DE102022112065B3

DE102022112065B3 - Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur mikroskopischen probenabbildung

Info

Publication number: DE102022112065B3
Application number: DE102022112065.1A
Authority: DE
Inventors: Gerald Donnert
Original assignee: Abberior Instruments GmbH
Current assignee: Abberior Instruments GmbH
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2023-08-24
Anticipated expiration: 2042-05-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikroskopischen Probenabbildung, wobei mit einem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren ein erstes Bild (B1) einer ersten Probe erstellt wird, wobei die erste Probe oder eine weitere zweite Probe anschließend um einen Expansionsfaktor expandiert wird, und wobei nach dem Expandieren mit einem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren ein zweites Bild (B2) der expandierten ersten oder zweiten Probe erstellt wird, und wobei das erste Bild (B1) und das zweite Bild (B2) mittels eines Prozessors (6) verglichen werden, und wobei auf Basis des Vergleichs zwischen dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2) Strukturveränderungen der ersten oder zweiten Probe mittels des Prozessors (6) analysiert werden sowie eine Vorrichtung mit einem Lichtmikroskop (1) und einem Prozessor (6) zur Durchführung des Verfahrens und ein Computerprogrammprodukt zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur mikroskopischen Probenabbildung sowie ein Computerprogramm mit Programmcode zur Durchführung des Verfahrens mittels der Vorrichtung.
Stand der Technik
Bei der sogenannten Expansionsmikroskopie (expansion microscopy, ExM) handelt es sich um eine relative neue fluoreszenzmikroskopische Technik, mit der Strukturen unterhalb der Beugungsgrenze dargestellt werden können.
Im Gegensatz zur sogenannten „superauflösenden Mikroskopie“ (z.B. PALM/STORM, STED-, oder RESOLFT-Mikroskopie), bei der ein Teil der Fluoreszenz-Emitter in der Probe gezielt oder stochastisch in einen nichtemittierenden Zustand überführt werden, wodurch die Punktspreizfunktion der mikroskopischen Abbildung verschmälert wird oder wodurch einzelne Emitter mittels eines Detektors lokalisierbar werden, wird bei der Expansionsmikroskopie die Probe in ein Hydrogel eingebettet und durch Schwellen des Hydrogels in allen Raumrichtungen expandiert. Anschließend wird die Probe mit beugungsbegrenzten Lichtmikroskopie-Verfahren, wie konfokaler Rastermikroskopie oder spinning disk-Mikroskopie, abgebildet. Aufgrund der Expansion haben mit Emittern markierte Probenstrukturen größere Abstände zueinander als in der nichtexpandierten Probe und können somit mit beugungsbegrenzten Lichtmikroskopie-Verfahren aufgelöst werden. Die resultierende Auflösung liegt dabei um den Expansionsfaktor höher als die entsprechende beugungsbegrenzte Auflösung.
Gemäß der ersten Publikation über die Expansionsmikroskopie (Chen F, Tillberg PW, Boyden ES. Optical imaging. Expansion microscopy. Science. 2015 Jan 30;347(6221):543-8. doi: 10.1126/science.1260088. Epub 2015 Jan 15. PMID: 25592419; PMCID: PMC4312537) sowie gemäß der in der Patentanmeldung WO 2015/127183 A2 beschriebenen Methode wird eine biologische Probe in ein Hydrogel aus einem Co-Polymer von Natriumacrylat und Acrylamid eingebettet, welches mit N-N'-Methylen-Bisacrylamid quervernetzt ist. Interessierende Proteine in der Probe werden mit Antikörpern markiert, die an ein erstes Oligonukleotid gekoppelt sind. Zur Fluoreszenzmarkierung der Strukturen werden Label in die Probe eingebracht, die einen Fluoreszenzfarbstoff, ein zweites Oligonukleotid, welches eine zu dem ersten Oligonukleotid komplementäre Sequenz aufweist und somit spezifisch an das erste Oligonukleotid bindet, und eine Methacryloyl-Gruppe aufweisen, die eine Quervernetzung mit dem Hydrogel eingeht. Der Fluoreszenzfarbstoff wird auf diese Weise an der Position des interessierenden Proteins an die Gelmatrix gekoppelt. Anschließend wird die Probe proteolytisch verdaut und das Hydrogel wird durch Wasseraufnahme in jeder Raumrichtung um einen Expansionsfaktor von 4-5 expandiert.
Bei einer Weiterentwicklung der Methode, die in der Literatur auch als protein-retention expansion microscopy bzw. proExM bezeichnet wird (Chang JB, Chen F, Yoon YG, Jung EE, Babcock H, Kang JS, Asano S, Suk HJ, Pak N, Tillberg PW, Wassie AT, Cai D, Boyden ES. Iterative expansion microscopy. Nat Methods. 2017 Jun;14(6):593-599. doi: 10.1038/nmeth.4261. Epub 2017 Apr 17. PMID: 28417997; PMCID: PMC5560071, siehe auch Patentanmeldung WO 2017/027368 A1 ) werden die Proteine in der Probe, bzw. deren proteolytische Fragmente über chemische Crosslinker direkt mit der Gelmatrix des Hydrogels vernetzt. Dies erlaubt die Markierung der Proteine mittels herkömmlicher Antikörperfärbung oder mittels rekombinanter fluoreszenter Proteine.
Eine weitere Variante der Expansionsmikroskope (Chozinski TJ, Halpern AR, Okawa H, Kim HJ, Tremel GJ, Wong RO, Vaughan JC. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nat Methods. 2016 Jun;13(6):485-8. doi: 10.1038/nmeth.3833. Epub 2016 Apr 11. PMID: 27064647; PMCID: PMC4929147) verwendet herkömmliche mit Fluorophoren markierte Antikörper, welche zunächst vor der Expansion kovalent mit Zielproteinen verknüpft werden und anschließend mit Crosslinkern an die Gelmatrix gekoppelt werden.
Schließlich ist aus dem Stand der Technik eine Weiterentwicklung der Expansionsmikroskopie bekannt, bei der ganze Organe in eine Gelmatrix eingebettet und expandiert werden. Diese Technik ist auch unter der Bezeichnung magnified analysis of the proteome (MAP) bekannt (Ku T, Swaney J, Park JY, Albanese A, Murray E, Cho JH, Park YG, Mangena V, Chen J, Chung K. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nat Biotechnol. 2016 Sep;34(9):973-81. doi: 10.1038/nbt.3641. Epub 2016 Jul 25. PMID: 27454740; PMCID: PMC5070610, siehe auch Patentanmeldung WO 2017/190101 A1 ).
Die Publikation Chang JB, Chen F, Yoon YG, Jung EE, Babcock H, Kang JS, Asano S, Suk HJ, Pak N, Tillberg PW, Wassie AT, Cai D, Boyden ES. Iterative expansion microscopy. Nat Methods. 2017 Jun;14(6):593-599. doi: 10.1038/nmeth.4261. Epub 2017 Apr 17. PMID: 28417997; PMCID: PMC5560071 sowie die Patentanmeldung US 2016/0305856 A1 beschreiben eine Weiterbildung der oben beschriebenen Methode, die auch unter der Bezeichnung iterative expansion microscopy bekannt ist. Dabei wird die Probe nacheinander in zwei Hydrogele eingebettet, wobei das erste Hydrogel mit spaltbaren Crosslinkern und das zweite Hydrogel mit nicht spaltbaren Crosslinkern quervernetzt ist. Durch insgesamt zwei Expansionsschritte lassen sich dadurch Expansionsfaktoren im Bereich von 20-25 erreichen, was die effektive Auflösung im Vergleich zu der ursprünglich beschriebenen Expansionsmikroskopie nochmals deutlich erhöht.
Eine Weiterentwicklung der iterativen Expansionsmikroskopie ist in M'Saad O, Bewersdorf J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nat Commun. 2020 Jul 31; 11(1):3850. doi: 10.1038/s41467-020-17523-8. PMID: 32737322; PMCID: PMC7395138 beschrieben. Diese Methode kommt ohne einen proteolytischen Verdau der Probe aus und erhält daher laut den Autoren die natürliche Anordnung der Probenstrukturen besser als vergleichbare Expansionsmikroskopie-Verfahren. Bei der Methode werden Proteine in der Probe zunächst mit dem ersten Hydrogel quervernetzt. Nach einer Denaturierung der Proteine wird das erste Hydrogel expandiert. Anschließend wird das zweite Hydrogel polymerisiert, die Quervernetzungen des ersten Gels werden hydrolysiert und das zweite Gel wird expandiert. Insgesamt können dabei aufgrund des iterativen Verfahrens Expansionsfaktoren von etwa 20 bis 25 erreicht werden. Dabei wird gemäß den Autoren der Publikation die ursprüngliche Anordnung der Proteine dadurch konserviert, dass die Polymerketten des ersten Gels mit denen des zweiten Gels verschlungen sind. Bei der beschriebenen Methode wird das gesamte Proteom unspezifisch mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert (sogenanntes pan-labeling, daher wird die Methode auch als panExM bezeichnet). Die Bilder der expandierten Proben ähneln daher schwermetall-gefärbten Elektronenmikroskopie-Präparaten. Die unspezifische Fluoreszenzmarkierung kann mit spezifisch (z.B. über Antikörper) an bestimmte Zielmoleküle bindenden Farbstoffen kombiniert werden.
In der Publikation Velasco MGM, Zhang M, Antonello J, Yuan P, Allgeyer ES, May D, M'Saad O, Kidd P, Barentine AES, Greco V, Grutzendler J, Booth MJ, Bewersdorf J. 3D super-resolution deep-tissue imaging in living mice. Optica. 2021 Mar 25;8(4):442-450. doi: 10.1364/OPTICA.416841. PMID: 34239948; PMCID: PMC8243577 ist eine Anwendung der oben beschriebenen panExM-Methode für die Aufklärung neuronaler Strukturen beschrieben.
Die Patentanmeldung CN 1 12 824 878 A beschreibt ein spezielles Verfahren für die Expansionsmikroskopie bestimmter Biomoleküle ohne natürliche Aminogruppen, z.B. Lipide, Kohlenhydrate, DNA und RNA, bei dem die Biomoleküle mit einer Aminogruppe und einem Fluorophor chemisch markiert werden, um die Biomoleküle anschließend in eine Polymermatrix einzubetten und wie weiter oben beschrieben die Probe zu expandieren. Die Anmeldung beschreibt außerdem die Kombination von superauflösender Mikroskopie mit Expansionsmikroskopie, um die Auflösung weiter zu erhöhen.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 2018/157 048 A1 beschreibt ein spezielles Verfahren für die Expansionsmikroskopie von Nierengewebeproben unter Verwendung von Hydrogelen, wobei Podozyten-Fußfortsätze mikroskopisch nachgewiesen werden.
Die oben beschriebenen Verfahren haben den Vorteil, dass mit herkömmlichen, relativ günstigen Lichtmikroskopen, deren Auflösung normalerweise beugungsbegrenzt ist, relativ schnell superauflösende Bilder aufgenommen werden können.
Zusätzlich ist mit der Expansionsmikroskopie je nach Art und Zeitpunkt der Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen der Vorteil erreichbar, dass die Größe des Fluoreszenzfarbstoffs bzw. der mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Markermoleküle (z.B. Antikörper) einen geringeren Einfluss auf die erhaltenen Bilder hat. Dies liegt daran, dass durch die Expansion des Hydrogels die markierten Probenstrukturen größere Abstände zueinander erhalten, während die Größe des Markermoleküls gleichbleibt. Auf diese Weise werden Bildartefakte vermieden, die darauf beruhen, dass das Markermolekül eine Größe hat, die im Bereich der erzielbaren Auflösung oder sogar darüber liegt, was insbesondere bei lokalisationsmikroskopischen Verfahren mit sehr hohen Auflösungen relevant ist.
Vorteilhafterweise ist die Expansionsmikroskopie auch mit der Markierung verschiedener Probenstrukturen mit unterschiedlichen Farbstoffen kompatibel, so dass sie als Mehrfarbenmikroskopie durchgeführt werden kann.
Ein Nachteil der Expansionsmikroskopie liegt jedoch darin, dass sich durch die Probenpräparation und/oder durch die Probenexpansion Probenstrukturen verändern können, was zu Bildartefakten führen kann.
Solche Effekte werden z.B. in der Publikation Gambarotto D, Zwettler FU, Le Guennec M, Schmidt-Cernohorska M, Fortun D, Borgers S, Heine J, Schloetel JG, Reuss M, Unser M, Boyden ES, Sauer M, Hamel V, Guichard P. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat Methods. 2019 Jan;16(1):71-74. doi: 10.1038/s41592-018-0238-1. Epub 2018 Dec 17. PMID: 30559430; PMCID: PMC6314451 untersucht. Dort ist z.B. beschrieben, dass der in expansionsmikroskopischen Bildern erfasste Durchmesser einer Centriolen-Struktur von Clamydomonas reinhardii durch nicht vollständig isotrope Expansion artefaktbehaftet sein kann und dass Artefakte durch Epitopmaskierung bei der Probenpräperation für die Expansionsmikroskopie entstehen können.
Aufgabe der Erfindung
Aus den Nachteilen des oben beschriebenen Standes der Technik ergibt sich die Aufgabe, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur mikroskopischen Probenabbildung zur Verfügung zu stellen, die es, insbesondere auf einfache und benutzerfreundliche Weise, erlaubt, Veränderungen einer Probe zu erfassen, die durch die Präparation der Probe für die Expansionsmikroskopie entstehen.
Lösung
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 (Verfahren), 15 (Vorrichtung) und 17 (Computerprogramm) gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung finden sich in den Unteransprüchen 1 bis 14 und 16 sowie in der folgenden Beschreibung.
Beschreibung der Erfindung
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikroskopischen Probenabbildung, wobei mit einem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren ein erstes Bild einer ersten Probe erstellt wird, wobei das erste superauflösende Lichtmikroskopie-Verfahren eine Auflösung aufweist, die unterhalb der Beugungsgrenze eines Lichts liegt, mit dem die erste Probe beleuchtet wird und/oder das von Emittern in der ersten Probe ausgeht, wobei die erste Probe oder eine weitere zweite Probe anschließend um einen Expansionsfaktor expandiert wird, so dass Abstände zwischen Einheiten in der ersten bzw. zweiten Probe durch das Expandieren um den Expansionsfaktor vergrößert werden, und wobei nach dem Expandieren mit einem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren ein zweites Bild der expandierten ersten oder zweiten Probe erstellt wird, und wobei das erste Bild und das zweite Bild (oder die dem ersten Bild und dem zweiten Bild zugrundeliegenden Bilddaten) mittels eines Prozessors unter Berücksichtigung des Expansionsfaktors, insbesondere automatisch, verglichen werden, und wobei auf Basis des Vergleichs zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild, insbesondere durch das Expandieren der ersten oder der zweiten Probe hervorgerufene, Strukturveränderungen der ersten oder zweiten Probe mittels des Prozessors, insbesondere automatisch, analysiert werden, und wobei das erste Bild und das zweite Bild mittels desselben Lichtmikroskops erstellt werden.
Durch den Vergleich zwischen dem mittels superauflösender Mikroskopie aufgenommenen ersten Bild der nichtexpandierten Probe und dem zweiten Bild der expandierten Probe kann sich der Benutzer auf einfache und benutzerfreundliche Weise einen Eindruck von der Probenqualität, insbesondere der Isotropie der Expansion der Probe und der Erhaltung von biologischen Strukturen in der Probe machen. Dabei ermöglicht die superauflösende Mikroskopie einen besonders genauen Vergleich der Probenstrukturen. Dieser Vergleich kann z.B. im Rahmen eines initialen Kontrollexperiments erfolgen. Ergibt sich aufgrund des Vergleichsergebnisses der Schluss, dass die Probenqualität ausreichend ist und biologische Strukturen in der expandierten Probe gut erhalten sind, kann der Benutzer insbesondere weitere Bereiche der Probe, ggf. ohne weitere Kontrolle, mittels Expansionsmikroskopie abbilden und analysieren. Alternativ ist es natürlich auch möglich, mehrere Kontrollexperimente durchzuführen, d.h. insbesondere erste Bilder verschiedener Probenbereiche aufzunehmen, die mit jeweiligen zweiten Bildern verglichen werden.
Der hier verwendete Begriff „mikroskopische Probenabbildung“ schließt zusätzlich zu einer optischen Abbildung der Probe im eigentlichen Sinne selbstverständlich insbesondere auch scannende Mikroskopieverfahren wie die konfokale Laserscanning-Mikroskopie mit ein. Weiterhin sind auch lokalisationsmikroskopische Verfahren wie z.B. PALM/STORM oder MINFLUX, bei denen einzelne lichtemittierende Moleküle lokalisiert werden und aus den erhaltenen Lokalisationsdaten rechnerisch ein Bild erstellt werden kann, im Sinne der vorliegenden Anmeldung ebenfalls als mikroskopische Probenabbildung zu verstehen.
Mit der „Auflösung“ ist in der vorliegenden Spezifikation der Abstand gemeint, den zwei Strukturen mindestens haben müssen, um bei einer mikroskopischen Abbildung als getrennte Strukturen wahrgenommen zu werden. Bei einer „Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze“ handelt es sich insbesondere um eine Auflösung unterhalb des sogenannten Abbe-Limits. Das Abbe-Limit kann für die laterale Auflösung durch den Quotienten der Wellenlänge des detektierten Lichts und dem Zweifachen der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs ausgedrückt werden. Mit einem superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren ist im Kontext dieser Anmeldung ein Lichtmikroskopie-Verfahren gemeint, das eine Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze ermöglicht.
Gemäß einer ersten Alternative des Verfahrens wird zunächst mit dem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren das erste Bild der ersten Probe erstellt, wobei anschließend dieselbe erste Probe um den Expansionsfaktor expandiert wird, und wobei nach dem Expandieren mit einem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren das zweite Bild der expandierten ersten Probe erstellt wird.
Dies erlaubt einen besonders aussagekräftigen Vergleich der nichtexpandierten Probe mit der expandierten Probe, insbesondere einen Vergleich derselben biologischen Strukturen.
Gemäß einer zweiten Alternative des Verfahrens wird zunächst mit dem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren das erste Bild der ersten Probe erstellt, wobei mit dem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren das zweite Bild einer expandierten zweiten Probe, die sich von der ersten Probe unterscheidet, erstellt wird.
Durch die Verwendung von zwei getrennten, aber vergleichbaren Proben lässt sich der Vergleich auf besonders einfache und benutzerfreundliche Weise durchführen.
Die erste Probe bzw. die zweite Probe wird um einen Expansionsfaktor expandiert, und zwar insbesondere in allen drei Raumrichtungen. Hierbei ist eine möglichst isotrope, also in allen Raumrichtungen gleich ausgeprägte Expansion anzustreben, damit Probenstrukturen in ihrem natürlichen Kontext möglichst gut erhalten bleiben. Die Abstände zwischen den Einheiten in der ersten bzw. zweiten Probe werden dann durch das Expandieren insbesondere in jeder Raumrichtung um den Expansionsfaktor vergrößert, so dass sich insgesamt eine Volumenvergrößerung um die dritte Potenz des Expansionsfaktors ergibt. Diese Volumenvergrößerung führt vorteilhafterweise auch zu einer Verringerung des sogenannten molecular crowding-Effekts in der Probe.
Das erste Bild und das zweite Bild werden von dem Prozessor „unter Berücksichtigung des Expansionsfaktors“ verglichen, da die Abstände zwischen gleichen oder vergleichbaren Probenstrukturen in dem zweiten Bild aufgrund der Probenexpansion insbesondere in jeder Raumrichtung um den Expansionsfaktor größer sind als in dem ersten Bild. Für einen Bildvergleich ist daher insbesondere eines der Bilder um den Expansionsfaktor zu skalieren. Das skalierte Bild kann dann insbesondere auf einer grafischen Anzeigeeinheit mit dem jeweils anderen Bild überlagert werden, um Bildunterschiede darzustellen oder das skalierte Bild kann auf der grafischen Anzeigeeinheit neben dem jeweils anderen Bild angezeigt werden. Selbstverständlich ist es jedoch auch möglich, die Skalierung lediglich auf Ebene der Bilddaten durchzuführen und das skalierte Bild nicht darzustellen, solange ein Vergleich zwischen den Bildern bzw. Bilddaten durchgeführt wird.
Der erfindungsgemäße Vergleich kann vollständig automatisch durchgeführt werden oder auch z.B. durch eine Benutzereingabe ausgelöst werden.
Strukturveränderungen der Probe können sich insbesondere dadurch äußern, dass bestimmte Probenstrukturen (z.B. biologische Strukturen wie Proteine, Proteinkomplexe, Organellen oder Lipidvesikel) in der expandierten Probe im Vergleich zur nichtexpandierten Probe verschoben sind. Dies kann z.B. durch eine nichtisotrope Expansion, also unterschiedliche Expansionsfaktoren in den unterschiedlichen Raumrichtungen oder durch positionsabhängig unterschiedliche Expansionsfaktoren verursacht werden. Strukturveränderungen im Sinne dieser Anmeldung umfassen jedoch z.B. auch die Beobachtung, dass bestimmte Probenstrukturen nur in der nichtexpandierten Probe oder nur in der expandierten Probe mikroskopisch nachweisbar sind, während die Probenstruktur im Bild der jeweils anderen Probe fehlt. Dieser Effekt kann beispielsweise durch Maskierung oder Entmaskierung bestimmter Epitope (z.B. Antikörper-Bindestellen) auftreten.
Selbstverständlich müssen Strukturveränderungen der Probe nicht ausschließlich die Folge der Expansion selbst sein, sondern können auch durch andere Probenpräparationsschritte, wie z.B. Fixierung, Proteaseverdau, Denaturierung oder Färbung entstehen.
Die erfindungsgemäße Analyse der Strukturveränderungen auf Basis des Vergleichs kann z.B. darin bestehen, eine Ähnlichkeitsanalyse zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild durchzuführen, wobei insbesondere ein Ähnlichkeitsmaß bestimmt wird und/oder wobei Ähnlichkeiten zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild auf einer Anzeigeeinheit grafisch dargestellt werden. Letzteres kann z.B. durch eine Überlagerung des ersten und des zweiten Bildes mit einer zusätzlichen farblichen Markierung der Unterschiede oder durch eine Vektorkarte erfolgen.
Vor dem Vergleich des ersten und des zweiten Bildes werden insbesondere zunächst ähnliche Bildbereiche (insbesondere solche, die gleiche oder vergleichbare Probenstrukturen zeigen) aus jeweiligen Datensätzen ausgewählt. Weiterhin kann zur Registrierung der Bildbereiche (also für die Auswahl, welche Bildbereiche des ersten Bildes mit welchen Bildbereichen des zweiten Bildes verglichen werden, ein Registrierungsalgorithmus, z. B. basierend auf einer Ähnlichkeitstransformation, verwendet werden. Bei dem Vergleich bzw. bei der Registrierung wird zumindest eines der Bilder insbesondere translatiert, rotiert oder gestreckt.
Gemäß einer Ausführungsform ist das erste superauflösende Lichtmikroskopie-Verfahren ein MINFLUX-Verfahren, ein STED-MINFLUX-Verfahren oder ein MINSTED-Verfahren, ein SIM-Verfahren, ein SIMFLUX-Verfahren, ein STED-Mikroskopie-Verfahren, ein RESOLFT-Mikroskopie-Verfahren oder ein PALM/STORM-Mikroskopie-Verfahren.
Der Begriff MINFLUX-Verfahren (beschrieben z.B. in Balzarotti F, Eilers Y, Gwosch KC, Gynna, A, Westphal V, Stefani F, Elf J, Hell SW „Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes“, Science 355 (6325), 606-611 (2016)), bezeichnet eine lichtmikroskopische Technik zur Lokalisierung einzelner Emitter in einer Probe, wobei die Probe mit einer Lichtverteilung beleuchtet wird, die ein lokales Minimum an Positionen aufweist, die ein Muster in der Nähe einer erwarteten Position eines einzelnen Emitters bilden, Emissionslichtintensitäten oder Photonenzahlen für jede Position gemessen werden und eine neue Positionsschätzung auf der Grundlage der gemessenen Lichtintensitäten/Photonenzahlen und der entsprechenden Positionen bestimmt wird. Insbesondere ist die Lichtverteilung mit dem lokalen Minimum eine Anregungslichtverteilung. Alternativ kann die Lichtverteilung z. B. eine Verhinderungslichtverteilung (z. B. von STED-Licht) mit einem lokalen Minimum sein, die insbesondere mit einer Anregungslichtverteilung mit einem lokalen Maximum überlagert ist. Letztere Ausführungsform des Verfahrens wird hier auch als STED-MINFLUX-Verfahren bezeichnet.
Der Begriff MINSTED-Mikroskopie (veröffentlicht z.B. in Weber, M., Leutenegger, M., Stoldt, S. et al. MINSTED fluorescence localization and nanoscopy. Nat. Photonics 15, 361-366 (2021). https://doi.org/10.1038) beschreibt ein Lichtmikroskopie-Verfahren zur Lokalisierung einzelner Emitter in einer Probe, wobei die Probe mit einer Anregungslichtverteilung abgetastet wird, die ein lokales Maximum umfasst, und mit einer Verhinderungslichtverteilung (z.B. STED-Licht), die ein lokales Minimum aufweist, kreisförmig abgetastet wird, wobei bei der Detektion eines Photons von einem Emitter der Mittelpunkt des Kreises in Richtung des Ortes der Photonendetektion verschoben wird, während sein Radius verringert wird, und eine effektive Punktspreizfunktion der Detektion verengt wird, bis die Position des Mittelpunkts mit der Position eines einzelnen Emitters konvergiert. Insbesondere wird das Licht von den Emittern konfokal zum Mittelpunkt des Kreises erfasst.
Bei der STED (stimulated emission depletion) - Mikroskopie wird ein Anregungslichtfokus mit einer Lichtverteilung von Fluoreszenz-Verhinderungslicht mit einem lokalen Intensitätsminimum überlagert, das den angeregten Zustand der Fluorophore durch stimulierte Emissionsdepletion bis auf einen schmalen zentralen Bereich am Fokus entvölkert, was zu einer Steigerung der Auflösung bis unterhalb der Beugungsgrenze führt. Die RESOLFT (reversible saturable optical linear fluorescence transitions) - Mikroskopie basiert analog dazu auf der Überführung von Fluorophoren in einen Dunkelzustand durch eine Schaltlichtverteilung mit einem lokalen Minimum.
Unter dem Begriff SIM (structured illumination microscopy) sind superauflösende Mikroskopie-Verfahren zu verstehen, bei denen am Fokus in der Probe eine, insbesondere periodisch, strukturierte, Lichtverteilung von Beleuchtungslicht, insbesondere Anregungslicht, erzeugt wird, wobei aus dem detektierten Emissionslicht ein Bild mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze erhalten wird.
Der Begriff „SiMFLUX-Verfahren“ beschreibt ein z.B. in dem Artikel Cnossen J, Hinsdale T, Thorsen RØ, Siemons M, Schueder F, Jungmann R, Smith CS, Rieger B, Stallinga S. Localization microscopy at doubled precision with patterned illumination. Nat Methods. 2020 Jan;17(1):59-63. doi: 10.1038/s41592-019-0657-7. Epub 2019 Dec 9. PMID: 31819263; PMCID: PMC6989044 beschriebenes Einzelmolekül-Lokalisationsverfahren, bei der die Probe nacheinander mit zueinander orthogonalen periodischen Mustern von Anregungslicht mit unterschiedlichen Phasenverschiebungen beleuchtet wird. Aus den mit einem Flächendetektor gemessenen Photonenzahlen werden Zentroid-Position von einzelnen Molekülen abgeschätzt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das zweite Lichtmikroskopie-Verfahren ein konfokales Raster-Mikroskopie-Verfahren oder ein Widefield-Mikroskopieverfahren. Bei einem konfokalen Raster-Mikroskopie-Verfahren wird die Probe mit fokussiertem Beleuchtungslicht gescannt und das von Emittern in der Probe emittierte Licht wird in einer zur Fokusebene konfokalen Ebene detektiert, insbesondere mit einem hinter einer Lochblende positionierten Punktdetektor oder mit einem Flächendetektor wie einem sogenannten Array von avalanche-Photodioden (APDs). Bei einem Widefield-Mikroskopieverfahren wird Beleuchtungslicht in eine Pupille des Objektivs fokussiert, so dass die Fokusebene in der Probe idealerweise homogen beleuchtet wird und von Emittern in der Probe emittiertes Licht wird insbesondere mittels eines Flächendetektors, z.B. einer Kamera, erfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird auf Basis des Vergleichs zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild ein Qualitätsmaß, insbesondere für das zweite Bild, bestimmt. Bei diesem Qualitätsmaß kann es sich z.B. um ein Ähnlichkeitsmaß handeln, also beispielsweise um einen Zahlenwert, der umso höher ist, je ähnlicher das erste Bild und das zweite Bild sind.
Ausgehend von dem Qualitätsmaß kann z.B. das zweite Bild verworfen werden oder es kann eine Fehlermeldung angezeigt werden.
Erfindungsgemäß werden das erste Bild und das zweite Bild mittels desselben Lichtmikroskops erstellt. Dies erhöht die Benutzerfreundlichkeit des Verfahrens.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die erste und/oder die zweite Probe Emitter, die in Folge einer Beleuchtung der ersten bzw. zweiten Probe mit Beleuchtungslicht Emissionslicht aussenden. Bei den Emittern handelt es sich insbesondere um Luminophore, z.B. Fluorophore, die durch Anregungslicht in einen angeregten Zustand überführt werden, aus welchem sie spontan unter Aussendung von Fluoreszenzlicht in den Grundzustand zurückfallen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird bei dem ersten Lichtmikroskopie-Verfahren und dem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren Emissionslicht von Emittern, welche identische oder zueinander ähnliche Strukturen in der ersten bzw. zweiten Probe markieren, detektiert, wobei das erste Bild und das zweite Bild auf Basis des jeweils detektierten Emissionslichts erstellt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellen das erste Bild und das zweite Bild unterschiedliche Bereiche der ersten Probe dar. Dabei werden insbesondere bei dem Vergleich zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild dieselben Strukturen verglichen. Dazu werden insbesondere zunächst entsprechende Ausschnitte des ersten Bildes und des zweiten Bildes identifiziert, welche gleiche Strukturen abbilden oder es werden aus Datensätzen von Bilddaten, die mit dem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren oder mit dem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren erzeugt wurden, Bilddaten bzw. das erste und das zweite Bild ausgewählt, welche die gleichen Strukturen zeigen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellen das erste Bild und das zweite Bild jeweilige Bereiche der ersten Probe und der zweiten Probe dar. Insbesondere werden dabei bei dem Vergleich zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild zueinander ähnliche Strukturen in dem ersten Bild und dem zweiten Bild verglichen, wobei insbesondere ein Ähnlichkeitsmaß zwischen den zueinander ähnlichen Strukturen mittels des Prozessors bestimmt wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden in dem ersten Bild und dem zweiten Bild jeweils mehrere Strukturen durch einen Vergleich mit einer Struktur des jeweils anderen Bildes analysiert, wobei insbesondere mittels des Prozessors, insbesondere automatisch, eine statistische Auswertung des Vergleichs zwischen den Strukturen des ersten Bildes und den Strukturen des zweiten Bildes durchgeführt wird. Beispielsweise können hierbei eine Anzahl von bestimmten Strukturen einer bestimmten Anordnung (z.B. hexamere Strukturen) auf einer bestimmten Bildfläche, ein statistisches Maß für die Verteilung solcher Strukturen oder Ähnliches analysiert werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellen das erste Bild und das zweite Bild zumindest teilweise denselben Bereich der ersten Probe dar, wobei bei dem Vergleich zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild Abweichungen der Darstellung derselben Strukturen der ersten Probe bestimmt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine Überlagerung des ersten Bildes und des zweiten Bildes mittels einer Anzeigeeinheit angezeigt, wobei insbesondere Abweichungen zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild in der angezeigten Überlagerung markiert werden. Z.B. sind farbliche Markierungen oder eine Vektordarstellung der Abweichungen auf einer Überlagerung des ersten Bildes und des zweiten Bildes möglich.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die erste Probe oder die zweite Probe in mindestens ein Hydrogel eingebettet, wobei das Hydrogel anschließend zum Schwellen gebracht wird, um die erste Probe bzw. die zweite Probe um den Expansionsfaktor zu expandieren. Das Expandieren wird in diesem Fall insbesondere wie eingangs im Stand der Technik zur Expansionsmikroskopie beschrieben durchgeführt. Dabei können verschiedenste Arten von Hydrogelen (z.B. ein Acrylamid-Natriumacrylat-Copolymer) und verschiedene Crosslinker (z.B. N-N'-Methylenbisacrylamid) eingesetzt werden. Das Schwellen erfolgt insbesondere durch Aufnahme von Wasser durch das Hydrogel. Insbesondere werden Strukturen (z.B. Biomoleküle wie Proteine oder Membranlipide) vor oder nach der Expansion mit spezifischen oder unspezifischen Markermolekülen markiert, die mit Farbstoffen verknüpft sind, um die Strukturen lichtmikroskopisch abzubilden (insbesondere durch mikroskopische Bildaufnahmen oder Lokalisation von Einzelmolekülen). Die Markermoleküle und/oder die zu markierenden Strukturen können, insbesondere vor der Expansion, mit den Polymerketten des Hydrogels verknüpft werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die erste Probe oder die zweite Probe zunächst in ein erstes Hydrogel eingebettet, wobei das erste Hydrogel spaltbare Quervernetzungen aufweist, und wobei das erste Hydrogel zum Schwellen gebracht wird, um die erste Probe bzw. die zweite Probe um einen ersten Teilexpansionsfaktor zu expandieren, und wobei die erste Probe bzw. die zweite Probe anschließend in ein zweites Hydrogel eingebettet wird, und wobei die spaltbaren Quervernetzungen des ersten Hydrogels gespalten werden, und wobei das zweite Hydrogel anschließend zum Schwellen gebracht wird, um die erste Probe bzw. die zweite Probe um einen zweiten Teilexpansionsfaktor zu expandieren, insbesondere wobei das Produkt aus dem ersten Teilexpansionsfaktor und dem zweiten Teilexpansionsfaktor den Expansionsfaktor ergibt.
Diese Methode ist aus dem Stand der Technik unter dem Begriff „iterative Expansionsmikroskopie“ bekannt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird von dem Prozessor auf Basis des ersten Bildes ein Bereich der ersten Probe bzw. der zweiten Probe ausgewählt, wobei mittels des zweiten Lichtmikroskopie-Verfahrens der ausgewählte Bereich abgebildet wird, um das zweite Bild zu erstellen. Das heißt, es wird nur ein bestimmter Teil der jeweiligen Probe mit dem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren abgebildet, beispielsweise um zunächst in einem Kontrollexperiment die Qualität der expandierten Probe zu überprüfen, bevor diese weiteren Experimenten unterzogen wird. Dies hat den Vorteil, dass Zeit und Rechenaufwand gespart wird, insbesondere wenn dieselben Strukturen zwischen der nichtexpandierten Probe und der expandierten Probe verglichen werden sollen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die erste Probe und/oder die zweite Probe mindestens einen Referenzmarker auf, anhand dessen eine Position in der ersten bzw. zweiten Probe markierbar ist. Dies erleichtert insbesondere das automatische Auffinden der gleichen Probenregion in der nichtexpandierten Probe und der expandierten Probe und beschleunigt und vereinfacht somit das Verfahren. Bei dem Referenzmarker kann es sich z.B. um ein lichtreflektierendes oder lichtstreuendes Nanopartikel handeln. In diesem Fall kann ein Teil des von der Probe ausgehenden Lichts, insbesondere von der Probe aus gesehen vor einem dichroitischen Strahlteiler, der Fluoreszenzlicht von Anregungslicht trennt, ausgekoppelt und zu einem Streu- bzw. Detektionslichtdetektor (z. B. einer Photodiode) geleitet werden. Alternativ ist es z.B. auch möglich, charakteristische Probenstrukturen als Referenzmarker zu verwenden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mittels des Prozessors der mindestens eine Referenzmarker automatisch erkannt und die Position des mindestens einen Referenzmarkers bestimmt, wobei die bestimmte Position des Referenzmarkers bei dem Vergleich zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild zugrunde gelegt wird.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur mikroskopischen Probenabbildung, wobei die Vorrichtung dazu ausgebildet ist, das Verfahren nach dem ersten Aspekt durchzuführen, und wobei die Vorrichtung zumindest die folgenden Komponenten aufweist:

- ein Lichtmikroskop, das dazu ausgebildet ist, mit einem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren ein erstes Bild einer ersten Probe zu erstellen, wobei das erste superauflösende Lichtmikroskopie-Verfahren eine Auflösung aufweist, die unterhalb der Beugungsgrenze eines Lichts liegt, mit dem die erste Probe beleuchtet wird und/oder das von Emittern in der ersten Probe ausgeht, wobei das Lichtmikroskop weiterhin dazu ausgebildet ist, nach einem Expandieren der ersten Probe oder einer weiteren zweiten Probe um einen Expansionsfaktor, bei der Abstände zwischen Einheiten in der ersten Probe bzw. der zweiten Probe um den Expansionsfaktor vergrößert werden, mit einem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren ein zweites Bild der expandierten ersten oder zweiten Probe zu erstellen, und
- einen Prozessor, der dazu ausgebildet ist, das erste Bild und das zweite Bild unter Berücksichtigung des Expansionsfaktors, insbesondere automatisch, zu vergleichen, und auf Basis des Vergleichs zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild durch das Expandieren der ersten Probe oder der zweiten Probe hervorgerufene Strukturveränderungen der ersten Probe oder der zweiten Probe, insbesondere automatisch, zu analysieren.

Gemäß einer Ausführungsform weist das Lichtmikroskop einen ersten Betriebsmodus auf, in dem das Lichtmikroskop zur Durchführung des ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahrens ausgebildet ist, wobei das Lichtmikroskop weiterhin einen zweiten Betriebsmodus aufweist, in dem das Lichtmikroskop zur Durchführung des zweiten Lichtmikroskopie-Verfahrens ausgebildet ist. In den beiden Betriebsmodi werden insbesondere unterschiedliche Komponenten des Lichtmikroskops von einem Steuergerät angesteuert. Insbesondere wird ein Teil der Komponenten jedoch in beiden Betriebsmodi genutzt, d.h. es müssen keine völlig verschiedenen Sätze von Komponenten verwendet werden. Insbesondere kann sich auch ein Lichtweg von Beleuchtungslicht und/oder Detektionslicht zwischen den Betriebsmodi ändern.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop mindestens eine erste Lichtquelle, insbesondere einen ersten Laser, zur Erzeugung von Beleuchtungslicht, insbesondere Anregungslicht, auf. Mittels des Anregungslichts können Emitter (z.B. Fluorophore) in der Probe anregbar sein, so dass diese Emissionslicht, insbesondere Fluoreszenzlicht, aussenden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop ein Objektiv zur Fokussierung des Beleuchtungslichts in die Probe auf.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop mindestens einen Detektor zur Erfassung des Emissionslichts, insbesondere des Fluoreszenzlichts, auf. Dieser Detektor befindet sich insbesondere in einem Detektionsstrahlengang, der über einen dichroitischen Strahlteiler von einem Beleuchtungsstrahlengang getrennt ist. Bei dem Detektor kann es sich um einen Punktdetektor (z.B. eine Avalanche-Photodiode, APD, oder einen Photomultiplier) oder um einen Flächendetektor (z.B. ein sogenanntes APD-Array) handeln. Der Detektor kann Licht in einer zur Fokusebene in der Probe konfokalen Ebene detektieren. Dazu kann z.B. eine konfokale Lochblende im Detektionsstrahlengang angeordnet sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop einen Scanner, insbesondere einen Galvo-Scanner, zur Ablenkung des Fokus des Beleuchtungslichts auf. Insbesondere ist das Lichtmikroskop so ausgebildet, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht über den Scanner zum Detektionsstrahlengang gelangt (sog. descanned-Konfiguration). Alternativ dazu ist auch eine sogenannte non-descanned-Konfiguration denkbar, bei der das Detektionslicht aus Sicht der Probe vor dem Scanner abgetrennt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop eine weitere zweite Lichtquelle, insbesondere einen zweiten Laser, zur Erzeugung von Emissionsverhinderungslicht (z.B. STED-Licht oder Schaltlicht) auf.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop mindestens einen Phasenmodulator zur Erzeugung einer Lichtverteilung mit einem lokalen Intensitätsminimum (insbesondere einer Intensitätsnullstelle) am Fokus in der Probe auf. Durch den Phasenmodulator wird insbesondere eine Phasenverteilung des Beleuchtungslichts, insbesondere des Anregungslichts, der ersten Lichtquelle oder eine Phasenverteilung des Emissionsverhinderungslichts der zweiten Lichtquelle, in einer zur Pupille des Objektivs konjugierten Ebene so phasenmoduliert, dass am Fokus durch Interferenz die beschriebene Lichtverteilung entsteht. Bei der Lichtverteilung kann es sich z.B. um einen sogenannten 2D- oder 3D-Donut handeln.
Im Falle der Phasenmodulation des Emissionsverhinderungslichts kann das Lichtmikroskop z.B. für die STED- oder RESOLFT-Mikroskopie als erstes superauflösendes Lichtmikroskopie-Verfahren eingerichtet sein.
Wenn das Anregungslicht wie oben beschrieben phasenmoduliert wird, kann das erste superauflösende Lichtmikroskopie-Verfahren z.B. ein MINFLUX-Verfahren sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop eine von dem Scanner verschiedene Strahlablenkeinheit zur Ablenkung eines Lichtstrahls des Beleuchtungslichts auf. Hierbei kann es sich z.B. um einen oder mehrere elektrooptische Deflektoren (EODs) oder akustooptische Deflektoren (AODs) handeln. Diese sorgen insbesondere für eine schnelle und genaue Strahlablenkung bei (im Vergleich zu einem Galvoscanner) relativ geringer maximaler Ablenkung. Mittels der Strahlablenkeinheit kann z. B. eine Lichtverteilung von Anregungslicht mit lokalem Intensitätsminimum in der Probe auf Positionen eines Beleuchtungsmusters verlagert werden, um ein MINFLUX-Verfahren durchzuführen. Alternativ dazu kann die Strahlablenkeinheit das Emissionsverhinderungslicht der zweiten Lichtquelle ablenken, um ein STED-MINFLUX-Verfahren zu implementieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop ein Steuergerät auf, das dazu ausgebildet ist, die Strahlablenkeinheit derart zu steuern, dass ein MINFLUX- oder STED-MINFLUX-Verfahren durchgeführt wird. Dabei ist der Prozessor insbesondere so mit dem Detektor gekoppelt, dass der Prozessor Photonenzahlen für unterschiedliche Positionen des Minimums der Lichtverteilung erhält, wobei der Prozessor dazu ausgebildet ist, aus den Photonenzahlen und den entsprechenden Positionen die Position eines Emitters in der Probe zu ermitteln. Weiterhin ist der Prozessor insbesondere dazu ausgebildet, aus einer Vielzahl von Einzel-Lokalisationen von Emittern ein mikroskopisches Bild der Probe zu berechnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop mindestens ein Gitter in einem Beleuchtungsstrahlengang des Beleuchtungslichts auf, um die Probe bei der ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren mit einer strukturierten Lichtverteilung zu beleuchten. Dabei ist der Prozessor insbesondere dazu ausgebildet, aus dem mittels strukturierter Beleuchtung erhaltenen Detektionslicht ein Bild mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze zu berechnen. Das entsprechende Lichtmikroskop kann als erstes superauflösendes Lichtmikroskopie-Verfahren ein SIM-Verfahren durchführen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop einen ersten Teilstrahlengang mit einem ersten Gitter zur Erzeugung eines ersten strukturierten Beleuchtungsmusters, einen zweiten Teilstrahlengang mit einem zweiten Gitter zur Erzeugung eines zweiten strukturierten Beleuchtungsmusters, welches zu dem ersten Beleuchtungsmuster orthogonal ist, sowie eine Schaltvorrichtung zur selektiven Führung des Beleuchtungslichts entlang des ersten Teilstrahlengangs oder des zweiten Teilstrahlengangs auf. Der erste Teilstrahlengang und der zweite Teilstrahlengang können z.B. mittels eines Polarisationsstrahlteilers aus einem Hauptstrahlengang des Beleuchtungslichts geteilt und hinter den jeweiligen Gittern mittels eines weiteren Polarisationsstrahlteilers wieder vereinigt werden. Bei der Schaltvorrichtung kann es sich in diesem Fall um einen Polarisationsschalter, z. B. eine Pockels-Zelle, handeln. Das erste und zweite Gitter ist insbesondere jeweils verstellbar, so dass eine Phasenlage des jeweiligen strukturierten Beleuchtungsmusters anpassbar ist. Die beschriebene Konfiguration kann insbesondere zur Durchführung eines SIMFLUX-Verfahrens als erstes superauflösendes Lichtmikroskopie-Verfahren dienen. In diesem Fall ist der Prozessor insbesondere dazu eingerichtet, für verschiedene Beleuchtungsmuster und Phasenlagen Photonenzahlen des Detektors zu erhalten und aus den Photonenzahlen und den entsprechenden Beleuchtungsmustern und Phasenlagen eine Position eines Emitters in der Probe zu ermitteln.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Lichtmikroskop dazu ausgebildet, als erstes superauflösendes Lichtmikroskopie-Verfahren ein PALM/STORM-Verfahren durchzuführen. Dazu ist das Lichtmikroskop insbesondere dazu ausgebildet, die Probe mittels Widefield-Beleuchtung mit dem Beleuchtungslicht, insbesondere Anregungslicht, zu beleuchten. Der Detektor ist in diesem Fall insbesondere ein Flächendetektor wie eine Kamera, mit ausreichender zeitlicher und räumlicher Auflösung für ein PALM/STORM-Verfahren. Der Prozessor ist insbesondere dazu ausgebildet, aus Detektorsignalen, die zu mehreren Zeitpunkten aufgenommen wurden, einzelne Emitter in der Probe zu lokalisieren, d.h. ihre Zentroid-Position zu bestimmen. Weiterhin ist der Prozessor insbesondere dazu ausgebildet, aus einer Vielzahl von Einzel-Lokalisationen von Emittern ein mikroskopisches Bild der Probe zu berechnen. Das Lichtmikroskop kann weiterhin dazu ausgebildet sein, die Probe mit Aktivierungslicht zu beleuchten, um fotoaktivierbare oder fotokonvertierbare Emitter in der Probe zu aktivieren, bzw. ihr Emissionsspektrum zu verschieben. Dazu kann z.B. die erste Lichtquelle oder eine separate Lichtquelle verwendet werden.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft ein Computerprogrammprodukt aufweisend Befehle, die bewirken, dass die Vorrichtung nach dem zweiten Aspekt das Verfahren nach dem ersten Aspekt ausführt.
Weitere Merkmale der Vorrichtung nach dem zweiten Aspekt und des Computerprogrammprodukts gemäß dem dritten Aspekt ergeben sich aus den oben beschriebenen Merkmalen des Verfahrens nach dem ersten Aspekt.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen zu den Zeichnungen. Die beschriebenen Vorteile von Merkmalen und / oder Merkmalskombinationen der Erfindung sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen.
Hinsichtlich des Offenbarungsgehalts (aber nicht des Schutzbereichs) der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents gilt Folgendes: Weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten relativen Anordnungen und Wirkverbindungen - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen, was aber nicht für die unabhängigen Patentansprüche des erteilten Patents gilt.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
Figurenliste

1 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens;
2 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
3 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Beschreibung der Figuren
1 zeigt ein erstes mikroskopisches Bild B1 eines Teilbereichs einer ersten Probe, das mit einem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren aufgenommen wurde und ein zweites Bild B2 der ersten Probe oder einer weiteren zweiten Probe, das nach einer Expansion der Probe mit einem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren aufgenommen wurde. Für die Expansion wurde die Probe in ein Hydrogel eingebettet und insbesondere zwischen der Aufnahme des ersten Bildes B1 und des zweiten Bildes B2 wurde das Hydrogel zum Schwellen gebracht. Das zweite Bild B2 wurde also mittels Expansionsmikroskopie aufgenommen.
In den Bildern sind erste Probenstrukturen P1, zweite Probenstrukturen P2 und dritte Probenstrukturen P3 schematisch dargestellt. Bei den Probenstrukturen kann es sich z.B. um Proteine handeln, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden.
In dem zweiten Bild B2 sind drei unterschiedliche Probenstrukturen P1, P2, P3 sichtbar. Diese können z.B. mit Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Farben (also unterschiedlicher Emissionsspektren) oder unterschiedlicher Fluoreszenzlebenszeiten markiert sein. In dem ersten Bild B1 ist dagegen nur die erste Probenstruktur P1 dargestellt, insbesondere weil das erste Bild B1 von einer Probe aufgenommen wurde, bei denen nur die erste Probenstruktur P1 mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurde, oder weil bei der Aufnahme des ersten Bildes B1 nur das Licht des Fluoreszenzfarbstoffs, mit dem die erste Probenstruktur P1 markiert ist, detektiert wurde.
Die erste Probenstruktur P1, bzw. der an diese gebundene Fluoreszenzfarbstoff, dient bei dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel als Referenz, um zu kontrollieren, ob durch die Expansion der Probe Strukturveränderungen stattgefunden haben.
Das erste Bild B1 weist einen ersten Maßstabsbalken S1 auf und das zweite Bild B2 umfasst einen zweiten Maßstabsbalken S2. Dabei entspricht die Länge des zweiten Maßstabsbalkens S2 dem Produkt der Länge des ersten Maßstabsbalken S1 und dem Expansionsfaktor, um den die Probe expandiert wurde. Mit anderen Worten, die in dem zweiten Bild B2 gezeigten ersten Probenstrukturen P1 weisen um den Expansionsfaktor größere Abstände zueinander auf als die entsprechenden in dem ersten Bild B1 gezeigten ersten Probenstrukturen P1.
Weiterhin ist ein überlagertes Bild B3 gezeigt, bei dem die auf dem ersten Bild B1 und dem zweiten Bild B2 dargestellten ersten Probenstrukturen P1 überlagert dargestellt sind. Bei der Erzeugung des überlagerten Bildes B3 wurde das erste Bild B1 und/oder das zweite Bild B2 unter Verwendung des Expansionsfaktors so skaliert, dass die Abstände gleicher Strukturen in dem ersten Bild B1 und dem zweiten Bild B2 gleich dargestellt werden.
Aus dem Bild B3 ist ersichtlich, dass eine der ersten Probenstrukturen P1 (siehe Markierung * in 1) in dem zweiten Bild B2, jedoch nicht in dem ersten Bild B1 zu sehen ist. Diese erste Probenstruktur P1 wurde also mit dem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren (Expansionsmikroskopie) dargestellt, nicht aber mit dem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren.
Ein Grund hierfür könnte z.B. sein, dass durch die bei der Expansionsmikroskopie verwendete Probenpräparation eine Bindestelle eines Proteins für einen fluoreszenzmarkierten Antikörper demaskiert wurde.
Eine weitere mögliche Abweichung zwischen dem ersten Bild B1 und dem zweiten Bild B2, die in dem überlagerten Bild B3 erkennbar wäre, ist eine Verzerrung der Anordnung der ersten Probenstrukturen P1 (in 1 nicht gezeigt). Dies könnte beispielsweise eine Folge einer nicht isotropen, also nicht in jeder Raumrichtung gleichen, Expansion der Probe sein.
Ausgehend von dem überlagerten Bild B3 kann eine weitere Analyse der Abweichungen zwischen der nichtexpandierten Probe und der expandierten Probe durchgeführt werden. Hierbei kann z.B. ein Qualitätsmaß für das Bild der expandierten Probe berechnet werden. Ausgehend von dem Qualitätsmaß kann der Benutzer dann z.B. weitere mikroskopische Aufnahmen machen oder die Probe verwerfen.
2 zeigt eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassend ein Lichtmikroskop 1 und einen Prozessor 6. Die in 2 dargestellte Ausführungsform ist in einem ersten Betriebsmodus zur Durchführung des ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahrens, nämlich STED-Mikroskopie, ausgebildet und ist in einem zweiten Betriebsmodus zur Durchführung des zweiten Lichtmikrokopie-Verfahrens, nämlich konfokaler Rastermikroskopie, ausgebildet.
Das Lichtmikroskop 1 weist eine erste Lichtquelle 3a zur Erzeugung von Anregungslicht und eine zweite Lichtquelle 3b zur Erzeugung von Emissionsverhinderungslicht, nämlich STED-Licht, auf, die über einen ersten dichroitischen Spiegel 10a in einen gemeinsamen Strahlengang eingekoppelt werden. Zwischen der zweiten Lichtquelle 3b und dem ersten dichroitischen Spiegel10b ist ein Phasenmodulator 11 zur Phasenmodulation des STED-Lichtstrahls angeordnet, um im Fokus in der Probe 2 eine Lichtverteilung mit einem lokalen Minimum, z.B. eine Donut-Verteilung, des STED-Lichts zu erzeugen. Auf diese Weise werden Emitter in der Probe 2 um das Minimum herum in den Grundzustand abgeregt, so dass nur emittiertes Licht von Emittern in dem zentralen Bereich um das Minimum detektiert wird. So kann eine Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze erreicht werden. Das vereinigte Anregungslicht und STED-Licht wird von dem zweiten dichroitischen Spiegel 10b transmittiert und gelangt über einen Scanner 4 mit einem verstellbaren Scanspiegel 41 und einer Scan-Linse 42 sowie eine Tubuslinse 7 zu einem Objektiv 8, welches das Anregungslicht und das STED-Licht in die Probe 2 fokussiert. Der Scanner 4 bewegt dabei den kombinierten Anregungs- und STED-Fokus durch die Probe 2. Das Emissionslicht (Fluoreszenzlicht), das von angeregten Emittern in der Probe 2 ausgestrahlt wird, gelangt über das Objektiv 8, die Tubuslinse 7 und den Scanner 4 zu dem zweiten dichroitischen Spiegel 10b, wo es aufgrund seiner im Vergleich zum Anregungslicht und STED-Licht geringeren Wellenlänge in den Detektionsstrahlengang abgelenkt wird. Das Detektionslicht gelangt über eine konfokale Lochblende 9 zu einem Detektor 5, der die Lichtintensität erfasst. Der Detektor 5 ist mit dem Prozessor 6 gekoppelt, welcher aus den von dem Detektor 5 erfassten Lichtintensitäten ein Scan-Bild errechnet. Dieses kann mittels der Anzeigeeinheit 14 angezeigt werden.
In dem ersten Betriebsmodus (STED-Mikroskopie) sind die erste Lichtquelle 3a und die zweite Lichtquelle 3b aktiv und der Scanner 4 und der Detektor 5 sind so aufeinander abgestimmt, dass das erste Bild B1 der nichtexpandierten Probe als Rasterbild mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze aufgenommen wird. Dagegen ist die zweite Lichtquelle 3b im zweiten Betriebsmodus (konfokale Rastermikroskopie) inaktiv oder abgeschattet, so dass das zweite Bild B2 der expandierten Probe als Rasterbild mit beugungsbegrenzter Auflösung aufgenommen wird.
Das erste Bild B1 und das zweite Bild B2 werden dann mittels des Prozessors 6 unter Berücksichtigung des Expansionsfaktors automatisch verglichen, wobei auf Basis des Vergleichs Strukturveränderungen der Probe mittels des Prozessors 6 automatisch analysiert werden. Das Ergebnis des Vergleichs bzw. der Analyse wird dann auf der Anzeigeeinheit 14 dargestellt.
3 zeigt eine zweite Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassend ein Lichtmikroskop 1 und einen Prozessor 6. Die in 3 dargestellte Ausführungsform ist in einem ersten Betriebsmodus zur Durchführung des ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahrens, nämlich MINFLUX-Mikroskopie, ausgebildet und ist in einem zweiten Betriebsmodus zur Durchführung des zweiten Lichtmikrokopie-Verfahrens, nämlich konfokaler Rastermikroskopie, ausgebildet.
Das Lichtmikroskop 1 weist eine Lichtquelle 3 zur Erzeugung von Anregungslicht auf. Das Anregungslicht durchläuft ein Strahlablenkeinheit 12 (z.B. einen oder mehrere elektrooptische Deflektoren) und einen Phasenmodulator 11, insbesondere einen programmierbaren spatial light modulator, zur Phasenmodulation des Anregungslichts, so dass am Fokus in der Probe 2 eine Anregungslichtverteilung mit einem lokalen Intensitätsminimum, z.B. eine Donut-Verteilung, entsteht. Das Anregungslicht wird von dem dichroitischen Spiegel 10 transmittiert und gelangt über einen Scanner 4 mit Scan-Spiegel 41 und Scan-Linse 42 und eine Tubuslinse 7 zu einem Objektiv 8, das das Anregungslicht in die Probe 2 fokussiert. Das von Emittern in der Probe 2 ausgehende Emissionslicht wird von dem dichroitischen Spiegel 10 reflektiert und gelangt über eine optionale konfokale Lochblende 9 zu einem photonenzählenden Detektor 5. Der Detektor 5 ist mit einem Prozessor 6 verbunden, der wiederum mit einem Steuergerät 13 verbunden ist.
In dem ersten Betriebsmodus (MINFLUX) steuert das Steuergerät 13 die Strahlablenkeinheit 12 so, dass das Minimum der Anregungslichtverteilung am Fokus nacheinander an Positionen eines Beleuchtungsmusters um eine vermutete Position eines einzelnen Emitters in der Probe 2 positioniert wird. Für jede Position wird mittels des Detektors 5 eine Anzahl von detektierten Photonen ermittelt. Der Prozessor 6 berechnet dann aus den Photonenanzahlen und den zugeordneten Positionen eine neue Positionsschätzung für den einzelnen Emitter. Dieses Verfahren kann iterativ durchgeführt werden, z.B. bis die Lokalisierungsgenauigkeit gegen einen Grenzwert konvergiert oder bis der Emitter aufhört, Licht zu emittieren. Der Vorgang kann dann für weitere Emitter wiederholt werden. Anschließend kann der Prozessor 6 auf Basis einer Vielzahl von Einzelmolekül-Lokalisationen das erste Bild B1 errechnen, das die Verteilung mehrerer Emitter in der Probe 2 darstellt.
In dem zweiten Betriebsmodus wird das Lichtmikroskop 1 als konfokales Rastermikroskop verwendet. Dazu wird der Phasenmodulator 11 insbesondere so eingestellt, dass er die Phasenverteilung des Anregungslichts nicht moduliert, wodurch in der Fokusebene in der Probe 2 ein regulärer Fokus gebildet wird. Weiterhin erfolgt die Strahlablenkung in diesem Betriebsmodus insbesondere nicht durch die Strahlablenkeinheit 12 sondern durch den Scanner 4. Der Prozessor 6 errechnet dann aus den Daten des Detektors 5 das zweite Bild B2 als Rasterbild.
Das erste Bild B1 und das zweite Bild B2 werden mittels des Prozessors 6 unter Berücksichtigung des Expansionsfaktors automatisch verglichen, wobei auf Basis des Vergleichs Strukturveränderungen der Probe mittels des Prozessors 6 automatisch analysiert werden. Das Ergebnis des Vergleichs bzw. der Analyse wird auf der Anzeigeeinheit 14 dargestellt.
Bezugszeichenliste

1: Lichtmikroskop
2: Probe
3: Lichtquelle
3a: Erste Lichtquelle
3b: Zweite Lichtquelle
4: Scanner
5: Detektor
6: Prozessor
7: Tubuslinse
8: Objektiv
9: Lochblende
10: Dichroitischer Spiegel
10a: Erster dichroitischer Spiegel
10b: Zweiter dichroitischer Spiegel
11: Phasenmodulator
12: Strahlablenkeinheit
13: Steuergerät
14: Anzeigeeinheit
41: Scan-Spiegel
42: Scan-Linse
B1: Erstes Bild
B2: Zweites Bild
B3: Überlagertes Bild
P1: Erste Probenstruktur
P2: Zweite Probenstruktur
P3: Dritte Probenstruktur
S1: Erste Maßstabsbalken
S2: Zweiter Maßstabsbalken
S3: Dritter Maßstabsbalken

Claims

Verfahren zur mikroskopischen Probenabbildung, wobei mit einem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren ein erstes Bild (B1) einer ersten Probe erstellt wird, wobei das erste superauflösende Lichtmikroskopie-Verfahren eine Auflösung aufweist, die unterhalb der Beugungsgrenze eines Lichts liegt, mit dem die erste Probe beleuchtet wird und/oder das von Emittern in der ersten Probe ausgeht, wobei die erste Probe oder eine weitere zweite Probe anschließend um einen Expansionsfaktor expandiert wird, so dass Abstände zwischen Einheiten in der ersten bzw. zweiten Probe durch das Expandieren um den Expansionsfaktor vergrößert werden, und wobei nach dem Expandieren mit einem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren ein zweites Bild (B2) der expandierten ersten oder zweiten Probe erstellt wird, und wobei das erste Bild (B1) und das zweite Bild (B2) mittels eines Prozessors (6) unter Berücksichtigung des Expansionsfaktors, insbesondere automatisch, verglichen werden, und wobei auf Basis des Vergleichs zwischen dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2), insbesondere durch das Expandieren der ersten oder der zweiten Probe hervorgerufene, Strukturveränderungen der ersten oder zweiten Probe mittels des Prozessors (6), insbesondere automatisch, analysiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Bild (B1) und das zweite Bild (B2) mittels desselben Lichtmikroskops (1) erstellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erste superauflösende Lichtmikroskopie-Verfahren ein MINFLUX-Verfahren, ein STED-MINFLUX-Verfahren oder ein MINSTED-Verfahren, ein SIM-Verfahren, ein SIMFLUX-Verfahren, ein STED-Mikroskopie-Verfahren, ein RESOLFT-Mikroskopie-Verfahren oder ein PALM/STORM-Mikroskopie-Verfahren ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Lichtmikroskopie-Verfahren ein konfokales Raster-Mikroskopie-Verfahren oder ein Widefield-Mikroskopieverfahren ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf Basis des Vergleichs zwischen dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2) ein Qualitätsmaß für das zweite Bild (B2) bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und/oder die zweite Probe Emitter umfasst, die in Folge einer Beleuchtung der ersten bzw. zweiten Probe mit Beleuchtungslicht Emissionslicht aussenden, wobei bei dem ersten Lichtmikroskopie-Verfahren und dem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren Emissionslicht von Emittern, welche identische oder zueinander ähnliche Strukturen in der ersten bzw. zweiten Probe markieren, detektiert wird, wobei das erste Bild (B1) und das zweite Bild (B2) auf Basis des jeweils detektierten Emissionslichts erstellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Bild (B1) und das zweite Bild (B2) unterschiedliche Bereiche der ersten Probe oder jeweilige Bereiche der ersten Probe und der zweiten Probe darstellen, wobei bei dem Vergleich zwischen dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2) zueinander ähnliche Strukturen in dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2) verglichen werden, wobei insbesondere ein Ähnlichkeitsmaß zwischen den zueinander ähnlichen Strukturen mittels des Prozessors (6) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2) jeweils mehrere Strukturen durch einen Vergleich mit einer Struktur des jeweils anderen Bildes analysiert werden, wobei insbesondere mittels des Prozessors (6), insbesondere automatisch, eine statistische Auswertung des Vergleichs zwischen den Strukturen des ersten Bildes (B1) und den Strukturen des zweiten Bildes (B2) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Bild (B1) und das zweite Bild (B2) zumindest teilweise denselben Bereich der ersten Probe darstellen, wobei bei dem Vergleich zwischen dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2) Abweichungen der Darstellung derselben Strukturen der ersten Probe bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Überlagerung (B3) des ersten Bildes (B1) und des zweiten Bildes (B2) mittels einer Anzeigeeinheit (14) angezeigt wird, wobei insbesondere Abweichungen zwischen dem ersten Bild und dem zweiten Bild in der angezeigten Überlagerung markiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Probe oder die zweite Probe in mindestens ein Hydrogel eingebettet wird, wobei das Hydrogel anschließend zum Schwellen gebracht wird, um die erste Probe bzw. die zweite Probe um den Expansionsfaktor zu expandieren.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Probe oder die zweite Probe zunächst in ein erstes Hydrogel eingebettet wird, wobei das erste Hydrogel spaltbare Quervernetzungen aufweist, und wobei das erste Hydrogel zum Schwellen gebracht wird, um die erste Probe bzw. die zweite Probe um einen ersten Teilexpansionsfaktor zu expandieren, und wobei die erste Probe bzw. die zweite Probe anschließend in ein zweites Hydrogel eingebettet wird, und wobei die spaltbaren Quervernetzungen des ersten Hydrogels gespalten werden, und wobei das zweite Hydrogel anschließend zum Schwellen gebracht wird, um die erste Probe bzw. die zweite Probe um einen zweiten Teilexpansionsfaktor zu expandieren, insbesondere wobei das Produkt aus dem ersten Teilexpansionsfaktor und dem zweiten Teilexpansionsfaktor den Expansionsfaktor ergibt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass von dem Prozessor (6) auf Basis des ersten Bildes (B1) ein Bereich der ersten Probe bzw. der zweiten Probe ausgewählt wird, wobei mittels des zweiten Lichtmikroskopie-Verfahrens der ausgewählte Bereich abgebildet wird, um das zweite Bild (B2) zu erstellen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Probe und/oder die zweite Probe mindestens einen Referenzmarker aufweist, anhand dessen eine Position in der ersten bzw. zweiten Probe markierbar ist, insbesondere wobei mittels des Prozessors (6) der mindestens eine Referenzmarker automatisch erkannt und die Position des mindestens einen Referenzmarkers bestimmt wird, wobei die bestimmte Position des Referenzmarkers bei dem Vergleich zwischen dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2) zugrunde gelegt wird.
Vorrichtung zur mikroskopischen Probenabbildung, wobei die Vorrichtung dazu ausgebildet ist, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 durchzuführen, und wobei die Vorrichtung zumindest die folgenden Komponenten aufweist: - ein Lichtmikroskop (1), das dazu ausgebildet ist, mit einem ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahren ein erstes Bild (B1) einer ersten Probe zu erstellen, wobei das erste superauflösende Lichtmikroskopie-Verfahren eine Auflösung aufweist, die unterhalb der Beugungsgrenze eines Lichts liegt, mit dem die erste Probe beleuchtet wird und/oder das von Emittern in der ersten Probe ausgeht, wobei das Lichtmikroskop (1) weiterhin dazu ausgebildet ist, nach einem Expandieren der ersten Probe oder einer weiteren zweiten Probe um einen Expansionsfaktor, bei der Abstände zwischen Einheiten in der ersten Probe bzw. der zweiten Probe um den Expansionsfaktor vergrößert werden, mit einem zweiten Lichtmikroskopie-Verfahren ein zweites Bild (B2) der expandierten ersten oder zweiten Probe zu erstellen, und - einen Prozessor (6), der dazu ausgebildet ist, das erste Bild (B1) und das zweite Bild (B2) unter Berücksichtigung des Expansionsfaktors, insbesondere automatisch, zu vergleichen, und auf Basis des Vergleichs zwischen dem ersten Bild (B1) und dem zweiten Bild (B2) durch das Expandieren der ersten Probe oder der zweiten Probe hervorgerufene Strukturveränderungen der ersten Probe oder der zweiten Probe, insbesondere automatisch, zu analysieren.
Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtmikroskop (1) einen ersten Betriebsmodus aufweist, in dem das Lichtmikroskop (1) zur Durchführung des ersten superauflösenden Lichtmikroskopie-Verfahrens ausgebildet ist, und dass das Lichtmikroskop (1) einen zweiten Betriebsmodus aufweist, in dem das Lichtmikroskop (1) zur Durchführung des zweiten Lichtmikroskopie-Verfahrens ausgebildet ist.
Computerprogrammprodukt aufweisend Befehle, die bewirken, dass die Vorrichtung nach Anspruch 14 oder 15 das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 ausführt.