KR20040044336A - 특이결합반응 측정방법과 이에 이용하는 시약키트 및특이결합반응 측정장치 - Google Patents

특이결합반응 측정방법과 이에 이용하는 시약키트 및특이결합반응 측정장치 Download PDF

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마쯔시다덴기산교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 1 개의 반응용기 내에서 복수의 피측정물질을 측정하기가 가능한 특이결합반응 측정방법과, 이에 이용하는 시약키트 및 특이결합반응 측정장치를 제공하는 것이다.
우선 도 1에 나타내는 공정(St1)에서, 피측정물질(2)의 함유량을 측정하고자 하는 시료(1)와, 피측정물질(2)에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질(3)이 고정된 자성(磁性)입자(4)를 포함하는 반응계를 구축한다. 다음으로 도 1에 나타내는 공정(St2)에서, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이 때 상기 공정(St1)에서 응집복합체(5)가 발생할 경우에는, 상기 반응계가 흐려져 산란광 강도 및 투과광량 등에 변화가 생긴다. 따라서 산란광 강도 및 투과광량 등을 측정함으로써, 반응계의 흐림(turbidity) 정도를 견적할 수 있다. 다음에 도 1에 나타내는 공정(St3)에서, 피측정물질(2)과 특이결합물질(3)과 자성입자(4)로 구성되는 응집복합체(5)와, 응집복합체(5)를 형성하지 않은 자성입자(도시 생략)를 자력을 이용하여 회수하고 반응계로부터 제거한다.

Description

특이결합반응 측정방법과 이에 이용하는 시약키트 및 특이결합반응 측정장치{SPECIFIC COUPLING REACTION MEASURING METHOD AND REAGENT KIT AND SPECIFIC COUPLING REACTION MEASURING APPARATUS FOR USE IN THE SAME}
본 발명은, 시료 중에 함유돼있을 가능성이 있는 피측정물질의 함유량을 측정할 수 있는 특이결합반응 측정방법, 이에 이용되는 시약키트 및 특이결합반응 측정장치에 관한 것이다.
의료분야에서는, 각종 질환의 진단 및 증세의 경과를 조사하기 위해, 사람의 체액 중에 존재하는 각 질환에 특징적인 단백질의 함유량 측정이 널리 실행되고 있다. 이들 단백질 함유량의 측정에는, 표적이 되는 단백질을 항원으로 하여 특이하게 인식하는 항체와 항원의 반응(항원항체반응)을 이용한 면역반응 측정검사가 널리 이용되고 있다. 현재, 면역반응 측정방법에도 여러 가지 원리를 이용한 것이 개발되고 있다.
상술한 여러 가지 면역반응 측정방법 중에서도, 시료 중의 피측정물질 함유량을 측정하기 위해, 항원항체반응에 의해 생성되는 항원항체 복합체의 응집체(이하, 응집복합체라 칭함)를 검출하는, 면역비롱법(免疫比朧法; immune nephelometry)(이하 비롱법으로 약칭), 면역비탁법(免疫比濁法; immune turbidimetry)(이하 비탁법으로 약칭), 슬라이드응집법 등의 측정방법은 잘 알려진 바이다. 항원항체반응에서는, 응집복합체 생성에 의해 반응계에 흐림을 발생시킨다. 응집복합체의 생성에 의해 반응계에 발생하는 흐림 정도는, 항원의 양 및 항체 양에 의존한다. 이 점에 기초하여 비롱법 및 비탁법은, 상술한 반응계에 발생하는 흐림의 정도를 광학적으로 측정하고, 그 측정값으로부터 항원의 양 또는 항체양을 산출하는 방법이다. 구체적으로, 비롱법은 반응계에서 산란된 광량의 변화에 기초하여, 비탁법은 반응계에서의 산란에 의해 감소된 투과광량의 변화에 기초하여, 응집복합체를 측정하는 방법이다. 일반적으로 상기 2 가지 측정방법에서는, 동일 반응계를 측정에 이용할 수 있다. 즉 어느 한쪽 측정방법으로 측정할 수 있는 반응계는, 다른 한쪽의 측정방법으로도 측정할 수 있다. 슬라이드응집법은, 응집복합체의 생성에 의해, 반응계 중에 발생한 흐림 또는 응집덩어리를, 슬라이드유리 위 등에서 시각확인 등으로 판정하는 방법이다. 슬라이드응집법으로도, 비롱법, 비탁법과 같은 반응계를 측정에 이용할 수 있다. 이상 열거한 3 가지 측정방법은, 반응계 중에 항원 및 항체가 고르게 분산된 상태에서 측정을 실시하는 것이기 때문에, 「균일계 면역반응 측정방법」이라 총칭된다.
또 의료분야에서는, 각종 질환의 진단 및 증세의 경과를 조사하기 위해, 복수 종류의 피측정물질 함유량 측정이 실시된다. 예를 들어 임상검사에서는, 신장 여과능력의 지표로서 사람의 뇨 중에 함유될 수 있는 전체 단백질 함유량을, 또 급성 사구체신염, IgA신증, 신장결핵, 신장경색, 신우신염, 방광염, 요도염, 전립선염 등 요로 염증, 결석증 및 종양 등의 지표로서 사람의 뇨 중에 함유될 수 있는 적혈구(헤모글로빈) 함유량을 측정한다(예를 들어, 가네이 이즈미(金井泉) 원저, 가네이 마사미츠(金井正光) 편저, 「임상검사법제요」, 개정 제 31판, 가네하라(金原)출판주식회사, 1998년, 156쪽, 179-181쪽). 또한 일특개평 5-2024호 공보는, 복수 종류의 피측정물질을 측정하기 위한 균일계 면역반응 측정반응으로서, 피측정물질별로 다른 반응용기를 준비하고, 각 피측정물질에 대한 측정을 개별로 실시하는 방법을 개시하고 있다.
여기서, 시료 중에 함유되는 피측정물질과, 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질과의 반응을 이용하여, 시료 중의 피측정물질 함유량을 측정하는 방법을 본 명세서 중에서는 「특이결합반응 측정방법」이라 칭한다. 상술한 면역반응 측정방법도 특이결합반응 측정방법의 일종이다.
그러나 상기 종래의 방법에서는, 복수 종류의 피측정물질을 측정할 때 피측정물질의 수와 같은 수의 반응용기를 준비해야 할 필요가 있어, 측정에 대량의 시료를 필요로 한다.
본 발명은 상기 사정에 감안하여 이루어진 것으로, 1 개의 반응용기 내에서 복수의 피측정물질 측정이 가능한 특이결합반응 측정방법, 이에 이용되는 시약키트 및 특이결합반응 측정장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 실시형태에 있어서의 면역반응 측정방법을 나타내는 흐름도.
도 2의 (a)~(c)는 도 1에 나타내는 면역반응 측정방법의 각 공정에서의 반응계를 모식적으로 나타내는 도.
도 3은 본 발명의 다른 실시형태에 있어서의 면역반응 측정방법을 나타내는 흐름도.
도 4의 (a) 및 (b)는 도 3에 나타내는 면역반응 측정방법의 반응계를 모식적으로 나타내는 도.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서의 면역반응 측정방법을 나타내는 흐름도.
도 6은 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서의 면역반응 측정방법을 나타내는 흐름도.
도 7의 (a) 및 (b)는 도 6에 나타내는 면역반응 측정방법의 반응계를 모식적으로 나타내는 도.
도 8은 본 발명 실시형태의 측정장치 구성을 나타내는 모식도.
도 9는 도 8의 측정장치 일부의 배치관계를 나타내는 도.
도 10은 본 발명의 다른 실시형태의 측정장치 구성을 나타내는 모식도.
도 11은 도 10의 측정장치 일부의 배치관계를 나타내는 도.
도 12는 도 10의 측정장치 일부의 배치관계를 나타내는 도.
* 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 *
1 : 시료 2 : 피측정물질
2a : 제 1 피측정물질 2b : 제 2 피측정물질
3 : 특이결합물질 3a : 제 1 특이결합물질
3b : 제 2 특이결합물질 4, 4a, 4c : 자성입자
4b, 5, 5a, 5c : 응집복합체 6 : 자석
7 : 항체 8 : 자성복합체
100, 200 : 측정장치 101, 201 : 광원
102, 202 : 셀 103, 203 : 셀 홀더
104, 204 : 광 검출기 105 : 영구자석
106 : 커버 107 : 암
108, 208 : 제거수단 202a : 배출구
205 : 전자석 206 : 용기
207 : 밸브
본 발명의 특이결합반응 측정방법은, 시료 중의 피측정물질 함유량을 측정하는 특이결합반응 측정방법이며, 상기 시료와, 상기 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질이 고정된 자성입자를 포함하는 반응계를 구축하는 공정(a)과, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(b)과, 상기 피측정물질과 상기 특이결합물질과 상기 자성입자를 포함하는 응집복합체를, 자력을 이용하여 상기 반응계로부터 제거하는 공정(c)을 포함한다.
본 발명에 의하면, 측정 후의 공정(c)에서, 반응계 중에 존재했던 자성입자와, 피측정물질과 특이결합물질과 자성입자를 포함하는 응집복합체가, 자력을 이용함으로써 반응계로부터 제거된다. 특히 본 발명에서는 자력을 이용하므로, 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에, 측정 후의 반응계를 이용하여, 시료에 함유된 다른 성분을 각종 측정방법으로 측정할 수 있다.
또 종래에는, 2 종류의 피측정물질을 측정할 때, 피측정물질 수와 같은 수의 반응용기를 준비할 필요가 있었다. 그러나 본 발명에 의하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면 이를 이용하여 2 종류의 피측정물질을 측정할 수 있다. 따라서 측정에 필요한 시료를 매우 소량으로 할 수 있다. 이로써 예를 들어 의료분야에서는, 환자로부터의 시료 채취량을 저감할 수 있어, 환자에의 부담을 경감시킬 수 있다.
상기 광학특성은, 산란광 강도 또는 투과광량이라도 된다.
상기 자성입자의 직경은 약 0.05~2㎛의 범위 내인 것이 바람직하다.
상기 공정(c)에서, 상기 반응계에 잔존하는 상기 자성입자를 상기 반응계로부터 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 특이결합반응 측정방법은, 시료 중의 제 1 피측정물질 및 제 2 피측정물질 함유량을 측정하는 특이결합반응 측정방법이며, 상기 시료와, 상기 제 1 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 1 특이결합물질이 고정된 자성입자를 포함하는 반응계를 구축하는 공정(a)과, 상기 공정(a) 후, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(b)과, 상기 제 1 피측정물질과 상기 제 1 특이결합물질과 상기 자성입자를 포함하는 응집복합체를, 자력을 이용하여 모으는 공정(c)과, 상기반응계에, 상기 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 2 특이결합물질을 첨가하는 공정(d)과, 상기 공정(d) 후, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(e)을 포함한다.
본 발명에 의하면 제 2 피측정물질을 측정할 때, 반응계 중의 피측정물질과 특이결합물질과 자성입자를 포함하는 응집복합체에 의한 반응계의 광학특성 변화가, 자력을 이용함으로써 제거된다. 특히 자력을 이용하기 때문에 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에 본 발명의 특이결합반응 측정방법에 의하면, 제 2 피측정물질을 측정할 때도 측정값의 신뢰성이 높다.
또 종래에는, 2 종류의 피측정물질을 측정할 때, 피측정물질의 종류와 같은 2 개의 반응용기를 준비할 필요가 있었지만, 본 발명에 의하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면 이를 이용하여 2 종류의 피측정물질의 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 측정에 필요한 시료가 매우 소량이다. 이로써 예를 들어 의료분야에서는, 환자로부터의 시료 채취량을 저감할 수 있어, 환자에의 부담을 경감시킬 수 있다.
상기 공정(d)에서는, 반응계가 폴리에틸렌글리콜을 2~6 중량% 함유하는 것이 바람직하다.
상기 제 2 특이결합물질은, 상기 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 항원 또는 항체와, 상기 항원 또는 항체가 고정된 비자성입자로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 자성입자의 직경은 약 0.05~2㎛의 범위 내이며, 상기 비자성입자의 직경은 약 0.05~2㎛의 범위 내인 것이 바람직하다.
상기 제 1 피측정물질과 상기 제 2 피측정물질의 조합은 휴먼 헤모글로빈과 휴먼 알부민의 조합이라도 된다.
상기 공정(c)에서, 상기 반응계에 잔존하는 상기 자성입자를 모으는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 특이결합반응 측정방법은, 시료 중의 n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질 함유량을 측정하는 특이결합반응 측정방법이며, 상기 시료와, 미측정 피측정물질 중 1 종류에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질이 고정된 자성입자를 포함하는 반응계를 구축하는 공정(a)과, 상기 공정 (a) 후에 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(b)과, 상기 1 종류의 피측정물질과 상기 특이결합물질과 상기 자성입자를 포함하는 응집복합체를, 자력을 이용하여 상기 반응계로부터 제거하는 공정(c)과, 상기 공정(c) 후에, 상기 공정(b)이 제 (n-1)회 미만일 경우, 다시 공정(a)으로 진행하도록 판단하는 공정(d)과, 상기 반응계에, 상기 반응계에 남은 1 종류의 미측정 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 첨가하는 공정(e)과, 상기 공정(e) 후, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(f)을 포함한다.
본 발명에 의하면, 피측정물질과 특이결합물질과 자성입자를 포함하는 응집복합체가, 광학특성 측정 후에 자력을 이용함으로써 제거된다. 자력을 이용하므로 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에 복수의 피측정물질을 측정할 때도, 먼저 형성된 응집복합체의 영향이 거의 배제되므로, 광학특성 측정 시에매회 측정값의 신뢰성이 높다.
특히 종래에는, 2 종류 이상의 피측정물질을 측정할 때, 피측정물질 종류와 같은 수의 반응용기를 준비할 필요가 있었지만, 본 발명에 의하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 측정에 필요한 시료가 매우 소량이다. 이로써 예를 들어 의료분야에서는, 환자로부터의 시료 채취량을 저감할 수 있어, 환자에의 부담을 경감시킬 수 있다.
상기 공정(c)에서, 상기 반응계에 잔존하는 상기 자성입자를 상기 반응계로부터 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 특이결합반응 측정방법은, 시료 중의 n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질 함유량을 측정하는 특이결합반응 측정방법이며, 상기 시료와, 미측정 피측정물질 중 1 종류에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 포함하는 반응계를 구축하는 공정(a)과, 상기 공정 (a) 후에 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(b)과, 상기 1 종류의 피측정물질과 상기 특이결합물질을 포함하는 응집복합체에, 결합 가능한 물질과 자성입자를 포함하는 자성복합체를 반응계에 첨가하는 공정(c)과, 상기 자성복합체가 결합된 상기 응집복합체를, 자력을 이용하여 상기 반응계로부터 제거하는 공정(d)과, 상기 공정(d) 후에, 상기 공정(b)이 제 (n-1)회 미만일 경우, 다시 공정(a)으로 진행하도록 판단하는 공정(e)과, 상기 반응계에, 상기 반응계에 남은 1 종류의 미측정 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 첨가하는 공정(f)과, 상기 공정(e) 후, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(g)을 포함한다.
본 발명에 의하면, 피측정물질과 특이결합물질을 포함하는 응집복합체가, 광학특성 측정 후에 자력을 이용함으로써 제거된다. 자력을 이용하므로 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에 복수의 피측정물질을 측정할 때도, 먼저 형성된 응집복합체의 영향이 거의 배제되므로, 광학특성 측정 시에 매회 측정값의 신뢰성이 높다.
특히 종래에는, 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 때는, 피측정물질 종류와 같은 수의 반응용기를 준비할 필요가 있었지만, 본 발명에 의하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 측정에 필요한 시료가 매우 소량이다. 이로써 예를 들어 의료분야에서는, 환자로부터의 시료 채취량을 저감할 수 있어, 환자에의 부담을 경감시킬 수 있다.
상기 공정(d)에서, 상기 응집복합체에 결합하지 않은 상기 자성복합체를 상기 반응계로부터 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명의 시약키트는, 시료 중의 제 1 피측정물질 및 제 2 피측정물질의 함유량을 측정하기 위한 시약키트이며, 상기 제 1 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 1 특이결합물질이 고정된 자성입자와, 상기 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 2 특이결합물질을 포함한다.
본 발명의 시약키트를 특이결합반응 측정방법에 이용하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 측정에 필요한 시료가 매우 소량으로 가능하다.
상기 자성입자의 직경은 약 0.05~2㎛의 범위 내인 것이 바람직하다.
상기 제 2 특이결합물질은, 상기 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 항원 또는 항체와, 상기 항원 또는 항체가 고정된 비자성입자로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 시약키트는, 시료 중의 n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질 함유량을 측정하기 위한 시약키트이며, 상기 n 종류의 피측정물질 중 1 종류의 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 1 종류의 특이결합물질과, 상기 n 종류의 피측정물질 중 나머지 (n-1) 종류의 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질이 각각 고정된 (n-1) 종류의 자성입자를 포함한다.
본 발명의 시약키트를 특이결합반응 측정방법에 이용하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 측정에 필요한 시료가 매우 소량으로 가능하다.
본 발명의 또 다른 시약키트는, 시료 중의 n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질 함유량을 측정하기 위한 시약키트이며, 상기 n 종류의 피측정물질에 대해 각각 특이하게 결합하는 n 종류의 특이결합물질과, 상기 n 종류의 피측정물질 중 (n-1) 종류의 피측정물질과 그에 대응하는 (n-1) 종류의 특이결합물질을 포함하는 응집결합체에 결합 가능한 물질과, 상기 물질이 고정된 자성입자를 포함하는 자성복합체를 포함한다.
본 발명의 시약키트를 특이결합반응 측정방법에 이용하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 측정에 필요한 시료가 매우 소량으로 가능하다.
본 발명의 특이결합반응 측정장치는, 셀과, 상기 셀을 향해 광을 조사하는 광원과, 상기 반응계로부터의 산란광 또는 투과광을 검출하는 광 검출기와, 상기 셀 내에 자성입자가 포함된 경우, 자력을 이용하여, 상기 셀 내로부터 상기 자성입자를 제거하는 제거수단을 구비한다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 상술한 특이결합반응 측정방법에 매우 적합한 특이결합반응 측정장치가 얻어진다.
상술한 목적 및 기타의 목적과 본 발명의 특징 및 이점은 첨부 도면과 관련한 다음의 상세한 설명을 통해 보다 분명해 질 것이다.
(실시형태)
이하 각 실시형태에서는 특이결합반응 측정방법의 하나인, 면역반응 측정방법을 도면을 이용하여 설명하기로 한다. 또 간단히 하기 위해, 각 실시형태에 공통되는 구성요소는, 동일 참조부호를 부여하기로 한다.
(제 1 실시형태)
도 1은 본 실시형태의 면역반응 측정방법을 나타내는 흐름도이다. 도 2의 (a)~(c)는 본 실시형태의 면역반응 측정방법의 각 공정에서의 반응계를 모식적으로 나타내는 도이다.
우선, 도 1에 나타내는 공정(St1)에서 도 2의 (a)에 나타내는 바와 같이, 피측정물질(2)의 함유량을 측정하고자 하는 시료(1)와, 피측정물질(2)에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질(3)이 고정된 자성입자(4)를 포함하는 반응계를 구축한다. 시료(1)로서는 예를 들어, 혈액, 뇨 등의 체액 그대로거나, 혹은 이들과 완충액을 혼합한 것을 들 수 있다. 여기서 피측정물질(2)이 항원일 경우 특이결합물질(3)은 항체이며, 피측정물질(2)이 항체일 경우 특이결합물질(3)은 항원이다.
이로써, 피측정물질(2)이 시료 중에 포함되어 있을 때는, 도 2의 (b)에 나타내는 바와 같이, 피측정물질(2)과 특이결합물질(3)의 항원항체반응에 의해, 피측정물질(2)과 특이결합물질(3)과 자성입자(4)로 이루어지는 응집복합체(5)가 생성된다. 피측정물질(2)이 시료 중에 포함되지 않았을 때는, 피측정물질(2)과 특이결합물질(3)의 항원항체반응에 의한 응집복합체(5)는 생성되지 않는다.
다음으로, 도 1에 나타내는 공정(St2)에서, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이 때 상기 공정(St1)에서 응집복합체(5)가 생성되는 경우에는, 상기 반응계에 흐림이 발생하여 산란광 강도 및 투과광량 등에 변화가 생긴다. 따라서 산란광 강도 또는 투과광량 등을 측정함으로써, 반응계의 흐림 정도를 견적할 수 있다. 여기서 측정 전의 시료(1)를 기준으로 하면서, 상기 반응계의 광학적 변화량, 즉 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량을 측정하는 것이 바람직하다. 또 시료(1)를 완충액과 혼합하여 반응계를 구축할 경우, 완충액을 기준으로 해도 된다.
다음, 도 1에 나타내는 공정(St3)에서, 피측정물질(2)과 특이결합물질(3)과 자성입자(4)로 이루어지는 응집복합체(5)와, 응집복합체(5)를 형성하지 않은 자성입자(도시 생략)를 자력(구체적으로는 도 2의 (c)에 나타내는 바와 같이, 자석(6))을 이용하여 회수하고 반응계로부터 제거한다.
면역반응 측정방법에 있어서, 응집복합체의 생성으로 반응계에 발생하는 흐림 정도는, 항원의 양 및 항체의 양에 의존한다. 이 점에 기초하여 본 실시형태에 의하면, 상술한 반응계의 광학특성을 측정하고, 그 측정값으로부터 피측정물질(2)의 함유량을 산출할 수 있다.
또한 본 실시형태에 의하면, 측정 후에는 반응계 중에 존재했던 자성입자와, 피측정물질(2)과 특이결합물질(3)과 자성입자(4)로 이루어지는 응집복합체(5)가, 자력을 이용함으로써 반응계로부터 제거된다. 본 실시형태에서는 자력을 이용하므로, 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에 측정 후의 반응계를 이용하여, 시료(1)에 포함되는 다른 성분을 각종 측정방법으로 측정하기가 가능하다.
또 종래에는 2 종류의 피측정물질을 측정할 때는, 피측정물질 수와 같은 수의 반응용기를 준비할 필요가 있었지만, 본 실시형태에 의하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류의 피측정물질을 측정할 수 있다. 따라서 본 실시형태에 의하면, 측정에 필요한 시료를 매우 소량으로 하기가 가능하다. 이로써 예를 들어 의료분야에 있어서는, 환자로부터의 시료 채취량을 저감할 수 있어, 환자에의 부담을 경감할 수 있다.
또 본 실시형태에서 반응계로부터 제거되는 응집복합체(5)와 자성입자(도시 생략)로써, pH 3.0 이하의 산성조건하에서 항원항체 반응을 저해함으로써, 고정된 항체 또는 항원이 반응성을 갖는 상태로 자성입자를 회수하여 재이용할 수도 있다.또는 강한 산 또는 알칼리 처리, 계면활성제에 의한 세정으로써 자성입자에 고정된 항체 또는 항원을 완전히 제거하고, 그 자성입자에 별도의 항체 또는 항원을 고정시키는 것도 가능하다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법에서 이용하는 자성입자(4)는, 반응계에서 불용성인 것이 바람직하다. 자성입자(4)의 구체적 예로는, 페라이트입자, 페라이트콜로이드입자, 페라이트 함유 라텍스입자 등을 들 수 있다. 이와 같은 자성입자는 자기제작이 가능하다. 특히 균체 내에 0.05~0.1㎛의 자성입자를 함유하는 자성세균을 배양하여 균 수를 증가시키고, 프렌치 프레스 등으로 파쇄시켜, 균체 내의 자성입자를 자석으로 모아 분리하여 취해냄으로써, 거의 균일한 직경을 갖는 자성입자가 얻어진다. 자성세균을 이용하여 자성입자를 얻는 방법은, 보다 상세하게는 일특개 2000-346843호 공보에 기재되어 있다.
자성세균으로부터 얻어진 자성입자는 지방질이중막으로 피복돼있다. 때문에 수용액 등에서의 분산성이 양호하며, 또 특이결합물질인 항체 등의 단백질을 고정시키는 데도 적합하다.
본 실시형태에서 이용하는 자성입자(4)의 직경은, 수용액 중에서 균일하게 분산되기 쉬운 점, 항원항체반응으로 생성된 응집복합체를 정량화 하기 위한 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량 검출이 가능하다는 관점에서, 0.05~2㎛인 것이 바람직하다.
본 실시형태에서는, 자성입자를 모으기 위한 자력 발생에 자석(6)을 들었지만, 이 자석(6)은 더 구체적으로 영구자석, 전자석 등이다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법 반응계에는, 그 용도 등에 따라 당해 분야에서 공지된 임의의 성분을 첨가해도 된다. 예를 들어 피측정물질(2) 및 특이결합물질(3) 각각의 자기응집에 의한 비 특이적 응집을 저감하기 위해, 본 실시형태에 있어서, 반응계에 트윈20(tween 20), 옥틸글루코사이드(octyl glucoside), 라우릴황산나트륨(SDS), 서크로스 모노라우레이트(sucrose monolaurate) 또는 CHAPS 등의 계면활성제를 부가해도 된다. 상기 계면활성제의 반응계에서의 함유량은 항원항체반응의 저해가 적다는 관점에서, 0.3중량% 이하인 것이 바람직하며, 0.1중량% 이하인 것이 보다 바람직하다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법에서는, 공정(St2)에서 측정하는 광학특성으로서, 산란광 강도의 변화를 측정해도 되며(비롱법), 반응계로부터의 투과광량 변화를 측정(비탁법)해도 된다.
본 실시형태에서, 피측정물질은 특별히 한정되지 않으며, 항원항체반응을 이용하여 측정할 수 있는 물질이면 된다. 예를 들어 단백질, 핵산, 지질, 세균, 바이러스, 헵텐(hapten) 등을 들 수 있다. 특히 본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트는, 종래 임상검사에서 항원항체반응을 이용하여 측정되던 측정대상인 단백질 측정에 적합하다. 단백질로는 예를 들어, LH(황체형성호르몬), FSH(난포자극호르몬), hCG(융모성 성선자극호르몬) 등의 호르몬, 각종 면역글로블린 클래스 및 서브클래스, 보체성분, 각종 감염증의 마커, CRP, 알부민, 헤모글로빈, 류마티스인자, 그리고 혈액형 항원 등을 들 수 있다.
본 실시형태에서 이용되는 항체는, 항원과 특이하게 결합함으로써 항원과의응집복합체가 형성 가능한 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 중 어느 항체클래스라도 되며, 이들의 혼합물이라도 된다. 또 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이라도 상관없으며, 또 이들의 혼합물이라도 된다. 이들 중에서 IgG항체가 비 특이적 반응이 적으며, 또 비교적 시판되고 있는 것도 많고, 입수도 용이하므로 바람직하다. 또 항체의 유래동물 종에 관해서도 특별히 한정되지 않지만, 토끼, 염소, 쥐 유래의 항체가 비교적 입수도 간단하고 사용예도 많으므로 바람직하다.
그리고 본 실시형태에서는 특이결합반응 측정방법으로서, 항원항체반응을 이용하는 면역반응 측정방법을 설명하지만, 항원항체반응 이외의 특이한 결합을 발생시키는 반응을 이용하여 응집복합체를 생성시킴으로써 측정하는 것도 가능하다. 항원항체반응 이외의 특이한 결합을 발생하는 반응을 이용할 경우, 피측정물질과 특이결합물질의 조합은, 예를 들어 리간드-리셉터 조합, 외가닥사슬 DNA(피측정물질)와 이 외가닥사슬 DNA에 상보적인 배열을 갖는 각종 DNA 단편과의 조합 등을 들 수 있다.
리간드-리셉터 조합의 예로는, 리간드가 될 분자와, 그 분자에 대해 복수의 결합부위를 갖는 알로스테릭 단백질과의 조합을 들 수 있다. 리간드가 될 분자 내에 알로스테릭 단백질과 결합하는 부분이 1 개소만 존재할 경우, 자성입자에 리간드가 될 분자를, 알로스테릭 단백질과 결합할 부분 이외에서 고정시키면, 리간드가 될 분자와 알로스테릭 단백질의 응집복합체를 생성시킬 수 있다.
또 외가닥사슬 DNA를 피측정물질로 하고, 각종 DNA 단편을 특이결합물질로할 경우, 각종 DNA 단편을, 피측정물질인 외가닥사슬 DNA에 상보적으로 결합 가능한 상태에서 자성입자에 고정시키면 된다.
(제 2 실시형태)
본 실시형태에서는, 2 종류의 피측정물질의 함유량을 측정하기가 가능한 면역반응 측정방법을 도면을 참조하면서 설명한다.
도 3은 본 실시형태의 면역반응 측정방법을 나타내는 흐름도이다. 도 4의 (a) 및 (b)는 본 실시형태의 면역반응 측정방법에서의 반응계를 모식적으로 나타낸 도이다.
우선 도 3에 나타낸 공정(St21)에서, 제 1 피측정물질 및 제 2 피측정물질의 함유량을 측정하고자 하는 시료와, 제 1 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 1 특이결합물질이 고정된 자성입자를 포함하는 반응계를 구축한다. 시료로서는 예를 들어, 혈액, 뇨 등의 체액 그대로거나, 혹은 이들과 완충액을 혼합한 것을 들 수 있다. 여기서 제 1 피측정물질이 항원일 경우 제 1 특이결합물질은 항체이며, 제 1 피측정물질이 항체일 경우 제 1 특이결합물질은 항원이다.
이로써, 도 4의 (a)에 나타내는 바와 같이, 제 1 피측정물질(2a)이 시료 중에 포함되어 있을 때는, 제 1 피측정물질(2a)과 제 1 특이결합물질(3a)의 항원항체반응에 의해, 제 1 피측정물질(2a)과 제 1 특이결합물질(3a)과 자성입자(4)로 이루어지는 응집복합체(5a)가 생성된다. 제 1 피측정물질(2a)이 시료 중에 포함되지 않았을 때는, 제 1 피측정물질(2a)과 제 1 특이결합물질(3a)의 항원항체반응에 의한 응집복합체(5a)는 생성되지 않는다.
다음으로, 도 3에 나타내는 공정(St22)에서, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이 때 상기 공정(St21)에서 응집복합체(5a)가 생성되는 경우에는, 상기 반응계에 흐림이 발생하여 산란광 강도 및 투과광량 등에 변화가 생긴다. 따라서 산란광 강도 및 투과광량 등을 측정함으로써, 반응계의 흐림 정도를 견적할 수 있다. 여기서 측정 전의 시료를 기준으로 하면서, 상기 반응계의 광학적 변화량, 즉 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량을 측정하는 것이 바람직하다. 또 시료를 완충액과 혼합하여 반응계를 구축할 경우, 완충액을 기준으로 해도 된다.
다음으로 도 3에 나타내는 공정(St23)에서, 제 1 피측정물질(2a)과 제 1 특이결합물질(3a)과 자성입자(4a)로 이루어지는 응집복합체(5a)와, 응집복합체(5a)를 형성하지 않은 자성입자를 자력을 이용하여 모은다. 이 때 응집복합체(5a) 및 자성입자를 반응계로부터 제거해도 되며, 또 후술하는 공정(St25)에서의 반응계 광학특성 측정을 방해하지 않도록, 반응계가 구축된 반응용기 내의 일부에 집중시켜 배치해도 된다.
다음에, 도 3에 나타내는 공정(St24)에서, 반응계에, 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 2 특이결합물질을 첨가한다. 예를 들어 제 2 피측정물질이 항원일 경우, 제 2 특이결합물질은 항체이며, 제 2 피측정물질이 항체일 경우, 제 2 특이결합물질은 항원이다.
이로써 제 2 피측정물질이 시료 중에 포함되었을 경우에는, 도 4의 (b)에 나타내는 바와 같이, 제 2 피측정물질(2b)과 제 2 특이결합물질(3b)의 항원항체반응에 의해, 제 2 피측정물질(2b)과 제 2 특이결합물질(3b)로 이루어지는응집복합체(4b)가 생성된다. 물론 제 2 피측정물질(2b)이 시료 중에 포함되어 있지 않을 때는 제 2 피측정물질(2b)과 제 2 특이결합물질(3b)의 항원항체반응에 의한 응집복합체(4b)는 생성되지 않는다.
다음으로 도 3에 나타내는 공정(St25)에서, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이 때 상기 공정(St24)에서 응집복합체(4b)가 생성되는 경우에는, 상기 반응계에 흐림이 발생하여 산란광 강도 및 투과광량 등에 변화가 생긴다. 따라서 산란광 강도 및 투과광량 등을 측정함으로써, 반응계의 흐림 정도를 견적할 수 있다. 여기서 측정 전의 시료를 기준으로 하면서, 상기 반응계의 광학적 변화량, 즉 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량을 측정하는 것이 바람직하다. 또 시료를 완충액과 혼합하여 반응계를 구축할 경우, 완충액을 기준으로 해도 된다.
특히, 상기 공정(St23)에서 도 4의 (b)에 나타내는 경우와 같이, 응집복합체(5a)와, 응집복합체(5a)를 형성하지 않은 자성입자가 자력을 이용하여 모여지므로, 본 공정에서는 반응계의 광학특성을 측정할 때는, 응집복합체(4b)만에 의한 산란광 강도 및 투과광량 등의 변화를 측정할 수 있다.
특히 본 실시형태에 의하면, 제 2 피측정물질(2b)을 측정할 때는, 반응계 중에 존재했던 자성입자(4a)와, 제 1 피측정물질(2a)과 제 1 특이결합물질(3a)과 자성입자(4a)로 이루어지는 응집복합체(5a)에 의한 반응계의 광학특성 변화가, 자력을 이용함으로써 제거된다. 자력을 이용하므로 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에 본 실시형태의 면역반응 측정방법에 의하면, 제 2 피측정물질(2b)을 측정할 때도 측정값의 신뢰성이 높다.
종래, 2 종류의 피측정물질의 함유량을 측정할 때는, 피측정물질의 종류와 같은 2 개의 반응용기를 준비할 필요가 있었지만, 본 실시형태에 의하면 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 본 실시형태에 의하면, 측정에 필요한 시료가 매우 소량이다. 때문에 예를 들어 의료분야에서는, 환자로부터의 시료 채취량을 저감할 수 있어, 환자에의 부담을 경감시킬 수 있다.
또 본 실시형태에서 반응계로부터 제거되는 응집복합체(5)와 자성입자로써, pH 3.0 이하의 산성조건하에서 항원항체반응을 저해함으로써, 고정된 항체 또는 항원이 반응성을 갖는 상태로 자성입자를 회수하여 재이용할 수도 있다. 또는 강한 산 또는 알칼리 처리, 계면활성제에 의한 세정으로써 자성입자에 고정된 항체 또는 항원을 완전히 제거하고, 그 자성입자에 별도의 항체 또는 항원을 고정시키는 것도 가능하다.
다음, 본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하는 시약키트를, 도 4의 (a) 및 (b)를 참조하면서 설명한다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하는 시약키트는, 제 1 피측정물질(2a)에 대해 특이하게 결합하는 제 1 특이결합물질(3a)이 고정된 자성입자(4a)와, 제 2 피측정물질(2b)에 대해 특이하게 결합하는 제 2 특이결합물질(3b)을 포함한다.
여기서 제 1 피측정물질(2a)이 항원일 경우, 제 1 특이결합물질(3a)은 항체이며, 제 1 피측정물질(2a)이 항체일 경우, 제 1 특이결합물질(3a)은 항원이다.또 제 2 피측정물질(2b)이 항원일 경우, 제 2 특이결합물질(3b)은 항체이며, 제 2 피측정물질(2b)이 항체일 경우, 제 2 특이결합물질(3b)은 항원이다.
본 실시형태의 시약키트를, 본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 본 실시형태의 시약키트를 이용하면, 측정에 필요한 시료를 매우 소량으로 할 수 있다.
특히 도 4의 (b)에 나타내는 바와 같이, 제 2 피측정물질(2b)을 측정할 때, 반응계 중에 존재했던 자성입자(4a)와, 피측정물질(2a)과 특이결합물질(3a)과 자성입자(4a)로 이루어지는 응집복합체(5a)에 의한 반응계의 광학특성 변화가, 자력을 이용함으로써 제거된다. 자력을 이용하므로 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에 본 실시형태의 면역반응 측정방법에 의하면, 제 2 피측정물질(2b)을 측정할 때도 측정값의 신뢰성이 높다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트에 이용되는 자성입자(4a)는, 반응계에서 불용성인 것이 바람직하다. 자성입자(4a)의 구체예로는, 페라이트입자, 페라이트콜로이드입자, 페라이트 함유 라텍스입자 등을 들 수 있다. 이와 같은 자성입자는 자기제작이 가능하다. 특히 균체 내에 0.05~0.1㎛의 자성입자를 함유하는 자성세균을 배양하여 균 수를 증가시키고, 프렌치 프레스 등으로 파쇄시켜, 균체 내의 자성입자를 자석으로 모아 분리하여 취해냄으로써, 거의 균일한 직경을 갖는 자성입자가 얻어진다. 자성세균을 이용하여 자성입자를 얻는 방법은, 보다 상세하게는 일특개 2000-346843호 공보에 기재되어 있다.
자성세균으로부터 얻어진 자성입자는 지방질이중막으로 피복돼있다. 때문에 수용액 등에서의 분산성이 양호하며, 또 특이결합물질인 항체 등의 단백질을 고정시키는 데 적합하다.
본 실시형태에서 이용하는 자성입자(4a)의 직경은, 수용액 중에서 균일하게 분산되기 쉬운 점, 항원항체반응으로 생성된 응집복합체를 정량화 하기 위한 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량 검출이 가능하다는 관점에서, 0.05~2㎛인 것이 바람직하다.
본 실시형태에서는, 자성입자를 모으기 위한 자력 발생에 자석(6)을 들었는데, 이 자석(6)은 보다 구체적으로는 영구자석, 전자석 등이다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트에 있어서, 제 2 특이결합물질(3b)로서, 예를 들어 항원 혹은 항체이지만 이에 한정되지 않는다. 특히 제 2 특이결합물질(3b)은, 제 2 피측정물질(2b)과 항원항체반응을 발생시키는 항원 또는 항체가 고정된 비 자성입자인 것이 바람직하다. 이로써 제 2 피측정물질(2b) 측정 시(즉 공정(St25))의 광학특성 변화범위가, 제 1 피측정물질(2a) 측정 시(즉 공정(St22))의 광학특성 변화범위와 그리 크게 변화하지 않는다. 이로써 측정에 이용되는 장치의 조정이 용이해진다. 또 제 2 피측정물질(2b)의 항원항체반응 진행이, 자력에 의한 영향을 전혀 받지 않는 점도 바람직한 이유이다.
비 자성입자로는 예를 들어, 유리입자, 흑연입자, 금 콜로이드입자, 라텍스입자 등을 들 수 있다. 이 중에서 안정성이 높으며, 여러 가지 직경을 갖는 입자를 입수 용이하다는 점에서 라텍스입자가 바람직하며, 특히 단백질 흡착성에 우수한 폴리스틸렌 라텍스입자가 바람직하다.
상술한 비 자성입자에는 용액 중에 균일하게 분산되기 쉬운 점, 및 항원항체반응으로 생성된 응집복합체를 정량화 하기 위한 산란광 강도 및 투과광량의 변화량 검출이 가능한 점이 요구된다. 따라서 상술한 비 자성입자의 직경은 0.05~2㎛인 것이 바람직하며, 자성입자(4a)를 이용한 경우의 측정과 광학특성의 변화범위를 동등하게 한다는 관점에서, 자성입자(4a)의 직경과 동등하다면 더욱 바람직하다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법의 반응계에는 그 용도 등에 따라서, 당해 분야에서 공지된 임의의 성분을 첨가해도 된다. 예를 들어 제 2 특이결합물질(3b)이, 항원 또는 항체가 고정된 비 자성입자가 아닌 경우, 공정(St24)에서 반응계에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가해도 된다. 또 공정(St24)에서 반응계에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하기 위해, 시약키트에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가해도 된다. 폴리에틸렌 글리콜의 함유량은 반응계에 대해 2~6중량%가 바람직하며, 4중량%가 보다 바람직하다. 상기 농도의 폴리에틸렌 글리콜이 반응계에 포함될 경우, 제 2 피측정물질(2b) 및 제 2 특이결합물질(3b) 각각의 자기응집에 의한 비 특이 응집이 적어져 측정감도가 향상된다.
또 공정(St22) 및 공정(St25)에서, 제 1 피측정물질(2a), 제 1 특이결합물질(3a), 제 2 피측정물질(2b) 및 제 2 특이결합물질(3b) 각각의 자기응집에 의한 비 특이 응집을 저감하기 위해, 본 실시형태에 있어서, 반응계에 트윈20, 옥틸글루코사이드, 라우릴황산나트륨(SDS), 서크로스 모노라우레이트 또는 CHAPS 등의 계면활성제를 부가해도 된다. 상기 계면활성제의 반응계에서의 함유량은 항원항체반응의 저해가 적다는 관점에서, 0.3중량% 이하인 것이 바람직하며, 0.1중량% 이하인 것이 보다 바람직하다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법에서는, 공정(St22) 및 공정(St25)에서 측정하는 광학특성으로서, 산란광 강도의 변화를 측정해도 되며(비롱법), 반응계로부터의 투과광량 변화를 측정(비탁법)해도 된다.
본 실시형태에서, 제 1 피측정물질(2a) 및 제 2 피측정물질(2b)은 특히 한정되지 않으며, 항원항체반응을 이용하여 측정할 수 있는 물질이면 된다. 예를 들어 단백질, 핵산, 지질, 세균, 바이러스, 헵텐 등을 들 수 있다. 특히 본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트는, 종래 임상검사에서 항원항체반응을 이용하여 측정되던 측정대상인 단백질 측정에 적합하다. 단백질로는 예를 들어, LH(황체형성호르몬), FSH(난포자극호르몬), hCG(융모성 성선자극호르몬) 등의 호르몬, 각종 면역글로블린 클래스 및 서브클래스, 보체성분, 각종 감염증의 마커, CRP, 알부민, 헤모글로빈, 류마티스인자, 그리고 혈액형 항원 등을 들 수 있다. 예를 들어 본 실시형태에서, 제 1 피측정물질(2a) 및 제 2 피측정물질(2b)을 각각, 휴먼 헤모글로빈 및 휴먼 알부민으로 하면, 신장질환의 초기 스크리닝에 적합한 측정결과를 제공할 수 있다. 이는 뇨 중의 휴먼 헤모글로빈이 급성사구체신염, IgA신증, 신장결핵, 신장경색, 신우신염, 방광염, 요도염, 전립선염 등의 요로 염증의 지표가 되어, 뇨 중의 휴먼 알부민이 뇨 중 단백질 총량의 변화를 반영하기 쉬우므로, 신장기능 평가를 실시할 수 있기 때문이다.
본 실시형태에서 이용되는 항체는, 항원과 특이하게 결합함으로써 항원과의응집복합체가 형성 가능한 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 중 어느 항체클래스라도 되며, 이들의 혼합물이라도 된다. 또 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이라도 상관없으며, 또 이들의 혼합물이라도 된다. 이들 중에서 IgG항체가 비 특이적 반응이 적으며, 또 비교적 시판되고 있는 것도 많고, 입수도 용이하므로 바람직하다. 또 항체의 유래동물 종에 관해서도 특별히 한정되지 않지만, 토끼, 염소, 쥐 유래의 항체가 비교적 입수도 간단하고 사용예도 많으므로 바람직하다.
그리고 본 실시형태에서는 특이결합반응 측정방법으로서, 항원항체반응을 이용하는 면역반응 측정방법을 설명하지만, 항원항체반응 이외의 특이한 결합을 발생시키는 반응을 이용하여 응집복합체를 생성시킴으로써 측정하는 것도 가능하다. 항원항체반응 이외의 특이한 결합을 발생하는 반응을 이용할 경우, 피측정물질과 특이결합물질의 조합은, 예를 들어 리간드-리셉터 조합, 외가닥사슬 DNA(피측정물질)와 이 외가닥사슬 DNA에 상보적인 배열을 갖는 각종 DNA 단편과의 조합 등을 들 수 있다.
리간드-리셉터 조합의 예로는, 리간드가 될 분자와, 그 분자에 대해 복수의 결합부위를 갖는 알로스테릭 단백질과의 조합을 들 수 있다. 리간드가 될 분자 내에 알로스테릭 단백질과 결합하는 부분이 1 개소만 존재할 경우, 자성입자, 비 자성입자 등에 리간드가 될 분자를, 알로스테릭 단백질과 결합할 부분 이외에서 고정시키면, 리간드가 될 분자와 알로스테릭 단백질의 응집복합체를 생성시킬 수 있다.
또 외가닥사슬 DNA를 피측정물질로 하고, 각종 DNA 단편을 특이결합물질로할 경우, 각종 DNA 단편을, 피측정물질인 외가닥사슬 DNA에 상보적으로 결합 가능한 상태에서 자성입자, 비자성입자 등에 고정시키면 된다.
(제 3 실시형태)
본 실시형태에서는, 상기 제 2 실시형태의 면역반응 측정방법을, 더욱 다종류의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있도록 확장시킨 면역반응 측정방법을, 도면을 참조하면서 설명한다.
도 5는 본 실시형태의 면역반응 측정방법을 나타내는 흐름도이다.
우선 도 5에 나타낸 공정(St31)에서, n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질의 함유량을 측정하고자 하는 시료와, 미측정 피측정물질 중 1 종류에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질이 고정된 자성입자를 포함하는 반응계를 구축한다. 시료로서는 예를 들어, 혈액, 뇨 등의 체액 그대로거나, 혹은 이들과 완충액을 혼합한 것을 들 수 있다. 여기서 피측정물질이 항원일 경우 특이결합물질은 항체이며, 피측정물질이 항체일 경우 특이결합물질은 항원이다.
이로써, 피측정물질이 시료 중에 포함되어 있을 때는, 피측정물질과 특이결합물질의 항원항체반응에 의해, 상기 제 2 실시형태의 도 4의 (a)에 나타내는 응집복합체(5a)와 동등한, 피측정물질과 특이결합물질과 자성입자로 이루어지는 응집복합체가 생성된다. 피측정물질이 시료 중에 포함되지 않았을 때는, 피측정물질과 특이결합물질의 항원항체반응에 의한 응집복합체는 생성되지 않는다.
다음으로, 도 5에 나타내는 공정(St32)에서, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이 때 상기 공정(St31)에서 응집복합체가 생성되는 경우에는, 상기 반응계에 흐림이 발생하여 산란광 강도 및 투과광량 등에 변화가 생긴다. 따라서 산란광 강도 및 투과광량 등을 측정함으로써, 반응계의 흐림 정도를 견적할 수 있다. 여기서 측정 전의 시료를 기준으로 하면서, 상기 반응계의 광학적 변화량, 즉 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량을 측정하는 것이 바람직하다. 또 시료를 완충액과 혼합하여 반응계를 구축할 경우, 완충액을 기준으로 해도 된다.
다음으로 도 5에 나타내는 공정(St33)에서, 피측정물질과 특이결합물질과 자성입자로 이루어지는 응집복합체와, 응집복합체를 형성하지 않은 자성입자를 자력을 이용하여 반응계로부터 제거한다.
다음에, 도 5에 나타내는 공정(St34)에서, 상기 공정(St32)이 제 (n-1)회인지를 판단한다. 이 때, 상기 공정(St32)이 제 (n-1)회인 경우 공정(St35)으로 진행한다. 상기 공정(St32)이 제 (n-1)회 미만일 경우, 다시 공정(St31)으로 돌아간다. 즉 상기 공정(St32)이 제 (n-1)회가 될 때까지, 공정(St31~St33)을 되풀이한다. 이로써 n종류의 피측정물질 중, (n-1) 종류의 피측정물질이 반응계로부터 제거된다.
다음에, 도 5에 나타내는 공정(St35)에서, 반응계에 남은 1 종류의 미측정 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 첨가한다. 이 때, 예를 들어 피측정물질이 항원일 경우, 특이결합물질은 항체이며, 피측정물질이 항체일 경우, 특이결합물질은 항원이다.
이로써 피측정물질이 시료 중에 포함되었을 경우에는, 피측정물질과 특이결합물질의 항원항체반응에 의해, 상기 제 2 실시형태 도 4의 (b)에 나타내는 응집복합체(4b)와 동등한, 피측정물질과 특이결합물질로 이루어지는 응집복합체가 생성된다. 물론 피측정물질이 시료 중에 포함되어 있지 않을 때는, 피측정물질과 특이결합물질의 항원항체반응에 의한 응집복합체는 생성되지 않는다.
다음으로 도 5에 나타내는 공정(St36)에서, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이 때 상기 공정(St35)에서 응집복합체가 생성되는 경우에는, 상기 반응계에 흐림이 발생하여 산란광 강도 및 투과광량 등에 변화가 생긴다. 따라서 산란광 강도 및 투과광량 등을 측정함으로써, 반응계의 흐림 정도를 견적할 수 있다. 여기서 측정 전의 시료를 기준으로 하면서, 상기 반응계의 광학적 변화량, 즉 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량을 측정하는 것이 바람직하다. 또 시료를 완충액과 혼합하여 반응계를 구축할 경우, 완충액을 기준으로 해도 된다.
특히, 상기 공정(St33)에서, 응집복합체와, 응집복합체를 형성하지 않은 자성입자가 자력을 이용하여 모여지므로, 본 공정에서는 반응계의 광학특성을 측정할 때는, 응집복합체만에 의한 산란광 강도 및 투과광량 등의 변화를 측정할 수 있다.
본 실시형태에 의하면, 피측정물질과 특이결합물질과 자성입자로 이루어지는 응집복합체가, 광학특성 측정 후에 자력을 이용함으로써 제거된다. 자력을 이용하므로 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에 복수의 피측정물질을 측정할 때도, 먼저 형성된 응집복합체의 영향이 거의 배제되므로, 광학특성 측정 시 매회 측정값의 신뢰성이 높다.
특히 종래, 2 종류 이상의 피측정물질의 함유량을 측정할 때는, 피측정물질의 종류와 같은 2 개 이상의 반응용기를 준비할 필요가 있었지만, 본 실시형태에의하면 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 본 실시형태에 의하면, 측정에 필요한 시료가 매우 소량이다. 때문에 예를 들어 의료분야에서는, 환자로부터의 시료 채취량을 저감할 수 있어, 환자에의 부담을 경감시킬 수 있다.
또 본 실시형태에서 반응계로부터 제거되는 응집복합체와 자성입자로써, pH 3.0 이하의 산성조건하에서 항원항체 반응을 저해함으로써, 고정된 항체 또는 항원이 반응성을 갖는 상태로 자성입자를 회수하여 재이용할 수도 있다. 또는 강한 산 또는 알칼리 처리, 계면활성제에 의한 세정으로써 자성입자에 고정된 항체 또는 항원을 완전히 제거하고, 그 자성입자에 별도의 항체 또는 항원을 고정시키는 것도 가능하다.
다음, 본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하는 시약키트를 설명한다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하는 시약키트는, (n-1)종류의 피측정물질 각각에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질이 고정된 자성입자와, 나머지 1 종류의 미측정 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 포함한다.
본 실시형태의 시약키트를, 본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하면, 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 본 실시형태의 시약키트를 이용하면, 측정에 필요한 시료를 매우 소량으로 할 수 있다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트에 이용되는 자성입자 및 자성입자를 모으기 위한 자석(6)으로서, 상기 제 2 실시형태에서 설명한 것과 동일한것을 이용할 수 있다.
또 본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트에 있어서, 도 5에 나타내는 공정(St35)에서 첨가하는 특이결합물질로서, 반응계에 남은 1 종류의 미측정 피측정물질과 항원항체반응을 발생시키는 항원 또는 항체가 고정된 비 자성입자인 것이 바람직하다. 이로써 공정(St36)에서의 피측정물질 측정에서의 광학특성 변화범위가, 공정(St32)에서의 (n-1) 종류의 피측정물질 측정에서의 광학특성 변화범위와, 그리 크게 변화하지 않는다. 이로써 측정에 이용되는 장치의 조정이 용이해진다.
비 자성입자로는 상기 제 2 실시형태에서 서술한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. 즉 상술한 비 자성입자의 직경은 0.05~2㎛인 것이 바람직하며, 상술한 자성입자의 직경과 동등하다면 더욱 바람직하다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법의 반응계에는 그 용도 등에 따라서, 당해 분야에서 공지된 임의의 성분을 첨가해도 된다. 예를 들어 특이결합물질이, 항원 또는 항체가 고정된 비 자성입자가 아닌 경우, 공정(St35)에서 반응계에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가해도 된다. 또 공정(St35)에서 반응계에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하기 위해, 시약키트에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가해도 된다. 폴리에틸렌 글리콜의 함유량은 반응계에 대해 2~6중량%가 바람직하며, 4중량%가 보다 바람직하다. 상기 농도의 폴리에틸렌 글리콜이 반응계에 포함될 경우, 공정(St36)에서 피측정물질 또는 특이결합물질 각각의 자기응집에 의한 비 특이 응집이 적어져 측정감도가 향상된다.
또 공정(St32) 및 공정(St36)에서, 각 피측정물질 및 각 특이결합물질의 자기응집에 의한 비 특이 응집을 저감하기 위해, 본 실시형태에 있어서, 반응계에 트윈20, 옥틸글루코사이드, 라우릴황산나트륨(SDS), 서크로스 모노라우레이트 또는 CHAPS 등의 계면활성제를 부가해도 된다. 상기 계면활성제의 반응계에서의 함유량은 항원항체반응의 저해가 적다는 관점에서, 0.3중량% 이하인 것이 바람직하며, 0.1중량% 이하인 것이 보다 바람직하다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법에서는, 공정(St32) 및 공정(St36)에서 측정하는 광학특성으로서, 산란광 강도의 변화를 측정해도 되며(비롱법), 반응계로부터의 투과광량 변화를 측정(비탁법)해도 된다.
본 실시형태에서, n종류의 각 피측정물질은 특히 한정되지 않으며, 항원항체반응을 이용하여 측정할 수 있는 물질이면 된다. 예를 들어 단백질, 핵산, 지질, 세균, 바이러스, 헵텐 등을 들 수 있다. 특히 본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트는, 종래 임상검사에서 항원항체반응을 이용하여 측정되던 측정대상인 단백질 측정에 적합하다. 단백질로는 예를 들어, LH(황체형성호르몬), FSH(난포자극호르몬), hCG(융모성 성선자극호르몬) 등의 호르몬, 각종 면역글로블린 클래스 및 서브클래스, 보체성분, 각종 감염증의 마커, CRP, 알부민, 헤모글로빈, 류마티스인자, 그리고 혈액형 항원 등을 들 수 있다.
본 실시형태에서 이용되는 항체는, 항원과 특이하게 결합함으로써 항원과의 응집복합체가 형성 가능한 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 중 어느 항체클래스라도 되며, 이들의 혼합물이라도 된다. 또폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이라도 상관없으며, 또 이들의 혼합물이라도 된다. 이들 중에서 IgG항체가 비 특이적 반응이 적으며, 또 비교적 시판되고 있는 것도 많고, 입수도 용이하므로 바람직하다. 또 항체의 유래동물 종에 관해서도 특별히 한정되지 않지만, 토끼, 염소, 쥐 유래의 항체가 비교적 입수도 간단하고 사용예도 많으므로 바람직하다.
그리고 본 실시형태에서는 특이결합반응 측정방법으로서, 항원항체반응을 이용하는 면역반응 측정방법을 설명했지만, 항원항체반응 이외의 특이한 결합을 발생시키는 반응을 이용하여 응집복합체를 생성시킴으로써 측정하는 것도 가능하다. 항원항체반응 이외의 특이한 결합을 발생하는 반응을 이용할 경우, 피측정물질과 특이결합물질의 조합은, 예를 들어 리간드-리셉터 조합, 외가닥사슬 DNA(피측정물질)와 이 외가닥사슬 DNA에 상보적인 배열을 갖는 각종 DNA 단편과의 조합 등을 들 수 있다.
리간드-리셉터 조합의 예로는, 리간드가 될 분자와, 그 분자에 대해 복수의 결합부위를 갖는 알로스테릭 단백질과의 조합을 들 수 있다. 리간드가 될 분자 내에 알로스테릭 단백질과 결합하는 부분이 1 개소만 존재할 경우, 자성입자, 비 자성입자 등에 리간드가 될 분자를, 알로스테릭 단백질과 결합할 부분 이외에서 고정시키면, 리간드가 될 분자와 알로스테릭 단백질의 응집복합체를 생성시킬 수 있다.
또 외가닥사슬 DNA를 피측정물질로 하고, 각종 DNA 단편을 특이결합물질로 할 경우, 각종 DNA 단편을, 피측정물질인 외가닥사슬 DNA에 상보적으로 결합 가능한 상태에서 자성입자, 비자성입자에 고정시키면 된다.
(제 4 실시형태)
본 실시형태에서는, 다종류의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있는, 다른 면역반응 측정방법을 도면을 참조하면서 설명한다.
도 6은 본 실시형태의 면역반응 측정방법을 나타내는 흐름도이다. 도 7의 (a) 및 도 7의 (b)는 본 실시형태의 면역반응 측정방법의 반응계를 모식적으로 나타내는 도이다.
우선 도 6에 나타낸 공정(St41)에서, n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질의 함유량을 측정하고자 하는 시료와, 미측정 피측정물질 중 1 종류에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 포함하는 반응계를 구축한다. 시료로서는 예를 들어, 혈액, 뇨 등의 체액을 들 수 있다. 여기서 피측정물질이 항원일 경우 특이결합물질은 항체이며, 피측정물질이 항체일 경우 특이결합물질은 항원이다.
이로써, 도 7의 (a)에 나타내는 바와 같이, 1 종류의 피측정물질(2a)이 시료 중에 포함되어 있을 때는, 피측정물질(2a)과 특이결합물질(3a)의 항원항체반응에 의해, 피측정물질(2a)과 특이결합물질(3a)로 이루어지는 응집복합체(5c)가 생성된다. 피측정물질(2a)이 시료 중에 포함되지 않았을 때는, 피측정물질(2a)과 특이결합물질(3a)의 항원항체반응에 의한 응집복합체(5c)는 생성되지 않는다.
다음으로, 도 6에 나타내는 공정(St42)에서, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이 때 상기 공정(St41)에서 응집복합체가 생성되는 경우에는, 상기 반응계에 흐림이 발생하여 산란광 강도 및 투과광량 등에 변화가 생긴다. 따라서 산란광 강도 및 투과광량 등을 측정함으로써, 반응계의 흐림 정도를 견적할 수 있다. 여기서측정 전의 시료를 기준으로 하면서, 상기 반응계의 광학적 변화량, 즉 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량을 측정하는 것이 바람직하다. 또 시료를 완충액과 혼합하여 반응계를 구축하는 경우, 완충액을 기준으로 해도 된다.
다음으로 도 6에 나타내는 공정(St43)에서, 상기 1 종류의 피측정물질과 특이결합물질로 이루어지는 응집복합체에, 결합 가능한 물질(예를 들어 응집복합체에 포함되는 항체에 결합 가능한 항체)과 자성입자로 이루어지는 자성복합체를 반응계에 첨가한다. 이로써 도 7의 (b)에 나타내는 바와 같이, 항체(7)와 자성입자(4c)로 이루어지는 자성복합체(8)가, 응집복합체(5c)에 결합된다.
다음으로 도 6에 나타내는 공정(St44)에서, 자성복합체가 결합된 응집복합체와, 응집복합체에 결합되지 않은 자성복합체를 자력을 이용하여 제거한다. 이로써 도 7의 (b)에 나타내는 바와 같이, 응집복합체(5c)가 자성복합체(8)와 함께 모두 자력에 끌려 제거되고, 반응계 내에 다른 피측정물질(2b)이 잔존한다.
다음에, 도 6에 나타내는 공정(St45)에서, 상기 공정(St42)이 제 (n-1)회인지를 판단한다. 이 때, 상기 공정(St42)이 제 (n-1)회인 경우 공정(St46)으로 진행한다. 상기 공정(St42)이 제 (n-1)회 미만일 경우, 다시 공정(St41)으로 돌아간다. 즉 상기 공정(St42)이 제 (n-1)회가 될 때까지, 공정(St41~St44)을 되풀이한다. 이로써 n종류의 피측정물질 중, (n-1) 종류의 피측정물질이 반응계로부터 제거된다.
다음에, 도 6에 나타내는 공정(St46)에서, 반응계에 남은 1 종류의 미측정 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 첨가한다. 이 때, 예를 들어 피측정물질이 항원일 경우, 특이결합물질은 항체이며, 피측정물질이 항체일 경우, 특이결합물질은 항원이다.
이로써 피측정물질이 시료 중에 포함되었을 경우에는, 피측정물질과 특이결합물질의 항원항체반응에 의해, 상기 제 2 실시형태 도 4의 (b)에 나타내는 응집복합체(4b)와 동등한, 피측정물질과 특이결합물질로 이루어지는 응집복합체가 생성된다. 물론 피측정물질이 시료 중에 포함되어 있지 않을 때는, 피측정물질과 특이결합물질의 항원항체반응에 의한 응집복합체는 생성되지 않는다.
다음으로 도 6에 나타내는 공정(St47)에서, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이 때 상기 공정(St46)에서 응집복합체가 생성되는 경우에는, 상기 반응계에 흐림이 발생하여 산란광 강도 및 투과광량 등에 변화가 생긴다. 따라서 산란광 강도 및 투과광량 등을 측정함으로써, 반응계의 흐림 정도를 견적할 수 있다. 여기서 측정 전의 시료를 기준으로 하면서, 상기 반응계의 광학적 변화량, 즉 산란광 강도 또는 투과광량의 변화량을 측정하는 것이 바람직하다. 또 시료를 완충액과 혼합하여 반응계를 구축할 경우, 완충액을 기준으로 해도 된다.
특히, 상기 공정(St44)에서, 응집복합체와 자성복합체가 자력을 이용하여 모여지므로, 본 공정에서는 반응계의 광학특성을 측정할 때는, 응집복합체만에 의한 산란광 강도 및 투과광량 등의 변화를 측정할 수 있다.
본 실시형태에 의하면, 피측정물질과 특이결합물질로 이루어지는 응집복합체가, 광학특성 측정 후에 자력을 이용함으로써 제거된다. 자력을 이용하므로 반응계에 화학적인 영향을 전혀 끼치지 않는다. 때문에 복수의 피측정물질을 측정할때도, 먼저 형성된 응집복합체의 영향이 거의 배제되므로, 광학특성 측정 시 매회 측정값의 신뢰성이 높다.
특히 종래, 2 종류 이상의 피측정물질의 함유량을 측정할 때는, 피측정물질의 종류와 같은 2 개 이상의 반응용기를 준비할 필요가 있었지만, 본 실시형태에 의하면 반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 본 실시형태에 의하면, 측정에 필요한 시료가 매우 소량이다. 때문에 예를 들어 의료분야에서는, 환자로부터의 시료 채취량을 저감할 수 있어, 환자에의 부담을 경감시킬 수 있다.
또 본 실시형태에서 반응계로부터 제거되는 자성복합체를, pH 3.0 이하의 산성조건하에서 항원항체반응을 저해함으로써, 고정된 항체 또는 항원이 반응성을 갖는 상태로 자성입자를 회수하여 재이용할 수도 있다. 또는 강한 산 또는 알칼리 처리, 및 계면활성제에 의한 세정으로써 자성입자에 고정된 항체 또는 항원을 완전히 제거하고, 그 자성입자에 별도의 항체 또는 항원을 고정시키는 것도 가능하다.
다음, 본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하는 시약키트를 설명한다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하는 시약키트는, n 종류의 피측정물질 각각에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질과, (n-1) 종류의 피측정물질과 이에 대응하는 특이결합물질로 이루어지는 응집복합체 각각에 결합 가능한 물질(예를 들어, 응집복합체에 포함되는 항체에 결합 가능한 2 차 항체)과, 상기 물질이 고정된 자성입자로 이루어지는 자성복합체를 포함한다.
본 실시형태의 시약키트를, 본 실시형태의 면역반응 측정방법에 이용하면,반응계를 구축하기가 가능한 반응용기가 1 개 있으면, 이를 이용하여 2 종류 이상의 피측정물질 함유량을 측정할 수 있다. 따라서 본 실시형태의 시약키트를 이용하면, 측정에 필요한 시료를 매우 소량으로 할 수 있다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트에 이용되는 자성입자 및 자성입자를 모으기 위한 자석(6)으로서, 상기 제 2 실시형태에서 설명한 것과 동일한 것을 이용할 수 있다.
본 실시형태에 이용되는, 응집복합체에 대해 특이 결합 가능한 자성복합체로는, 각 응집복합체 생성에 이용한 항체에 대해 특이하게 결합하는 항체, 응집복합체 생성에 이용한 항체와는 다른 장소에 특이하게 결합하는 항체, 혹은 응집복합체의 특정 구조에 대해 특이하게 결합하는 항체 등이 자성입자에 고정된 것을 이용할 수 있다.
또 본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트에 있어서, 도 6에 나타내는 공정(St46)에서 첨가하는 특이결합물질로서, 반응계에 남은 1 종류의 미측정 피측정물질과 항원항체반응을 발생시키는 항원 또는 항체가 고정된 비 자성입자인 것이 바람직하다. 이로써 공정(St47)에서, 피측정물질 측정에서의 광학특성 변화농도 범위가, 공정(St42)에서의 (n-1) 종류의 피측정물질 측정에서의 광학특성 변화농도범위와, 그리 크게 변화하지 않는다. 이로써 측정에 이용되는 장치의 조정이 용이해진다.
비 자성입자로는 상기 제 2 실시형태에서 서술한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. 즉 상술한 비 자성입자의 직경은 0.05~2㎛인 것이 바람직하며, 상술한자성입자의 직경과 동등하다면 더욱 바람직하다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법의 반응계에는 그 용도 등에 따라서, 당해 분야에서 공지된 임의의 성분을 첨가해도 된다. 예를 들어 특이결합물질이, 항원 또는 항체가 고정된 비 자성입자가 아닌 경우, 공정(St46)에서 반응계에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가해도 된다. 또 공정(St46)에서 반응계에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하기 위해, 시약키트에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가해도 된다. 폴리에틸렌 글리콜의 함유량은 반응계에 대해 2~6중량%가 바람직하며, 4중량%가 보다 바람직하다. 상기 농도의 폴리에틸렌 글리콜이 반응계에 포함될 경우, 공정(St47)에서 피측정물질 또는 특이결합물질 각각의 자기응집에 의한 비 특이 응집이 적어져 측정감도가 향상된다.
또 공정(St42) 및 공정(St47)에서, 각 피측정물질 및 각 특이결합물질의 자기응집에 의한 비 특이 응집을 저감하기 위해, 본 실시형태에 있어서, 반응계에 트윈20, 옥틸글루코사이드, 라우릴황산나트륨(SDS), 서크로스 모노라우레이트 또는 CHAPS 등의 계면활성제를 부가해도 된다. 상기 계면활성제의 반응계에서의 함유량은 항원항체반응의 저해가 적다는 관점에서, 0.3중량% 이하가 바람직하며, 0.1중량% 이하가 보다 바람직하다.
본 실시형태의 면역반응 측정방법에서는, 공정(St42) 및 공정(St47)에서 측정하는 광학특성으로서, 산란광 강도의 변화를 측정해도 되며(비롱법), 반응계로부터의 투과광량 변화를 측정(비탁법)해도 된다.
본 실시형태에서, n종류의 각 피측정물질은 특별히 한정되지 않으며, 항원항체반응을 이용하여 측정할 수 있는 물질이면 된다. 예를 들어 단백질, 핵산, 지질, 세균, 바이러스, 헵텐 등을 들 수 있다. 특히 본 실시형태의 면역반응 측정방법 및 시약키트는, 종래 임상검사에서 항원항체반응을 이용하여 측정되던 측정대상인 단백질 측정에 적합하다. 단백질로는 예를 들어, LH(황체형성호르몬), FSH(난포자극호르몬), hCG(융모성 성선자극호르몬) 등의 호르몬, 각종 면역글로블린 클래스 및 서브클래스, 보체성분, 각종 감염증의 마커, CRP, 알부민, 헤모글로빈, 류마티스인자, 그리고 혈액형 항원 등을 들 수 있다.
본 실시형태에서 이용되는 항체는, 항원과 특이하게 결합함으로써 항원과의 응집복합체가 형성 가능한 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 중 어느 항체클래스라도 되며, 이들의 혼합물이라도 된다. 또 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이라도 상관없으며, 또 이들의 혼합물이라도 된다. 이들 중에서 IgG항체가 비 특이적 반응이 적으며, 또 비교적 시판되고 있는 것도 많고, 입수도 용이하므로 바람직하다. 또 항체의 유래동물 종에 관해서도 특별히 한정되지 않지만, 토끼, 염소, 쥐 유래의 항체가 비교적 입수도 간단하고 사용례도 많으므로 바람직하다.
그리고 본 실시형태에서는 특이결합반응 측정방법으로서, 항원항체반응을 이용하는 면역반응 측정방법을 설명하지만, 항원항체반응 이외의 특이한 결합을 발생시키는 반응을 이용하여 응집복합체를 생성시킴으로써 측정하는 것도 가능하다. 항원항체반응 이외의 특이한 결합을 발생하는 반응을 이용할 경우, 피측정물질과 특이결합물질의 조합은, 예를 들어 리간드-리셉터 조합, 외가닥사슬 DNA(피측정물질)와 이 외가닥사슬 DNA에 상보적인 배열을 갖는 각종 DNA 단편과의 조합 등을 들 수 있다.
리간드-리셉터 조합의 예로는, 리간드가 될 분자와, 그 분자에 대해 복수의 결합부위를 갖는 알로스테릭 단백질과의 조합을 들 수 있다. 리간드가 될 분자 내에 알로스테릭 단백질과 결합하는 부분이 1 개소만 존재할 경우, 자성입자, 비 자성입자 등에 리간드가 될 분자를, 알로스테릭 단백질과 결합할 부분 이외에서 고정시키면, 리간드가 될 분자와 알로스테릭 단백질의 응집복합체를 생성시킬 수 있다.
또 외가닥사슬 DNA를 피측정물질로 하고, 각종 DNA 단편을 특이결합물질로 할 경우, 각종 DNA 단편을, 피측정물질인 외가닥사슬 DNA에 상보적으로 결합 가능한 상태에서 자성입자, 비자성입자 등에 고정시키면 된다.
(제 5 실시형태)
본 실시형태에서는, 상기 제 1~제 4 면역반응 측정방법을 실시하기 위한 측정장치를, 도면을 참조하면서 설명한다.
우선 측정장치(100)를 도 8을 참조하면서 설명한다. 도 8은 본 실시형태의 측정장치(100) 구성을 나타내는 모식도이다.
본 실시형태의 측정장치(100)는 도 8에 나타내는 바와 같이, 광원(101)과, 셀(반응용기)(102)과, 셀(102)을 유지하는 셀 홀더(103)와, 셀(102)로부터의 광을 검출하는 광 검출기(104)와, 제거수단(108)을 구비한다.
광원(101)은, 출사되는 광이 셀(102)을 향하도록 배치된다.
광 검출기(104)는, 셀(102) 내에 구축된 반응계로부터의 산란광 또는 투과광을 검출한다.
제거수단(108)은 상기 제 1~제 4 실시형태에 있어서, 자력을 이용하여, 반응계 내에서 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 수집 및 제거하기 위한 것이다. 측정장치(100)에서 제거수단(108)은, 영구자석(105)과, 영구자석(105)을 보호하기 위한 커버(106)와, 영구자석(105)과 커버(106)가 배치된 암(107)으로 구성된다.
여기서, 제거수단(108)의 동작을 도 9를 참조하면서 설명한다. 도 9는 본 실시형태의 측정장치(100)에서의, 셀(102)과 제거수단(108)의 배치관계를 나타내는 도이다.
암(107)은 도 9에 나타내는 바와 같이, 영구자석(105)과 커버(106)를 강하시켜 셀(102) 내부로 삽입하고, 상승시켜 셀(102) 내부로부터 꺼내 올리는 것이 가능하다. 따라서 영구자석(105)과 커버(106)를 반응계 내로 도입시켜, 반응계 내의 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 커버(106) 표면에 부착시킨다. 이어서, 반응계의 흐림이 거의 소멸되면, 셀(102) 내에서 꺼내 올린다. 이로써 반응계 내로부터 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 수집 및 제거할 수 있다. 여기서 커버(106)에 부착된 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등은, 기계적인 방법으로 이탈시키면 된다. 예를 들어 커버(106)로부터 영구자석(105)을 꺼낸 후, 커버(106)에 부착되어 회수된 자성입자를 세정 등으로 제거하거나, 혹은 커버(106)를 폐기 처분해도 된다. 또 영구자석(105) 대신 전자석을 이용할 경우, 전자석의 자력발생 ON-OFF에 따라, 자성입자의 수집 및 제거를 실시하면 된다.
다음으로, 측정장치(200)를 도 10을 참조하면서 설명한다. 도 10은 본 실시형태의 측정장치(200) 구성을 나타내는 모식도이다.
본 실시형태의 측정장치(200)는, 도 10에 나타내는 바와 같이, 광원(201)과, 배출구(202a)를 구비하는 셀(반응용기)(202)과, 셀(202)을 유지하는 셀 홀더(203)와, 셀(202)로부터의 광을 검출하는 광 검출기(204)와 제거수단(208)을 구비한다.
광원(201)은, 출사되는 광이 셀(202)을 향하도록 배치된다.
광 검출기(204)는, 셀(202) 내에 구축된 반응계로부터의 산란광 또는 투과광을 검출한다.
제거수단(208)은, 상기 제 1~제 4 실시형태에서 자력을 이용하여, 반응계로부터 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 수집 및 제거하기 위한 것이다. 측정장치(200)에서 제거수단(208)은, 전자석(205)과, 셀(202) 배출구(202a)로부터의 배출물을 저류하기 위한 용기(206)와, 셀(202) 배출구(202a)에 연결되며 개폐 가능한 밸브(207)가 구성된다.
여기서 제거수단(208)의 동작을 도 11을 참조하면서 설명한다. 도 11은 본 실시형태의 측정장치(200)에서의, 셀(202)과 제거수단(208)의 배치관계를 나타내는 도이다.
밸브(207)는 도 11에 나타내는 바와 같이, 셀(202) 배출구(202a)에 연결된다. 이 상태에서 전자석(205)에 통전시키면, 셀(202) 내 반응계 중의 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등이 배출구(202a)로부터 밸브(207)를 통해 용기(206)로 이동한다. 이어서 반응계의 흐림이 거의 소멸되면, 밸브(207)를 닫고 전자석(205)으로의 통전을 멈춘다. 이로써 반응계 내로부터 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 수집 및 제거할 수 있다. 여기서 용기(206)에 저류된 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등은, 세정시켜 제거해도 된다. 또는 용기(206)를 폐기 처분해도 된다.
또 측정장치(200)에 있어서, 용기(206) 대신 셀(202)에 연결된 배출용 배관을 설치해도 된다.
또한 측정장치(200)에 있어서, 제거수단(208) 대신 도 12에 나타내는 제거수단(208')을 설치해도 된다. 도 12에 나타내는 바와 같이, 제거수단(208')은 영구자석(105)과, 영구자석(105)을 유지하는 암(107)과, 셀(202) 배출구(202a)로부터의 배출물을 저류시키기 위한 용기(206)와, 셀(202) 배출구(202a)에 연결되며 개폐 가능한 밸브(207)가 구성된다.
암(107)은, 도 12에 나타내는 바와 같이 영구자석(105)을 상하 운동시킬 수 있다. 따라서 영구자석(105)을 용기(206)에 가까이 하여, 반응계 내의 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 용기(206) 내로 배출시킨다. 이어서 반응계의 흐림이 거의 소멸되면, 밸브(207)를 닫고 영구자석(105)을 용기(206)로부터 멀리한다. 이로써 반응계 내로부터 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 수집 및 제거할 수 있다. 여기서 용기(206)에 저류된 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등은, 세정시켜 제거해도 된다. 또는 용기(206)를 폐기 처분해도 된다.
영구자석(105)을 포함하는 제거수단(108 및 208')을 이용하는 경우에는, 반응계의 광학 특성을 측정할 때, 영구자석(105)을 셀(202)로부터 떨어진 장소에 대기시켜두고, 측정 종료 후에 셀(202) 내의 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 수집 및 제거할 수 있도록 제거수단(108 및 208')을 동작시키는 것이 바람직하다.
전자석(205)을 포함하는 제거수단(108)을 이용하는 경우에는, 전자석(205)을 셀(202) 가까이 배치하는 것도 가능하다. 이는, 전자석(205)은 통전되지 않은 상태에서는 자력을 거의 발생시키지 않기 때문이다. 따라서 반응계의 광학 특성을 측정할 때는, 비 통전에 의해 자력을 발생시키지 않고 측정 종료 후에 통전에 의해 자력을 발생시켜, 셀(202) 내의 자성입자, 자성복합체 및 응집복합체 등을 수집 및 제거할 수 있도록 제거수단(108 및 208')을 동작시키는 것이 바람직하다. 상술한 어느 경우도, 반응계의 광학 특성을 측정할 때, 자력에 의한 항원항체반응에의 영향을 가능한 한 저감시킬 수 있기 때문이다.
이 때 미리 용기(206) 내를 반응계와 같은 완충액으로 채워두는 것이 바람직하다. 이로써 셀(202) 내의 반응계 체적변화를 적게 할 수 있다. 또 셀(202) 내 반응계의 체적변화가 작아지기 때문에, 반응계의 광학 특성을 측정할 때도, 측정에서 추가되는 시약의 용량만을 고려하면 된다. 따라서 광학특성 측정값으로부터 피측정물질의 농도를 추정하기가 용이해진다.
(실시예)
이하, 본 발명의 실시예를 상세하게 설명한다. 그리고 이하에 나타내는 실시예는 본 발명을 한정시키는 것이 아니다.
본 실시예에서는, 상기 제 2 실시형태의 제 1 피측정물질을 휴먼헤모글로빈으로 하고, 제 2 피측정물질을 휴먼알부민으로 하며, 제 1 특이결합물질을 항 휴먼헤모글로빈 항체로 하고, 제 2 특이결합물질을 항 휴먼알부민 항체로 하며, 제 2 특이결합물질을 비자성입자에 고정시키지 않는 경우의 시약 구성방법을 나타낸다.
여기서 본 실시예에 나타낸 완충액 등의 조제에는, Milli-Q SP TOC(Millipore제)로 여과한 순물을 사용한다. 또 특히 기재가 없는 소금, 완충제 등의 시약은, 모두 와코순약공업(和光純藥工業)제의 약품을 입수하며, 폴리에틸렌글리콜 6,000은 1급 시약을, 그 이외의 것은 특급시약을 사용한다.
제 1 특이결합물질인 항 휴먼헤모글로빈 항체 및 제 2 특이결합물질인 항 휴먼알부민 항체의 조제를, 다음과 같이 실시한다.
우선, 항 휴먼알부민 항체는, 휴먼알부민(와코순약공업제)을 면역시킨 토끼에서 채취한 항혈청으로부터, 프로테인A 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 IgG분획(fraction)을 정제하여 조제한다. 칼럼에 충전시킬 프로테인A 고정화 겔은, 아머샴 파마시아 바이오텍(Amersham Pharmacia Biotech)제의 것을 사용한다. 정제에 사용하는 평형화 완충액으로는, 1.5M 글리신, 3.0M NaCl, pH8.9 조성의 것을 사용하고, 용출 완충액으로는, 0.1M 구연산, pH4.0의 것을 사용한다.
정제는 다음과 같이 실시한다. 칼럼에 충전된 겔 용량의 5 배의 평형화 완충액을 흘려보내 칼럼을 평형화시킨 후, 칼럼 전체 결합용량의 10~20%의 항체를 포함하는 항혈청을 평형화 완충액으로써 2 배 용량으로 희석시켜 칼럼으로 보내, 혈청 중의 항체를 프로테인A에 결합시킨다. 이어서, 프로테인A에 흡착되지 않는 혈청성분이 칼럼으로부터 나오지 않을 때까지 평형화 완충액을 흘려보내 칼럼을 세정한다. 계속해서 칼럼에 용출 완충액을 흘려보내, 프로테인A에 결합된 항체를 용출한다. 용출된 항체분획을 분획분자량 1만의 투석튜브에 넣어, 약 100배 용량의 0.05M 3-(N-모폴리노(morpholino))프로판설폰산(Dojin제, 이하 MPS로 약칭함), 0.15M NaCl, 0.04중량% NaN3, pH7.4 조성의 완충액으로 수 회 투석하여 완충액 성분을 치환한다. 이어서 항체농도를 280nm의 흡광도 측정으로 추정하여, 투석에서 이용한 것과 동일한 완충액으로 조정하여 항체농도를 3.0mg/ml로 하고, 이를 항 휴먼알부민 항체용액으로 한다. 항체농도는, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 제작한 항체용액은 실온에서도 보존할 수 있지만, 항체 변성방지 관점에서 더욱 저온보존이 바람직하며, 4℃에서 보존하는 것이 보다 바람직하다.
항 휴먼헤모글로빈 항체는, 휴먼 헤모글로빈(SIGMA, Cat. No. H-7379)을 면역시킨 염소에서 채취한 항혈청으로부터, 프로테인G 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 IgG분획을 정제하고 자성입자에 고정시켜 조제한다. IgG분획 정제에 사용한 칼럼에 충전시킬 프로테인G 고정화 겔은, 아머샴 파마시아 바이오텍 제의 것을 사용한다. 정제에 이용하는 평형화 완충액으로는, 0.02M Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.0 조성의 것을 사용하며, 용출 완충액으로는, 0.1M 글리신, pH 2.7 조성의 것을 사용한다. 투석에 이용하는 완충액 조성은 0.05M MPS, 0.15M NaCl, 0.04중량% NaN3, pH 7.4로 한다. 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제조작 및 투석에 의한 완충액의 치환방법에 대해서는, 항 휴먼알부민 항체 조제의 경우와 마찬가지 방법을 사용한다.
이어서, 항체농도를 280nm의 흡광도 측정으로 추정하고, 투석에 이용한 것과동일한 완충액으로 조정하여 항체농도를 3.0mg/ml로 하고, 이를 항 휴먼헤모글로빈 항체의 자성입자에의 고정화를 위한 항 휴먼헤모글로빈 항체용액으로 한다.
자성입자는 조제하는 것도 가능하지만, 시판되고 있는 것을 이용할 수도 있다. 본 실시예에서는, 입경 1~2㎛의 철을 함유한 폴리스티렌라텍스 입자인 polysciences사제의 상품명 Polystyrene Superparamagnetic Microspheres, 1-2μ(Cat. No. 18190)을 사용한다. 자성입자에의 항체 고정화는 다음과 같이 실시한다.
2.5중량%의 자성입자 0.5ml를 마이크로튜브에 넣고, 여기에 0.05M MPS, 0.04중량% NaN3, pH 7.4 완충액을 0.5ml 첨가시켜 자성입자를 현탁(suspension)시키며, 이를 원심분리기(TOMY SEIKO사제, 모델No. MRX-150)를 이용하여 12,000rpm으로 30분간 원심 분리시키고, 자성입자를 침전시켜 상청액을 제거한다.
이어서 여기에, 0.05M MPS, 0.04중량% NaN3, pH 7.4의 완충액을 1ml 첨가하여 자성입자를 현탁시키며, 이를 12,000rpm으로 30분간 원심 분리시키고, 자성입자를 침전시켜 상청액을 제거한다. 이 자성입자의 현탁, 및 원심분리에 의한 침전을 다시 반복한다.
또 0.9ml의 0.05M MPS, 0.04중량% NaN3, pH 7.4의 완충액을 첨가하여 자성입자를 현탁시켜, 0.1ml의 상기에서 조제한 자성입자에의 항 휴먼헤모글로빈 항체용액을 첨가한다. 이를 실온하에서 회전기(TAITEC사제 모델No. RT-50)로 하룻밤 교반시킨다. 교반 후, 12,000rpm으로 30분간 원심 분리시키고, 자성입자를 침전시켜상청액을 제거한다. 여기에, 조성이 0.05M MPS, 1중량% 카제인나트륨, 0.04중량% NaN3, pH 7.4의 완충액을 첨가하여 자성입자를 현탁시키고, 30분간 회전기로 교반시킨다. 교반 후 12,000rpm으로 30분간 원심 분리시켜 자성입자를 침전시킨다. 이 자성입자의 현탁, 및 원심분리에 의한 침전을 합계 3 회 반복하여, 항체가 고정되지 않은 자성입자 표면을 블로킹한다.
그리고 조성이 0.05M MPS, 0.15M NaCl, 0.04중량% NaN3, 5 체적% 글리세롤, pH 7.4의 완충액을 첨가하여 자성입자를 현탁시킨다. 여기서 고정화에 사용한 항체농도 및 자성입자의 농도는, 상기에 한정되는 것이 아니다. 제작한 항체용액은 실온에서도 보존되지만, 항체의 변성방지 관점에서, 보다 저온보존이 바람직하며 4℃에서 보존하는 것이 더욱 바람직하다.
또 휴먼헤모글로빈을 측정하기 위해 반응계에 첨가하는 제 1 완충액으로서, 0.05M MPS, 0.04중량% NaN3, pH 7.4 조성의 완충액을 조제하며, 휴먼알부민을 측정하기 위해 반응계에 첨가하는 제 2 완충액으로서, 0.05M MPS, 8.6중량% 폴리에틸렌 글리콜 6,000, 0.04중량% NaN3, pH 7.4 조성의 완충액을 조제한다. 제작한 각 완충액은 실온에서 보존한다.
이상과 같이 구성한 항 휴먼헤모글로빈 항체(제 1 특이결합물질)가 고정된 자성입자와, 항 휴먼알부민 항체(제 2 특이결합물질)와, 각 완충액을 조합시킴으로써, 면역반응용 시약을 구성할 수 있다.
상기에서 구성한 시약의 사용방법을 이하에 나타낸다. 우선 2 종류의 피측정물질(휴먼헤모글로빈 및 휴먼알부민)을 포함하는 시료와, 항 휴먼헤모글로빈 항체(제 1 특이결합물질)가 고정된 자성입자와, 제 1 완충액을 혼합하여 반응계를 구축한다. 다음으로, 반응계의 광학특성을 측정한다. 측정 종료 후, 휴먼헤모글로빈(제 1 피측정물질)과, 항 휴먼헤모글로빈 항체(제 1 특이결합물질)과 자성입자로 이루어지는 응집복합체와, 응집복합체를 형성하지 않은 자성입자를, 자력으로 집합하여 반응계의 흐림을 소거한다.
이어서 항 휴먼알부민 항체(제 2 특이결합물질)용액과 제 2 완충액을 반응계에 혼합한다. 그 후, 반응계의 광학특성을 측정한다. 이상의 순서로 시료 중의 피측정물질 농도를 알 수 있다.
여기서 본 실시예에서는 나타내지 않았지만, 항 휴먼알부민 항체(제 2 특이결합물질)를 라텍스, 금콜로이드 등의 비자성입자에 고정시켜도 된다. 예를 들어 라텍스입자에 고정시키는 방법은, 상기 서술한 자성입자에 이용한 방법이 그대로 적용 가능하다.
또 본 실시예에서는 항체가 고정되지 않은 입자 표면을 카제인나트륨으로 블로킹하지만, 젤라틴, 스킴밀크 등으로도 대용할 수 있다. 사용하는 농도는 카제인나트륨의 경우와 같아도 된다.
그리고 본 실시예에서는 반응계를 구축하기 위해, 피측정물질별로 완충액을 준비하지만, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 고분자를 첨가한 1 종류의 완충액으로 각각의 반응계를 구성해도 된다.
또한 항체용액의 완충제 성분 및 pH는, 항원과 항체의 결합에 의한 면역반응에 악영향을 미치지 않는다면, 상기 조성 및 pH에 한정되는 것은 아니다.
또 적혈구 중에 함유된 헤모글로빈을 추출하기 위해, 예를 들어 염화칼륨 등의 용혈제를 반응계에 첨가하거나, 혹은 용혈제를 함유한 용액을 시약키트에 부가시켜도 된다.
이상 본 발명의 면역반응 측정방법 및 시약키트에 의해, 1 개의 반응용기 내에서 2 종류의 피측정물질을 측정할 수 있다.
본 발명의 특이결합반응 측정방법, 이에 이용되는 시약키트 및 특이결합반응 측정장치는, 다양한 질환의 진단 및 증세의 경과를 조사하는 데 유용하다. 예를 들어 본 발명의 구성을, 1 개의 시료로 휴먼헤모글로빈과 휴먼알부민을 측정하는 구성으로 하면, 신장질환의 진단에 유용하다.
본 발명에 의해, 1 개의 반응용기 내에서 2 종류 이상의 피측정물질을 측정하기가 가능하며, 측정에 필요한 시료를 삭감할 수 있는 특이결합반응 측정방법과 이에 이용되는 시약키트 및 측정장치를 제공할 수 있다.

Claims (20)

  1. 시료 중의 피측정물질 함유량을 측정하는 특이결합반응 측정방법이며,
    상기 시료와, 상기 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질이 고정화된 자성입자를 포함하는 반응계를 구축하는 공정(a)과,
    상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(b)과,
    상기 피측정물질과 상기 특이결합물질과 상기 자성입자를 포함하는 응집복합체를, 자력을 이용하여 상기 반응계로부터 제거하는 공정(c)을 포함하는 특이결합반응 측정방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 광학특성은, 산란광 강도 또는 투과광량인, 특이결합반응 측정방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성입자의 직경은 약 0.05~2㎛의 범위 내인, 특이결합반응 측정방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 공정(c)에서, 상기 반응계에 잔존하는 상기 자성입자를 상기 반응계로부터 제거하는, 특이결합반응 측정방법.
  5. 시료 중의 제 1 피측정물질 및 제 2 피측정물질 함유량을 측정하는 특이결합반응 측정방법이며,
    상기 시료와, 상기 제 1 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 1 특이결합물질이 고정화된 자성입자를 포함하는 반응계를 구축하는 공정(a)과,
    상기 공정(a) 후, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(b)과,
    상기 제 1 피측정물질과 상기 제 1 특이결합물질과 상기 자성입자를 포함하는 응집복합체를, 자력을 이용하여 모으는 공정(c)과,
    상기 반응계에, 상기 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 2 특이결합물질을 첨가하는 공정(d)과,
    상기 공정(d) 후, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(e)을 포함하는 특이결합반응 측정방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 공정(d)에서는, 반응계가 폴리에틸렌글리콜을 2~6 중량% 함유하는, 특이결합반응 측정방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 제 2 특이결합물질은, 상기 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 항원 또는 항체와, 상기 항원 또는 항체가 고정화된 비자성입자로 구성되는, 특이결합반응 측정방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 자성입자의 직경은 약 0.05~2㎛의 범위 내이며,
    상기 비자성입자의 직경은 약 0.05~2㎛의 범위 내인, 특이결합반응 측정방법.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 제 1 피측정물질과 상기 제 2 피측정물질의 조합은 휴먼 헤모글로빈과 휴먼 알부민의 조합인, 특이결합반응 측정방법.
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 공정(c)에서, 상기 반응계에 잔존하는 상기 자성입자를 모으는, 특이결합반응 측정방법.
  11. 시료 중의 n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질 함유량을 측정하는 특이결합반응 측정방법이며,
    상기 시료와, 미측정 피측정물질 중 1 종류에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질이 고정화된 자성입자를 포함하는 반응계를 구축하는 공정(a)과,
    상기 공정 (a) 후에 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(b)과,
    상기 1 종류의 피측정물질과 상기 특이결합물질과 상기 자성입자를 포함하는응집복합체를, 자력을 이용하여 상기 반응계로부터 제거하는 공정(c)과,
    상기 공정(c) 후에, 상기 공정(b)이 제 (n-1)회 미만일 경우, 다시 공정(a)으로 진행하도록 판단하는 공정(d)과,
    상기 반응계에, 상기 반응계에 남은 1 종류의 미측정 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 첨가하는 공정(e)과,
    상기 공정(e) 후, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(f)을 포함하는 특이결합반응 측정방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 공정(c)에서, 상기 반응계에 잔존하는 상기 자성입자를 상기 반응계로부터 제거하는, 특이결합반응 측정방법.
  13. 시료 중의 n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질 함유량을 측정하는 특이결합반응 측정방법이며,
    상기 시료와, 미측정 피측정물질 중 1 종류에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 포함하는 반응계를 구축하는 공정(a)과,
    상기 공정 (a) 후에 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(b)과,
    상기 1 종류의 피측정물질과 상기 특이결합물질로 이루어지는 응집복합체에, 결합 가능한 물질과 자성입자를 포함하는 자성복합체를 반응계에 첨가하는 공정(c)과,
    상기 자성복합체가 결합된 상기 응집복합체를, 자력을 이용하여 상기 반응계로부터 제거하는 공정(d)과,
    상기 공정(d) 후에, 상기 공정(b)이 제 (n-1)회 미만일 경우, 다시 공정(a)으로 진행하도록 판단하는 공정(e)과,
    상기 반응계에, 상기 반응계에 남은 1 종류의 미측정 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질을 첨가하는 공정(f)과,
    상기 공정(e) 후, 상기 반응계의 광학특성을 측정하는 공정(g)을 포함하는 특이결합반응 측정방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 공정(d)에서, 상기 응집복합체에 결합하지 않은 상기 자성복합체를 상기 반응계로부터 제거하는, 특이결합반응 측정방법.
  15. 시료 중의 제 1 피측정물질 및 제 2 피측정물질의 함유량을 측정하기 위한 시약키트이며,
    상기 제 1 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 1 특이결합물질이 고정화된 자성입자와,
    상기 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 제 2 특이결합물질을 포함하는, 시약키트.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 자성입자의 직경은 약 0.05~2㎛의 범위 내인, 시약키트.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 제 2 특이결합물질은, 상기 제 2 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 항원 또는 항체와, 상기 항원 또는 항체가 고정화된 비자성입자로 구성되는, 시약키트.
  18. 시료 중의 n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질 함유량을 측정하기 위한 시약키트이며,
    상기 n 종류의 피측정물질 중 1 종류의 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 1 종류의 특이결합물질과,
    상기 n 종류의 피측정물질 중 나머지 (n-1) 종류의 피측정물질에 대해 특이하게 결합하는 특이결합물질이 각각 고정화된 (n-1) 종류의 자성입자를 포함하는, 시약키트.
  19. 시료 중의 n 종류(n은 2 이상의 정수)의 피측정물질 함유량을 측정하기 위한 시약키트이며,
    상기 n 종류의 피측정물질에 대해 각각 특이하게 결합하는 n 종류의 특이결합물질과,
    상기 n 종류의 피측정물질 중 (n-1) 종류의 피측정물질과 그에 대응하는 (n-1) 종류의 특이결합물질로 이루어지는 응집결합체에 결합 가능한 물질과, 상기 물질이 고정화된 자성입자로 이루어지는 자성복합체를 포함하는, 시약키트.
  20. 셀과,
    상기 셀을 향해 광을 조사하는 광원과,
    상기 반응계로부터의 산란광 또는 투과광을 검출하는 광 검출기와,
    상기 셀 내에 자성입자가 포함된 경우, 자력을 이용하여, 상기 셀 내로부터 상기 자성입자를 제거하는 제거수단을 구비하는, 특이결합반응 측정장치.
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