液、上呼吸道液、腹膜液、从免疫应答部位收获的流体、从合并的采集部位收获的流体、支气管灌洗液、尿液、活检材料，例如来自所有合适的器官，如肺、肌肉、脑、肝、皮肤、胰腺、胃等等，有核细胞样品、与粘膜表面相关的流体、毛发或皮肤。此外，可以使用来自环境源的样品，例如水样品、肉或家禽样品、土壤样品、来自潜在污染源等的样品、生物样品、食物样品、农业样品。
靶分子可以直接获自如上文所述的样品。在其他情况下，样品可以经受样品制备技术，例如基于标准方案，包括例如部分纯化，其使得靶分子对结合配偶体更易接近。例如，血液样品可以被离心以从血清分离包括全细胞或膜的级分，粪便样品可以被分段并用生理学上可接受的缓冲液和去污剂均质化，痰样品可以被液化并分级。此外，抗生素或杀细菌剂可以添加至样品以防止任何存在的有机体的进一步生长。还可以去除全细胞或可以将全细胞裂解以释放其内含物。在其他实施方案中，样品可以在合适的缓冲液中均质化和/或重悬。在合适缓冲液中的此类均质化和重悬还可以用于非液体粪便样品（例如固体粪便样品）的情况中。在进一步的实施方案中，如上提及的体液或样品材料可以通过添加化学品或生物反应物来处理。这可以执行成稳定样品材料，以去除样品组分，或以避免样品中的相互作用。例如，可以使用EDTA或肝素来稳定血液样品。优选使用血液，即全血或血浆，或尿液或唾液样品。
其中应当有利地防止聚集的“用于检测多表位靶分析物的测试”可以是技术人员已知的任何合适的分子测定或分子测试。测试可以是例如免疫测定、ELISA测定、包含光学和/或磁性元件的测定、基于DNA或RNA实体的测试等。优选地，测试为基于光磁原理的免疫学测试。测试可以是定性测试，例如产生关于分析物是否存在于样品中的问题的答案，或者它可以是定量测试，例如提供关于有多少分析物存在于样品中的问题的答案。
类似地，其中应当有利地防止聚集的“用于确定多表位靶分析物浓度的测试”可以是技术人员已知的任何合适的浓度测量方法。此类方法可以基于如上所述的测试，例如免疫测定、ELISA测定、包含光学和/或磁性元件的测定、基于DNA或RNA实体的测试等。优选地，浓度测量基于根据光磁原理的免疫学测试。
在典型的实施方案中，包括阻断表位的步骤的方法通过允许如上文定义的所述多表位分析物的检测的进一步步骤来扩展。该另外的步骤包括采用第二捕获实体。该第二捕获实体优选地能够如上文定义的第一捕获实体那样特异性结合到相同或相似表位。如本文所用的术语“第二捕获实体”－如第一捕获实体那样－是指免疫系统的元素，例如抗体，或包含抗体的实体，或包含抗体的相互作用表面或部分的实体，例如确定给定抗体的抗原特异性的高变环或抗体的1、2、3、4、5或6个CDR或其任何子形式或衍生物，或者涉及任何其他分子，其能够特异性结合到分子结构或表位。
在优选的实施方案中，所述第二捕获实体为抗体、抗体片段，例如Fab片段。第二捕获实体可以进一步不涉及免疫球蛋白分子或抗体，但是通过不同的、可选机制提供其特异性结合能力。例如，第二捕获实体可以是核酸或非免疫球蛋白。
优选的是，第二捕获实体为如上文定义的抗体或其片段，或如上文定义的核酸，诸如DNA或RNA等。
进一步优选的是，第二捕获实体为如上所述的非免疫球蛋白，诸如经设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）、affibody分子、adnectin、anticalin、affilin、avimer、knottin、fynomer、phylomer或kunitz域肽。
第二捕获实体在功能上和/或结构上可以与第一捕获实体相同或相似，或者它在功能上和/或结构上可以与第一捕获实体不同，尽管提供对如上所述的靶分析物的多个表位的相同特异性结合特性。
在优选的实施方案中，第二捕获实体在功能上和/或结构上可以与第一捕获实体相同并且另外包含标记。如本文所用的术语“标记”是指可识别的实体，诸如表位或相互作用物域，其允许标记（和包含标记的捕获实体）与其他捕获实体之间的特异性结合。优选地，标记可以被如上定义的检测颗粒所识别。例如，所述检测颗粒上存在的捕获实体可以能够与所述标记特异性相互作用或特异性结合到所述标记。由此，靶分析物与检测颗粒的结合可经由第二捕获实体的相互作用来实现，所述第二捕获实体可以能够结合到靶分析物的多个相似或相同表位之一并且同时提供允许与检测颗粒的相互作用或结合的扇区或部分（标记）。在特定的实施方案中，非标记的捕获实体例如可以是兔抗体或IgG，而标记的捕获实体可以是小鼠IgG。这两种捕获实体可以具有对相同靶分析物（即如上文所述的靶分析物的相同表位）的亲和力。在该情形下，检测颗粒可以包含抗小鼠抗体或IgG，因而能够仅特异性结合到小鼠抗体或IgG。还预期到所述相互作用的变体，诸如来源于其他有机体的抗体或IgG的组合等。
合适标记的预期示例包括抗生物素蛋白、抗生物素蛋白相关的蛋白、抗生物素蛋白状实体，诸如tamavidin 1和2、bradavidin、中性抗生物素蛋白、或链霉抗生物素或其衍生物或同源物。这些蛋白通常以特异性方式结合到生物素，例如包含生物素的结构。在进一步的实施方案中，标记可以是生物素，其可以与抗生物素蛋白、抗生物素蛋白相关的蛋白、抗生物素蛋白状实体，诸如tamavidin 1和2、bradavidin、中性抗生物素蛋白、或链霉抗生物素或其衍生物或同源物相互作用。标记的进一步优选的示例是能够通过抗体或其部分结合或者结合到抗体或其部分的任何抗原或表位。还预期到标记，诸如FITC，其可以由抗FITC捕获分子识别；德克萨斯红，其可以由抗德克萨斯红分子（例如抗体）所识别；或地高辛，其可以由抗地高辛分子（例如抗体）所识别。进一步预期到的是使用核酸分子，优选单链核酸分子，以作为标记。这些分子可以被互补核酸分子识别，或被抗体或能够特异性识别核酸分子的结构或序列的任何其他分子所识别。核酸分子因此可以是DNA或RNA或PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子，如上文所定义，或其任何混合物或组合，或与其他标记或表位的任何混合物或组合。
在该实施方案的特定变体中，如上文所提及的检测颗粒可以不包含能够直接结合到靶分析物的任何捕获实体。检测颗粒可以替代地包含能够特异性结合到如上文定义的标记的捕获实体或由其覆盖或涂敷。由此，通过允许标记和其相关识别配偶体之间的相互作用来防止检测颗粒的群聚而同时稳定测试的灵敏性。说明性示例（其不应理解为限制性的）提供于图6中。
在进一步优选的实施方案中，第二捕获实体在功能上和/或结构上可以与第一捕获实体相同并且存在于如本文定义的检测颗粒上。在该情形（其类似于图5中所示的情况，尽管没有阻断第一捕获实体）中，不需要使用标记，这是由于通过检测颗粒本身提供相互作用配偶体。
根据本发明的“第三捕获实体”涉及如上文所述的捕获实体，例如在第一和第二捕获实体的上下文中。第三捕获实体存在于如上文定义的检测颗粒上并且可以优选地结合包含标记的第二捕获实体。尤其优选的是在检测颗粒上下文中如上文定义的第二和第三捕获实体之间的相互作用对。
第二捕获实体可以与第一捕获实体一同使用，使得靶分析物的合适比例或合适数量的相似或相同的多个表位被第一捕获实体所阻断，同时所述多个表位的合适比例或合适数量未被第一捕获实体所阻断并且因此能够被第二捕获实体所识别和结合。“合适比例”或“合适数量”可以取决于方法要素的若干特征，并且原则上可以由技术人员根据预测试、校准或基于文献知识来确定。例如，此类预测试或校准方法可以改变方法中存在的第一捕获实体的数量并且针对对每一不同数量用期望范围内的已知浓度的靶分析物来执行方法。方法针对其显示出最佳性能（例如最灵敏）的第一捕获实体的数量可以选择。可选地，可以使用具有固定数量的第一捕获实体的相似测试并且第二捕获实体的数量可以改变。在进一步的可选方案中，可以执行类似测试，其中颗粒的数量可以改变。在仍另一可选方案中，可以执行类似测试，其中所有上述参数的组合可以改变并测试。此类测试的进一步细节和详情对于技术人员将是已知的并且可以来自合适的文献源。
通常，根据本发明的测试或其他应用中待使用的第一和/或第二捕获实体的合适比例或数量可以取决于测试中待使用的检测颗粒的数目。如果存在非常少的检测颗粒，则聚集的可能性可能较不显著并且测试可能易于不灵敏，这是由于靶分析物的未结合，例如如果许多结合位点被阻断的话。因此，在该情形下，经由第一捕获实体的多个相似或相同表位的阻断应当导致一个靶分析物上约60-80%的可用多个相似或相同表位的覆盖。这应当与样品中存在比靶分析物多的检测颗粒的情形平衡，使得多个分析物结合到相同颗粒的机率降低。这可以导致靶分析物上相似或相同表位的不同覆盖。合适比例和数量的计算应当考虑两种情况并且可以根据本文描述的其他因素（例如预期的灵敏度等）而改变。
因此，在特定的实施方案中，在本发明上下文中待使用的第一捕获实体的数量和第二捕获实体的数量可以根据待使用的检测颗粒的数目来确定。因此，在某些实施方案中，第一和第二捕获实体可以以基本上所有靶分析物可以通过第二捕获实体结合至少一次的方式而可用。在进一步的实施方案中，可选地可能预期到不结合一定比例的靶分析物，即以使得并非所有靶分析物被结合或覆盖的这样的数量提供第一捕获实体和第二捕获实体。可以使用这一点来改进测试所应必需的再现性，或者其可以用于降低群聚事件。
此外，根据本发明的测试或其他应用中待使用的第一和/或第二捕获实体的合适比例或数量可以取决于靶分析物上相似或相同表位的数目。比例例如可以粗略地以靶分析物上存在的表位的化学计量计算为导向。该信息可以来源于合适的文献源或数据库，或者其可以基于以靶分析物和捕获实体执行的定量预测试来确定，例如在所需的特定测试条件下。在一个示例中，合适的比例可以选择，使得几乎预定数目的表位被阻断。这可以是每靶分析物一个表位、两个表位、3、4、5、6、7、8、9、10个等表位，其未被阻断。在某些实施方案中，以多于靶分子上的表位数目乘以样品中靶分子的假定最大数目或待测量的靶分析物的假定浓度范围的上限来提供第一和第二捕获实体。由此可以实现第一和第二捕获实体之间的化学计量比例。在捕获实体的总体数目小于样品中所有靶分析物上的可用表位数目的情况下，非化学计量结合可能发生，或者测试可能由于无法实质上捕获样品中的所有或几乎所有靶分析物而变得不灵敏。
在特定情形中，可能不必具有过量的捕获实体。在此类情形中，优选提供不超过靶分析物的第一和/或第二捕获实体。例如，在大约接近二级捕获实体数目的非常高分析物浓度的情况下，颗粒上的所有二级捕获实体可以粗略地捕获仅一个靶分析物。在该情况下，检测颗粒之间的群聚将不再成问题或者较小明显。在进一步特定的实施方案中，这可以例如通过预分析样品中靶分析物的浓度范围来确定。
在本发明进一步的特定实施方案中，如上文定义的第二捕获实体可以包含如上文定义的标记。所述标记可以通过如上文定义的检测颗粒上的第三捕获实体而结合。在该特定实施方案中，合适比例或数量的第一和/或第二捕获实体还可以取决于第三捕获实体的数量和/或所述第三捕获实体的亲和力。尤其优选的是应该避免其中（具有标记的）第二实体的数量大于（颗粒上的）第三实体的数量的情况，这是因为随后仅一部分靶分析物可被检测到。因此优选的是，第三捕获实体的数量超出第二捕获实体的数量，例如超出10%、15%、20%、25%、50%、75%、100%、200%、500%、1000%或更多。
在另一实例中，根据本发明的测试或其他应用中待使用的第一和/或第二捕获实体的合适比例或数量可以取决于待测量的靶分析物的浓度范围。由于靶分子的准确浓度将是未知的，因此在本发明的上下文中对样品中靶分析物的浓度范围进行一些假定是有帮助的。此类浓度范围可以从历史值或用相似样品或样品类型的之前测量来推断。可选地，浓度范围可以基于预测试或校准测试（例如用样品的子部分）来确定。所假定的浓度范围可以是在没有控制或精细调整的情况下对靶分析物的浓度的粗略估计。可以使用浓度范围以便定义捕获实体的总体数目来覆盖样品中存在的所有可能存在的相同或相似表位，例如通过将假定浓度的上限乘以靶分析物上的相似或相同表位的数目。由此可以确定捕获实体的最大数目或过量数目。随后，第一与第二捕获实体的比例可以基于该数目并且基于每靶分析物的相同或相似表位数目来计算。
在进一步可选的实施方案中，测试可以用不同浓度同时进行，例如在不同腔室或设备中，并且随后可以选择最合适的浓度或者靶分析物浓度可以基于组合结果来确定。例如，可以用不同浓度或数量的第一捕获实体、第二捕获实体和/或第三捕获实体或检测颗粒上的结合位点，和/或用不同浓度或数量的检测颗粒，和/或用具有对多表位靶分析物的不同亲和力的第一、第二和/或第三捕获实体，例如在不同腔室或设备中进行测试，并且随后可以选择最合适的浓度或数量的上述要素以及最合适的实体组合或比例。该信息可以随后用于确定靶分析物浓度。
在进一步特定的实施方案中，在本发明上下文中待使用的第一捕获实体的数量和第二捕获实体的数量可以根据待测量的多表位靶分析物的浓度范围来确定。可以如上所述那样计算或推定的浓度范围可以给出关于待使用的捕获实体的总量的指示。该实施方案和类似实施方案背后的意图是提供靶分析物上的相似或相同表位的阻断，其使得能够有效降低检测颗粒的聚集。此类阻断可以是靶分析物上的相似或相同表位的显著阻断，同时保持小但恒定数目的相同的相似或相同表位免受阻断捕获实体（第一捕获实体），以便允许第二捕获实体结合到这些表位。然而，还预期到其他可能性和阻断比例。这可以取决于如本文定义的进一步参数或因素，例如靶分析物的浓度范围。
因此，如果存在待测量的靶分析物的浓度范围的至少粗略估计，则可以促进方法，这是由于否则可能使用数目不足的捕获实体。应当进一步防止使用过多的捕获实体，以便节约成本并且避免第一和第二捕获实体之间的共同相互作用，其可能损害潜在测试的准确度和灵敏度。
此外，在根据本发明的测试或其他应用中待使用的第一和/或第二捕获实体的合适比例或数量可以取决于第二和/或第一捕获实体的亲和力。例如，在第一捕获实体（阻断实体）对靶分析物的同样或相同的多个表位的亲和力比第二捕获实体（检测实体）更低时，所述第一与所述第二捕获实体的比例应当比相反情况中更高，在所述相反情况中，第二捕获实体（检测实体）对靶分析物的同样或相同的多个表位的亲和力比第一捕获实体（阻断实体）更低。捕获实体的亲和力可以确定或计算并作为因子进入关于待使用的捕获实体的合适或最佳比例的总体计算。合适的测试已在上文描述。用于确定捕获实体的亲和力的其他合适测试对于技术人员将是已知的，或者可以来源于合适的文献源，诸如The ImmunoassayHandbook, 第4版, Theory and applications of ligand binding, ELISA and relatedtechniques, D. Wild, Elsevier Science, 2013。
在进一步的特定实施方案中，在根据本发明的测试或其他应用中待使用的第一捕获实体的数量可以根据用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目来确定。在该实施方案中，可以选择第一捕获实体的数目使得其以比第二捕获实体更高的数量存在。这可以进一步根据靶分析物上的潜在相同或相似表位或结合位点的数量来确定。第一和第二捕获实体的比例可以遵循相应的化学计量。
在进一步的特定实施方案中，在根据本发明的测试或其他应用中待使用的第二捕获实体的数量可以根据用于多表位靶分析物的第一捕获实体的数目来确定。在该实施方案中，可以选择第二捕获实体的数目使得其以比第一捕获实体更低的数量存在。这可以进一步根据靶分析物上的潜在相同或相似表位或结合位点的数量来确定。第一和第二捕获实体的比例可以遵循相应的化学计量。
在检测颗粒上存在第三捕获实体的情况下，用于标记的第二捕获实体的第三捕获实体的数目和/或第三捕获实体对标记的第二捕获实体的亲和力可以根据第一和/或第二捕获实体的数目来确定，或反之亦然，即第一和/或第二捕获实体的数目可以根据第三捕获实体的数目，尤其是根据检测颗粒上的第三捕获实体的数目来确定。因此，在特定的实施方案中，在根据本发明的测试中待使用的第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据用于标记的检测颗粒上的结合位点的数目来确定。优选的是，结合位点基本上通过如上文定义的第三捕获实体来提供。在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目；和多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目；和待测量的多表位靶分析物的浓度范围。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目；和第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目；和第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；和多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；和待测量的多表位靶分析物的浓度范围。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；和第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；和第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：多表位靶分析物上相似或相同表位的数目；和待测量的多表位靶分析物的浓度范围。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目；和第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目；和第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待测量的多表位靶分析物的浓度范围；和第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待测量的多表位靶分析物的浓度范围；和第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：用于多表位靶分析物的第一捕获实体；和第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及待测量的多表位靶分析物上的浓度范围。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目和待测量的多表位靶分析物的浓度范围。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目和第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目和第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目和待测量的多表位靶分析物的浓度范围和第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目和待测量的多表位靶分析物的浓度范围和第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
在进一步的实施方案中，第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量可以根据以下来确定：待使用的检测颗粒的数目和用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；以及多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目和待测量的多表位靶分析物的浓度范围和第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力和第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力。
还预期到第一捕获实体的数量和/或第二捕获实体的数量取决于以下任一特征的进一步组合：
(i) 待使用的检测颗粒的数目；
(ii) 用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；
(iii) 多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目；
(iv) 待测量的多表位靶分析物的浓度范围；
(v) 第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力；
(vi) 第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力；
(vii) 用于标记的第二捕获实体的第三捕获实体的数目，以及
(viii) 针对标记的第二捕获实体的第三捕获实体的亲和力；或者
(ix) 用于标记的检测颗粒上的结合位点的数目，例如第二捕获实体上存在的标记。
在特别优选的实施方案中，在根据本发明的测试或其他应用中待使用的第一与第二捕获实体的比例可以为n-1至1，其中n为所述多表位靶分析物上的相同表位的数目。在进一步的实施方案中，还预期到不同比例，例如n-2至1、n-3至1、n-4至1、n-5至1、n-6至1等，其中n为所述多表位靶分析物上的相同表位的数目。可以根据靶分析物上的相同或相似表位的总数目以及靶分析物的性质或结构（例如在第一和第二捕获实体对靶分析物的亲和力相似的情况下）来选择比例。
在本发明的特定实施方案中，测试期间的事件的时间顺序，即第一和/或第二捕获实体和/或检测颗粒的提供顺序，可以指定。例如，在一个实施方案中，第一和第二捕获实体和检测颗粒可以同时提供。
在进一步的实施方案中，第一和第二捕获实体可以首先提供，即它们可以与靶分析物接触。检测颗粒可以在该步骤期间不存在并且在更靠后的阶段，例如在初始接触之后的若干秒或分钟，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30 min或更长之后，添加至第一和第二捕获实体和靶分析物的混合物。在该实施方案中，第二捕获实体优选地提供有如上所述的标记。第一接触步骤中不存在检测颗粒可以避免所标记的第二捕获实体与检测颗粒之间的直接相互作用，因为两者（即具有标记的第二捕获实体和检测颗粒）可以相互作用。通过暂时分离两者，可能实现第一和第二捕获实体与靶分析物的成比例结合，而没有来自检测颗粒的干扰。在进一步的实施方案中，可以首先提供第一捕获实体，而第二捕获实体和检测颗粒可以在例如初始接触之后的若干秒或分钟，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30min或更长之后晚点提供。
在仍进一步的实施方案中，可以首先提供第一捕获实体和检测颗粒，而第二捕获实体可以在例如初始接触之后的若干秒或分钟，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30min或更长之后晚点提供。
在进一步的方面中，本发明涉及用于检测样品中如上文定义的多表位靶分析物和/或用于确定样品中所述多表位靶分析物的浓度的方法，包括步骤：
- 应用可以特异性结合到所述多表位分析物上的至少一个表位的如上文定义的第一捕获实体，其特征在于所述第一捕获实体阻断至少一个表位结合到检测颗粒；
- 应用如上文定义的第二捕获实体，其可以如第一捕获实体那样特异性结合到所述多表位靶分析物的相同表位，其中第二捕获实体包含准许第二捕获实体结合到如上文定义的所述检测颗粒的标记，或其中第二捕获实体存在于如上文描述的所述检测颗粒上；以及
- 利用能够结合到所述第二捕获实体上所存在的所述标记的如上文定义的检测颗粒或者利用包含能够特异性结合到所述多表位靶分析物的所述表位的第二捕获实体的检测颗粒来检测所述多表位靶分析物，
其中防止所述检测颗粒聚集。
该方法可以在针对如上文提供的第一和第二捕获实体的数量和/或比例的限定的结果下执行。
此外，方法可以基于如上概述的不同时间顺序来执行。例如，在一个实施方案中，在方法期间，第一和第二捕获实体和检测颗粒可以同时提供。
在进一步的实施方案中，在方法期间，第一和第二捕获实体可以首先提供，即它们可以与靶分析物接触。检测可以在该步骤期间不存在并且在更靠后的阶段，例如在方法的初始接触步骤之后的若干秒或分钟，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30 min或更长之后，添加至第一和第二捕获实体和靶分析物的混合物。在该实施方案中，第二捕获实体优选地提供有如上所述的标记。在方法期间的第一接触步骤中不存在检测颗粒可以避免所标记的第二捕获实体与检测颗粒的直接相互作用，因为两者（即具有标记的第二捕获实体和检测颗粒）可以相互作用。通过在方法期间暂时分离两者，可能实现第一和第二捕获实体与靶分析物的成比例结合，而没有来自检测颗粒的干扰。
在进一步的实施方案中，在方法期间可以首先提供第一捕获实体，而第二捕获实体和检测颗粒可以例如在初始接触之后的若干秒或分钟，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30 min或更长之后晚点提供。
在仍进一步的实施方案中，在方法期间可以首先提供第一捕获实体和检测颗粒，而第二捕获实体可以例如在初始接触之后的若干秒或分钟，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30 min或更长之后晚点提供。
检测步骤可以进一步与任何类型的合适读出方法组合，例如检测颗粒的数量可以用任何合适的光学或磁性方法来确定。
如上概述，对于上述方法必需的是在多表位靶的检测期间防止检测颗粒的聚集。这是由于所涉及的颗粒的分子结构和形式（例如参见图6的说明）。
还预期到基于竞争方法的测定或方法格式，其通常需要存在竞争物或靶类似物。如本文所用的术语“靶类似物分子”是指任何分子，其与靶分析物竞争以结合到如本文定义的第一或第二捕获实体。在此类情况下，靶分析物可以干扰第一或第二捕获实体与靶类似物分子的结合。
本发明还预期到竞争或抑制测定或方法格式，其中第一或第二捕获实体可以结合传感器表面上所附连的靶类似物分子。如果如本文所述的靶分析物存在于样品中并且如果该靶分析物首先结合到第一或第二捕获实体，则可以防止该结合。例如，如果药物分子的类似物例如固定至平坦传感器表面，则可以使用所预期的方法检测小药物分子。如果药物分子不存在于样品中，则具有识别靶分析物的捕获实体的所有颗粒均可以结合到传感器表面上的靶类似物分子。然而，在存在药物（靶）分析物（其干扰该结合）的情况下，抗药物捕获实体无法结合或较少结合到传感器表面上的靶类似物。在这种情况下，传感器表面上的颗粒的数量与靶分析物的数量负相关。
在特别优选的实施方案中，如上文定义的方法的检测步骤，即样品中所述多表位靶分析物的检测和/或如上文定义的样品中所述多表位靶分析物的浓度的确定，可以在合适的系统中执行。系统例如可以适合检测如本文所述的检测颗粒。例如，系统可以适合允许或执行以下步骤：
- 结合多表位靶分析物至如上文所述的检测颗粒，即经由如本文定义的第二捕获实体，
- 使结合到多表位靶分析物的检测颗粒与系统的传感器表面接触；
- 允许多表位靶分析物的不同（非相同或不相似的）表位通过系统的所述传感器表面上所存在的第三捕获实体而结合；以及
- 检测所述传感器表面处剩余的颗粒。
在一个实施方案中，本发明还预期提供如本文定义的系统，例如生物传感器系统。此类生物传感器系统可以包括例如含有样品容器的生物传感器筒、用于感测颗粒的传感器设备、检测系统、以及任选地磁场发生器。在进一步的实施方案中，该系统可以包括一个或多个另外的功能单元，诸如读出系统，例如屏幕或打印机，用于数据库或计算机系统的界面，校准单元，与高吞吐量设备的直接或间接连接等。本发明特别预期到用于快速和立即分析的手持式设备，其中可以插入包括用于执行根据本发明的方法所需的测定格式或成分的筒。通常，此类设备包括电源（优选为可再充电电池的形式），显示器，用于快速数据库访问或接入到实验室信息系统的无线连接，诸如WLAN。
“传感器表面”可以是平坦表面，其能够与检测颗粒相互作用。传感器表面通常可以用捕获实体或其他官能化元素（诸如靶类似物）进行官能化，例如在抑制测定或相应方法的情况下。如本文所用的术语“相互作用”意指检测颗粒可以结合（优选地可逆结合）至表面。传感器表面可以进一步与下游电子或光学或磁学等设备连接，从而允许执行检测颗粒上的另外活动。
如本文所用的术语“不同表位”是指与如上所述的靶分析物上的多个表位不相同且不相似的表位。表位可以基本上无法通过如上所述的第一或第二捕获实体识别或基本上无法通过其结合。可以进一步在所述第一或第二捕获实体与如上所述的不同（非相同或非相似）表位之间基本上不存在交叉反应性。该额外表位或结合位点可以另外存在于多表位靶分析物上。然而，该表位可以存在仅一次或两次，即其可能不具备作为根据上文提供的定义的多个表位的资格。在特定的实施方案中，表位还可以以更高数目存在，即其还可以作为多表位提供，具有靶分析物上的三个或更多相同或相似的拷贝，然而其中这些拷贝与第一和第二捕获分析物可以结合到的表位不相同或相似。
优选的是，如上文定义的不同表位可以通过第三捕获实体所识别和结合。第三捕获实体可以优选存在于传感器表面上或检测表面上等。第三捕获实体可以由与第一和第二捕获实体相同的材料构成或包含它，例如抗体、其片段、DNA、RNA、非免疫球蛋白等，如本文上述定义。优选的是，第三捕获实体为固定在传感器表面上的单克隆抗体。在传感器表面处可以如何执行此类相互作用的说明性而非限制性示例提供于图6中。此处，靶分析物经由传感器表面上所存在的第三捕获实体直接结合到传感器表面。
在进一步特定的实施方案中，向传感器表面的结合还可以经由传感器表面上的第三捕获实体与检测颗粒上的同族表位或标记之间的相互作用来执行，其仅在靶分析物已结合到检测颗粒的情况下变得可接近。例如，传感器表面上的捕获实体，例如抗体，可以识别颗粒上的捕获实体（诸如抗体）与靶分析物之间的界面。该界面可以对应于仅在靶分析物结合时变得可接近的新表位。
靶分析物的检测（经由检测颗粒）可以最终基于剩余在传感器表面处的复合体的检测。这可以包括“清洁”传感器表面以便去除非特异性结合的检测颗粒的之前活动。此类活动可以包括技术人员可想象的针对检测颗粒的任何去除活动。优选的是，所述去除活动为检测颗粒（其为如本文上述定义的磁颗粒）的磁致动。
本发明特别预期到如上文定义的磁颗粒的特别使用，其可以通过施加磁场来致动，使得分析程序可以加速。本发明还预期到使用磁场可以降低背景信号，这是由于去除了非特异性结合的颗粒。适合于根据本发明的检测方法的示例性光磁系统图示于图1中。因此，根据本发明的方法还包括在检测之前磁致动如上文定义的磁检测颗粒的额外步骤。
在本发明的一个实施方案中，施加磁力以使颗粒紧密接近传感器表面。
在本发明另一优选的实施方案中，所结合的颗粒（例如磁颗粒）的检测经由受抑全内反射（FTIR）或经由来自靠近表面的所述结合颗粒的散射光的测量或经由群簇形成的光学检测而发生。特别优选的是基于颗粒（特别是如上文定义的磁颗粒）的光学检测的传感设备。相应的细节可以来源于图1中所示的示例性设备，其包括光源和光检测系统，并且构成根据本发明的特定实施方案。用于检测的光学方法通常测量光信号中的改变，即从磁颗粒反射的光中的差异，并且其可以通过光学手段来检测。
例如，此类方法可以包括诸如散射光的检测或基于全内反射（TIR）或受抑全内反射（FTIR）的检测之类的技术。优选地，光信号中的改变仅指借助于第三捕获实体向传感器表面的结合所结合的那些磁颗粒。细节对于本领域技术人员将是已知的，或者可以来源于合适的参考文献，诸如Bruls 等人, Lab Chip, 2009, 9.2504-3510。
如本文所用的术语“全内反射”描述当光以比特定角度大的入射角从具有较高折射率的一种材料进入另一材料时在某些材料中存在的情形。其发生时所处于的特定角度取决于两种材料的折射率，也称为临界角，并且可以数学计算（斯涅耳定律，折射定律）。在不存在颗粒（例如磁颗粒）的情况下，不发生折射并且来自光源的光束被完全反射。如果颗粒（例如磁颗粒）靠近表面或者与传感器表面接触，则将光线说成被颗粒抑制并且该点的反射不再完全。可以计算信号，其可以定义为全内反射信号的降低。
该信号或多或少线性取决于表面上的颗粒浓度（表面密度ñ）。信号可以表示为：
S = β ñ
其中S为以％计所测量的信号改变并且β为从表面密度至信号改变的转换因子。
在本发明优选的实施方案中，所结合的颗粒（例如磁颗粒）的检测经由受抑全内反射（FTIR）或经由来自靠近表面的所述结合颗粒的散射光的测量而发生。
在特别优选的实施方案中，检测可以在光磁系统中执行，其中所述颗粒为磁颗粒，其在静止样品流体中磁致动并且光学检测。
在进一步的方面中，本发明涉及特异性结合到包含两个或多个相似或相同表位的多表位分析物上的至少一个表位的如上文定义的第一捕获实体用于阻断至少一个表位的用途。阻断可以具体为阻断靶分析物向如本文定义的检测颗粒的结合。颗粒可以优选为如本文定义的磁颗粒。磁颗粒可以进一步优选用于如本文定义的光磁系统中。在可选的实施方案中，阻断还可以是阻断向任何其他颗粒或相互作用实体的结合。
在本发明特别优选的实施方案中，待检测或测量的多表位靶分析物为包含至少3个或更多相似或相同表位的靶。最优选的靶分析物为CRP和D-二聚体。具有两个或更多相似或相同表位的进一步的靶分析物也涵盖在本发明的范围内。
在实施方案的其他组中，本发明涉及包含可以特异性结合到所述多表位分析物（优选如上文定义）上的至少一个表位的至少第一捕获实体的一套部件。在特定的实施方案中，这一套部件包含可以特异性结合到所述多表位分析物（优选如上文定义）上的至少一个表位的一个捕获实体。在进一步特定的实施方案中，这一套部件包含可以特异性结合到所述多表位分析物（优选如上文定义）上的至少一个表位的第一捕获实体；以及可以如第一捕获实体那样特异性结合到所述多表位靶分析物（优选如上文定义）的相同表位的第二捕获实体。
在某些实施方案中，可以特异性结合到所述多表位分析物上的至少一个表位的所述第一捕获实体可以能够阻断至少一个表位结合到检测颗粒。在某些实施方案中，所述第二捕获实体可以包含准许第二捕获实体结合到检测颗粒的标记。在进一步特定的实施方案中，这一套部件可以进一步包含第三捕获实体，其优选为固定在表面（例如传感器表面）上的单克隆抗体。因此，可以以表面（例如传感器表面）的形式提供这一套部件，或者这一套部件可以基于表面（例如传感器表面）。在某些实施方案中，传感器可以认为是套件的部分，或者作为可以与套件一同使用的外部元件。
在进一步的实施方案中，这一套部件可以任选或另外包含检测颗粒，即包含本领域技术人员已知的任何合适材料或由其组成的颗粒，例如检测颗粒可以包含无机或有机材料，或由其组成，或基本上由其组成，更优选为如上文定义的磁颗粒。
在特定的实施方案中，根据本发明的这一套部件可以包含作为捕获实体的抗体、其片段、DNA、RNA、非免疫球蛋白等，如上文定义。
通常，根据本发明的套件可以包含助剂，诸如缓冲液，阻断剂，离子，例如二价阳离子或一价阳离子，校准蛋白，二级抗体，检测试剂，诸如检测染料，以及本领域技术人员已知的对于基于蛋白的检测的执行所必需的任何其他合适的化合物或液体。此类成分对于本领域技术人员是已知的并且可以根据所执行的检测方法而变化。另外，套件可以包含说明书小册和/或可以提供与所获结果相关的信息。
在实施方案的其他组中，本发明涉及包含可以特异性结合到所述多表位分析物（优选如上文定义）上的至少一个表位的至少第一捕获实体的筒。在特定的实施方案中，所述筒包含可以特异性结合到所述多表位分析物（优选如上文定义）上的至少一个表位的一个捕获实体。在进一步特定的实施方案中，所述筒包含可以特异性结合到所述多表位分析物（优选如上文定义）上的至少一个表位的第一捕获实体；以及可以如第一捕获实体那样特异性结合到所述多表位靶分析物（优选如上文定义）的相同表位的第二捕获实体。
在进一步优选的实施方案中，筒可以进一步包含第三捕获实体，其优选为单克隆抗体。
在进一步特定的实施方案中，筒可以包含作为捕获实体的抗体、其片段、DNA、RNA、非免疫球蛋白等，如上文定义。
如本文所用的“筒”是指从任何合适的材料（如玻璃、任何透明塑料或半导体）制成的容器状结构，在其中测量样品。在特定实施方案中，筒可以包含单一容器或腔室，其包含如上文定义的捕获实体等。在可选的实施方案中，筒可以包含多于一个容器或腔室，其包含如上文定义的捕获实体等，例如2、3、4、5或更多的不同腔室或容器。这些腔室或容器优选地彼此或与冲洗或射流转运系统流体连通。根据本发明的捕获实体和检测颗粒可以优选地在所有腔室中相似地提供。在任选的实施方案中，某些腔室可以仅包含捕获实体和检测颗粒的子集或者相比于其他腔室而言包含更低或更高的数量。
如本文描述的颗粒（例如磁颗粒）在引入样品时可能已经存在于筒中（例如在一个或多于一个腔室中），与样品一同引入，或者在已将样品注射入样品容器之后引入。筒可以进一步包含传感器表面，例如如本文所定义的。优选地，传感器表面位于筒的底部。在特定的实施方案中，筒可以作为可交换实体提供，例如在与传感器设备分离的单独组件中。由于与样品有关的可能污染，因此优选地筒可以是一次性物品，例如通过注射成型而由塑料制成。还预期到可回收的筒或可回收的筒部件，例如可以清洁或灭菌的筒或筒部件。
提供以下附图用于说明性目的。因而要理解附图不应解释为限制性的。本领域技术人员将清楚地能够预期到本文展示的原理的其他修改。

Claims (15)

1.一种在用于检测样品中包含两个或多个相似或相同表位的多表位靶分析物和/或用于确定样品中所述多表位靶分析物的浓度的测试中防止检测颗粒聚集的方法，所述方法包括以下步骤：
应用能够特异性结合到所述多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体，其特征在于所述第一捕获实体阻断至少一个表位结合到检测颗粒。
2.权利要求1的方法，其中所述多表位靶分析物的所述检测包括使用第二捕获实体，其能够如第一捕获实体那样特异性结合到所述多表位靶分析物的相同或相似表位，其中第二捕获实体包含准许第二捕获实体结合到所述检测颗粒的标记。
3.权利要求1的方法，其中所述多表位靶分析物的所述检测包括使用第二捕获实体，其能够如第一捕获实体那样特异性结合到所述多表位靶分析物的相同或相似表位，并且其中所述第二捕获实体存在于所述检测颗粒上。
4.一种用于检测样品中的多表位靶分析物和/或用于确定样品中所述多表位靶分析物的浓度的方法，包括以下步骤：
- 应用能够特异性结合到所述多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体，其特征在于所述第一捕获实体阻断至少一个表位结合到检测颗粒；
- 应用第二捕获实体，其能够如第一捕获实体那样特异性结合到所述多表位靶分析物的相同表位，其中如权利要求2中所限定的那样，第二捕获实体包含准许第二捕获实体结合到所述检测颗粒的标记，或者其中如权利要求3中所限定的那样，第二捕获实体存在于所述检测颗粒上；以及
- 利用能够结合到所述第二捕获实体上所存在的所述标记的检测颗粒或者利用包含能够特异性结合到所述多表位靶分析物的所述表位的第二捕获实体的检测颗粒，检测所述多表位靶分析物，
其中防止所述检测颗粒聚集。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述测试中待使用的所述第一捕获实体的数量和/或所述第二捕获实体的数量取决于以下来确定
(i) 待使用的检测颗粒的数目；
(ii) 用于多表位靶分析物的第二捕获实体的数目；
(iii) 多表位靶分析物上的相似或相同表位的数目；
(iv) 待测量的多表位靶分析物的浓度范围；
(v) 第一捕获实体对多表位靶分析物的亲和力；
(vi第二捕获实体对多表位靶分析物的亲和力；和/或
(vii) 用于标记的检测颗粒上的结合位点的数目。
6.权利要求2-5中任一项的方法，其中在用于检测样品中的多表位靶分析物和/或用于确定样品中所述多表位靶分析物的浓度的所述测试中待使用的第一与第二捕获实体的比例为n-1至1，其中n为所述多表位靶分析物上的相同表位的数目。
7.权利要求2-6中任一项的方法，其中在添加所述检测颗粒之前，使包含所述多表位靶分析物的所述样品与所述第一和/或所述第二捕获实体接触。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述第一捕获实体和/或所述第二捕获实体为抗体、诸如Fab片段之类的抗体片段、DNA分子、RNA分子或非免疫球蛋白。
9.权利要求8的方法，其中所述非免疫球蛋白为经设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）、affibody分子、adnectin、anticalin、affilin、avimer、knottin、fynomer、phylomer或kunitz域肽。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中样品中的所述多表位靶分析物的所述检测和/或样品中的所述多表位靶分析物的浓度的所述确定在系统中执行，包括以下步骤：
- 结合所述多表位靶分析物至所述检测颗粒，
- 使结合到多表位靶分析物的检测颗粒与系统的传感器表面接触；
- 允许多表位靶分析物的不同（非相同或不相似的）表位通过系统的所述传感器表面上所存在的第三捕获实体而结合；以及
- 检测所述传感器表面处剩余的颗粒。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述检测颗粒为磁颗粒。
12.权利要求10或11的方法，其中样品中的多表位靶分析物的所述检测和/或样品中的所述多表位靶分析物的浓度的所述确定在光磁系统中执行，并且其中光学检测在静止的样品流体中。
13.权利要求12的方法，另外包括在检测之前磁致动磁颗粒的步骤。
14.能够特异性结合到包含两个或多个相似或相同表位的多表位分析物上的至少一个表位的第一捕获实体用于阻断至少一个表位结合到优选为磁检测颗粒的检测颗粒的用途。
15.权利要求1-13中任一项的方法或权利要求14的用途，其中所述多表位分析物为CRP或D-二聚体。
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