CN115494243B

CN115494243B - 链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法及应用

Info

Publication number: CN115494243B
Application number: CN202211394694.2A
Authority: CN
Inventors: 陈南; 陆秋仙
Original assignee: Nanjing Kelos Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Kelos Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-09
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2042-11-09
Also published as: CN115494243A

Abstract

本申请涉及化学蛋白质组领域，尤其涉及链霉亲和素‑生物素的结合效率定量测定的方法及应用，其中测定的方法采用荧光素‑生物素‑叠氮代替现有的生物素‑叠氮，通过凝胶电泳‑胶内荧光强度直接扫描检测，可获取准确的富集效率。另外将该方法应用于提高链霉亲和素‑生物素的结合效率中，筛选出富集效率高的缓冲液为溶有0.05%SDS的PBS缓冲液，并且间隔固定时间分批次加入链霉亲和素偶联磁珠也可提高结合效率。

Description

链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法及应用

技术领域

本申请涉及化学蛋白质组领域，尤其涉及链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法及应用。

背景技术

化学蛋白质组学技术的不断发展，为生物体系中的小分子化学药物作用机制的探究提供了新的思路。链霉亲和素-生物素以其极高结合亲和力（解离常数Kd≈10⁻¹⁴ mol/L），高度选择性和稳定性而被广泛应用于分子科学的相关研究中。近年来，随着新的链霉亲和素变体被用于蛋白质纯化，以及选择性生物素化的方法被应用于体外和体内研究，使得链霉亲和素-生物素的相关应用在一定程度上迎来了复兴。除了广泛应用的检测、标记和药物传递等领域外，链霉亲和素-生物素在催化、细胞生物学和化学蛋白质组学领域也取得了显著的发展(Christopher M. Dundas et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97,9343–9353)。

随着该方法的应用逐渐推广，在复杂蛋白质组体系中链霉亲和素-生物素的结合效率的定量测定也变得尤为重要，例如在不同的生物缓冲液中链霉亲和素偶联磁珠对生物素化蛋白质组的富集效率，该过程的定量分析对于化学蛋白质组学样品的制备至关重要。通常，化学蛋白质组学样品制备过程包括将生物素化（外源化学或酶法引入）的蛋白质与背景蛋白质（无生物素化修饰）分离，该过程可以借助于链霉亲和素偶联磁珠完成，如果富集效率较低则会造成最终样品中靶标蛋白质的丰度较低，导致实验组和空白组的差异不明显而不能有效检测，同时会严重影响实验结果的重复性。在一些实验研究中，研究人员一般会试图提高链霉亲和素偶联磁珠的用量或蛋白质组样品的进样量来解决以上问题，这使得成本大幅度提升。尤其是，对于一些较为珍贵的样品（病人组织，体液等），实验结果的准确性和可重复性显得尤为重要。

为了能够比较溶液中生物素修饰水平的变化，通常会选用炔基碘乙酰胺探针（IA），该探针已经被广泛应用于蛋白质组中半胱氨酸残基标记研究。IA探针共价标记半胱氨酸残基后，末端炔基能够和叠氮基团发生生物正交偶联反应，从而引入功能性化学修饰。其中，生物素-叠氮（Biotin-PEG₃-azide）是用于引入外源生物素修饰的常用标签试剂之一，通过点击化学与IA探针耦合，从而对IA探针标记的蛋白质组进行高效生物素化修饰，能够被后续链霉亲和素偶联磁珠富集分离，供检测分析。

然而，若比较富集分离前后，溶液中生物素修饰强度变化，传统方法一般是进行免疫印迹分析，结合带有荧光基团标记的链霉亲和素蛋白质能够对生物素修饰强度进行定量分析。该方法不足之处在于实验操作流程较为繁琐，需进行以下步骤：凝胶电泳，转膜，封闭，抗体孵育及荧光强度定量检测等。同时，当外源性引入生物素修饰强度较低（化学探针标记强度较低）时，内源性生物素修饰会产生较强的背景信号，无法对所关注的外源性生物素修饰水平变化进行定量比较。同时，由于该过程涉及步骤较为繁琐，容易引入实验操作误差，不利于广泛应用于链霉亲和素偶联磁珠富集效率定量分析中。

发明内容

为了简化测定方法，以及减少内源生物素背景信号的干扰，确保测定结果的准确性，本申请提供的链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法，将荧光素-生物素-叠氮代替现有的生物素-叠氮，通过凝胶电泳-胶内荧光强度直接扫描检测，可获取准确的富集效率。另外将该方法应用于提高链霉亲和素-生物素的结合效率中，筛选出富集效率高的缓冲液为溶有0.05% SDS的PBS缓冲液，并且间隔固定时间，分批次加入链霉亲和素偶联磁珠也可提高结合效率。

本申请一方面提供链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法，包括：

使用炔基碘乙酰胺探针标记蛋白质组。

加入荧光素-生物素-叠氮、抗坏血酸钠、BTTAA和CuSO₄。

萃取、洗涤、重悬于待富集缓冲浓缩液中。

溶解、去沉淀，并稀释至富集缓冲液终浓度，得到富集前样品。

将富集前样品与链霉亲和素偶联磁珠富集，富集后的上清液，作为富集后样品。

获取富集前样品和富集后样品的蛋白质荧光信号强度。

对比富集前样品和富集后样品的蛋白质荧光信号强度，得到链霉亲和素-生物素的结合效率。

需要说明的是本申请中提及的“链霉亲和素-生物素的结合效率”，也可称为：富集效率，是本领域技术人员所公知的。

在一些实施方案中所述链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法，包括：将-80℃保存的NCI-H358细胞置于冰上融化，加入lysis buffer[PBS（ThermoFisherScientific），1%IGEPAL-CA-630(Sigma-Aldrich)，0.2% SDS(Sigma-Aldrich)，1% EDTA-free protease inhibitor mixture（Sigma-Aldrich）]，超声破碎后在4℃台式离心机高速离心(20000 g，30 min)。取上清液，使用BCA蛋白质测定法（Beyotime）在酶标仪上测定蛋白质浓度，并用lysis buffer将浓度调至2mg/mL。室温下加入终浓度为10μM探针炔基碘乙酰胺或DMSO，静置避光孵育一个小时，在室温下加入200μM荧光素-生物素-叠氮、2.5mM抗坏血酸钠、25mM BTTAA和12.5mM CuSO₄，反应1小时。

上述反应结束后，用氯仿-甲醇萃取蛋白质组以除去多余的试剂，再将蛋白质组用冷甲醇洗涤两次，重悬于待富集缓冲浓缩液中，超声辅助溶解，高速离心（20000g，2min）去除可能的沉淀杂质，并用PBS稀释至富集缓冲液终浓度，此时取40μL全蛋白质组溶液，作为富集前样品。随后将蛋白质溶液与链霉亲和素偶联磁珠(400μL)在室温下旋转孵育3小时，富集结束后分别取上清液40μL，作为富集后样品。将富集前样品和富集后样品分别与SDS样品上样缓冲液混合并通过10％ SDS-PAGE分离，使用BioradChemiDoc成像系统得到罗丹明荧光及考马斯亮蓝的图像。

在一些实施方案中，所述荧光素-生物素-叠氮的化学结构如下所示：

。

在一些实施方案中，获取富集前样品和富集后样品的荧光信号强度的步骤，包括：

将富集前样品和富集后样品分别与SDS样品上样缓冲液混合并通过10％ SDS-PAGE分离；使用成像系统获取罗丹明荧光及考马斯亮蓝的图像。

根据荧光图像获取富集前样品和富集后样品的荧光信号强度。

在一些实施方案中，对比富集前样品和富集后样品的蛋白质荧光信号强度，得到链霉亲和素-生物素的结合效率，包括：

使用链霉亲和素-生物素的结合效率的计算模型，获取链霉亲和素-生物素的结合效率，所述链霉亲和素-生物素的结合效率的计算模型如下：

其中，E为链霉亲和素-生物素的结合效率。

本申请另一方面提供所述的方法在提高链霉亲和素-生物素的结合效率中的应用。

在一些实施方案中，所述应用包括：

获取不同种类缓冲液的富集效率，筛选出富集效率高的缓冲液。

将链霉亲和素偶联磁珠间隔固定时间加入。

在一些实施方案中，所述富集效率高的缓冲液为溶有0.05% SDS的PBS缓冲液。

在一些实施方案中，所述固定时间为1h。

本申请的有益效果：

能够实现探针标记蛋白质的富集，借助于荧光基团，能够快速比较富集前后溶液中残留探针修饰蛋白质的量。本申请提供的方法，避免了转膜，封闭，抗体孵育等过程，大大降低了方法繁琐度，同时由于荧光分子直接偶合在化学探针上，无需借助链霉亲和素-生物素系统对探针标记信号进行检测，因此没有内源生物素背景信号干扰。本申请提供的方法分别将富集前后的溶液取样，只需通过一步法，即凝胶电泳-胶内荧光强度直接扫描检测，则可对每组样品荧光强度进行定量比较，快速得到富集前后样品中生物素修饰蛋白质的含量差异，该差异信号反映了磁珠对于生物素修饰蛋白质的富集程度，从而能够对富集效率进行准确定量。

同时，在实验中，由于探针标记的蛋白质占全蛋白质组量的比例很低，不足1%，因此在链霉亲和素偶联磁珠富集前后，蛋白质含量不会发生显著改变，即考马斯亮蓝（Coomassie blue）信号在富集前后的样品中将保持一致。由于磁珠在不同的生物缓冲液中可能会有不同程度的非特异性吸附，导致富集前后样品中蛋白质总体量发生变化，所以Coomassie blue信号的变化能够帮助我们判断磁珠非特异性吸附程度，即该生物缓冲液是否适合选择性富集生物素修饰蛋白质。同时，我们也设置了对照组，即没有探针标记的蛋白质样品（DMSO处理组），理论上链霉亲和素偶联磁珠的富集不会对该样品组荧光信号（无荧光信号强度）和Coomassie blue信号带来明显影响（内源生物素修饰蛋白质数目很少，不足以导致蛋白质量的变化），因此，该对照组也将为不同生物缓冲液特异性富集效率的测定和选择提供重要的数据支持。

本研究申请提供的测定方法，具有高灵敏度和操作快速等特点，能够在任意分子生物学实验室中进行实验操作，对复杂样品体系中生物素修饰的大分子（例如蛋白质和DNA）的富集效率进行准确定量，从而确保相应实验条件下实验结果的可靠性和可重复性。本申请提供的测定方法，适用于多种不同生物缓冲液，避免了实验条件的改变导致方法应用的局限性，极大的拓展了该方法的应用场景。

通过本申请提供的测定方法，将本申请提供的测定方法应用于提高链霉亲和素-生物素的结合效率中，对蛋白质组中外源生物素修饰富集条件进行了优化，即在0.05%SDS/PBS缓冲液中，链霉亲和素偶联磁珠能够高度选择性富集生物素修饰蛋白质，同时没有明显的非特异性吸附，其富集效率可以达到50%以上。最优富集体系0.05% SDS/PBS缓冲液对磁珠富集工艺流程进行优化，使用连续分批加入策略，溶液中生物素化修饰富集效率提升到80%以上，满足大多数实验的检测需求。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为现有方法对链霉亲和素偶联磁珠富集效率进行检测的结果图，A为丽春红荧光信号（Ponceau-S），B为异硫氰酸荧光素信号（Streptavidin-FITC），before和after分别指磁珠富集前后的样品；

图2为链霉亲和素偶联磁珠在IGEPAL-CA-630/urea溶液中富集结果图，A为罗丹明荧光信号（Fluorescence），B为考马斯亮蓝信号（Coomassie blue），before和after分别指磁珠富集前后的样品；

图3为链霉亲和素偶联磁珠在SDS/urea溶液中富集结果图，A为罗丹明荧光信号（Fluorescence），B为考马斯亮蓝信号（Coomassie blue），before和after分别指磁珠富集前后的样品；

图4为链霉亲和素偶联磁珠在SDS溶液中富集结果图，A为罗丹明荧光信号（Fluorescence），B为考马斯亮蓝信号（Coomassie blue），before和after分别指磁珠富集前后的样品；

图5为链霉亲和素偶联磁珠在0.05% SDS/PBS溶液中不同链霉亲和素偶联磁珠用量的富集结果图，A为罗丹明荧光信号（Fluorescence），B为考马斯亮蓝信号（Coomassieblue），before和after分别指磁珠富集前后的样品；

图6为链霉亲和素偶联磁珠在0.05% SDS/PBS溶液中以本申请实施例所用方法分批加入对溶液中生物素化修饰进行富集的结果图，A为罗丹明荧光信号（Fluorescence），B为考马斯亮蓝信号（Coomassie blue），before和after分别指磁珠富集前后的样品。

具体实施方式

下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。

实施例1现有测定方法的结果

为了能够比较溶液中生物素修饰水平的变化，本申请实施例首先构建了实验体系，能够在复杂蛋白质组引入外源生物素化修饰。选用炔基碘乙酰胺探针（IA）。IA探针共价标记半胱氨酸残基后，末端炔基能够和叠氮基团发生生物正交偶联反应，从而引入功能性化学修饰。其中，生物素-叠氮（Biotin-PEG3-azide）是用于引入外源生物素修饰的常用标签试剂之一，通过点击化学与IA探针耦合，从而对IA探针标记的蛋白质组进行高效生物素化修饰，能够被后续链霉亲和素偶联磁珠富集分离，供检测分析。

炔基碘乙酰胺探针的结构如下：

生物素-叠氮（Biotin-PEG3-azide）的结构如下：

比较富集分离前后，溶液中生物素修饰强度变化，采用传统方法进行免疫印迹分析，结合带有荧光基团标记的链霉亲和素蛋白质能够对生物素修饰强度进行定量分析。该方法不足之处在于实验操作流程较为繁琐，其结果如图1所示，在IA探针浓度为0的条件下，有两条非常显著的生物素信号条带，即内源性生物素修饰蛋白质对应信号，由于该信号太强，导致10 μM IA探针标记组信号强度与对照组相比，并无显著差异。在富集后的上清溶液中残留生物素修饰的信号相比于富集前略有降低，且随磁珠用量增加有降低趋势，但并不能准确定量。同时，由于该过程涉及步骤较为繁琐，容易引入实验操作误差，不利于广泛应用于链霉亲和素偶联磁珠富集效率定量分析中。

实施例2胶内荧光分析

将-80℃保存的NCI-H358细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）置于冰上融化，加入lysis buffer [PBS（ThermoFisher Scientific），1%IGEPAL-CA-630(Sigma-Aldrich)，0.2% SDS (Sigma-Aldrich)，1% EDTA-free protease inhibitor mixture（Sigma-Aldrich）]，超声破碎后在4℃台式离心机高速离心(20000 g，30 min)。取上清液，使用BCA蛋白质测定法（Beyotime）在酶标仪上测定蛋白质浓度，并用lysis buffer将浓度调至2mg/mL。室温下加入终浓度为10 μM探针炔基碘乙酰胺（IA）(由南京科洛斯生物科技有限公司合成)或DMSO（Sigma-Aldrich），静置避光孵育一个小时，在室温下加入200μM荧光素-生物素-叠氮（TAMRA-Azide-PEG-Biotin，CONFLUORE）、2.5mM抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich）、25mMBTTAA（CONFLUORE）和12.5mM CuSO₄(Innochem)，反应1小时。

上述反应结束后，用氯仿(北京沃凯生物科技有限公司)-甲醇(Innochem)萃取蛋白质组以除去多余的试剂，再将蛋白质组用冷甲醇洗涤两次，重悬于待富集缓冲浓缩液中，超声辅助溶解，高速离心（20000g，2 min）去除可能的沉淀杂质，并用PBS稀释至富集缓冲液终浓度，此时取40μL全蛋白质组溶液，作为富集前（Before）样品。随后将蛋白质溶液与链霉亲和素偶联磁珠(400μL，ThermoFisher)在室温下旋转孵育3小时，富集结束后分别取上清液40μL，作为富集后（After）样品。将所有样品分别与SDS样品上样缓冲液混合并通过10％SDS-PAGE(Epizyme)分离，使用BioradChemiDoc成像系统得到罗丹明荧光及考马斯亮蓝的图像。

实施例3富集工艺优化

将-80℃保存的NCI-H358细胞置于冰上融化，加入lysis buffer[PBS，1%IGEPAL-CA-630，0.2% SDS，1% EDTA-free protease inhibitor mixture]，超声破碎后在4℃台式离心机高速离心(20000 g，30 min)。取上清液，使用BCA蛋白质测定法在酶标仪上测定蛋白质浓度，用lysis buffer将浓度调至2mg/mL。室温下加入终浓度为10 μM探针炔基碘乙酰胺（IA）(购自南京志药科技有限公司)或DMSO（Sigma-Aldrich），静置避光孵育一个小时，在室温下加入200μM荧光素-生物素-叠氮（TAMRA-Azide-PEG-Biotin，TAB）、2.5mM抗坏血酸钠、25mM BTTAA和12.5 mM CuSO₄，反应1小时。上述反应结束后，用氯仿-甲醇萃取蛋白质组以除去多余的试剂，再将蛋白质组用冷甲醇洗涤两次，重悬于待富集缓冲浓缩液中，超声辅助溶解，高速离心（20000g，2 min）去除可能的沉淀杂质，并用PBS稀释至富集缓冲液终浓度，此时取40μL蛋白质组溶液，作为富集前（Before）样品。随后将蛋白质溶液与链霉亲和素偶联磁珠(200μL，ThermoFisher)在室温下旋转孵育1小时，富集结束后分别取上清液40μL，作为富集1小时后样品，此时将磁珠分离，分离出来的磁珠保存于PBS溶液中，全蛋白质组样品溶液则加入新的200μL磁珠，重复两次（共计使用600μL磁珠）。

将所有样品分别与SDS样品上样缓冲液混合并通过10％SDS-PAGE分离，罗丹明荧光及考马斯亮蓝的图像是在BioradChemiDoc成像系统上获得。

富集效率检测：

使用ImageJ软件打开按上述方法所得的荧光图像，并定量各组的荧光信号强度，将泳道中的条带依次进行分析，并标注出较为清晰的条带，接着使用软件中的定量工具分析各实验组中对应位置较为独立的三个条带，从而得到这些条带的荧光信号强度。按富集效率的计算公式计算出各条带对应的富集效率，再取各组平均值为每组实验样品对应的富集效率。富集效率的计算公式如下：

其中，E为链霉亲和素-生物素的结合效率，也即富集效率。

实施例4提高富集效率

去污剂的筛选

在生物学或生物化学实验室使用的去污剂都是作用比较温和的表面活性剂（即表面活性成分），是用来破坏细胞膜（裂解细胞）以释放细胞内的可溶性物质。它们可以破坏蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质、脂质-脂质之间的连接，使蛋白质发生结构上的变性，防止蛋白质结晶。同时去污剂也具有去除非特异性吸附的特性，因此这里只是根据有限的实验选择了适合的去污剂。

IGEPAL-CA-630是一种非离子、非变性去垢剂，适用于膜蛋白复合物的增溶、分离和纯化，同时尿素（urea）是一种常用的蛋白质溶解剂中，二者均能够破坏蛋白质之间的非特异性吸附结合，所以将IGEPAL-CA-630和urea加入富集的缓冲液中，研究其对磁珠富集生物素修饰蛋白质的影响。如图2所示，与上述实验方法类似，首先使用IA探针标记全蛋白质组，再加入TAB试剂，发生点击化学反应，从而在探针标记的蛋白质上通过化学反应引入外源性生物素修饰。当加入链霉亲和素偶联磁珠后，溶液中的生物素修饰蛋白质与链霉亲和素特异性结合，通过磁珠-磁铁作用，即可将生物素修饰蛋白质从溶液中富集分离出来。该实验结果如图2所示，链霉亲和素偶联磁珠富集反应分别在0.1% IGEPAL-CA-630/2M urea/PBS、0.1% IGEPAL-CA-630/1M urea/PBS、0.1% IGEPAL-CA-630/0.5M urea/PBS的缓冲液中进行，尽管富集前后荧光信号显著性减弱，但对比Coomassie blue信号强度可知，富集后蛋白质量显著降低，尤其是探针为0的对照组，理论上富集前后该组Coomassie blue信号保持不变，因此，上述数据说明在实验条件下，链霉亲和素偶联磁珠非特异性吸附严重，达不到对生物素修饰蛋白质高选择性富集的目的。

IGEPAL-CA-630和尿素不能有效破坏链霉亲和素偶联磁珠与蛋白质之间的非特异性结合，因此导致磁珠在溶液中具有显著性非特异性吸附。为了进一步去除非特异性吸附，我们对缓冲液的变性能力进行了提升，将IGEPAL-CA-630替换成十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是阴离子表面活性剂，其变性能力很高，常用于蛋白质和类脂类的电泳分离。如图3所示，在该实验条件下，磁珠富集前后Coomassie blue信号在0.01% SDS/1M urea/PBS和1M urea缓冲液中明显降低，即富集前后蛋白质量明显减少，说明磁珠在该富集体系中非特异性吸附严重。而其它条件下，通过对Coomassie blue信号定量分析，未观察到明显非特异性吸附，分别计算0.05% SDS/PBS、0.05% SDS/1M urea/PBS、0.025% SDS/1M urea/PBS 三个条件下的磁珠富集效率，富集后/富集前占比依次54.9%、51.6%、45.4%，即富集效率E分别是45.1%、48.4%、54.6%。

因此，以上数据说明SDS能够显著降低非特异性吸附，提高磁珠富集的选择性。为了简化实验条件，在后续实验中，我们尝试将urea去除，仅保留SDS作为蛋白质的溶解剂，对磁珠富集条件进行进一步优化。高浓度SDS能够有效溶解蛋白质，使蛋白质的去折叠，将生物素修饰暴露于蛋白质表面，从而有利于生物素和链霉亲和素之间的结合，同时也降低了蛋白质对磁珠的非特异性吸附。然而，SDS浓度过高也会对生物素与链霉亲和素之间的结合产生影响，因此后续实验对SDS浓度进行尝试，确保有效去除非特异性吸附的前体下，使链霉亲和素磁珠富集效率达到最大化。

实验结果如图4所示，在四个实验条件下，富集前后样品中蛋白质Coomassie blue信号不变，即蛋白质量在富集前后无显著改变，而荧光信号明显减弱，表明生物素修饰的蛋白质被选择性吸附富集。对四个实验条件下，各组样品的荧光强度进行定量分析，0.1% SDS条件下，链霉亲和素磁珠富集效率为46%、0.05% SDS条件下链霉亲和素偶联磁珠富集效率为58%以及0.025% SDS条件下链霉亲和素偶联磁珠富集效率为53%。然而，随着SDS浓度的降低，需要增大溶液体积，以确保蛋白质完全溶解，因此0.025% SDS条件下缓冲液体积加倍，蛋白质浓度减半，荧光信号较弱，不利于后续定量分析。综上，实验结果表明0.05% SDS/PBS缓冲液条件下，链霉亲和素偶联磁珠与生物素修饰的蛋白质结合效率最高。同时0.05%SDS/PBS缓冲液条件下，进行三次生物重复性实验，其富集效率分别52%、59%、53.5%(CV值为6.113%)，说明该条件下链霉亲和素偶联磁珠能够稳定的实现复杂蛋白质组体系中生物素修饰蛋白质有效富集。

综上研究结果，对比不同缓冲溶液体系中链霉亲和素偶联磁珠富集效率，其中0.05% SDS /PBS缓冲液条件下链霉亲和素偶联磁珠富集效率最高，但仅在50%左右，因此，本发明则进一步在该条件下，对富集工艺进行了优化，以提高链霉亲和素偶联磁珠富集效率。

理论上，在一定量的生物素化蛋白质溶液中，增加链霉亲和素偶联磁珠的使用量，即可提高富集效率。实验结果如图5所示，当磁珠的使用量从200μL分别增加至400μL和600μL时，溶液中生物素修饰蛋白质的富集率分别是38%、52%、53%，并没有显著提升。实际上，链霉亲和素与生物素之间的结合是一个动态平衡过程，与化学反应类似，当反应物浓度始终处于较高水平时，则有利于平衡向产物方向推动。因此，为了提高富集效率，我们对富集工艺进行了改进，将链霉亲和素偶联磁珠间隔不同时间分批加入，保证了溶液中链霉亲和素有效浓度始终较高。如图6所示，对IA探针标记的蛋白质组，分别在1h、2h和3h时加入200 μL链霉亲和素偶联磁珠，对结果进行分析，富集效率依次为41.7%、66.3%、81.9%。未加IA探针处理的DMSO组，富集前后样品中蛋白质Coomassie blue信号不变，即蛋白质量在富集前后无显著改变，表明生物素修饰的蛋白质被选择性吸附富集。因此，该结果表明相同的磁珠用量下，连续分批加入法会显著提高生物素化修饰的富集效率，达到80%以上，满足了后续实验的需求。

本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。

Claims

1.链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法，其特征在于，包括：

使用炔基碘乙酰胺探针标记蛋白质组；

加入荧光素-生物素-叠氮、抗坏血酸钠、BTTAA和CuSO₄；

萃取、洗涤、重悬于待富集缓冲浓缩液中；

溶解、去沉淀，并稀释至富集缓冲液终浓度，得到富集前样品；

将富集前样品与链霉亲和素偶联磁珠富集，富集后的上清液，作为富集后样品；

获取富集前样品和富集后样品的蛋白质荧光信号强度；

对比富集前样品和富集后样品的蛋白质荧光信号强度，得到链霉亲和素-生物素的结合效率；所述荧光素-生物素-叠氮的化学结构如下所示：

；

所述对比富集前样品和富集后样品的蛋白质荧光信号强度，得到链霉亲和素-生物素的结合效率，包括：

；

其中，E为链霉亲和素-生物素的结合效率。

2.根据权利要求1所述的链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法，其特征在于，获取富集前样品和富集后样品的荧光信号强度的步骤，包括：

将富集前样品和富集后样品分别与SDS样品上样缓冲液混合并通过10％SDS-PAGE分离；使用成像系统获取罗丹明荧光及考马斯亮蓝的图像；

3.权利要求1所述的方法在提高链霉亲和素-生物素的结合效率中的应用，其特征在于，所述应用包括：

采用权利要求1所述的方法获取不同种类缓冲液的富集效率，筛选出富集效率高的缓冲液；

将链霉亲和素偶联磁珠间隔固定时间加入。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述富集效率高的缓冲液为溶有0.05%SDS的PBS缓冲液。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述固定时间为1h。