WO2022050416A1 - アレルギー疾患の判定方法及び判定システム - Google Patents

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probe
prediction
reaction
allergen
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恵梨香 澤野
雄希 ▲高▼▲瀬▼
直樹 下条
史也 山出
泰至 中野
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三菱瓦斯化学株式会社
国立大学法人千葉大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining an allergic disease and a kit, biochip, system, etc. used for the determination method.
  • the invention provides: [1] It is a method for determining allergic diseases. A step of contacting a biological sample collected from a subject with two or more probes selected from the allergen and its fragments. Step of detecting the reaction between the probe and the antibody contained in the biological sample, A step of determining the type of antibody that has reacted with the probe, The process of inputting the data related to the reaction with the antibody for each of at least two types of the probe and the data related to the type of bound antibody into the prediction model to obtain the prediction result, and the allergic disease based on the prediction result.
  • Data on the reaction between the probe and the antibody contained in the biological sample obtained by contacting two or more probes selected from the allergen and its fragments with the biological sample collected from the subject, and the reacted antibody.
  • the process of acquiring data related to the type, and the process of inputting the data into the prediction model and obtaining the prediction result includes, at least, two or more non-linear models or explanatory variables and the number of terms created using training data relating to the reaction of the probe with the antibody and training data relating to the type of bound antibody. Is a model with two or more terms, a method for obtaining an index for determining an allergic disease.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the type of antibody is selected from IgE and IgG4.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the probe contains an overlapping fragment of the allergen.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the probe is immobilized.
  • the data relating to the reaction with the antibody is the reaction intensity with the antibody.
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein additional training data is used to create a predictive model.
  • the step of determining an allergic disease includes two or more kinds of biological samples collected from a subject having different collection times, and the step of determining allergic diseases includes comparing the prediction results obtained for the two or more kinds of biological samples with each other.
  • Data acquisition unit which acquires data related to the type of Data processing unit that inputs the above data into the prediction model and obtains the prediction result.
  • a determination unit for determining an allergic disease based on the prediction result and an output unit for outputting the determination result are provided, and the prediction model can be used for at least training data related to the reaction with the antibody for the probe and the type of bound antibody.
  • An allergic disease determination system which is a nonlinear model or a model having two or more explanatory variables and two or more terms, created using the training data.
  • the present invention has, for example, one or more of the following effects, depending on its embodiment.
  • (1) The degree of symptoms of allergic diseases can be predicted.
  • (2) Responses to provocation tests such as food oral challenge tests can be predicted.
  • (3) The diagnostic ability is superior to the conventional method based on specific IgE.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a functional configuration of an allergic disease determination system.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of data processing in the system of the present invention.
  • FIG. 3 is a block diagram showing an example of a hardware configuration of a computer that realizes a stand-alone system of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a partial peptide immobilized on beads.
  • FIG. 5 is a decision tree of the prediction model 1-4. "1" in the prediction result means severe illness, and "0” means mild illness.
  • FIG. 6 is a decision tree of the prediction model 1-5. "1" in the prediction result means severe illness, and "0” means mild illness.
  • FIG. 7 is a ROC curve created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-1.
  • FIG. 8 is a dot histogram created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-1.
  • FIG. 9 is a ROC curve created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-2.
  • FIG. 10 is a dot histogram created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-2.
  • FIG. 11 is an ROC curve created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-3.
  • FIG. 12 is a dot histogram created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-3.
  • FIG. 13 is an ROC curve created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-4.
  • FIG. 14 is a dot histogram created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-4.
  • FIG. 15 is a ROC curve created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-5.
  • FIG. 16 is a dot histogram created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-5.
  • FIG. 17 is an ROC curve created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-6.
  • FIG. 18 is a dot histogram created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-6.
  • FIG. 19 is a ROC curve created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-7.
  • FIG. 20 is a dot histogram created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-7.
  • FIG. 21 is an ROC curve created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-8.
  • FIG. 22 is a dot histogram created from the predicted values of each subject obtained by the prediction model 1-8.
  • FIG. 23 is a decision tree of the prediction model 2-3. The numbers in the prediction results represent the sufficiency rate of the ASCA value.
  • FIG. 24 is a decision tree of the prediction model 2-3. The numbers in the prediction results represent the sufficiency rate of the ASCA value.
  • FIG. 25 is a scatter diagram created from the predicted values and observed values of each subject obtained by the prediction model 2-1.
  • FIG. 26 is a scatter plot created from the predicted values and observed values of each subject obtained by the prediction model 2-2.
  • FIG. 27 is a scatter diagram created from the predicted values and observed values of each subject obtained by the prediction model 2-3.
  • FIG. 28 is a scatter plot created from the predicted values and observed values of each subject obtained by the prediction model 2-4.
  • FIG. 29 is a scatter plot created from the predicted values and observed values of each subject obtained by the prediction model 2-5.
  • FIG. 30 is a scatter plot created from the predicted values and observed values of each subject obtained by the prediction model 2-6.
  • the determination method of the present invention is A step of contacting a biological sample collected from a subject with two or more probes selected from the allergen and its fragments. Step of detecting the reaction between the probe and the antibody contained in the biological sample, A step of determining the type of antibody that has reacted with the probe, The process of inputting the data related to the reaction with the antibody for each of at least two types of the probe and the data related to the type of bound antibody into the prediction model to obtain the prediction result, and the allergic disease based on the prediction result.
  • the predictive model comprises at least two non-linear models or explanatory variables created using training data relating to the reaction of the probe with the antibody and training data relating to the type of bound antibody. Moreover, it is a model having two or more terms.
  • Allergic diseases are diseases in which the immune system reacts excessively to allergens, and include food allergies, atopic dermatitis, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, bronchial asthma, urticaria, anaphylactic shock, drug allergies, etc.
  • the allergic disease is a disease involving IgE.
  • the allergic disease belongs to type I allergy.
  • the allergic disease is a food allergy.
  • the allergen and / or a fragment thereof is used as a probe for detecting an antibody contained in a biological sample (hereinafter, may be referred to as a target antibody).
  • a biological sample hereinafter, may be referred to as a target antibody.
  • the allergen used as a probe include, but are not limited to, food allergens, inhalable allergens, contact allergens, and the like.
  • Examples of food allergens include, but are not limited to, allergens such as milk / dairy products, eggs, fish, meat, soft animals, shellfish, grains, nuts, fruits, vegetables, mushrooms, and potatoes.
  • Examples of fish allergens include salmon, mackerel, salmon roe, bass, flounder, cod and other allergens.
  • Examples of meat allergens include chicken, pork, gelatin and other allergens.
  • Examples of allergens of mollusks include allergens such as abalone and squid.
  • Examples of crustacean allergens include shrimp, crab and other allergens.
  • Examples of cereal allergens include wheat, rye, barley, oats, spelled, kamut wheat, buckwheat, peanuts, sesame, soybeans, and lupinus.
  • Nut allergens include allergens such as almonds, cashew nuts, walnuts, hazelnuts, walnuts, pecan nuts, brazil nuts, pistachio nuts and macadamia nuts.
  • Examples of fruit allergens include oranges, kiwifruits, bananas, peaches, apples and the like.
  • Examples of vegetable allergens include allergens such as celery and mustard.
  • the allergen comprises a raw material allergen described as a specified or quasi-specified raw material in Japanese food labeling standards.
  • Specific raw materials include shrimp, crab, wheat, buckwheat, egg, milk and peanuts
  • semi-specific raw materials include almonds, abalone, squid, salmon roe, oranges, cashew nuts, kiwifruit, beef, walnuts, sesame, salmon roe, and mackerel. Includes soybeans, chicken, bananas, pork, matsutake mushrooms, thighs, salmon roe, apples and gelatin, respectively.
  • allergens include allergens that are required to be labeled under European Parliament and Council Regulation No. 1169/2011.
  • allergens include gluten-containing grains (wheat, rye, barley, oats, spelled wheat, kamut wheat), shellfish, eggs, fish, peanuts, soybeans, milk and dairy products, and nuts (almonds, hazelnuts, walnuts). , Cashew nuts, pecan nuts, Brazilian nuts, pistachio nuts, macadamia nuts), celery, mustard, sesame, lupinus and allergens of soft animals.
  • the allergen comprises a food allergen as provided for labeling in the US Consumer Protection Act.
  • Such foods include milk, eggs, fish (bath, flounder, cod, etc.), crustaceans (crab, lobster, shrimp, etc.), nuts (almonds, walnuts, pecan nuts, etc.), peanuts, wheat and soybeans.
  • food allergens include animal and vegetable allergens.
  • animal allergens include casein ( ⁇ s1-casein, ⁇ s2-casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, etc.), albumin (lactoalbumin, ovoalbumin, conalbumin, serum albumin, etc.), globulin (lactoglobulin, immunoglobulin, etc.). Etc.), tropomyosin, parvalbumin ( ⁇ -parvalbumin, etc.).
  • Examples of plant allergens include coupin (7S globulin (vicilin), 11S globulin (legumin), 13S globulin, etc.), prolamin ( ⁇ -amylase inhibitor, 2S albumin, non-specific lipid transport protein (nsLTP), etc.), PR- Examples include 10 (Bet v 1 homolog), profilin, and oleocin.
  • the allergen is selected from casein, albumin, globulin, tropomyosin, parvalbumin, coupin, prolamin, PR-10 (Bet v1 homolog), profilin and oleosin.
  • milk allergens are ⁇ s1-casein (Bos d 9), ⁇ s2-casein (Bos d 10), ⁇ -casein (Bos d 11), ⁇ -casein (Bos d 12), ⁇ -lactalbumin (Bos). Includes d 4), serum albumin (Bos d 6), ⁇ -lactoglobulin (Bos d 5) and immunoglobulin (Bos d 7).
  • egg allergens include ovomucoid (Gal d 1), ovalbumin (Gal d 2), ovotransferrin (conalbumin, Gal d 3) and lysozyme C (Gal d 4).
  • the fish allergens are Taiseiyosaketropomyosin (Sal s4), Taiseiyosake ⁇ -parvalbumin (Sals1), ⁇ -parvalbumin (Gad c1), Kawasuzu metropomyosin (Orem4), and herring ⁇ .
  • Parvalbumin (Cluh1), Koi ⁇ parvalbumin (Crpc1), Curry ⁇ parvalbumin (Lepw1), Nijimas ⁇ parvalbumin (Oncm1), Iwashi ⁇ parvalbumin (Sarsa1), Kihada tuna ⁇ Includes parvalbumin (Thua1) and mekajiki ⁇ -parvalbumin (Xipg1).
  • the mollusc allergens are abalone tropomyosin (Hal l 1), Japanese flying squid tropomyosin (Tod p 1), garden snail mymaitropomyosin (Hel as 1), Pacific oyster tropomyosin (Crag 1) and Sydney rock oyster tropomyosin (Sac). g 1) is included.
  • the crustacean allergens are Indian shrimp tropomyosin (Pen i 1), Yoshie vitropomyosin (Met e 1), American lobster tropomyosin (Hom a 1), Black Tiger tropomyosin (Pen m 1), Brown shrimp tropomyosin (Pen m 1).
  • Pen a 1) Banamei shrimp tropomyosin (Lit v 1), Futmiso shrimp tropomyosin (Mel l 1), Hokkokuaka shrimp tropomyosin (Pan b 1), Tenaga shrimp tropomyosin (Mac r 1), European shrimp jacotropomyosin (Cra c 1) Includes (Pan s 1), Taiwan gasamitropomyosin (Por p 1) and Ishiga nitropomyosin (Cha f 1).
  • the grain allergens are wheat gluten: wheat ⁇ -5 gliadin (Tri a 19), wheat ⁇ / ⁇ -gliadin (Tri a 21), wheat ⁇ -gliazine (Tri a 20), wheat high molecular weight glutenin.
  • Tri a 26 wheat low molecular weight glutenin (Tri a 36), wheat ⁇ -amylase inhibitor (monomer, Tri a 15 dimer, Tri a 28, tetramer, Tri a 29, Tria 30), wheat nsLTP (Tria14), barley ⁇ -amylase inhibitor (Horv15), buckwheat 13S globulin (molecular weight 76 kDa), buckwheat 13S globulin ⁇ -subunit (molecular weight 24 kDa, Fage1), buckwheat 7S globulin (vicilin, Fage3) , Soba 2S albumin (Fage2), peanut 7S globulin (vicilin, Arah1), peanut 11S globulin (regmin, Arah3), peanut 2S albumin (Arah2,6,7), peanut nsLTP (Arah) 9, 16, 17), peanut Bet v 1 (Ara h 8), peanut profylline (A
  • the nut allergens are almond 11S globulin (regmin, Pru du 6), almond nsLTP1 (Pru du 3), almond profylline (Pru du 4), cashew nut 7S globulin (bisillin, Ana o 1), cashew nuts.
  • the fruit allergens are orange nsLTP (Cit s 3), orange profilin (Cit s 2), green kiwi 2S albumin (Act d 13), golden kiwin ns LTP (Act c 10), green kiwin ns LTP (Act).
  • the fruit allergens are celery nsLTP (Api g 2, 6), celery Bet v 1 (Api g 1), celery profilin (Api g 4), yellow mustard 2S albumin (Sin a 1), yellow.
  • the inhalable allergen is not limited, and examples thereof include indoor allergens, pollen allergens, and mold allergens.
  • indoor allergens include, but are not limited to, allergens such as dust, mites, tatami mats, buckwheat, pet hair, clothes, and bedding (cotton, silk, wool, feathers).
  • Pollen allergens include, but are not limited to, for example, ragweed, humulus, sugi, red pine, suki, himegama, yomogi, olive, platanas, European hazel, European hazel, white goosefoot, hazel, hazel, hazel, hazel, etc.
  • allergens such as European asada, white oak, blue goosefoot, white goosefoot, hazel, saffron, gyoushiba, hazel, sardine, rapeseed, hera obaco, mesquito, Brassica rapa, okahijiki, and lilac.
  • mold allergen include, but are not limited to, allergens such as Alternaria, Penicillium, Candida, Cladosporium, and Aspergillus.
  • the pollen allergens are butaxan nsLTP (Amb a 6), yomogin nsLTP (Art v 3), olive ns LTP (Ole e 7), Platanas ns LTP (Pla or 3), European Hikagemizu ns LTP (Par j 1).
  • the contact allergen is not limited, and examples thereof include allergens such as cosmetics, paints, clothes, latex (rubber), bedding, and detergents.
  • the latex allergen comprises latex nsLTP (Heb v12).
  • the allergen has different reactivity with IgE and IgG4 depending on the fragment thereof.
  • allergens include ⁇ s1-casein, ⁇ s2-casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -lactoglobulin, brown shrimp tropomyosin and the like.
  • the allergen used as a probe is a polypeptide.
  • the allergen fragment used as a probe is not particularly limited as long as it can bind to an antibody, and is 3 to 50 amino acids long, preferably 5 to 30 amino acids long, more preferably 10 to 20 amino acids long, and particularly preferably. It may be 12-18 amino acids long.
  • the fragment of the allergen may be contiguous on the amino acid sequence, or may be a fragment containing the amino acid sequence of the structural epitope if the allergen contains a structural epitope that is not contiguous on the amino acid sequence. .. When the fragment is a continuous fragment, it may be an overlapping fragment in which adjacent fragments partially overlap each other.
  • SEQ ID NOs: 2 to 21 shown in Table 1 below are examples of overlapping fragment sets of ⁇ s1-casein (SEQ ID NO: 1).
  • the number of probes used in the determination method of the present invention may vary depending on the length of the amino acid sequence of the allergen to be detected and the number of types of allergen, and is, for example, 2 to 10,000, 3 to 1,000, and 9 to 512. , 18 to 144, and the like.
  • the probe may be composed of multiple fragments of the same allergen or may be composed of one or more fragments from two or more different allergens. Further, the probe may be composed of only the full-length allergen, the allergen fragment only, or may contain both the full-length allergen and the allergen fragment.
  • the probe may be immobilized.
  • the solidification method is not particularly limited, and any known method can be used. Specifically, for example, a method of directly adsorbing the probe to the measuring plate or chip, a method of binding the probe to a carrier such as beads, and fixing the beads to which the probe is bound to the measuring plate or chip (WO2018 / 154814, WO2019 / 050017) and the like. Specific embodiments of fixing the probe to the chip are described in detail in the section on biochip below.
  • the subject in the determination method of the present invention may or may not have an allergic disease.
  • the subject is a subject suspected of having an allergic disease.
  • the subject is a subject diagnosed with an allergic disease.
  • the subject has severe allergic symptoms such as anaphylaxis, such as provocation tests for allergic diseases (eg, food oral challenge test, inhalation provocation test, nasal mucosa provocation test, intradermal test, etc.) and intradermal test.
  • provocation tests for allergic diseases eg, food oral challenge test, inhalation provocation test, nasal mucosa provocation test, intradermal test, etc.
  • intradermal test intradermal test.
  • This is a subject that is scheduled to undergo a test that may induce it.
  • the subject is a subject who is scheduled to undergo a food oral challenge test.
  • the biological sample used in the determination method of the present invention is not particularly limited as long as it can contain an antibody to be detected, and examples thereof include blood, plasma, and serum.
  • the biological sample may be two or more kinds of the same subject but at different collection times. Allergic diseases can be monitored by obtaining determination results for each of such samples, comparing them with each other, and comparing them with predetermined reference values. For example, if the determination item is whether the allergic disease is mild or severe, it can be further determined whether the allergic disease remains mild or severe, whether it has changed from mild to severe, or from severe to mild. .. If the sample is collected at two different time points, for example, before the start of the treatment, after the start of the treatment, or after the start of the treatment, the therapeutic effect can be determined.
  • the type of antibody discriminated by the determination method of the present invention is not limited, and examples thereof include IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, and IgM.
  • the type of antibody identified is IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4.
  • the types of antibodies identified are IgE and IgG4.
  • the step of contacting the probe with the biological sample can be performed by any known method that enables specific binding between the antigen and the antibody, or the method described in the following Examples. Specifically, for example, a liquid containing a biological sample may be loaded on a probe fixed to a substrate or a carrier. The biological sample may be used as a stock solution or diluted.
  • the step of detecting the reaction between the probe and the target antibody can be performed by any known method for detecting the reaction between the antigen and the antibody or the method described in the following Examples. Specifically, for example, the probe is brought into contact with a biological sample and reacted for a predetermined time under conditions that allow the probe to bind to the antibody, and then the antibody that is not bound to the probe is removed to detect the label. It can be carried out by allowing an antibody (secondary antibody) specific to the target antibody to be labeled with the above, removing the unbound secondary antibody, and then detecting the label.
  • an antibody secondary antibody
  • the label includes, without limitation, for example, a fluorescent substance, a luminescent substance, an enzyme (for example, ALP, HRP), a radioisotope, etc., and the method for detecting the label is not limited, for example, spectrophotometric degree. Methods, absorptiometry, fluorescence spectrophotometry, spectrophotometry, autoradiography and the like can be mentioned. The detection may be qualitative or quantitative. Prior to contacting the probe with the biological sample, a blocking agent can be acted upon to suppress non-specific adsorption of the antibody.
  • a blocking agent Prior to contacting the probe with the biological sample, a blocking agent can be acted upon to suppress non-specific adsorption of the antibody.
  • the blocking agent may contain biotin.
  • the signal-to-noise ratio can be increased by using a blocking agent containing biotin.
  • a secondary antibody specific to the desired type of antibody is used.
  • the type of antibody may be discriminated one by one for each step of detecting the reaction between the probe and the antibody in the biological sample, or a plurality of types may be discriminated at the same time. Simultaneous discrimination of a plurality of types can be performed, for example, by changing the type of label for each type of secondary antibody.
  • a secondary antibody specific for a type A antibody and a secondary antibody specific for a type B antibody can be labeled with fluorescent labels having different wavelengths.
  • a monoclonal antibody or a polyclonal antibody may be used as the secondary antibody.
  • a monoclonal antibody By using a monoclonal antibody, non-specific adsorption can be suppressed and the SN ratio can be increased.
  • the step of determining the type of antibody that has reacted with the probe may be performed simultaneously with the step of detecting the reaction between the probe and the target antibody, or may be performed separately.
  • the data relating to the reaction between the probe and the antibody may be quantitative or qualitative. In one aspect, the data is quantitative data. Quantitative data may vary depending on the reaction detection method and the like, but may include, but are not limited to, reaction intensity (absorbance, emission intensity, radiation intensity, etc.).
  • the predictive model used in the determination method of the present invention is a model for obtaining an index that is a basis for determining an allergic disease, and at least training data on the reaction of the probe with an antibody and training on the type of bound antibody.
  • the number of explanatory variables is not particularly limited as long as it is two or more.
  • Non-limited examples of the number of explanatory variables may vary depending on the type of prediction model, for example, 2 to 100 (ie, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 etc.) 2-50 pieces, 2-30 pieces, 2 ⁇ 20 pieces, 2 ⁇ 15 pieces, 2 ⁇ 10 pieces, 3 ⁇ 100 pieces, 3 ⁇ 50 pieces, 3 ⁇ 30 pieces, 3 ⁇ 20 pieces, 3 ⁇ 15 pieces, 3 ⁇ 10 pieces, 4 ⁇ 100 pieces, 4 ⁇ 50 pieces, 4 ⁇ 30 pieces, 4 ⁇ 20 pieces, 4 ⁇ 15 pieces, 4 ⁇ 10 pieces, 5 ⁇ 100 pieces, 5 ⁇ 50 pieces, 5 ⁇ 20 pieces, 5 ⁇ 15 pieces, 5 ⁇ 10 pieces, etc. It may be there.
  • the number of explanatory variables may be less than two, for example, one.
  • Explanatory variables include variables related to the reaction between the probe and the antibody (eg, emission intensity, absorbance, fluorescence intensity, etc.), variables related to the type of bound antibody (eg, isotypes such as IgE, IgG4, etc.), and the target. Age, gender, history, family history, underlying disease, complications, genetic predisposition, total IgE amount, IgE dilution rate (Samples of subjects with high total IgE amount are diluted to the extent that specific IgE can be detected. Magnification at the time of this), test results of other allergens, etc. can be used.
  • variables related to the reaction between the probe and the antibody eg, emission intensity, absorbance, fluorescence intensity, etc.
  • variables related to the type of bound antibody eg, isotypes such as IgE, IgG4, etc.
  • allergens include non-protein allergens such as formaldehyde, VOCs, metals, urushiol and iodine, in addition to those described above.
  • allergen test results include test results of specific IgE antibodies by RAST, CAP method, MAST method and the like, and skin test results such as prick test, scratch test and intradermal test.
  • an unprocessed numerical value may be used as it is, or a numerical value that has undergone preprocessing (variable transformation) such as logarithmic conversion may be used.
  • the prediction model can take the form of a prediction formula, decision tree, etc., depending on the statistical method used for creation.
  • the prediction formula may include four arithmetic operations, a hinge function, and the like, and the number of terms is not particularly limited as long as it is two or more terms. Non-limited examples of the number of terms in the prediction formula may vary depending on the type of prediction model, but for example, 2 to 150 terms (that is, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12). , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37.
  • the number of terms may be less than two terms, for example, one term.
  • Training data is data from multiple subjects with known presence or absence of allergic disease to be judged, for use in creating and evaluating predictive models. For example, when the determination method of the present invention determines whether the allergic reaction to allergen A is mild or severe, the training data includes data from a subject whose degree of allergic reaction to allergen A is known, and allergen A. When predicting an ASCA value for allergen A, the training data includes data from a subject whose ASCA value for allergen A is known. Based on such training data, various statistical methods will be used to create a model that can better distinguish between mild and severe subjects, and a model that can predict an ASCA value that is closer to the actual ASCA value. ..
  • Statistical methods used for creating and evaluating predictive models include, but are not limited to, the least squares method, Ridge regression, Lasso regression, CART method, MARS method, and the like.
  • the CART method, MARS method, etc. are used to create a nonlinear model, and the least squares method, Ridge regression, Lasso regression, etc. are used to create a linear model.
  • the accuracy and generalization of the prediction model can be improved by cross-validation (CV) or the like.
  • cross-validation for example, training data is divided into multiple sets, some of which are used as training data and the rest as validation data, and the prediction results are obtained by inputting them into a prediction model. Is there any bias in the results? To confirm.
  • cross-validation examples include Leave one out cross validation (LOOCV), 10-fold cross validation, and Generalized cross validation. If similar results are obtained from a set of multiple training data and verification data, it is highly probable (generalization) that similar results will be obtained even if it is applied to a sample used for actual determination.
  • the prediction model may be created manually or by machine learning. The prediction model can be evaluated by sensitivity, specificity, correlation coefficient (prediction rate), AUC in ROC curve, dot histogram, and the like.
  • the prediction model has a correlation coefficient of 0.60 or more.
  • the higher the correlation coefficient the more preferable and not limited, for example, 0.60 or more, 0.62 or more, 0.64 or more, 0.66 or more, 0.68 or more, 0.70 or more, 0.72 or more, 0.74 or more, 0.76 or more, 0.78 or more, 0.80 or more, 0.82 or more, 0.84 or more, 0.86 or more, 0.88 or more, 0.90 or more, 0.92 or more, It may be 0.94 or more, 0.96 or more, 0.98 or more, and the like.
  • the prediction model has an AUC of 0.900 or more when the vertical axis of the ROC curve is the sensitivity in the range of 0 to 1 and the horizontal axis is the sensitivity in the range of 0 to 1 (1-specificity).
  • the higher the AUC the more preferable, and without limitation, for example, 0.900 or more, 0.905 or more, 0.910 or more, 0.915 or more, 0.920 or more, 0.925 or more, 0.930 or more, 0. 935 or more, 0.940 or more, 0.945 or more, 0.950 or more, 0.955 or more, 0.960 or more, 0.965 or more, 0.970 or more, 0.975 or more, 0.980 or more, 0. It may be 985 or more, 0.990 or more, 0.995 or more, and the like.
  • additional training data related to the determination of allergic diseases can be used to create the predictive model.
  • Examples of such data include, without limitation, the above-mentioned explanatory variables.
  • the determination of the allergic disease by the determination method of the present invention is not limited to, for example, determination of whether the allergic disease is mild or severe (for example, whether the symptom when exposed to the allergen is mild or severe), grade (severity). ), Prediction of total ASCA value, etc. Criteria for mild and severe allergic diseases may vary depending on the circumstances in which the determination results are used. For example, the criteria for mild illness include grade 1 of the induced symptom, an ASCA value of less than a predetermined value, and a degree that does not require medical measures (a degree that can be dealt with by follow-up or the like). The criteria for mild and severe cases can be appropriately determined by the doctor depending on the situation.
  • Grade is an index of the severity of anaphylaxis and is determined based on the organ symptoms with the highest symptom grade based on the grade table below (Yanagida et al., Journal of the Japanese Society of Allergology, 2014; 28: 201).
  • ASMA Anaphylaxis Scoring Aichi
  • ASMA Anaphylaxis Scoring Aichi
  • ASMA is a scoring system that quantitatively evaluates the severity of induced symptoms in oral food challenge tests, and classifies induced symptoms into five categories: respiratory, skin-, digestive, nerve, and circulatory organs.
  • subjective symptoms and objective findings are divided into order of severity, and the organ score (1 to 60) is used.
  • the highest score of each organ in a series of stress tests is totaled to obtain the total score (up to 240).
  • the determination of allergic disease based on the prediction result may differ depending on the prediction model and the judgment items, but can be performed, for example, by comparing the prediction result with the reference value.
  • the prediction result (prediction value) obtained by the prediction formula can be compared with a preset reference value (for example, a cutoff value) to determine positive or negative. If the standard value is set so that if the predicted value is higher than the standard value, the probability of severe illness is high, and if it is low, the probability of mild illness is high. Can be done.
  • the cutoff value can be set by a known method such as Youden index.
  • the prediction model is a mode in which judgment items are directly output (for example, judgment of severe / mild disease using a decision tree, prediction of ASCA value using a prediction formula / decision tree, etc.), the prediction result is judged as it is. It can also be used as a result.
  • Another aspect of the present invention is the probe obtained by contacting two or more probes selected from an allergen and fragments thereof with a biological sample collected from a subject.
  • the prediction model includes, at least, two or more non-linear models or explanatory variables and the number of terms created using training data relating to the reaction of the probe with the antibody and training data relating to the type of bound antibody.
  • the present invention relates to a method for obtaining an index for determining an allergic disease, which is a model having two or more terms (hereinafter, may be referred to as “the index acquisition method of the present invention”).
  • the index acquisition method of the present invention is the same as the determination method of the present invention, except that the step of determining an allergic disease based on the prediction result by the prediction model is not essential.
  • the prediction result obtained by the index acquisition method of the present invention can be used as an index for determining an allergic disease. Specifically, for example, the presence or absence of a medical condition can be determined by comparing the prediction result with a reference value (cutoff value or the like) related to the medical condition to be determined.
  • the prediction model is a mode in which judgment items are directly output (for example, judgment of severe / mild disease using a decision tree, prediction of ASCA value using a prediction formula / decision tree, etc.), the prediction result is judged as it is. It can also be used as a result.
  • kits for use in the determination method or index acquisition method of the present invention which comprises two or more probes selected from allergens and fragments thereof (hereinafter, "the present invention”. (Sometimes referred to as a "kit").
  • the probe included in the kit of the present invention is as described above for the determination method of the present invention.
  • the probe may be immobilized or may be modified for immobilization.
  • Modifications for solidification include, for example, avidin or a derivative thereof, biotin or a derivative thereof, alkyne, azide, a phenolic OH group, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, a photoreactive group, a His tag, an antibody and the like. And so on.
  • the kit of the present invention may further include reagents for detecting the target antibody.
  • Such reagents include, but are not limited to, for example, labeled secondary antibodies that specifically bind to the target antibody, and if necessary, reagents for detecting the label (light emitting reagent, coloring reagent, etc.). Will be done.
  • the label added to the secondary antibody is as described above for the determination method of the present invention.
  • the kit of the present invention further includes a standard sample, instructions indicating how to use the kit, for example, a usage manual, site information including information on the usage method (for example, a URL, a two-dimensional code), and a usage method.
  • a usage manual for example, a URL, a two-dimensional code
  • site information including information on the usage method (for example, a URL, a two-dimensional code)
  • a usage method for example, a URL, a two-dimensional code
  • a medium on which information about the subject is recorded for example, a flexible disc, a CD, a DVD, a Blu-ray disc, a memory card, a USB memory, or the like may be included.
  • Biochip for determining allergic disease Another aspect of the present invention is a biochip for use in the determination method or index acquisition method of the present invention in which two or more probes selected from allergens and fragments thereof are immobilized on a substrate.
  • biochip of the present invention The probe fixed to the substrate of the biochip of the present invention is as described above for the determination method of the present invention.
  • the probe may be fixed directly to the substrate or may be fixed via a carrier (immobilized carrier).
  • the probe or the carrier on which the probe is immobilized may be referred to as an immobilized substance.
  • the biochip substrate is not particularly limited as long as it does not have an excessive adverse effect on the test sample or biochemical reaction, but for example, a resin material, a glass material, or the like can be used.
  • a resin material for example, a thermosetting resin or a thermoplastic resin can be used without limitation.
  • a light-transmitting resin material such as polypropylene, polycarbonate, acrylic, polystyrene, polyethylene terephthalate, cycloolefin polymer, or cycloolefin copolymer is used, good visible light transmission can be ensured.
  • the polypropylene is not limited, and for example, homopolypropylene or a random copolymer of polypropylene and polyethylene can be used.
  • the acrylic is not limited, and for example, polymethyl methacrylate or a copolymer of methyl methacrylate and other monomers such as methacrylic acid ester, acrylic acid ester, and styrene can be used. It is also possible to use a light-impermeable resin material.
  • the light-impermeable resin material is not limited to, for example, a resin material such as polypropylene, polycarbonate, acrylic, polystyrene, polyethylene terephthalate, cycloolefin polymer, cycloolefin copolymer, and a colorant for resin (for example, masterbatch). ) Is added.
  • the light-impermeable resin material preferably has a high light-shielding property, and the color is preferably black.
  • the thickness of the substrate is not particularly limited, but is preferably 0.3 mm to 3.0 mm, more preferably 0.5 mm to 1.5 mm, and 0. 7 mm to 1.0 mm is particularly preferable.
  • the resin material used for the substrate is hydrophobic. In some embodiments, the resin material is formed from a water-insoluble polymer. In some embodiments, the resin material is free of dextran, polyethylene glycol or derivatives thereof.
  • the substrate may be hydrophilized. The hydrophilization treatment can prevent non-specific adsorption to the substrate and firmly immobilize the substrate and the probe (or the carrier to which the probe is bound). The hydrophilization treatment may be performed on one or more portions of the surface of the substrate, or may be performed on the entire surface of the substrate. When the portion of the surface of the substrate is hydrophilized, for example, it may be applied to the entire upper surface of the substrate or one or more portions of the upper surface of the substrate.
  • the hydrophilization treatment is not particularly limited, but surface coating with an inorganic material such as hydrophilic silica or a surfactant, plasma treatment, UV-ozone treatment, chemical hydrophilization treatment such as corona treatment and frame treatment, and fineness. It can be mentioned that hydrophilicity is imparted by physically forming a nanostructure (WO2011 / 024947).
  • the substrate is made of resin
  • the chemical bonds of the molecules on the surface of the resin are broken, and functional groups having polarity depending on the type of resin, for example, OH (hydroxyl group), CO (carbonyl group), COOH (carboxyl group), methoxy Chemical hydrophilization treatment by plasma treatment, UV-ozone treatment, corona treatment, frame treatment or the like capable of generating a group, a peroxide group, a polar ether group or the like is more preferable, and UV-ozone treatment is particularly preferable.
  • the substrate has a surface comprising a hydrophilic reaction area, preferably a resin surface comprising a hydrophilic reaction area.
  • the reaction area means a region on the substrate on which the substance to be immobilized is immobilized and reacted with the substance to be detected.
  • the reaction area may be a part or the whole of the surface of the substrate.
  • the reaction area is a part of the surface of the substrate, the surface of the substrate other than the reaction area may be hydrophilic or hydrophobic.
  • the reaction area may be of various shapes, eg, circular, oval, polygonal or a combination thereof.
  • the reaction area may be continuous or discontinuous.
  • the reaction area may form a plurality of spots that do not contact each other.
  • the reaction area may be surrounded by a boundary within which the liquid can be retained.
  • the reaction area may be covered with a functional group having a polarity generated by cutting the carbon-related bonds of the resin forming the surface of the substrate and binding the cut points with oxygen.
  • a functional group include, but are not limited to, a hydroxyl group, a carbonyl group, a carboxyl group, a methoxy group, a peroxide group, a polar ether group and the like.
  • a coat layer for preventing non-specific adsorption and immobilizing the probe can be provided on the substrate.
  • the coat layer is not particularly limited as long as it can promote the immobilization of the substance to be immobilized and / or suppress the non-specific adsorption, and can be composed of various polymers, for example.
  • a water-soluble polymer is preferable. By using a water-soluble polymer, it is possible to avoid the use of non-aqueous solvents other than water and alcohol, which may denature the substance to be immobilized.
  • water-soluble polymer in order to prevent denaturation of the substance to be immobilized.
  • the water-soluble polymer has an advantage that it is also excellent in a non-specific adsorption suppressing effect.
  • water-soluble means, for example, that the solubility of the polymer in water (the number of grams dissolved in 100 g of water) is 5 or more.
  • the number average molecular weight of the polymer is not particularly limited, and is usually about 3.5 to 5 million.
  • the number of crosslinks between the polymers can be maintained at an appropriate level, and the substance to be immobilized and the substance to be subjected to the reaction with the substance to be immobilized (photocrosslinking). It is possible to proceed with the reaction with the agent, etc.).
  • Water-soluble polymers include bipolar polymers such as phosphorylcholine-containing polymers and nonionic polymers.
  • bipolar polymer examples include a polymer containing 2-methacryloyloxyphosphorylcholine (MPC) as a main component (for example, “LIPIDURE (R) ” manufactured by NOF CORPORATION (LIPIDURE (R) -CR2001, LIPIDURE (R) -CM5206, etc.). )).
  • MPC 2-methacryloyloxyphosphorylcholine
  • Nonionic polymers include polyalkylene glycols such as polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol; vinyl alcohols, methylvinyl ethers, vinylpyrrolidones, vinyloxazolidones, vinylmethyloxazolidones, 2-vinylpyridines, 4-vinylpyridines, N-vinyls.
  • PEG polyethylene glycol
  • Ppropylene glycol vinyl alcohols, methylvinyl ethers, vinylpyrrolidones, vinyloxazolidones, vinylmethyloxazolidones, 2-vinylpyridines, 4-vinylpyridines, N-vinyls.
  • the substrate can be surface-treated in order to enhance the adhesiveness between the coat layer and the substrate.
  • the surface treatment is not particularly limited, but for example, the chemical bonds of the molecules on the resin surface of the substrate are cleaved, and the hydrophilic functional groups OH (hydroxyl group), CO (carbonyl group), and COOH (carboxyl group) are selected depending on the type of resin. ), Treatments for generating methoxy groups, peroxide groups, polar ether groups and the like, such as plasma treatments, UV-ozone treatments, corona treatments and frame treatments.
  • the immobilized carrier is not particularly limited, and examples thereof include fine particle carriers such as organic fine particles and inorganic fine particles.
  • the fine particle carrier may be magnetic fine particles.
  • a magnetizable substance such as ⁇ Fe 2 O 3 and Fe 3 O 4 has a uniform particle size covered with a polymer having uniformly hydrophilicity (for example, a water-soluble polymer such as glycidyl methacrylate).
  • a polymer having uniformly hydrophilicity for example, a water-soluble polymer such as glycidyl methacrylate.
  • Examples of commercially available products include Dyna beads manufactured by Thermo Fisher Scientific, FG beads manufactured by Tamagawa Seiki, Sera-Mag magnetic beads manufactured by GE Healthcare, and Polymer beads manufactured by JSR Life Science. Can be mentioned.
  • the immobilized carrier may be subjected to various surface treatments useful for immobilizing the probe.
  • Non-limiting examples of surface treatment are based on reactive groups such as avidin or a derivative thereof, biotin or a derivative thereof, alkin, azide, epoxy, hydroxyl group, amino group, carboxyl group, succinimide group, tosyl group, protein A and protein G. Including modifications and the like.
  • the probe may also have modifications useful for immobilization on the substrate or immobilized carrier.
  • modifications include modifications with avidin or its derivatives, biotin or its derivatives, alkynes, azides, phenolic OH groups, hydroxyl groups, amino groups, carboxyl groups, His tags, antibodies and the like.
  • the probe is attached to biotin via a spacer, the immobilized carrier is avidinized, and the probe and the immobilized carrier are attached by biotin-avidin interaction.
  • the spacer does not inhibit the interaction between the immobilized substance (for example, a peptide) and the antibody and the interaction between the reactive group and the group that reacts with the reactive group, and is non-cleavable in the use situation of the biochip of the present invention.
  • the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a carbon chain and PEG.
  • the length of the spacer is not limited, and may be, for example, 5 to 150 ⁇ , 6 to 100 ⁇ , 7 to 80 ⁇ , 8 to 60 ⁇ , 9 to 50 ⁇ , etc., and if it is a carbon chain, for example, directly from C1 to C20.
  • It may be the length of a chain alkyl, a linear alkyl of C3 to C10, a linear alkyl of C4 to C8, particularly a linear alkyl of C6, and if it is PEG, it may be, for example, a 2 to 24 mer or a 2 to 12 mer. It may be of 2 to 8 mer, especially 2 to 4 mer.
  • a biochip (biochip A) in which a carrier to which a probe is bound is immobilized on a hydrophilized substrate can be produced as follows. Specifically, for example, a substrate is produced by a step of hydrophilizing the substrate (hereinafter referred to as “step 1-1”), and then the substrate is provided with at least an immobilized substance and at least two in one molecule. The substance to be immobilized is fixed to the substrate by a step of spotting a photocrosslinking agent having a photoreactive group and a thickener and / or a surfactant and irradiating with light (hereinafter referred to as “step 1-2”). To become.
  • the hydrophilization treatment of the substrate is not particularly limited as long as it is a treatment for hydrophilizing the surface of the substrate.
  • a method of coating a substrate with silica, a surfactant or the like dissolved or suspended in a liquid by spin coating, coating, spraying, dipping or the like and then drying the substrate, plasma treatment, UV-ozone treatment, corona treatment or frame.
  • Examples include a method of coating with a polymer.
  • a method of chemically hydrophilizing by plasma treatment, UV-ozone treatment, corona treatment, frame treatment or the like capable of generating an ether group or the like is more preferable, and UV-ozone treatment is particularly preferable.
  • the method for forming the reaction area is not particularly limited, but a method of adhering the rubber composition or a ring previously formed of the resin material to the substrate by using an adhesive or the like, and injection molding of the substrate composed of the resin material. , Various resin molding methods such as vacuum forming, and a method of forming a ring by machine cutting or the like can be used.
  • the adhesive is not particularly limited as long as it does not affect the test sample or the biochemical reaction, and can be appropriately selected from commercially available adhesives.
  • step 1-2 at least the substance to be immobilized, a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule, and a thickener and / or a surfactant are latticed on the substrate. It includes a step of spotting a shape and a step of irradiating with light.
  • Biochip B The production of a biochip (Biochip B) having a coat layer and a reaction area surrounded by a boundary capable of holding a liquid inside thereof, for example, prevents non-specific adsorption and immobilizes a biological substance.
  • a substrate is manufactured by a step selected from a step of providing a coat layer for forming the substrate on the substrate and a step of forming a boundary on the substrate to provide a reaction area (hereinafter referred to as "step 2-1"), and then the substrate is manufactured.
  • a step of spotting at least the substance to be immobilized, a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule, a thickener and / or a surfactant on the substrate, and irradiating the substrate with light May include.
  • Step 2-1 is selected from a step of providing a coat layer for preventing non-specific adsorption on the substrate and immobilizing a biological substance, and a step of forming a boundary on the substrate and providing a reaction area. including. If these steps are included, the order of the steps can be changed arbitrarily. Further, a step of surface-treating the substrate may be included before the step of providing the coat layer.
  • the surface treatment method in the step of applying the surface treatment to the substrate is not particularly limited as long as it improves the adhesion between the substrate and the coat layer.
  • known surface modification methods such as plasma treatment, UV ozone treatment, and corona treatment can be mentioned.
  • Known methods for forming a coat layer for preventing non-specific adsorption to a substrate and immobilizing a biological substance include spin coating, coating, spraying, and immersion in a coating solution of a coating solution containing a water-soluble polymer.
  • the coating liquid can be prepared by dissolving a water-soluble polymer in a solvent.
  • the solvent water, a lower alcohol that mixes with water at an arbitrary ratio, or a mixture thereof can be used.
  • the lower alcohol methanol, ethanol and isopropanol are preferable. Above all, it is preferable to use a mixed solvent of ethanol and water as the solvent.
  • the concentration of the polymer in the coating liquid is not particularly limited, but the concentration of the polymer is, for example, 0.0001 to 10 parts by mass, preferably 0.001 to 1 part by mass, and the concentration of the photocrosslinking agent is, for example, the polymer. On the other hand, it can be 1 to 20 parts by mass, preferably 2 to 10 parts by mass.
  • the coating liquid containing the polymer preferably contains a photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule.
  • the "photoreactive group” means a group that generates radicals by irradiating with light.
  • the photocrosslinking agent can form a covalent bond with an amino group, a carboxyl group, a carbon atom constituting an organic compound, or the like by generating a radical of a photoreactive group by irradiation with light.
  • a photoreactive group and / or a group capable of covalent bond or coordination bond with the surface of the substrate is introduced into the polymer without using the photocrosslinking agent or together with the photocrosslinking agent. Therefore, it is also possible to bond the substrate to the polymer by utilizing the group of the polymer.
  • the water-soluble polymer and the photocrosslinking agent contained in the coat layer of the present invention are known by themselves, can be produced by a known production method, and are commercially available.
  • the film thickness of the coat layer is not particularly limited, but is preferably 1 nm to 10 ⁇ m, more preferably 2 nm to 1 ⁇ m, and particularly preferably 10 nm to 100 nm.
  • the coat layer it is preferable to stabilize the coat layer by coating the coat layer as described above and then aging under constant temperature and humidity conditions.
  • the temperature is preferably 5 ° C to 40 ° C, more preferably 20 ° C to 30 ° C.
  • the humidity is preferably 40% to 80%, more preferably 50% to 70%.
  • the aging period is preferably 1 day to 1 month, more preferably 3 days to 2 weeks.
  • the method for forming a boundary on the substrate is not particularly limited, but a method of adhering a ring previously formed from the rubber composition or the resin material to the substrate using an adhesive or the like, or a substrate made of the resin material can be used.
  • Various resin molding methods such as injection molding and vacuum molding, and a method of molding a ring by machine cutting or the like can be used.
  • the adhesive is not particularly limited as long as it does not affect the test sample or the biochemical reaction, and can be appropriately selected from commercially available adhesives.
  • step 2-2 at least the substance to be immobilized, the photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule, and the thickener and / or the surfactant are latticed on the substrate. It includes a step of spotting in a shape, a step of irradiating with light, and a step of removing unreacted components.
  • a known method can be used as the immobilization method.
  • the magnetic fine particles as an immobilization carrier and a pre-prepared substance to be immobilized are reacted in a solution such as a known buffer solution appropriately selected to immobilize the substance to be immobilized.
  • a solution such as a known buffer solution appropriately selected to immobilize the substance to be immobilized.
  • examples thereof include, but are not limited to, a method for recovering magnetic fine particles.
  • the magnetic fine particles may be washed with a known buffer solution in advance, or may be washed with a known buffer solution when recovering the magnetic fine particles on which the substance to be immobilized is immobilized.
  • the photocrosslinking agent having at least two photoreactive groups in one molecule used in step 1-2 or 2-2 is not particularly limited.
  • the photoreactive group contained in the photocrosslinking agent include an azido group ( ⁇ N3) , an acetyl group, a benzoyl group, a diazirine group and the like.
  • ⁇ N3 azido group
  • acetyl group an acetyl group
  • benzoyl group a diazirine group and the like.
  • the nitrogen radical when the nitrogen molecule is irradiated with light, a nitrogen radical is generated, and the nitrogen radical is bonded not only to a functional group such as an amino group or a carboxyl group but also to a carbon atom constituting an organic compound. It is possible and preferable because it can form a covalent bond with most organic substances.
  • photocrosslinking agent having an azido group examples include diazidothrilben.
  • the photocrosslinking agent is preferably water-soluble.
  • water-soluble for a photocrosslinking agent means that an aqueous solution having a concentration of 0.5 mM or more, preferably 2 mM or more can be provided.
  • the immobilized substance or the immobilized carrier on which the immobilized substance is immobilized and the photocrosslinking agent are dispersed or dissolved in a solution.
  • the solution is not particularly limited, but a known buffer solution can be used. Examples of the buffer solution include PBS buffer, HEPES buffer, Tris buffer, MES buffer, and the like.
  • the buffer solution include PBS buffer, HEPES buffer, Tris buffer, MES buffer, and the like.
  • phosphate buffered saline is preferable, and the immobilized substance is used.
  • a HEPES buffer solution is preferable in order to prevent aggregation of the immobilized carrier.
  • a solution in which the substance to be immobilized and the photocrosslinking agent are dispersed or dissolved may be referred to as a stamp solution.
  • the concentration of the immobilized substance is not particularly limited, but is preferably 0.05 mg / mL to 2 mg / mL, preferably 0.1 mg / mL to 1 mg / mL when the immobilized substance is not immobilized on the immobilized carrier. mL is more preferred.
  • the immobilized substance is immobilized on the immobilized carrier, it is preferable to react the immobilized substance with the immobilized carrier at 0.5 mg / mL to 50 mg / mL, and 1 mg / mL to 25 mg / mL is preferable.
  • the immobilized carrier on which the substance to be immobilized is immobilized is preferably used at 1 mg / mL to 10 mg / mL, and more preferably 2.5 mg / mL to 7.5 mg / mL.
  • the concentration of the photocrosslinking agent is not particularly limited, but is preferably 0.01 mg / mL to 1 g / mL, more preferably 0.2 mg / mL to 0.2 g / mL.
  • the solution in which the immobilized substance or the immobilized carrier on which the immobilized substance is immobilized and the photocrosslinking agent are dispersed or dissolved in the solution may further contain a thickener and / or a surfactant. preferable.
  • a thickener By including a thickener, the size of the spot can be adjusted when the solution is spotted on the substrate. More specifically, the higher the concentration of the thickener in the solution, the smaller the spot size (contact area with the substrate) tends to be when the same volume of solution is spotted.
  • a surfactant it is possible to prevent the substance to be immobilized from accumulating at the gas-liquid interface and suppressing the substance to be immobilized at the spot from being localized at the edge of the spot.
  • the surfactant also contributes to the improvement of the affinity with the substrate, and the higher the concentration of the surfactant in the solution, the larger the spot size (contact area with the substrate) when the same volume of solution is spotted. It tends to grow. Therefore, by adjusting the concentrations of the thickener and the surfactant, a stamp of any size can be formed.
  • the thickener is not particularly limited as long as it does not affect the test sample or biochemical reaction, and a commercially available thickener can be used.
  • examples thereof include cellulose-based compounds and derivatives thereof, polysaccharides, vinyl-based compounds, vinylidene-based compounds, polyglycol-based compounds, polyvinyl alcohol-based compounds, polyalkylene oxide-based compounds, and specifically, gellan gum, xanthan gum, and curd.
  • the concentration of the thickener is not particularly limited, but when polyvinyl alcohol is used, for example, it is preferably 0.01 part by weight to 1 part by weight, and 0.02 part by weight to 0.5 part by weight with respect to 100 parts by weight of the solution. Parts are more preferable, and 0.03 parts by weight to 0.3 parts by weight are particularly preferable.
  • the surfactant is not particularly limited as long as it does not affect the test sample or the biochemical reaction, and a commercially available nonionic surfactant can be used, and polyoxyethylene (10) octylphenyl can be used.
  • Ether Triton X-100
  • Polyoxyethylene (8) octylphenyl ether Triton X-114
  • Polyoxyethylene sorbitan monolaurate Tween20
  • Polyoxyethylene sorbitan monooleate [Tween80] Polyoxyethylene ( 23) Lauryl ether [Brij35], polyoxyethylene (20) lauryl ether [Brij58], Pluronic F-68, polyethylene glycol, etc., or a mixture of two or more thereof can be used, and Triton X-100, Tween 20, etc. can be used. It is preferable to use one or more kinds selected from Tween 80, and it is more preferable to use Tween 20.
  • the concentration of the surfactant is not particularly limited, but for example, when Tween 20 is used, it is preferably 0.001 part by weight to 1 part by weight, preferably 0.005 part by weight to 0.5 part by weight, based on 100 parts by weight of the solution. Is more preferable, and 0.01 part by weight to 0.3 part by weight is particularly preferable.
  • the viscosity of the stamp liquid is not particularly limited as long as it forms a spot having a desired shape, but is, for example, 0.4 mPa ⁇ s to 40 mPa ⁇ s, preferably 0.5 mPa / s to 10 mPa ⁇ s at 25 ° C. , More preferably 0.6 mPa ⁇ s to 4 mPa ⁇ s, particularly preferably 0.8 mPa ⁇ s to 2 mPa ⁇ s, especially about 1.3 mPa ⁇ s.
  • the viscosity of the stamp liquid is 0.6 mPa / s to 10 mPa ⁇ s, 0.8 mPa ⁇ s to 4 mPa ⁇ s, 1.0 mPa ⁇ s to 2 mPa ⁇ s, 1.12 mPa ⁇ s to 2 mPa ⁇ s at 25 ° C.
  • the method of spotting the substance to be immobilized on the substrate or the immobilized carrier on which the substance to be immobilized is immobilized and the photocrosslinking agent is not particularly limited, and for example, a method of spotting with a non-contact type dispenser, a micropipette.
  • a method of spotting by a pin method, a method of spotting by a pin method, a method of spotting by a piezoelectric method, or the like can be used.
  • the method of spotting with a non-contact type dispenser can apply a more accurate amount of dispersion liquid to the substrate and is immobilized on each spot.
  • the non-contact dispenser has a nozzle diameter of 100-2000 times, preferably 150-1000 times, more preferably 200-700 times, particularly 500 times the average maximum diameter of the solid carrier. Can be used.
  • the diameter of the spot can be, for example, 400 ⁇ m to 800 ⁇ m, preferably 500 ⁇ m to 700 ⁇ m.
  • the coefficient of variation of the amount (volume) of the substance to be immobilized can be set to less than 11.8% by the spots produced by the non-contact type dispenser. Therefore, one aspect of the biochip of the present invention has a plurality of spots on which the substance to be immobilized is immobilized, and the coefficient of variation of the volume of the substance to be immobilized on each spot is less than 11.8%. For example, 11.5% or less, 11.0% or less, 10.5% or less, 10.0% or less, 9.5% or less, 9.0% or less, 8.5% or less, 8.0% or less.
  • the coefficient of variation of the volume of the substance to be immobilized per spot is the volume of the solid content per spot. The coefficient of variation can be used as a substitute.
  • the volume of solids present in the spot is measured, for example, from a 3D image obtained by a laser microscope (especially a shape analysis laser microscope manufactured by KEYENCE, VK-X series, etc.) using image analysis software (manufactured by KEYENCE, a multi-analysis application, etc.). can do.
  • a laser microscope especially a shape analysis laser microscope manufactured by KEYENCE, VK-X series, etc.
  • image analysis software manufactured by KEYENCE, a multi-analysis application, etc.
  • Immobilization of the substance to be immobilized or the immobilized carrier on which the substance to be immobilized is immobilized can be performed by irradiating light after coating, preferably after drying the coated solution.
  • the light may be any light as long as the photoreactive group used can generate a radical, and in particular, when an azido group is used as the photoreactive group, ultraviolet rays (for example, a wavelength of 10 to 400 nm) are preferable.
  • the irradiation time can be, for example, 10 seconds to 120 minutes, preferably 30 seconds to 60 minutes, and more preferably 1 minute to 30 minutes. Since the substance to be immobilized is rapidly immobilized by irradiation, the irradiation time is almost equal to the time required for immobilization.
  • the dose of the light beam to be irradiated is not particularly limited, but is usually about 1 mW to 100 mW per 1 cm 2 .
  • the photoreactive group contained in the photocrosslinking agent (and, if the polymer has a photoreactive group, the photoreactive group) generates a radical, and the substance to be immobilized is immobilized on the immobilized carrier. If not immobilized, the polymer layer and the immobilized substance are crosslinked with a photocrosslinking agent, and if the immobilized substance is immobilized on the immobilized carrier, the polymer layer and the immobilized substance and / or the immobilized carrier are immobilized. Can be combined via and.
  • the substrate can be washed by a known method to remove unreacted components and the like, but such washing is not essential, and the product is commercialized with the stamp liquid remaining. May be good. In this way, a biochip on which the desired substance to be immobilized is immobilized can be obtained.
  • components of the stamping liquid such as a thickener and / or a surfactant may be attached to the spot of the biochip in addition to the immobilized substance to be immobilized. The residue of the stamp liquid can be appropriately washed and removed before the use of the biochip.
  • Allergic disease determination system Another aspect of the present invention is the probe and the biological sample obtained by contacting two or more probes selected from allergens and fragments thereof with a biological sample collected from a subject.
  • Data acquisition unit that acquires data related to the reaction with the antibody contained in the above and data related to the type of the reacted antibody,
  • Data processing unit that inputs the above data into the prediction model and obtains the prediction result.
  • a determination unit for determining an allergic disease based on the prediction result and an output unit for outputting the determination result are provided, and the prediction model can be used for at least training data related to the reaction with an antibody for the probe and the type of bound antibody.
  • An allergic disease determination system (hereinafter, referred to as "system of the present invention”), which is a non-linear model or a number model having two or more explanatory variables and two or more terms, created using the training data. ).
  • the allergic disease determination system described below is intended to illustrate the present invention, and is not intended to limit the present invention. Further, the configurations common to the determination method of the present invention, such as allergic diseases, probes, data on the reaction between the probe and the antibody contained in the biological sample, data on the type of antibody, and a prediction model in the system of the present invention, are described.
  • the determination method of the present invention is as described above.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a functional configuration of an allergic disease determination system 100.
  • the allergic disease determination system 100 includes a data acquisition unit 101, a data processing unit 102, a determination unit 103, and an output unit 104.
  • the data acquisition unit 101 acquires and stores data relating to the reaction between the probe and the target antibody and data relating to the type of the reacted antibody. Other data used in the predictive model can also be acquired and stored as needed.
  • the data may be acquired directly from the detector that detects the reaction between the probe and the target antibody, may be performed from an input device such as a keyboard or a touch panel, or the digitized data may be obtained from a storage medium interface or the storage medium interface.
  • the data is stored in any writable data storage device, such as a ROM, RAM, magnetic disk, magneto-optical disk, or the like.
  • the data processing unit 102 accesses the data stored in the data acquisition unit 101, reads out the information necessary for the prediction model, inputs the information into the prediction model stored in the data processing unit 101, and obtains the prediction result.
  • the prediction result is sent to the determination unit 103, which is associated with the determination result, and the determination result is sent to the output unit 104.
  • the association with the determination result can be performed by various methods. For example, when determining discontinuous matters (for example, severe / mild binary classification) with a prediction model using a prediction formula, the prediction result (prediction value) obtained by the prediction formula is set as a preset reference value (for example). For example, by comparing with the cutoff value, etc.), it is possible to link with the determination result.
  • the prediction model is a mode in which the judgment items are directly output (for example, the output of discontinuous items using a decision tree or the output of continuous items using a prediction formula (for example, ASCA value)). Etc.), the prediction result can be used as the judgment result as it is.
  • the output unit 104 outputs the sent determination result.
  • the output format is not particularly limited, and for example, display on various displays, output by a printer, transmission of electronic data, storage in a transferable storage medium, and the like are possible.
  • the output unit 104 can also be configured to store the determination result sent from the determination unit 103.
  • the system of the present invention may have additional functions and configurations useful for determining allergic diseases.
  • the system of the present invention can output the related information of the determination items together with the determination result (related information output function).
  • the determination results are not only for mild or severe information, but also for, for example, related to various provocation tests (such as food oral challenge tests). It may contain information.
  • Such related information includes, for example, information that a provocation test can be performed in an outpatient setting if it is mild, and that, for example, a provocation test should or should not be performed in a hospital if it is severe. Information etc. can be mentioned.
  • the predictive model can be updated as appropriate, such as by optimizing with additional training data. Even if the user manually updates the predictive model, the system automatically accesses the server where the updated predictive model is stored and obtains the updated predictive model. May be (predictive model update function).
  • the reference value used for associating with the determination result may be changeable.
  • the system of the present invention may be configured so that the reference value can be selected from a plurality of candidates, or may be configured so that the user can input the reference value. Therefore, the system of the present invention may have, for example, a function of causing the determination unit 103 to select the reference value from a plurality of candidates by the user and a function of causing the user to input the reference value (reference value changing function).
  • the system of the present invention may include a detector for detecting the reaction between the probe and the target antibody.
  • the detection unit may include a detector that detects the reaction between the probe and the target antibody, a transmitter that transmits data on the reaction between the probe and the target antibody, data on the type of antibody, and the like to the data acquisition unit.
  • the system of the present invention may also include a user interface that enables system operation and data input, a communication interface that enables external information to be taken in via a power source, the Internet, and the like.
  • the determination unit 103 presents the candidate of the reference value stored in the storage unit to the user (S1).
  • the user selects a reference value
  • the selected reference value is stored in the storage unit of the determination unit 103.
  • the data acquisition unit 101 asks the user to input data, and the input data is stored in the storage unit of the data acquisition unit 101 (S2).
  • the data processing unit 102 reads the data stored in the storage unit of the data acquisition unit 101 and the prediction model stored in the storage unit of the data processing unit 102 (S3), and inputs the data to the prediction model (S3).
  • the predicted value is obtained (S5).
  • the predicted value is sent to the output unit 104, the predicted value is output (S10), and the process ends.
  • the obtained predicted value can be directly used as an index for determining an allergic disease.
  • the predicted value is continuous (for example, a calculation result by a prediction formula), it is possible to assist a sensory judgment such as a sense of level.
  • the predicted value and the judgment result are output (Yes in S6, Yes in S7), the predicted value is sent to the judgment unit 103 and compared with the reference value stored in the storage unit of the judgment unit 103 and selected by the user. (S8). The predicted value and the determination result are sent to the output unit 104, the predicted value and the determination result are output (S9), and the process ends.
  • the determination result includes information related to the determination item (for example, information on whether the symptom when exposed to the allergen is mild or severe) and information accompanying the information (for example, the embodiment of the provocation test as described above). Information about) etc. may be included.
  • FIG. 3 is a block diagram showing an example of a hardware configuration of a computer 200 that realizes a stand-alone system of the present invention.
  • the computer 200 includes a monitor 210, a communication interface 220, a CPU 230, a RAM 240 and a storage 250.
  • the storage 250 stores a determination program 251 for executing various processes of the system of the present invention, acquired data 252 used for determination of allergic diseases, a prediction model 253, and a reference value 254.
  • the CPU 230 reads the code of the determination program 251 stored in the storage 250 and executes it. Therefore, the CPU 230 realizes the functions of the data processing unit 102 and the determination unit 103 in the system of the present invention.
  • the storage 250 realizes the storage functions of the data acquisition unit 101, the processing unit 102, and the determination unit 103 in the system of the present invention.
  • the RAM 240 stores intermediate data and the like at the time of program execution.
  • the monitor 210 realizes functions such as an output unit 104 and a user interface.
  • the communication interface 220 realizes functions such as a data acquisition unit 101 and an output unit 104. Further, by reading the code of the determination program 251, a part or all of the processing related to the system of the present invention may be realized by an OS running on a computer or other software.
  • the present invention also includes a program that realizes the determination method and / or the index acquisition method of the present invention by a computer or the like, and a storage medium (for example, a flexible disk, a hard disk, a magnetic disk, a CD-ROM, MO, etc.) that stores the program. It relates to magneto-optical disks such as DVDs and BDs, magnetic tapes, and semiconductor memories such as flash memories).
  • Example 1 Production of biochip> 2 minutes at an irradiation distance of 50 mm using a UV-ozone irradiation device (Sen Special Light Source, SSP16-110, UV lamp: SUV110GS-36L) on a polycarbonate sheet (Mitsubishi Gas Chemical Company, MR58U, thickness 0.8 mm) Irradiated.
  • a polymer of polyethylene glycol monomethacrylate polyethylene glycol part molecular weight 350
  • 4,4'-diazidostilbene-2,2' 0.5 parts by weight of a polymer of polyethylene glycol monomethacrylate (polyethylene glycol part molecular weight 350) in a 75% ethanol aqueous solution.
  • -Disulfonic acid manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 98%, hereinafter referred to as stilbene
  • a spin coater MS-A100 manufactured by MIKASA
  • 15 ⁇ L of this coating liquid was coated on the UV-irradiated polycarbonate under the conditions of 800 rpm for 5 seconds and 5000 rpm for 10 seconds.
  • irradiation was performed at 120 mW / cm 2 for 10 minutes using a UV irradiation device (CL-1000 manufactured by UVP).
  • An O-ring (14 ⁇ ) made of silicon rubber was adhered to the coated substrate with an adhesive to form a reaction area. Aging was performed at a temperature of 25 ° C. and a humidity of 65% for 4 days to obtain a biochip substrate.
  • Sodium chloride is 0.8 parts by weight, potassium chloride is 0.02 parts by weight, disodium hydrogen phosphate dodecahydrate is 0.29 parts by weight, and potassium dihydrogen phosphate is 0.02 parts by weight.
  • Each was dissolved in ultrapure water to obtain a PBS solution.
  • 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid was dissolved in ultrapure water so as to be 0.59 parts by weight to obtain a HEPES solution.
  • polyvinyl alcohol manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 160-03055
  • Tween 20 manufactured by Sigma-Aldrich, P7949-100ML
  • a solvent for the stamp solution was obtained.
  • aminohexyl ends with a partial peptide of ⁇ s1-casein, ⁇ -casein, ⁇ -lactoglobulin, and ⁇ s1-casein (20 overlapping fragments consisting of 15 amino acid residues (SEQ ID NOs: 2-21)).
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of the partial peptide immobilized on the beads. The structure of the biotinylated peptide is shown below.
  • Bisazid was dissolved in ultrapure water to prepare a 10 mg / mL bisazid solution.
  • the 10 mg / mL bisazide solution was diluted 5-fold.
  • the bisazide solution was dissolved in the stamp solution so as to be 4.8 parts by weight.
  • a stamp solution containing one type of partial peptide is latticed on a biochip substrate so that a total of 81 spots are 9 ⁇ 9. Spotted by the point-type multi-point dispensing spot method. After the spot, it was dried at 0.09 MPa for 10 minutes using a vacuum dryer.
  • a biochip After drying, in order to immobilize the beads to which the partial peptide is attached to the substrate with a photocrosslinking agent, a biochip is obtained by irradiating with a UV irradiation device (UVP, CL-1000) at 4 mW / cm 2 for 10 minutes. rice field.
  • UV irradiation device UVP, CL-1000
  • Example 2 Measurement using a chip> Using the biochip produced in Example 1, the reaction between the IgE antibody and IgG4 antibody in the serum collected from the subject and the partial peptide immobilized on the biochip was measured.
  • the composition of the subjects is shown in Table 3 below. Subjects with an immunocap-specific IgE (casein) of less than 0.35 are non-patients, subjects with an immunocap-specific IgE (casein) of 0.35 or more and an ASCA value of 2 or less, and immunocap-specific IgE (casein). ) was 0.35 or more, the total milk load was 6 mL or more, and the ASCA value was 11 or less as mild patients, and the others were severe patients.
  • test sample was removed by suction and washed with TBS-T solution. After washing, ALP-labeled anti-human IgE monoclonal antibody (Abcam, ab99805) or ALP-labeled anti-human IgG4 monoclonal antibody (Abcam) diluted 2000-fold with CanGetSignalImmunoreactionEnhancerSolution2 (Toyobo, NKB-301). , Ab99822) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 4 minutes while shaking. The antibody was removed by suction and washed with TBS-T.
  • a predictive model was created by the following method.
  • an and cn are coefficients
  • xn is an explanatory variable
  • h () is a hinge function
  • n is a natural number.
  • Each coefficient and explanatory variable are independent for each prediction model, and are not always the same among different prediction models.
  • the coefficient a1 of the following prediction model 1-1 is independent of the coefficient a1 of the prediction model 1-2, and may take different values.
  • a numerical value obtained by normally converting the measured value (for example, the emission intensity of the probe) was used as an explanatory variable.
  • ⁇ Predictive model 1-1 Construction of a prediction model assuming a binomial distribution by Lasso regression, with the emission intensity of each probe, the subject's age, total IgE, and immunocap-specific IgE (casein, milk) as explanatory variables and mild or severe as the objective variable.
  • the non-patients and mildly ill patients in Table 3 were regarded as mildly ill, and the severely ill patients were classified as severely ill (the same applies to the prediction models 1-2 to 1-8).
  • the interaction term product of two variables
  • Predictive model 1-2 A prediction model was constructed in the same manner as the prediction model 1-1 except that only the emission intensity of each probe was used as an explanatory variable, and a prediction model 1-2 represented by the following prediction formula was obtained. a1 + x1 x a2 + x2 x x3 x a3 + x4 x x5 x a4 + x3 x x6 x a5 + x7 x x x8 x a6 + x7 x x x9 x a7 + x10 x x11 x a8 + x10 x x12 x a9 + x13 x x11 x a10 + x13 x 14 x a11 + x13 x 13 x a14 + x1 x x17 x a15 + x18 x x9 x a16 + x18 x x19 x a17 + x5
  • Predictive model 1-3 A predictive model was constructed in the same manner as the predictive model 1-1 except that the subject's age, total IgE, and immunocap-specific IgE (casein, milk) were used as explanatory variables, and the predictive model 1 represented by the following predictive formula 1 I got -3. a1 + x1 x a2 + x2 x a3 In the above prediction formula, x1 is immunocap-specific IgE (milk) and x2 is immunocap-specific IgE (casein).
  • ⁇ Predictive model 1-4> A classification tree was constructed by the CART method using the same explanatory variables and objective variables as in the prediction model 1-1. After first constructing a large tree, the mean value of the misclassification rate is calculated by 10-fold cross validation and pruned at the minimum position to obtain the prediction model 1-4 represented by the decision tree in Fig. 5. rice field.
  • x1 is an immunocap-specific IgE (milk)
  • x2 to x4 are different probe (IgE) emission intensities.
  • ⁇ Predictive model 1-5> Using the same explanatory variables and objective variables as the prediction model 1-3, the prediction model 1-5 represented by the decision tree in FIG. 6 was obtained by the same procedure as the prediction model 1-4.
  • x1 is immunocap-specific IgE (milk).
  • Predictive model 1-6 Using the same explanatory variables and objective variables as the prediction model 1-1, a binomial distribution was assumed by the MARS method, and a model considering the interaction between the two elements was constructed. The position where the R-square value was maximized was obtained by 10-fold cross validation, and the prediction model 1-6 represented by the following prediction formula was obtained.
  • x1 is immunocap-specific IgE (milk)
  • x2 is the emission intensity of the probe (IgG4)
  • x3 is total IgE
  • immunocap-specific IgE casein
  • x4 to x5 are different probes (IgE). Is the emission intensity of.
  • ⁇ Predictive model 1-7> Using the same explanatory variables and objective variables as the prediction model 1-2, the prediction model 1-7 represented by the following prediction formula was obtained by the same procedure as the prediction model 1-6. a1 + h (x1-c1) x a2 + h (c1-x1) x a3 + h (x2-c2) x a4 + h (c3-x1) x x2 x a5 + h (x1-c4) x a6
  • x1 to x2 are emission intensities of probes (IgE) different from each other.
  • ⁇ Predictive model 1-8> Using the same explanatory variables and objective variables as the prediction model 1-3, the prediction model 1-8 represented by the following prediction formula was obtained by the same procedure as the prediction model 1-6. a1 + h (c1-x1) x a2 + h (x2-c2) x a3 + h (x2-c3) x h (x3-c4) x a4
  • x1 is immunocap-specific IgE (milk)
  • x2 is immunocap-specific IgE (casein)
  • x3 is total IgE.
  • ROC curves and dot histograms are obtained from the predicted values of each subject obtained by the prediction models 1-1, 1-2, 1-4, 1-6, 1-7. Created. In addition, ROC curves and dot histograms (FIGS. 11 to 12, 15 to 16, 21 to 22) were also created from the predicted values of the subjects obtained from the prediction models 1-3, 1-5, and 1-8 as comparison targets. Table 4 summarizes the AUC (Area Under Curve) of each prediction model.
  • Prediction of ASCA value ⁇ Predictive model 2-1> A normal distribution was assumed by LASSO regression with the emission intensity of each probe, the subject's age, total IgE, immunocap-specific IgE (casein, milk), and IgE dilution rate as explanatory variables, and the subject's ASCA value as the objective variable. I built a model. For the emission intensity of each probe, the interaction term (product of two variables) between the two elements was added to the explanatory variables. Leave one out cross validation was performed, and the prediction model 2-1 represented by the following prediction formula was obtained at the position where the prediction error was minimized.
  • Predictive model 2-2> A prediction model was constructed in the same manner as the prediction model 2-1 except that the subject's age, total IgE, and immunocap-specific IgE (casein, milk) were used as explanatory variables, and the prediction model 2 represented by the following prediction formula was used. I got -2. a1 + x1 x a2 + x2 x a3 + x3 x a4 + x4 x a5
  • x1 is the age of the subject
  • x2 is immunocap-specific IgE (milk)
  • x3 immunocap-specific IgE (casein)
  • x4 is total IgE.
  • ⁇ Predictive model 2-3> A regression tree was constructed by the CART method using the same explanatory variables and objective variables as in the prediction model 2-1. First, after constructing a large tree, the average value of the misclassification rate is calculated by 10-fold cross validation, and pruning is performed at the minimum position to create the prediction model 2-3 represented by the decision tree in Fig. 23. Obtained.
  • x1 is the emission intensity of the probe (IgE)
  • x2 is the immunocap-specific IgE (milk).
  • ⁇ Predictive model 2-4> Using the same explanatory variables and objective variables as the prediction model 2-2, the prediction model 2-4 represented by the decision tree in FIG. 24 was obtained by the same procedure as the prediction model 2-3. In the figure, x1 is immunocap-specific IgE (milk).
  • ⁇ Predictive model 2-5> Using the same explanatory variables and objective variables as the prediction model 2-1 we assumed a normal distribution by the MARS method and constructed a model considering the interaction between the two elements. The position where the R-square value was maximized was obtained by generalized cross validation, and the prediction model 2-5 represented by the following prediction formula was obtained.
  • ⁇ Predictive model 2-6> Using the same explanatory variables and objective variables as the prediction model 2-2, the prediction model 2-6 represented by the following prediction formula was obtained by the same procedure as the prediction model 1-6. a1xh (c1-x1) x a2 + h (c2-x2) x h (x1-c1) x a3 In the above prediction formula, x1 is immunocap-specific IgE (casein) and x2 is immunocap-specific IgE (milk).
  • Allergic disease determination system 101: Data acquisition unit 102: Data processing unit 103: Determination unit 104: Output unit 200: Computer 210: Monitor 220: Communication interface 230: CPU 240: RAM 250: Storage 251: Judgment program 252: Acquired data 253: Predictive model 254: Reference value

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Abstract

【解決手段】本発明は、アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させる工程、前記プローブと、生体試料に含まれる抗体との反応を検出する工程、前記プローブと反応した抗体の種類を判別する工程、前記プローブの少なくとも２種の各々についての抗体との反応に係るデータ及び結合した抗体の種類に係るデータを予測モデルに入力し、予測結果を得る工程、及び前記予測結果に基づいて、アレルギー疾患を判定する工程を含み、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである、アレルギー疾患の判定方法等に関する。

Description

アレルギー疾患の判定方法及び判定システム
　本発明は、アレルギー疾患の判定方法及びこれに使用するキット、バイオチップ、システム等に関する。
　アレルギー疾患の罹患者は増加傾向にあり、その対策が課題となっている。アレルギー疾患は、その原因となるアレルゲンが数多く存在し、患者により症状や治療への反応性も様々であるなど、多様性に富んでいる。また、アレルギーに関する研究はこの数十年で飛躍的に進歩したが、その病態は想像以上に複雑であり、依然不明な部分が多い。このような多様性や複雑性がアレルギー疾患への対応を困難なものにしている。疾患への対応には正確な診断が重要となるが、多様で複雑なアレルギー疾患の診断手法は未だ十分確立されているとは言い難い。最も一般的なアレルギー疾患の診断手法としては、アレルゲン特異的ＩｇＥの測定が挙げられるが、近年では、ＩｇＥのほかにＩｇＧ４の測定結果を組み合わせる試みも行われている（特許文献１）。
WO2010/110454
　優れたアレルギー疾患の診断手法が求められている。
　一態様において、本発明は以下を提供する。
［１］
　アレルギー疾患の判定方法であって、
　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させる工程、
　前記プローブと、生体試料に含まれる抗体との反応を検出する工程、
　前記プローブと反応した抗体の種類を判別する工程、
　前記プローブの少なくとも２種の各々についての抗体との反応に係るデータ及び結合した抗体の種類に係るデータを予測モデルに入力し、予測結果を得る工程、及び
　前記予測結果に基づいて、アレルギー疾患を判定する工程
を含み、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである、方法。
［２］
　アレルギー疾患の判定が、アレルギー疾患が軽症か重症かの判定及び総ＡＳＣＡ値の予測から選択される、［１］に記載の方法。
［３］
　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させて得られた、前記プローブと生体試料に含まれる抗体との反応に係るデータ及び反応した抗体の種類に係るデータを取得する工程、及び
前記データを予測モデルに入力し、予測結果を得る工程、
を含み、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである、アレルギー疾患判定のための指標を得る方法。
［４］
　抗体の種類がＩｇＥ及びＩｇＧ４から選択される、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
　プローブが、アレルゲンのオーバーラップ断片を含む、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
　プローブが固相化されている、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
　抗体との反応に係るデータが、抗体との反応強度である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
　予測モデルの作成に、追加の訓練データが用いられる、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
　アレルゲンが、食物アレルゲン、吸入性アレルゲン及び接触性アレルゲンから選択される、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
　食物アレルゲンが、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミン、リゾチーム、グリアジン、アミラーゼインヒビター、アルブミン、グロブリン、グルテン及びトロポミオシンから選択される、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
　対象から採取した生体試料が、採取時期の異なる２種以上の生体試料を含み、アレルギー疾患を判定する工程が、前記２種以上の生体試料について得られた予測結果を相互に比較することを含む、アレルギー疾患のモニタリングに使用する、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
　アレルギー疾患が食物アレルギーである、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブを含む、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
［１４］
　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブが基体に固定された、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の方法に使用するためのバイオチップ。
［１５］
　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させて得られた、前記プローブと、生体試料に含まれる抗体との反応に係るデータ及び反応した抗体の種類に係るデータを取得するデータ取得部、
前記データを予測モデルに入力し、予測結果を得るデータ処理部、
前記予測結果に基づきアレルギー疾患の判定を行う判定部、及び
判定結果を出力する出力部
を備え、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである、アレルギー疾患判定システム。
［１６］
　［１］～［１２］のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
［１７］
　［１６］に記載のプログラムを記憶した記憶媒体。
　本発明は、その態様に応じて、例えば、以下の１又は２以上の効果を有する。
（１）アレルギー疾患の症状の程度を予測することができる。
（２）食物経口負荷試験などの誘発試験に対する反応を予測することができる。
（３）従来の特異的ＩｇＥに基づく手法に比べ診断能が優れている。
図１はアレルギー疾患判定システムの機能的な構成を示すブロック図である。 図２は本発明のシステムにおけるデータ処理の一例を示したフローチャートである。 図３はスタンドアロン型の本発明のシステムを実現するコンピュータのハードウェア構成の一例を示すブロック図である。 図４はビーズに固定された部分ペプチドの模式図である。 図５は予測モデル１－４の決定木である。予測結果の「１」は重症、「０」は軽症を意味する。 図６は予測モデル１－５の決定木である。予測結果の「１」は重症、「０」は軽症を意味する。 図７は予測モデル１－１により得た各被験者の予測値から作成したＲＯＣ曲線である。 図８は予測モデル１－１により得た各被験者の予測値から作成したドットヒストグラムである。 図９は予測モデル１－２により得た各被験者の予測値から作成したＲＯＣ曲線である。 図１０は予測モデル１－２により得た各被験者の予測値から作成したドットヒストグラムである。 図１１は予測モデル１－３により得た各被験者の予測値から作成したＲＯＣ曲線である。 図１２は予測モデル１－３により得た各被験者の予測値から作成したドットヒストグラムである。 図１３は予測モデル１－４により得た各被験者の予測値から作成したＲＯＣ曲線である。 図１４は予測モデル１－４により得た各被験者の予測値から作成したドットヒストグラムである。 図１５は予測モデル１－５により得た各被験者の予測値から作成したＲＯＣ曲線である。 図１６は予測モデル１－５により得た各被験者の予測値から作成したドットヒストグラムである。 図１７は予測モデル１－６により得た各被験者の予測値から作成したＲＯＣ曲線である。 図１８は予測モデル１－６により得た各被験者の予測値から作成したドットヒストグラムである。 図１９は予測モデル１－７により得た各被験者の予測値から作成したＲＯＣ曲線である。 図２０は予測モデル１－７により得た各被験者の予測値から作成したドットヒストグラムである。 図２１は予測モデル１－８により得た各被験者の予測値から作成したＲＯＣ曲線である。 図２２は予測モデル１－８により得た各被験者の予測値から作成したドットヒストグラムである。 図２３は予測モデル２－３の決定木である。予測結果の数字はＡＳＣＡ値の十分率を表す。 図２４は予測モデル２－３の決定木である。予測結果の数字はＡＳＣＡ値の十分率を表す。 図２５は予測モデル２－１により得た各被験者の予測値及び観測値から作成した散布図である。 図２６は予測モデル２－２により得た各被験者の予測値及び観測値から作成した散布図である。 図２７は予測モデル２－３により得た各被験者の予測値及び観測値から作成した散布図である。 図２８は予測モデル２－４により得た各被験者の予測値及び観測値から作成した散布図である。 図２９は予測モデル２－５により得た各被験者の予測値及び観測値から作成した散布図である。 図３０は予測モデル２－６により得た各被験者の予測値及び観測値から作成した散布図である。
　以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、以下に説明する材料、構成等は本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨の範囲内で互いに組み合わせたり、種々改変することができるものである。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願及び他の出版物（オンライン情報を含む）は、その全内容を参照により本明細書に援用する。また、本明細書は、２０２０年９月７日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０２０－１５０１４２号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．アレルギー疾患の判定方法
　本発明の一側面はアレルギー疾患の判定方法（以下、「本発明の判定方法」と称することがある）に関する。本発明の判定方法は、
　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させる工程、
　前記プローブと、生体試料に含まれる抗体との反応を検出する工程、
　前記プローブと反応した抗体の種類を判別する工程、
　前記プローブの少なくとも２種の各々についての抗体との反応に係るデータ及び結合した抗体の種類に係るデータを予測モデルに入力し、予測結果を得る工程、及び
　前記予測結果に基づいて、アレルギー疾患を判定する工程
を含み、前記予測モデルは、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである。
　アレルギー疾患は、免疫システムがアレルゲンに対して過剰に反応する疾患であり、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、蕁麻疹、アナフィラキシーショック、薬物アレルギー等を含む。一態様において、アレルギー疾患はＩｇＥが関与する疾患である。別の態様において、アレルギー疾患はＩ型アレルギーに属する。特定の態様において、アレルギー疾患は食物アレルギーである。
　本発明の判定方法において、アレルゲン及び／又はその断片が、生体試料に含まれる抗体（以下、標的抗体と称することがある）を検出するためのプローブとして用いられる。プローブとして用いられるアレルゲンとしては、限定されずに、食物アレルゲン、吸入性アレルゲン、接触性アレルゲン等が挙げられる。
　食物アレルゲンとしては、限定されずに、例えば、乳・酪農製品、卵、魚、食肉、軟体動物、甲殻類、穀物、ナッツ、果物、野菜、きのこ、いもなどのアレルゲンが挙げられる。魚のアレルゲンとしては、サケ、サバ、イクラ、バス、ヒラメ、タラなどのアレルゲンが挙げられる。食肉のアレルゲンとしては、鶏肉、豚肉、ゼラチンなどのアレルゲンが挙げられる。軟体動物のアレルゲンとしては、アワビ、イカなどのアレルゲンが挙げられる。甲殻類のアレルゲンとしては、エビ、カニなどのアレルゲンが挙げられる。穀物のアレルゲンとしては、小麦、ライ麦、大麦、オーツ麦、スペルト小麦、カムット小麦、そば、落花生、ごま、大豆、ルピナスなどのアレルゲンが挙げられる。ナッツのアレルゲンとしては、アーモンド、カシューナッツ、くるみ、ヘーゼルナッツ、ウォルナッツ、ペカンナッツ、ブラジルナッツ、ピスタチオナッツ、マカデミアナッツなどのアレルゲンが挙げられる。果物のアレルゲンとしては、オレンジ、キウイフルーツ、バナナ、モモ、リンゴなどのアレルゲンが挙げられる。野菜のアレルゲンとしては、セロリ、マスタードなどのアレルゲンが挙げられる。
　一部の態様において、アレルゲンは、日本の食品表示基準に特定原材料又は準特定原材料として記載された原材料のアレルゲンを含む。特定原材料には、えび、かに、小麦、そば、卵、乳及び落花生、準特定原材料にはアーモンド、あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご及びゼラチンがそれぞれ含まれる。
　別の態様において、アレルゲンは、欧州議会及び理事会規則No 1169/2011において表示が義務付けられているアレルゲンを含む。かかるアレルゲンには、グルテンを含む穀物（小麦、ライ麦、大麦、オーツ麦、スペルト小麦、カムット小麦）、甲殻類、卵、魚、ピーナッツ、大豆、牛乳・酪農製品、ナッツ（アーモンド、ヘーゼルナッツ、ウォルナッツ、カシューナッツ、ペカンナッツ、ブラジルナッツ、ピスタチオナッツ、マカデミアナッツ）、セロリ、マスタード、ゴマ、ルピナス及び軟体動物のアレルゲンが含まれる。
　別の態様において、アレルゲンは、米国消費者保護法に表示が規定されている食品のアレルゲンを含む。かかる食品には、牛乳、卵、魚（バス、ヒラメ、タラなど）、甲殻類（カニ、ロブスター、エビなど）、ナッツ（アーモンド、クルミ、ペカンナッツなど）、ピーナッツ、小麦及び大豆が含まれる。
　別の態様において、食物アレルゲンは、動物性及び植物性アレルゲンを含む。動物性アレルゲンとしては、例えば、カゼイン（αｓ１－カゼイン、αｓ２－カゼイン、βカゼイン、κ－カゼインなど）、アルブミン（ラクトアルブミン、オボアルブミン、コンアルブミン、血清アルブミンなど）、グロブリン（ラクトグロブリン、免疫グロブリンなど）、トロポミオシン、パルブアルブミン（βパルブアルブミンなど）が挙げられる。植物性アレルゲンとしては、例えば、クーピン（７Ｓグロブリン（ビシリン）、１１Ｓグロブリン（レグミン）、１３Ｓ　グロブリンなど）、プロラミン（αアミラーゼインヒビター、２Ｓアルブミン、非特異的脂質輸送タンパク質（ｎｓＬＴＰ）など）、ＰＲ－１０（Bet v 1ホモログ）、プロフィリン、オレオシンが挙げられる。一部の態様において、アレルゲンは、カゼイン、アルブミン、グロブリン、トロポミオシン、パルブアルブミン、クーピン、プロラミン、ＰＲ－１０（Bet v 1ホモログ）、プロフィリン及びオレオシンから選択される。
　特定の態様において、牛乳のアレルゲンは、αｓ１－カゼイン（Bos d 9）、αｓ２－カゼイン（Bos d 10）、βカゼイン（Bos d 11）、κ-カゼイン（Bos d 12）、αラクトアルブミン（Bos d 4）、血清アルブミン（Bos d 6）、βラクトグロブリン（Bos d 5）及び免疫グロブリン（Bos d 7）を包含する。
　特定の態様において、卵のアレルゲンは、オボムコイド（Gal d 1）、オボアルブミン（Gal d 2）、オボトランスフェリン（コンアルブミン、Gal d 3）及びリゾチームC（Gal d 4）を包含する。
　特定の態様において、魚のアレルゲンは、タイセイヨウサケトロポミオシン（Sal s 4）、タイセイヨウサケβパルブアルブミン（Sal s 1）、βパルブアルブミン（Gad c 1）、カワスズメトロポミオシン（Ore m 4）、ニシンβパルブアルブミン（Clu h 1）、コイβパルブアルブミン（Crp c 1）、カレイβパルブアルブミン（Lep w 1）、ニジマスβパルブアルブミン（Onc m 1）、イワシβパルブアルブミン（Sar sa 1）、キハダマグロβパルブアルブミン（Thu a 1）、メカジキβパルブアルブミン（Xip g 1）を包含する。
　特定の態様において、軟体動物のアレルゲンは、アワビトロポミオシン（Hal l 1）、スルメイカトロポミオシン（Tod p 1）、ヒメリンゴマイマイトロポミオシン（Hel as 1）、マガキトロポミオシン（Cra g 1）及びシドニーロックオイスタートロポミオシン（Sac g 1）を包含する。
　特定の態様において、甲殻類のアレルゲンは、インドエビトロポミオシン（Pen i 1）、ヨシエビトロポミオシン（Met e 1）、アメリカンロブスタートロポミオシン（Hom a 1）、ブラックタイガートロポミオシン（Pen m 1）、ブラウンエビトロポミオシン（Pen a 1）、バナメイエビトロポミオシン（Lit v 1）、フトミゾエビトロポミオシン（Mel l 1）、ホッコクアカエビトロポミオシン（Pan b 1）、テナガエビトロポミオシン（Mac r 1）、ヨーロッパエビジャコトロポミオシン（Cra c 1）、イセエビトロポミオシン（Pan s 1）、タイワンガサミトロポミオシン（Por p 1）及びイシガニトロポミオシン（Cha f 1）を包含する。
　特定の態様において、穀物のアレルゲンは、小麦グルテン：小麦ω－５グリアジン（Tri a 19）、小麦α／β－グリアジン（Tri a 21）、小麦γ－グリアジン（Tri a 20）、小麦高分子量グルテニン（Tri a 26）、小麦低分子量グルテニン（Tri a 36）、小麦αアミラーゼインヒビター（単量体、Tri a 15二量体、Tri a 28、四量体、Tri a 29、Tria 30）、小麦ｎｓＬＴＰ（Tri a 14）、大麦αアミラーゼインヒビター（Hor v 15）、そば１３Ｓグロブリン（分子量76ｋＤａ）、そば１３Ｓグロブリンβ－サブユニット（分子量２４ｋＤａ、Fag e 1）、そば７Ｓグロブリン（ビシリン、Fag e 3）、そば２Ｓアルブミン（Fag e 2）、落花生７Ｓグロブリン（ビシリン、Ara h 1）、落花生１１Ｓグロブリン（レグミン、Ara h 3）、落花生２Ｓアルブミン（Ara h 2、6、7）、落花生ｎｓＬＴＰ（Ara h 9、16、17）、落花生Bet v 1（Ara h 8）、落花生プロフィリン（Ara h 5）、落花生オレオシン（Ara h 10、11、14、15）、ゴマ７Ｓグロブリン（ビシリン、Ses i 3）、ゴマ１１Ｓグロブリン（レグミン、Ses i 6、7）、ゴマ２Ｓアルブミン（Ses i 1、2）、ゴマオレオシン（Ses i 4、5）、大豆７Ｓグロブリン（ビシリン、Gly m 5）、大豆１１Ｓグロブリン（レグミン、Gly m 6）、大豆ｎｓＬＴＰ（Gly m 1）、大豆２Ｓアルブミン（Gly m 8）、大豆Bet v 1（Gly m 4）、大豆プロフィリン（Gly m 3）、トウモロコシｎｓＬＴＰ（Zea m 14）、エンドウ７Ｓグロブリン（ビシリン、Pis s 1）、緑豆７Ｓグロブリン（ビシリン、Vig r 2）、緑豆Bet v 1（Vig r 1）及びトウモロコシプロフィリン（Zea m 12）を包含する。
　特定の態様において、ナッツのアレルゲンは、アーモンド１１Ｓグロブリン（レグミン、Pru du 6）、アーモンドｎｓＬＴＰ１（Pru du 3）、アーモンドプロフィリン（Pru du 4）、カシューナッツ７Ｓグロブリン（ビシリン、Ana o 1）、カシューナッツ１１Ｓグロブリン（レグミン、Ana o 2）、カシューナッツ２Ｓアルブミン（Ana o 3）、くるみ７Ｓグロブリン（ビシリン、Jug r 2）、くるみ１１Ｓグロブリン（レグミン、Jug r 4）、くるみ２Ｓアルブミン（Jug r 1）、くるみｎｓＬＴＰ（Jug r 3）、くるみＰＲ－１０（Jug r 5）、くるみプロフィリン（Jug r 7）、ヘーゼルナッツ７Ｓグロブリン（ビシリン、Cor a 11）、ヘーゼルナッツ１１Ｓグロブリン（レグミン、Cor a 9）、ヘーゼルナッツ２Ｓアルブミン（Cor a 14）、ヘーゼルナッツｎｓＬＴＰ（Cor a 8）、ヘーゼルナッツBet v 1（Cor a 1）、ヘーゼルナッツプロフィリン（Cor a 2）、ヘーゼルナッツオレオシン（Cor a 12、13）、ペカンナッツ７Ｓグロブリン（ビシリン、Car i 2）、ペカンナッツ１１Ｓグロブリン（レグミン、Car i 4）、ペカンナッツ２Ｓアルブミン（Car i 1）、ブラジルナッツ１１Ｓグロブリン（レグミン、Ber e 2）、ブラジルナッツ２Ｓアルブミン（Ber e 1）、ピスタチオナッツ７Ｓグロブリン（ビシリン、Pis v 3）、ピスタチオナッツ１１Ｓグロブリン（レグミン、Pis v 2、5）、ピスタチオナッツ２Ｓアルブミン（Pis v 1）、黒グルミ１１Ｓグロブリン（レグミン、Jung n 4）を包含する。
　特定の態様において、果物のアレルゲンは、オレンジｎｓＬＴＰ（Cit s 3）、オレンジプロフィリン（Cit s 2）、グリーンキウイ２Ｓアルブミン（Act d 13）、ゴールデンキウイｎｓＬＴＰ（Act c 10）、グリーンキウイｎｓＬＴＰ（Act d 10）、ゴールデンキウイBet v 1（Act c 8）、グリーンキウイBet v 1（Act d 8）、グリーンキウイプロフィリン（Act d 9）、バナナｎｓＬＴＰ（Mus a 3）、バナナプロフィリン（Mus a 1）、モモｎｓＬＴＰ（Pru p 3）、モモBet v 1（Pru p 1）、モモプロフィリン（Pru p 4）、リンゴｎｓＬＴＰ（Mal d 3）、リンゴBet v 1（Mal d 1）、リンゴプロフィリン（Mal d 4）、イチゴｎｓＬＴＰ（Fra a 3）、アンズｎｓＬＴＰ（Pru ar 3）、サクランボｎｓＬＴＰ（Pru av 3）、西洋スモモｎｓＬＴＰ（Pru d 3）、ザクロｎｓＬＴＰ（Pun g 1）、レッドラズベリーｎｓＬＴＰ（Rub I 3）、ブドウｎｓＬＴＰ（Vit v 1）、ナシｎｓＬＴＰ（Pyr c 3）、イチゴBet v 1（Fra a 1）、アンズBet v 1（Pru ar 1）、サクランボBet v 1（Pru av 1）、ナシBet v 1（Pyr c 1）、キイチゴBet v 1（Rub i 1）、イチゴプロフィリン（Fra a 4）、サクランボプロフィリン（Pru av 4）、セイヨウナシプロフィリン（Pyr c 4）、スイカプロフィリン（Citr l 2）、マスクメロンプロフィリン（Cuc m 2）、レイシプロフィリン（Lit c 1）及びパイナップルプロフィリン（Ana c 1）を包含する。
　特定の態様において、果物のアレルゲンは、セロリｎｓＬＴＰ（Api g 2、6）、セロリBet v 1（Api g 1）、セロリプロフィリン（Api g 4）、イエローマスタード２Ｓアルブミン（Sin a 1）、イエローマスタードプロフィリン（Sin a 4）、アスパラガスｎｓＬＴＰ（Aspa o 1）、レタスｎｓＬＴＰ（Lac s 1）、キャベツｎｓＬＴＰ（Bra o 3）、トマトｎｓＬＴＰ（Sola l 13、16、17）、ニンジンBet v 1（Dau c 1）、トマトBet v 1（Sola l 4）、ニンジンプロフィリン（Dau c 4）、ピーマンプロフィリン（Cap a 2）及びトマトプロフィリン（Sola l 1）を包含する。
　吸入性アレルゲンとしては、限定されずに、例えば、室内アレルゲン、花粉アレルゲン、カビアレルゲンなどが挙げられる。室内アレルゲンとしては、限定されずに、例えば、ほこり、ダニ、畳、ソバガラ、ペットの毛、衣服、寝具（綿、絹、羊毛、羽毛）等のアレルゲンが挙げられる。花粉アレルゲンとしては、限定されずに、例えば、ブタクサ、カナムグラ、スギ、アカマツ、ススキ、ヒメガマ、ヨモギ、オリーブ、プラタナス、ヨーロッパヒカゲミズ、ヨーロッパハンノキ、シラカンバ、セイヨウシデ、ヨーロッパグリ、セイヨウハシバミ、ヨーロッパプナ、ヨーロッパアサダ、ホワイトオーク、アオゲイトウ、シロザ、セイヨウハシバミ、サフラン、ギョウシバ、セイヨウヤマアイ、オオアワガエリ、ナツメヤシ、ヘラオオバコ、メスキート、Brassica rapa、オカヒジキ、ライラック等のアレルゲンが挙げられる。カビアレルゲンとしては、限定されずに、例えば、アルテルナリア、ぺニシリウム、カンジダ、クラドスポリウム、アスペルギルス等のアレルゲンが挙げられる。
　特定の態様において、花粉アレルゲンは、ブタクサｎｓＬＴＰ（Amb a 6）、ヨモギｎｓＬＴＰ（Art v 3）、オリーブｎｓＬＴＰ（Ole e 7）、プラタナスｎｓＬＴＰ（Pla or 3）、ヨーロッパヒカゲミズｎｓＬＴＰ（Par j 1）、ヨーロッパハンノキBet v 1（Aln g 1）、シラカンバBet v 1（Bet v 1）、セイヨウシデBet v 1（Car b 1）、 ヨーロッパグリBet v 1（Cas s 1）、セイヨウハシバミBet v 1（Cor a 1）、ヨーロッパプナBet v 1（Fag s 1）、 ヨーロッパアサダBet v 1（Ost c 1）、（ホワイトオークBet v 1（Qua a 1）、アオゲイトウプロフィリン（Ama r 2）、プタクサプロフィリン（Amb a 8）、ヨモギプロフィリン（Art v 4）、シラカンバプロフィリン（Bet v 2）、シロザプロフィリン（Che a 2）、セイヨウハシバミプロフィリン（Cor a 2）、サフランプロフィリン（Cro s 2）、ギョウシバプロフィリン（Cyn d 12）、オリーブプロフィリン（0le e 2）、 セイヨウヤマアイプロフィリン（Mer  a 1）、ヨーロッパヒカゲミスプロフィリン（Par j 3）、オオアワガエリプロフィリン（Phl p 12）、ナツメヤシプロフィリン（Pho d 2）、ヘラオオバコプロフィリン（Pla l 2）、メスキートプロフィリン（Pro j 2）、ヨーロッパハンノキポルカルシン（Aln g 4）、ブタクサポルカルシン（Amb a 9）、ヨモギポルカルシン（Art v 5）、シラカンバポルカルシン（Bet v 4）、Brassica rapaポルカルシン（Bra r 5）、シロザポルカルシン（Che a 3）、ギョウギシバポルカルシン（Cyn d 7）、オリープポルカルシン（Ole e 3）、ヨーロッパヒカゲミズポルカルシン（Par j 4）、オオアワガエリポルカルシン（Phi p 7）、オカヒジキポルカルシン（Sal k 7）及びライラックポルカルシン（Syr v 3）を包含する。
　接触性アレルゲンとしては、限定されずに、例えば、化粧品、塗料、衣服、ラテックス（ゴム）、寝具類、洗剤などのアレルゲンが挙げられる。特定の態様において、ラテックスのアレルゲンは、ラテックスｎｓＬＴＰ（Heb v 12）を包含する。
　一態様において、アレルゲンは、その断片によってＩｇＥとＩｇＧ４との反応性が異なる。かかるアレルゲンとしては、αｓ１－カゼイン、αｓ２－カゼイン、βカゼイン、κ－カゼイン、βラクトグロブリン、ブラウンエビトロポミオシン等が挙げられる。
　好ましい態様において、プローブとして用いられるアレルゲンはポリペプチドである。プローブとして用いられるアレルゲンの断片は、抗体が結合し得る長さであれば特に限定されず、３～５０アミノ酸長、好ましくは５～３０アミノ酸長、より好ましくは１０～２０アミノ酸長、特に好ましくは１２～１８アミノ酸長であってよい。アレルゲンの断片は、アミノ酸配列上連続したものであってもよいし、アレルゲンがアミノ酸配列上連続していない構造的エピトープを含む場合は、その構造的エピトープのアミノ酸配列を含む断片であってもよい。断片が連続断片である場合、それは隣り合う断片同士が一部重なり合うオーバーラップ断片であってもよい。下表１に示す配列番号２～２１は、αｓ１－カゼイン（配列番号１）のオーバーラップ断片セットの一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　本発明の判定方法で使用するプローブの数は、検出するアレルゲンのアミノ酸配列の長さやアレルゲンの種類数によって異なり得るが、例えば２～１０，０００個、３～１，０００個、９～５１２個、１８～１４４個等であってよい。プローブは同じアレルゲンの複数の断片で構成されても、２以上の異なるアレルゲンからの１又は２以上の断片で構成されてもよい。また、プローブは全長アレルゲンのみで構成されても、アレルゲン断片のみで構成されても、全長アレルゲンとアレルゲン断片の両方を含んでいてもよい。
　プローブは固相化されていてもよい。固相化の手法は特に限定されず、既知の任意の手法を用いることができる。具体的には、例えば、プローブを測定用プレートやチップに直接吸着させる手法、プローブをビーズなどの担体に結合させ、プローブが結合したビーズを測定用プレートやチップに固定する手法（WO2018/154814、WO2019/050017）などが挙げられる。プローブをチップに固定する特定の態様については、後述のバイオチップの項に詳述されている。
　本発明の判定方法における対象は、アレルギー疾患を有していてもいなくてもよい。一態様において、対象はアレルギー疾患を有する疑いがある対象である。別の態様において、対象はアレルギー疾患を有すると診断された対象である。一部の態様において、対象はアレルギー疾患に係る誘発試験（例えば、食物経口負荷試験、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験、眼反応など）や皮内テストといった、アナフィラキシーなどの重篤なアレルギー症状を誘発する虞のある検査を行う予定のある対象である。特定の態様において、対象は食物経口負荷試験を行う予定のある対象である。
　本発明の判定方法に用いる生体試料としては、検出対象となる抗体を含み得るものであれば特に限定されず、血液、血漿、血清などが挙げられる。
　生体試料は、同じ対象の、採取時期の異なる２種以上のものであってもよい。かかる試料についてそれぞれ判定結果を得、これを相互に比較したり、それぞれ所定の基準値と比較することにより、アレルギー疾患のモニタリングを行うことができる。例えば、判定事項がアレルギー疾患が軽症か重症かである場合、軽症のまま又は重症のままであるのか、軽症から重症に転じたのか、或いは重症から軽症に転じたのかをさらに判定することができる。試料を、例えば、治療開始前と治療開始後、又は、治療開始後の異なる２時点にそれぞれ採取すれば、治療効果を判定することが可能になる。
　本発明の判定方法において判別される抗体の種類としては、限定されずに、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ等が挙げられる。一部の態様において、判別される抗体の種類はＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。特定の態様において、判別される抗体の種類はＩｇＥとＩｇＧ４である。
　プローブと、生体試料とを接触させる工程は、抗原と抗体との特異的結合を可能にする既知の任意の手法や、下記実施例に記載の手法により行うことができる。具体的には、例えば、基体又は担体に固定されたにプローブに、生体試料を含む液体を負荷することなどが挙げられる。生体試料は原液のまま使用しても、希釈して使用してもよい。
　プローブと、標的抗体との反応を検出する工程は、抗原と抗体との反応を検出するための既知の任意の手法や下記実施例に記載の手法により行うことができる。具体的には、例えば、プローブと生体試料とを接触させ、プローブと抗体との結合を可能にする条件で所定時間反応させた後、プローブに結合していない抗体を除去し、検出可能な標識を付した、標的抗体に特異的な抗体（二次抗体）を作用させ、未結合の二次抗体を除去後、標識を検出することで行うことができる。標識としては、限定されずに、例えば、蛍光物質、発光物質、酵素（例えばＡＬＰ、ＨＲＰ）、放射性同位体等が挙げられ、標識を検出する手法としては、限定されずに、例えば、分光光度法、吸光光度法、蛍光光度法、比色法、オートラジオグラフィー等が挙げられる。検出は定性的であっても、定量的であってもよい。プローブと生体試料とを接触させる前に、抗体の非特異的吸着を抑制するためにブロッキング剤を作用させることができる。ビオチン化したプローブを、アビジン又はその誘導体で修飾された基体又は固定担体に結合させたバイオチップを使用する態様において、ブロッキング剤はビオチンを含んでいてもよい。ビオチンを含むブロッキング剤を使用することによりＳＮ比を高めることができる。
　プローブと反応した抗体の種類を判別する工程は、例えば、プローブと、生体試料中の抗体との反応を検出する工程において、二次抗体として、所望の種類の抗体に特異的なものを使用することで行うことができる。抗体の種類は、プローブと、生体試料中の抗体との反応を検出する工程ごとに１種類ずつ判別しても、複数の種類を同時に判別してもよい。複数の種類の同時判別は、例えば、二次抗体の種類ごとに標識の種類を変えることなどで行うことができる。具体的には、例えば、種類Ａの抗体に特異的な二次抗体と、種類Ｂの抗体に特異的な二次抗体とに、波長の異なる蛍光標識を付することができる。また、同じプローブを２以上の反応領域に用い、反応領域ごとに異なる二次抗体を作用させることで、同じ標識を使用しながら複数の種類の抗体を実質的に同時に検出することもできる。二次抗体には、モノクローナル抗体を用いても、ポリクローナル抗体を用いてもよい。モノクローナル抗体を用いることにより、非特異的吸着を抑制し、ＳＮ比を高めることができる。
　プローブと反応した抗体の種類を判別する工程は、プローブと標的抗体との反応を検出する工程と同時に行われてもよいし、別々に行われてもよい。
　プローブと抗体との反応に係るデータは、定量的であっても定性的であってもよい。一態様において、前記データは定量的データである。定量的データは、反応の検出手法などによって異なり得るが、限定されずに、例えば、反応強度（吸光度、発光強度、放射線強度など）が挙げられる。
　本発明の判定方法に使用する予測モデルは、アレルギー疾患判定の基礎となる指標を得るためのモデルであり、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである。説明変数の数は２個以上であれば特に限定されない。説明変数の数の非限定例は、予測モデルの種類によって異なり得るが、例えば、２～１００個（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個など）、２～５０個、２～３０個、２～２０個、２～１５個、２～１０個、３～１００個、３～５０個、３～３０個、３～２０個、３～１５個、３～１０個、４～１００個、４～５０個、４～３０個、４～２０個、４～１５個、４～１０個、５～１００個、５～５０個、５～２０個、５～１５個、５～１０個等であってよい。なお、非線形モデルについては、説明変数は２個より少なくてもよく、例えば１個でもよい。
　説明変数としては、プローブと抗体との反応に係る変数（例えば、発光強度、吸光度、蛍光強度など）、結合した抗体の種類に係る変数（例えば、ＩｇＥ、ＩｇＧ４などのアイソタイプ）のほか、対象の年齢、性別、既往歴、家族歴、基礎疾患、合併症、遺伝的素因、総ＩｇＥ量、ＩｇＥ希釈率（総ＩｇＥ量の高い対象の試料を、特異的ＩｇＥの検出が可能になる範囲まで希釈した際の倍率）、他のアレルゲンの検査結果などを用いることができる。他のアレルゲンとしては、上記に記載したもののほか、ホルムアルデヒド、ＶＯＣ、金属、うるし（ウルシオール）、ヨードなどの非タンパク質アレルゲンが挙げられる。アレルゲンの検査結果としては、例えば、ＲＡＳＴ、ＣＡＰ法、ＭＡＳＴ法等による特異ＩｇＥ抗体の検査結果、プリックテスト、スクラッチテスト、皮内テストなどの皮膚テストの結果等が挙げられる。説明変数は、未処理の数値をそのまま使用してもよいし、対数変換などの前処理（変数変換）を行った数値を使用してもよい。
　予測モデルは、作成に使用する統計学的手法に応じて、予測式、決定木などの形態をとり得る。予測式は、四則演算、ヒンジ関数等を含み得、項数は２項以上であれば特に限定されない。予測式の項数の非限定例は、予測モデルの種類によって異なり得るが、例えば、２～１５０項（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０項など）、２～１００項、２～５０項、２～３０項、２～２０項、２～１５項、２～１０項、４～１００項、４～５０項、４～３０項、４～２０項、４～１５項、４～１０項、６～１５０項、６～１００項、６～５０項、６～３０項、６～２０項、６～１５項、６～１０項、８～１５０項、８～１００項、８～５０項、８～３０項、８～２０項、８～１５項、８～１０項、１０～１５０項、１０～１００項、１０～５０項、１０～３０項、１０～２０項、１０～１５項等であってよい。なお、非線形モデルについては、項数は２項より少なくてもよく、例えば１項でもよい。
　訓練データは、予測モデルの作成や評価などに使用するための、判定するアレルギー疾患の有無が既知の複数の対象からのデータである。例えば、本発明の判定方法が、アレルゲンＡに対するアレルギー反応が軽症か重症かを判定するものである場合、訓練データは、アレルゲンＡに対するアレルギー反応の程度が既知の対象からのデータを含み、アレルゲンＡに対するＡＳＣＡ値を予測するものである場合、訓練データは、アレルゲンＡに対するＡＳＣＡ値が既知の対象からのデータを含む。かかる訓練データをベースに、種々の統計学的手法を用い、軽症の対象と重症の対象とをより良好に区別し得るモデルや、実際のＡＳＣＡ値により近いＡＳＣＡ値を予測し得るモデルを作成する。
　予測モデルの作成や評価に用いる統計学的手法としては、限定されずに、最小二乗法、Ｒｉｄｇｅ回帰、ＬＡＳＳＯ回帰、ＣＡＲＴ法、ＭＡＲＳ法等が挙げられる。非線形モデルの作成にはＣＡＲＴ法、ＭＡＲＳ法などが、線形モデルの作成には最小二乗法、Ｒｉｄｇｅ回帰、ＬＡＳＳＯ回帰などがそれぞれ用いられる。予測モデルの精度や汎化性は、クロスバリデーション（ＣＶ）等により改善することができる。クロスバリデーションでは、例えば、訓練データを複数の組に分割し、そのうちの一部を訓練データ、残りを検証データとして、予測モデルに入力して予測結果を得、結果に偏りなどが生じていないかを確認する。クロスバリデーションの具体的手法としては、Leave one out cross validation（ＬＯＯＣＶ)、10-fold cross validation、Generalized cross validation等が挙げられる。複数の訓練データと検証データとのセットで同様の結果が得られていれば、それを実際の判定に用いる試料に適用しても同様の結果が得られる蓋然性（汎化性）が高くなる。予測モデルの作成は、手動で行っても、機械学習により行ってもよい。予測モデルの評価は、感度、特異度、相関係数（予測率）、ＲＯＣ曲線におけるＡＵＣ、ドットヒストグラムなどにより行うことができる。
　一態様において、予測モデルは相関係数が０．６０以上である。相関係数は高いほど好ましく、限定されずに、例えば、０．６０以上、０．６２以上、０．６４以上、０．６６以上、０．６８以上、０．７０以上、０．７２以上、０．７４以上、０．７６以上、０．７８以上、０．８０以上、０．８２以上、０．８４以上、０．８６以上、０．８８以上、０．９０以上、０．９２以上、０．９４以上、０．９６以上、０．９８以上等であってよい。
　一態様において、予測モデルは、ＲＯＣ曲線の縦軸が０～１の範囲の感度、横軸が０～１の範囲の（１－特異度）である場合、ＡＵＣが０．９００以上である。ＡＵＣは高いほど好ましく、限定されずに、例えば、０．９００以上、０．９０５以上、０．９１０以上、０．９１５以上、０．９２０以上、０．９２５以上、０．９３０以上、０．９３５以上、０．９４０以上、０．９４５以上、０．９５０以上、０．９５５以上、０．９６０以上、０．９６５以上、０．９７０以上、０．９７５以上、０．９８０以上、０．９８５以上、０．９９０以上、０．９９５以上等であってよい。
　予測モデルの作成には、プローブと抗体との反応に係るデータ及び結合した抗体の種類に係るデータに加え、アレルギー疾患の判定に関連する追加の訓練データを用いることができる。かかるデータとしては、限定されずに、説明変数について上記したもの等が挙げられる。
　本発明の判定方法によるアレルギー疾患の判定としては、限定されずに、例えば、アレルギー疾患が軽症か重症か（例えば、アレルゲンに暴露した際の症状が軽症か重症か）の判定、グレード（重症度）の予測、総ＡＳＣＡ値の予測等が挙げられる。アレルギー疾患の軽症、重症の基準は、判定結果を使用する状況に応じて異なり得る。例えば、軽症の基準としては、誘起される症状がグレード１、ＡＳＣＡ値が所定値未満、医学的措置を施す必要のない程度（経過観察などで対応する程度）などが挙げられる。軽症、重症の基準は、状況に応じ、医師が適宜決定することができる。グレードは、アナフィラキシーの重症度の指標であり、下記のグレード表に基づいて最も症状グレードの高い臓器症状を基に判定される（柳田 他、日本小児アレルギー学会誌、2014;28:201）。
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　ＡＳＣＡ（Anaphylaxis Scoring Aichi）は、食物経口負荷試験における誘発症状の重症度を定量的に評価するスコアシステムであり、誘発症状を呼吸器、皮膚～、消化器、神経、循環器の５つに分類し、主観症状、客観所見に分けて重症度順に配し、臓器スコア（１～６０）とし、一連の負荷試験における各臓器の最高スコアを合計し、総合スコア（最高２４０）とするものである（Hino et al., Arerugi. 2013;62(8):968-79、Sakai et al., Asia Pac Allergy. 2017;7(4):234-242等参照）。アレルゲンに暴露した際の症状が軽症か重症かがアレルゲン暴露前に判定できると、アレルゲンの暴露を伴う検査（例えば、食物経口負荷試験、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験、眼反応などの誘発試験や皮内テスト）を行うか否か、また、行う場合でも、外来で行うか入院で行うかの判断に寄与することができる。
　前記予測結果に基づくアレルギー疾患の判定は、予測モデルや、判定事項に応じて異なり得るが、例えば、予測結果を基準値と比較することにより行うことができる。予測式による予測モデルの場合、予測式で得られた予測結果（予測値）を予め設定された基準値（例えば、カットオフ値など）と比較し、陽性、陰性の判定を行うことができる。予測値が基準値より高ければ重症の確率が高く、低ければ軽症の確率が高くなるよう基準値を設定した場合、予測値が基準値より高ければ重症と判定し、低ければ軽症と判定することができる。カットオフ値は、Youden indexなどの既知の手法で設定することができる。また、予測モデルが、判定事項を直接出力する態様である場合（例えば、決定木を用いた重症・軽症の判定、予測式・決定木を用いたＡＳＣＡ値の予測など）、予測結果をそのまま判定結果として利用することもできる。
２．アレルギー疾患判定のための指標を得る方法
　本発明の別の側面は、アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させて得られた、前記プローブと生体試料に含まれる抗体との反応に係るデータ及び反応した抗体の種類に係るデータを取得する工程、及び前記データを予測モデルに入力し、予測結果をアレルギー疾患判定のための指標として得る工程、
を含み、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである、アレルギー疾患判定のための指標を得る方法に関する（以下、「本発明の指標取得方法」と称することがある）。
　本発明の指標取得方法は、予測モデルによる予測結果に基づいて、アレルギー疾患を判定する工程が必須でないこと以外は、本発明の判定方法と同様である。本発明の指標取得方法で得た予測結果は、アレルギー疾患の判定の指標として用いることができる。具体的には、例えば、予測結果を、判定の対象となる病状に係る基準値（カットオフ値など）と比較することにより、病状の有無を判定することができる。また、予測モデルが、判定事項を直接出力する態様である場合（例えば、決定木を用いた重症・軽症の判定、予測式・決定木を用いたＡＳＣＡ値の予測など）、予測結果をそのまま判定結果として利用することもできる。
３．アレルギー疾患の判定キット
　本発明の別の側面は、アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブを含む、本発明の判定方法又は指標取得方法に使用するためのキット（以下、「本発明のキット」と称することがある）に関する。
　本発明のキットに含まれるプローブについては、本発明の判定方法について上記したとおりである。本発明のキットにおいて、プローブは固相化されていてもよいし、固相化のための修飾がなされていてもよい。固相化のための修飾としては、例えば、アビジン又はその誘導体、ビオチン又はその誘導体、アルキン、アジド、フェノール性ＯＨ基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、光反応性基、Ｈｉｓタグ、抗体等の付加などが挙げられる。
　本発明のキットは、標的抗体を検出するための試薬をさらに含んでいてもよい。かかる試薬には、限定されずに、例えば、標的抗体と特異的に結合する標識化された二次抗体や、必要に応じて標識を検出するための試薬（発光試薬、発色試薬など）が包含される。二次抗体に付加される標識については、本発明の判定方法について上記したとおりである。本発明のキットにはさらに、標準試料、キットの使用方法等が示された指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を含むサイトの情報（例えば、ＵＲＬ、２次元コード）、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等が含まれていてもよい。
４．アレルギー疾患判定用バイオチップ
　本発明の別の側面は、アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブが基体に固定された、本発明の判定方法又は指標取得方法に使用するためのバイオチップ（以下、「本発明のバイオチップ」と称することがある）に関する。
　本発明のバイオチップの基体に固定されるプローブについては、本発明の判定方法について上記したとおりである。プローブは、基体に直接固定されていても、担体（固定化担体）を介して固定されていてもよい。以下、プローブ又はプローブが固定された担体を被固定化物質と称することがある。
　バイオチップの基体としては、検査試料や生化学反応に過度の悪影響を与えないものであれば特に制限はないが、例えば、樹脂材料やガラス材料等を使用することができる。樹脂材料としては、限定されずに、例えば、熱硬化性樹脂や熱可塑性樹脂を使用することができる。特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどの光透過性樹脂材料を用いれば、良好な可視光透過性を確保することができる。ポリプロピレンとしては、限定されずに、例えば、ホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体を使用することができる。また、アクリルとしては、限定されずに、例えば、ポリメタクリル酸メチル、又は、メタクリル酸メチルとその他のメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレンなどのモノマーとの共重合体を使用することができる。また、光不透過性樹脂材料を用いることも可能である。光不透過性樹脂材料としては、限定されずに、例えば、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどの樹脂材料に、樹脂用着色剤（例えば、マスターバッチなど）を添加したものが挙げられる。光不透過性樹脂材料は遮光性の高いものが好ましく、色は黒が好ましい。基体の厚さとしては特に制限されないが、製造工程である程度の非変形性を有することが望ましいことから、０．３ｍｍ～３．０ｍｍが好ましく、０．５ｍｍ～１．５ｍｍがより好ましく、０．７ｍｍ～１．０ｍｍが特に好ましい。
　一部の態様において、基体に用いられる樹脂材料は疎水性である。一部の態様において、前記樹脂材料は水不溶性のポリマーから形成される。一部の態様において、前記樹脂材料はデキストラン、ポリエチレングリコール又はその誘導体を含まない。
　基体は親水化処理が施されたものであってよい。親水化処理により、前記基体への非特異的吸着を防止し、かつ、基体とプローブ（又はプローブが結合した担体）とを強固に固定化することができる。親水化処理は、基体表面の１又は複数の部分に行ってもよいし、基体表面全体に行ってもよい。基体表面の部分を親水化処理する場合、例えば、基体の上表面の全体又は、基体の上表面の１又は複数の部分に行ってもよい。親水化処理としては特に限定されないが、親水性をもつシリカなど無機材料や界面活性剤による表面のコーティング、プラズマ処理やＵＶ－オゾン処理、コロナ処理やフレーム処理などの化学的な親水化処理、微細なナノ構造を物理的に形成することによる親水性の付与（ＷＯ２０１１／０２４９４７）などを挙げることができる。基体が樹脂製の場合、樹脂表面の分子の化学結合を切断し、樹脂の種類に応じて極性を有する官能基、例えば、ＯＨ（水酸基）、ＣＯ（カルボニル基）、ＣＯＯＨ（カルボキシル基）、メトキシ基、ぺルオキシド基、極性エーテル基等を生成させることができるプラズマ処理やＵＶ－オゾン処理、コロナ処理やフレーム処理などによる化学的な親水化処理がより好ましく、ＵＶ－オゾン処理が特に好ましい。
　一態様において、基体は、親水性の反応エリアを含む表面、好ましくは親水性の反応エリアを含む樹脂製の表面を有する。反応エリアは、その上に被固定化物質を固定化し、検出対象物質と反応させる基体上の領域を意味する。反応エリアは、基体表面の一部であっても全体であってもよい。反応エリアが基体表面の一部である場合、反応エリア以外の基体表面は親水性であっても疎水性であってもよい。反応エリアが基体表面の一部である場合、反応エリアは、種々の形状、例えば、円形、楕円形、多角形又はこれらの組合せであってよい。反応エリアは、連続していても不連続であってもよい。例えば、反応エリアは、複数の、互いに接触しないスポットを形成していてもよい。反応エリアは、その内側に液体を保持することが可能な境界で包囲されていてもよい。また、反応エリアは、基体表面を形成する樹脂の炭素に関わる結合が切断され、当該切断箇所が酸素と結合して生成した極性を有する官能基で覆われていてもよい。かかる官能基としては、限定されずに、例えば、水酸基、カルボニル基、カルボキシル基、メトキシ基、ぺルオキシド基、極性エーテル基等が挙げられる。
　基体上に、非特異的吸着を防止し、プローブを固定化するためのコート層を設けることができる。コート層を介して基体上に物質を固定化することにより、非特異的吸着を防止し、検出感度を高めることができる。コート層は、被固定化物質の固定化の促進、及び／又は、非特異的吸着の抑制を可能にするものであれば特に限定されず、例えば、種々のポリマーで構成することができる。ポリマーのうち、水溶性ポリマーが好ましい。水溶性のポリマーを使用することで、被固定化物質を変性させることのある、水やアルコール以外の非水系溶媒の使用を回避することができる。そこで、本発明では、被固定化物質の変性防止のために、水溶性ポリマーを使用することが好ましい。さらに、水溶性ポリマーは、非特異的吸着抑制効果にも優れるという利点がある。ここで、「水溶性」とは、例えば、前記ポリマーの水に対する溶解度（水１００ｇに溶解するグラム数）が、５以上であることをいう。前記ポリマーの数平均分子量は、特に限定されず、通常、３５０～５００万程度である。ポリマーの分子量を５００～数１０万程度とすることで、ポリマー同士の架橋数を適度に維持することができ、被固定化物質と、被固定化物質との反応に供される物質（光架橋剤等）との反応に進めることができる。
　水溶性ポリマーとしては、ホスホリルコリン含有ポリマーなどの両極性ポリマー及びノニオン性ポリマーが挙げられる。両極性ポリマーとしては、例えば、２－メタクリロイルオキシホスホリルコリン(MPC)を主成分としたポリマー（例えば、日油社製「LIPIDURE(R)」（LIPIDURE(R)-CR2001、LIPIDURE(R)-CM5206等））が挙げられる。ノニオン性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール；ビニルアルコール、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、２－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、Ｎ－ビニルサクシンイミド、Ｎ－ビニルホルムアミド、Ｎ－ビニル－Ｎ－メチルホルムアミド、Ｎ－ビニルアセトアミド、Ｎ－ビニル－Ｎ－メチルアセトアミド、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリロイルピロリジン、アクリロイルピペリジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、ブチルアクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、ｎ－プロピルシアノアクリレート、イソプロピルシアノアクリレート、ｎ－ブチルシアノアクリレート、イソブチルシアノアクリレート、ｔｅｒｔ－ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレート、エチルビニルエーテル、ｎ－プロピルビニルエーテル、イソプロピルビニルエーテル、ｎ－ブチルビニルエーテル、イソブチルビニルエーテル、ｔｅｒｔ－ブチルビニルエーテルなどのモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノニオン性のビニル系高分子；ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グァーガム、プルラン、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体、カラギーナン、澱粉類（カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン）、デキストリン、サイクロデキストリン等の天然高分子、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然高分子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらのポリマーをベースにした光架橋型水溶性ポリマーの市販品、例えばポリビニルアルコールをベースにした東洋合成工業社製「ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ－ＡＷＰ」や、２－メタクリロイルオキシホスホリルコリン（ＭＰＣ）をベースにした日油社製「LIPIDURE(R)-CR2001」などを使用することも可能である。これらのうち、ポリエチレングリコール系ポリマー（例えばポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのビニル重合体）、ＭＰＣを主成分とするポリマー（例えばLIPIDURE(R)-CR2001）等が好ましい。
　コート層と、前記基体との接着性を高めるために基体に表面処理を施すことができる。表面処理としては特に限定されないが、例えば、基体の樹脂表面の分子の化学結合を切断し、樹脂の種類に応じて親水性の官能基ＯＨ（水酸基）、ＣＯ（カルボニル基）、ＣＯＯＨ（カルボキシル基）、メトキシ基、ぺルオキシド基、極性エーテル基等を生成させる処理、例えば、プラズマ処理やＵＶ－オゾン処理、コロナ処理やフレーム処理などが挙げられる。
　前記固定化担体としては特に限定されず、例えば、有機微粒子、無機微粒子などの微粒子担体が挙げられる。微粒子担体は磁性微粒子であってもよい。磁性微粒子の非限定例としてはγＦｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４などの可磁化物質が一様に親水性を有するポリマー（例えば、グリシジルメタクリレートなどの水溶性ポリマー）で覆われた粒径が均一なビーズが挙げられ、市販品としてはサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のダイナビーズや多摩川精機社製のＦＧビーズ、ＧＥヘルスケア社製のＳｅｒａ－Ｍａｇ磁気ビーズ、ＪＳＲライフサイエンス社製のＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅなどを挙げることができる。固定化担体は、プローブの固定に有用な種々の表面処理を施したものであってよい。表面処理の非限定例は、アビジン又はその誘導体、ビオチン又はその誘導体、アルキン、アジド、エポキシ、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、スクシンイミド基、トシル基、プロテインＡ、プロテインＧ等の反応性基による修飾などを含む。
　プローブも、基体又は固定化担体への固定に有用な修飾を有していてもよい。修飾の非限定例は、アビジン又はその誘導体、ビオチン又はその誘導体、アルキン、アジド、フェノール性ＯＨ基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、Ｈｉｓタグ、抗体などによる修飾を含む。特定の態様において、プローブはスペーサーを介してビオチンと結合しており、固定化担体はアビジン化されており、プローブと固定化担体はビオチン・アビジン相互作用により結合している。スペーサーは、被固定化物質（例えばペプチド）と抗体との相互作用及び反応性基とこれに反応する基との相互作用を阻害せず、かつ、本発明のバイオチップの使用状況において非切断性のものであれば特に限定されず、例えば、炭素鎖、ＰＥＧ等が挙げられる。スペーサーの長さは、限定されずに、例えば、５～１５０Å、６～１００Å、７～８０Å、８～６０Å、９～５０Å等であってよく、炭素鎖であれば、例えばＣ１～Ｃ２０の直鎖アルキル、Ｃ３～Ｃ１０の直鎖アルキル、Ｃ４～Ｃ８の直鎖アルキル、特にＣ６の直鎖アルキルの長さであってよく、ＰＥＧであれば、例えば２～２４量体、２～１２量体、２～８量体、特に２～４量体の長さであってよい。スペーサーを使用することにより、被固定化物質と抗体との相互作用が立体障害などにより阻害されにくくなる。
　本発明のバイオチップは、既知の任意の手法、又は、実施例に記載の手法により製造することができる。例えば、親水化処理を施した基体に、プローブが結合した担体を固定したバイオチップ（バイオチップＡ）は、以下のように製造することができる。具体的には、例えば、基体を親水化処理する工程（以下、「工程１－１」という）により基体を製造し、次いで、基体に、少なくとも被固定化物質と、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤と、増粘剤及び／又は界面活性剤をスポットし、光照射する工程（以下、「工程１－２」という）により、被固定化物質を基体に固定化する。
　以下、バイオチップＡの例示的な製造方法を説明する。
工程１－１
　基体の親水化処理は、基体の表面を親水化する処理であれば特に限定されるものではない。例えば、液体に溶解又は懸濁したシリカ、界面活性剤等をスピンコート、塗布、噴霧、浸漬等により基体上にコートした後に乾燥する方法、基体をプラズマ処理やＵＶ－オゾン処理、コロナ処理やフレーム処理などで化学的に親水化処理する方法、基体に微細なナノ構造を転写する、又は基体を薬液により粗化して物理的にナノ構造を形成して親水性を付与する方法、基体を親水性ポリマーでコートする方法などを挙げることができる。樹脂表面の分子の化学結合を切断し、樹脂の種類に応じて親水性の極性を有する官能基ＯＨ（水酸基）、ＣＯ（カルボニル基）、ＣＯＯＨ（カルボキシル基）、メトキシ基、ぺルオキシド基、極性エーテル基等を生成させることができるプラズマ処理やＵＶ－オゾン処理、コロナ処理やフレーム処理などで化学的に親水化処理する方法がより好ましく、ＵＶ－オゾン処理によるものがとくに好ましい。
　基体上へ境界を形成し、反応エリアを形成する工程を設けることができる。反応エリアの形成方法としては特に制限されないが、前記ゴム組成物又は前記樹脂材料により予め形成されたリングを接着剤などを用いて基体に接着する方法、前記樹脂材料から構成される基体を射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などでリングを成型する方法を用いることができる。接着剤としては検査試料や生化学反応に影響を与えないものであれば特に制限はなく、市販の接着剤から適宜選択することができる。
工程１－２
　工程１－２は、前記基体上に、少なくとも被固定化物質と、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤と、増粘剤及び／又は界面活性剤とを格子目状のスポットする工程と、光照射する工程とを含む。
　コート層と、その内側に液体を保持することが可能な境界で包囲された反応エリアとを有するバイオチップ（バイオチップＢ）の製造は、例えば、非特異的吸着を防止し、生体物質を固定化するためのコート層を基体に設ける工程と、基体に境界を形成して反応エリアを設ける工程と、から選ばれる工程により基体を製造し（以下、「工程２－１」という）、次いで、
　前記基体上に、少なくとも被固定化物質と、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤と、増粘剤及び／又は界面活性剤をスポットし、光照射する工程（以下、「工程２－２」という）、
を含むものとしてよい。
　以下、バイオチップＢの例示的な製造方法を説明する。
工程２－１
　工程２－１は、基体に非特異的吸着を防止し、生体物質を固定化するためのコート層を設ける工程と、基体に境界を形成して反応エリアを設ける工程と、から選択される工程を含む。これらの工程を含めば、任意に工程の順番を入れ替えることができる。また、コート層を設ける工程の前に、基体を表面処理する工程を含んでもよい。
　基体に表面処理を施す工程における表面処理の方法としては、基体と前記コート層の密着性を上げるものであれば特に限定されるものではない。例えば、プラズマ処理やＵＶオゾン処理、コロナ処理など既知の表面改質方法を挙げることができる。
　基体への非特異的吸着を防止し、生体物質を固定化するためのコート層の形成は、水溶性ポリマーを含むコート液のスピンコート、塗付、噴霧、コート液への浸漬など既知の方法により行うことができる。例えばコート液は水溶性ポリマーを溶媒に溶解して調製することができる。溶媒としては、水、水と任意の割合で混じり合う低級アルコール及びこれらの混合物を用いることができる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノールが好ましい。中でも、溶媒としてエタノールと水の混合溶媒を用いることが好ましい。
　前記コート液中のポリマーの濃度は特に限定されないが、ポリマーの濃度は、例えば０．０００１～１０質量部、好ましくは０．００１～１質量部、光架橋剤の濃度は、例えば、前記ポリマーに対して１～２０質量部、好ましくは２～１０質量部とすることができる。
　前記ポリマーを含有する塗布液は、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤を含むことが好ましい。本発明において、「光反応性基」とは、光を照射することによりラジカルを生じる基を意味する。
　前記光架橋剤は、光照射により光反応性基がラジカルを生じることにより、アミノ基やカルボキシル基、有機化合物を構成する炭素原子等と共有結合を形成することができる。これにより、前記光架橋剤を含む塗布液を基体上に塗布した後に光を照射することによって、光架橋剤を介して基体とポリマーを結合させることができ、基体上に非特異的吸着防止効果を有するポリマー層を形成することができる。なお、本発明では、前記光架橋剤を使用せずに、又は、前記光架橋剤とともに、前記ポリマーに光反応性基及び／又は基体表面と共有結合又は配位結合可能な基を導入することにより、該ポリマーが有する基を利用して、基体とポリマーを結合することも可能である。
　本発明のコート層に含まれる水溶性ポリマー、光架橋剤は、それ自体公知であり、公知の製造方法により製造可能であり、また、市販されているものである。前記コート層の膜厚に特に制限はないが、１ｎｍ～１０μｍであることが好ましく、２ｎｍ～１μｍであることがより好ましく、１０ｎｍ～１００ｎｍであることが特に好ましい。
　本発明では、前述のようにコート層をコーティングした後、恒温・恒湿条件でエージングすることによりコート層を安定化することが好ましい。温度は５℃～４０℃が好ましく、温度２０℃～３０℃がより好ましい。湿度は４０％～８０％が好ましく、湿度５０％～７０％がより好ましい。エージング期間は１日～１ヵ月が好ましく、３日～２週間がより好ましい。
　基体への境界の形成方法としては特に制限されないが、前記ゴム組成物又は前記樹脂材料により予め形成されたリングを接着剤などを用いて基体に接着する方法、前記樹脂材料から構成される基体を射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などでリングを成型する方法を用いることができる。接着剤としては検査試料や生化学反応に影響を与えないものであれば特に制限はなく、市販の接着剤から適宜選択することができる。
工程２－２
　工程２－２は、前記基体上に、少なくとも被固定化物質と、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤と、増粘剤及び／又は界面活性剤とを格子目状にスポットする工程と、光照射する工程と、未反応成分を除去する工程と、を含む。
　工程１－２又は２－２において、前記被固定化物質を予め固定化担体に固定化する場合、固定化方法は既知の方法を用いることができる。固定化方法としては、例えば、固定化担体として前記磁性微粒子と、予め調製した被固定化物質とを適宜選択される公知の緩衝液などの溶液中で反応させ、被固定化物質を固定化した磁性微粒子を回収する方法を挙げることができるが、これに限定されるものではない。例えば、前記磁性微粒子を予め公知の緩衝液を用いて洗浄してもよく、また、被固定化物質を固定化した磁性微粒子を回収する際に公知の緩衝液を用いて洗浄してもよい。
　工程１－２又は２－２に用いる、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤としては特に限定されない。前記光架橋剤が有する光反応性基としては、アジド基（－Ｎ３）、アセチル基、ベンゾイル基、ジアジリン基などを挙げることができる。特に、アジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であり、ほとんどの有機物と共有結合を形成し得るため好ましい。アジド基を有する光架橋剤としては、例えば、ジアジドスリルベンなどが挙げられる。
　前記光架橋剤は、水溶性であることが好ましい。光架橋剤についての「水溶性」とは、０．５ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上の濃度の水溶液を与えることができることを意味する。
　前記被固定化物質又は被固定化物質が固定化された固定化担体と前記光架橋剤とは溶液に分散又は溶解していることが好ましい。溶液としては特に限定されないが、公知の緩衝液を用いることができる。緩衝液組成は、ＰＢＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などを挙げることができ、被固定化物質をそのまま用いる際はリン酸緩衝生理食塩水が好ましく、被固定化物質を固定化担体に固定化させて用いる際には固定化担体の凝集を防ぐため、ＨＥＰＥＳ緩衝液が好ましい。前記被固定化物質と前記光架橋剤が分散又は溶解した溶液を、スタンプ液と称する場合がある。
　前記被固定化物質の濃度は特に限定されないが、被固定化物質が固定化担体に固定化されていない場合には０．０５ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬがより好ましい。被固定化物質が固定化担体に固定化されている場合には被固定化物質を０．５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬで固定化担体に反応させることが好ましく、１ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬがより好ましく、被固定化物質を固定化した固定化担体を１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬで使用するのが好ましく、２．５ｍｇ／ｍＬ～７．５ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
　前記光架橋剤の濃度は特に限定されないが、０．０１ｍｇ／ｍＬ～１ｇ／ｍＬが好ましく、０．２ｍｇ／ｍＬ～０．２ｇ／ｍＬがより好ましい。
　前記被固定化物質又は被固定化物質が固定化された固定化担体と前記光架橋剤とが溶液に分散又は溶解している溶液にはさらに増粘剤及び／又は界面活性剤を含むことが好ましい。増粘剤を含ませることで前記溶液を基体上へスポットする際に、スポットの大きさを調整することができる。より具体的には、溶液中の増粘剤の濃度が高いほど、同じ体積の溶液をスポットした場合に、スポットの大きさ（基体との接触面積）は小さくなる傾向にある。また、界面活性剤を含ませることで前記被固定化物質が気－液界面に集積してスポットにおける前記被固定化物質がスポットの辺縁に局在化するのを抑制することができる。界面活性剤はまた、基体との親和性向上に寄与し、溶液中の界面活性剤の濃度が高いほど、同じ体積の溶液をスポットした場合に、スポットの大きさ（基体との接触面積）は大きくなる傾向にある。したがって、増粘剤と界面活性剤の濃度を調整することで、任意の大きさのスタンプを形成することができる。
　前記増粘剤としては、検査試料や生化学反応に影響を与えないものであれば特に制限されず、市販のものを使用することができる。例えば、セルロース系及びその誘導体、多糖類、ビニル系化合物、ビニリデン系化合物、ポリグリコール系化合物、ポリビニルアルコール系化合物、ポリアルキレンオキサイド系化合物などを挙げることができ、具体的にはジェランガム、キサンタンガム、カードラン、プルラン、グァーガム誘導体、ローカストビーンガム、カラギーナン、ペクチン、βグルカン、タマリンドガム、サイリウムシードガム、デキストラン、グリセリン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシルビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストリン酸脂肪エステル、イヌリン酸脂肪エステルなどを用いることができ、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールより選ばれる１種以上を用いることが好ましく、ポリビニルアルコールを用いることがより好ましい。
　前記増粘剤の濃度は特に限定されないが、例えばポリビニルアルコールを用いる場合は、前記溶液１００重量部に対し、０．０１重量部～１重量部が好ましく、０．０２重量部～０．５重量部がより好ましく、０．０３重量部～０．３重量部が特に好ましい。
　前記界面活性剤としては、検査試料や生化学反応に影響を与えないものであれば特に制限されず、市販の非イオン性界面活性剤を使用することができ、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル［Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００］、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル［Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［Ｔｗｅｅｎ２０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［Ｔｗｅｅｎ８０］、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル［Ｂｒｉｊ３５］、ポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテル［Ｂｒｉｊ５８］、プルロニック　Ｆ－６８、ポリエチレングリコール等或いはこれらを２種類以上混合したものを用いることができ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０から選ばれる１種類以上を用いることが好ましく、Ｔｗｅｅｎ２０を用いることがより好ましい。
　前記界面活性剤の濃度は特に限定されないが、例えばＴｗｅｅｎ２０を用いる場合は、前記溶液１００重量部に対し、０．００１重量部～１重量部が好ましく、０．００５重量部～０．５重量部がより好ましく、０．０１重量部～０．３重量部が特に好ましい。
　スタンプ液の粘度は、所望の形状のスポットが形成されるものであれば特に限定されないが、例えば、２５℃において０．４ｍＰａ・ｓ～４０ｍＰａ・ｓ、好ましくは０．５ｍＰａ／ｓ～１０ｍＰａ・ｓ、より好ましくは０．６ｍＰａ・ｓ～４ｍＰａ・ｓ、特に好ましくは０．８ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、特に約１．３ｍＰａ・ｓであってよい。また、スタンプ液の粘度は、２５℃において、０．６ｍＰａ／ｓ～１０ｍＰａ・ｓ、０．８ｍＰａ・ｓ～４ｍＰａ・ｓ、１．０ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．１２ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．１３ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．１４ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．１５ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．１６ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．１７ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．１８ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．１９ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ、１．２ｍＰａ・ｓ～２ｍＰａ・ｓ等であってもよい。
　基体への被固定化物質又は被固定化物質が固定化された固定化担体と光架橋剤とをスポットする方法は特に限定されず、例えば、非接触型分注機によりスポットする方法、マイクロピペット等によってスポットする方法、ピン方式によるスポッティングや圧電方式によるスポッティング等の方法を用いることができる。非接触型分注機によりスポットする方法は、ピン方式によるスポッティングなどの基体への接触が必要な手法に比べ、より正確な量の分散液を基体に適用でき、各スポットに固定化される被固定化物質の量のばらつきを軽減できるため、好ましい。特定の態様において、非接触型分注機は、ノズルの口径が固体担体の平均最大径に対し１００～２０００倍、好ましくは１５０～１０００倍、より好ましくは２００～７００倍、特に５００倍のものを使用することができる。スポットの直径は、例えば４００μｍ～８００μｍ、好ましくは５００μｍ～７００μｍとすることができる。
　非接触型分注機によるスポットにより、各スポットに固定化される被固定化物質の量（体積）の変動係数を１１．８％未満とすることができる。したがって、本発明のバイオチップの一態様は、被固定化物質が固定化された複数のスポットを有し、各スポットに固定化された被固定化物質の体積の変動係数が１１．８％未満、例えば、１１．５％以下、１１．０％以下、１０．５％以下、１０．０％以下、９．５％以下、９．０％以下、８．５％以下、８．０％以下、７．５％以下、７．０％以下、６．５％以下、６．０％以下、５．５％以下、５．０％以下、４．５％以下、４．０％以下、３．５％以下、３．０％以下である。１スポット当たりの被固定化物質の体積は、１スポット当たりの固形分の体積に概ね比例するため、１スポット当たりの被固定化物質の体積の変動係数は、１スポット当たりの固形分の体積の変動係数で代用することができる。スポットに存在する固形分の体積は、例えば、レーザー顕微鏡（特にキーエンス社製、ＶＫ－Ｘシリーズなどの形状解析レーザー顕微鏡）による３Ｄ画像から画像解析ソフト（キーエンス社製、マルチ解析アプリケーションなど）によって測定することができる。
　被固定化物質又は被固定化物質が固定化された固定化担体の固定化は、塗布後、好ましくは塗布した溶液を乾燥した後、光を照射することにより行うことができる。光は、用いる光反応性基がラジカルを生じさせることができる光であればよく、特に、光反応性基としてアジド基を用いる場合には、紫外線（例えば波長１０～４００ｎｍ）が好ましい。照射時間は、例えば、１０秒～１２０分、好ましくは３０秒～６０分、より好ましくは１分～３０分とすることができる。照射により被固定化物質は迅速に固定化するため、照射時間は固定化に要する時間とほぼ等しい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、１ｃｍ２当たり１ｍＷ～１００ｍＷ程度である。この光照射によって光架橋剤に含まれる光反応性基（また、ポリマーが光反応性基を有する場合には、該光反応性基）がラジカルを生じ、被固定化物質が固定化担体に固定化されていない場合にはポリマー層と被固定化物質とを光架橋剤を、被固定化物質が固定化担体に固定化している場合にはポリマー層と被固定化物質及び／又は固定化担体とを介して結合させることができる。
　前述のように所望の物質を固定化した後、公知の方法によって基体を洗浄して未反応成分等を除去することができるが、かかる洗浄は必須ではなく、スタンプ液を残したまま製品化してもよい。こうして、所望の被固定化物質が固定化されたバイオチップを得ることができる。洗浄を行わなかった場合、バイオチップのスポット上には、固定化された被固定化物質のほか、増粘剤及び／又は界面活性剤などのスタンプ液の成分が付着していることがある。かかるスタンプ液の残留物は、バイオチップの使用前に適宜洗浄して除去することができる。
５.アレルギー疾患判定システム
　本発明の別の側面は、アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させて得られた、前記プローブと、生体試料に含まれる抗体との反応に係るデータ及び反応した抗体の種類に係るデータを取得するデータ取得部、
前記データを予測モデルに入力し、予測結果を得るデータ処理部、
前記予測結果に基づきアレルギー疾患の判定を行う判定部、及び
判定結果を出力する出力部
を備え、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上の数モデルである、アレルギー疾患判定システム（以下、「本発明のシステム」と称することがある）に関する。
　以下、図面を参照して、本発明のシステムを説明する。なお、以下で説明するアレルギー疾患判定システムは本発明を例示することを意図したものであり、本発明を限定するためのものではない。また、本発明のシステムにおけるアレルギー疾患、プローブ、プローブと生体試料に含まれる抗体との反応に係るデータ、抗体の種類に係るデータ、予測モデルなどの本発明の判定方法と共通する構成については、本発明の判定方法について上記したとおりである。
　図１は、アレルギー疾患判定システム１００の機能的な構成を示すブロック図である。アレルギー疾患判定システム１００は、データ取得部１０１、データ処理部１０２、判定部１０３、及び出力部１０４を有する。
　データ取得部１０１は、プローブと標的抗体との反応に係るデータ及び反応した抗体の種類に係るデータを取得、記憶する。必要に応じて予測モデルに使用する他のデータを取得、記憶することもできる。データの取得は、プローブと標的抗体との反応を検出する検出器から直接行ってもよいし、キーボードやタッチパネルなどの入力装置から行ってもよいし、電子化されたデータを、記憶媒体インターフェイスやネットワークインターフェイスなどの通信インターフェイスを介して読み込むことにより行ってもよいし、これらの取得手法を組み合わせて行ってもよい。データは、書き込み可能な任意のデータ記憶デバイス、例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、磁気ディスク、光磁気ディスクなどに記憶される。
　データ処理部１０２は、データ取得部１０１に記憶されたデータにアクセスして予測モデルに必要な情報を読み出し、データ処理部１０１に記憶された予測モデルに入力し、予測結果を得る。予測結果は判定部１０３に送られ、そこで判定結果との紐づけが行われ、判定結果が出力部１０４に送られる。判定結果との紐づけは、種々の手法により行われ得る。例えば、予測式による予測モデルで非連続的な事項（例えば、重症・軽症の２値分類など）を判定する場合、予測式で得られた予測結果（予測値）を予め設定された基準値（例えば、カットオフ値など）との比較により、判定結果との紐づけを行うことができる。一方、予測モデルが、判定事項を直接出力する態様である場合（例えば、決定木を用いた非連続的事項の出力や、予測式を用いた連続的な事項（例えば、ＡＳＣＡ値など）の出力など）、予測結果をそのまま判定結果とすることもできる。出力部１０４は、送られてきた判定結果を出力する。出力形式は特に限定されず、例えば、各種のディスプレイにおける表示やプリンタによる出力、電子データの送信や移送可能な記憶媒体への記憶等が可能である。出力部１０４は、判定部１０３から送られてきた判定結果を記憶するよう構成することも可能である。
　本発明のシステムは、上記事項に加え、アレルギー疾患の判定に有用なさらなる機能や構成を備えていてもよい。例えば、本発明のシステムは、判定事項の関連情報を判定結果と合わせて出力することができる（関連情報出力機能）。例えば、判定事項が、アレルゲンに暴露した際の症状が軽症か重症かである場合、判定結果は、軽症又は重症の情報だけでなく、例えば、種々の誘発試験（食物経口負荷試験など）に関する関連情報を含んでいてもよい。かかる関連情報としては、軽症であれば、例えば、誘発試験が通院で実施可能であるとの情報、重症であれば、例えば、誘発試験を入院して実施すべき、又は、実施すべきでないとの情報等が挙げられる。
　予測モデルは、追加の訓練データによる最適化などにより適宜更新され得る。予測モデルの更新は、ユーザーが手動で行っても、更新された予測モデルが格納されたサーバーなどにシステムが自動的にアクセスし、更新された予測モデルを取得することなどにより、自動的に行われてもよい（予測モデル更新機能）。
　判定結果との紐づけに使用する基準値は変更可能であってもよい。例えば、本発明のシステムは、基準値を複数の候補から選択できるように構成されていても、ユーザーが基準値を入力できるように構成されていてもよい。したがって、本発明のシステムは、例えば判定部１０３が、基準値を複数の候補からユーザーに選択させる機能や、基準値をユーザーに入力させる機能を有していてもよい（基準値変更機能）。
　本発明のシステムは、プローブと標的抗体との反応を検出する検出部を備えていてもよい。検出部は、プローブと標的抗体との反応を検出する検出器、プローブと標的抗体との反応に関するデータ及び抗体の種類に関するデータなどをデータ取得部に送信する送信器を備えていてもよい。
　本発明のシステムはまた、システムの操作やデータ入力を可能にするユーザーインターフェース、電源、インターネットなどを介して外部の情報を取り込むことを可能にする通信インターフェースなどを備えていてよい。
　予測結果と判定結果の紐づけに、予測結果（予測値）と基準値との比較を行う態様の本発明のシステムにおけるデータ処理の一例を、図２のフローチャートに基づいて説明する。まず、システムを起動すると、判定部１０３は記憶ユニットに記憶された基準値の候補をユーザーに提示する（Ｓ１）。ユーザーが基準値を選択すると、選択された基準値が判定部１０３の記憶ユニットに記憶される。次に、データ取得部１０１がユーザーにデータの入力を求め、入力されたデータは、データ取得部１０１の記憶ユニットに記憶される（Ｓ２）。次いで、データ処理部１０２が、データ取得部１０１の記憶ユニットに記憶されたデータと、データ処理部１０２の記憶ユニットに記憶された予測モデルを読み取り（Ｓ３）、予測モデルにデータを入力して（Ｓ４）、予測値を得る（Ｓ５）。予測値のみを出力する場合（Ｓ６でＹｅｓ、Ｓ７でＮｏ）、得られた予測値が出力部１０４に送られ、予測値が出力され（Ｓ１０）、処理が終了する。得られた予測値は、直接アレルギー疾患判定の指標として利用することができる。特に予測値が連続的なもの（例えば、予測式による計算結果など）である場合、レベル感などの感覚的な判断を補助することが可能となる。予測値と判定結果を出力する場合（Ｓ６でＹｅｓ、Ｓ７でＹｅｓ）、予測値は判定部１０３に送られ、判定部１０３の記憶ユニットに記憶された、ユーザーが選択した基準値と比較される（Ｓ８）。予測値と判定結果は出力部１０４に送られ、予測値と判定結果が出力され（Ｓ９）、処理が終了する。判定結果のみを出力する場合（Ｓ６でＮｏ）、予測値は判定部１０３に送られ、ユーザーが選択した基準値と比較され（Ｓ１１）、判定結果のみ出力部１０４に送られ、判定結果が出力され（Ｓ１２）、処理が終了する。判定結果には、判定事項に係る情報（例えば、アレルゲンに暴露した際の症状が軽症か重症かの情報など）のほか、その情報に付随する情報（例えば、上述のような誘発試験の実施態様に関する情報）などが含まれ得る。
　本発明のシステムは、コンピュータにより実現することも可能である。図３は、スタンドアロン型の本発明のシステムを実現するコンピュータ２００のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。コンピュータ２００は、モニタ２１０、通信インターフェイス２２０、ＣＰＵ２３０、ＲＡＭ２４０及びストレージ２５０を含む。ストレージ２５０には本発明のシステムの各種処理を実行するための判定プログラム２５１、アレルギー疾患の判定に利用される取得データ２５２、予測モデル２５３及び基準値２５４が格納されている。ＣＰＵ２３０は、ストレージ２５０に格納された判定プログラム２５１のコードを読み出し、これを実行する。したがって、ＣＰＵ２３０は、本発明のシステムにおけるデータ処理部１０２及び判定部１０３などの機能を実現する。ストレージ２５０は、本発明のシステムにおけるデータ取得部１０１、処理部１０２及び判定部１０３の記憶機能を実現する。ＲＡＭ２４０はプログラム実行時の中間データ等を記憶する。モニタ２１０は、出力部１０４、ユーザーインターフェースなどの機能を実現する。通信インターフェイス２２０は、データ取得部１０１、出力部１０４などの機能を実現する。また、判定プログラム２５１のコードが読み出されることにより、本発明のシステムに係る処理の一部又は全部が、コンピュータ上で稼働しているＯＳや、他のソフトウェアにより実現されてもよい。
　本発明はまた、本発明の判定方法及び／又は指標取得方法をコンピュータ等により実現するプログラム、及び、当該プログラムを記憶した記憶媒体（例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ、ＢＤなどの光磁気ディスク、磁気テープ、フラッシュメモリなどの半導体メモリ）に関する。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。
＜例１：バイオチップの製造＞
　ポリカーボネートシート（三菱瓦斯化学社製、ＭＲ５８Ｕ、厚さ０．８ｍｍ）にＵＶ－オゾン照射装置（セン特殊光源社製、ＳＳＰ１６－１１０、ＵＶランプ：ＳＵＶ１１０ＧＳ－３６Ｌ）を用いて照射距離５０ｍｍで２分照射した。次に、７５％エタノール水溶液にポリエチレングルコールモノメタクリレートの重合体（三友化学研究所社製、ポリエチレングリコール部分子量３５０）を０．５重量部、４，４’－ジアジドスチルベン－２，２’－ジスルホン酸（東京化成工業社製、９８％、以下、ビスアジドとする）を０．０２５重量部となるようにそれぞれ溶解し、非特異的吸着防止剤の塗付液を得た。スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社製、ＭＳ－Ａ１００）を用いて、この塗付液１５μＬを前記ＵＶ照射処理したポリカーボネートに８００ｒｐｍで５秒、５０００ｒｐｍで１０秒の条件でコーティングした。コーティング後、ＵＶ照射装置（ＵＶＰ社製、ＣＬ－１０００）を用いて１２０ｍＷ／ｃｍ２で１０分照射した。コーティングした基体にシリコンゴム製のＯリング（１４φ）を接着剤で接着し、反応エリアを形成した。温度２５℃、湿度６５％で４日間エージングを施し、バイオチップ用基体を得た。
　塩化ナトリウムを０．８重量部、塩化カリウムを０．０２重量部、リン酸水素二ナトリウム十二水和物を０．２９重量部、リン酸二水素カリウムを０．０２重量部となるようにそれぞれ超純水に溶解し、ＰＢＳ溶液を得た。４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸を０．５９重量部となるように超純水に溶解し、ＨＥＰＥＳ溶液を得た。ＨＥＰＥＳ溶液に、ポリビニルアルコール（和光純薬工業社製、１６０－０３０５５）及びＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｐ７９４９－１００ＭＬ）を、それぞれ０．１重量部及び０．０５重量部となるように溶解し、スタンプ液用溶媒を得た。被固定化物質として、αｓ１－カゼイン、βカゼイン、βラクトグロブリン、及びαｓ１－カゼインの部分ペプチド（１５アミノ酸残基からなる２０のオーバーラップ断片（配列番号２～２１））の末端をアミノヘキシル（Ａｈｘ）基をスペーサーとしてビオチン化した被固定化物質をそれぞれＰＢＳ溶液中でＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ｂｅａｄｓ（粒径２００ｎｍ、多摩川精機社製）と４℃で、１．５時間反応させた後、精製してスタンプ液用溶媒に分散し、スタンプ液を得た。図４に、ビーズに固定された部分ペプチドの模式図を示す。また、以下にビオチン化したペプチドの構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
　ビスアジドを超純水に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬビスアジド溶液を調製した。１０ｍｇ／ｍＬビスアジド溶液を５倍希釈した。スタンプ液にビスアジド溶液を４．８重量部になるように溶解した。各々１種類の部分ペプチドを含むスタンプ液を非接触分注機（BioDot社製、非接触微量分注システムAD1520）を用いて、バイオチップ用基体に計８１スポットを９×９となるように格子点型多点分注スポット法でスポットした。スポット後、真空乾燥器を用いて、０．０９ＭＰａで１０分乾燥した。乾燥後、部分ペプチドが付着したビーズを基体に光架橋剤で固定化するため、ＵＶ照射装置（ＵＶＰ社製、ＣＬ－１０００）を用いて４ｍＷ／ｃｍ２で１０分照射し、バイオチップを得た。
＜例２：チップを用いた測定＞
　例１で製造したバイオチップを用いて、被験者から採取した血清中のＩｇＥ抗体及びＩｇＧ４抗体と、バイオチップに固定された部分ペプチドとの反応を測定した。被験者の構成は下表３のとおりである。なお、イムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン）が０．３５未満の被験者を非患者、イムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン）が０．３５以上でＡＳＣＡ値が２以下の被験者及びイムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン）が０．３５以上でかつ乳の総負荷量が６ｍＬ以上でＡＳＣＡ値が１１以下の被験者を軽症患者、それ以外を重症患者とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　バイオチップの反応エリアをビオチンを含むプロテインフリーブロッキング剤（PVDF Blocking Reagent for Can Get Signal（東洋紡社製、ＮＹＰＢＲ０１）に０．０２重量％のビオチンを添加したもの）により室温で１時間ブロッキングした後、ＴＢＳ－Ｔ溶液（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、２５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、ｐＨ７．４、０．１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。バイオチップの反応エリアに検査試料として８倍に希釈した血清を１３０μＬ添加し、振とうしながら、室温で８分間反応させた。検査試料を吸引除去し、ＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した。洗浄後、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution 2（東洋紡社製、ＮＫＢ－３０１）で２０００倍に希釈したＡＬＰ標識抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（Abcam社製、ab99805）又はＡＬＰ標識抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（Abcam社製、ab99822）を１３０μＬ添加し、振とうしながら、室温で４分間反応させた。抗体を吸引除去し、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。発光試薬（Dynalight Substrate with Rapid Glow Enhancer、Molecular Probes社製、4475406）を１３０μＬ添加し、１分間振とう後、Dynacom社製のＳｐｏｔＳｏｌｖｅｒ及びNHIのＩｍａｇｅＪを用いてスポットが存在しない部分をバックグラウンドとして発光部分のピクセル数をカウントすることにより発光強度を測定した。
（１）軽症・重症の判定
　以下の手法で予測モデルを作成した。各予測モデルにおいて、ａｎ、ｃｎは係数、ｘｎは説明変数、ｈ（）はヒンジ関数、ｎは自然数をそれぞれ表す。各係数及び説明変数は予測モデルごとに独立しており、異なる予測モデル同士で同じであるとは限らない。例えば、以下の予測モデル１－１の係数ａ１は、予測モデル１－２の係数ａ１とは独立しており、異なる値を取り得る。また、測定値（例えば、プローブの発光強度）を正規変換した数値を説明変数として用いた。
＜予測モデル１－１＞
　各々のプローブの発光強度及び被験者の年齢、総ＩｇＥ、イムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン、ミルク）を説明変数、軽症か重症かを目的変数として、ＬＡＳＳＯ回帰により二項分布を仮定した予測モデルの構築を行った。なお、表３の非患者及び軽症患者を軽症、重症患者を重症とした（予測モデル１－２～１－８についても同様）。各々のプローブの発光強度に関しては２要素間の交互作用項（２つの変数の積）を説明変数に加えた。Leave one out cross validation（ＬＯＯＣＶ)を行い、予測誤差最小となる位置で、以下の予測式で表される予測モデル１－１を得た。
　ａ１＋ｘ１×ａ２＋ｘ２×ａ３＋ｘ２２×ｘ３×ａ４＋ｘ４×ｘ２×ａ５＋ｘ３×ｘ５×ａ６＋ｘ３×ｘ６×ａ７＋ｘ２１×ｘ６×ａ８＋ｘ７×ｘ８×ａ９＋ｘ７×ｘ９×ａ１０＋ｘ７×ｘ１０×ａ１１＋ｘ１１×ｘ１２×ａ１２＋ｘ１１×ｘ１３×ａ１３＋ｘ１１×ｘ９×ａ１４＋ｘ１１×ｘ１４×ａ１５＋ｘ２×ｘ８×ａ１６＋ｘ１５×ｘ６×ａ１７＋ｘ１５×ｘ１６×ａ１８＋ｘ１７×ｘ１８×ａ１９＋ｘ１３×ｘ１９×ａ２０＋ｘ２０×ｘ１９×ａ２１＋ｘ１９×ｘ１４×ａ２２
　上記予測式において、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）、ｘ２～ｘ７、ｘ１１、ｘ１２、ｘ１５、ｘ１７、ｘ２１、ｘ２２は互いに異なるプローブ（ＩｇＥ）の発光強度、ｘ８～ｘ１０、ｘ１３、ｘ１４、ｘ１６、ｘ１８～ｘ２０は互いに異なるプローブ（ＩｇＧ４）の発光強度である。
＜予測モデル１－２＞
　各々のプローブの発光強度のみを説明変数とした以外は予測モデル１－１と同様に予測モデルの構築を行い、以下の予測式で表される予測モデル１－２を得た。
　ａ１＋ｘ１×ａ２＋ｘ２×ｘ３×ａ３＋ｘ４×ｘ５×ａ４＋ｘ３×ｘ６×ａ５＋ｘ７×ｘ８×ａ６＋ｘ７×ｘ９×ａ７＋ｘ１０×ｘ１１×ａ８＋ｘ１０×ｘ１２×ａ９＋ｘ１３×ｘ１１×ａ１０＋ｘ１３×ｘ１４×ａ１１＋ｘ１３×ｘ１２×ａ１２＋ｘ１３×ｘ１５×ａ１３＋ｘ１３×ｘ１６×ａ１４＋ｘ１×ｘ１７×ａ１５＋ｘ１８×ｘ９×ａ１６＋ｘ１８×ｘ１９×ａ１７＋ｘ５×ｘ２０×ａ１８＋ｘ１４×ｘ１５×ａ１９＋ｘ２１×ｘ１５×ａ２０＋ｘ１５×ｘ１６×ａ２１
　上記予測式において、ｘ１～ｘ１１、ｘ１３、ｘ１８は互いに異なるプローブ（ＩｇＥ）の発光強度、ｘ１２、ｘ１４～ｘ１７、ｘ１９～ｘ２１は互いに異なるプローブ（ＩｇＧ４）の発光強度である。
＜予測モデル１－３＞
　被験者の年齢、総ＩｇＥ及びイムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン、ミルク）を説明変数とした以外は予測モデル１－１と同様に予測モデルの構築を行い、以下の予測式で表される予測モデル１－３を得た。
　ａ１＋ｘ１×ａ２＋ｘ２×ａ３
　上記予測式において、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）、ｘ２はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン）である。
＜予測モデル１－４＞
　予測モデル１－１と同じ説明変数及び目的変数を用いてCART法により分類木を構築した。初めにサイズの大きい木を構築したあと、10-fold cross validationにより誤分類率の平均値を求め、最小となる位置で剪定し、図５の決定木で表される予測モデル１－４を得た。図中、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）、ｘ２～ｘ４は互いに異なるプローブ（ＩｇＥ）の発光強度である。
＜予測モデル１－５＞
　予測モデル１－３と同じ説明変数及び目的変数を用い、予測モデル１－４と同様の手順で、図６の決定木で表される予測モデル１－５を得た。図中、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）である。
＜予測モデル１－６＞
　予測モデル１－１と同じ説明変数及び目的変数を用いて、ＭＡＲＳ法により二項分布を仮定し、２要素間の交互作用を考慮したモデルを構築した。10-fold cross validationによりR-square値が最大となる位置を求め、以下の予測式で表される予測モデル１－６を得た。
　ａ１＋ｈ（ｃ１－ｘ１）×ａ２＋ｈ（ｘ１－ｃ１）×ｘ２×ａ３＋ｈ（Ｘ３－ｃ２）×ｈ（ｃ３－Ｘ４）×ａ４＋ｈ（ｃ４－Ｘ４）×ａ５＋ｈ（ｃ５－Ｘ５）×ａ６
　上記予測式において、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）、ｘ２はプローブ（ＩｇＧ４）の発光強度、ｘ３は総ＩｇＥ、イムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン）、ｘ４～ｘ５は互いに異なるプローブ（ＩｇＥ）の発光強度である。
＜予測モデル１－７＞
　予測モデル１－２と同じ説明変数及び目的変数を用い、予測モデル１－６と同様の手順で、以下の予測式で表される予測モデル１－７を得た。
　ａ１＋ｈ（ｘ１－ｃ１）×ａ２＋ｈ（ｃ１－ｘ１）×ａ３＋ｈ（ｘ２－ｃ２）×ａ４＋ｈ（ｃ３－ｘ１）×ｘ２×ａ５＋ｈ（ｘ１－ｃ４）×ａ６
　上記予測式において、ｘ１～ｘ２は互いに異なるプローブ（ＩｇＥ）の発光強度である。
＜予測モデル１－８＞
　予測モデル１－３と同じ説明変数及び目的変数を用い、予測モデル１－６と同様の手順で、以下の予測式で表される予測モデル１－８を得た。
　ａ１＋ｈ（ｃ１－ｘ１）×ａ２＋ｈ（ｘ２－ｃ２）×ａ３＋ｈ（ｘ２－ｃ３）×ｈ（ｘ３－ｃ４）×ａ４
　上記予測式において、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）、ｘ２はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン）、ｘ３は総ＩｇＥである。
　予測モデル１－１、１－２、１－４、１－６、１－７により得た各被験者の予測値からＲＯＣ曲線及びドットヒストグラム（図７～１０、１３～１４、１７～２０）を作成した。また、比較対象として、予測モデル１－３、１－５、１－８より得た被験者の予測値からＲＯＣ曲線及びドットヒストグラム（図１１～１２、１５～１６、２１～２２）も作成した。また、各予測モデルのＡＵＣ（Area Under Curve）を表４にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
（２）ＡＳＣＡ値の予測
＜予測モデル２－１＞
　各々のプローブの発光強度及び被験者の年齢、総ＩｇＥ、イムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン、ミルク）、ＩｇＥ希釈率を説明変数に、被験者のＡＳＣＡ値を目的変数として、ＬＡＳＳＯ回帰により正規分布を仮定したモデルを構築した。各々のプローブの発光強度に関しては２要素間の交互作用項（２つの変数の積）を説明変数に加えた。Leave one out cross validationを行い、予測誤差最小となる位置で、以下の予測式で表される予測モデル２－１を得た。
　ａ１＋ｘ１×ａ２＋ｘ２×ａ３＋ｘ３×ａ４＋ｘ４×ａ５＋ｘ５×ｘ３×ａ６＋ｘ６×ｘ３×ａ７＋ｘ６×ｘ４×ａ８＋ｘ７×ｘ８×ａ９＋ｘ７×ｘ９×ａ１０＋ｘ７×ｘ１０×ａ１１＋ｘ７×ｘ１１×ａ１２＋ｘ１２×ｘ８×ａ１３＋ｘ１３×ｘ１４×ａ１４＋ｘ８×ｘ９×ａ１５＋ｘ３×ｘ９×ａ１６＋ｘ３×ｘ１５×ａ１７＋ｘ１４×ｘ１６×ａ１８＋ｘ１４×ｘ１７×ａ１９＋ｘ１４×ｘ１８×ａ２０＋ｘ１４×ｘ１９×ａ２１＋ｘ２０×ｘ２１×ａ２２＋ｘ２２×ｘ１５×ａ２３＋ｘ２３×ｘ１５×ａ２４＋ｘ２３×ｘ２４×ａ２５＋ｘ１５×ｘ２５×ａ２６＋ｘ１５×ｘ２６×ａ２７＋ｘ１５×ｘ２４×ａ２８
　上記予測式において、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）、ｘ２はＩｇＥ希釈率、ｘ３～ｘ８、ｘ１２～ｘ１４、ｘ２０は互いに異なるプローブ（ＩｇＥ）の発光強度、ｘ９～ｘ１１、ｘ１５～ｘ１９、ｘ２１～ｘ２６は互いに異なるプローブ（ＩｇＧ４）の発光強度である。
＜予測モデル２－２＞
　被験者の年齢、総ＩｇＥ、イムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン、ミルク）を説明変数とした以外は予測モデル２－１と同様に予測モデルの構築を行い、以下の予測式で表される予測モデル２－２を得た。
　ａ１＋ｘ１×ａ２＋ｘ２×ａ３＋ｘ３×ａ４＋ｘ４×ａ５
　上記予測式において、ｘ１は被験者の年齢、ｘ２はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）、ｘ３はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン）、ｘ４は総ＩｇＥである。
＜予測モデル２－３＞
　予測モデル２－１と同じ説明変数及び目的変数を用いてＣＡＲＴ法により回帰木を構築した。初めにサイズの大きい木を構築したあと、10-fold cross validationにより誤分類率の平均値を求め、最小となる位置で剪定し、図２３の決定木で表される予測モデル２－３を作得た。図中、ｘ１はプローブ（ＩｇＥ）の発光強度、ｘ２はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）である。
＜予測モデル２－４＞
　予測モデル２－２と同じ説明変数及び目的変数を用い、予測モデル２－３と同様の手順で、図２４の決定木で表される予測モデル２－４を得た。図中、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）である。
＜予測モデル２－５＞
　予測モデル２－１と同じ説明変数及び目的変数を用い、ＭＡＲＳ法により正規分布を仮定し、２要素間の交互作用を考慮したモデルを構築した。Generalized cross validationによりR-square値が最大となる位置を求め、以下の予測式で表される予測モデル２－５を得た。
　ａ１＋ｈ（ｘ１－ｃ１）×ａ２＋ｈ（ｃ２－ｘ２）×ａ３＋ｈ（ｃ２－ｘ２）×ｘ３×ａ４＋ｈ（ｘ４－ｃ３）×ａ５＋ｈ（ｘ１－ｃ１）×ｘ５×ａ６＋ｈ（ｘ１－ｃ１）×ｈ（ｘ６－ｃ４）×ａ７＋ｈ（ｘ１－ｃ１）×ｈ（ｃ４－ｘ６）×ａ８＋ｈ（ｘ６－ｃ５）×ａ９＋ｈ（ｘ１－ｃ１）×ｘ７×ａ１０＋ｘ８×ｈ（ｃ２－ｘ２）×ａ１１＋ｈ（ｃ６－ｘ９）×ｈ（ｃ３－ｘ４）×ａ１２＋ｈ（ｘ１０－ｃ７）×ａ１３＋ｈ（ｃ８－ｘ１１）×ｈ（ｃ５－ｘ６）×ａ１４＋ｈ（ｃ９－ｘ１２）×ｈ（ｃ３－ｘ４）×ａ１５＋ｈ（ｃ５－ｘ６）×ｈ（ｘ１３－ｃ１０）×ａ１６＋ｈ（ｃ１１－ｘ１４）×ｈ（ｃ３－ｘ４）×ａ１７＋ｈ（ｃ１２－ｘ１５）×ｈ（ｃ３－ｘ４）×ａ１８
　上記予測式において、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）、ｘ５は総ＩｇＥ、ｘ２、ｘ８、ｘ９、ｘ１２、ｘ１４、ｘ１５は互いに異なるプローブ（ＩｇＥ）の発光強度、ｘ３、ｘ４、ｘ６、ｘ７、ｘ１０、ｘ１１、ｘ１３は互いに異なるプローブ（ＩｇＧ４）の発光強度である。
＜予測モデル２－６＞
　予測モデル２－２と同じ説明変数及び目的変数を用い、予測モデル１－６と同様の手順で、以下の予測式で表される予測モデル２－６を得た。
　ａ１ｘｈ（ｃ１－ｘ１）×ａ２＋ｈ（ｃ２－ｘ２）×ｈ（ｘ１－ｃ１）×ａ３
　上記予測式において、ｘ１はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（カゼイン）、ｘ２はイムノキャップ特異的ＩｇＥ（ミルク）である。
　予測モデル２－１、２－３、２－６により得た各被験者の予測値（横軸）及び観測値（縦軸）の散布図（図２５、２７、２９）を作成した。また、比較対象として、予測モデル２－２、２－４、２－６より得た各被験者の予測値（横軸）及び観測値（縦軸）の散布図も作成した（図２６、２８、３０）。また、各予測モデルの相関係数を表５にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　以上の結果から、アレルゲン又はその断片に対するＩｇＥ及びＩｇＧ４の反応性をパラメータに加えることにより、重症、軽症の区別やＡＳＣＡ値の予測がより正確に行えることが明らかとなった。
１００：アレルギー疾患判定システム
１０１：データ取得部
１０２：データ処理部
１０３：判定部
１０４：出力部
２００：コンピュータ
２１０：モニタ
２２０：通信インターフェイス
２３０：ＣＰＵ
２４０：ＲＡＭ
２５０：ストレージ
２５１：判定プログラム
２５２：取得データ
２５３：予測モデル
２５４：基準値

Claims (17)

  1. 　アレルギー疾患の判定方法であって、
    　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させる工程、
    　前記プローブと、生体試料に含まれる抗体との反応を検出する工程、
    　前記プローブと反応した抗体の種類を判別する工程、
    　前記プローブの少なくとも２種の各々についての抗体との反応に係るデータ及び結合した抗体の種類に係るデータを予測モデルに入力し、予測結果を得る工程、及び
    　前記予測結果に基づいて、アレルギー疾患を判定する工程
    を含み、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである、方法。
  2. 　アレルギー疾患の判定が、アレルギー疾患が軽症か重症かの判定及び総ＡＳＣＡ値の予測から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させて得られた、前記プローブと生体試料に含まれる抗体との反応に係るデータ及び反応した抗体の種類に係るデータを取得する工程、及び前記データを予測モデルに入力し、予測結果を得る工程、
    を含み、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである、アレルギー疾患判定のための指標を得る方法。
  4. 　抗体の種類がＩｇＥ及びＩｇＧ４から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　プローブが、アレルゲンのオーバーラップ断片を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　プローブが固相化されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　抗体との反応に係るデータが、抗体との反応強度である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　予測モデルの作成に、追加の訓練データが用いられる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　アレルゲンが、食物アレルゲン、吸入性アレルゲン及び接触性アレルゲンから選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　食物アレルゲンが、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミン、リゾチーム、グリアジン、アミラーゼインヒビター、アルブミン、グロブリン、グルテン及びトロポミオシンから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　対象から採取した生体試料が、採取時期の異なる２種以上の生体試料を含み、アレルギー疾患を判定する工程が、前記２種以上の生体試料について得られた予測結果を相互に比較することを含む、アレルギー疾患のモニタリングに使用する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　アレルギー疾患が食物アレルギーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
  14. 　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブが基体に固定された、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に使用するためのバイオチップ。
  15. 　アレルゲン及びその断片から選択される２種以上のプローブと、対象から採取した生体試料とを接触させて得られた、前記プローブと、生体試料に含まれる抗体との反応に係るデータ及び反応した抗体の種類に係るデータを取得するデータ取得部、
    前記データを予測モデルに入力し、予測結果を得るデータ処理部、
    前記予測結果に基づきアレルギー疾患の判定を行う判定部、及び
    判定結果を出力する出力部
    を備え、前記予測モデルが、少なくとも前記プローブについての抗体との反応に係る訓練データ及び結合した抗体の種類に係る訓練データを用いて作成された、非線形モデル又は説明変数が２個以上且つ項数が２項以上のモデルである、アレルギー疾患判定システム。
  16. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
  17. 　請求項１６に記載のプログラムを記憶した記憶媒体。
     
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