CN115792248A

CN115792248A - 食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN115792248A
Application number: CN202310100961.9A
Authority: CN
Inventors: 熊霞; 徐陈槐; 潘兴鑫; 周延庆; 张雨星; 张现侠
Original assignee: Jiangxi Saiji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangxi Saiji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-02-13
Filing date: 2023-02-13
Publication date: 2023-03-14
Also published as: CN117929752A

Abstract

本发明提供了一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法，所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒包括捕获微球混合液、荧光检测抗体，所述捕获微球混合液包括食物抗原微球复合体和质控微球，所述质控微球为抗人IgG抗体微球复合体，本发明食物特异性IgG抗体检测试剂盒通过荧光抗体的检测信号来计算待测样本的浓度，检测灵敏度高、特异性强，无需逐一检测每种食物特异性IgG抗体，解决了操作繁琐的问题，缩短了检测时间。规避了样本中存在多种食物特异性IgG抗体而无法准确鉴别的情况，节约了成本，具有良好的应用前景。同时在样本检测过程中，质控微球的检测结果可以实时判断试剂盒的有效性以及实验操作的正确性。

Description

食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

人体摄入某类食物和(或)食物添加剂而引起的异常生理表现常被称为食物不良反应(adverse reaction to food)。食物不耐受是由免疫球蛋白G(immuneglobulin G，IgG)介导的一种食物不良反应，其发病机制为当患者食入某类食物后，人体的免疫系统将患者体内因缺少相关消化酶而导致未被完全分解的小分子食物抗原视为有害抗原，从而产生相应的食物特异性IgG抗体，引发机体的过度保护性免疫反应。

如果患者长期食用不耐受食物，则该食物的特异性IgG抗体便会在体内不断积蓄，并与不耐受食物抗原形成免疫复合物后游离或者沉积在相应的器官组织中，引起Ⅲ型超敏反应，全身各系统也会出现异常的慢性病症，临床表现为胃肠道、皮肤、神经系统、呼吸系统、肌肉骨骼系统的异常症状，例如肠易激综合征、皮肤疾病、头痛、焦虑、抑郁、疲劳、湿疹、哮喘、慢性鼻炎、关节痛、过敏性紫癜、自身免疫性疾病等病症。与此同时，人体体内抵御外来病原微生物入侵和保障身体健康的免疫力也会出现异常。

临床中多种常见的疾病类型与食物不耐受息息相关，因此食物不耐受症状缺乏特异性，患者难以自我诊断。近期临床研究进一步证明：如果患者体内的消化酶得不到改善或者患者的饮食结构不发生改变，那么患者体内的与食物不耐受相关的免疫反应会持续进行。当某种食物进入人体消化系统后，通过检测人体血清中是否存在特异性IgG抗体及IgG抗体含量，不仅能判断患者不耐受食物的种类和不耐受程度，而且可为临床诊断提供新的思路，同时为患者的饮食调整提供有价值的临床依据。

目前，市面上食物特异性IgG抗体的检测方法有酶联免疫法、蛋白芯片法、条带酶免分析法、免疫印迹法、免疫荧光芯片法和化学发光免疫分析法。上述检测方法中使用酶联免疫法检测食物特异性IgG抗体的产品最多，其次是条带酶免分析法和蛋白芯片法，免疫印迹法、免疫荧光芯片法和化学发光免疫分析法比较少见。酶联免疫法和条带酶免分析法在检测过程中需要多步手工操作，步骤繁琐且重复性低。蛋白芯片法在检测过程中容易发生非特异性结合，检测灵敏度低。

目前食物特异性IgG抗体的检测技术均存在手工操作步骤繁琐、检测结果重复性较差的问题，这严重影响了检测的灵敏度、准确度和精密度。此外，市面上多数食物特异性IgG抗体的检测技术多数为单一指标的检测，检测成本较高，样本消耗量较大，无法实现高通量检测。因此，需要一种可以同时检测多种食物特异性IgG抗体的高性能检测试剂。

因此，有必要提供一种新型的食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法以解决现有技术中存在的上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒及其使用方法，能够同时检测不同种的食物特异性IgG抗体，且检测灵敏度高、特异性强。

为实现上述目的，本发明食物特异性IgG抗体检测试剂盒，包括捕获微球混合液、荧光检测抗体，所述捕获微球混合液包括质控微球和至少2种食物抗原微球复合体，所述质控微球为抗人IgG抗体微球复合体，用于评估试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，所述食物抗原微球复合体包含食物抗原和可辨识的聚苯乙烯微球，所述抗人IgG抗体微球复合体包含抗人IgG抗体和可辨识的聚苯乙烯微球，每种所述聚苯乙烯微球中包含不同含量的别藻蓝蛋白。

本发明食物特异性IgG抗体检测试剂盒的有益效果在于：本发明通过识别固相载体微球的不同信号，来区分不同的食物抗原，通过荧光抗体的检测信号来计算待测样本的浓度，能够同时检测不同种的食物特异性IgG抗体，检测灵敏度高、特异性强，无需逐一检测每种食物特异性IgG抗体，解决了繁琐操作的问题，缩短了检测时间。并且能够规避样本中存在多种食物特异性IgG抗体而无法准确鉴别的情况，节约了成本，具有良好的应用前景。在样本检测过程中，捕获微球混合液中质控微球的检测结果可以同时实时判断试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，更加方便客户使用。

优选的，所述抗人IgG抗体微球复合体包括抗人IgG1抗体微球复合体、抗人IgG2抗体微球复合体、抗人IgG3抗体微球复合体或抗人IgG4抗体微球复合体。

优选的，所述食物抗原微球复合体包括第一组食物抗原，所述第一组食物抗原包括鸡蛋、牛奶、大豆、小麦、大米、鳕鱼、虾、蟹、西红柿、蘑菇、玉米、鸡肉、猪肉、马铃薯、牛肉抗原中的至少3种抗原。

优选的，所述食物抗原微球复合体还包括第二组食物抗原，所述第二组食物抗原包括芝麻、花生、烟草、咖啡、白软干酪、蔗糖、青豆、菠菜、燕麦、羊肉、腰果、甘薯、巧克力、红茶、蜂蜜抗原中的至少3种抗原。

优选的，所述食物抗原微球复合体还包括第三组食物抗原，所述第三组食物抗原包括扇贝、蛤、牡蛎、龙虾、三文鱼、沙丁鱼、带鱼、草鱼、金枪鱼、鳟鱼、鳎鱼、大马哈鱼抗原中的至少3种食物抗原。

优选的，所述食物抗原微球复合体还包括第四组食物抗原，所述第四组食物抗原包括芒果、橘子、菠萝、西瓜、橄榄、桃、榴莲、香蕉、哈密瓜、葡萄、柚子、草莓、蓝莓、苹果、柠檬抗原中的至少3种食物抗原。

本发明的食物特异性IgG抗体检测试剂盒能够同时检测57种食物特异性IgG抗体，通过识别作为固相载体的微球的不同信号，来区分不同的食物抗原，通过荧光抗体的检测信号来计算待测样本的浓度，检测灵敏度高、特异性强，有效规避了样本中存在多种食物特异性IgG抗体而无法准确鉴别的情况，节约了成本，具有良好的应用前景。同时在样本检测过程中，捕获微球混合液中质控微球的检测结果可以实时判断试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，更加方便客户使用。

优选的，所述质控微球为所述抗人IgG1抗体微球复合体，所述抗人IgG1抗体微球复合体中每10-30μg抗人IgG1抗体包被6×10⁶个微球。

优选的，所述食物抗原微球复合体中，每0.2-200μg食物抗原包被6×10⁶个微球。

优选的，所述荧光检测抗体中，每0.5-1.5mg抗人IgG抗体偶联2-4mg藻红蛋白。其有益效果在于：本发明将抗人IgG抗体与作为荧光物质的藻红蛋白偶联，通过优化抗体与荧光物质之间的质量比来确定抗人IgG抗体检测时的最佳使用量。

优选的，所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒还包括洗涤缓冲液、样品稀释液、校准微球混合液、校准专用荧光检测抗体和校准品，所述洗涤缓冲液包括磷酸盐和表面活性剂，所述样品稀释液包括Tris缓冲液及防腐剂，所述校准微球混合液为食物抗原微球和质控微球的混合液，所述校准专用荧光检测抗体为藻红蛋白和抗人IgG抗体形成的复合物，所述校准品包括不同浓度的食物特异性IgG抗体。

本发明还提供一种所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：向样本管中加入所述捕获微球混合液和待测样本，将所得混合物在室温下避光孵育；

S2：向步骤S1所得的混合物中加入所述荧光检测抗体，将所得混合物在室温下避光孵育，得到待检测混合物；

S3：在流式细胞仪上检测所述待检测混合物的荧光类型和荧光信号强度，得到所述待测样本中食物特异性IgG抗体的含量。

本发明的食物特异性IgG抗体检测试剂盒使用方法的有益效果在于：本发明通过识别作为固相载体的微球的不同信号，来区分不同的食物抗原，采用流式细胞仪对该复合物进行荧光类型和荧光强度的检测，得出该血清样本食物不耐受的情况，能够同时检测不同种的食物特异性IgG抗体，并通过荧光抗体的检测信号来计算待测样本的浓度，检测灵敏度高、特异性强，有效规避了样本中存在多种食物特异性IgG抗体而无法准确鉴别的情况，节约了成本，具有良好的应用前景。同时在样本检测过程中，捕获微球混合液中质控微球的检测结果可以实时判断试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，更加方便客户使用。

优选的，步骤S2中，向步骤S1所得的混合物中加入所述荧光检测抗体的步骤包括，向步骤S1所得的混合物中加入洗涤缓冲液，离心后保留沉淀，在所得沉淀中加入所述荧光检测抗体。

附图说明

图1为本发明实施例试剂盒中食物抗原微球复合体的检测原理示意图；

图2为本发明实施例试剂盒中质控微球的检测原理示意图；

图3为本发明实施例的荧光微球分布情况；

图4为本发明实施例中鸡蛋特异性IgG抗体的校准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒，包括捕获微球混合液、荧光检测抗体，所述捕获微球混合液包括质控微球和至少2种食物抗原微球复合体，所述质控微球为抗人IgG抗体微球复合体，用于评估试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，所述食物抗原微球复合体包含食物抗原和可辨识的聚苯乙烯微球，所述抗人IgG抗体微球复合体包含抗人IgG抗体和可辨识的聚苯乙烯微球，每种所述聚苯乙烯微球中包含不同含量的别藻蓝蛋白。

本发明食物特异性IgG抗体检测试剂盒的有益效果在于：本发明通过识别固相载体微球的不同信号，来区分不同的食物抗原，通过荧光抗体的检测信号来计算待测样本的浓度，能够同时检测不同种的食物特异性IgG抗体，检测灵敏度高、特异性强，无需逐一检测每种食物特异性IgG抗体，解决了操作繁琐的问题，缩短了检测时间。并且能够规避样本中存在多种食物特异性IgG抗体而无法准确鉴别的情况，节约了成本，具有良好的应用前景。在样本检测过程中，捕获微球混合液中质控微球的检测结果可以同时实时判断试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，更加方便客户使用。

一些实施例中，所述抗人IgG抗体微球复合体包括抗人IgG1抗体微球复合体、抗人IgG2抗体微球复合体、抗人IgG3抗体微球复合体或抗人IgG4抗体微球复合体。

一些实施例中，所述食物抗原微球复合体包括第一组食物抗原，所述第一组食物抗原包括鸡蛋、牛奶、大豆、小麦、大米、鳕鱼、虾、蟹、西红柿、蘑菇、玉米、鸡肉、猪肉、马铃薯、牛肉抗原中的至少3种抗原。一些具体的实施例中，所述第一组食物抗原包括鸡蛋、牛奶、大豆抗原。

一些实施例中，所述食物抗原微球复合体还包括第二组食物抗原，所述第二组食物抗原包括芝麻、花生、烟草、咖啡、白软干酪、蔗糖、青豆、菠菜、燕麦、羊肉、腰果、甘薯、巧克力、红茶、蜂蜜抗原中的至少3种抗原。一些具体的实施例中，所述第二组食物抗原包括芝麻、花生、烟草。

一些实施例中，所述食物抗原微球复合体还包括第三组食物抗原，所述第三组食物抗原包括扇贝、蛤、牡蛎、龙虾、三文鱼、沙丁鱼、带鱼、草鱼、金枪鱼、鳟鱼、鳎鱼、大马哈鱼抗原中的至少3种食物抗原。一些具体的实施例中，所述第三组食物抗原包括扇贝、蛤、牡蛎。

一些实施例中，所述食物抗原微球复合体还包括第四组食物抗原，所述第四组食物抗原包括芒果、橘子、菠萝、西瓜、橄榄、桃、榴莲、香蕉、哈密瓜、葡萄、柚子、草莓、蓝莓、苹果、柠檬抗原中的至少3种食物抗原。一些具体的实施例中，所述第四组食物抗原包括芒果、橘子、菠萝。

一些实施例中，所述食物抗原微球复合体包括第一组食物抗原、第二组食物抗原、第三组食物抗原和第四组食物抗原，所述第一组食物抗原包括鸡蛋、牛奶、大豆、小麦、大米、鳕鱼、虾、蟹、西红柿、蘑菇、玉米、鸡肉、猪肉、马铃薯、牛肉抗原，所述第二组食物抗原包括芝麻、花生、烟草、咖啡、白软干酪、蔗糖、青豆、菠菜、燕麦、羊肉、腰果、甘薯、巧克力、红茶、蜂蜜抗原，所述第三组食物抗原包括扇贝、蛤、牡蛎、龙虾、三文鱼、沙丁鱼、带鱼、草鱼、金枪鱼、鳟鱼、鳎鱼、大马哈鱼抗原，所述第四组食物抗原包括芒果、橘子、菠萝、西瓜、橄榄、桃、榴莲、香蕉、哈密瓜、葡萄、柚子、草莓、蓝莓、苹果、柠檬抗原。本发明的食物特异性IgG抗体检测试剂盒能够同时检测57种食物特异性IgG抗体，通过识别作为固相载体的微球的不同信号，来区分不同的食物抗原，通过荧光抗体的检测信号来计算待测样本的浓度，检测灵敏度高、特异性强，有效规避了样本中存在多种食物特异性IgG抗体而无法准确鉴别的情况，节约了成本，具有良好的应用前景。同时在样本检测过程中，捕获微球混合液中质控微球的检测结果可以实时判断试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，更加方便客户使用。

一些实施例中，所述质控微球为所述抗人IgG1抗体微球复合体，所述抗人IgG1抗体微球复合体中每10-30μg抗人IgG1抗体包被6×10⁶个微球。使用抗人IgG1抗体微球复合体作为质控微球可以提高试剂盒的有效性以及实验操作的正确性。

一些实施例中，所述食物抗原微球复合体中，每0.2-200μg食物抗原包被6×10⁶个微球。

一些实施例中，所述荧光检测抗体中，每0.5-1.5mg抗人IgG抗体偶联2-4mg藻红蛋白。其有益效果在于：本发明将抗人IgG抗体与作为荧光物质的藻红蛋白偶联，通过优化抗体与荧光物质之间的质量比来确定抗人IgG抗体检测时的最佳使用量。

所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒还包括洗涤缓冲液、样品稀释液、校准微球混合液、校准专用荧光检测抗体和校准品，所述洗涤缓冲液包括磷酸盐和表面活性剂，所述样品稀释液包括Tris缓冲液及防腐剂，所述校准微球混合液为食物抗原微球和质控微球的混合液，用于绘制校准曲线，所述校准专用荧光检测抗体为藻红蛋白和抗人IgG抗体形成的复合物，与所述校准微球混合液搭配用于绘制校准曲线，所述校准品包括不同浓度的食物特异性IgG抗体，用于绘制校准曲线。

本发明的食物特异性IgG抗体检测试剂盒使用方法将不同食物抗原微球和质控微球按一定稀释比例混合后与血清样本混合，室温避光孵育，分别形成微球、食物抗原和特异性IgG抗体的复合物，以及微球、抗人IgG1抗体和IgG1抗体的复合物，之后加入优化计量的荧光检测抗体，于室温下避光孵育，分别形成微球、食物抗原、特异性IgG抗体、抗人IgG抗体和荧光蛋白的复合物，以及微球、抗人IgG1抗体、IgG1抗体、抗人IgG抗体和荧光蛋白的复合物。最后，采用流式细胞仪对该复合物进行荧光类型和荧光强度的检测，得出该血清样本食物不耐受的情况，以及试剂盒有效性以及实验操作正确性。本发明食物特异性IgG抗体检测试剂盒通过识别作为固相载体的微球的不同信号，来区分不同的食物抗原，通过荧光抗体的检测信号来计算待测样本的浓度，检测灵敏度高、特异性强，有效规避了样本中存在多种食物特异性IgG抗体而无法准确鉴别的情况，节约了成本，具有良好的应用前景。同时在样本检测过程中，捕获微球混合液中质控微球的检测结果可以实时判断试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，更加方便客户使用。

一些实施例中，步骤S2中，向步骤S1所得的混合物中加入所述荧光检测抗体的步骤包括，向步骤S1所得的混合物中加入洗涤缓冲液，离心后保留沉淀，在所得沉淀中加入所述荧光检测抗体。其中向步骤S1所得的混合物中加入洗涤缓冲液，离心后保留沉淀可以除去未反应的物质。

一些实施例中，步骤S2中，将所得混合物在室温下避光孵育的步骤执行完毕后，还包括将避光孵育后的混合物中加入所述洗涤缓冲液，离心后保留沉淀。

一些实施例中，步骤S1中，将所得混合物在室温下避光孵育的步骤包括，控制将所得混合物在室温下避光孵育的时间为0.4-0.6小时。

一些实施例中，步骤S2中，将所得混合物在室温下避光孵育的步骤包括，控制将所得混合物在室温下避光孵育的时间为0.4-0.6小时。

和酶标板微孔相比，本发明的食物特异性IgG抗体检测试剂盒采用的微米级微球具有更大的比表面积，可以更全面地与目标物接触并且发生免疫结合。将微球作为固相载体，相比于普通ELISA的酶标板微孔来说，拥有更大的表面负载量。相比于化学发光法来说，流式平台的操作步骤更为简便。另外，微球通过外加低速离心和洗涤的过程可以对目标物起到浓缩的作用，有效提高食物IgG检测的灵敏度和准确性。

图1为本发明实施例试剂盒中食物抗原微球复合体的检测原理示意图。参照图1，包被有食物抗原2的微球1、样本中的特异性IgG抗体3、偶联藻红蛋白5和抗人IgG抗体4形成免疫复合体，流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由不同抗原偶联的微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定各项检测指标含量。

图2为本发明实施例试剂盒中质控微球的检测原理示意图。参照图2，使用抗人IgG1抗体6固定于所述微球1形成质控微球，所述偶联藻红蛋白5与抗人IgG抗体4形成免疫复合体，反应时，首先固定于所述微球1上的所述抗人IgG1抗体6与待测样本中的IgG1抗体7之间特异性结合，然后与所述偶联藻红蛋白5与抗人IgG抗体4形成的复合体之间特异性结合，形成的复合体在流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射下，由抗体偶联的微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定检测指标含量。

一些实施例中，所述抗人IgG1抗体和食物抗原标记于固相载体上，固相载体包括微球、酶标板微孔、纤维素膜。

另一些实施例中，所述抗原的标记方法采用了直接标记法，直接标记法是将食物抗原直接固定到固相载体上。

又一些实施例中，所述食物抗原的标记方法采用了间接标记法，间接标记法是采用生物素与链霉亲和素之间的特异性结合反应将食物抗原间接固定于固相载体上。

本发明一些实施例中所述抗人IgG抗体为鼠源单克隆抗体。另一些实施例中，所述抗人IgG抗体为大鼠、羊、兔或骆驼的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明一些实施例中所述微球为羧基修饰的聚苯乙烯微球，各聚苯乙烯微球内部的荧光材料以不同浓度别藻蓝蛋白(APC)配制而成、不同粒径的微球以不同合成工艺制备。另一些实施例中，固相载体可以替换为酶标板微孔、纤维素膜，或聚苯乙烯微球内部的别藻蓝蛋白(APC)荧光材料替换为其他种类的荧光素。

另一些实施例中，可将藻红蛋白替换为包括量子点的荧光素或标记物。

反应体系中各组分的加入量都可以等比例调整或单独组分的单独调整。

本发明所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒使用方法中各组分的加样量、孵育条件都可以进行适当的调整。

以下通过第一至第九实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。

第一实施例。

本实施例提供了一种基于流式荧光技术的同时检测多种食物特异性IgG抗体的试剂盒，试剂盒包括捕获微球混合液和荧光检测抗体、洗涤缓冲液(10×)、样品稀释液、校准微球混合液、校准专用荧光检测抗体、校准品。本发明的检测试剂盒可同时检测57种食物特异性IgG抗体，且一份临床样本只需40μL样本量且无需稀释样本便可同时检测57种食物特异性IgG抗体。不但全面检测了患者的食物不耐受情况、降低了样本使用量，而且解决了需逐一检测每种食物特异性IgG抗体的繁琐操作、有效降低了检测时间，同时检测精密度、准确度、灵敏度等较高。所有捕获微球混合液中均包括质控微球，用于评估试剂盒的有效性以及实验操作的正确性。本发明成功筛选出一系列与特定食物特异性IgG抗体特异相关的食物抗原，采用食物抗原标记固相载体微球的方法，研发出一套可以准确检测样本中一种或多种食物特异性IgG抗体的标记物微球组合。

表1是本发明第一实施例的食物特异性IgG抗体检测试剂盒的具体组成成分。其中，试剂盒为100人份/盒。试剂盒中可选择不加入校准微球混合液、校准专用荧光检测抗体、校准品和样品稀释液。

表 1。

表1的所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒中捕获微球混合液中不同聚苯乙烯微球分别标记有抗人IgG1抗体和鸡蛋、牛奶、大豆、小麦、大米、马铃薯、鳕鱼、虾、蟹、西红柿、蘑菇、玉米、鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉、腰果、芝麻、红茶、花生、烟草、咖啡、白软干酪、蔗糖、青豆、菠菜、燕麦、巧克力、甘薯、蜂蜜、扇贝、蛤、牡蛎、龙虾、三文鱼、沙丁鱼、带鱼、草鱼、金枪鱼、鳟鱼、鳎鱼、大马哈鱼、芒果、橘子、菠萝、西瓜、橄榄、桃、榴莲、香蕉、哈密瓜、葡萄、柚子、草莓、蓝莓、苹果、柠檬等57种食物抗原。本发明中所述鸡蛋、牛奶、大豆、小麦、大米、马铃薯、鳕鱼、虾、蟹、西红柿、蘑菇、玉米、鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉、腰果、芝麻、红茶、花生、烟草、咖啡、白软干酪、蔗糖、青豆、菠菜、燕麦、巧克力、甘薯、蜂蜜、扇贝、蛤、牡蛎、龙虾、三文鱼、沙丁鱼、带鱼、草鱼、金枪鱼、鳟鱼、鳎鱼、大马哈鱼、芒果、橘子、菠萝、西瓜、橄榄、桃、榴莲、香蕉、哈密瓜、葡萄、柚子、草莓、蓝莓、苹果、柠檬等57种食物抗原，均为天然提取物，并且为食物不耐受的源头。

本实施例57种食物抗原包被微球的标记技术，是采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)作为活化剂来活化荧光微球表面的羧基，将其与食物抗原上的氨基和抗人IgG1抗体上的氨基结合形成共价键，从而形成食物抗原微球复合体和抗人IgG1抗体微球复合体。将食物抗原微球复合体和抗人IgG1抗体微球复合体混合得捕获微球混合液，捕获微球混合液微球浓度为0.34×10⁶个/mL。

本实施例中的微球为羧基修饰的不同大小的聚苯乙烯微球，每种聚苯乙烯微球中包含不同含量的别藻蓝蛋白(APC)，图3为本发明实施例的荧光微球分布情况。参照图3，不同种聚苯乙烯微球可以通过在Beckman公司生产的DxFLEX流式细胞仪上的别藻蓝蛋白通道荧光信号值（APC-A）及别藻蓝蛋白偶联A750染料通道荧光信号值（APC-A750-A）来区分，其中A指通过激光时，产生波状信号的曲线下的面积，代表信号强度；A750指染料名称。本实施例的所述食物抗原微球复合体和抗人IgG1抗体微球复合体中，可以将聚苯乙烯微球划分成16种不同参数的微球，对应L1~L16水平的荧光微球的APC-A及APC-A750-A通道的检测结果，不同水平微球的荧光强度见表2。

表 2。

表3为本实施例57种食物抗原分别标记在不同微球表面的标记比例表。

表 3。

所述校准微球混合液的悬浮液中包含16种可辨识的聚苯乙烯微球，每种聚苯乙烯微球包含不同含量的别藻蓝蛋白(APC)，通过分析APC-A和APC-A750-A，可以将聚苯乙烯微球划分成16种不同参数的微球，对应L1~L16水平。

校准品包括不同浓度的食物特异性IgG抗体，以建立检测时的校准曲线。

本发明实施例的食物特异性IgG抗体检测试剂盒共有组合1至组合4的四个套餐，用户可根据具体需求选择相应的套餐类型，选择上更具有针对性。

本发明食物特异性IgG抗体检测试剂盒中每个组合所需样本量仅为10μL，该样本量对所有年龄段的群体都比较友好，尤其是婴幼儿群体，并且无需稀释样本，操作步骤简便。

本发明的食物特异性IgG抗体检测试剂盒每个组合套餐中采用一份样本量最多可以检测15项食物抗原，高效简化了当前一些试剂盒需逐一单独检测的操作繁琐问题。

第二实施例。

本发明第二实施例提供另一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒，与第一实施例中的食物特异性IgG抗体检测试剂盒的区别在于：

所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒中捕获微球混合液中不同聚苯乙烯微球分别标记有抗人IgG1抗体和鸡蛋、牛奶、大豆、小麦、大米、鳕鱼、虾、蟹、西红柿、蘑菇、玉米、鸡肉、猪肉、马铃薯、牛肉15种食物抗原，所述15种食物抗原标记微球的比例参见表3。

第三实施例。

本发明第三实施例提供另一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒，与第一实施例中的食物特异性IgG抗体检测试剂盒的区别在于：

所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒中捕获微球混合液中不同聚苯乙烯微球分别标记有抗人IgG1抗体和芝麻、花生、烟草、咖啡、白软干酪、蔗糖、青豆、菠菜、燕麦、羊肉、腰果、甘薯、巧克力、红茶、蜂蜜15种食物抗原，所述15种食物抗原标记微球的比例参见表3。

第四实施例。

本发明第四实施例提供另一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒，与第一实施例中的食物特异性IgG抗体检测试剂盒的区别在于：

所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒中捕获微球混合液中不同聚苯乙烯微球分别标记有抗人IgG1抗体和扇贝、蛤、牡蛎、龙虾、三文鱼、沙丁鱼、带鱼、草鱼、金枪鱼、鳟鱼、鳎鱼、大马哈鱼12种食物抗原，所述12种食物抗原标记微球的比例参见表3。

第五实施例。

本发明第五实施例提供另一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒，与第一实施例中的食物特异性IgG抗体检测试剂盒的区别在于：

所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒中捕获微球混合液中不同聚苯乙烯微球分别标记有抗人IgG1抗体和芒果、橘子、菠萝、西瓜、橄榄、桃、榴莲、香蕉、哈密瓜、葡萄、柚子、草莓、蓝莓、苹果、柠檬15种食物抗原，所述15种食物抗原标记微球的比例参见表3。

第六实施例。

本实施例提供第一实施例中食物特异性IgG抗体检测试剂盒的制备方法。

（1）捕获微球混合液制备：

将16种微球和抗人IgG1抗体、57种食物抗原分别偶联，分别制得57种食物抗原微球复合体和抗人IgG1抗体微球复合体，将抗人IgG1抗体微球复合体和食物抗原微球复合体混合得捕获微球混合液。

（2）荧光检测抗体制备：

将抗人IgG抗体与藻红蛋白偶联得到荧光检测抗体，所述抗人IgG抗体与藻红蛋白的质量比为1:1-1:5。

（3）洗涤缓冲液(10×)：

将2.4g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、36.32g十二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）、8g的NaCl、2g的氯化钾（KCl）溶于1000mL纯水中，加入25g的BSA、质量分数为1%的ProClin 300防腐剂、质量分数为0.5%的吐温20（Tween-20），获得洗涤缓冲液（10×）备用。将洗涤缓冲液（10×）稳定到室温，待所有盐溶解，取10mL的洗涤缓冲液（10×）加入到90mL纯水中，获得洗涤缓冲液（1×）。

（4）样品稀释液：

将3.0275g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、9.0g氯化钠（NaCl）溶于800mL纯水，并加入1ml的ProClin防腐剂，调节pH至7.4，完全溶解后加入20g牛血清白蛋白（BSA），待完全溶解后定容至1000ml，调节pH至7.4备用。

（5）校准品包括不同浓度的食物特异性IgG抗体，以建立检测时的校准曲线。所述校准品为使用所述样品稀释液稀释得到的不同浓度的食物特异性IgG抗体。

本实施例所使用的原料的厂家、货号见表4-1至表4-4。

表4-1。

表4-2。

表4-3。

表4-4。

第七实施例。

本实施例提供第一实施例的食物特异性IgG抗体检测试剂盒的使用方法，所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒的具体使用方法为：

向样本管中加入40μL所述捕获微球混合液，向校准管中分别加入40μL所述校准微球混合液；

向样本管中加入10μL待测样本，向校准管中加入10μL校准品，分别混匀，并在室温避光孵育0.5h；

向样本管、校准管中分别加入1000μL的洗涤缓冲液（1×），在400g的离心力下离心4min，去上清；

向样本管加入40μL所述荧光检测抗体，分别混匀，室温避光孵育0.5h；

向校准管中分别加入40μL所述校准专用荧光检测抗体，分别混匀，室温避光孵育0.5h；

向样本管、校准管中分别加入1000μL的洗涤缓冲液（1×），在400g的离心力下离心4min，弃上清；

向样本管、校准管中分别加入150μL-300μL的洗涤缓冲液（1×），混匀，在流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度，具体的检测过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。

所述洗涤缓冲液即用纯水将洗涤缓冲液（10×）按1：9比例(1份洗涤缓冲液（10×）+9份纯水)稀释成洗涤缓冲液（1×）备用。

本发明的食物特异性IgG抗体检测试剂盒检测时所需的样本量少，血清样本用量仅需10μL，并且无需稀释样本，操作步骤简便。

第八实施例。

本实施例对第一实施例的食物特异性IgG抗体检测试剂盒进行相关性能评价。

（a）检验前准备工作。

将使用试剂恢复至室温；

校准曲线的绘制原理：同一试剂盒组合内校准微球混合液与一系列浓度的校准品混合，室温避光孵育，形成“校准微球-校准品”复合物，之后加入优化剂量的校准专用荧光检测抗体，室温避光孵育，形成“校准微球-校准品-荧光检测抗体”复合物。最后，采用流式细胞仪对该复合物进行荧光类型和荧光强度的检测，并且根据一系列校准品浓度所对应的荧光信号来绘制校准曲线。本实施例中不同食物抗原对应的血清中食物特异性IgG抗体的相对浓度采用校准曲线的回归来计算。

绘制校准曲线：向5个校准微球管中分别加入40μL所述校准微球混合液，然后依次分别加入10μL浓度为0U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、400U/mL的校准品溶液，所述0U/mL为样品稀释液，混匀，室温避光孵育0.5h；加入1000μL的洗涤缓冲液（1×），在400g的离心力下离心4min，去上清；加入40μL所述校准专用荧光检测抗体，混匀，室温避光孵育0.5h；加入1000μL的洗涤缓冲液（1×），在400g的离心力离心4min，弃上清；加入150μL-300μL的洗涤缓冲液（1×），混匀，在流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度，以浓度为横坐标，检测信号(MFI)为纵坐标绘制校准曲线。图4为本发明实施例中鸡蛋特异性IgG抗体的校准曲线图。本发明的校准曲线制备方法为本领域常规技术手段，本发明仅展示鸡蛋特异性IgG抗体的校准曲线，其余56种食物抗原校准曲线的制备方法与之类似，校准曲线图不再展示。

（b）阴、阳性符合率评价。

向流式管中加入40μL所述捕获微球混合液，每个项目均选取阴、阳性样本各50例，每份样本各加入10μL，混匀，并在室温下避光孵育0.5h；加入1000μL的洗涤缓冲液（1×），在400g的离心力下离心4min，去上清；分别加入40μL所述荧光检测抗体复合物，混匀，室温避光孵育0.5h；分别加入1000μL的洗涤缓冲液（1×），在400g的离心力下离心4min，弃上清；分别加入150μL-300μL的洗涤缓冲液（1×），混匀，在Beckman公司生产的DxFLEX流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度。所有检测样本同时采用已上市的浩欧博食物特异性IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)作为对照试剂进行同步测试，对照试剂的检测过程及检测结果的判读均依照该试剂盒的说明书进行。在本试剂盒中，当检测信号>阳性判断值检测信号时，检测结果显示为阳性；当检测信号<阳性判断值检测信号时，检测结果显示为阴性。表5-1至表5-4分别为组合1至组合4的阴、阳性符合率评价结果。参照表5-1至表5-4，试剂盒的阳性符合率≥90%，阴性符合率≥90%。

表 5-1 。

表5-2。

表5-3。

表5-4。

（c）最低检出限评价。

向流式管中加入40μL所述校准微球混合液，选取5份浓度近似最低检出限(20U/mL)的低值样本，每份样本各加入10μL，重复5次，混匀，并在室温下避光孵育0.5h；加入1000μL的洗涤缓冲液（1×），在400g的离心力下离心4min，去上清；分别加入40μL所述荧光检测抗体复合物，混匀，室温避光孵育0.5h；分别加入1000μL的洗涤缓冲液（1×），在400g的离心力下离心4min，弃上清；分别加入150μL-300μL的洗涤缓冲液（1×），混匀，在Beckman公司生产的DxFLEX流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度。表6为最低检出限（U/mL）评价结果，参照表6，低于空白限数值（10U/mL）的检测结果的数量为1个，并且无高于参考区间下限(50U/mL)的检测结果。

表 6。

（d）重复性评价。

检测2份不同浓度水平的校准品，按上述操作要求进行10次平行检测，计算变异系数CV。表7-1至表7-16为重复性试验（U/mL）评价结果，参照表7-1至表7-16，本试剂盒的低值、中值校准品的变异系数CV均在10%以内，具有较好的重复性。

表 7-1。

表 7-2。

表 7-3。

表 7-4。

表 7-5。

表7-6。

表7-7。

表7-8。

表7-9。

表7-10。

表7-11。

表7-12。

表7-13。

表7-14。

表7-15。

表7-16。

第九实施例。

本实施例提供了使用第一实施例的食物特异性IgG抗体检测试剂盒检测一个受试对象的血清样本中57种食物特异性IgG抗体的判读结果。阳性判断值为50U/mL。表8-1至表8-4为该血清样本的检测结果，该样本中具有扇贝、哈密瓜、菠萝、芒果特异性IgG抗体，由此可知，该名受试对象对扇贝、哈密瓜、菠萝、芒果过敏。同时检测57种食物特异性IgG抗体，可以大大缩短检测时间。

表 8-1。

表 8-2。

表 8-3。

表 8-4。

虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims

1.一种食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，包括捕获微球混合液、荧光检测抗体，所述捕获微球混合液包括质控微球和至少2种食物抗原微球复合体，所述质控微球为抗人IgG抗体微球复合体，用于评估试剂盒的有效性以及实验操作的正确性，所述食物抗原微球复合体包含食物抗原和可辨识的聚苯乙烯微球，所述抗人IgG抗体微球复合体包含抗人IgG抗体和可辨识的聚苯乙烯微球，每种所述聚苯乙烯微球中包含不同含量的别藻蓝蛋白。

2.根据权利要求1所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG抗体微球复合体包括抗人IgG1抗体微球复合体、抗人IgG2抗体微球复合体、抗人IgG3抗体微球复合体或抗人IgG4抗体微球复合体。

3.根据权利要求1所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述食物抗原微球复合体包括第一组食物抗原，所述第一组食物抗原包括鸡蛋、牛奶、大豆、小麦、大米、鳕鱼、虾、蟹、西红柿、蘑菇、玉米、鸡肉、猪肉、马铃薯、牛肉抗原中的至少3种抗原。

4.根据权利要求3所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述食物抗原微球复合体还包括第二组食物抗原，所述第二组食物抗原包括芝麻、花生、烟草、咖啡、白软干酪、蔗糖、青豆、菠菜、燕麦、羊肉、腰果、甘薯、巧克力、红茶、蜂蜜抗原中的至少3种抗原。

5.根据权利要求4所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述食物抗原微球复合体还包括第三组食物抗原，所述第三组食物抗原包括扇贝、蛤、牡蛎、龙虾、三文鱼、沙丁鱼、带鱼、草鱼、金枪鱼、鳟鱼、鳎鱼、大马哈鱼抗原中的至少3种食物抗原。

6.根据权利要求5所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述食物抗原微球复合体还包括第四组食物抗原，所述第四组食物抗原包括芒果、橘子、菠萝、西瓜、橄榄、桃、榴莲、香蕉、哈密瓜、葡萄、柚子、草莓、蓝莓、苹果、柠檬抗原中的至少3种食物抗原。

7.根据权利要求2所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述质控微球为所述抗人IgG1抗体微球复合体，所述抗人IgG1抗体微球复合体中每10-30μg抗人IgG1抗体包被6×10⁶个微球。

8.根据权利要求1所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述食物抗原微球复合体中，每0.2-200μg食物抗原包被6×10⁶个微球。

9.根据权利要求1所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述荧光检测抗体中，每0.5-1.5mg抗人IgG抗体偶联2-4mg藻红蛋白。

10.根据权利要求1所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述食物特异性IgG抗体检测试剂盒还包括洗涤缓冲液、样品稀释液、校准微球混合液、校准专用荧光检测抗体和校准品，所述洗涤缓冲液包括磷酸盐和表面活性剂，所述样品稀释液包括Tris缓冲液及防腐剂，所述校准微球混合液为食物抗原微球和质控微球的混合液，所述校准专用荧光检测抗体为藻红蛋白和抗人IgG抗体形成的复合物，所述校准品包括不同浓度的食物特异性IgG抗体。

11.一种如权利要求1-10任意一项所述的食物特异性IgG抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

12.根据权利要求11所述的使用方法，其特征在于，步骤S2中，向步骤S1所得的混合物中加入所述荧光检测抗体的步骤包括，向步骤S1所得的混合物中加入洗涤缓冲液，离心后保留沉淀，在所得沉淀中加入所述荧光检测抗体。