CN101980020A - 一种r-藻蓝蛋白标记的荧光抗抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin，RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法。制备过程为：阴离子交换层析法制备RPC，分别用摩尔比20-30∶1、50-100∶1的双功能化学交联剂SPDP将RPC、抗抗体衍生，衍生物以适宜摩尔比液相交联，经高压液相色谱纯化制备出RPC标记的荧光抗抗体。本法制备的RPC标记的荧光抗抗体交联效率高，纯度达电泳纯，红色荧光明亮，荧光抗体活性稳定，可作为通用荧光探针用于动物传染病的间接免疫荧光检测。
Description
技术领域：
本发明涉及一种R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin，RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法，属于免疫荧光检测领域。
技术背景
免疫荧光检测法是一种历史悠久的标记分析法，兼具有抗原、抗体反应的特异性及荧光检测的灵敏性，广泛应用于疾病检测和生物学研究中。免疫荧光检测法的特异性和敏感性依赖于荧光染料、抗体及荧光探针的属性和质量。在实际应用时，由于血清和其他生物样品发射波长为400～600nm的本底荧光，与常用的FITC等传统荧光染料的荧光发射光谱重叠，严重降低荧光检测的灵敏度，造成一段时期内免疫荧光检测法发展缓慢。
多管藻是生长在我国沿海地区潮间带的特有海洋红藻，含有大量的R-藻蓝蛋白，是提取R-藻蓝蛋白的比较理想的试材。R-藻蓝蛋白的稳定态为(αβ)3，分子量约为104.9kDa，是唯一同时含有PEB和PCB的藻胆蛋白。多管藻RPC有2个吸收峰，最大吸收峰分别位于540、620nm。540nm激发光激发时室温最大荧光发射峰位于632nm。与传统的荧光染料相比，RPC具有水溶性、无毒性、摩尔消光系数大、荧光量子产率高、斯托克位移大、发射红色荧光、背景光干扰小、不易淬灭等特点，因而是一类优秀的荧光染料。
RPC用于免疫荧光检测需要将其与抗体或抗抗体交联制备荧光探针，RPC与抗体交联得率低，造成RPC荧光标记物生产成本居高不下，成为限制其应用的瓶颈因素。本发明选择温和型的异型双功能化学交联剂SPDP将RPC与抗抗体液相化学交联制备通用型荧光抗抗体，通过优化交联剂浓度既保证了交联效率又不影响荧光亮度和抗体活性，成功制备出RPC标记的荧光二抗，可方便地用于传染病病原的间接免疫荧光检测，省去了直接免疫荧光检测时需要针对每种病原的抗体制备荧光标记抗体的麻烦，同时采用标记的抗抗体作为信号放大系统，还能提高免疫荧光检测的灵敏度。目前国内外尚没有RPC应用到动物疫病检测中的报道。
发明内容
本发明涉及一种R-藻蓝蛋白(RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法。
本发明采用的R-藻蓝蛋白(RPC)是纯化自多管藻的典型的二峰型藻蓝蛋白，是唯一同时含有PEB和PCB的藻胆蛋白，具有无毒性、水溶性大、荧光明亮且不易淬灭等特点。RPC的组成和晶体结构特点决定了低稳定性，因此在蛋白质交联是控制交联剂的浓度是关键，浓度过高会造成RPC的变性和荧光丧失，浓度过低则交联效率降低。
本发明的解决方案如下：
RPC的制备：RPC的制备由多管藻中采用阴离子交换层析法分离纯化，纯化过程为：取冷冻保存的多管藻，加入20mM醋酸缓冲液(pH5.8)，4℃下溶胀24h，多层纱布过滤、挤压获得褐色浸提液，然后加入固体硫酸铵至浓度为60％(w/v)，4℃放置24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)中，然后对20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)(含50mM NaCl)预平衡过的阴离子交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的R-藻蓝蛋白，用20mM醋酸缓冲液(pH4.8)(含50mMNaCl)一步洗脱就可得到大量纯的R-藻蓝蛋白，纯化的多管藻RPC纯度达电泳纯，纯度指数A620/A280＞4.5，结构式为(αβ)3，分子量约为110kDa，最大吸收峰分别位于540、620nm，室温荧光发射峰位于640nm，纯化的RPC硫酸铵沉淀4℃避光保存，使用前用50mM pH7.5PBS充分透析除盐，调整浓度为10mg/mL。
RPC标记荧光抗抗体的制备：抗抗体为抗鸡IgG抗体、抗猪IgG抗体，购自Sigma公司，标记时用PBS透析，调整蛋白浓度为5mg/ml。RPC与抗抗体的交联采用蛋白质交联法。利用异型双功能交联剂SPDP分别在RPC、抗抗体上衍生吡啶二硫基团，然后用DTT还原抗抗体的衍生物引入游离-SH，将携带吡啶二硫基的RPC与携带巯基的抗抗体按一定摩尔比交联制备荧光抗抗体。以DMSO准确配制SPDP母液，SPDP与RPC、抗抗体的摩尔比分别为20-30∶1、50-100∶1，混匀、铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按50-100∶1的摩尔比与抗抗体衍生物充分混匀，室温静置反应1h，超滤离心除去多余的DTT，抗抗体-HS与RPC衍生物以摩尔比1∶2-3混匀，铝箔封好后于20-25℃振荡反应20h。加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。
RPC标记抗荧光抗抗体的纯化和交联效率分析：液相色谱工作站上采用HPLC法进行荧光抗抗体的交联效率分析和纯化，流动相为50mM PBS pH 7.5，流速0.5mL/min，检测波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000sw(规格7.5mm×60cm)，荧光标记抗抗体最先被洗脱下来(附图1)。目标产物的洗脱峰面积占所有洗脱峰面积的比例即为交联效率。收集各洗脱峰，进行光谱学、抗体活性、电泳检测。
RPC标记荧光抗抗体的光谱检测：吸收光谱在紫外-可见光分光光度计上测定，扫描波长区间250-700nm。室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，用540nm的激发光激发，荧光发射波长扫描范围为550-700nm，检测步长为0.2nm，狭缝宽度为3nm，检测灵敏度为中等，扫描速度为1000nm/min，每个样品扫描3次取平均值，用不含蛋白的相同溶液作背景扣除。在紫外区，RPC标记荧光抗抗体的吸光度明显高于对照RPC，吸收峰位置相同，这是因为RPC表面交联了抗抗体分子，而抗抗体在280nm有较强的光吸收；在450-700nm范围内，交联物的吸收光谱与对照RPC的吸收峰及吸光度相似，是由于抗抗体在该范围内无光吸收，因而不影响RPC的吸收光谱。通过吸收光谱检测可判定交联成功，同时交联反应没有导致RPC变性。RPC标记荧光抗抗体与对照RPC在540nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于632nm，没有发生斯托克位移的改变，仍具有RPC的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低。荧光光谱检测结果再次证实RPC与抗抗体交联成功。
RPC标记荧光抗抗体的效价检测：对流免疫电泳法检测RPC标记荧光抗抗体的免疫学活性。RPC标记荧光抗抗体与动物IgG形成青色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察到沉淀线的位置。免疫沉淀线的形成说明抗抗体与RPC交联成功，同时也说明交联反应对抗抗体的免疫学活性影响不大，交联物能够进行抗原抗体反应，仍然保留较高的抗体活性。
RPC标记荧光抗抗体的电泳检测：SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％。恒压电泳，电压为218V。用0.25％(w/v)考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现RPC标记荧光抗抗体既具有RPC的α、β亚基条带，又具有抗体的H、L链条带(附图2)，证实RPC与抗抗体交联成功。
RPC标记荧光抗抗体的稳定性检测：纯化的RPC标记荧光抗抗体中加入0.02％叠氮化钠，4℃避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价。RPC标记的荧光抗抗体稳定性较好，在0.05mol/L的磷酸缓冲液中4℃保存60天，荧光抗抗体的荧光强度保持不变，抗体效价维持在5Log 2。
综上所述，RPC标记的通用荧光探针荧光明亮，稳定性好，可用于动物传染病的病原或抗体的间接免疫荧光检测，省去了直接免疫荧光检测时需要针对每种病原的抗体制备荧光标记抗体的麻烦，采用标记抗抗体还能起到信号放大作用。
附图说明
附图1为RPC标记荧光抗抗体的HPLC洗脱图。液相柱型号为TSK G3000sw，流动相为50mM pH7.5的PBS，流速0.5mL/min，RPC标记荧光抗抗体、抗抗体、RPC的洗脱时间为分别为19.57min、27.32、31.26min。
附图2为RPC标记荧光抗抗体的SDS-PAGE电泳。RPC标记荧光抗抗体既具有RPE的α、β亚基条带，又具有抗体的H、L链条带。
附图3为不同保存时间的RPC标记抗鸡IgG荧光抗抗体的荧光亮度和抗体活性。RPC标记荧光抗抗体在0.05mol/L的磷酸缓冲液中4℃保存60天，荧光强度保持不变，随后随着保存时间推移荧光强度缓慢降低。荧光抗抗体4℃保存90天抗体效价维持在5Log 2，随后抗体效价随保存时间推迟而缓慢降低。
具体实施方式：
实施方式1：RPC标记的抗鸡IgG荧光抗抗体的制备
RPC的分离纯化：冷冻保存的多管藻加入6倍体积的20mM醋酸缓冲液(pH5.8)，4℃下溶胀24h，多层纱布过滤、挤压获得褐色浸提液，然后加入固体硫酸铵至浓度为60％(w/v)，4℃放置24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)中，然后对20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)(含50mM NaCl)预平衡过的阴离子交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的样品及杂质，用20mM醋酸缓冲液(pH4.8)(含50mM NaCl)一步洗脱就可得到大量纯的RPC，纯化的多管藻RPC纯度达电泳纯，纯度指数A620/A280＞4.5，结构式为(αβ)3，分子量约为110kDa，最大吸收峰分别位于540、620nm，室温荧光发射峰位于632nm，纯化的RPC硫酸铵沉淀4℃避光保存，使用前用50mM pH7.5PBS充分透析除盐，调整浓度为10mg/mL。
RPC标记抗鸡IgG荧光抗抗体的高效制备：抗鸡IgG抗体购自Sigma公司，标记时用PBS透析，调整蛋白浓度为5mg/ml。以DMSO准确配制SPDP母液，SPDP与RPC、抗抗体的摩尔比分别为20∶1、50∶1，混匀、铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按50∶1的摩尔比与抗抗体衍生物充分混匀，室温静置反应1h，超滤离心除去多余的DTT，抗抗体-HS与RPC衍生物以摩尔比1∶2混匀，铝箔封好后于20-25℃振荡反应20h。加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。
RPC标记抗鸡IgG荧光抗抗体的交联效率分析和高效纯化：液相色谱工作站上采用HPLC法进行荧光抗抗体的交联效率分析和纯化，流动相为50mM PBS pH 7.5，流速0.5mL/min，检测波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000sw(规格7.5mm×60cm)，荧光标记抗抗体最先被洗脱下来(附图1)。收集第一个洗脱峰，即为纯化的荧光抗抗体。通过计算目标产物的洗脱峰面积与全部洗脱峰面积的比例即交联效率为88％。
RPC标记荧光抗抗体的光谱检测：吸收光谱在紫外-可见光分光光度计上测定，扫描波长区间250-700nm。室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，用540nm的激发光激发，荧光发射波长扫描范围为550-700nm，检测步长为0.2nm，狭缝宽度为3nm，检测灵敏度为中等，扫描速度为1000nm/min，每个样品扫描3次取平均值，用不含蛋白的相同溶液作背景扣除。在紫外区，RPC标记荧光抗抗体的吸光度明显高于对照RPC，吸收峰位置相同，这是因为RPC表面交联了抗抗体分子，而抗抗体在280nm有较强的光吸收；在450-700nm范围内，交联物的吸收光谱与对照RPC的吸收峰及吸光度相似，是由于抗抗体在该范围内无光吸收，因而不影响RPC的吸收光谱。通过吸收光谱检测可判定交联成功，同时交联反应没有导致RPC变性。RPC标记荧光抗抗体与对照RPC在540nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于632nm，没有发生斯托克位移的改变，仍具有RPC的特征荧光发射光谱，且荧光亮度无明显降低。荧光光谱检测结果再次证实RPC与抗抗体交联成功。
RPC标记荧光抗抗体的效价检测：对流免疫电泳法检测RPC标记荧光抗抗体的免疫学活性。RPC标记荧光抗抗体与鸡IgG形成青色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察到沉淀线的位置。免疫沉淀线的形成说明抗抗体与RPC交联成功，同时也说明交联反应对抗抗体的免疫学活性影响不大，交联物能够进行抗原抗体反应，仍然保留较高的抗体活性。
RPC标记荧光抗抗体的电泳检测：SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％。恒压电泳，电压为218V。用0.25％(w/v)考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现RPC标记荧光抗抗体既具有RPC的α、β亚基条带，又具有抗体的H、L链条带(附图2)，证实RPC与抗抗体交联成功。
RPC标记荧光抗抗体的稳定性检测：纯化的RPC标记荧光抗抗体中加入0.02％叠氮化钠，4℃避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价。RPC标记的荧光抗抗体稳定性较好，在0.05mol/L的磷酸缓冲液中4℃保存60天，荧光抗抗体的荧光强度保持不变，抗体效价维持在5Log 2。
实施方式2：RPC标记抗猪IgG荧光抗抗体制备
RPC的分离纯化：RPC的制备由多管藻中采用阴离子交换层析法分离纯化，取冷冻保存的多管藻，加入6倍体积的20mM醋酸缓冲液(pH5.8)，4℃下溶胀24h，多层纱布过滤、挤压获得褐色浸提液，然后加入固体硫酸铵至浓度为60％(w/v)，4℃放置24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)中，然后对20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)(含50mM NaCl)预平衡过的阴离子交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的样品及杂质，用20mM醋酸缓冲液(pH4.8)(含50mM NaCl)一步洗脱就可得到大量纯的RPC，纯化的多管藻RPC纯度达电泳纯，纯度指数A620/A280＞4.5，结构式为(αβ)3，分子量约为110kDa，最大吸收峰分别位于540、620nm，室温荧光发射峰位于640nm，纯化的RPC硫酸铵沉淀4℃避光保存，使用前用50mM pH7.5PBS充分透析除盐，调整浓度为10mg/mL。
RPC标记抗猪IgG荧光抗抗体的高效制备：抗猪IgG抗体购自Sigma公司，标记时用PBS透析，调整蛋白浓度为5mg/ml。以DMSO准确配制SPDP母液，SPDP与RPC、抗抗体的摩尔比分别为30∶1、100∶1，混匀、铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按100∶1的摩尔比与抗抗体衍生物充分混匀，室温静置反应1h，超滤离心除去多余的DTT，抗抗体-HS与RPC衍生物以摩尔比1∶3混匀，铝箔封好后于20-25℃振荡反应20h。加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。
RPC标记抗猪IgG荧光抗抗体的交联效率分析和高效纯化：液相色谱工作站上采用HPLC法进行荧光抗抗体的交联效率分析和纯化，流动相为50mM PBS pH 7.5，流速0.5mL/min，检测波长190-800nm。采用分子筛高压液相色谱柱纯化，液相柱型号TSK G3000sw(规格7.5mm×60cm)，荧光标记抗抗体最先被洗脱下来，收集第一个洗脱峰，即为纯化的荧光抗抗体。通过计算目标产物的洗脱峰面积与全部洗脱峰面积的比例即交联效率为90％。
RPC标记抗猪IgG荧光抗抗体的光谱检测：吸收光谱在紫外-可见光分光光度计上测定，扫描波长区间250-700nm。室温荧光发射光谱在荧光分光光度计上测定，用580nm的激发光激发，荧光发射波长扫描范围为600-700nm，检测步长为0.2nm，狭缝宽度为3nm，检测灵敏度为中等，扫描速度为1000nm/min，每个样品扫描3次取平均值，用不含蛋白的相同溶液作背景扣除。RPC标记荧光抗抗体与RPC的吸收峰位置相同，但在紫外区吸光度明显高于RPC，这是因为RPC表面交联了抗抗体分子，而抗抗体在280nm有较强的光吸收，在450-700nm范围内抗抗体无光吸收。RPC标记荧光抗抗体与对照RPC在540nm激发光的激发下，室温荧光发射波长均位于632nm，没有发生斯托克位移的改变，且荧光亮度无明显降低。
RPC抗猪IgG荧光抗抗体的效价检测：对流免疫电泳法检测RPC标记荧光抗抗体的免疫学活性。RPC标记荧光抗抗体与动物IgG形成青色免疫沉淀线，不用染色就可清晰地观察到沉淀线的位置。免疫沉淀线的形成说明抗抗体与RPC交联成功，同时也说明交联物仍然保留较高的抗体活性。
RPC标记抗猪IgG荧光抗抗体的电泳检测：SDS-PAGE在垂直板不连续电泳装置上进行，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％。恒压电泳，电压为218V。用0.25％(w/v)考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察结果。SDS-PAGE电泳发现RPC标记抗猪IgG荧光抗抗体同样既具有RPC的α、β亚基条带，又具有抗体的H、L链条带。
RPC标记抗猪IgG荧光抗抗体的稳定性检测：纯化的RPC标记荧光抗抗体中加入0.02％叠氮化钠，4℃避光保存，每隔30天测定一次荧光光谱和抗体效价。RPC标记的抗猪IgG荧光抗抗体稳定性同RPC标记的抗鸡IgG荧光抗抗体相似，在0.05mol/L的磷酸缓冲液中4℃保存60天，荧光抗抗体的荧光强度保持不变，抗体效价维持在5Log 2。
Claims (5)
1.一种R-藻蓝蛋白(RPC)标记的荧光抗抗体的制备方法，包括：阴离子交换层析法制备多管藻RPC，分别用摩尔比20-30∶1、50-100∶1的交联剂SPDP将RPC、抗抗体衍生，抗抗体的SPDP衍生物经摩尔比50-100∶1的DTT还原获得带-HS的抗抗体，带-HS的抗抗体与RPC的衍生物以摩尔比1∶2-3液相交联，经HPLC纯化制备出荧光抗抗体，制备的荧光抗抗体得率高、纯度高、稳定性好、荧光呈明亮的红色，可作为通用荧光探针用于鸡、猪传染病的间接免疫荧光检测。
2.根据权利要求1的方法，其中RPC的制备由多管藻中采用阴离子交换层析法分离纯化，纯化步骤为：取冷冻保存的多管藻，加入20mM醋酸缓冲液(pH5.8)，4℃下溶胀24h，多层纱布过滤、挤压获得褐色浸提液，然后加入固体硫酸铵至浓度为60％(w/v)，4℃放置24h，离心收集沉淀，将沉淀溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)中，然后对20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)透析，透析液加到用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)(含50mM NaCl)预平衡过的阴离子交换柱，用20mM醋酸缓冲液(pH5.8)冲洗掉阴离子交换柱上过量的样品和杂质，用20mM醋酸缓冲液(pH4.8)(含50mM NaCl)一步洗脱就可得到大量纯的RPC，纯化的多管藻RPC纯度达电泳纯，纯度指数A620/A280＞4.5，结构式为(αβ)3，分子量约为110kDa，最大吸收峰分别位于540、620nm，室温荧光发射峰位于640nm，纯化的RPC硫酸铵沉淀4℃避光保存，使用前用50mM pH7.5PBS充分透析除盐，调整浓度为5mg/mL。
3.根据权利要求1的方法，其中抗抗体为抗鸡IgG抗体、抗猪IgG抗体，购自Sigma公司，电泳检测纯度达电泳纯，对流免疫电泳法检测抗抗体具有良好的生物学活性，标记时用PBS透析，调整蛋白浓度为5mg/ml。
4.根据权利要求1的方法，其中荧光抗抗体的制备采用蛋白质交联技术在液相体系中化学交联制备，制备方法为：以DMSO准确配制SPDP母液，分别用双功能化学交联剂SPDP衍生RPC、抗抗体，SPDP与RPC、抗抗体的摩尔比分别为20-30∶1、30-60∶1，混匀、铝箔封好后于室温旋转反应2h，超滤离心除去多余的SPDP。取DTT按30-60∶1的摩尔比与抗抗体衍生物充分混匀，室温静置反应1h，超滤离心除去多余的DTT，抗抗体-HS与RPC衍生物以摩尔比1∶2-3混匀，铝箔封好后于20-25℃振荡反应20h，加NEM封闭多余巯基，室温旋转反应60min。
5.根据权利要求1的方法，其中荧光抗抗体经HPLC纯化，纯化在液相色谱工作站上进行，液相柱型号TSK G3000sw(规格7.5mm×60cm)，流动相为50mM pH 7.5PBS，流速0.5ml/min，检测波长190-800nm，收集洗脱19.57min出现的产物峰，置4℃避光保存。
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