CN112824878A - 目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用。其中，锚定方法包括通过对目标生物分子进行标记，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中。通过采用对目标生物分子进行标记的方式使其带上氨基基团和信号标记，既能使具有氨基基团的目标生物分子带上标记信号，也能使不具有氨基基团的目标生物分子，比如脂质或糖类，进行标记的同时带上氨基基团，进而使得该目标生物分子通过氨基基团采用现有的锚定方法锚定到凝胶中，从而实现了任何类型的生物分子的凝胶锚定，进而便于实现后续的膨胀显微成像。

Description

目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物体标记领域，具体而言，涉及一种目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用。
背景技术
ExM技术于2015年由Edward S.Boyden组所开发。具体实现过程为，利用丙烯酸钠与共聚剂丙烯酰胺以及交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺穿透到生物样品内部，并在其中进行自由基聚合。经过适度的蛋白酶酶切或者高温变形，从而使得样品力学均一化，带有大量羧酸根基团的聚电解质凝胶在吸水后因电性相斥发生膨胀，使得锚定在凝胶中的生物分子得以各向同性地膨胀(如图1所示)。
在ExM技术中，如何将生物分子锚定到凝胶中至关重要。目前主要有下列方法：(1)合成三功能的DNA链或者化学小分子，分别带有锚定基团、报告基团以及识别基团；(2)利用丙烯酰胺活性酯与生物分子上的氨基残基反应，实现对生物分子上修饰上丙烯酰胺；(3)利用戊二醛通过对生物分子上的氨基进行交联，与聚合物凝胶形成互穿聚合物网络，游离的醛基也可以与在聚合过程中与凝胶中的游离氨基偶联，从而达到生物分子锚定到凝胶中的目的。上述方法可以使得荧光信号在膨胀后得以保留。目前在传统的荧光显微镜如共聚焦或宽场荧光显微镜下，膨胀四倍的ExM技术使得分辨率提升到70-80nm。而且膨胀对样品中荧光分子的相对位置信息扰动较小，可以应用到细胞以及组织中的超分辨成像。
目前ExM技术被逐渐应用于细胞或者组织样品中蛋白质、RNA等生物分子的成像，解决了许多之前只能用昂贵、费时的超分辨显微镜才有可能去研究的生物问题。ExM与其他成像技术的结合同样方兴未艾，如与SIM、STED、STORM等超分辨成像技术等结合，使分辨率得到进一步提升。应用导向型工作也呈现出爆发式增长，诸多课题组证明了ExM可以被应用到各种体系中，如小鼠、涡虫、果蝇、斑马鱼、细菌，甚至被应用到DNA折纸术、蛋白晶体中。
尽管前人开发的ExFISH方法中利用鸟嘌呤烷基化试剂使得RNA连接上丙烯酰基，实现了对RNA的成像，但是难以实现具有DNA、RNA分子特异性的ExM标记、锚定以及成像。因此ExM技术中的另一大挑战是如何实现非蛋白分子的超分辨成像，如对脂质、糖类、核酸分子、小分子药物、代谢物以及化学探针进行ExM标记以及成像。
同时由于目前锚定生物分子到凝胶中的方式主要利用基于氨基的化学连接，但是像糖类、脂质、小分子药物、代谢物以及化学探针等分子本身不具有氨基基团，因此难以被锚定到凝胶中。除此之外，糖类以及脂质等非蛋白质生物分子无法利用遗传编码方式进行标记，同时也缺乏广谱性免疫荧光手段，该类型生物分子在ExM技术中的标记难题也需要解决，因此目前的ExM技术无法对该类型分子进行标记以及成像。
此外在ExM成像过程中，由于样品体积增大数十倍，荧光分子浓度被大幅稀释，自由基聚合过程中也会造成部分荧光染料结构被破坏。这两个因素都会造成ExM成像中荧光信号弱、信噪比低等缺点，因此ExM技术也亟需信号放大的方法。
当前ExM技术主要集中在利用荧光蛋白或者免疫荧光等蛋白质水平的成像，但是如何实现具有时间分辨能力的针对蛋白质在合成以及降解过程中的ExM标记以及成像方法目前也还没有有效的方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用，以解决现有技术中尚未有合适的方法能够利用ExM对某些生物分子(比如某些脂质、糖类等)进行荧光标记以及超分辨成像的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种目标生物分子的锚定方法，锚定方法包括：通过对目标生物分子进行标记，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中。
进一步地，通过生物正交反应对目标生物分子进行标记使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；优选地，采用带有生物正交基团的代谢类似物或经过生物正交基团修饰的有机化学分子与带有互补生物正交基团的第一标记分子，通过生物正交基团之间进行生物正交反应，使目标生物分子带上第一标记分子；利用带有氨基基团和信号标记的第二标记分子特异性结合第一标记分子，从而使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；更优选地，生物正交基团为叠氮或端炔基；第一标记分子为生物素、地高辛、FLAG或二硝基苯；相应地，带有氨基基团和信号标记的第二标记分子为带有信号标记的链霉亲和素、地高辛抗体、FLAG抗体或二硝基苯抗体。
进一步地，通过带有氨基基团的第三标记分子标记目标生物分子，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记，优选地，目标生物分子为脂质或核酸或糖类，相应地，第三标记分子为脂溶性染料、核酸染料或荧光标记的适配体、或者带荧光标记的凝集素。
进一步地，通过带有氨基基团的第四标记分子标记目标生物分子，使目标生物分子带上氨基基团和第四标记分子；将带有信号标记的第五标记分子与第四标记分子进行特异性结合，从而使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；优选地，第四标记分子为一抗，相应地，第五标记分子为荧光标记的二抗。
进一步地，采用邻近标记的方法使目标生物分子修饰上生物素，并利用带有氨基基团和荧光标记的生物素结合物与生物素结合，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记，其中，生物素结合物为生物素亲和素或生物素抗体；优选地，邻近标记的方法为APEX，BirA或TurboID；优选地，生物素亲和素为链霉亲和素。
进一步地，利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中包括：通过丙烯酰胺活性酯或者戊二醛与氨基基团进行反应的方式，将目标生物分子锚定到凝胶中。
进一步地，在使目标生物分子带上氨基基团和信号标记之后，以及利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中之前，锚定方法还包括对信号标记进行放大的步骤。
进一步地，采用生物素三聚体连接两个链霉亲和素，并通过逐轮生物素-链霉亲和素相互作用的迭代染色锚定方法来实现对信号标记进行放大；或者通过isHCR的锚定方法实现对信号标记进行放大。
进一步地，经过生物正交基团修饰的有机化学分子为小分子药物或化学探针，小分子药物或化学探针修饰有生物正交基团和靶向基团，靶向基团选自细胞器靶向基团、细胞骨架靶向基团或细胞膜靶向基团。
进一步地，经过生物正交基团修饰的有机化学分子通过化学交联或光交联的方式实现与周围分子的共价交联；优选地，化学交联包括采用氯代乙酰基进行交联。
进一步地，目标生物分子选自脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种膨胀显微成像方法，其特征在于，成像方法包括：利用上述任一种锚定方法将目标生物分子锚定到凝胶中；使凝胶吸水膨胀并利用信号标记对膨胀后的目标生物分子进行成像。
进一步地，成像为共聚焦显微成像或超分辨率显微成像，优选地，超分辨率显微成像为SIM成像、STED成像、STORM成像或者DNA-PAINT成像。
根据本发明的另一方面，提供了上述任一种锚定方法和/或上述任一种成像方法在目标生物分子的生物学相关研究中的应用。
进一步地，目标生物分子为脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种；优选地，生物学相关研究包括结构和/或功能研究。
应用本发明的技术方案，通过采用对目标生物分子进行标记的方式使其带上氨基基团和信号标记，既能使具有氨基基团的目标生物分子带上标记信号，也能使不具有氨基基团的目标生物分子，比如脂质或糖类，进行标记的同时带上氨基基团，进而使得该目标生物分子通过氨基基团采用现有的锚定方法锚定到凝胶中，从而实现了任何类型的生物分子的凝胶锚定，进而便于实现后续的膨胀显微成像。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了现有技术中ExM方法的流程示意图；以及
图2示出了根据本发明的Click-ExM方法的流程示意图；
图3中的a至e示出了本发明的实施例1中的检测结果图。
图3中的a示出了现有的ExM方法无法保留脂质分子的示意图。
图3中的b示出了图3中的a至e中所使用的炔基-胆碱,炔基-棕榈酸，炔基-法尼醇以及DiI化学结构式。
图3中的c示出了对原代神经细胞代谢标记炔基-胆碱，进行ExM成像，发现膨胀之后脂质基本无保留。
图3中的d示出了对HeLa细胞代谢标记炔基-棕榈酸以及炔基-法尼醇，进行ExM成像，发现膨胀之后脂质基本无保留。
图3中的e示出了对CHO细胞利用DiI染料对细胞膜染色，进行ExM成像，发现膨胀之后脂质基本无保留。
图4中的a至f示出了本发明的实施例2中的检测结果图。
图4中的a示出了链霉亲和素的晶体结构。
图4中的b示出了MALDI质谱证明一分子链霉亲和素可以与约14个丙烯酰胺活性酯(AcX)反应。
图4中的c示出了链霉亲和素-生物素复合体可以抵御蛋白酶k的酶切。
图4中的d示出了对HeLa细胞代谢标记炔基-胆碱，分别click标记上有机染料TAMRA或者Alexa Fluor 555标记的链霉亲和素，后固定之后，利用甲醇、Triton-X100、乙醇/10％甲酰胺、10％SDS进行处理，发现Alexa Fluor 555标记的链霉亲和素标记的脂质依旧得以保留。
图4中的e示出了对图4中的d中的荧光强度进行定量比较。
图4中的f示出了在COS-7细胞中代谢标记炔基-胆碱，click标记上Alexa Fluor555标记的链霉亲和素，利用三种ExM方法中的丙烯酰胺活性酯(AcX、MA-NHS)以及戊二醛交联的方式都能够实现对脂质的click-ExM成像。
图5中的a至g示出了本发明的实施例3中的检测结果图。
图5中的a示出了化学合成生物素三聚体。
图5中的b示出了以微管蛋白的免疫荧光为例，分别对微管蛋白进行传统的基于荧光二抗的免疫荧光、基于生物素偶联二抗的免疫荧光以及利用生物素三聚体的一轮、二轮、四轮信号放大。
图5中的c示出了对图5中的b中的荧光强度进行定量比较。
图5中的d示出了四轮信号放大之后的微管蛋白免疫荧光图。
图5中的e示出了对图5中的d中方框部分单根微管蛋白的横截面荧光强度曲线分布。
图5中的f示出了基于传统荧光二抗免疫荧光以及四轮信号放大之后的微管蛋白分辨率比较。
图5中的g示出了click-ExM利用链霉亲和素与isHCR信号放大示意图。
图6中的a至j示出了本发明的实施例4中的检测结果图。
图6中的a示出炔基-胆碱化学结构式。
图6中的b示出了对COS-7细胞代谢标记炔基-胆碱之后的click-ExM成像图，脂质标记信号可以与线粒体的标志物如mito-GFP以及TOM20免疫荧光共定位。
图6中的c示出了图6中的b中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。
图6中的d示出了对COS-7细胞代谢标记炔基-胆碱之后的click-ExM成像图，脂质标记信号可以与内质网的标志物KDEL-GFP共定位。
图6中的e示出了图6中的d中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。
图6中的f示出了对COS-7细胞代谢标记炔基-胆碱之后的click-ExM成像图，脂质标记信号可以与高尔基体的标志物B4GALT1-GFP共定位。
图6中的g示出了图6中的f中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。
图6中的h示出了对原代心肌细胞代谢标记炔基-胆碱之后的click-ExM三维成像图。
图6中的i示出了图6中的h中成像光学截面以及视野放大成像图。
图6中的j示出了图6中的i中直线横截面部分的荧光强度分布曲线。
图7中的a至n示出了根据本发明的实施例5中的检测结果图。
图7中的a示出GalNAz,SiaNAz以及ManNAz化学结构式。
图7中的b示出了对HeLa细胞代谢标记GalNAz的click-ExM前后以及结构光照明显微镜(SIM)成像图。
图7中的c示出了GalNAz标记与RL2抗体免疫荧光共定位图。
图7中的d示出了图7中的c中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。
图7中的e示出了GalNAz标记在细胞核膜上分布的click-ExM成像图。
图7中的f示出了图7中的e中方框部分直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。
图7中的g示出了图7中的e中GalNAz标记的核孔复合物粒径分析统计直方图。
图7中的h示出了对HeLa细胞代谢标记SiaNAz之后的click-ExM成像图。
图7中的i示出了对原代海马区神经元细胞代谢标记ManNAz的click-ExM前后成像图。
图7中的j示出了图7中的i中膨胀前成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。
图7中的k示出了图7中的i中膨胀后成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。
图7中的l示出了对原代心肌细胞代谢标记ManNAz的click-ExM成像图。
图7中的m示出了图7中的l中膨胀前成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。
图7中的n示出了图7中的l中膨胀后成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。
图8中的a至h示出了本发明的实施例6中的检测结果图。
图8中的a示出了AHA,EdU,EU,叠氮-阿法替尼,TPP-AC,Op-puro,叠氮-DSPE的化学结构式。
图8中的b示出了对原代海马神经细胞代谢标记AHA 2h后与神经元标志物MAP2免疫荧光的click-ExM前后成像图。
图8中的c示出了EdU标记的U2OS细胞click-ExM前后成像图。
图8中的d示出了EU标记的HeLa细胞click-ExM前后成像图。
图8中的e示出了炔基-胆碱处理2h以及12h后的HeLa细胞的click-ExM前后成像图。
图8中的f示出了Op-puro标记的HeLa细胞的click-ExM前后成像图。
图8中的g示出了TPP-AC标记的COS-7细胞的click-ExM前后成像图。
图8中的h示出了炔基-胆碱标记的HeLa细胞的click-ExM前后成像图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
生物正交反应：本文中统称为click反应。指那些能够在活体细胞或组织中，能够在不干扰生物自身生化反应条件下，可以进行的化学反应，如叠氮-端炔环加成反应。用于标记核酸、蛋白质、糖类或脂质等生物大分子。首先需要将可参与特异反应的功能基团引入目标分子，然后与带有互补反应基团的标记物进行生物正交反应，最后利用不同标记物特征区检测目标分子的定位、结构或功能。能够发生生物正交反应的这两个反应基团之间具有高度的反应活性，同时在生理环境下对周围其他的反应基团是惰性的。最广泛的生物正交反应是一价铜离子催化的叠氮和末端炔基之间的环加成反应，也是“点击化学(clickchemistry)”。
Expansion microscopy：膨胀显微术，本文中统称为ExM方法。该方法利用聚电解质凝胶吸水膨胀的特性，拉开包埋在凝胶中相临近的生物分子或者标记的荧光分子之间的物理距离，从而可以绕过光学衍射极限，在普通宽场或者共聚焦荧光显微镜下即可实现超分辨成像，ExM的分辨率取决于膨胀系数及所使用的显微镜。
APEX：一种通过过氧化物酶APEX2对RNA进行直接邻近标记的方法。来源于大豆的AEX2能够催化活性位点几纳米内的生物素标记，以往经常与甲醛交联结合使用，对细胞内的各种细胞器进行定位。该方法适用于各种亚细胞区域，能够分析无法纯化的结构，比如核纤层和线粒体外膜(具体参见Atlas of Subcellular RNA localization Revealed byAPEX-seq，Cell,2019-06-20)。近年来以APEX和BioID为代表的蛋白质邻近标记技术逐渐被应用于蛋白质相互作用研究。
邻近标记(Proximity labeling,PL)的原理是将一个具有邻近标记功能的酶与目标蛋白融合，通过酶催化的共价修饰将邻近的蛋白标记上生物素，最后通过亲和素磁珠富集生物素标记蛋白进行质谱鉴定。邻近标记技术不依赖于目标蛋白本身的性质及蛋白质相互作用的强度，能够捕获传统的亲和纯化-质谱技术(AP-MS)无法鉴定的蛋白质相互作用。
2018年，斯坦福大学的Alice Y Ting课题组利用基于酵母表面展示的定向进化技术对BioID使用的生物素连接酶进行了升级改造，产生了TurboID和miniTurbo两种新的连接酶，其催化活性得到极大提升，标记时间从18hrs缩短至10min。
Bir A：生物素连接酶，用于催化生物素化反应，将生物素连接到特定的蛋白上。常见类型包括大肠杆菌中的BirA。BirA受体-多肽系统在生物素化多肽底物时，具有超高的特异性。BirA可以识别一段多肽序列(生物素受体标签BAT)。当融合BAT的蛋白和BirA共表达时，BAT序列可以被isHCR有效生物素化。被生物素化的蛋白质可以通过与之有高亲和力的抗生物素蛋白或链霉亲和素进行一步纯化或标记。BirA催化的生物素化过程一般包含两个步骤：1)将生物素和ATP反应生成biotinoyl-5’-AMP，此过程将活化的生物素别固定在BirA的活性位点上；2)将活化的生物素通过反应偶联到BAT序列的特定赖氨酸残基上。
isHCR：immunosignal hybridization chaim reaction，HCR杂交链式反应。
SIM：全称是Structured Illumination Microscopy，结构光照明显微。
STED：STED和SIM均是形成一个结构性的光调制来实现超分辨，不依赖于特定的荧光染料。而STORM则是通过特定染料的性质，通过光控制来实现ON-OFF。
STORM：全称是Stochastic Optical Reconstruction Microscopy。
DNA-PAINT：用一个DNA锚定链与目标分子相连，一个带染色标签的DNA成像链携带锚定链互补序列，成像链与锚定链瞬时接触，就会产生一个荧光信号。并非持久的发光形式，这种闪烁型荧光信号，能以更高的分辨率区分纳米级的分子间距离。它可以与一般细胞生物学实验都有、但分辨率较低的共聚焦显微镜配套使用，实现细胞内各种分子，如蛋白质、RNAs和DNA的超分辨率观察。利用这种方法，研究人员可以清晰地观察到细胞核内独立的生物分子，包括DNA序列、蛋白质-DNA复合物、核RNAs以及围绕细胞核的核膜。
如背景技术所提到的，目前锚定生物分子到凝胶中的方式主要利用了基于氨基的化学连接，但是像糖类、脂质、小分子药物、代谢物以及化学探针等分子本身不具有氨基基团，因此难以被锚定到凝胶中。另外，多糖以及脂质分子无法利用遗传编码方式进行标记，缺乏广谱性免疫荧光手段，该类型生物分子在ExM方法中的标记难题也需要解决，因此目前的ExM方法无法对该类型分子进行标记以及成像。
为解决上述问题，本申请开发了点击-膨胀显微方法(click-expansionmicroscopy方法，下文中简称click-ExM方法)，该方法的原理是：将生物正交反应标记方法与生物素-链霉亲和素相互作用(包括但不限于)相结合，实现了ExM方法对糖类、脂质、新生成蛋白质、小分子药物、代谢物以及化学探针等分子进行标记以及成像。以炔基探针为例，该方法的流程如图2所示。
Click-ExM方法具体流程如下：对细胞代谢标记带有生物正交基团的代谢类似物，通过click反应偶联上生物素，随后进行荧光分子标记的链霉亲和素染色，若需要进行信号放大，即可在此步进行生物素三聚体以及荧光分子标记的链霉亲和素的迭代染色，或者isHCR信号放大，接下来即可进行前人的ExM流程，如利用丙烯酰胺活性酯或者戊二醛交联方式锚定生物分子，自由基聚合合成凝胶，蛋白酶酶切进行力学均一化，凝胶吸水膨胀，荧光成像。
Click-ExM方法从标记生物分子、锚定生物分子以及信号放大三个方面入手：
(1)荧光标记方面，Click-ExM方法采用基于生物正交反应如铜(I)催化的叠氮-端炔环加成反应(click反应)，对生物分子进行标记。具体来说，可以通过代谢标记的手段，喂给细胞带有叠氮、炔基等生物正交基团的代谢类似物，细胞通过自身代谢通路利用该种代谢类似物，从而合成的生物分子上便被标记上了生物正交基团。对于小分子化学探针的标记，我们可以对小分子化学探针修饰上生物正交基团，随后即可对细胞特定结构进行标记。接下来通过click反应，我们可以对生物分子标记上带有荧光分子的基团，如带有氨基的蛋白、多肽或者有机化学小分子，包括但不限于链霉亲和素、地高辛、FLAG、二硝基苯等。
(2)锚定生物分子方面，Click-ExM方法的思路是将无氨基的生物分子通过(1)中click反应转变为带有氨基的基团，如蛋白、多肽或者有机化学小分子，包括但不限于链霉亲和素、地高辛、FLAG、二硝基苯等。随后通过丙烯酰胺活性酯或者戊二醛交联的方式，实现对生物分子锚定到凝胶中的目的。
(3)信号放大方面，由于链霉亲和素可以结合化学计量比四倍的生物素，因此我们设计并合成了生物素三聚体用来连接两个链霉亲和素，因此通过逐轮生物素-链霉亲和素相互作用的迭代染色实验，即可实现荧光信号在目标生物分子上的信号累积放大，提高ExM方法的信噪比。另外，click-ExM还可以与已发表的isHCR信号放大技术相结合，实现高扩增倍数的信号放大。
具体地，本申请利用之前的ExM方法，发现并验证了脂质等生物分子无法被当前ExM方法成像。通过质谱、蛋白质凝胶电泳、荧光成像等方式证明了基于链霉亲和素的Click-ExM方法能够被用来实现脂质等生物分子的锚定。通过对微管蛋白免疫荧光的实验证明可以实现基于链霉亲和素以及生物素三聚体迭代相互作用实现信号放大。随后，通过荧光成像等方式证明了本申请改进的click-ExM确实能够实现对脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸分子包括DNA、RNA、小分子药物、代谢物以及化学探针的荧光标记以及超分辨成像。
潜在的可替代方案为将识别非蛋白分子的荧光探针锚定在凝胶中，有以下方式：第一种方式是采用带有氨基的脂溶性染料、凝集素、抗体、核酸染料、适配体等分别来标记脂质、糖类、核酸，随后氨基可以与丙烯酰胺活性酯进行反应，从而使其锚定在凝胶中，实现后续的膨胀成像。另一种方式是有机合成三功能小分子，其带有生物正交基团，荧光报告基团以及锚定基团，也可实现该目的，但是这种方法依赖于对现有探针分子的改造，不具有普适性，工程量巨大。
基于上述研究，申请人提出了本申请的技术方案。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种膨胀显微成像方法，该方法包括：通过对目标生物分子进行标记，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中；使凝胶吸水膨胀并利用信号标记对膨胀后的目标生物分子进行成像。
本申请的上述锚定方法，通过采用对目标生物分子进行标记的方式使其带上氨基基团和信号标记，既能使具有氨基基团的目标生物分子带上标记信号，也能使不具有氨基基团的目标生物分子，比如脂质或糖类，进行标记的同时带上氨基基团，进而使得该目标生物分子通过氨基基团采用现有的锚定方法锚定到凝胶中，从而实现了任何类型的生物分子的凝胶锚定，进而便于实现后续的膨胀显微成像。
上述对目标生物分子进行标记，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记的方法有多种，根据具体目标生物分子的不同，可以采用不同的方式进行标记。
在一种优选的实施例中，通过生物正交反应对目标生物分子进行标记使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；优选地，采用带有生物正交基团的代谢类似物或经过生物正交基团修饰的有机化学分子(包括小分子药物及化学探针)与带有互补生物正交基团的第一标记分子，通过生物正交反应，使目标生物分子带上第一标记分子；利用带有氨基基团和信号标记的第二标记分子特异性结合第一标记分子，从而使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；更优选地，第一生物正交基团为叠氮或端炔基；第一标记分子为生物素、地高辛、FLAG或二硝基苯；相应地，带有氨基基团和信号标记的第二标记分子为带有信号标记的链霉亲和素、地高辛抗体、FLAG抗体或二硝基苯抗体。
在一种优选的实施例中，通过带有氨基基团的第三标记分子标记目标生物分子，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记，优选地，目标生物分子为脂质、核酸或糖类，相应地，第三标记分子为脂溶性染料、核酸染料或荧光标记的适配体、荧光标记的凝集素。
在一种优选的实施例中，通过带有氨基基团的第四标记分子标记目标生物分子，使目标生物分子带上氨基基团和第四标记分子；将带有信号标记的第五标记分子与第四标记分子进行特异性结合，从而使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；优选地，第四标记分子为一抗，相应地，第五标记分子为凝集素抗体或二抗。
在一种优选的实施例中，采用邻近标记的方法使目标生物分子修饰上生物素，并利用带有氨基基团和荧光标记的生物素结合物与生物素结合，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记，其中，生物素结合物为生物素亲和素或生物素抗体；优选地，邻近标记的方法为APEX，BirA或TurboID；优选地，生物素亲和素为链霉亲和素。
上述四种不同的标记方法，可以根据目标生物分子的不同进行合理选择。根据目标生物分子的类别是糖类、脂质、核酸还是蛋白，设计不同的带生物正交基团的物质来进行标记。比如，糖类或脂质类，可以通过在培养基中饲喂目标生物分子的代谢类似物，使得新合成的糖类或脂质带上生物正交基团。如果是小分子探针，则可以通过带上生物正交基团以及细胞结构靶向基团，通过细胞结构靶向基团与亚细胞结构上的靶标特异性结合，使得亚细胞上的靶标分子带上生物正交基团，则可以通过生物正交反应实现标记，同时该小分子探针上还设计有氨基基团，能够使目标分子锚定到凝胶中。
如果不通过生物正交反应来实现对目标生物分子带上氨基基团和标记信号，则可以根据研究目的的不同或者目标生物分子的性质，使与目标生物分子结合的物质既有氨基基团，又能进行成像检测。比如脂溶性染料、核酸染料或荧光标记的适配体，或者荧光标记的凝集素，本身带有氨基基团，又能成像检测。而凝集素具有氨基基团，又能够特异性结合目标糖类物质，因而通过其携带的荧光标记即可对其结合的目标生物分子进行成像检测。
目前新兴的邻近标记法能够实现对于感兴趣的靶标分子的生物素化，因而通过对目标生物分子进行生物素化，进而利用生物素与链霉亲和素的亲和作用，或者与亲和素抗体的特异性结合，同样能够实现在对目标分子进行标记，和使目标分子带上氨基基团。
上述利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中的方法可以采用现有方法进行锚定。在一种优选的实施例中，通过丙烯酰胺活性酯或者戊二醛与氨基基团进行反应的方式，将目标生物分子锚定到凝胶中。
在一种优选的实施例中，在使目标生物分子带上氨基基团和信号标记之后，以及利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中之前，上述锚定方法还包括对信号标记进行放大的步骤。
上述对信号方法的方式有很多种，可以根据具体目标生物分子的类别是糖类、脂质、核酸还是蛋白来进行合理确定。比如可以通过现有技术中的一抗、二抗、二抗的抗体等级联放大方法进行放大。
在一种优选的实施例中，上述目标生物分子上连接有生物素，采用生物素三聚体连接两个链霉亲和素，并通过逐轮生物素-链霉亲和素相互作用的迭代染色方法来实现对信号标记进行放大；或者通过isHCR的方法实现对信号标记进行放大。通过采用生物素作为标记分子，便于利用生物素与亲和素的亲和作用来实现对信号的放大，从而在实现锚定的同时，放大了标记信号，便于后续实现对目标生物分子的超分辨率成像。
在一种优选的实施例中，经过生物正交基团修饰的有机化学分子为小分子药物或化学探针，化学探针修饰有第一生物正交基团和靶向基团，靶向基团选自细胞器靶向基团、细胞骨架靶向基团或细胞膜靶向基团。
某些小分子药物与靶标有特异性结合能力，比如，抗生素类小分子药物，不同类别的抗生素能够用于特异性识别革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。化学探针可以修饰为带有能够特异性结合靶向细胞膜、细胞骨架或线粒体、叶绿体等细胞器的基团。
对于某些无法通过靶向结合或者特异性结合将有机化学分子固定在待检测的生物材料中，比如容易被洗脱掉的有机化学分子，则需要将该有机化学分子与周围的生物分子进行交联。具体实现交联的方式可以根据需要进行合理选择。
在一种优选的实施例中，经过生物正交基团修饰的有机化学分子通过化学交联、光交联的方式实现与周围生物分子的共价键形式交联，优选地，化学交联包括采用氯代乙酰基进行交联。根据交联剂或交联方式的不同，有机化学分子所能够交联的对象也有差异。当采用氯代乙酰基进行交联时，只与周围蛋白质交联。
在一种优选的实施例中，目标生物分子选自脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种。脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸等属于生物大分子，而小分子药物、代谢物以及化学探针等属于生物小分子。无论这些生物小分子标记的对象是何种生物大分子，这些生物小分子产生的荧光信号显示的是其本身的位置，根据其发光位置或分布位置的不同，其标记的对象也不同。对于某些小分子药物，其产生的荧光信号可能没有特定的区域分布，所以荧光成像显示的就是这些小分子药物自身的分布。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种膨胀显微成像方法，该成像方法包括：利用上述任一种锚定方法将目标生物分子锚定到凝胶中；使凝胶吸水膨胀并利用信号标记对膨胀后的目标生物分子进行成像。
上述成像可以为共聚焦显微成像，也可以结合目前新兴的超分辨率技术进行超分辨率技术显微成像。优选地，超分辨率显微成像为SIM成像、STED成像、STORM成像或者DNA-PAINT成像。本申请的上述膨胀显微成像方法中，通过将目标分子标记上荧光信号，同时锚定到凝胶中，通过凝胶膨胀将目标分子放大，对于成像，根据具体所使用的显微镜的不同，可以进行不同的成像。上述SIM成像、STED成像、STORM成像或者DNA-PAINT成像都是新兴的根据不同的原理而实现的超分辨率显微成像方法。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了上述任一种方法在目标生物分子的生物学相关研究中的应用。采用本申请的方法进行研究，目标生物分子包括但不仅限于脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种。生物学相关研究包括但不仅限于对目标分子的结构和/或功能研究。
下面结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1：
一、实验目的：利用现有的ExM方法，证明了脂质等生物分子无法被现有的ExM方法成像。
二、实验步骤：
对于原代海马区神经元以及HeLa细胞分别标记炔基-胆碱，炔基-棕榈酸，炔基-法尼醇以及脂溶性染料DiI，随后进行ExM成像。
ExM成像步骤：样品利用0.1mg/mL的AcX室温标记过夜，或者采用0.25％戊二醛交联15分钟。配制单体溶液(1×PBS,2M NaCl,2.5％丙烯酰胺,0.15％N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,8.625％丙烯酸钠)，其中依次加入新配置的10％四甲基乙二胺(TEMED)以及10％过硫酸铵(APS)，细胞先在4℃中孵育5分钟，随后置于37℃温箱中孵育凝胶一小时。凝胶随后利用8U蛋白酶K在消化缓冲液(50mM Tris pH 8.0,1mM EDTA,0.1％Triton X-100,0.8M盐酸胍)在37℃下酶切1-4h。凝胶随后置于去离子水中膨胀，每隔20分钟换水一次，换4次达到膨胀平衡，随后可进行成像操作。
三、实验结果
实验结果见图3中的a至e，其中，图3中的a示出了现有的ExM方法无法保留脂质分子的示意图。图3中的b示出了图3中的a至图3中的e中所使用的炔基-胆碱，炔基-棕榈酸，炔基-法尼醇以及DiI化学结构式。图3中的c示出了对原代神经细胞代谢标记炔基-胆碱，进行ExM成像，发现膨胀之后脂质基本无保留。图3中的d示出了对HeLa细胞分别代谢标记炔基-棕榈酸以及炔基-法尼醇，进行ExM成像，发现膨胀之后脂质基本无保留。图3中的e示出了对CHO细胞利用DiI染料对细胞膜染色，进行ExM成像，发现膨胀之后脂质基本无保留。
实施例2：
一、实验目的：通过质谱、蛋白质凝胶电泳、荧光成像等方式证明基于链霉亲和素的click-ExM方法能够被用来实现脂质等生物分子的锚定。
二、实验步骤：
1)链霉亲和素与生物素共同孵育过夜，随后进行MALDI质谱检测。
2)对于蛋白酶K酶切实验，链霉亲和素与生物素复合物，分别与蛋白酶K孵育不同时间，进行蛋白胶考马斯亮蓝成像。
3)对HeLa细胞代谢标记炔基-胆碱，分别click标记上有机染料四甲基罗丹明(TAMRA)或者Alexa Fluor 555标记的链霉亲和素，固定之后，利用甲醇、Triton-X100、乙醇/10％甲酰胺、10％SDS进行处理。
三、实验结果：
如图4中的a至f所示，其中，图4中的a示出的是链霉亲和素的晶体结构。图4中的b示出的是MALDI质谱证明一分子链霉亲和素可以与约14个丙烯酰胺活性酯(AcX)反应。图4中的c示出的是链霉亲和素-生物素复合体可以抵御蛋白酶k的酶切。图4中的d示出的是对HeLa细胞代谢标记炔基-胆碱(图中简称Alk-Cho)，分别利用click反应标记上有机染料TAMRA或者Alexa Fluor 555标记的链霉亲和素(分别对应第2行和第1行)，固定之后，利用甲醇、Triton-X100、乙醇/10％甲酰胺、10％SDS进行处理，发现Alexa Fluor 555标记的链霉亲和素标记的脂质依旧得以保留。图4中的e示出的是对图4中的d中的荧光强度进行定量比较。图4中的f示出的是在COS-7细胞中代谢标记炔基-胆碱，click标记上Alexa Fluor555标记的链霉亲和素，利用三种ExM方法中的丙烯酰胺活性酯(AcX、MA-NHS)以及戊二醛(GA)交联的方式都能够实现对脂质的click-ExM成像。
实施例3
一、实验目的：通过对微管蛋白免疫荧光的实验证明可以实现基于链霉亲和素以及生物素三聚体迭代相互作用实现信号放大。
二、实验步骤：
生物素三聚体的合成路线：10mg生物素-PEG3-胺置于100μL二甲基甲酰胺中，其中加入100μL 1,3,5-苯三甲酰氯(英文：1,3,5-benzene tricarboxylic acid tris-(2,3,5,6-tetrafluorophenyl)ester)(浓度为0.474mg mL-1)，室温搅拌过夜，旋蒸除去溶剂。产物通过硅胶柱纯化(甲醇：乙酸乙酯从1:100升到3:7)，得到白色固体产物(7mg,68％)。
其核磁检测数据为：1H NMR(500MHz,CD3OD3)8.45(s,3H),4.84(s,9H),4.50-4.46(m,3H),4.30-4.27(m,3H),3.70-3.56(m,36H),3.51-3.48(m,6H),3.33-3.29(m,9H),3.19-3.15(m,3H),2.93-2.88(m,3H),2.69(d,J＝10.5Hz,3H),2.21-2.16(m,6H),1.74-1.53(m,12H),1.44-1.37(m,6H)。
13C NMR(125MHz,CD3OD3)176.02,168.54,166.04,136.60,130.10,71.55,71.30,71.19,70.57,70.50,63.33,61.59,57.00,41.14,41.10,41.07,40.30,36.74,29.76,29.50,26.85。
HRMS(ESI):m/z结构式为C63H103N12O18S3，理论分子量为[M+H]+1411.6670，实际分子量为1411.6634。
微管蛋白免疫荧光实验：HeLa细胞置于细胞骨架提取液(0.2％Triton X-100,0.1M PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸),1mM EGTA,1mM MgCl2,pH 7.0)室温1分钟。随后细胞利用3％多聚甲醛及0.1％戊二醛固定15分钟，随后利用0.1％硼氢化钠还原7分钟。接下来利用100mM甘氨酸洗涤3次，利用0.1％Triton X-100穿孔15分钟，细胞在封闭液中(1×PBS/3％BSA/0.1％Triton X-100)封闭30分钟,在带有微管蛋白抗体(Abcam,ab52866,1:250)的抗体稀释液中(1×PBS/3％BSA/0.1％Triton X-100)4℃孵育过夜,洗涤3次，随后在带有Alexa Fluor 555二抗室温孵育1小时，随后洗涤3次。
信号放大实验：同微管蛋白免疫荧光实验步骤，选用生物素化的二抗，随后加入10μM生物素三聚体室温孵育半小时，PBS洗涤三次，加入Alexa Fluor 555偶联的链霉亲和素室温孵育半小时，PBS洗涤三次，随后的多轮信号放大可重复该步骤。
三、实验结果：
如图5中的a至g所示，其中图5中的a示出的是化学合成生物素三聚体。图5中的b示出的是以微管蛋白的免疫荧光为例，分别对微管蛋白进行传统的基于荧光二抗的免疫荧光、基于生物素偶联二抗的免疫荧光以及利用生物素三聚体的一轮、二轮、四轮信号放大。图5中的c示出的是对图5中的b中的荧光强度进行定量比较。图5中的d示出的是四轮信号放大之后的微管蛋白免疫荧光图。图5中的e示出的是对图5中的d中方框部分单根微管蛋白的横截面荧光强度曲线分布。图5中的f示出的是基于传统荧光二抗免疫荧光以及四轮信号放大之后的微管蛋白分辨率比较。图5中的g示出的是Click-ExM利用链霉亲和素与isHCR(immunosignal hybridization chaim reaction，HCR杂交链式反应)信号放大示意图。
实施例4：
一、实验目的：采用Click-ExM方法对脂质进行超分辨成像。
二、实验步骤：
对COS-7细胞或者对原代大鼠心肌细胞，其中COS-7细胞中分别转染表达了mito-GFP、KDEL-GFP、B4GALT1-GFP，利用200μM炔基-胆碱标记12-16小时，细胞利用3％多聚甲醛及0.1％戊二醛固定15分钟，随后利用0.1％硼氢化钠还原7分钟。接下来利用100mM甘氨酸洗涤3次，利用0.1％皂苷穿孔15分钟，利用click反应标记上炔基生物素，随后孵育5μg/mL的荧光标记的链霉亲和素，随后可以进行膨胀前成像。
膨胀显微镜实验步骤：样品利用0.1mg/mL的AcX室温标记过夜，或者采用0.25％戊二醛交联15分钟。配制单体溶液(1×PBS,2M NaCl,2.5％丙烯酰胺,0.15％N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,8.625％丙烯酸钠)，其中加入新配置的10％过硫酸铵(APS)以及10％四甲基乙二胺(TEMED)，细胞先在4℃中孵育5分钟，随后置于37℃温箱中孵育凝胶一小时。凝胶随后利用8U蛋白酶K在消化缓冲液(50mM Tris pH 8.0,1mM EDTA,0.1％Triton X-100,0.8M盐酸胍)在37℃下酶切1-4h。凝胶随后置于去离子水中膨胀，每隔20分钟换水一次，换4次达到膨胀平衡，随后可进行成像操作。
三、实验结果：
如图6中的a至j所示，图6中的a示出的是炔基-胆碱化学结构式。图6中的b示出的是对COS-7细胞代谢标记炔基-胆碱之后的click-ExM成像图，脂质标记信号可以与线粒体的标志物如mito-GFP以及TOM20免疫荧光共定位。图6中的c示出的是图6中的b中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。图6中的d示出的是对COS-7细胞代谢标记炔基-胆碱之后的click-ExM成像图，脂质标记信号可以与内质网的标志物KDEL-GFP共定位。图6中的e示出的是图6中的d中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。图6中的f示出的是对COS-7细胞代谢标记alk-choline之后的click-ExM成像图，脂质标记信号可以与高尔基体的标志物B4GALT1-GFP共定位。图6中的g示出的是图6中的f中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。图6中的h示出的是对原代心肌细胞代谢标记炔基-胆碱之后的click-ExM三维成像图。图6中的i示出的是图6中的h中成像光学截面以及视野放大成像图。图6中的j示出的是图6中的i中直线横截面部分的荧光强度分布曲线。
实施例5：
一、实验目的：采用Click-ExM方法对糖类进行超分辨成像。
二、实验步骤：
对于O-GlcNAc标记，HeLa或者U2OS细胞孵育1mM GalNAz 48小时，细胞随后进行固定操作，步骤同脂质标记部分。细胞通过click标记上生物素基团。对于唾液酸标记，HeLa细胞,原代海马区神经元以及原代大鼠心肌细胞孵育2mM ManNAz 48h。随后孵育100μM DBCO-PEG4-生物素30分钟，随后培养基洗涤15分钟。细胞随后进行固定操作，步骤同脂质标记。细胞利用click反应标记上生物素基团。孵育5μg/mL的荧光标记的链霉亲和素，随后可以进行膨胀前成像。凝胶、酶切、膨胀、成像步骤同脂质标记部分。
三、实验结果：
如图7中的a至n所示，其中图7中的a示出的是GalNAz,SiaNAz以及ManNAz化学结构式。图7中的b示出的是对HeLa细胞代谢标记GalNAz的click-ExM前后以及结构光照明显微镜SIM成像图。图7中的c示出的是GalNAz标记与RL2抗体免疫荧光共定位图。图7中的d示出的是图7中的c中直线横截面部分各个荧光通道的荧光强度分布曲线。图7中的e示出的是GalNAz标记在细胞核膜上分布的click-ExM成像图。图7中的f示出的是图7中的e中方框部分直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。图7中的g示出的是图7中的e中GalNAz标记的核孔复合物粒径分析统计直方图。图7中的h示出的是对HeLa细胞代谢标记SiaNAz之后的click-ExM成像图。图7中的i示出的是对原代海马区神经元细胞代谢标记ManNAz的click-ExM前后成像图。图7中的j示出的是图7中的i中膨胀前成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。图7中的k示出的是图7中的i中膨胀后成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。图7中的l示出的是对原代心肌细胞代谢标记ManNAz的click-ExM成像图。图7中的m示出的是图7中的l中膨胀前成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。图7中的n示出的是图7中的l中膨胀后成像图直线横截面荧光通道的荧光强度分布曲线。
实施例6：
一、实验目的：采用Click-ExM方法对新生成蛋白质、核酸分子、小分子进行超分辨成像。
二、实验步骤：
对于DNA标记，U2OS细胞孵育10μM 5-炔基-2’-脱氧尿嘧啶(EdU)24小时。对于标记不同时期的新生成DNA，U2OS细胞首先利用无血清培养基饥饿处理过夜，随后利用10μM EdU标记响应时间。凝胶前，EdU标记的细胞利用30U mL-1DNase I在37℃下处理30分钟。
对于RNA标记，HeLa细胞孵育1mM 5-炔基-尿嘧啶(EU)4小时。上述细胞通过4％多聚甲醛固定15分钟。PBS洗涤3次后，细胞利用0.1％Triton X-100穿孔15分钟。细胞随后利用click反应标记上生物素，然后与孵育5μg/mL的荧光标记的链霉亲和素，随后可以进行膨胀前成像。凝胶、酶切、膨胀、成像步骤同脂质标记部分。
对于神经细胞新生成蛋白质的标记。7d的原代海马区神经元利用1mM叠氮-甘氨酸(AHA)标记2小时，后续步骤同上述O-GlcNAc标记过程。
对于小分子标记，HeLa细胞孵育100μM叠氮-阿法替尼2小时或者12小时。后续所有步骤同上述脂质标记过程。
对于新生成多肽标记，HeLa细胞孵育50μM炔基-嘌呤霉素(Op-puro)1小时，DMEM洗涤15分钟,后续所有步骤同上述蛋白质标记过程。
对于细胞膜标记，HeLa cells利用4％多聚甲醛固定15分钟,利用0.1％皂苷穿孔15分钟,随后利用50μM叠氮-DSPE标记1小时，随后利用PBS洗涤5次，后续所有步骤同上述O-GlcNAc标记过程。
对于线粒体标记，COS-7细胞首先标记10μM TPP-AC 30分钟，PBS洗涤两次，换用新鲜的培养基继续培养标记5小时，后续所有步骤同脂质标记过程。
三、实验结果：
如图8中的a至h所示，其中，图8中的a示出的是AHA,EdU,EU,叠氮-阿法替尼,TPP-AC,Op-puro,DSPE-azide的化学结构式。图8中的b示出的是对原代海马神经细胞代谢标记AHA 2h后与神经元标志物MAP2免疫荧光的click-ExM前后成像图。图8中的c示出的是EdU标记的U2OS细胞click-ExM前后成像图。图8中的d示出的是EU标记的HeLa细胞click-ExM前后成像图。图8中的e示出的是叠氮-阿法替尼处理2h以及12h后的HeLa细胞的click-ExM前后成像图。图8中的f示出的是Op-puro标记的HeLa细胞的click-ExM前后成像图。图8中的g示出的是TPP-AC标记的COS-7细胞的click-ExM前后成像图。图8中的h示出的是DSPE-azide标记的HeLa细胞的click-ExM前后成像图。
从以上的描述中，可以看出，本申请的上述实施例具有如下优点：
1.本申请的Click-ExM方法利用click反应进行生物分子的标记，在探针选择上本技术中既可以选用可代谢标记的带有生物正交基团的非天然代谢物探针，也可以选择带有经过生物正交基团修饰的有机化学探针。
2.本申请的Click-ExM方法利用click反应将各种生物分子都可以转变为带有可被锚定到凝胶中、带有氨基的蛋白、多肽或者有机化学小分子，包括但不限于链霉亲和素、地高辛、FLAG、二硝基苯等。
3.本申请的Click-ExM方法能够实现对脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸分子包括DNA、RNA、小分子药物、代谢物以及化学探针的荧光标记以及超分辨成像。
4.本申请的Click-ExM方法通过生物素三聚体与荧光分子标记的链霉亲和素之间的迭代染色实验，即可实现荧光信号在目标生物分子上的信号累积放大，提高ExM方法的信噪比。另外，click-ExM还可以与已发表的isHCR信号放大技术相结合，实现高扩增倍数的信号放大。
5.本申请的Click-ExM方法能够实现对小分子药物、代谢物以及化学探针等生物小分子的荧光标记以及超分辨成像。其中生物小分子包括但不限于实例中所示的小分子药物以及化学探针。只要按照本申请的发明思想对化学探针修饰上生物正交基团以及靶向基团，如细胞器靶向基团、细胞骨架靶向基团(比如某些小分子药物)、细胞膜靶向基团等，都可以应用click-ExM方法来实现成像。
6.本申请的方法中，对于生物小分子锚定的方式，除实例中所示的氯代乙酰基与周围蛋白共价偶联外，还可以采用其他方式如光交联或化学交联的方式与周围其他类别的分子共价偶联(使小分子与周围的分子进行交联，以避免洗脱时被洗掉)。此外，APEX，BirA以及TurboID等方法都可以用来修饰靶标分子，使其连上生物素，从而通过生物素与链霉亲和素或生物素抗体的相互作用来实现膨胀显微成像。
7.本申请的膨胀显微方法除了可以是实例中展示的共聚焦显微镜成像外，还可以与诸多前沿成像技术相结合，如超分辨技术：SIM，STED，STORM等，也可以与DNA-PAINT等技术结合，实现更高分辨率的成像。
8.本申请提供了一种锚定生物分子到凝胶中的方法，且该方法通用、普适，具有商业化前景，无需个性化设计以及合成。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种目标生物分子的锚定方法，其特征在于，所述锚定方法包括：
通过对目标生物分子进行标记，使所述目标生物分子带上氨基基团和信号标记；
利用所述氨基基团将所述目标生物分子锚定到凝胶中。
2.根据权利要求1所述的锚定方法，其特征在于，通过生物正交反应对所述目标生物分子进行标记使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记；
优选地，采用带有生物正交基团的代谢类似物或经过生物正交基团修饰的有机化学分子与带有互补生物正交基团的第一标记分子，通过所述生物正交基团之间进行所述生物正交反应，使所述目标生物分子带上所述第一标记分子；
利用带有氨基基团和信号标记的第二标记分子特异性结合所述第一标记分子，从而使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记；
更优选地，所述生物正交基团为叠氮或端炔基；所述第一标记分子为生物素、地高辛、FLAG或二硝基苯；相应地，所述带有氨基基团和信号标记的第二标记分子为带有信号标记的链霉亲和素、地高辛抗体、FLAG抗体或二硝基苯抗体。
3.根据权利要求1所述的锚定方法，其特征在于，通过带有氨基基团的第三标记分子标记所述目标生物分子，使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记，
优选地，所述目标生物分子为脂质或核酸或糖类，相应地，所述第三标记分子为脂溶性染料、核酸染料或荧光标记的适配体、或者带荧光标记的凝集素。
4.根据权利要求1所述的锚定方法，其特征在于，
通过带有氨基基团的第四标记分子标记所述目标生物分子，使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述第四标记分子；
将带有信号标记的第五标记分子与所述第四标记分子进行特异性结合，从而使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记；
优选地，所述第四标记分子为一抗，相应地，所述第五标记分子为荧光标记的二抗。
5.根据权利要求1所述的锚定方法，其特征在于，采用邻近标记的方法使所述目标生物分子修饰上生物素，并利用带有氨基基团和荧光标记的生物素结合物与所述生物素结合，使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记，其中，所述生物素结合物为生物素亲和素或生物素抗体；
优选地，所述邻近标记的方法为APEX，BirA或TurboID；
优选地，所述生物素亲和素为链霉亲和素。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的锚定方法，其特征在于，利用所述氨基基团将所述目标生物分子锚定到凝胶中包括：
通过丙烯酰胺活性酯或者戊二醛与所述氨基基团进行反应的方式，将所述目标生物分子锚定到凝胶中。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的锚定方法，其特征在于，在使所述目标生物分子带上所述氨基基团和所述信号标记之后，以及利用所述氨基基团将所述目标生物分子锚定到凝胶中之前，所述锚定方法还包括对所述信号标记进行放大的步骤。
8.根据权利要求2或5所述的锚定方法，其特征在于，采用生物素三聚体连接两个链霉亲和素，并通过逐轮生物素-链霉亲和素相互作用的迭代染色锚定方法来实现对所述信号标记进行放大；或者通过isHCR的锚定方法实现对所述信号标记进行放大。
9.根据权利要求2所述的锚定方法，其特征在于，所述经过生物正交基团修饰的有机化学分子为小分子药物或化学探针，所述小分子药物或所述化学探针修饰有所述生物正交基团和靶向基团，所述靶向基团选自细胞器靶向基团、细胞骨架靶向基团或细胞膜靶向基团。
10.根据权利要求2所述的锚定方法，其特征在于，所述经过生物正交基团修饰的有机化学分子通过化学交联或光交联的方式实现与周围分子的共价交联；
优选地，所述化学交联包括采用氯代乙酰基进行交联。
11.根据权利要求1所述的锚定方法，其特征在于，所述目标生物分子选自脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种。
12.一种膨胀显微成像方法，其特征在于，所述成像方法包括：
利用权利要求1至11中任一项所述的锚定方法将所述目标生物分子锚定到凝胶中；
使所述凝胶吸水膨胀并利用所述信号标记对膨胀后的所述目标生物分子进行成像。
13.根据权利要求12所述的成像方法，其特征在于，所述成像为共聚焦显微成像或超分辨率显微成像，优选地，所述超分辨率显微成像为SIM成像、STED成像、STORM成像或者DNA-PAINT成像。
14.权利要求1至11中任一项所述的锚定方法和/或权利要求12或13所述的成像方法在目标生物分子的生物学相关研究中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述目标生物分子为脂质、糖类、新生成蛋白质、核酸、小分子药物、代谢物以及化学探针中的任意一种或多种；
优选地，所述生物学相关研究包括结构和/或功能研究。
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