CN114891060A - 关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记方法，以及其在制备用于研究蛋白‑蛋白相互作用的试剂盒中的应用。方法包括：将目标蛋白与光敏蛋白进行融合表达，获得含有融合蛋白的第一体系；提供含氨基和炔基的化学探针，第一体系与化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理，获得第二体系；提供含生物素标记叠氮化物的点击化学反应试剂，将第二体系与点击化学反应试剂混合并进行点击化学反应，然后进行蛋白质组学分析，获得与目标蛋白相互作用的邻近蛋白信息。

Description

关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记方法，以及其在制备用于研究蛋白-蛋白相互作用的试剂盒中的应用。
背景技术
为了研究蛋白-蛋白相互作用（PPI），许多生物化学技术已经被利用并发展起来，用于表征蛋白的亚细胞定位以及蛋白的相互作用靶点。
1、亲和力纯化-质谱技术：
传统的鉴定蛋白-蛋白相互作用的方法是亲和力纯化与质谱鉴定相结合的方法，对于高丰度的内源蛋白，通常采用抗体免疫沉淀的方法进行蛋白复合体的捕获；对于低丰度内源蛋白或没有适合的抗体的蛋白，则通常需要将一段抗原标签融合到待研究的蛋白上，从而可以利用标签的抗体对内源过表达的靶点蛋白的相互作用蛋白进行捕获。利用蛋白质谱技术，可以对相互作用蛋白进行鉴定和定量。亲和力纯化与质谱鉴定相结合的方法在过去几十年被研究人员广泛采用，然而其存在几个重要的局限：第一，此方法要求在后续的纯化、洗涤等过程中维持蛋白复合体的结构，这导致实验结果高度依赖具体的实验条件，重现性不好；并且细胞裂解后，导致在细胞结构中原本处于不同细胞器的蛋白发生接触，容易产生假阳性的信号，最终鉴定到的相互作用蛋白是否能够真实反应体内的原始结构很难评估。第二，此方法更倾向于检测强结合力的作用蛋白，而对于弱结合力或者瞬时作用蛋白的检测比较困难。弱结合力蛋白在生命过程中扮演着重要角色，然而其在当前的蛋白-蛋白相互作用数据库中却是被高度忽视的。
2、非天然氨基酸方法
为了捕获弱结合力、瞬时的蛋白-蛋白相互作用，研究人员应用Peter Schultz等人发展的遗传密码扩增技术，通过正交的氨酰-tRNA合成酶，以及相应的tRNA组合对，将光交联基团以非天然氨基酸的形式插入到待研究的蛋白中，再通过光照触发，光交联基团可以将蛋白表面结合的相互作用蛋白捕获，这一方法在研究体内动态的蛋白-蛋白相互作用具有重要优势，能够以位点特异性的方式捕获直接相互作用蛋白，具有较高的空间分辨率（通常限制性标记半径小于15Å）。然而这一方法存在的局限性在于：第一，由于在插入光交联氨基酸的位置对标记产率的影响很大，因此需要对光交联基团的插入位点进行大量的优化；并且通常在待研究的蛋白中只插入一个光交联基团，因此该标记反应是“化学计量的”，这也导致其标记产率较低；第二，该方法只能标记蛋白结合表面的直接相互作用蛋白，而对蛋白复合体中的其他非直接相互作用蛋白则无法鉴定。
3、邻近标记法
为了实现“催化量”标记，即在每个目标蛋白的周围产生大量的活性标记分子，从而提高标记产率并实现对较大蛋白复合体中各个成员的标记，Brian Burke课题组和AliceTinge课题组发展了“邻近生物素标记”技术。这些方法通常将目标蛋白与一种具有“催化活性”的蛋白酶进行融合表达，此蛋白酶能够催化活化生物素（biotin）衍生物，进而生物素衍生物可以在活细胞中对目标蛋白的邻近蛋白进行生物素标记。由于生物素标签被共价连接到了邻近蛋白上，因此表达目标蛋白的细胞或者组织可以采用严苛的裂解条件，来有效的溶解膜蛋白等细胞组分。通过链霉亲和素磁珠富集以后，可通过严苛的洗涤条件洗去背景，降低假阳性信号，最后可以通过质谱方法进行鉴定。
目前，有两大类蛋白酶被应用于“邻近生物素标记”。第一类蛋白酶是生物素连接酶，其可以活化生物素，生成生物素-单磷酸腺苷中间体（biotinoyl-AMP），并将其释放到目标蛋白的周围，通过与邻近蛋白上赖氨酸上ε-氨基反应，完成标记，其中，相应技术包括BioID，以及通过对生物素连接酶进行定向演化而优化后的TurboID等。第二类蛋白酶是过氧化物酶，在过氧化氢存在下，将生物素-苯酚转化为生物素-苯酚自由基，进而与邻近蛋白上的酪氨酸反应完成标记。相应的技术称为APEX，或者APEX2。目前BioID/TurboID存在的弊端在于：1）生物素活性衍生物如生物素-单磷酸腺苷中间体反应活性低（t1/2 ~ 5分钟），致扩散较远；2）BioID方法需要利用生物素作为原料，因此内源的生物素会产生大量的背景干扰；而APEX/APEX2的方法，虽然一定程度上可以弥补BioID/TurboID的不足，然而其依然存在显著的限制：标记过程需要过氧化氢，因此不适用于研究对氧化还原条件敏感的蛋白或者信号通路。因此开发新型的、能够解决上述问题的蛋白-蛋白相互作用研究方法，将具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记方法，以应用于研究蛋白-蛋白相互作用网络。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记方法，包括以下步骤：
将目标蛋白与光敏蛋白进行融合表达，获得含有融合蛋白的第一体系；
提供含氨基和炔基的化学探针，所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理，获得第二体系；
提供含生物素标签叠氮化物的点击化学反应试剂，将所述第二体系与所述点击化学反应试剂混合并进行点击化学反应，然后进行蛋白质组学分析，获得与所述目标蛋白相互作用的邻近蛋白信息。
本发明提供的以上光激活依赖性邻近标记方法中，光敏蛋白具有光催化活性，在可见光作用下可触发生成单线态氧，单线态氧的理论扩散距离为70nm，将目标蛋白与光敏蛋白进行融合表达，可利用单线态氧来实现对蛋白复合体中与目标蛋白质相互作用的邻近蛋白进行标记。将含氨基和炔基的化学探针与融合蛋白孵育后进行光照处理，在可见光光照处理后，蛋白复合体中的部分氨基酸残基被单线态氧修饰，亲核氨基酸残基发生极性转换，氧化后呈亲电性，从而进一步与化学探针的氨基发生反应，使得化学探针被标记到经单线态氧修饰的氨基酸残基上，最终在蛋白复合体上连接炔基标签。加入含叠氮化物的点击化学反应试剂后，化学探针的炔基与叠氮化物发生点击化学反应而完成生物素标记以便用于后续的蛋白质组学分析，进而由此获得与目标蛋白相互作用的邻近蛋白信息。由于单线态氧的半衰期短（小于0.6 µs）并且扩散半径较小（小于70nm），因此在实现催化标记的同时，可以保证标记的空间分辨率和保真性。同时，将目标蛋白与光敏蛋白进行融合表达，一方面，光敏蛋白作为信号的接收“天线”，可以吸收可见光，从而实现在时间和空间上对整个体系的调控，并且通过调节光照时间，可以对标记半径进行调节，从而对目标蛋白周围的蛋白复合体进行拓扑结构模拟，另一方面，蓝光的光照波长为450-480nm，对细胞的整体影响较小。
作为可选的实施方式，所述光敏蛋白包括：miniSOG、单线态氧光敏蛋白SOPP系列中的至少一种。
作为可选的实施方式，所述化学探针具有如通式（Ⅰ）所示的化学结构：
Figure 865630DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）
n为0-10之间的整数，R1包括烷基、胺基酰基、酰基、酯基和酰胺基中的至少一种。
在本发明中，烷基是指一类仅含有碳、氢两种原子的有机基团，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基等，优选地，当R1为烷基时，其碳原子个数应不大于5。胺基酰基表示为-NHC(O)-R3-，R3为烷基，优选地，R3的碳原子个数不大于3。酰基表示为-C(O)-R4-，R4为烷基，优选地，R4的碳原子个数不大于5。酯基表示为-C(O)OR5-，R5为烷基，优选地，R5的碳原子个数不大于3。酰胺基表示为-C(O)NR6-，R6为氢或烷基，当R6为烷基时，其碳原子个数不大于3。
优选的，化学探针选自以下任一种：
Figure 773543DEST_PATH_IMAGE002
，
Figure 518645DEST_PATH_IMAGE003
，
Figure 486601DEST_PATH_IMAGE004
，
Figure 317154DEST_PATH_IMAGE005
。
作为可选的实施方式，所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理的步骤中，所述孵育的时间为1小时以上，所述可见光为蓝光，所述光照处理的时间为5分钟以上。经实验证实，当化学探针选为3-氨基苯乙炔时，化学探针与稳定表达融合蛋白的细胞孵育1小时后，蓝光光照处理5min后即出现表示单线态氧生成的红色荧光。
优选的，所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理的步骤中，所述化学探针选为3-氨基苯乙炔，孵育的时间为1小时，光照波长为460nm，光照处理的时间为20-30分钟。
作为可选的实施方式，所述生物素标记叠氮化物包括：光可裂解生物素叠氮化物和/或生物素叠氮化物。叠氮化物用于提供叠氮基团而与蛋白复合体上的炔基标签发生点击化学反应，在叠氮化物上标记生物素分子，可在点击化学反应之后通过链霉亲和素与生物素结合而实现富集连接有化学探针标签的蛋白。
可以理解的是，光可裂解生物素叠氮化物主要是指生物素通过光可裂解基团连接叠氮化物而形成的一类生物素标记叠氮化物，其他形式的可裂解基团包括但不限于二硫键、Dde、Diazo、PC等。生物素叠氮化物主要是指生物素通过非光裂解基团连接叠氮化物而形成的一类生物素标记叠氮化物，例如：生物素-PEG3-叠氮化物。
作为可选的实施方式，所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理的步骤中，由光催化产生的单线态氧以邻近依赖性方式修饰邻近蛋白质的组氨酸残基。通过开放搜索策略，本发明所提供的光激活依赖性邻近标记方法中，单线态氧的修饰位点为蛋白上的组氨酸残基，其以邻近依赖性方式修饰邻近组氨酸残基。
作为可选的实施方式，所述第一体系为稳定表达所述融合蛋白的细胞。
优选的，所述点击化学反应试剂主要由生物素标记叠氮化物、CuSO4、BTTAA和抗坏血酸钠组成。采用该点击化学反应试剂，有助于在活细胞中发生点击化学反应。
优选的，所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理的步骤之后还包括：对经所述光照处理后的细胞进行裂解处理；
所述点击化学反应试剂主要由生物素标记叠氮化物、磷酸三氯乙酯、叔丁基三氯乙酰亚胺酯和CuSO4组成。
本发明实施例还提供了以上光激活依赖性邻近标记方法在制备用于研究蛋白-蛋白相互作用的试剂盒中的应用。
以上光激活依赖性邻近标记方法具有如下特征：1）光敏蛋白光催化产生单线态氧，实现催化标记，提高标记效率，实现在活细胞内对蛋白-蛋白相互作用进行捕获；2）单线态氧的理论扩散距离为70 nm，标记半径小，提高蛋白复合体鉴定的保证性；3）通过光照条件的触发，实现“时间分辨率”，通过光照时间的长短，调控标记半径，实现“空间分辨率”；4）避免使用内源性的辅因子（例如：生物素），同时避免使用双氧水等，对细胞环境产生的干扰较小。由此，以上方法能够较好地应用于研究蛋白-蛋白相互作用。
作为可选的实施方式，所述试剂盒至少包括：稳定表达所述融合蛋白的细胞，如通式（Ⅰ）所示化学结构的化学探针，以及点击化学反应试剂，
所述点击化学反应试剂主要由生物素标记叠氮化物、CuSO4、叔丁基三氯乙酰亚胺酯和磷酸三氯乙酯组成，或主要由生物素标记叠氮化物、CuSO4、BTTAA和抗坏血酸钠组成。
附图说明
图1为实施例1提供的一种关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记（PDPL）的方法的流程图；
图2为测试例中采用远红外染料Si-DMA对单线态氧的共聚焦成像的结果；
图3为测试例中对蛋白质组溶液进行荧光凝胶分析的结果；
图4为测试例中单线态氧的修饰位点的表征结果，左图为开放搜库显示的偏移分子量（Δm）对应的肽谱匹配数（PSMs）统计图，右图为二级串联质谱MS2；
图5为组氨酸经单线态氧修饰后形成2-氧代组氨酸后在本发明光激活依赖性邻近标记过程中的标记过程的推测机理图；
图6为实施例3线粒体、细胞核、内质网等细胞器蛋白质组的鉴定结果；
图7为实施例4的BRD4蛋白质复合体的鉴定结果；
图8为实施例5的E3连接酶作用底物的鉴定结果；
图9为实施例6中不同光敏蛋白对比的荧光凝胶分析结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供了一种关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记（PDPL）的方法，其流程如图1所示，具体包括以下步骤：
S11、制备表达miniSOG融合蛋白的稳转细胞株
采用Gibson试剂盒 (Beyotime, #D7010S)，在pLVX质粒上插入基因片段：BstBI-mito-V5-miniSOG-NheI，构建重组慢病毒质粒；
将HEK293T细胞以每孔2.0×105个细胞接种在6孔板中培养24小时至细胞汇合度达80%，然后，将重组慢病毒质粒（2.4 μg）和病毒包装质粒（1.5 μg psPAX2和1.2 μgpMD2.G）共同转染至该HEK293T细胞种，过夜转染后，更换培养基并再孵育 24 小时，在48h和72h后分别进行慢病毒收集。
将收集的慢病毒感染靶细胞系，用5 μg/mL的杀稻瘟菌素 (Solarbio, #3513-03-9) 筛选获得稳转细胞株。在感染靶细胞系之前，用0.8 μm过滤器（Merck，#millex-GP）过滤病毒培养基，并添加聚凝胺（Solarbio，#H8761）至浓度为8 μg/mL，24小时后，通过更换培养基使细胞恢复。
S12、对步骤S11筛选获得的稳转细胞株进行光催化处理
将步骤S11制备的能稳定表达miniSOG融合蛋白的细胞以约30%的密度接种在15厘米培养皿中，培养48小时至细胞融合度达80%后用PBS洗涤细胞一次，在37 ℃下将细胞与1mM具有氨基和炔基的化学探针在新鲜HBSS缓冲液中孵育1小时，然后在室温下用蓝色LED照射10分钟，此后，用PBS洗涤细胞两次；
其中，本实施例所选择的化学探针为3-氨基苯乙炔：
Figure 497600DEST_PATH_IMAGE006
。
S13、进行细胞裂解
将步骤S12洗涤后的细胞重新悬浮在冰冷的 PBS 缓冲液中，该缓冲液含有不含EDTA的蛋白酶抑制剂（MCE，#HY-K0011），进行细胞超声裂解1分钟（1秒开启和1秒关闭，幅度为35%）。将得到的混合物在4 ℃下以13000rpm 离心10分钟以去除碎片，并使用BCA蛋白质测定试剂盒（Beyotime, #P0009）将上清液的浓度调节至4 mg/mL，得到裂解物溶液。
S14、进行点击反应
室温下，将1mL上述裂解物溶液与第一点击反应试剂一起孵育自下而上旋转1 h，其中，该第一点击反应试剂包含：0.1 mM光可裂解生物素叠氮化物（Confluore，#BBBD-14）、1 mM 磷酸三氯乙酯（TCEP，Sangon，#A600974）、0.1 mM叔丁基三氯乙酰亚胺酯（TBTA，Aladdin，#T162437）配体和1 mM CuSO4。
S15、点击反应后，将混合物添加到混合溶液 (MeOH: CHCl3: H2O = 4 mL: 1 mL:3 mL)中，在室温下以4500 g离心10分钟后依次丢弃底层和上层溶液，取中层溶液在4℃下以13000 rpm离心5分钟后随后用1 mL甲醇洗涤沉淀两次，然后加入1 mL由25 mM 碳酸氢铵(ABC, Aladdin, #A110539)溶解形成的8 M 尿素 (Aladdin, #U111902) 溶液以溶解沉淀，之后在55℃下加入10 mM二硫苏糖醇（Sangon，#A100281，在25 mM ABC中）还原40分钟，然后在室温下在黑暗中加入15 mM新配制的碘乙酰胺（Sangon，#A600539）烷基化30分钟，随后添加额外的5 mM二硫苏糖醇以停止反应，获得蛋白质组溶液。
将经3次PBS洗涤后的100 μLNeutrAvidin琼脂糖树脂珠（Thermo，#29202）与上述蛋白质组溶液在室温下孵育4 h。下一步，用含有0.2% SDS (Sangon, #A600485) 的5 mLPBS洗涤珠子3次，用含有1 M尿素的5 mL PBS洗涤3次，用5 mL ddH2O洗涤3次。下一步，通过离心收集树脂珠并重新悬浮在含有1 M尿素、1 mM CaCl2（Macklin, #C805228）和20 ng/μL胰蛋白酶（Promega, #V5280）的200 μL 25 mM ABC中，在37℃下搅拌过夜，随后加入甲酸(Thermo，#A117-50)，直到溶液pH值为2-3，反应停止。之后，用含有0.2% SDS的1 ml PBS洗涤珠子3次，用含有1 M尿素的1 ml PBS洗涤3次，然后用1 ml蒸馏水洗涤3 次。
在200 μL 70% MeOH中通过光 (365 nm) 裂解90分钟释放修饰肽，离心收集上清液。然后，将树脂珠用100 μL 70% MeOH洗涤一次，并合并上清液。将上清液真空浓缩干燥并储存在-20℃，备用。
测试例
1、参照实施例1步骤S12对细胞株进行光催化处理的方法，考察不同光照时间下单线态产生的情况，采用远红外染料Si-DMA对单线态氧的共聚焦成像。
检测结果如图2所示，在叠氮化钠存在的情况下，红色荧光标记消失，而叠氮化钠可以淬灭单线态氧，这证实了单线态氧的存在。此外，蓝光照射5min后即出现红色荧光，蓝光照射20-30min后出现明显的红色荧光，表明蓝光光照处理时间长短影响着单线态氧的形成量。
2、参照实施例1的步骤S12至步骤S14的方法，考察以下探针（1）至探针（4）等4种化学探针对点击化学反应活性的影响，与实施例1不同的是，此处点击化学反应加入荧光基团四甲基罗丹明（TAMRA）而非生物素分子，取不同化学探针反应下的蛋白质组溶液进行荧光凝胶分析，图3为检测结果，附图中，293T对应于不表达miniSOG融合蛋白的细胞，293T-miniSOG-mito对应于表达miniSOG融合蛋白且靶向线粒体的细胞，460nm光照对应于蓝光照射，+表示含该因素，-表示不含该因素，无光照表示不进行蓝光照射，无探针 表示没有加入探针与细胞进行孵育，所有条件表示方法涉及蓝光照射、化学探针和miniSOG等影响单线态氧形成的所有因素；同时，柱状图中，每一组从左到右的顺序依次为293T组、无光照组、miniSOG组；
Figure 612055DEST_PATH_IMAGE002
（1）、
Figure 750913DEST_PATH_IMAGE007
（2）、
Figure 68761DEST_PATH_IMAGE003
（3）、
Figure 52898DEST_PATH_IMAGE008
（4）
如图3的左图所示，探针（1）至探针（4）均出现了不同程度的荧光信号，探针（3）的信号最为显著，然后是探针（1），探针（4）的信号微弱接近于无，因此，本发明实施例的方法优先选用探针（3）。
图3的右图采用探针（3）进一步考察了蓝光照射、化学探针和miniSOG等因素的缺失对单线态氧形成的影响，如图所示，蓝光照射、化学探针和miniSOG等三因素对单线态氧形成而言，缺一不可。通过凝胶电泳条带灰度值定量分析，如图3的柱状图所示，探针（3）的信噪比可以达到8倍以上。
3、表征单线态氧的修饰位点
将实施例1步骤S15最终制备的样品重新溶解在0.1%甲酸中，并用配备有nano-ESI源的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪进行分析，质谱仪连接EASY-nLC 1200 UHPLC系统（Thermo），色谱柱为内部填充3 μm C18材料的75 μm×15 cm毛细管柱，液相条件为：95分钟内从8%溶剂B线性增加到50%溶剂B（A=0.1%甲酸水溶液，B=0.1% 甲酸的80%乙腈溶液）来梯度色谱分离肽段，然后再以300 nL/min的流速线性增加至 98% B。喷雾电压设定为2.1kV，毛细管温度为320℃。以120000分辨率、4×105的AGC和150 ms的最大进样时间进行一级质谱分析 (350-2000 m/z)。每次全扫描中丰度最高的10个多电荷肽段前体被HCD碎片化，归一化碰撞能量为30%，四极杆隔离窗口为1.6 m/z，分辨率设置为30000。使用5×104串联质谱的AGC目标和150 ms最大进样时间，进行二级质谱分析。动态排除时间设置为30秒。
使用基于MSFragger的FragPipe计算平台处理原始数据。使用具有前体质量公差-150到500道尔顿（Da）的开放搜索策略来确定偏移分子量和相应的氨基酸。然后，质量为+229.0964和+247.1069 Da的组氨酸修饰被应用于ProteomeDiscovery搜库中的动态修饰来进行定量。
检测结果如图4，左图为检测到的偏移分子量及其对应的PSMs（肽段与谱图匹配），图中列出超过50个肽谱匹配对应的修饰，发现所有的修饰均发生在组氨酸上。右图为二级串联质谱MS2，其反应机理如图5所示，组氨酸经单线态氧修饰后形成2-氧代组氨酸，探针（3）完成加成反应后，发生第二次氧化过程，得到分子量+229 Da和+247 Da的产物，其中+247 Da是+229 Da的水解产物。
实施例2
本实施例提供了一种关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记（PDPL）的方法，具体包括以下步骤：
S21、取实施例1步骤S11制备的能稳定表达miniSOG融合蛋白的细胞；
S22、对用于培养细胞的12孔板 (Ibidi, #81201)进行预处理：用50 μg/ml纤连蛋白（Corning，#356008，稀释于PBS）在37 ℃下预处理1小时，然后用PBS洗涤除去纤连蛋白；
将细胞以每孔约20000个细胞的密度接种在以上经预处理的12孔板中，培养24小时后用PBS洗涤一次，加入1 mM第一化学探针，在新鲜的Hanks平衡盐溶液（HBSS，Gibco，#14025092）中37℃下孵育1小时，此后，在室温下用蓝色LED（460 nm）照射10分钟后，用PBS洗涤细胞两次，并在室温下PBS中用4%甲醛（Sangon，#E672002）固定15分钟，采用PBS洗涤3次去除甲醛，加入0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) 使细胞通透化处理，然后再PBS洗涤3次；
S23、进行点击反应
将经过光催化处理的细胞与点击反应试剂混合形成25 μL的体系，在室温下孵育30分钟；反应结束后，加入含有0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) 的PBST缓冲液洗涤细胞六次，然后在室温下加入5% BSA (Abcone, #B24726) 的PBST缓冲液封闭30分钟，收集经点击反应处理后的细胞。
其中，点击反应试剂为： 50 μMCy3-叠氮化物（Aladdin, #C196720）、2 mM CuSO4（Sangon，#A603008）、1 mM BTTAA（Confluore，#BDJ -4)和0.5 mg/ml抗坏血酸钠(Aladdin, #S105024)。
S24、将上述荧光标记的细胞与其他细胞器标志物抗体等进行免疫染色，并进行激光共聚焦成像分析。
实施例3
将miniSOG定位到细胞核、线粒体以及内质网，鉴定细胞器蛋白质组。结果如图6所示，PDPL方法可以鉴定1364,461和911种蛋白，经过与不同细胞器的蛋白质组数据库进行比对，准确度可以达到73.4%，78.5%和73.0%。将PDPL方法和广泛采用的TurboID方法进行比较，发现PDPL方法有更好的特异性和更深的蛋白质组覆盖度。
实施例4
以BRD4蛋白复合体为例，将PDPL方法应用于蛋白质复合体的鉴定。结果如图7所示，除了发现多种已知的BRD4结合蛋白以外（MED1，CHD8，BICRA，NIPBL，SMC1A，HMGB1），我们还验证了其他未知的蛋白，例如SFPQ，Fus，NSUN2，mSin3A等。利用String数据库进行分析，表明BRD4与HDAC相互作用的复合体，Sin3A，NCOR2，BCOR以及SAP130存在相互作用，这与BRD4和HDAC结合乙酰化的组蛋白这一特性相符合，表明此方法的准确性。
实施例5
由于PDPL方法可以通过调节光照时间调控标记半径，因此PDPL非常适合鉴定分子量较大的蛋白复合体中的间接作用蛋白，例如通过形成巨大蛋白复合体的E3连接酶的作用底物。我们以与帕金森综合征相关的Parkin酶为例，鉴定了Parkin的相互作用蛋白。为了进一步发现Parkin的作用底物，我们首先构建蛋白质组鉴定的未知互作蛋白的质粒，并将其转染至稳定表达Parkin的HEK293T细胞以及常规的HEK293T细胞，通过对比稳定表达Parkin以及对照细胞中对未知蛋白的降解程度，确定了两种新的Parkin底物Ssu72和SNW1，结果如图8所示。
实施例6
本实施例参照实施例1的方法以及使用荧光电泳分析考察了其他类型光敏蛋白的效果，本实施例的方法与实施例1的区别主要在于：
（1）光敏蛋白选为单线态氧光敏蛋白（singlet oxygen proteinphotosensitiser，SOPP）系列作为备选，按照实施例1的步骤11的方法制备表达SOPP融合蛋白的稳转细胞株；设置3个试验组，各试验组分别标记为SOPP-H2B、SOPP2-H2B、SOPP3-H2B；作为对比的为实施例1制得的表达miniSOG融合蛋白的稳转细胞株，标记为miniSOG-H2B；阴性对照（293T）的为不表达融合蛋白的细胞；
（2）对各细胞进行光催化处理的步骤中，在460m下光照20min。
图9为不同光敏蛋白组的荧光凝胶分析结果，SOPP-H2B组、SOPP2-H2B组、SOPP3-H2B组和miniSOG组均出现了荧光信号，表明SOPP可作为光敏蛋白应用于本发明实施例所提供的方法中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种关于蛋白质的光激活依赖性邻近标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
将目标蛋白与光敏蛋白进行融合表达，获得含有融合蛋白的第一体系；
提供含氨基和炔基的化学探针，所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理，获得第二体系；
提供含生物素标记叠氮化物的点击化学反应试剂，将所述第二体系与所述点击化学反应试剂混合并进行点击化学反应，然后进行蛋白质组学分析，获得与所述目标蛋白相互作用的邻近蛋白信息。
2.根据权利要求1所述的光激活依赖性邻近标记方法，其特征在于，所述光敏蛋白包括：miniSOG、单线态氧光敏蛋白SOPP系列中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的光激活依赖性邻近标记方法，其特征在于，所述化学探针具有如通式（Ⅰ）所示的化学结构：
Figure 868317DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）
n为0-10之间的整数，R1包括烷基、胺基酰基、酰基、酯基和酰胺基中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的光激活依赖性邻近标记方法，其特征在于，所述化学探针选自以下任一种：
Figure 742732DEST_PATH_IMAGE002
，
Figure 244121DEST_PATH_IMAGE003
，
Figure 520381DEST_PATH_IMAGE004
，
Figure 691599DEST_PATH_IMAGE005
。
5.根据权利要求1所述的光激活依赖性邻近标记方法，其特征在于，所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理的步骤中，所述孵育的时间为1小时以上，所述可见光为蓝光，所述光照处理的时间为5分钟以上；和/或
所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理的步骤中，由光催化产生的单线态氧以邻近依赖性方式修饰邻近蛋白质的组氨酸残基。
6.根据权利要求1至5任一项所述的光激活依赖性邻近标记方法，其特征在于，所述第一体系为稳定表达所述融合蛋白的细胞。
7.根据权利要求6所述的光激活依赖性邻近标记方法，其特征在于，所述点击化学反应试剂主要由生物素标记叠氮化物、CuSO4、BTTAA和抗坏血酸钠组成。
8.根据权利要求6所述的光激活依赖性邻近标记方法，其特征在于，所述第一体系与所述化学探针混合孵育预设时间后采用可见光进行光照处理的步骤之后还包括：对经所述光照处理后的细胞进行裂解处理；
所述点击化学反应试剂主要由生物素标记叠氮化物、磷酸三氯乙酯、叔丁基三氯乙酰亚胺酯和CuSO4组成。
9.权利要求1至8任一项所述的光激活依赖性邻近标记方法在制备用于研究蛋白-蛋白相互作用的试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述试剂盒至少包括：稳定表达所述融合蛋白的细胞，如通式（Ⅰ）所示化学结构的化学探针，以及点击化学反应试剂，
所述点击化学反应试剂主要由生物素标记叠氮化物、CuSO4、叔丁基三氯乙酰亚胺酯和磷酸三氯乙酯组成，或主要由生物素标记叠氮化物、CuSO4、BTTAA和抗坏血酸钠组成。
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