CN106662578A - 用于检测食物变态反应的肽、试剂和方法 - Google Patents
用于检测食物变态反应的肽、试剂和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了肽生物标志物,其用于诊断变态反应,在变应性个体中监测临床耐受性的形成,和预测变应性受试者是否可能随时间的推移形成临床或天然耐受性。本发明还涉及采用肽生物标志物的诊断方法和诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及用于诊断变态反应以及用于测定变应性受试者是否可能长出变态反应的肽生物标志物。本发明还涉及采用肽生物标志物的诊断方法和诊断试剂盒。
对序列表的交叉引用
在2015年3月18日创建并且标识为“DSC0056-00WO_ST25.txt”(141.1KB)的序列表特此通过引用方式并入。
背景
食物变态反应是成人和儿童中的一种常见问题,并且症状的范围可以为轻度口腔瘙痒至潜在危及生命的过敏性休克。目前,通过皮刺测试或者口服激发和特异性IgE和在一些情况下,其它血清抗体,如IgG4的血清水平测量诊断食物变态反应。这些测试指示临床反应性的可能性,但是不区分食物变态反应的不同表型或提供预后信息。它们还牵涉对患者的风险的某种水平。目前的IgE测试和患者的实际临床灵敏性之间的关系是一种弱的关系,其通常定义为反应严重性和激发反应的变应原的量的组合。目前的测试的另一种限制是不能测定儿科患者是否会在童年期间长出变态反应。在此情况下,特异性IgE水平和临床变态反应的持续时间之间有阳性,但弱的关联。
新近,已经提出了对食物变应原的临床反应性可以在表位识别水平上与变应原特异性IgE更好关联。已经报告了具有持续性或更严重的变应性反应的患者识别较大数目的IgE表位,提示了表位定位为一种用于变态反应诊断和预测的另外的工具。基于膜的点免疫测定法已经用于表位定位。在此系统中,在膜上合成肽,并且与患者的血清温育。该方法需要大量的肽,并且因此是易错的、费时的、劳动密集的、且昂贵的。此形式的免疫测定法还需要大体积的患者血清。
多重测定技术,如微阵列的形成,和肽合成技术的进展已经改善了食物变应原的表位定位。微阵列形式的免疫测定法可以使用小体积的稀释血清平行测定数千种靶肽,大大降低成本并且允许更好的复制和用于分析的统计学方法。不幸地,基于微阵列的测试不是通量的,并且它经常需要多个重复来克服再现性的限制。
高通量测定形式具有以自动化形式快速处理多个患者样本的优点,并且已经开发用于对多重筛选方法应用。基于珠的多路复用,如LUMINEX/xMAP技术,使用红色和红外荧光团染色的5.6μm聚苯乙烯珠。使用不同量的两种荧光团中的每种,可以产生多达500种不同特异性谱标签,并且理论上,单一反应体积中的多达500个测试是可能的。在典型的蛋白质测定法中,将抗体与珠表面偶联以捕捉感兴趣的分析物。然后,使对感兴趣的分析物特异性的生物素化的检测抗体结合以形成抗体-抗原三明治。使用生物素与偶联有藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白(SA-PE)的相互作用标记复合物。为了检测分析物,在基于双重激光流的检测仪上读取珠。一种激光根据掺入的染料分类珠,并且确定所检测的分析物。第二种激光确定PE衍生的信号的量值,其与结合的分析物的量成正比。与ELISA板测定法相比,此类测定法降低捕捉抗体和需要的样品的量,因此降低成本并且保留罕见的或难以获得的样品材料。一般还改善动态范围和测定法的灵敏性。
牛奶变态反应(CMA)是儿童中的最常见的食物变态反应之一。它通常牵涉对牛奶的几种组分蛋白质的敏感性。这些包括酪蛋白级份中的蛋白质(αs-1-酪蛋白、αs-2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白)、α-乳清蛋白和β-乳清蛋白。构象性和连续表位两者都激发抗体应答。虽然大多数儿童最终长出其CMA(即它们变为临床耐受的),但是一些保留他们的敏感性到晚年。促成临床耐受性的形成的机制没有完全理解,但是假设具有持续性CMA的那些人的IgE抗体可以识别牛奶蛋白质中不被来自患者的IgE抗体识别的某些表位,所述患者可能长出其变态反应。
表位的分析,如连续表位识别可以提供关于CMA的持续性的有用的信息。肽微阵列结果已经显示了与奶变态反应的临床特征的关联,即具有奶变态反应的患者和奶耐受性的患者证明了不同表位识别模式。还证明了IgE和IgG4对奶肽的相对结合的变化与变态反应的存在或与临床改善相关联。
然而,仍然需要鉴定可用于诊断CMA和预测CMA的临床结果的提供信息的表位。还仍然需要新的测定平台,该测定平台克服微阵列免疫测定法的缺陷,并且在相似的工作流下提供高通量、增加的灵活性、降低的样品体积、和较低的成本。本发明解决这些需要。
概述
在第一个实施方案中,本发明涉及含有牛奶蛋白质的变应原性表位的肽,其可用于诊断CMA,用于检测对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成,以及用于监测变应性应答的强度的升高和降低。
在第一个实施方案的一个具体的方面中,含有变应原性表位的肽是选自下组的多种肽:αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白和κ-酪蛋白的变应原性肽表位。在又一个具体的实施方案中,含有变应原性表位的肽是选自SEQ ID NO:1-33的多种肽:
在用于诊断CMA、用于检测对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成以及用于检测变态反应强度的升高和降低的方法中有用的肽还可以包括含有牛奶蛋白质的非反应性表位的肽。这些肽可用作阴性对照。在具体的方面中,含有阴性对照表位的肽是选自下组的一种或多种肽:αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、和β-乳球蛋白的非反应性肽表位。在又一个具体的实施方案中,含有非反应性表位的肽是选自下组的一种或多种肽:
在第二个实施方案中,本发明涉及使用多种(即两种或更多种)前述含有变应原性表位的肽诊断CMA的方法。在具体的方面中,通过方法诊断受试者中的CMA,所述方法包括:
a)提供选自SEQ ID NO:1-33的多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
b)使每个固体支持物与从所述受试者获得的血清在足以允许所述血清中的变态反应相关免疫球蛋白(AAI)结合每个固体支持物上的所述肽的条件下接触以形成肽-AAI复合物;
c)使AAI特异性标记试剂结合所述肽-AAI复合物;并且
d)分析所述标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的所述AAI识别的肽;
其中所述受试者的血清中的AAI对至少一种肽的识别指示所述受试者对于所述食物是变应性的。
在又一个实施方案中,本发明涉及使用多种前述含有变应原性表位的肽在具有CMA的受试者中检测临床耐受性的形成的方法。在具体的方面中,通过方法检测具有CMA的受试者中对牛奶的临床耐受性的形成,所述方法包括:
a)提供所述受试者的血清中对选自SEQ ID NO:1-33的多种肽的变态反应相关免疫球蛋白(AAI)反应性的初始特征,其中所述初始特征限定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的初始数目或所述受试者的血清中识别每种肽的AAI的初始浓度;
b)提供选自SEQ ID NO:1-33的多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
b)在足以允许所述血清中的AAI结合每个固体支持物上的所述肽的条件下使每个固体支持物与在所述初始特征后的时间点时从所述受试者获得的血清接触以形成肽-AAI复合物;
c)使AAI特异性标记试剂结合所述肽-AAI复合物;并且
d)分析所述标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的后续数目或所述受试者的血清中识别每种肽的AAI的后续浓度;
其中当被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的所述后续数目小于被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的所述初始数目时,或者当所述受试者的血清中识别至少一种肽的AAI的所述后续浓度小于所述受试者的血清中识别至少一种肽的AAI的所述初始浓度时指示对所述牛奶的临床耐受性的形成。
在另一个实施方案中,临床耐受性的形成的初始检测用于预测患者是否会形成对变态反应的天然耐受性或者响应疗法。在此实施方案中,在分析初始特征前将变应性受试者暴露于免疫原(免疫疗法)。如果在后续时间点时,与初始特征中的肽有高度反应性的所有AAI的血清浓度有至少2倍的降低,那么可能的是受试者会形成对牛奶的临床或天然耐受性。如果在后续时间点时,与初始特征中的肽有高度反应性的小于所有的AAI的血清浓度有至少2倍的降低,那么受试者可能仅形成对牛奶的部分临床或天然耐受性。
在一个备选的实施方案中,可以使用本发明的方法在一段时间里检测受试者中对牛奶的变异性应答的强度(CMA强度)的升高或降低。在具体的方面中,变异性应答的强度的升高的检测可以对应于先前牛奶耐受性的受试者中的CMA的形成。或者,变异性应答的强度的升高的检测可以对应于先前已知具有CMA的受试者中的变态反应强度的升高。对牛奶的变应性应答的强度的降低的检测是对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成的一个方面,如上文讨论。
在具体的方面中,通过方法检测受试者中对牛奶的变态反应的强度随时间的推移的升高,所述方法
a)提供所述受试者的血清中的变态反应相关免疫球蛋白(AAI)对选自SEQ ID NO:1-33的多种肽的反应性的初始特征,其中所述初始特征限定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的初始数目或所述受试者的血清中识别每种肽的AAI的初始浓度;
b)提供选自SEQ ID NO:1-33的多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
b)在足以允许所述血清中的AAI结合每个固体支持物上的所述肽的条件下使每个固体支持物与在所述初始特征后的时间点时从所述受试者获得的血清接触以形成肽-AAI复合物;
c)使AAI特异性标记试剂结合所述肽-AAI复合物;并且
d)分析所述标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的后续数目或所述受试者的血清中识别每种肽的AAI的后续浓度;
其中与被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的初始数目相比被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的后续数目的增加,或者与所述受试者的血清中识别至少一种肽的AAI的初始浓度相比所述受试者的血清中识别至少一种肽的AAI的后续浓度的增加指示所述受试者中对所述牛奶的变应性应答的升高的强度。
本发明的方法的任何前述实施方案和方面可以为微阵列免疫测定法的形式,其中使多种含有变应原性表位的肽中的每种结合到微量滴定板的不同孔,并且与血清起反应以结合AAI。通过AAI特异性标记试剂,例如与报告部分,如荧光标记物偶联的抗AAI抗体的结合检测结合的AAI。结合的标记试剂的荧光指示针对与孔结合的肽中含有的变应原性表位的抗体在血清中的存在。多种含有变应原性表位的肽也可以在侧向流免疫测定形式中使用,其中在多孔或层析支持物上的离散区中固定每种肽,并且将血清芯吸通过支持物以接触肽,从而使AAI与肽结合。在此测定法中,AAI特异性标记试剂可以包含与抗AAI抗体偶联的生色团或染料。还将标记试剂芯吸通过支持物以接触肽-AAI复合物,从而使标记试剂结合复合物,其指示针对支持物的每个离散区域上固定的肽中含有的变应原性表位的抗体在血清中的存在或缺乏。
在一个备选的方面中,本发明的方法的任何前述实施方案和方面可以为流式细胞术测定法的形式,其中将每种含有变应原性表位的肽与适合于通过流式细胞术分析的可单独鉴定的固体支持物,如珠偶联。通常,通过结合固体支持物上的肽特异性捕捉抗体或者通过与固体支持物的化学连接将肽与固体支持物偶联。在此方面中,使具有偶联的含有变应原性表位的肽的珠与受试者的血清接触以使存在的任何肽特异性AAI结合到珠,在珠上形成肽-AAI复合物。然后,使包含荧光报告部分的AAI特异性标记试剂与肽-AAI复合物结合,并且通过流式细胞术定量或定性分析珠。这检测来自与偶联有含有变应原性表位的肽的每个珠联合的结合的标记试剂的荧光,从而鉴定肽和与其有反应性的AAI在血清中的存在。对选自SEQ ID NO:1-33的多种含有变应原性表位的肽的至少一种有反应性的AAI的存在指示受试者对牛奶有变应性,并且在反应性肽的数目上随时间的推移变化,或者在对一种或多种肽有反应性的AAI的浓度上随时间的推移变化,指示变态反应强度的升高,变态反应强度的降低,或者在该时间段里临床耐受性的形成。
在又一个方面中,流式细胞术测定法可以是多重测定法,如LUMINEX xMAP技术,其使用用于定量和检测肽和蛋白质的微球阵列平台。将多种含有变应原性表位的肽中的每种与一组具有不同光谱特性的珠结合,所述珠可以用于通过流式细胞术鉴定联合的含有变应原性表位的肽。然后,使这组珠与受试者的血清接触以使识别肽的AAI结合到每个珠,从而在珠上形成肽-AAI复合物,并且使包含荧光报告部分的AAI特异性标记试剂结合到复合物的AAI。通过监测每个珠的光谱特性和来自结合的标记试剂的联合荧光的量分析珠。此过程允许鉴定珠上的肽,和与其有反应性的血清AAI的存在或缺乏。如上文讨论,解读测定法的结果。
在又一个实施方案中,本发明涉及用于检测CMA、检测CMA强度的升高或降低或者检测对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成的试剂盒,所述试剂盒包含包装在一起的下列各项并且包含使用说明书:
a)选自SEQ ID NO:1-33的多种含有变应原性表位的肽;
b)标记试剂,所述标记试剂包含与第一报告部分偶联的抗变态反应相关免疫球蛋白(AAI)抗体;和
c)任选地,特异性结合所述标记试剂的第二报告部分。
可以将标记试剂与直接可检测的第一报告部分,如荧光染料、放射性标记物、或有色染料偶联。在具体的实例中,可以将藻红蛋白(PE)分子与抗变态反应相关免疫球蛋白直接偶联,并且用于检测。或者,第一报告部分可以是间接可检测的报告部分(例如生色染料的酶标记物),并且任选地,试剂盒可以包含与直接可检测的标记物偶联的第一报告部分的特异性结合配偶体(第二报告部分)。例如,试剂盒可以包含偶联有生物素的抗AAI抗体和偶联有链霉抗生物素蛋白的荧光染料,用于检测偶联有生物素的抗AAI。
附图说明
图1显示了接受用于CMA的免疫疗法的牛奶耐受性个体对SEQ ID NO:1-33的肽组的随时间的推移的血清反应性。
图2显示了响应用于CMA的免疫疗法被脱敏的具有CMA的个体对SEQ ID NO:1-33的肽组的随时间的推移的血清反应性。
图3显示了部分响应用于CMA的免疫疗法的具有CMA的个体对SEQ ID NO:1-33的肽组的随时间的推移的血清反应性。
在图中,以“a”开始标识的肽代表“α”,以“b”开始标识的肽代表“β”,并且以“k”开始标识的肽代表“κ”。
详述
在描述本发明的几个例示性的实施方案前,应当理解本发明不限于以下描述中列出的构建或过程步骤的详情。本发明能够有其它实施方案,并且能够以各种方式实践或实施。
贯穿本说明书提及“一个实施方案”、“某些实施方案”、“一个或多个实施方案”或者“实施方案”意味着在本发明的至少一个实施方案中包括与实施方案结合描述的具体的特点、结构、材料、或特征。因此,贯穿本说明书的各个位置中的短语,如“在一个或多个实施方案中”、“在某些实施方案中”、“在一个实施方案中”或“在实施方案中”的出现不一定指本发明的相同实施方案。此外,可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合具体的特点、结构、材料或特征。
如本文中使用,术语“变态反应相关免疫球蛋白”和“AAI”指血清中介导对食物变应原的超敏感性的免疫球蛋白。这些包括下列一种或多种:IgE、IgA和IgG(包括IgG4)。
如本文中使用,术语“反应的”、“反应性”、“识别”等指变态反应相关免疫球蛋白结合含有变应原性表位的肽的能力。反应性的水平指示血清中的AAI浓度,高反应性与较高的AAI浓度有关,并且较低的反应性与较低的AAI浓度有关。通过测定法中检测的信号量测定相对AAI浓度(即相对血清反应性)。AAI对含有变应原性表位的肽的反应性的水平也指示变应性应答的强度,即较高的反应性与更强烈的变应性反应有关。
如本文中使用,术语“临床耐受性”指由于暴露于变应原由变应性受试者形成的对食物变应原的免疫学耐受性,即由于免疫疗法形成的耐受性。
如本文中使用,术语“天然耐受性”指由于一生期间对变应原的天然暴露或者在缺乏暴露的情况下由变应性受试者随时间的推移作为生物化学过程形成的对食物变应原的免疫学耐受性。
应当理解,虽然本文中公开的含有变应原性表位的肽描述为具有具体氨基酸序列的具体实施方案,但是本领域技术人员应当认识到每种此类肽可以在其源于的蛋白质的N端或C端方向上移位以获得相关肽序列,所述相关肽序列仍含有相关表位,但是其中的相关表位侧翼有与规定不同的氨基酸。因而,在所有实施方案和方面中,本发明包括含有变应原性表位的肽,其具有与公开的肽序列重叠8个或更多个连续氨基酸的氨基酸序列。
在从αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、和κ-酪蛋白衍生的肽文库中鉴定以SEQ ID NO:1-33所示的含有变应原性表位的肽为具有大于10的在高度变应性个体中的z-得分。在高度变应性受试者中,SEQ ID NO:1-33的所有33种肽与血清有反应性。相反,在非变应性受试者中,SEQ ID NO:1-33的33种肽无一与血清有反应性。SEQ ID NO:1-33的单独的肽还提供反应性的连续区,其可用于测定个体中的CMA的强度,以及用于监测CMA强度随时间的推移的变化。具有落入非反应性和最高反应性之间的对牛奶的变态反应强度的个体具有与SEQ ID NO:1-33中的一些但非全部肽有反应性的血清。一般地,SEQ ID NO:1-33中的与这些个体的血清有反应性的肽的数目与变态反应的强度正相关,即,变态反应越强烈,SEQ ID NO:1-33间与血清有反应性的肽越多。具有轻度变态反应的个体的血清比具有更强烈的变态反应的个体的血清与更少的肽有反应性。因此,本发明不仅提供用于诊断CMA的方法,它提供用于测定变态反应的强度的方法和用于测定变态反应的强度随时间的推移的变化的方法,包括检测对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成。
在本发明的某些方面中,SEQ ID NO:1-33的组内与CMA受试者的血清有反应性的含有变应原性表位的肽的数目与变应性应答的强度具有正相关,即,与较少肽的反应性指示较轻的对牛奶的变应性应答,并且与较多肽的反应性指示受试者对牛奶具有较高的变应性。在本发明的另一个方面中,血清IgE对以SEQ ID NO:1-33所示的肽的结合强度(血清中的IgE浓度的测量)与变应性应答的强度相关联,即与所有33种肽,或者与33种肽的子集的较弱的反应性指示与所有33种肽或者与肽的子集的较强的反应性相比更加中等的变应性应答。如本文中使用,提及与含有变应原性表位的肽的“非反应性”或“阴性”反应性意指小于约2的测定法中的信噪比(S/N)。典型的背景信号(N)是由来自非变应原性个体的血清的合并物产生的信号。或者,本发明涵盖阴性肽作为用于建立背景信号的基础的用途。如本文中使用,提及与含有变应原性表位的肽的“弱”或“中等”,“中等”反应性意指约2-10的S/N,尽管此数值可以随肽和变态反应而变化。如本文中使用,提及与含有变应原性表位的肽的“高”或“强”反应性意指大于约10的S/N。
基于对牛奶蛋白质中的肽表位的分析的用于CMA的先前已知的测定法是竞争免疫测定法,其依赖于IgE和IgG4对表位的结合的相对亲和力的分析。认为抗体结合的亲和力与受试者是否会形成对牛奶的临床耐受性相关。比较而言,在一个方面中,本发明基于AAI与一组关键牛奶蛋白质表位中的每种单独的肽的结合的存在或缺乏的分析,基于被受试者的血清中的IgE结合的表位(即肽)的数目与CMA的诊断,与变应性应答的强度,以及患者形成耐受性或经历升高的变应性应答的潜力相关联。在第二方面中,本发明基于血清中与每种含有变应原性表位的肽有反应性的AAI的浓度的分析,所述浓度也与变应性应答的强度相关联。
本发明的一个实施方案涉及诊断受试者中的CMA的方法,所述方法包括提供选自SEQ ID NO:1-33的多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联,使每个固体支持物与从所述受试者获得的血清在足以允许所述血清中的AAI结合每个固体支持物上的所述肽的条件下接触以形成肽-AAI复合物,使AAI特异性标记试剂结合所述肽-AAI复合物;并且分析所述标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的所述AAI识别的肽。如果在暴露于牛奶变应原后,至少一种肽与血清AAI是中等或高度反应性的(S/N>2),并且一种或多种反应性肽的反应性不在约6个月内降低至少2倍,受试者诊断为具有CMA。
图1中显示了施用CMA免疫疗法后牛奶耐受性个体的血清反应性。在此实验中,用针对CMA的免疫疗法治疗牛奶耐受性个体,并且相隔6-12个月采集血清样品。可以看出对免疫疗法的初始应答导致与约11种肽的中等至高的反应性(蓝色柱形,S/N>2)。在6个月内(橙色柱形),针对所有这些肽的反应性有至少约2倍降低。虽然kcas--04在反应性的略小于2倍降低的范围中,但是最高反应性的肽(例如as1-09,as1-44)展现出在至少5倍的范围中的实质性大于2倍的6个月内的反应性降低。另外,反应性肽无一(S/N>2)不能在6个月时间点时在反应性上降低。
在方法的另一个方面中,标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合的分析可以包括分析结合的程度,其指示血清中的每种肽特异性AAI的浓度。与所有SEQ ID NO:1-33的肽或其子集的低至中等的血清反应性指示血清中的较低浓度的肽特异性AAI和轻度至中等CMA,而与所有肽或其子集的高血清反应性指示血清中的较高浓度的肽特异性AAI和更严重的CMA。用于诊断CMA的结合分析可以采用与血清有反应性的肽的数目,血清AAI对肽的结合程度,或两者。
在某些方面中,本发明进一步涉及牛奶蛋白质的肽,其含有与对牛奶有变应性的受试者的血清非反应性的表位,即使受试者在表型上是高度变应性的。非变应性受试者的血清与这些肽也是非反应性的。这些肽以SEQ ID NO:34、35和36所示,并且在用于诊断CMA的测定法的具体的实施方案中可用作阴性对照。具有可用于此目的的高度可靠的阴性对照降低假阳性诊断的可能性和反应性AAI浓度的高得错误的测定。
在具体的实施方案中,使用选自SEQ ID NO:1-33的多种(两种或更多种)肽诊断受试者中的CMA的方法包括固相测定法。选择用于在固相测定法中使用的多种肽可以代表SEQID NO:1-33的所有33种肽,5-10种肽的子集,10-15种肽的子集,或15-20种肽的子集。方法也可以采用肽的两种或更多种此类子集。提供了与固体支持物偶联的选自SEQ ID NO:1-33的多种肽的每种,所述固体支持物可以是珠、微量滴定板、层析材料(例如滤器)、或任何其它合适的固体支持物。每个珠、微量滴定板孔、或层析材料上的离散位置被选自SEQ ID NO:1-33的单一肽占据。然后,在适合于血清中的抗肽AAIE(若存在的话)与每个固体支持物或固体支持物上的离散位置上的肽的特异性结合的条件下使固体支持物与从受试者获得的血清接触,以在固体支持物上形成肽-AAI复合物。
然后,通过使每个固体支持物或固体支持物上的离散位置上的复合物与特异性结合复合物的标记试剂接触,通常通过对固定的血清AAI抗体的结合检测固体支持物上形成的任何肽-AAI复合物。单一标记试剂一般会用于所有复合物的通用检测。然后,特定的肽-AAI复合物可以通过其在微量滴定板或层析支持物上的位置鉴定。当与每种肽偶联的固体支持物具有不同光谱特性时,一旦经由来自与复合物结合的标记试剂的可检测信号鉴定复合物的存在,也可以通过分析与肽-AAI复合物联合的固体支持物的光谱特性鉴定特定肽-AAI复合物。作为一个实例,可以通过抗人AAI抗体对复合物的结合测定微量滴定板的每个孔中的肽-AAI复合物的存在或缺乏,所述抗人AAI抗体与报告部分,如荧光染料、生色染料、酶标记物或放射性标记物偶联。或者,可以将抗人AAI抗体与不可直接检出的报告部分偶联,从而第二可直接检测的报告部分对标记试剂的特异性结合对于结合的分析是必需的。
在某些方面中,用于诊断CMA的方法是定性方法,即仅基于相对于每种选定的肽的AAI的存在或缺乏。可以认为与任何选定的肽的中等或高度反应的AAI的存在指示某种程度的CMA,只要反应性在短的时间段,如约6个月内基本上不降低。方法也可以是半定量的,即与受试者的血清有反应性的肽的数目越大,变态反应相对越强烈,并且相反,反应性肽的数目越少,变态反应相对越不强烈。与SEQ ID NO:1-33的5-15种肽的血清反应性可以指示轻度至中等CMA,此范围的下端内的反应性一般表征为轻度CMA。与SEQ ID NO:1-33的16-33、16-30、16-25、16-20、16-18或所有33种肽的血清反应性可以指示中等至严重CMA,在此范围的下端内的反应性一般表征为中等CMA。在中间范围中,一般可以认为与SEQ ID NO:1-33的10-20、12-18或14-16种肽的血清反应性指示中等CMA。一般地,不超过约8-10种与非变应性个体的血清有高度反应性(S/N>10),并且因此比常规的测定法在诊断测定法的结果中提供更高的置信水平的正是SEQ ID NO:1-33的肽的特别有用的特征。
在其它方面中,用于诊断CMA的方法是定量方法,即基于AAI对每种选定的肽的反应性的水平的定量。在此实例中,反应性的水平与结合到肽-AAI复合物的标记试剂的量相关联,来自报告部分的信号的较高水平指示血清中的特定肽特异性AAI的较高浓度。为了获得与特定肽-AAI复合物结合的报告部分的量或浓度,来自荧光染料的荧光的数量、来自有色或生色染料或来自酶标记物的颜色的强度、或者来自放射性标记物的放射性的数量与复合物中的结合的AAI的量和因此其浓度正相关。用于测量这些参数的方法是本领域中已知的。可以认为与任何肽有反应性的AAI的相对数量指示CMA的程度或强度。也就是说,多种选定的肽,或选定肽内的一种或多种肽的反应性水平越高,变态反应越强烈。相反,多种选定的肽,或选定肽内的一种或多种肽的反应性水平越低,变态反应越不强烈。
在本发明的任何方法中使用的特别有用的定量测定法是用于流式细胞测定分析的多重肽-珠测定法,如LUMINEX exMAP多重珠测定法,其是ELISA的高通量备选。在此测定法中,用红色和近红外荧光团的独特比例染料的聚丙乙烯珠(微球)用作固体支持物。可以将肽与珠化学连接或者经由珠上包被的肽特异性捕捉抗体与其结合。荧光团的比例限定每个珠群体的“光谱地址”,其可以通过使用数字信号处理的流式细胞仪鉴定。第三种荧光颜色的检测用于测量与珠结合的标记试剂的报告部分的荧光强度。可以通过使选自SEQ IDNO:1-33的每种肽结合到具有特定“光谱地址”的珠同时检测多种分析物。使珠与含有AAI的血清接触继之以添加与报告部分偶联的抗人AAI抗体,所述AAI对与其结合的肽是特异性的。在一个实例中,抗人AAI的报告部分是生物素,并且对偶联有藻红蛋白(PE)的链霉抗生物素蛋白的结合提供用于检测的荧光信号。在标记试剂结合后,在基于双重激光流的检测仪,如LUMINEX 200或Bio-Rad BIO-PLEX分析仪上分析珠。一种激光分类珠并且鉴定与其结合的肽。第二种激光测定报告物衍生的信号的量值,其与结合的血清AAI的量成正比。
由于可以定量每种肽特异性AAI对固体支持物上的肽-AAI复合物的结合程度,选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的多种肽在用于在诊断为CMA的受试者中检测CMA的强度随时间的推移的升高或者在最初诊断为非变应性的受试者中随时间的推移检测CMA的形成的方法中也是有用的。对选自如上文描述的SEQ ID NO:1-33的多种肽实施初步测定法以提供反应性肽的初始数目和每种肽特异性AAI的初始浓度。在初始测定法后的时间点时,用与初始特征相同的选自SEQ ID NO:1-33的多种肽重复分析以获得反应性肽的后续数目或肽特异性AAI的后续浓度。可以如下概述此方法:提供对选自SEQ ID NO:1-33的多种肽的受试者血清AAI反应性的初始特征,其中初始特征指示被受试者的血清中的AAI识别(结合)的肽的初始数目或受试者的血清中识别(结合)每种肽的AAI的初始浓度;在初始特征后的时间点时,在足以允许血清中的AAI与每个固体支持物上的肽结合的条件下使与可单独鉴定的固体支持物偶联的相同的多种肽的每种肽与来自受试者的血清接触,形成肽-AAI复合物;使AAI特异性标记试剂结合复合物,并且分析标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的后续数目或受试者的血清中与每种选定肽起反应的AAI的后续浓度。
可用于本发明的备选测定形式是侧向流或免疫层析测定法。在此类测定法中,在多孔支持物上固定选定的含有变应原性表位的肽,并且将含有AAI的血清芯吸得与肽接触以形成免疫复合物。免疫复合物经多孔支持物的进一步迁移使它与特异性捕捉试剂接触以使用合适的检测试剂检测免疫复合物。
用于检测变态反应强度升高的方法可以利用任何合适的测定形式,包括上文描述的那些测定形式。可用于分析标记试剂的结合的分析类型的实例也如上文描述。与初始特征相比后续时间点时与AAI有反应性的肽的数目的增加(包括与没有与初始特征中的AAI有反应性的肽相比的增加),或者与初始特征相比在后续时间点时AAI对任何肽的结合强度的升高(包括从初始特征中没有对特定肽的结合增加到后续时间点时的可检测结合)指示先前诊断为CMA的受试者中的CMA强度的升高或者先前非变应性受试者中的CMA形成。如上文讨论,比较受试者的初始特征与后续时间点的特征可以用于预测受试者在特定变态反应中的严重性升高或较低的耐受性,或者预测形成对变应原的临床或天然耐受性的可能性。
选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的多种肽在用于在诊断为CMA的受试者中检测对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成的方法中也是有用的。在这些实施方案中,首先在初始时间点时进行如上文一般对检测变态反应强度升高描述的测定法以建立与选自SEQ ID NO:1-33的多种肽的血清AAI反应性的初始特征。初始特征基于与选定的肽的血清反应性的半定量或定量分析,如上文讨论。然后,使与固体支持物偶联的选定的肽与在初始特征后的时间点时获得的来自受试者的血清接触,并且用后续时间点时CMA强度的半定量或定量如上文进行测定法。与初始特征相比在后续时间点时与AAI有反应性的肽的数目的减少,或者与初始特征相比在后续时间点时AAI与任何肽的结合强度的降低,特别地至少2倍降低指示对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成。应当理解,在先前诊断为CMA的受试者中的对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成还指示在初始特征和后续时间点之间的时间段里变态反应强度的降低,并且方法也可以用于检测并预测变态反应强度随时间的推移的此类降低。
作为一个实例,图2中显示了CMA变应性个体的血清反应性。在此实验中,用针对CMA的免疫疗法治疗对牛奶有变应性的个体,并且在6个月和12个月后采集血清样品。可以看出对免疫疗法的初始应答牵涉与约15-17种肽的中等至高反应性(即S/N>2,染色柱形)。在6个月时,对于所有最具反应性的肽,血清反应性已经降低大于2倍(橙色柱形)。对某些肽的反应性的降低在4倍至7倍的范围中(例如as1-03、as1-09、as1-57、as1-44、bcas-01)。在12个月时观察到反应性的少量或无进一步降低(灰色柱形),并且最初最具反应性的肽无一恢复成非反应性水平(S/N<2)。此个体在免疫疗法过程里对牛奶变得脱敏,显示了测定法成功检测诊断为CMA的受试者中对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成。
组中的几种肽与图2中显示的个体的血清有高度反应性(S/N>10)。类似地,图3中测试的个体的血清与至少约15种肽是中等至高度反应性的,指示对牛奶的变态反应。然而,比较而言,在6个月时(橙色柱形),少于全部的最初最具反应性的肽展现出至少2倍的反应性降低。例如,用as1-61、bcas-25、和bcas-53看到反应性最小降低<2倍的实例。图3中显示的个体仅部分响应免疫疗法,并且尽管与一些最高度反应性的肽的反应性有大于2倍降低,但是一些高度反应性的肽没有展现出反应性的类似降低的发现可以是免疫疗法不太可能导致完全脱敏或者完全脱敏可能需要用免疫疗法的更长治疗的指示。
还应当认识到,以SEQ ID NO:1-33所示的所有33种肽的分析对于在本发明的前述方法中获得有用的结果不总是必要的。仅仅有必要采用选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的足够数目的肽以提供统计学可靠的结果。例如,如果受试者的CMA状态是未知的,那么一般期望分析选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的更大数目的含有变应原性表位的肽以确保轻度至中等CMA(其可以牵涉仅与以SEQ ID NO:1-33所示的肽中的几个的反应性)是可检测的。相反,如果已知受试者具有高强度CMA,那么选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的更少的含有变应原性表位的肽可以足以检测变态反应强度的变化或者临床耐受性的形成,因为较大的数目的以SEQ ID NO:1-33所示的肽将是最初有反应性的。然而,由于通过与血清有反应性的肽的数目的变化以及与特定肽有反应性的血清IgE的浓度的变化证明变态反应强度的变化和临床耐受性的形成,特别期望在测定法中包括选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的肽的足够大的集合以确保不错过就对于特定受试者诊断性的肽而言的变化。因而,在任何前述方法中使用的选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的多种含有变应原性表位的肽可以代表SEQ ID NO:1-33的所有33种肽,20-25种肽的子集,15-20种肽的子集,10-15种肽的子集,5-10种肽的子集或2-5种肽的子集。举例而言,已经显示了在许多情况下,βlac肽(SEQ IDNO:24-27)与变应性个体的血清是实质性较小反应性的,或无反应性的。因而,对于某些应用,可以期望单独或与SEQ ID NO:28-33(κcas肽)一起使用SEQ ID NO:1-23(αS1、αS2和betacas肽)。若想要的话,也可以在本发明中单独使用这些亚组中的每种。
为了方便用户,可以将在任何前述方法中使用的试剂以试剂盒的形式包装在一起,所述试剂盒包含选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的多种含有变应原性表位的肽或任何有用的亚组,包含与第一报告部分偶联的抗人IgE抗体的标记试剂和任选地(若间接检测需要的话),特异性结合标记试剂的第二报告部分。试剂盒通常会包含在上文描述的本发明的一种或多种方法中使用这些试剂的用法说明。
在某些试剂盒实施方案中,以及在本发明的方法中,可以提供与报告部分偶联的抗人AAI抗体,所述报告部分可以直接检测。可直接检测的报告部分是可以在不需要结合特异性结合配偶体的情况下鉴定和/或定量的报告部分。可以与抗人AAI抗体偶联的可直接检测的报告部分的实例包括荧光染料、有色染料、可以通过后续化学反应检测的生色染料和酶标记物、和放射性同位素。在其它试剂盒实施方案中,如在本发明的方法中一样,可以提供与可间接检测的报告部分,即自身不能检出,但是经历与第二报告部分的反应或相互作用的报告部分偶联的抗人AAI抗体,所述第二报告部分包含可直接检测的报告部分,如与可直接检测的标记物偶联的报告部分的特异性结合配偶体。可间接检测的报告部分的实例包括生物素、洋地黄毒苷、和其它半抗原,其在为了直接检测而标记的二抗(例如抗洋地黄毒苷)或其它结合配偶体(例如链霉抗生物素蛋白)的后续结合后可检出。应当理解,这些标记试剂和报告部分中的任一种可用于本发明的前述方法中的合适的测定形式和可用作试剂盒的组分。在用于进行上文描述的流式细胞术多重测定法的试剂盒的具体实例中,试剂盒的组分可以包含选自以SEQ ID NO:1-33所示的肽的多种含有变应原性表位的肽,生物素化的抗人AAI抗体(具有第一报告部分的标记试剂)、和与PE(第二报告部分)偶联的链霉抗生物素蛋白。
任何前述试剂盒中包括的选自SEQ ID NO:1-33的多种含有变应原性表位的肽可以代表SEQ ID NO:1-33的所有33种肽,20-25种肽的子集,15-20种肽的子集,10-15种肽的子集,5-10种肽的子集或2-5种肽的子集。任何前述试剂盒中包括的选自SEQ ID NO:1-33的多种含有变应原性表位的肽也可以代表一种或多种相关肽亚组(即αS1、αS2、βcas、βlac和κcas肽)。
在又一个方面中,本发明提供了在前述方法、肽组和试剂盒中使用的从牛奶蛋白质衍生的另外的含有变应原性表位的肽。在上文讨论的任何方面和/或实施方案中,可以用这些肽及其子集替换SEQ ID NO:1-33中的任一种或全部。另外,在上文讨论的任何方面和/或实施方案中,除了SEQ ID NO:1-33外可以使用肽及其子集。从牛奶蛋白质衍生的另外的含有变应原性表位的肽包括:
实施例
从CM耐受性和CMA个体获得血清,并且在LUMINEX测定法中测定以获得图1-3中显示的代表性结果。根据制造商的指导制备清洗缓冲液、血清、珠和抗体稀释液。用缓冲液预湿润过滤板1分钟,并且通过真空除去缓冲液。对每个孔添加100μl珠混合剂,通过真空除去缓冲液,并且用100μl缓冲液将珠清洗两次。对每个孔添加100μl血清稀释液,并且在摇动下温育2小时。应用真空以除去液体。再次用缓冲液清洗珠两次。对每个孔应用50μl抗体稀释液,并且在摇动下温育30分钟。在应用真空后,清洗孔三次。对孔添加100μl缓冲液,并且将样品转移到固定板。在LUMINEX仪上读取孔。结果在图1-3中显示并且在上文讨论。
方法的另外的应用
就源于牛奶的含有变应原性表位的肽及其用于诊断CMA、用于检测对牛奶蛋白质的临床耐受性的形成、和用于检测变态反应的强度的升高和降低的用途而言的本发明的构思也可以适用于开发其它含有变应原性表位的肽组及其在诊断、检测对其它变应原性蛋白质的耐受性,以及检测对其它变应原性蛋白质的耐受性的升高和形成中的用途。
例如,可以在与上文讨论的那些方法类似的方法中利用从变应原性花生蛋白质,特别是Ara h蛋白质家族衍生的含有变应原性表位的肽组。此类组可以包括来自下表的一种或多种肽(SEQ ID NO:69-277):
在又一个实例中,可以在与上文讨论的那些方法类似的方法中利用从变应原性蛋蛋白质,特别是卵清蛋白(ova)和/或卵类粘蛋白(ovm)衍生的含有变应原性表位的肽组。此类组可以包括来自下表的一种或多种肽(SEQ ID NO:278-460):
在又一个实例中,可以在与上文讨论的方法类似的方法中利用从变应原性虾蛋白质,特别是精氨酸激酶(ak)、肌球蛋白轻链(mlc)、肌浆钙结合蛋白(scp)、原肌球蛋白(tm)和肌钙蛋白C(tpc)衍生的含有变应原性表位的肽组。此类组可以包括来自下表的一种或多种肽,SEQ ID NO:461-683):
因而,本发明涵盖用于诊断受试者中的食物变态反应的方法,所述方法包括:
a)提供选自源于在所述食物中找到的一种或多种变应原性蛋白质的多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
b)使每个固体支持物与从所述受试者获得的血清在足以允许所述血清中的IgE结合每个固体支持物上的所述肽的条件下接触以形成肽-IgE复合物;
c)使IgE特异性标记试剂结合所述肽-IgE复合物;并且
d)分析所述标记试剂与每个肽-IgE复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的所述IgE识别的肽;
其中所述受试者的血清中的IgE对至少一种肽的识别指示所述受试者对于所述食物是变应性的。
在另一个方面中,本发明提供了用于在最初对食物有变应性的受试者中检测对食物的临床耐受性的形成的方法,所述方法包括:
a)提供所述受试者的血清的对源于在所述食物中找到的一种或多种变应原性蛋白质的多种肽的IgE反应性的初始特征,其中所述初始特征限定被所述受试者的血清中的IgE识别的肽的初始数目或所述受试者的血清中识别每种肽的IgE的初始浓度;
b)提供所述多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
c)在足以允许所述血清中的IgE结合每个固体支持物上的所述肽的条件下使每个固体支持物与在所述初始特征后的时间点时从所述受试者获得的血清接触以形成肽-IgE复合物;
d)使IgE特异性标记试剂结合所述肽-IgE复合物;并且
e)分析所述标记试剂与每个肽-IgE复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的IgE识别的肽的后续数目或所述受试者的血清中识别每种肽的IgE的后续浓度;
其中当被所述受试者的血清中的IgE识别的肽的所述后续数目小于被所述受试者的血清中的IgE识别的肽的所述初始数目时,或者当所述受试者的血清中识别至少一种肽的IgE的所述后续浓度小于所述受试者的血清中识别至少一种肽的IgE的所述初始浓度时指示对所述食物的临床耐受性的形成。
在又一个方面中,本发明提供了用于在受试者中检测对牛奶的变态反应的强度随时间的推移升高的方法,所述方法包括:
a)提供所述受试者的血清的对源于在所述食物中找到的一种或多种变应原性蛋白质的多种肽的IgE反应性的初始特征,其中所述初始特征限定被所述受试者的血清中的IgE识别的肽的初始数目或所述受试者的血清中识别每种肽的IgE的初始浓度;
b)提供所述多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
c)在足以允许所述血清中的IgE结合每个固体支持物上的所述肽的条件下使每个固体支持物与在所述初始特征后的时间点时从所述受试者获得的血清接触以形成肽-IgE复合物;
d)使IgE特异性标记试剂结合所述肽-IgE复合物;并且
e)分析所述标记试剂与每个肽-IgE复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的IgE识别的肽的后续数目或所述受试者的血清中识别每种肽的IgE的后续浓度;
其中与被所述受试者的血清中的IgE识别的肽的初始数目相比被所述受试者的血清中的IgE识别的肽的后续数目的增加,或者与所述受试者的血清中识别至少一种肽的IgE的初始浓度相比所述受试者的血清中识别至少一种肽的IgE的后续浓度的增加指示所述受试者中对所述食物的变应性应答的升高的强度。
任何前述方法中使用的试剂和材料可以以试剂盒的形式包装,其中将多种含有变应原性表位的肽、包含与第一报告部分偶联的抗IgE抗体的标记试剂和任选地,特异性结合标记试剂的第二报告部分包装在一起。
还应当理解,可用于本发明的方法的本文中公开的任何肽组及其子集也是本发明的一个方面。
虽然已经参考具体的实施方案描述了本文中的发明,但是应当理解这些实施方案仅仅例示本发明的原则和应用。对于本领域技术人员会明显的是,可以在不偏离本发明的精神和范围的前提下对本发明的方法和装置进行各种修改和变型。因此,意图本发明包括在所附权利要求书及其等同物的范围内的修改和变型。
序列表
<110> 詹尼斯费尔公司
西奈山伊坎医学院
R·C·盖茨
J·卡杜山
H·A·桑普森
L·芭蒂娜
G·格瑞斯纳
G·吉梅内斯
J·林
<120> 用于检测食物变态反应的肽、试剂和方法
<130> DSC0056-00WO
<160> 683
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 1
Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg
1 5 10 15
Phe Phe Val Ala
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 2
Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu
1 5 10 15
Ser Lys Asp Ile
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 3
Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys
1 5 10 15
His Ile Gln Lys
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 4
Lys His Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Gln Leu
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 5
Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Lys Val Pro
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 6
Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu
1 5 10 15
Arg Leu His Ser
20
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 7
Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Glu Leu
20
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 8
Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn
1 5 10 15
Pro Ile Gly Ser
20
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 9
Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr
1 5 10 15
Met Pro Leu Trp
20
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 10
Gln Glu Lys Asn Met Ala Ile Asn Pro Ser Lys Glu Asn Leu Cys Ser
1 5 10 15
Thr Phe Cys Lys
20
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 11
Ser Thr Phe Cys Lys Glu Val Val Arg Asn Ala Asn Glu Glu Glu Tyr
1 5 10 15
Ser Ile Gly Ser
20
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 12
Lys His Tyr Gln Lys Ala Leu Asn Glu Ile Asn Gln Phe Tyr Gln Lys
1 5 10 15
Phe Pro Gln Tyr
20
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 13
Gln Tyr Leu Tyr Gln Gly Pro Ile Val Leu Asn Pro Trp Asp Gln Val
1 5 10 15
Lys Arg Asn Ala
20
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 14
Lys Ile Ser Gln Arg Tyr Gln Lys Phe Ala Leu Pro Gln Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Thr Val Tyr Gln
20
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 15
Gln Tyr Leu Lys Thr Val Tyr Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp
1 5 10 15
Ile Gln Pro Lys
20
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 16
Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Glu
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 17
Gln Asp Lys Ile His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro
1 5 10 15
Phe Pro Gly Pro
20
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 18
Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro
1 5 10 15
Asn Ser Leu Pro
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 19
Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu
1 5 10 15
Gln Pro Glu Val
20
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 20
Lys Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro
1 5 10 15
Lys Tyr Pro Val
20
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 21
Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu
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<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 22
Phe Pro Pro Gln Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro
1 5 10 15
Val Pro Gln Lys
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 23
Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile
1 5 10 15
Gln Ala Phe Leu
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 24
Arg Val Tyr Val Glu Glu Leu Lys Pro Thr Pro Glu Gly Asp Leu Glu
1 5 10 15
Ile Leu Leu Gln
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 25
Asp Glu Cys Ala Gln Lys Lys Ile Ile Ala Glu Lys Thr Lys Ile Pro
1 5 10 15
Ala Val Phe Lys
20
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 26
Cys Leu Val Arg Thr Pro Glu Val Asp Asp Glu Ala Leu Glu Lys Phe
1 5 10 15
Asp Lys Ala Leu
20
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 27
Glu Val Asp Asp Glu Ala Leu Glu Lys Phe Asp Lys Ala Leu Lys Ala
1 5 10 15
Leu Pro Met His
20
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 28
Arg Cys Glu Lys Asp Glu Arg Phe Phe Ser Asp Lys Ile Ala Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Pro Ile Gln
20
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 29
Lys Pro Val Ala Leu Ile Asn Asn Gln Phe Leu Pro Tyr Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Ala Lys Pro Ala
20
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 30
Met Ala Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr
1 5 10 15
Ile Asn Thr Ile
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 31
Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu Ala Val Glu Ser Thr Val Ala Thr
1 5 10 15
Leu Glu Asp Ser
20
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 32
Thr Leu Glu Asp Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu Ile Asn
1 5 10 15
Thr Val Gln Val
20
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 33
Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Gln Trp
1 5 10 15
Gln Val Leu Ser
20
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 34
Asn Arg Glu Gln Leu Ser Thr Ser Glu Glu Asn Ser Lys Lys Thr Val
1 5 10 15
Asp Met Glu Ser
20
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 35
Arg Ile Asn Lys Lys Ile Glu Lys Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln
1 5 10 15
Thr Glu Asp Glu
20
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 36
Lys Val Leu Val Leu Asp Thr Asp Tyr Lys Lys Tyr Leu Leu Val Cys
1 5 10 15
Met Glu Asn Ser
20
<210> 37
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 37
Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Asn
20
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 38
Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Leu
20
<210> 39
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 39
Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln
1 5 10 15
Leu Leu Arg Leu
20
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 40
Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys
1 5 10 15
Glu Gly Ile His
20
<210> 41
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 41
Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His Ala Gln Gln Lys Glu
1 5 10 15
Pro Met Ile Gly
20
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 42
Ile His Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu
1 5 10 15
Ala Tyr Phe Tyr
20
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 43
Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg
1 5 10 15
Gln Phe Tyr Gln
20
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 44
Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp
1 5 10 15
Ala Pro Ser Phe
20
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 45
Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala Pro Ser
1 5 10 15
Phe Ser Asp Ile
20
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 46
Ser Ile Ile Ser Gln Glu Thr Tyr Lys Gln Glu Lys Asn Met Ala Ile
1 5 10 15
Asn Pro Ser Lys
20
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 47
Ile Asn Pro Ser Lys Glu Asn Leu Cys Ser Thr Phe Cys Lys Glu Val
1 5 10 15
Val Arg Asn Ala
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 48
Ser Ala Glu Val Ala Thr Glu Glu Val Lys Ile Thr Val Asp Asp Lys
1 5 10 15
His Tyr Gln Lys
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 49
Thr Ser Glu Glu Asn Ser Lys Lys Thr Val Asp Met Glu Ser Thr Glu
1 5 10 15
Val Phe Thr Lys
20
<210> 50
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 50
Thr Lys Leu Thr Glu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Asn Phe Leu Lys Lys
1 5 10 15
Ile Ser Gln Arg
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 51
Tyr Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Ile Gln Pro Lys Thr Lys
1 5 10 15
Val Ile Pro Tyr
20
<210> 52
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 52
Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro
1 5 10 15
Leu Thr Gln Thr
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 53
Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly
1 5 10 15
Val Ser Lys Val
20
<210> 54
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 54
Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met His
1 5 10 15
Gln Pro His Gln
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 55
Ser Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe
1 5 10 15
Pro Pro Gln Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 56
Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro
1 5 10 15
Gln Arg Asp Met
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 57
Gly Asp Leu Glu Ile Leu Leu Gln Lys Trp Glu Asn Asp Glu Cys Ala
1 5 10 15
Gln Lys Lys Ile
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 58
Asp Glu Ala Leu Glu Lys Phe Asp Lys Ala Leu Lys Ala Leu Pro Met
1 5 10 15
His Ile Arg Leu
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 59
Arg Phe Phe Ser Asp Lys Ile Ala Lys Tyr Ile Pro Ile Gln Tyr Val
1 5 10 15
Leu Ser Arg Tyr
20
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 60
Lys Pro Val Ala Leu Ile Asn Asn Gln Phe Leu Pro Tyr Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Ala Lys Pro Ala
20
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 61
Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Gln Trp
1 5 10 15
Gln Val Leu Ser
20
<210> 62
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 62
Pro Ala Gln Ile Leu Gln Trp Gln Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala
1 5 10 15
Lys Ser Cys Gln
20
<210> 63
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 63
Cys Gln Ala Gln Pro Thr Thr Met Ala Arg His Pro His Pro His Leu
1 5 10 15
Ser Phe Met Ala
20
<210> 64
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 64
Arg His Pro His Pro His Leu Ser Phe Met Ala Ile Pro Pro Lys Lys
1 5 10 15
Asn Gln Asp Lys
20
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 65
Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Glu Ala Val Glu
20
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 66
Asp Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln
1 5 10 15
Val Thr Ser Thr
20
<210> 67
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 67
Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ala Val
20
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛奶肽
<400> 68
Gln Ser Leu Val Cys Gln Cys Leu Val Arg Thr Pro Glu Val Asp Asp
1 5 10 15
Glu Ala Leu Glu
20
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 69
Val Leu Ala Ser Val Ser Ala Thr His Ala Lys Ser Ser Pro Tyr
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 70
Ser Val Ser Ala Thr His Ala Lys Ser Ser Pro Tyr Gln Lys Lys
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 71
Ala Thr His Ala Lys Ser Ser Pro Tyr Gln Lys Lys Thr Glu Asn
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 72
Thr Glu Asn Pro Cys Ala Gln Arg Cys Leu Gln Ser Cys Gln Gln
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 73
Pro Cys Ala Gln Arg Cys Leu Gln Ser Cys Gln Gln Glu Pro Asp
1 5 10 15
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<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 74
Leu Gln Ser Cys Gln Gln Glu Pro Asp Asp Leu Lys Gln Lys Ala
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<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 75
Cys Gln Gln Glu Pro Asp Asp Leu Lys Gln Lys Ala Cys Glu Ser
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<213> 花生肽
<400> 76
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<213> 花生肽
<400> 77
Gln Lys Ala Cys Glu Ser Arg Cys Thr Lys Leu Glu Tyr Asp Pro
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<213> 花生肽
<400> 78
Cys Glu Ser Arg Cys Thr Lys Leu Glu Tyr Asp Pro Arg Cys Val
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<213> 花生肽
<400> 79
Arg Cys Thr Lys Leu Glu Tyr Asp Pro Arg Cys Val Tyr Asp Pro
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 80
Lys Leu Glu Tyr Asp Pro Arg Cys Val Tyr Asp Pro Arg Gly His
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 81
Tyr Asp Pro Arg Cys Val Tyr Asp Pro Arg Gly His Thr Gly Thr
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 82
Tyr Asp Pro Arg Gly His Thr Gly Thr Thr Asn Gln Arg Ser Pro
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 83
Arg Gly His Thr Gly Thr Thr Asn Gln Arg Ser Pro Pro Gly Glu
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 84
Thr Asn Gln Arg Ser Pro Pro Gly Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gln
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<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 85
Arg Ser Pro Pro Gly Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gln Pro Gly Asp
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<211> 15
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<400> 86
Pro Gly Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gln Pro Gly Asp Tyr Asp Asp
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<213> 花生肽
<400> 87
Arg Thr Arg Gly Arg Gln Pro Gly Asp Tyr Asp Asp Asp Arg Arg
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<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 88
Gly Arg Gln Pro Gly Asp Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Pro Arg
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<213> 花生肽
<400> 89
Pro Gly Asp Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Pro Arg Arg Glu Glu
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 90
Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Pro Arg Arg Glu Glu Gly Gly Arg
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 91
Asp Arg Arg Gln Pro Arg Arg Glu Glu Gly Gly Arg Trp Gly Pro
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 92
Gln Pro Arg Arg Glu Glu Gly Gly Arg Trp Gly Pro Ala Gly Pro
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<213> 花生肽
<400> 93
Arg Glu Glu Gly Gly Arg Trp Gly Pro Ala Gly Pro Arg Glu Arg
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<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 94
Gly Gly Arg Trp Gly Pro Ala Gly Pro Arg Glu Arg Glu Arg Glu
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<213> 花生肽
<400> 95
Trp Gly Pro Ala Gly Pro Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Asp Trp
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<213> 花生肽
<400> 96
Ala Gly Pro Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Asp Trp Arg Gln Pro
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<213> 花生肽
<400> 97
Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Asp Trp Arg Gln Pro Arg Glu Asp
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<400> 98
Glu Arg Glu Glu Asp Trp Arg Gln Pro Arg Glu Asp Trp Arg Arg
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<400> 99
Glu Asp Trp Arg Gln Pro Arg Glu Asp Trp Arg Arg Pro Ser His
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<213> 花生肽
<400> 100
Arg Gln Pro Arg Glu Asp Trp Arg Arg Pro Ser His Gln Gln Pro
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<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 101
Arg Glu Asp Trp Arg Arg Pro Ser His Gln Gln Pro Arg Lys Ile
1 5 10 15
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<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 102
Trp Arg Arg Pro Ser His Gln Gln Pro Arg Lys Ile Arg Pro Glu
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 103
Pro Ser His Gln Gln Pro Arg Lys Ile Arg Pro Glu Gly Arg Glu
1 5 10 15
<210> 104
<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 104
Gln Gln Pro Arg Lys Ile Arg Pro Glu Gly Arg Glu Gly Glu Gln
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<210> 105
<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 105
Arg Lys Ile Arg Pro Glu Gly Arg Glu Gly Glu Gln Glu Trp Gly
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<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 106
Arg Pro Glu Gly Arg Glu Gly Glu Gln Glu Trp Gly Thr Pro Gly
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<213> 花生肽
<400> 107
Gly Arg Glu Gly Glu Gln Glu Trp Gly Thr Pro Gly Ser His Val
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<213> 花生肽
<400> 108
Gly Glu Gln Glu Trp Gly Thr Pro Gly Ser His Val Arg Glu Glu
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<400> 109
Glu Trp Gly Thr Pro Gly Ser His Val Arg Glu Glu Thr Ser Arg
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<213> 花生肽
<400> 110
Arg Glu Glu Thr Ser Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Ser Arg
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 111
Thr Ser Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Ser Arg Arg Phe Ser
1 5 10 15
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 112
Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Ser Arg Arg Phe Ser Thr Arg Tyr
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 113
Arg Ile Pro Ser Gly Phe Ile Ser Tyr Ile Leu Asn Arg His Asp
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<210> 114
<211> 15
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<213> 花生肽
<400> 114
Ser Gly Phe Ile Ser Tyr Ile Leu Asn Arg His Asp Asn Gln Asn
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 115
Asn Gln Asn Leu Arg Val Ala Lys Ile Ser Met Pro Val Asn Thr
1 5 10 15
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<213> 花生肽
<400> 116
Leu Arg Val Ala Lys Ile Ser Met Pro Val Asn Thr Pro Gly Gln
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<213> 花生肽
<400> 117
Ala Lys Ile Ser Met Pro Val Asn Thr Pro Gly Gln Phe Glu Asp
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<400> 118
Ser Met Pro Val Asn Thr Pro Gly Gln Phe Glu Asp Phe Phe Pro
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<400> 119
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Pro Gly Gln Phe Glu Asp Phe Phe Pro Ala Ser Ser Arg Asp Gln
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Ala Ser Ser Arg Asp Gln Ser Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Arg
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<213> 花生肽
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Arg Asp Gln Ser Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Arg Asn Thr Leu
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 花生肽
<400> 124
Ser Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Ala
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<213> 花生肽
<400> 125
Leu Gln Gly Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Ala Phe Asn Ala
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<400> 126
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<400> 127
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Ser Glu Glu Glu Gly Asp Ile Thr Asn Pro Ile Asn Leu Arg Glu
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Glu Gly Asp Ile Thr Asn Pro Ile Asn Leu Arg Glu Gly Glu Pro
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Ile Thr Asn Pro Ile Asn Leu Arg Glu Gly Glu Pro Asp Leu Ser
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Pro Ile Asn Leu Arg Glu Gly Glu Pro Asp Leu Ser Asn Asn Phe
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Leu Arg Glu Gly Glu Pro Asp Leu Ser Asn Asn Phe Gly Lys Leu
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Gly Glu Pro Asp Leu Ser Asn Asn Phe Gly Lys Leu Phe Glu Val
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Asp Leu Ser Asn Asn Phe Gly Lys Leu Phe Glu Val Lys Pro Asp
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Asn Asn Phe Gly Lys Leu Phe Glu Val Lys Pro Asp Lys Lys Asn
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Gly Lys Leu Phe Glu Val Lys Pro Asp Lys Lys Asn Pro Gln Leu
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Lys Lys Asn Pro Gln Leu Gln Asp Leu Asp Met Met Leu Thr Cys
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Pro Gln Leu Gln Asp Leu Asp Met Met Leu Thr Cys Val Glu Ile
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Ser Asn Arg Glu Val Arg Arg Tyr Thr Ala Arg Leu Lys Glu Gly
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Arg Tyr Thr Ala Arg Leu Lys Glu Gly Asp Val Phe Ile Met Pro
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<400> 153
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<400> 154
Pro Val Ala Ile Asn Ala Ser Ser Glu Leu His Leu Leu Gly Phe
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Leu Gly Phe Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn His Arg Ile Phe Leu
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Asn His Arg Ile Phe Leu Ala Gly Asp Lys Asp Asn Val Ile Asp
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Ile Phe Leu Ala Gly Asp Lys Asp Asn Val Ile Asp Gln Ile Glu
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<400> 163
Ala Gly Asp Lys Asp Asn Val Ile Asp Gln Ile Glu Lys Gln Ala
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<400> 164
Lys Asp Asn Val Ile Asp Gln Ile Glu Lys Gln Ala Lys Asp Leu
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<400> 165
Val Ile Asp Gln Ile Glu Lys Gln Ala Lys Asp Leu Ala Phe Pro
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<400> 166
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<400> 167
Lys Gln Ala Lys Asp Leu Ala Phe Pro Gly Ser Gly Glu Gln Val
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<400> 168
Lys Asp Leu Ala Phe Pro Gly Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Leu
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<400> 169
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Gly Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Leu Ile Lys Asn Gln Lys Glu
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<400> 171
Glu Gln Val Glu Lys Leu Ile Lys Asn Gln Lys Glu Ser His Phe
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<400> 172
Glu Lys Leu Ile Lys Asn Gln Lys Glu Ser His Phe Val Ser Ala
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<400> 173
Ile Lys Asn Gln Lys Glu Ser His Phe Val Ser Ala Arg Pro Gln
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<400> 174
Gln Lys Glu Ser His Phe Val Ser Ala Arg Pro Gln Ser Gln Ser
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<400> 175
Ser His Phe Val Ser Ala Arg Pro Gln Ser Gln Ser Gln Ser Pro
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<400> 176
Val Ser Ala Arg Pro Gln Ser Gln Ser Gln Ser Pro Ser Ser Pro
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<400> 177
Arg Pro Gln Ser Gln Ser Gln Ser Pro Ser Ser Pro Glu Lys Glu
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<400> 178
Ser Gln Ser Gln Ser Pro Ser Ser Pro Glu Lys Glu Ser Pro Glu
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<400> 179
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<400> 181
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<400> 182
Ser Pro Glu Lys Glu Asp Gln Glu Glu Glu Asn Gln Gly Gly Lys
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<213> 花生肽
<400> 183
Lys Glu Asp Gln Glu Glu Glu Asn Gln Gly Gly Lys Gly Pro Leu
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<213> 花生肽
<400> 184
Gln Glu Glu Glu Asn Gln Gly Gly Lys Gly Pro Leu Leu Ser Ile
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<213> 花生肽
<400> 185
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<400> 186
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<400> 187
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<400> 188
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<400> 189
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<400> 191
Gln Ser Gln Leu Glu Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Gln His
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<400> 192
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<400> 193
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<400> 194
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<400> 197
Lys Ile Gln Arg Asp Glu Asp Ser Tyr Glu Arg Asp Pro Tyr Ser
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<400> 203
Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser
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<400> 204
Ser Pro Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser Ser Gln His
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<213> 花生肽
<400> 205
Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser Ser Gln His Gln Glu Arg
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<400> 206
Gln Glu Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Glu Phe Glu Asn Asn Gln
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<400> 208
Glu Leu Asn Glu Phe Glu Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Glu Ala
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Glu Phe Glu Asn Asn Gln Arg Cys Met Cys Glu Ala Leu Gln Gln
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Arg Cys Met Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln Ser
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Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln Ser Asp Arg Leu
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<400> 212
Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln Ser Asp Arg Leu Gln Gly Arg
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Ile Met Glu Asn Gln Ser Asp Arg Leu Gln Gly Arg Gln Gln Glu
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<400> 215
Asp Arg Leu Gln Gly Arg Gln Gln Glu Gln Gln Phe Lys Arg Glu
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Gln Gln Glu Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln
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Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Gln Cys Gly
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Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu Pro Gln Gln Cys Gly Leu Arg Ala
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<400> 220
Leu Pro Gln Gln Cys Gly Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu
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Gln Cys Gly Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Asp Val Glu
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Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Asp Val Glu Ser Gly Gly
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Arg Ile Glu Ser Glu Gly Gly Tyr Ile Glu Thr Trp Asn Pro Asn
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Asn Gln Glu Phe Glu Cys Ala Gly Val Ala Leu Ser Arg Leu Val
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Thr Asp Gly Val Thr Tyr Asp Asn Glu Cys Leu Leu Cys Ala His
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Gly Ser Arg Ser Ser Ser Lys Arg Ser Lys Lys Ser Gly Gly Gly
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<213> 虾肽
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Ser Lys Arg Ser Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Asn Val Phe Asp
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Lys Ser Gly Gly Gly Ser Asn Val Phe Asp Met Phe Thr Gln Arg
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<213> 虾肽
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Ser Asn Val Phe Asp Met Phe Thr Gln Arg Gln Val Ala Glu Phe
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Met Phe Thr Gln Arg Gln Val Ala Glu Phe Lys Glu Gly Phe Gln
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 643
Glu Glu Lys Ala Asn Gln Arg Glu Glu Ala Tyr Lys Glu Gln Ile
1 5 10 15
<210> 644
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 644
Gln Arg Glu Glu Ala Tyr Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Thr Asn
1 5 10 15
<210> 645
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 645
Tyr Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Thr Asn Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
<210> 646
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 646
Lys Thr Leu Thr Asn Lys Leu Lys Ala Ala Glu Ala Arg Ala Glu
1 5 10 15
<210> 647
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 647
Lys Leu Lys Ala Ala Glu Ala Arg Ala Glu Phe Ala Glu Arg Ser
1 5 10 15
<210> 648
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 648
Glu Ala Arg Ala Glu Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
<210> 649
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 649
Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu Val Asp Arg
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 650
Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu Val Asp Arg Leu Glu Asp Glu Leu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 651
Lys Glu Val Asp Arg Leu Glu Asp Glu Leu Val Asn Glu Lys Glu
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 652
Leu Glu Asp Glu Leu Val Asn Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Ser Ile
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 653
Val Asn Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Thr Asp Glu Leu Asp
1 5 10 15
<210> 654
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 654
Lys Tyr Lys Ser Ile Thr Asp Glu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu
1 5 10 15
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<211> 14
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 655
Thr Asp Glu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu Leu Ser Gly Tyr
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 656
Met Asp Ser Leu Asp Glu Glu Gln Ile Glu Thr Leu Arg Lys Ala
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 657
Glu Glu Gln Ile Glu Thr Leu Arg Lys Ala Phe Asp Ser Phe Asp
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 658
Thr Leu Arg Lys Ala Phe Asp Ser Phe Asp Thr Glu Lys Thr Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 659
Phe Asp Ser Phe Asp Thr Glu Lys Thr Gly Ser Ile Thr Ala Glu
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 660
Thr Glu Lys Thr Gly Ser Ile Thr Ala Glu Thr Ile Ala Thr Ile
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 661
Ser Ile Thr Ala Glu Thr Ile Ala Thr Ile Met Arg Met Met Gly
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 662
Thr Ile Ala Thr Ile Met Arg Met Met Gly Val Lys Ile Ser Glu
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 663
Met Arg Met Met Gly Val Lys Ile Ser Glu Lys Asn Leu Gln Glu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 664
Val Lys Ile Ser Glu Lys Asn Leu Gln Glu Ala Ile Ala Glu Thr
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 665
Lys Asn Leu Gln Glu Ala Ile Ala Glu Thr Asp Glu Asp Gly Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 666
Ala Ile Ala Glu Thr Asp Glu Asp Gly Ser Gly Leu Leu Glu Phe
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 667
Asp Glu Asp Gly Ser Gly Leu Leu Glu Phe Glu Glu Phe Val Glu
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 668
Gly Leu Leu Glu Phe Glu Glu Phe Val Glu Leu Ser Ala Lys Phe
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 669
Glu Glu Phe Val Glu Leu Ser Ala Lys Phe Leu Ile Glu Glu Asp
1 5 10 15
<210> 670
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 670
Leu Ser Ala Lys Phe Leu Ile Glu Glu Asp Glu Glu Ala Leu Lys
1 5 10 15
<210> 671
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 671
Leu Ile Glu Glu Asp Glu Glu Ala Leu Lys Ala Glu Leu Arg Glu
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<211> 15
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<213> 虾肽
<400> 672
Glu Glu Ala Leu Lys Ala Glu Leu Arg Glu Ala Phe Arg Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 673
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<213> 虾肽
<400> 673
Ala Glu Leu Arg Glu Ala Phe Arg Ile Tyr Asp Lys Glu Gly Asn
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 674
Ala Phe Arg Ile Tyr Asp Lys Glu Gly Asn Gly Phe Ile Thr Thr
1 5 10 15
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<213> 虾肽
<400> 675
Asp Lys Glu Gly Asn Gly Phe Ile Thr Thr Asp Val Leu Lys Glu
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 676
Gly Phe Ile Thr Thr Asp Val Leu Lys Glu Ile Leu Ala Glu Leu
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 677
Asp Val Leu Lys Glu Ile Leu Ala Glu Leu Asp Pro Arg Leu Thr
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 678
Ile Leu Ala Glu Leu Asp Pro Arg Leu Thr Pro Ala Asp Leu Glu
1 5 10 15
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<213> 虾肽
<400> 679
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 680
Pro Ala Asp Leu Glu Asn Ile Ile Glu Glu Val Asp Glu Asp Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 681
Asn Ile Ile Glu Glu Val Asp Glu Asp Gly Ser Gly Thr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 682
<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 682
Val Asp Glu Asp Gly Ser Gly Thr Leu Asp Phe Asp Glu Phe Met
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 虾肽
<400> 683
Ser Gly Thr Leu Asp Phe Asp Glu Phe Met Glu Met Met Asn Gly
1 5 10 15
Claims (35)
1.一种用于诊断受试者中的食物变态反应的方法,所述方法包括:
a)提供选自源于在所述食物中找到的一种或多种变应原性蛋白质的多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
b)使每个固体支持物与从所述受试者获得的血清在足以允许所述血清中的变态反应相关免疫球蛋白(AAI)结合每个固体支持物上的所述肽的条件下接触以形成肽-IgE复合物;
c)使AAI特异性标记试剂结合所述肽-AAI复合物;并且
d)分析所述标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的所述AAI识别的肽;
其中所述受试者的血清中的AAI对至少一种肽的识别指示所述受试者对于所述食物是变应性的。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述变态反应是对牛奶的变态反应、对花生的变态反应、对蛋的变态反应或对虾的变态反应。
3.根据权利要求2所述的方法,其中检测IgG和/或IgE。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述IgG是IgG4。
5.根据权利要求2所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:1-33和/或SEQ ID NO:37-68。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述多种肽以SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10-15、SEQ ID NO:16-23、SEQ ID NO:24-27、SEQ ID NO:28-33、及其组合所示。
7.根据权利要求2所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:69-277。
8.根据权利要求2所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:278-460。
9.根据权利要求2所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:461-683。
10.一种用于在对食物有变应性的受试者中检测对变应原性食物的临床耐受性的形成的方法,所述方法包括:
a)提供所述受试者的血清的对源于在所述食物中找到的一种或多种变应原性蛋白质的多种肽的变态反应相关免疫球蛋白(AAI)反应性的初始特征,其中所述初始特征限定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的初始数目或所述受试者的血清中识别每种肽的AAI的初始浓度;
b)提供所述多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
b)在足以允许所述血清中的AAI结合每个固体支持物上的所述肽的条件下使每个固体支持物与在所述初始特征后的时间点时从所述受试者获得的血清接触以形成肽-AAI复合物;
c)使AAI特异性标记试剂结合所述肽-AAI复合物;并且
d)分析所述标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的后续数目或所述受试者的血清中识别每种肽的AAI的后续浓度;
其中当被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的所述后续数目小于被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的所述初始数目时,或者当所述受试者的血清中识别至少一种肽的AAI的所述后续浓度小于所述受试者的血清中识别至少一种肽的AAI的所述初始浓度时指示对所述食物的临床耐受性的形成。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述变态反应是对牛奶的变态反应、对花生的变态反应、对蛋的变态反应或对虾的变态反应。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:1-33和/或SEQ IDNO:37-68。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述多种肽以SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10-15、SEQ ID NO:16-23、SEQ ID NO:24-27、SEQ ID NO:28-33、及其组合所示。
14.根据权利要求10所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:69-277。
15.根据权利要求10所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:278-460。
16.根据权利要求7所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:461-683。
17.根据权利要求10所述的方法,其中AAI与选定的肽的反应性的定量降低模式用于预测所述受试者中对所述变应原性食物的临床耐受性的形成。
18.一种用于在对食物有变应性的受试者中检测对所述食物的变态反应的强度随时间的推移升高的方法,所述方法包括:
a)提供所述受试者的血清中的变态反应相关免疫球蛋白(AAI)对源于在所述食物中找到的一种或多种变应原性蛋白质的多种肽的反应性的初始特征,其中所述初始特征限定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的初始数目或所述受试者的血清中识别每种肽的AAI的初始浓度;
b)提供所述多种肽,每种肽与可单独鉴定的固体支持物偶联;
b)在足以允许所述血清中的AAI结合每个固体支持物上的所述肽的条件下使每个固体支持物与在所述初始特征后的时间点时从所述受试者获得的血清接触以形成肽-AAI复合物;
c)使AAI特异性标记试剂结合所述肽-AAI复合物;并且
d)分析所述标记试剂与每种肽-AAI复合物的结合以鉴定被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的后续数目或所述受试者的血清中识别每种肽的AAI的后续浓度;
其中与被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的初始数目相比被所述受试者的血清中的AAI识别的肽的后续数目的增加,或者与所述受试者的血清中识别至少一种肽的AAI的初始浓度相比所述受试者的血清中识别至少一种肽的AAI的后续浓度的增加指示所述受试者中对所述食物的变应性应答的升高的强度。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述变态反应是对牛奶的变态反应、对花生的变态反应、对蛋的变态反应或对虾的变态反应。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:1-33和/或SEQ IDNO:37-68。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述多种肽以SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10-15、SEQ ID NO:16-23、SEQ ID NO:24-27、SEQ ID NO:28-33、及其组合所示。
22.根据权利要求19所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ IDNO:69-277。
23.根据权利要求19所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ IDNO:278-460。
24.根据权利要求19所述的方法,其中所述多种肽选自SEQ ID NO:461-683。
25.根据权利要求18所述的方法,其中定量升高的AAI与选定的肽的反应性的模式用于预测对所述食物的变态反应的强度随时间的推移升高。
26.一组用于检测牛奶变态反应的含有变应原性表位的肽,其包含选自由以SEQ IDNO:1-33所示的肽组成的组的多种肽和/或选自由以SEQ ID NO:1-33的12个或更多个连续氨基酸所示的肽组成的组的多种肽。
27.根据权利要求19所述的一组含有变应原性表位的肽,其选自由SEQ ID NO:1-9、SEQID NO:10-15、SEQ ID NO:16-23、SEQ ID NO:24-27、SEQ ID NO:28-33、及其组合组成的组。
28.一组用于检测花生变态反应的含有变应原性表位的肽,其包含选自由以SEQ IDNO:69-277所示的肽组成的组的多种肽和/或选自由以SEQ ID NO:69-277的12个或更多个连续氨基酸所示的肽组成的组的多种肽。
29.一组用于检测蛋变态反应的含有变应原性表位的肽,其包含选自由以SEQ ID NO:278-460所示的肽组成的组的多种肽和/或选自由以SEQ ID NO:278-460的12个或更多个连续氨基酸所示的肽组成的组的多种肽。
30.一组用于检测虾变态反应的含有变应原性表位的肽,其包含选自由以SEQ ID NO:461-683所示的肽组成的组的多种肽和/或选自由以SEQ ID NO:461-683的12个或更多个连续氨基酸所示的肽组成的组的多种肽。
31.一种用于检测食物变态反应、检测食物变态反应的强度随时间的推移的升高或降低或者检测对变应原性食物蛋白质的临床耐受性的形成的试剂盒,所述试剂盒包含包装在一起的下列各项并且包含使用说明书:
a)源于在所述食物中找到的一种或多种变应原性蛋白质的多种含有变应原性表位的肽;
b)标记试剂,所述标记试剂包含与第一报告部分偶联的抗变态反应相关免疫球蛋白抗体(抗AAI);和
c)任选地,特异性结合所述标记试剂的第二报告部分。
32.根据权利要求31所述的试剂盒,其中所述说明书用于所述试剂盒以预测患者的天然耐受性、对疗法的响应性、或变应性应答的升高。
33.根据权利要求32所述的试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求26-30中任一项所述的一组含有变应原性表位的肽。
34.根据权利要求26-30中任一项所述的一组含有变应原性表位的肽。
35.根据权利要求1-24中任一项的方法,所述方法是用于流式细胞测定分析的多重肽-珠测定法或侧向流测定法。
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