CN115372527A

CN115372527A - 用于生物样品的膨胀蛋白组学分析的方法和制剂

Info

Publication number: CN115372527A
Application number: CN202211042411.8A
Authority: CN
Inventors: 科瑞欧; 郭天南; 孙翠骥; 李璐; 孙耀庭; 朱怡
Original assignee: Westlake University
Current assignee: Westlake University
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2022-08-29
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2042-08-29
Also published as: WO2023025318A1; CN115372527B

Abstract

本发明提供了一种通过水凝胶膨胀对组织样品进行物理膨胀从而进行蛋白组学分析的方法，和用于生产可膨胀的样品‑水凝胶复合体的方法。还提供了一种用于制备样品‑水凝胶复合体的水凝胶制剂、锚定剂等和包含其的相关试剂盒。

Description

用于生物样品的膨胀蛋白组学分析的方法和制剂

交叉引用

本申请要求2021年8月27日提交的中国专利申请No.202110994923.3的权益，该申请通过引用全部并入本文。

发明领域

本公开涉及蛋白质组学，特别是结合水凝胶膨胀技术对组织样品进行蛋白质组学分析的方法，在此类方法中采用的特定制剂及其用途，以及用于此类方法的试剂盒和系统。

背景技术

蛋白质亚细胞定位与蛋白质的功能密切相关，但是传统的高通量研究方法如转录组测序无法用于这类研究。随着显微术、质谱技术和机器学习方法的成熟，空间蛋白质组学通过对蛋白质在亚细胞水平的定位及其动态变化进行研究，正在成为了解细胞生物学的重要工具。其中一种空间蛋白质组学研究方法是基于成像来分析蛋白定位，而不需要在蛋白组学分析之前进行细胞裂解或细胞中区室或细胞器的分离。

对蛋白质的成像是质谱成像(IMS)技术开发中关注的焦点之一。质谱成像通过质谱直接扫描生物样品，分析分子在细胞或组织中的“结构、空间与时间分布”信息。在此基础上开发出的MALDI(基质辅助激光解吸电离)质谱成像技术能够对样品表面的数千种分析物进行多重分析，得到揭示分子的位置和相对丰度的二维分子图谱，尤其是允许蛋白质及各种蛋白形式的可视化。然而，MALDI由于其质量准确度相对较低，因此限制了其广泛使用。

在另一方面，对生物组织样品的空间蛋白质组学研究采取的主要方案是用激光捕获显微切割(LCM)方法来获取微小组织样品。LCM可以通过显微镜结合激光瞄准系统从异质环境中提取单个细胞样品，使用激光对组织进行穿孔并切除目标区域，将其与相邻组织分开。通过激光取样并用传统的溶液内胰酶消化的方法，得到多肽片段，然后进行蛋白质组学分析。然而，LCM取样只能取到3-5毫米左右的样品，而且激光显微切割取样价格非常昂贵，整套仪器需要上百万元，无法进行大规模应用；取到样品后，用的溶液内胰酶消化的方法会在处理的过程中损失很多低丰度的蛋白。

总之，本领域中存在对空间蛋白质组学鉴定的取样和分析方法进行改进的需要，从而能够更精确地获取特定位置处的样品，并在蛋白处理的过程中获得更多有效的蛋白片段。

发明内容

本公开解决了有效取得微小组织样品的问题，实现了微空间蛋白质组学分析(该技术在本文中被称为ProteomEx)。具体地，本公开提供了一种将生物样品可逆地锚定到水凝胶并均匀膨胀的方法，其中将生物样品-水凝胶复合体进行蛋白质染色和膨胀后，得到线性膨胀6倍左右的可视化组织样品。然后，根据需要用打孔器(例如在直径毫米尺度)可取到原始直径500微米左右的微小组织样品用于蛋白质组学鉴定。

在一个方面，本公开提供了一种用于对生物样品进行蛋白质组学鉴定的方法，包括：

将所述生物样品用锚定剂处理，加入水凝胶前体溶液并发生聚合，从而形成样品-水凝胶复合体；

对所述样品-水凝胶复合体进行蛋白质变性；

对所述样品-水凝胶复合体进行蛋白质染色，并使其膨胀；和

从膨胀的样品-水凝胶复合体取样用于蛋白质鉴定。

在某些实施方案中，所述生物样品是标本、活组织检查样品、器官或其部分、或整个生物体。样品可以是活的、固定或保存的，例如是固定的组织切片、新鲜冷冻组织或包埋在石蜡中的组织切片。

在某些实施方案中，待膨胀的样品是厚度为50μm或更小的组织切片，即薄的组织样品。在一些另外的实施方案中，待膨胀的样品是厚度大于400μm的组织样品。在一些其他实施方案中，待膨胀的样品是整个器官。

在某些实施方案中，在用锚定剂处理之前，所述方法可包括预先进行对蛋白质的免疫染色例如抗体染色。在某些实施方案中，免疫染色可与锚定同时进行。

在某些实施方案中，所述锚定剂包含生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团。例如，所述锚定剂可选自丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSA)、N-(烯丙氧基羰氧基)-琥珀酰亚胺(NAS)及其组合。

在某些实施方案中，锚定包括将生物样品与锚定剂接触，然后用水凝胶前体溶液灌注生物样品或将生物样品埋放到水凝胶前体溶液中。备选地，锚定包括将生物样品用添加有锚定剂的水凝胶前体溶液灌注或将组织样品埋放到添加有锚定剂的水凝胶前体溶液中，从而同时进行锚定和聚合。

所述水凝胶前体溶液包含水凝胶聚合物的前体。例如，所述前体选自丙烯酸钠(SA)，甲基丙烯酸钠(SMA)，衣康酸(IA)，反式乌头酸(TAA)，乙基-2-(羟甲基)-丙烯酸酯(EHA)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA，又称为BIS)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)，季戊四醇四丙烯酸酯(PT)，丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)，季戊四醇三丙烯酸酯(PA)，二季戊四醇五丙烯酸酯或二季戊四醇六丙烯酸酯(DPHA)，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TTA)，二(三羟甲基丙烷)-四丙烯酸酯(DiTA)，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TTMA)，甘油丙氧基化(1PO/OH)三丙烯酸酯(GPT)，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TET)，季戊四醇烯丙基醚(PAE)，4-羟基-2-亚甲基丁酸钠(SHMB)，N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺(DMPAA)和丙烯酰胺(AA)的一种或多种。

在某些实施方案中，所述前体包含SMA、DMAA和PAE。在某些实施方案中，前体中包含的DMAA:SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，例如在20:1至3:1的范围内，在15:1至3:1的范围内，在10:1至3:1的范围内，在9:1至3:1的范围内，在8:1至3:1的范围内，在7:1至3:1的范围内，在6:1至3:1的范围内，在5:1至3:1的范围内，在4:1至3:1的范围内或者在其中任何子范围之内，更具体地，DMAA:SMA的摩尔比可以是约4:1或3:1；而且，其中SMA:PAE的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内，例如在10:0.008至10:3、10:0.01至10:3、10:0.02至10:3、10:0.03至10:3、10:0.04至10:3、10:0.05至10:3、10:0.06至10:3、10:0.07至10:3、10:0.08至10:3、10:0.09至10:3、10:0.1至10:3、10:0.4至10:3、10:0.6至10:3、10:0.8至10:3、10:1至10:3、10:1.1至10:3、10:1.2至10:3、10:1.3至10:3、10:1.4至10:3、10:1.5至10:3、10:2至10:3的范围内或者在其中任何子范围之内，更具体地，SMA:PAE的摩尔比可以是约10:0.005、10:0.008、10:0.1、10:0.5、10:1、10:1.1、10:1.2、10:1.3、10:1.4、10:1.5、10:1.6、10:1.7、或10:1.8。

进一步地，在某些实施方案中，前体中包含的DMAA:SMA:PAE的摩尔比在(40±20):(10±5):(0.005-2)的范围内，如约(40±15):(10±3.5):(0.005-2)、约(40±10):(10±2.5):(0.005-2)、约(40±5):(10±2):(0.005-2)、约(40±5):(10±1.2):(0.005-2)、约(40±5):(10±1):(0.005-2)的范围内，优选约40:10:(0.005-2)的范围内，约40:10:(0.006-2)的范围内，约40:10:(0.008-2)的范围内，约40:10:(0.008-1.8)的范围内，约40:10:(0.05-1.8)的范围内，约40:10:(0.05-1.6)的范围内，约40:10:(0.05-1.4)的范围内，约40:10:(0.008-1.4)的范围内，包括其中的任何子范围。在另一些实施方案中，前体中包含DMAA、SMA和PAE，其中以摩尔份数计，若DMAA为30-50份，则SMA为5到15份，PAE为0.005到2份。。

在某些实施方案中，所述前体包含SMA、DMAA和TPT。在某些实施方案中，前体中包含的DMAA:SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，例如在20:1至3:1的范围内，在15:1至3:1的范围内，在10:1至3:1的范围内，在9:1至3:1的范围内，在8:1至3:1的范围内，在7:1至3:1的范围内，在6:1至3:1的范围内，在5:1至3:1的范围内，在4:1至3:1的范围内或者在其中任何子范围之内，更具体地，DMAA:SMA的摩尔比可以是约4:1或3:1；而且，其中SMA:TPT的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内，例如在10:0.008至10:3、10:0.01至10:3、10:0.02至10:3、10:0.03至10:3、10:0.04至10:3、10:0.05至10:3、10:0.06至10:3、10:0.07至10:3、10:0.08至10:3、10:0.09至10:3、10:0.1至10:3、10:0.4至10:3、10:0.6至10:3、10:0.8至10:3、10:1至10:3、10:1.1至10:3、10:1.2至10:3、10:1.3至10:3、10:1.4至10:3、10:1.5至10:3、10:2至10:3的范围内或者在其中任何子范围之内，更具体地，SMA:TPT的摩尔比可以是约10:0.005、10:0.008、10:0.1、10:0.5、10:1、10:1.1、10:1.2、10:1.3、10:1.4、10:1.5、10:1.6、10:1.7、或10:1.8。

进一步地，在某些实施方案中，前体中包含的DMAA:SMA:TPT的摩尔比在(40±20):(10±5):(0.005-2)的范围内，如约(40±15):(10±3.5):(0.005-2)、约(40±10):(10±2.5):(0.005-2)、约(40±5):(10±2):(0.005-2)、约(40±5):(10±1.2):(0.005-2)、约(40±5):(10±1):(0.005-2)的范围内，优选约40:10:(0.005-2)的范围内，约40:10:(0.006-2)的范围内，约40:10:(0.008-2)的范围内，约40:10:(0.008-1.8)的范围内，约40:10:(0.05-1.8)的范围内，约40:10:(0.05-1.6)的范围内，约40:10:(0.05-1.4)的范围内，约40:10:(0.008-1.4)的范围内，包括其中的任何子范围。在另一些实施方案中，前体中包含DMAA、SMA和TPT，其中以摩尔份数计，若DMAA为30-50份，则SMA为5到15份，TPT为0.005到2份。

在某些实施方案中，所述水凝胶前体溶液还包含聚合活化剂和/或促进剂(优选在使用前加入)，例如VA-044、V50、过硫酸铵、过硫酸钾和TEMED。

在某些实施方案中，通过变性来对样品-水凝胶复合体匀浆化(又称为均质化)，优选通过温和变性来匀浆化。在某些实施方案中，蛋白质变性通过用去污剂(例如SDS或十二烷基苯磺酸钠)处理来进行。

在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品用二硫键还原剂处理，所述二硫键还原剂可例如选自TCEP、DTT和BME。在某些实施方案中，所述二硫键还原剂处理可在锚定之前进行。

在某些实施方案中，所述方法还包括蛋白质去锚定。例如，通过提高溶液pH值至碱性(例如通过与Tris缓冲液接触)从而使酰胺键断裂来进行。

在某些实施方案中，所述染色为通过考马斯蓝染色方法来进行染色。

在某些实施方案中，使样品-水凝胶复合体膨胀通过将其与水或水性缓冲液孵育来进行。样品-水凝胶复合体膨胀后线性扩展因子的范围可以为2-7，例如为5以上。

在某些实施方案中，所述取样为局部取样，例如显微取样或通过打孔器进行局部取样。局部取样得到的样品的直径可以低于3毫米。优选地，通过显微取样的样品直径可达到微米级。

在某些实施方案中，蛋白质鉴定通过质谱分析进行，包括对样品-水凝胶复合体进行酶消化、肽提取(任选地脱盐)以及质谱检测。质谱检测可以通过HPLC-MS或MALDI-TOF进行。

在一个方面，本公开提供了包含DMAA、SMA和PAE，或者DMAA、SMA和TPT的水凝胶制剂。

在某些实施方案中，在所述水凝胶制剂中DMAA：SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA:PAE的摩尔比在10:0.01至10:3的范围内，例如DMAA:SMA:PAE的摩尔比在(40±20):(10±5):(0.005-2)的范围内，如约(40±10):(10±2.5):(0.005±0.1)、约(40±5):(10±1.2):(0.005±0.1)、约(40±5):(10±1.2):(0.005±0.1)、约(40±10):(10±5):(0.005±0.1)的范围内，优选约40:10:(0.005-2)的范围内，约40:10:(0.006-2)的范围内，约40:10:(0.008-2)的范围内，约40:10:(0.008-1.8)的范围内，约40:10:(0.005-1.8)的范围内，约40:10:(0.005-1.6)的范围内，约40:10:(0.005-1.4)的范围内，约40:10:(0.008-1.4)的范围内，包括其中的任何子范围。具体地，DMAA:SMA:PAE的摩尔比可以是约30:10:1、40:10:0.008、40:10:0.4、40:10:1、40:10:1.2、或40:10:1.5。

在某些实施方案中，在所述水凝胶制剂中DMAA：SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA:TPT的摩尔比在10:0.01至10:3的范围内，例如DMAA:SMA:TPT的摩尔比在(40±20):(10±5):(0.005-2)的范围内，如约(40±10):(10±2.5):(0.005±0.1)、约(40±5):(10±1.2):(0.005±0.1)、约(40±5):(10±1.2):(0.005±0.1)、约(40±10):(10±5):(0.005±0.1)的范围内，优选约40:10:(0.005-2)的范围内，约40:10:(0.006-2)的范围内，约40:10:(0.008-2)的范围内，约40:10:(0.008-1.8)的范围内，约40:10:(0.005-1.8)的范围内，约40:10:(0.005-1.6)的范围内，约40:10:(0.005-1.4)的范围内，约40:10:(0.008-1.4)的范围内，包括其中的任何子范围。具体地，DMAA:SMA:TPT的摩尔比可以是约30:10:1、40:10:0.008、40:10:0.4、40:10:1、40:10:1.2、或40:10:1.5。

在某些实施方案中，水凝胶制剂制备为包含DMAA、SMA和PAE，或DMAA、SMA和TPT稀释于水的储液。备选地，水凝胶制剂制备为未稀释的DMAA、SMA和PAE，或DMAA、SMA和TPT的混合物。

在一个方面，本公开提供一种水凝胶制剂在生物样品的膨胀中的用途，其中水凝胶制剂包含水凝胶前体，所述水凝胶前体包含DMAA、SMA和PAE，或DMAA、SMA和TPT。

在一个方面，本公开提供一种试剂盒，其包含在一个或多个容器中的DMAA、SMA和PAE，或DMAA、SMA和TPT。

在某些实施方案中，DMAA、SMA和PAE各自在分开的容器中。任选地，DMAA：SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA:PAE的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内。备选地，DMAA、SMA和PAE的至少两种混合在一个容器中。DMAA、SMA和PAE的摩尔比率可以如上文所述。

在某些实施方案中，DMAA、SMA和TPT各自在分开的容器中。任选地，DMAA：SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA:TPT的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内。备选地，DMAA、SMA和TPT的至少两种混合在一个容器中。DMAA、SMA和TPT的摩尔比率可以如上文所述.

在某些实施方案中，所述试剂盒适于保藏在0℃-4℃的温度或在室温保藏。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含一个或多个容器，该容器中包含NAS和/或NSA作为锚定剂。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含以下一项或多项：

包含二硫键还原剂(例如TCEP)的容器；包含选自VA-044、V50、TEMED、过硫酸铵和过硫酸钾的一种或多种聚合活化剂或促进剂的容器；包含固定剂(例如多聚甲醛)的容器；包含蛋白变性缓冲剂(例如包含SDS的蛋白变性缓冲剂)的容器；包含蛋白质染色液(例如考马斯亮蓝染色液)的容器；和包含用于对样品中的蛋白进行消化的酶的容器；和包含一种或多种缓冲溶液的容器。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含以下一项或多项：凝胶室，配置为用于在凝胶化之前容纳样品，例如具有腔室或凹槽的皿；染色室，其用于对样品-水凝胶复合体进行染色，例如考马斯亮蓝染色；凝胶操作工具，例如镊子、软毛笔；打孔器；降温装置，例如冰袋。

本公开还提供如上文所述的试剂盒用于生物样品的物理扩展。

在一个方面，本公开提供一种用于生物样品的空间蛋白质组学分析的系统，包含：

锚定模块，该模块中进行对生物样品中蛋白质的锚定；

凝胶反应模块，该模块中将水凝胶聚合，以形成样品-水凝胶复合体；

蛋白变性模块和去锚定模块，该模块中分别对样品-水凝胶复合体中的蛋白质进行变性和去锚定；

染色模块，该模块中对蛋白质进行染色和任选地局部取样；

质谱分析模块，该模块中包含对局部取样的样品进行质谱前预处理并且与质谱检测装置连接。

在一些实施方案中，所述系统还包含蛋白质预处理模块，该模块中进行对生物样品的二硫键还原处理、和/或免疫染色等。

在一些实施方案中，上述一个或多个模块可以整合在一起。在某些实施方案中，所述锚定模块和凝胶反应模块可以整合为一个模块，从而同时进行锚定和凝胶聚合。

从以下几个实施方案的参考附图进行的详细描述，本公开的前述和其他特征和优点将变得更加明显。

附图说明

图1例示了处理生物样品用于蛋白组学鉴定(即ProteomEx方法)的工作流程的一个实例。(A)将化学固定的组织样品(可以预先免疫染色)用化学锚定剂处理，包埋在水凝胶中，并通过温和变性机械匀浆化。将经过考马斯染色(CBB)的水凝胶包埋的样品膨胀，并成像。成像后，将膨胀的样品显微切割，并通过凝胶内消化处理组织-水凝胶复合体的切割片段，从而回收用于LC-MS/MS分析的肽(LEF表示线性膨胀因子，VOL表示体积膨胀因子)。(B)ProteomEx的时间线，表明总持续时间和每个步骤的操作时间(总持续时间/操作时间)。(C)小鼠脑组织切片膨胀前的明视野图像，和(D)考马斯染色和膨胀后的图像，(E)显示自动检测的和注释的脑区域(LEF＝5.5倍)。

图2例示了使用3mm打孔器对膨胀后的脑片样品-水凝胶复合体进行手动局部取样的示意图，其中左边是用打孔器打孔之前的样品，右边是打孔器打孔之后的样品。

图3例示了脑片样品-水凝胶复合体膨胀前后的大小，左边的是膨胀之前样品的大小，右边是膨胀之后样品的大小，可以看到脑片膨胀了6.1倍。

图4例示了膨胀胶用3mm打孔器取样后，经过蛋白质组学鉴定得到的蛋白种类数量的图。

图5例示了脑片样品经膨胀胶酶解、溶液内酶解、压力循环酶解(从左到右依次)后的鉴定的蛋白种类数量(A)和漏切比例(B)的柱状图。

图6例示了ProteomEx与本领域中标准方法的基准比较。(A)对小鼠脑组织应用的溶液内酶解、PCT、proExM-MS和ProteomEx方法的肽产率(来自一个、一个、两个和一个脑切片的分别为n＝4、4、7、4次的技术重复，将同样的样品用于小图A-F中的数据采集。整个图6中，点：单个数据点；条柱：均值；须(whisker)：标准偏差；根据Welch t检验。(B)使用溶液内酶解、PCT、proExM-MS和ProteomEx方法准备的鉴定肽的漏切。(C、D)7个样品组中的肽数目(C)和蛋白数目(D)鉴定(n＝3，对于ProteomEx(5.9nL)和空白水凝胶为来自一个小鼠的一个切片的3个打孔取样，对于MS缓冲液，n＝3次独立注射；通过DDA分析)。(E)对D中显示的成批样品所鉴定蛋白的Venn图。(F)E中显示的样品所鉴定蛋白的亚细胞位置。(G、H)通过ProteomEx和PCT处理的不同组织体积的肽数目(G)和蛋白数目(H)鉴定(对于ProteomEx，每组n＝4个打孔取样，来自2只小鼠，LEF＝6.3、6.2、6.3、5.9；对于PCT，每组n＝3个组织切样，来自1只小鼠；实线：四参数逻辑拟合；虚线：95％置信区间边界；阴影区域代表95％置信区间；通过PulseDIA分析)。

图7例示了四种方法的可重复性和稳定性的比较。(A)使用MSFragger软件分析的四种策略中每对样品的Pearson相关热图。颜色条表示Pearson相关值。(B)四种方法中定量的蛋白质丰度的变异系数。

图8例示了肽修饰分析。(A)翻转图显示了通过开放搜索模式在四种方法中识别的重叠修饰的数量。(B)ProteomEx中按肽修饰比率排序的不同修饰的分布。四种颜色表示对应方法。

图9例示了ProteomEx在不同组织类型中的验证。(A)不同组织切片膨胀前(左列)和膨胀后(中间列；考马斯染色)，以及膨胀前图像(绿色伪色)和配准(register)的膨胀后图像(洋红色伪色)覆盖(右列)所得的代表性明视野图像。箭头表示变形矢量场(n＝3、3和3个组织切片，各来自一只小鼠；在膨胀样品的图像中，白色圆圈表示(C)中所示的肽分析的切样区域。(B)A中所示实验的膨胀前相比膨胀后脑切片图像的均方根(RMS)测量长度误差(n＝3、3和3个组织切片，各来自一只小鼠；脑、肝和肿瘤的平均LEF分别为5.8、6.5和6.2)。(C、D)不同类型的组织鉴定的肽数目(C)和蛋白质数目(D)(每种组织n＝3、3和3个打孔取样，各来自一只小鼠；5.6nL组织被打孔取样并通过DDA分析)。(E)在PulseDIA模式下分析的0.37nL脑组织的肽和蛋白质鉴定数目(来自一个切片的n＝3次打孔取样)。

具体实施方式

本发明的有益效果：把蛋白锚定到水凝胶，染色和均匀膨胀后，可以人工取到直径约100-1000(例如128-1000)微米的组织样品，对蛋白质进行精细的空间定位研究；把蛋白锚定到水凝胶里后，可以避免传统溶液内胰酶消化方法中蛋白大量丢失的问题；锚定在水凝胶中的蛋白，经变性除脂，膨胀后，可以更容易被胰酶消化，得到更多有效多肽片段；经本方案处理的微小组织样品可以鉴定出比传统溶液内胰酶消化以及第二代压力循环酶解法更多的蛋白量。所用化学试剂及处理条件，均可以廉价获得，更适合大规模应用，并且普通的生化和分析实验室和设施即可完成。

本文阐述的公开内容和实施方案应被解释为仅示例性，而不是限制本发明的范围。虽然本文采用了特定术语，除非另有说明，否则它们均以通用和描述性的含义使用，而不是用于限制的目的。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。

定义

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”意图还包括复数形式，除非上下文清楚地另外表明。

如本文所用，术语“膨胀”、“扩展”、“扩大”和“放大”可互换使用，且通常是指在与液体如水或其他溶剂接触时发生扩展或放大，例如在3个维度中均匀地扩展。可膨胀的材料优选是透明的，使得在扩展时光可以通过样品。如本文所示例的，可膨胀的材料可以是水凝胶。在一些实施方案中，可膨胀的材料由其前体、单体或低聚体聚合形成。例如，单体可以含有水溶性基团，该水溶性基团含有可聚合的乙烯键不饱和基团。单体或低聚体可包含以下一种或多种：取代或未取代的甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯醇、乙烯胺、烯丙胺、烯丙基醇，包括其二乙烯交联剂(例如、N,N-亚烷基双丙烯酰胺)。在一些实施方案中，可膨胀的材料是聚丙烯酸酯和其共聚物或交联共聚物。备选地，可膨胀的材料可以通过化学交联水溶性低聚物或聚合物原位形成。在本发明中，涵盖将可膨胀材料的前体溶液添加到样品中，使前体发生原位聚合和膨胀。

如本文所用，术语“膨胀蛋白质组学”是指将生物样品(通常为组织样品)可逆地锚定到可以均匀膨胀的水凝胶中，经蛋白变性、去锚定、染色可视化、膨胀、取样酶解消化得到多肽后，用于蛋白质组学分析(特别是空间蛋白质学分析)的方法。

对生物样品的膨胀蛋白质组学分析

本发明提供了一种对来自生物样品(例如组织切片)的空间不同区域的蛋白质进行空间组学分析的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将样品与水凝胶前体聚合形成样品-水凝胶复合体，对样品中的蛋白质染色，使样品-水凝胶复合体膨胀，从膨胀后的复合体上取样并进行蛋白质鉴定。进一步地，所述蛋白质鉴定包括通过质谱技术(例如LC-MS/MS)鉴定从复合体取样并提取的肽。

在一方面，本公开提供了对包含蛋白质的组织样品进行膨胀以获取微小组织样品的方法，其中以保留原始功能状态下的生物分子(例如蛋白质)的相对位置的方式形成样品-水凝胶复合体。由于保留了蛋白质的相对位置，通过对不同区域的凝胶取样和蛋白质鉴定，可以获得蛋白质在样品中不同位置的定位信息。

在一些实施方案中，本发明的方法包括一个或多个以下步骤：

1)任选地，将生物样品(固定或活的)进行预处理，例如免疫染色和/或用二硫键还原剂处理；

2)将生物样品用锚定剂处理，加入水凝胶前体溶液并发生聚合，从而形成样品-水凝胶复合体，其中锚定和聚合可以同时或顺序进行；

3)对样品-水凝胶复合体进行蛋白质变性和去锚定处理；

4)任选地，用有机溶剂如甲醇来洗涤样品-水凝胶复合体；

5)对样品-水凝胶复合体进行蛋白质染色，然后使其膨胀；和

6)从膨胀的样品-水凝胶复合体取样，用于蛋白质组学鉴定。

任选地，本发明还涵盖通过在高盐缓冲液中浸泡使样品-水凝胶复合体去膨胀，例如返回到其原始大小。因此，本发明的方法能够可逆地调节样品-水凝胶复合体的膨胀因子。

本发明还例示了一些可用于蛋白质锚定的化学锚定剂或其组合，这些化学锚定剂或组合能够更快地穿透较大的生物样品锚定生物分子。本文的方法不仅适用于细胞和薄样品，而且还适用于大或稠厚的样品。

本发明的方法中获得的水凝胶在扩展后具有高机械稳定性，从而允许其应用于扩展大型组织块、组织切片、整个器官甚至整个生物体，而不会在其自身重量下变形和机械分解，这与其他水凝胶不同。在一些实施方案中，形成所述水凝胶的水凝胶前体溶液或水凝胶制剂包含DMAA、SMA和PAE。

本发明的方法可以用于对不同的器官和组织的蛋白质组学(特别是空间蛋白质组学)研究，例如脑图谱、连接组研究以及新的诊断、个性化药物、组织病理学和其他医学用途。

用于水凝胶膨胀的生物样品

用于本公开中提供的水凝胶锚定和膨胀的组织样品可以是新鲜的、冷冻或固定的(即保存的)。组织样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官，或组织样品或活检样品或穿刺样品，包括保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。组织样品可以是日常临床实践中常规制备和保存的样品。经过固定的样品是使用固定剂(例如甲醛、多聚甲醛)进行了组织学保存的样品。固定可以在二硫键还原处理、蛋白锚定、胶凝反应之前、期间或之后完成。在某些实施方案中，在进行二硫键还原处理之前将目的样品固定。样品也可以包埋入固体和通常硬质的介质例如石蜡、蜡、火棉或树脂中，从而可以切割成薄切片用于处理。

固定可以通过常规方法进行。本领域技术人员将理解，根据将样品要组织学染色或以其他方式分析的目的来确定固定剂的选择。本领域技术人员还将理解，固定时间取决于组织样品的尺寸和所用的固定剂。举例来说，可以使用中性缓冲福尔马林、Bouin或多聚甲醛来固定样品。

在某些实施方案中，组织样品是薄组织切片(例如厚度可为5μm)，例如脑切片、肝切片或肿瘤切片。在一些别的实施方案中，用于扩展的样品是厚度大于400μm的组织样品或甚至是整个器官或其部分，所述器官包括但不限于脑、脊髓、心脏、肺、肝、肾、胃、结肠、骨骼、肌肉、皮肤、淋巴结、生殖器、乳腺、胰腺、前列腺、膀胱、甲状腺和眼部等。

对生物样品的二硫键还原处理

二硫键是连接蛋白质的不同肽链或同一肽链中，两个不同半胱氨酸残基的巯基的化学键。二硫键是比较稳定的共价键，在蛋白质分子中，起着稳定肽链空间结构的作用。二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界因素影响的稳定性就愈大。因此，为了促进后续过程中蛋白质与水凝胶的锚定，可以预先对样品进行二硫键还原处理以破坏其中的蛋白质分子的二硫键。

可以通过用还原剂处理来破坏样品中的二硫键。本领域中存在许多已知能够实现二硫键裂解的还原剂，常用的还原剂有硫醇如β-硫基乙醇(β-ME)或二硫苏糖醇(DTT)。通常要使用过量硫醇试剂保证二硫键的完全裂解。其它还原剂还例如TCEP。与β-ME和DTT不同，TCEP无味，有选择性，可以在碱性和酸性环境下工作(不像DTT)，更亲水，耐氧化。

在本发明的一些实施方案中，将生物样品与还原剂孵育足量的时间来进行二硫键还原处理，其中所述还原剂选自TCEP、β-ME和DTT。还原剂可以配制成溶液，例如可以将TCEP的盐酸盐形式溶于硼酸缓冲液中来制备TCEP溶液。

生物样品的锚定

为了形成可膨胀的样品-水凝胶复合体，将样品与化学锚定剂接触或用锚定剂溶液灌注组织样品，并孵育足够的时间以进行化学反应。

术语“锚定剂”和“交联剂”可以在本文中互换使用。化学锚定剂优选是包含生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团的双功能接头。在某些实施方案中，含有一种或多种功能性的化学锚定剂将反应基团附着于生物样品内的生物分子的功能团(例如，伯胺或巯基)，所述生物分子可以是蛋白质、核酸、脂质、蛋白聚糖、脂多糖等。由于本文的目的是研究蛋白质组学，所采用的锚定剂是偏向于锚定蛋白质的锚定剂。所述锚定剂使样品中的生物分子例如蛋白质功能化，从而在水凝胶聚合时与水凝胶聚合物的生长的链反应，由此将功能化的生物分子共价锚定到水凝胶网络上。

化学锚定剂通常以锚定剂溶液的形式提供。在一些实施方案中，通过将化学锚定剂溶解或稀释于水性缓冲液，例如PBS、MES缓冲液中来制备锚定剂溶液。锚定剂溶液还可以包含固定剂以在锚定的同时实施样品的固定。本领域技术人员可以容易地基于所选择的锚定剂确定配备锚定剂溶液的缓冲液。

在某些实施方案中，化学锚定剂包括两种不同的功能团，一种用于生物分子特别是蛋白质分子的功能化，第二种功能团用于与生长的聚合物链反应。生物分子的功能化可以在化学固定期间进行，即在活的样品或新冷冻的样品上进行，或化学固定之后即在固定和保存了的样品上进行。如本领域技术人员理解的，双功能化学锚定剂的两种不同的功能团可以通过各种长度和结构的化学间隔物(包括支链间隔物)分隔开来。

在一些实施方案中，生物分子反应性化学基团包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、环氧基、醛基、甲酰胺基团，其可以与蛋白质、肽和/或核酸和/或脂质上的氨基或羧酸基团反应。水凝胶反应性基团包括但不限于乙烯基、烯丙基、丙烯酸根、甲基丙烯酸根、丙烯腈、丙烯酰胺基团。

在一些优选的实施方案中，用于将蛋白质直接与任何水凝胶聚合物链交联的化学锚定剂选自丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSA)、N-(烯丙氧基羰氧基)-琥珀酰亚胺(NAS)、或其组合。用NSA或NAS处理分别用丙烯酰胺或烯丙氧基羰基氧酰胺基功能团修饰蛋白质上的胺，其允许功能化蛋白在聚合过程中锚定到水凝胶。

在一些实施方案中，化学锚定剂包含NSA。在另一些实施方案中，锚定剂包含NAS。在再一些实施方案中，锚定剂包含NAS和NSA两者，例如1:1摩尔比的NAS和NSA。锚定剂可以以不同比率在锚定缓冲液中稀释，例如约1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:150、1:200，取决于选择的缓冲液和锚定剂、期望的反应速率和锚定效果等。

水凝胶聚合/成胶反应

如上公开的，用水凝胶前体溶液渗透(例如灌注、注入、浸渍、添加或其他混合方式)样品或将样品埋入水凝胶前体溶液中，然后发生聚合形成可膨胀的样品-水凝胶复合体。该复合体包括可膨胀的聚合物网络，其中样品内的蛋白质分子(已由锚定剂功能化或正通过锚定剂功能化)与水凝胶的聚合物链共价结合。

水凝胶前体溶液通常包含溶解在水性溶液(例如水或添加有酸以调节pH的水溶液)中的一种或多种水凝胶单体、低聚物或前体。与水凝胶相关的术语“单体”或“前体”可以在本文中交换使用，包括构建水凝胶聚合物链的小单元的单体、共聚单体和交联剂。除了水凝胶前体之外，水凝胶前体溶液还可以在使用前加入聚合活化剂或促进剂，例如VA-044、V50、APA、过硫酸钾和TEMED。通常将水或水性溶液用作形成水凝胶前体溶液中的分散介质，但也可以使用其他溶剂。

水凝胶前体将与样品一起聚合和/或交联以形成水凝胶-样品复合体。在某些实施方案中，水凝胶的前体包含但不限于，丙烯酸钠(SA)，甲基丙烯酸钠(SMA)，衣康酸(IA)，反式乌头酸(TAA)，乙基-2-(羟甲基)-丙烯酸酯(EHA)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA，又称为BIS)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)，季戊四醇四丙烯酸酯(PT)，丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)，季戊四醇三丙烯酸酯(PA)，二季戊四醇五丙烯酸酯或二季戊四醇六丙烯酸酯(DPHA)，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TTA)，二(三羟甲基丙烷)-四丙烯酸酯(DiTA)，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TTMA)，甘油丙氧基化(1PO/OH)三丙烯酸酯(GPT)，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TET)，季戊四醇烯丙基醚(PAE)，4-羟基-2-亚甲基丁酸钠(SHMB)，N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺(DMPAA)和/或丙烯酰胺(AA)的一种或多种。所有试剂均是市售的，化学稳定且相对安全(可用于常规生物实验室)。

例如，如果要将目的样品埋入聚丙烯酸钠类的水凝胶中，则在整个样品中灌注包含单体丙烯酸钠和丙烯酰胺以及锚定剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的溶液。在灌注前向溶液中添加聚合促进剂或引发剂，从而在样品渗透时溶液也被激活以形成水凝胶的聚合物。优选地，这类包含单体的溶液是水性的。

期望水凝胶在扩展状态下保持高机械稳定性以实现可调节和可逆地膨胀。为此，水凝胶的前体可选自N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酸钠(SMA)和季戊四醇烯丙基醚(PAE)，优选地同时包含三者。或者水凝胶的前体可选自N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酸钠(SMA)和丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)，优选地同时包含三者。在某些实施方案中，前体中包含DMAA、SMA和PAE，其中DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，例如在20:1至3:1的范围内，在15:1至3:1的范围内，在10:1至3:1的范围内，在9:1至3:1的范围内，在8:1至3:1的范围内，在7:1至3:1的范围内，在6:1至3:1的范围内，在5:1至3:1的范围内，在4:1至3:1的范围内，更具体地，DMAA:SMA的摩尔比可以是约4:1或3:1；而且，其中SMA:PAE的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内，例如在10:0.05至10:3、10:0.08至10:3、10:0.1至10:3、10:0.2至10:3、10:0.3至10:3、10:0.4至10:3、10:0.5至10:3、10:0.6至10:3、10:0.7至10:3、10:0.8至10:3、10:0.9至10:3、10:1至10:3、10:1.1至10:3、10:1.2至10:3、10:1.3至10:3、10:1.4至10:3、10:1.5至10:3、10:2至10:3的范围内，更具体地，SMA:PAE的摩尔比可以是约10:0.05、10:0.08、10:0.1、10:0.5、10:1、10:1.1、10:1.2、10:1.3、10:1.4、10:1.5、10:1.6、10:1.7、或10:1.8。在一些实施方案中，PAE可被TPT替代。

进一步地，在某些实施方案中，前体中包含DMAA、SMA和PAE，DMAA:SMA:PAE的摩尔比在(40±20):(10±5):(0.005-2)的范围内，如约(40±15):(10±3.5):(0.4±0.2)、约(40±10):(10±2.5):(0.4±0.2)、约(40±5):(10±2):(0.4±0.2)、约(40±5):(10±1.2):(0.4±0.2)、约(40±5):(10±1):(0.4±0.1)的范围内。在另一些实施方案中，前体中包含DMAA、SMA和PAE，其中以摩尔数计，若DMAA为20-60份，则SMA为5到15份，PAE为0.005到1.5份。具体地，DMAA:SMA:PAE的摩尔比可以是约30:10:1、40:10:0.008、40:10:0.4、40:10:1、40:10:1.2、或40:10:1.5。

可以通过向水凝胶的前体添加水或水性溶液(例如添加有酸来调节pH的水溶液)或通过溶解于水或水性溶液来配制成前体溶液。例如，前体溶液中包含的水凝胶前体的浓度可以在30-60％质量分数(w/w)的范围内，例如30％、40％、50％或60％。可以制备水凝胶前体溶液的储备溶液并在使用前稀释。储备溶液可具有高浓度(w/w)的前体，例如约50％或更高，约75％或更高，约80％或更高，约90％或更高。在应用到样品上时，储备溶液可稀释成约30-50％的浓度。

如实施例中例示的，使用DMAA、SMA和PAE作为前体，获得的水凝胶具有优越的机械强度和扩展因子性质。可以以各种比例混合前体以形成能在水性缓冲液中可调节和可逆地膨胀至在线性维度中多达7倍以上的水凝胶。发明人发现，DMAA:SMA:PAE可以以广泛范围内的多种比例混合在一起并且也能形成期望的水凝胶。

具体地，在一个实施方案中，DMAA：SMA：PAE以摩尔比40：10：0.4混合。水凝胶前体溶液可以通过将DMAA、SMA和PAE混合到水中来制备。水凝胶前体溶液的pH范围优选为6-7，例如约6.5。水凝胶前体溶液可以在使用前新鲜配制，或者制备成储液并在使用前稀释。

在准备聚合前，可以向水凝胶前体溶液添加聚合活化剂和/或促进剂以诱导聚合或凝胶化，所述活化剂和/或促进剂例如但不限于过硫酸铵、过硫酸钾、TEMED、VA-044或其组合。

在一些实施方案中，将组织样品用包含如上所述的化学锚定剂、水凝胶前体和聚合活化剂/促进剂的溶液灌注，即同时进行锚定和成胶反应。或者，在与水凝胶前体溶液接触之前用锚定剂处理待凝胶化的样品，即先进行锚定然后进行成胶反应。

蛋白变性和去锚定

在蛋白质分子中各氨基酸通过肽键及二硫键结合成具有一定顺序的肽链，多肽链中的氨基和酰基之间可以形成氢键或肽链间形成氢键，使得这一多肽链的主链具有一定的有规则构象，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和Ω-环等，在二级结构的基础上进一步盘曲折叠，形成一个完整的空间构象，多条肽链再通过非共价键聚集形成空间结构。

优选地，对成胶反应形成的样品-水凝胶复合体进行蛋白质变性处理(本文中也称为“匀浆化/均质化”)，从而破坏蛋白质的空间结构以利于后续膨胀。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构(但一级结构并未改变)将蛋白质转变为一级结构，这样在样品-水凝胶复合体膨胀时，蛋白质也随之膨胀。

在一些实施方案中，变性或均质化通过用基于SDS的缓冲液处理样品，从而通过变性去除蛋白质-蛋白质相互作用，使得组织-水凝胶复合体机械地均质化。在本发明的一些实施方案中，在成胶反应后，通过表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基苯磺酸钠(SDBS)等对样品-水凝胶复合体进行蛋白质变性处理。

进一步优选地，本发明还涵盖在对蛋白质变性后进行去锚定处理，主要是通过破坏/断裂蛋白质与水凝胶网络之间锚定形成的酰胺键，从而将蛋白质从样品-水凝胶复合体上去锚定。去锚定可以通过提高溶液pH值至碱性(例如通过加入Tris溶液)，将酰胺键断裂来进行。

样品-水凝胶复合体的膨胀

在形成样品-水凝胶复合体之后，对蛋白质进行变性和去锚定处理，然后通过蛋白质染色(通常为考马斯蓝染色)以可视化样品中的蛋白质分子。将溶剂或液体加入到样品-水凝胶复合体中，然后由复合体吸收并引起膨胀。当样品-水凝胶复合体是水可膨胀时，可以使用水溶液。由于聚合物将整个组织样品包埋，随着聚合物膨胀(生长)，它也会扩展样品。因此，组织样品本身会变得更大。例如，在纯水或水性缓冲液中孵育后，该复合体的体积可以膨胀约10倍，从而极大地提高了微小取样用于蛋白质鉴定的能力。可以根据需要通过调整孵育时间、水性缓冲液的摩尔渗透压浓度、温度等来获得不同的样品膨胀因子。

贯穿样品形成的可膨胀聚合物的分子链扩展将生物分子分开，使得组织样品本身变得更大。重要的是，膨胀后生物分子的相对位置保持不变。随着材料在各向同性上膨胀，蛋白质的染色标记保持其相对的空间关系。一旦扩展，可以探测组织中一种或多种蛋白质的存在和/或位置。如实施例中所示，得到线性膨胀6倍左右的可视化组织样品，用直径毫米尺度的打孔器，能取到原始直径500微米的微小组织样品，从而大大拓展了组织取样的精度。

在一些实施方案中，本文公开的方法可包括锚定、成胶和染色过程的不同组合。在某些实施方案中，加入纯水或其它水性缓冲液允许样品-水凝胶复合物在线性维度中从样品初始尺寸扩展高达约5-8倍，并保持高机械稳定性和弹性。机械稳定性和弹性均允许容易地处理扩展的样品，而不会使样品水凝胶复合体机械变形从而保持其完整性。

质谱分析

传统的对蛋白质组学鉴定方法涉及以下几个步骤之一：用水性或有机溶剂从组织表面进行微提取，多个相邻组织区域的组织均质化，对目的区域的激光捕获显微切割(LCM)收集，或者对大柱子的高效液相色谱(HPLC)分级，并将这些级分的等分试样进行MS分析以确定哪些级分含有目的蛋白质。

在一些实施方案中，对蛋白质的鉴定采用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用进行。液相色谱(LC)能够有效地将有机物待测样品中的有机物成分分离开，而质谱(MS)能够对分开的有机物逐个的分析，得到有机物分子量、结构和浓度的信息。HPLC-MS是本领域中常规采用的对大分子量化合物，例如蛋白、多聚体进行分析测定的手段。

将质谱数据与蛋白质数据库匹配是蛋白质组学鉴定的核心。目前大部分蛋白质组学研究使用的多为胰蛋白酶，它能够特异性地酶解赖氨酸和精氨酸残基的羧基端。尽管胰蛋白酶的酶切特异性很高，但胰酶漏切现象在蛋白质的鉴定中并不罕见。因此，通过分析漏切比例可以评估不同生物样品处理条件的优劣。

试剂盒

本公开还提供了用于实践所述方法的试剂盒。所述试剂盒可以在一个或多个容器中包含如上描述的用于形成水凝胶的前体和/或锚定剂，以及任选地，蛋白质二硫键还原剂、蛋白质变性剂、染色液、各种缓冲液等。优选地，所述前体是DMAA、SMA和PAE/TPT。所述前体可以存在于分别的容器中，例如DMAA在第一容器中(例如以固体或溶液形式)，SMA在第二容器中(例如以固体或溶液形式)，而PAE/TPT在第三容器中(例如以固体或溶液形式)，在使用前进行混合和配制。

备选地，也可以采用以下任一种形式：将DMAA和SMA以适合的比例混合放置于第一容器中，而PAE/TPT存在于第二容器中；将DMAA和PAE/TPT以适合的比例混合放置于第一容器中，而SMA存在于第二容器中；将SMA和PAE/TPT以适合的比例混合放置于第一容器中，而DMAA存在于第二容器中。这些容器可以以组合在一起的构型，或者是完全分开的。

在一些别的实施方案中，试剂盒可以包含其中存在DMAA、SMA和PAE/TPT的混合物的容器，其中DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，例如在20:1至3:1的范围内，在15:1至3:1的范围内，在10:1至3:1的范围内，在9:1至3:1的范围内，在8:1至3:1的范围内，在7:1至3:1的范围内，在6:1至3:1的范围内，在5:1至3:1的范围内，在4:1至3:1的范围内，更具体地，DMAA:SMA的摩尔比可以是约4:1或3:1；而且，其中SMA:PAE/TPT的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内，例如在10:0.05至10:3、10:0.08至10:3、10:0.1至10:3、10:0.2至10:3、10:0.3至10:3、10:0.4至10:3、10:0.5至10:3、10:0.6至10:3、10:0.7至10:3、10:0.8至10:3、10:0.9至10:3、10:1至10:3、10:1.1至10:3、10:1.2至10:3、10:1.3至10:3、10:1.4至10:3、10:1.5至10:3、10:2至10:3的范围内，更具体地，SMA:PAE/TPT的摩尔比可以是约10:0.05、10:0.08、10:0.1、10:0.5、10:1、10:1.1、10:1.2、10:1.3、10:1.4、10:1.5、10:1.6、10:1.7、或10:1.8。

进一步地，在某些实施方案中，前体中包含DMAA、SMA和PAE/TPT，DMAA:SMA:PAE/TPT的摩尔比在(40±20):(10±5):(0.005-2)的范围内，如约(40±15):(10±3.5):(0.4±0.2)、约(40±10):(10±2.5):(0.4±0.2)、约(40±5):(10±2):(0.4±0.2)、约(40±5):(10±1.2):(0.4±0.2)、约(40±5):(10±1):(0.4±0.1)的范围内。在另一些实施方案中，前体中包含DMAA、SMA和PAE/TPT，其中以摩尔数计，若DMAA为30-50份，则SMA为5到15份，PAE/TPT为0.005到1.5份。具体地，DMAA:SMA:PAE/TPT的摩尔比可以是约30:10:1、40:10:0.08、40:10:0.4、40:10:1、40:10:1.2、或40:10:1.5。

所述试剂盒还可以包含具有锚定剂的容器，锚定剂可以是NAS或NSA。所述试剂盒还可以包含具有聚合活化剂或加速剂的容器，以在聚合之前将其添加到水凝胶的前体中。所述聚合活化剂或加速剂可以选自例如VA-044、TEMED、过硫酸钾和APS。

所述试剂盒还可以包含以下一种或多种：包含二硫键还原剂(例如TCEP)的容器；包含固定剂(例如多聚甲醛)的容器；包含蛋白变性缓冲剂(例如SDS)的容器；包含蛋白质染色液(例如考马斯亮蓝染色液)的容器；和包含用于对样品中的蛋白进行消化的酶的容器。任选地，所述试剂盒还包含几种常见的缓冲液从而方便执行本发明的方法。

容器应理解为是指可以容纳或围绕水凝胶制剂、锚定剂等的组分的任何结构；示例性容器包括瓶(例如塑料瓶或玻璃瓶)，注射器，小瓶，小袋，胶囊，安瓿，药筒等。通过使用其他组件(例如，围绕小瓶的铝箔袋)或通过选择容器本身的材料属性(例如，琥珀色玻璃小瓶或不透明的塑料瓶)，可以使容器免受可见光、紫外线或红外线的辐射。

试剂盒还可包括混合装置，用于将前体混合在一起以产生本发明的水凝胶制剂。试剂盒还可以包括凝胶操作装置，例如软刷、镊子和/或递送设备(可以包括或可以不包括混合元件)等等，用于将水凝胶溶液灌注到样品上或转移凝胶。

在一些实施方案中，试剂盒包含以下一种或多种组件：凝胶室，配置为用于在凝胶化之前容纳样品，例如具有腔室或凹槽的皿；凝胶操作工具，例如镊子、软毛笔；打孔器；降温装置，例如冰袋；多个Eppendorf管、离心柱等。

试剂盒还可以包括其他组分/组件，例如例如干燥剂或其他保持试剂盒中水含量控制的手段，指示试剂盒温度的指示器等，这些成分可能是在运输和储存试剂盒过程中保持良好的状态所需要的。

在一些实施方案中，试剂盒包括用于形成如上所述的样品-水凝胶复合物的凝胶化室。腔室被配置为包括腔，孔或孔，用于在胶凝之前容纳样品，例如以皿的形式，例如MatTek皿。胶凝室还可包括覆盖腔，孔或孔的盖(例如盖玻片)。

在一些实施方案中，试剂盒还包括配置成在凝胶化之后容纳样品的膨胀室。该试剂盒可包括包装在一起的多个器皿以方便使用。

除上述成分和组件外，试剂盒通常还包括使用试剂盒的成分实施本发明方法的说明书。通常将用于实施本发明方法的说明书记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在诸如纸或塑料等的材料上。这样，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，在试剂盒或其组分的容器的标签中。在其他实施方案中，指令作为电子存储数据文件存储在合适的计算机可读存储介质上，例如，在其他实施方案中，试剂盒中不存在实际的说明书，而是从远程源(例如，光盘)获得说明书。该实施方案的一个示例是一种试剂盒，其包括网址，在该网址上可以查看和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段被记录在合适的材料上。

本发明提供的ProteomEx方法提供了几个优点，包括例如：

1.提供了对空间蛋白质组学鉴定的取样和分析方法的改进，能够更精确地获取样品中特定位置处的蛋白质信息；

2.在蛋白处理的过程中与本领域中的标准方法相比能够获得更多有效的蛋白片段和更低的漏切比例；和

3.能够以低成本方式通过试剂盒方便地进行，并且对于普通技术人员来说，相比于其他空间蛋白质组学鉴定方法操作难度明显降低。

提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，并且不被解释为限制本发明的范围。下面的所有特定组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些特定的组合物，材料和方法不旨在限制本发明，而是仅仅例示了落入本发明的范围内的具体实施方案。

实施例

试剂和材料的准备

PFA(4％多聚甲醛固定液)

2.5毫升的16％的多聚甲醛固定液，1毫升的10XPBS(磷酸盐缓冲液)，加6.5毫升三蒸水，可室温保存。

40X硼酸缓冲液(50毫升)

称3.1克硼酸(终浓度1摩尔)，1克氢氧化钠(终浓度0.5摩尔)，加三蒸水到50毫升，室温保存。

TCEP-HCl即三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液(0.5摩尔)

称5.73克三(2-羧乙基)膦盐酸盐，加25毫升三蒸水溶解，用5摩尔的氢氧化钠调pH至7，然后加三蒸水到40毫升，-20℃保存。

二硫键还原溶液

加1毫升40X硼酸缓冲液，加4毫升0.5摩尔的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，加35毫升三蒸水，4℃保存。

MES缓冲液

100毫摩尔MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，pH 6，溶于三蒸水中，4℃保存。

蛋白锚定液

0.1毫克/毫升的丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSA)溶解在100毫摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，4℃保存。

MOPS缓冲液

100毫摩尔的3-吗啉丙磺酸缓冲液，pH 7，4℃保存。

季戊四醇烯丙基醚(PAE)溶液

0.115克/毫升，0.4微摩尔，溶解在四氢呋喃中，4℃密封保存。

水凝胶前体溶液

N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酸钠(SMA)和季戊四醇烯丙基醚(PAE)按照40:10:0.4的摩尔比例配制，例如称3.137克N,N-二甲基丙烯酰胺，0.8624克甲基丙烯酸钠，加入77微升季戊四醇烯丙基醚溶液，350微升10％盐酸，4.6615微升三蒸水，配成单体溶液，4℃保存。

活化的水凝胶前体溶液

吸取900微升前体溶液，加入30微升新配的质量分数10％的过硫酸铵(APS)，加入20微升质量分数10％的四甲基乙二胺(TEMED)，再加入50微升三蒸水，配成活化单体溶液，现用现配。

蛋白变性缓冲液

称28.7克十二烷基磺酸钠(终浓度0.2摩尔)，1.545克硼酸(终浓度50毫摩尔)，加三蒸水到500毫升，混合均匀，室温保存。

快速考马斯亮蓝染色液

将市售8毫升的考马斯亮蓝浓缩液，用三蒸水配至1升，室温保存。

实施例1：水凝胶前体溶液的测试

测试了包含不同比率的SMA：DMAA：PAE的水凝胶前体溶液形成水凝胶的扩展因子和机械强度。聚合启动剂为VA-044或过硫酸钾(KPS)。发明人发现，SMA+DMAA+PAE的组合在较宽比率范围内均获得具有期望的膨胀因子和机械强度的凝胶(表1)，表明SMA+DMAA+PAE的不同比率的组合均适用于成功地配制成水凝胶。SMA+DMAA+TPT的组合也可得到类似的效果。膨胀因子是通过比较成胶后样品的大小和成胶膨胀后样品的大小(比如长和宽)计算得出的线性比率。在加纯水膨胀到最大倍数，凝胶不破裂，判定为该凝胶机械强度较好。膨胀因子和机械强度均符合期望的判断为达到凝胶较好的效果。

表1

*用于实施例3和4的ProteomEx与其他方法的比较

实施例2：对脑切片的样品-水凝胶膨胀取样和质谱分析

1.二硫键还原

加200微升的PBS(磷酸盐缓冲溶液)到35毫米的激光共聚焦皿的腔室里，用小毛笔把经4％PFA(多聚甲醛)固定过的30微米的脑片转移到腔室里；然后吸走腔室里的PBS(磷酸盐缓冲溶液)，加进200微升的二硫键还原溶液(包含50毫摩尔的TCEP-HCl即三(2-羧乙基)膦盐酸盐)，盖上盖子，室温下孵育2小时。

2.蛋白锚定

吸走二硫键还原溶液，用100毫摩尔的MES缓冲液冲洗3次；用200微升蛋白锚定液室温孵育6小时以上。用200微升的100毫摩尔的MOPS缓冲液冲洗3次。

3.成胶反应(PAE-0.5)

在200微升的活化单体ATMS溶液(包含APS和TEMED的活化单体溶液)中在4℃孵育6小时以上；吸走溶液，用软毛笔将组织切片平铺到激光共聚焦小皿的腔室底部，晾干，使组织切片贴紧到腔室底部；用一个几毫米厚的玻璃片盖住腔室里的组织切片，留一个小的缝隙，再次加入活化单体溶液，室温孵育30分钟左右；将盖上盖子的激光共聚焦小皿放进撒了三蒸水并预热到37度的真空干燥箱，用真空泵将真空干燥箱抽至半真空，然后通氮气到正常大气压水平，重复4次；让自由基聚合反应进行1.5小时，使活化单体溶液充分聚合形成水凝胶。

4.蛋白变性(SDS)和去锚定

将形成的凝胶转移到6孔板中，加入8毫升的蛋白变性缓冲液，在95度孵育3小时。将凝胶转移到6厘米的皿中，加入10毫升50毫摩尔的pH 8.8的tris缓冲液，室温洗脱三次，每次半个小时左右。

5.甲醇洗脱

加入50％甲醇水溶液，室温洗脱三次，每次20分钟左右。

6.考马斯亮蓝染色及膨胀

加入10毫升快速考马斯亮蓝染液，95℃孵育1小时以上到凝胶颜色变成黑蓝；把凝胶转移到10厘米皿中，加入三蒸水，95度孵育1小时，洗脱三次，直到除了组织之外区域变成透明，得到直线膨胀5倍左右的组织样品(图3)。

7.微小组织取样

用3毫米的打孔器，挑取目标组织微小区域。按照图2中所示的孔的顺序记录位置和编号。将每块组织分别置于1.5ml EP管中并记录对照脑地图中的脑区域。取样后，将样品置于-4℃用于以后操作。

8.甲醇清洗

向每个EP管添加100uL 50％甲醇并以600rpm在25℃孵育15分钟，然后弃去甲醇溶液，用ddH₂O清洗，然后重复上述步骤三次。

9.消化

通过添加25mM碳酸氢铵(ABB)将胰蛋白酶稀释至终浓度12.5ng/ul。向每个管添加该胰蛋白酶溶液，并在37℃孵育4小时，然后向每个管再次添加胰蛋白酶溶液，并在37℃孵育12小时。

10.肽提取(在室温)

以1000g离心3分钟，然后将溶液收集到新的Eppendorf管中(溶液A)，添加150ul的25mM ABB并以600rpm离心10分钟，将溶液收集到相应的Eppendorf管中(溶液B)。加入150ul50％ACN/50％25mM ABB，以600rpm孵育10分钟。将溶液收集在相同的Eppendorf管中(溶液C)。添加150ul 50％ACN/50％ddH₂O/2.5％FA并以600rpm孵育30分钟。收集上述Eppendorf管中的溶液(溶液D1)。添加150ul 50％ACN/50％ddH₂O/2.5％FA并以600rpm孵育10分钟。相应地收集溶液(溶液D2)。加入150ul 100％ACN并以600rpm孵育10分钟。类似地收集溶液(溶液E)。重复此步骤直到凝胶变白变粘为止。将所有溶液(溶液A，B，C，D1，D2和E)合并以15000g离心10分钟，将上清液收集在新的Eppendorf管中。

肽干燥：真空泵预热20分钟，在40℃，6-7mbar下开始最终干燥4小时，然后在-20℃保存。

肽溶解：使用30ul 2％ACN/0.1％TFA溶解肽。

11.脱盐

将Micro Spin柱放在新的长EP管中，用20μl MeOH离心洗涤Micro Spin柱，然后将它们放在新的长EP管中，用20μl 80％ACN 0.1％TFA离心洗涤，用20μl 2％ACN平衡，加载30μl肽溶剂，离心。用20μl 2％ACN洗涤，离心。

洗脱：更换cup(带有最终标签)，并用30μl 40％ACN 0.1％TFA洗脱两次，以1200rpm离心5分钟。在SpeedVac中干燥样品。在45℃6-7毫巴下离心4个小时。

12.重新溶解

使用10ul MS缓冲液(2％ACN,0.1％FA)重新溶解肽，然后离心。随后将上清液转移到小管中用于质谱检测。

13.数据采集

将8ul(8/10)肽在90分钟内注射到HPLC-MS/MS(timsTOF)中。

HPLC设置

缓冲液A：100％H₂O,0.1％FA

缓冲液B：100％ACN,0.1％FA

Trap柱：Thermo,3um

质谱柱：BPRC,1.9um,15cm

流速：0.3uL/min

梯度：5％-27％缓冲液B(0-80min)，27％-40％缓冲液B(80-90min),40％-80％缓冲液B(90-92min)，80％-80％缓冲液B(92-95min)。

14.数据查询

使用MS Fragger(V13.0)进行数据鉴定。

15.溶液内酶解(对照)

收集鼠脑切片组织样品，加入pH＝10的Tris HCl，在95℃条件下进行30分钟的水解反应，接着，加入裂解液，并在超声条件下进行裂解，裂解后的蛋白中先加入还原试剂，常温避光下孵育30分钟，随后继续加入烷基化试剂，25℃反应30分钟。接着，加入胰蛋白酶进行消化反应，共消化16个小时。消化结束后，加入0.1％三氟乙酸终止消化并除盐。获得的多肽样本通过HPLC-MS/MS进行数据依赖采集(DDA)。最终，蛋白组学数据通过MSFragger软件进行解谱并对蛋白质的鉴定数目进行分析。

16.压力循环酶解(对照)

收集鼠脑切片组织样品，加入裂解液后，利用压力循环技术(PCT)进行裂解，机器在50s，45,000psi与10s常压的循环程序下，进行90个循环裂解。裂解后的蛋白加入还原与烷基化试剂进行反应。接着，加入lysC与胰蛋白酶进行PCT辅助的消化，条件设置为120个循环，每个循环由50s，20,000psi与10s常压组成。消化结束后，加入0.1％三氟乙酸终止消化并除盐。获得的多肽样本通过HPLC-MS/MS进行数据依赖采集(DDA)。最终，蛋白组学数据通过MSFragger软件默认参数进行解谱并对蛋白质的鉴定数目进行分析。

17.结果

表2例示了每毫克的脑片样品分别经膨胀胶酶解、溶液内酶解或压力循环酶解后的多肽产率。多肽产率为每mg组织中提取的多肽量。从结果中可以发现膨胀胶酶解的多肽产率48.36μg/mg远远高于传统的溶液内酶解26.01μg/mg，此外也高于压力循环装置辅助的酶解效率(32.31μg/mg)。此方法证明了膨胀胶酶解的高效性，可以有效提取用于后续蛋白组分析的多肽。图4显示了膨胀胶酶解3mm打孔器取样后获得的多肽数目和鉴定的蛋白质种类数量。

表2

图5显示了三份同样的脑片样品分别经膨胀胶酶解、溶液内酶解或压力循环酶解(即PCT辅助酶切)后相应的鉴定的蛋白种类数量(图5A)和漏切比例(图5B)。漏切比例为漏切肽段数量占软件鉴定到的所有肽段数量的比例。三种方法比较的结果显示，膨胀胶可以得到与其他两种方法相当的蛋白质种类数量的鉴定结果，而且具有最低的漏切比例。膨胀胶的方法所得到的结果标准偏差更小，稳定性更好(图5A)。同时，可以显著降低漏切比例，增加胰蛋白酶酶切效率(图5B)。

实施例3.ProteomEx与本领域常用的其他方法在肽产率、痕量样品量、漏切率方面的比较

由于ProteomEx涉及组织的化学处理和膨胀，因此量化肽提取的效率并验证该方法可实现的定性和定量的可重复性和灵敏度非常重要。

首先，我们决定测量肽产率和漏切率作为样品准备的质控的主要参数。对于基准测试，我们使用了成熟的溶液内消化和压力循环技术(PCT)辅助的组织消化方法，这些方法广泛用于基于MS的蛋白质组学分析中的组织处理。我们还使用proExM-MS方法用于基准测试中与ProteomEx的比较。

根据以下方案进行proExM-MS的组织扩增：首先，用PBS中0.1mg/mL的6-((丙烯酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(AcX)处理PFA固定的小鼠脑组织，在22℃的潮湿室中过夜。新制备的单体溶液(8.6％(w/v)丙烯酸钠、30％(v/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺(30％溶液；37.5:1)、2M NaCl、0.01％(w/v)4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(4-羟基TEMPO)抑制剂溶解在1xPBS中并添加0.2％(w/v)TEMED和0.2％(w/v)APS，沉积在组织切片上并均匀铺在凝胶室内，然后盖上载玻片并在4℃孵育2h。聚合在真空烘箱(DZF-6000，上海日出仪器)中于37℃进行2h。用5％SDS在水中在58℃的湿度箱中孵育过夜进行均质化。对于膨胀，将凝胶在水中冲洗并放入过量体积的双去离子水中约1小时以膨胀，同时每15分钟换水一次。proExM-MS样品没有使用考马斯染色。

使用所选方法处理相邻的小鼠脑组织切片显示，ProteomEx的肽提取产率比溶液内消化、PCT和proExM-MS的肽提取产率高约1.4-1.7倍，具体为72.54±6.17μg肽/mg组织(除非另有说明，均为均值±标准偏差(SD))，溶液内酶解、PCT和proExM-MS则分别为44.59±18.54μg、43.58±11.59μg和50.78±9.33μg(图6A)。

此外，ProteomEx的特征包括，与溶液内酶解和PCT方案的27.96±1.4％和24.07±1.2％相比，漏切的数量较低(20.4±1.0％)，尽管与proExM-MS相似(21.1±5.4％；图6B)。使用ProteomEx和proExM-MS实现的更高的肽消化和提取效率可能是由于分子在扩展状态下的去拥挤为酶分子提供了更好地接近蛋白水解位点。这些结果表明，与用于组织样品的溶液内酶解和PCT辅助样品准备方法以及概念上相似的proExM-MS方法相比，ProteomEx中使用的组织膨胀方案提供了更高的肽提取效率。

接下来，使用timsTOF Pro质谱仪以数据相关采集(DDA)模式分析提取的肽。通过处理每个样品中约200ng的肽，我们鉴定了37,173、34,304、20,413和30,630个肽，对应于分别使用溶液内、PCT、proExM-MS和ProteomEx方法准备的每个样品平均4199、4278、3181和3818个分别的蛋白质(图6C，6D)。与溶液内酶解方法相比，ProteomEx、proExM-MS和PCT的肽和蛋白质数量的变化较低，表明这些方法的可重复性更高。ProteomEx鉴定的蛋白质数量比溶液内和PCT方法鉴定的蛋白质数量少约400个，但比proExM-MS鉴定的蛋白质数量多637个。

四种方法鉴定出的所有蛋白质的多样性有56.6％的重叠，每种方法唯一鉴定的蛋白质占蛋白质总数的不到7.0％(图6E)。鉴定的蛋白质的重叠是合理的(>50～60％是用于数据分析的DDA模式的典型重叠)，并且足够高以表明ProteomEx的性能与基于MS的蛋白质组学中用于样品处理的方法相当。此外，所有四种方法都通过生物标志物、亚细胞定位和生物学功能表现出相似的鉴定蛋白质的分布(图6F)。总体而言，上述结果表明，ProteomEx可以获得高质量的蛋白质组，并且在蛋白质鉴定的数量和类型方面与其他可用方法相当，满足了蛋白质组学分析的需要。

用比色染料对膨胀组织进行染色有助于用肉眼观察精细的形态特征，并通过手动显微切割(低至约100μm的实际尺寸)精确定位感兴趣的区域。为了验证MS分析的这种能力，我们使用活检打孔器，它提供了高度可重复的微量取样，以从同一个膨胀的小鼠脑组织切片切除3mm直径的组织-水凝胶复合体块(对应于直径约500μm或膨胀前的5.9nL组织体积)和相邻的空白水凝胶块(用作组织外可能的肽扩散的对照)，并如上所述使用纯MS缓冲液作为阴性对照进行分析。我们平均每个打孔样品鉴定出24,437/3541个肽/蛋白质，这远高于空白水凝胶(416/132个肽/蛋白质)和MS缓冲液(260/116个肽/蛋白质，对应于残留水平；图6C、6D)，和相似的通过亚细胞定位的蛋白质分布和对于成批样品分析观察到的生物学功能(图6F)。

与其他测试方法相比，ProtemoEx方法在脑组织的大样本和微样本制备中显示出相当的蛋白质定量可重现性(图7)。此外，ProteomEx没有对回收的肽进行化学修饰，并且在肽翻译后修饰的定性和定量方面表现出与其他方法相似(图8)。因此，肽可以有效地从膨胀组织的小块中提取，并且扩散到组织周围的空白水凝胶中的扩散可忽略不计。而且，与通过ProteomEx处理的全脑切片相比，3mm凝胶鉴定的肽数目略少，而蛋白质数量相当。

接下来，我们使用ProteomEx方法探索了组织微取样的体积依赖性限制。用实际体积约为0.6、2.4、5.4、9.6和15.0nL(对应横向分辨率约为160、320、480、640、800μm)处理显微切割的小鼠脑冠状切片，我们鉴定了2987、15,705、23,898、35,160和37,071个肽，分别对应于每个大小组平均928、3044、4203、5058和5105种独特蛋白质(图6G，6H)。正如预期的那样，鉴定的肽和蛋白质的数量随着组织体积增加，组织体积在约5.0nL组织大小(或直径480μm)时达到平台。PCT辅助样品制备作为处理小样品的代表性方法，能够有效分析0.2-1μL范围内的组织体积，比ProteomEx高出约三个数量级。尽管由于样品注入量较大，PCT鉴定的肽和蛋白质更多，但与PCT相比，ProteomEx在处理小样品量时表现出更高程度的可重复性(图6G，6H)。ProteomEx为蛋白质组学分析的亚纳升体积样品的准备提供了一种新策略，在肽产率、痕量样品大小、漏切率方面优于该领域的其他常用方法。

实施例4：ProteomEx可以应用于多种生物组织

为了评估ProteomEx对各种哺乳动物组织的适用性，我们对三种不同的小鼠组织类型进行了ProteomEx方法的处理，包括脑、肝脏和乳腺癌(图9A)。由于ProteomEx使用了新的水凝胶组成和优化的均质化处理，我们首先使用非刚性配准来量化基于水凝胶的组织膨胀的各向同性，如之前原始蛋白质保留ExM方法所做的那样(Tillberg等人,NatureBiotechnology,2016)。各向同性膨胀对于将空间蛋白质组分布精确映射到膨胀前的组织形态上至关重要。

我们计算了组织膨胀至1500μm长度尺度后特征测量的均方根(RMS)长度测量误差，发现RMS误差对于脑、肝和乳腺癌组织样品分别为测量距离的约8％、约10％和约8％(图9B)。接下来，我们使用DDA-MS处理了约5nL体积的每种组织类型，并对于脑癌、肝癌和乳腺癌样品分别鉴定了24,436/3540、14,298/2606、9623/2356个肽/蛋白质(图9C，9D)。为了探索将蛋白质组学特征与通过免疫组织化学和小染料染色可视化的细胞和亚细胞特征相关联的可能性，我们用DAPI和Aβ抗体对AD小鼠脑切片进行染色，对其进行成像和使用ProteomEx处理。对于2.52nL体积的免疫染色组织，我们鉴定了7000个肽，对应于2000个蛋白质，一式三份重复，证明了ProteomEx与免疫组织化学的相容性。ProteomEx可以很容易地应用于不同的哺乳动物组织类型，并且与抗体染色的样品相容。

为了探索ProteomEx的横向空间分辨率和组织体积的限制，我们将脑组织切片的线性尺寸扩大了8倍(体积的512倍)，得到打孔半径为1毫米的组织-水凝胶复合材料，对应于膨胀前125μm半径，用于蛋白质组学分析。打孔的组织的膨胀前体积为0.37nL，相当于大约160个细胞(使用BNID100434计算)。平均而言，我们在PulseDIA模式下每个样品鉴定和量化了超过3000多种肽和1000种蛋白质(图9E)。

Claims

1.一种处理生物样品以用于蛋白质鉴定的方法，包括：

对所述样品-水凝胶复合体进行蛋白质变性和去锚定处理；

对所述样品-水凝胶复合体进行蛋白质染色，并使其膨胀；和

从膨胀的样品-水凝胶复合体取样用于蛋白质鉴定。

2.根据权利要求1的方法，其中所述生物样品是标本、组织切片、活组织检查样品、器官或其部分、或整个生物体。

3.根据权利要求1或2的方法，其中加入水凝胶前体溶液为用水凝胶前体溶液灌注所述生物样品或将所述生物样品埋放到水凝胶前体溶液中。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中在水凝胶前体溶液中加入锚定剂，从而同时进行锚定和聚合。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述锚定剂包含生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团。

6.根据权利要求5的方法，其中所述锚定剂选自丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSA)、N-(烯丙氧基羰氧基)-琥珀酰亚胺(NAS)及其组合。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述水凝胶前体溶液包含一种或多种水凝胶聚合物的前体。

8.根据权利要求7的方法，其中所述前体选自丙烯酸钠(SA)、甲基丙烯酸钠(SMA)、衣康酸(IA)、反式乌头酸(TAA)、乙基-2-(羟甲基)-丙烯酸酯(EHA)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)、季戊四醇四丙烯酸酯(PT)、丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)、季戊四醇三丙烯酸酯(PA)、二季戊四醇五丙烯酸酯或二季戊四醇六丙烯酸酯(DPHA)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TTA)、二(三羟甲基丙烷)-四丙烯酸酯(DiTA)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TTMA)、甘油丙氧基化(1PO/OH)三丙烯酸酯(GPT)、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TET)、季戊四醇烯丙基醚(PAE)、4-羟基-2-亚甲基丁酸钠(SHMB)、N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺(DMPAA)和丙烯酰胺(AA)。

9.根据权利要求8的方法，其中所述水凝胶前体溶液中包含的前体为SMA、DMAA和PAE，任选地，其中DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA:PAE的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内，优选地DMAA:SMA:PAE的摩尔比为(30-50):(5-15):(0.005-2)。

10.根据权利要求8的方法，其中所述水凝胶前体溶液中包含的前体为SMA、DMAA和TPT，任选地其中DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA:TPT的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内，优选地DMAA:SMA:TPT的摩尔比为(30-50):(5-15):(0.005-2)。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在使用所述水凝胶前体溶液前向其中添加聚合活化剂和/或促进剂，例如VA-044、V50、过硫酸铵、过硫酸钾和TEMED。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中还包括将所述生物样品用二硫键还原剂处理，所述二硫键还原剂选自TCEP、DTT和BME。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白质变性通过用去污剂(例如SDS或十二烷基苯磺酸钠)处理来进行。

14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中蛋白质去锚定通过提高溶液pH值至碱性(例如通过与Tris缓冲液接触)从而使酰胺键断裂来进行。

15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在蛋白质去锚定之后和染色之前还包括用有机溶剂例如甲醇洗涤样品-水凝胶复合体的步骤。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述染色选自考马斯蓝染色、考马斯亮蓝染色、免疫染色、银染、荧光染色以及同位素显色。

17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使样品-水凝胶复合体膨胀通过将其与水或水性缓冲液孵育来进行。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中样品-水凝胶复合体膨胀后的线性扩展因子为5-7。

19.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述取样为局部取样，例如显微取样或通过打孔器实施的微取样。

20.根据权利要求19的方法，其中局部取样得到的样品的直径为0.1-3毫米。

21.根据前述权利要求中任一项的方法，其中对蛋白质的鉴定通过质谱分析例如HPLC-MS进行。

22.根据权利要求21的方法，其中质谱分析包括对样品-水凝胶复合体进行酶消化、肽提取(任选地脱盐)以及质谱检测。

23.一种水凝胶制剂，其包含DMAA、SMA和PAE，或者DMAA、SMA和TPT。

24.根据权利要求23的水凝胶制剂，其包含DMAA、SMA和PAE且其中DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA:PAE的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内，优选地DMAA:SMA:PAE的摩尔比为(20-60):(5-15):(0.005-2)；或

其包含DMAA、SMA和TPT且其中DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA:TPT的摩尔比在10:0.005至10:3的范围内，优选地DMAA:SMA:TPT的摩尔比为(20-60):(5-15):(0.005-2)。

25.权利要求23或24的水凝胶制剂，其中水凝胶制剂制备为包含DMAA、SMA和PAE，或者DMAA、SMA和TPT的稀释于水的储液。

26.权利要求23或24的水凝胶制剂，其中水凝胶制剂制备为未稀释的DMAA、SMA和PAE，或者DMAA、SMA和TPT的混合物。

27.权利要求23-26中任一项的水凝胶制剂用于生物样品的膨胀的用途。

28.一种试剂盒，其包含在一个或多个容器中的DMAA、SMA和PAE，或者DMAA、SMA和TPT。

29.权利要求28的试剂盒，其中DMAA、SMA和PAE各自在分开的容器中，任选地，DMAA和SMA为固体形式，PAE为溶于有机溶剂的液体形式。

30.权利要求28的试剂盒，其中DMAA、SMA和PAE的至少两种混合在一个容器中。

31.权利要求30的试剂盒，其中DMAA、SMA和PAE以(20-60):(5-15):(0.005-2)，例如(40±10):(5-15):(0.005-2)、(40±15):(10±3.5):(0.4±0.2)、(40±10):(10±2.5):(0.4±0.2)、(40±5):(10±2):(0.4±0.2)、(40±5):(10±1.2):(0.4±0.2)、约(40±5):(10±1):(0.005±0.1)的范围内的摩尔比混合在一起，任选地DMAA、SMA和PAE溶于水中配成溶液。

32.权利要求28-31中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒适合于保存在0℃-4℃的温度或常温保存。

33.权利要求28-32中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含一个或多个容器，该容器中包含锚定剂例如NAS和/或NSA。

34.权利要求28-33中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含以下一项或多项：

包含二硫键还原剂(例如TCEP)的容器；

包含选自VA-044、V50、TEMED、过硫酸铵和过硫酸钾的一种或多种聚合活化剂或促进剂的容器；

包含固定剂(例如多聚甲醛)的容器；

包含蛋白变性缓冲液(例如包含SDS或十二烷基磺酸钠的蛋白变性缓冲液)的容器；

包含蛋白质染色液(例如考马斯亮蓝染色液)的容器；以及

包含用于对样品中的蛋白进行消化的酶(例如胰酶)的容器。

35.权利要求28-34中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含以下一项或多项：

凝胶室，配置为用于在凝胶化之前容纳样品，例如具有腔室或凹槽的皿；

染色室，配置为用于对样品中的蛋白质进行染色；

凝胶操作工具，例如镊子、软毛笔；

打孔器；

降温装置，例如冰袋。

36.权利要求28-35中任一项的试剂盒，其用于生物样品的膨胀。

37.一种用于生物样品的空间蛋白质组学分析的系统，包含：

锚定模块，该模块中进行对生物样品中蛋白质的锚定；

凝胶反应模块，该模块中发生聚合以形成样品-水凝胶复合体；

蛋白变性模块，该模块中对蛋白质进行变性；

蛋白去锚定模块，该模块中对蛋白质进行去锚定；

染色模块，该模块中对蛋白质进行染色和任选地局部取样；以及

任选地，质谱分析模块，该模块中对局部取样的样品进行质谱前预处理并且与质谱检测装置串联。