CN103344756B - 一种用于检测p24抗原的碳量子点试纸条的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测P24抗原的试纸条，具体说是一种用于检测P24抗原的碳量子点试纸条的制备方法，其包括在底板两端分别粘结样品垫和吸水垫、P24碳量子点垫的制取和P24硝酸纤维素膜的制备、在所述底板上依次相互搭接地粘结所述样品垫、P24碳量子点垫、P24硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸板、将试纸板切割成若干条符合规定宽度的试纸条，并将试纸条密封保存的步骤。本发明将已知的特异性抗体或抗原先固定于纤维素膜的某一区带，当待测样品加到样本垫上后，溶解碳量子点垫上的碳量子点标记试剂，使大量的碳量子点聚集在检测带上，从而发出明亮的光，实现特异性的免疫诊断。本方法在检测时不仅灵敏度较高，而且少毒性或无毒性。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测P24抗原的试纸条，具体说是一种用于检测P24抗原的试纸条的制备方法。
背景技术
机体感染艾滋病HIV病毒后，P24抗原是较早能从血清中检出的病原学标志，感染后2—3周即可检出。目前检测P24抗体一般采用试纸条，试纸条主要是在底板上依次粘结样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫。其中样品垫的处理是将玻璃纤维膜放入含有BSA和PBS样品垫处理溶液中处理；包被膜的制备是用包被膜缓冲液稀释抗原后喷印在包被膜上；胶体金垫的制备是用碳酸钾调节胶体金溶液，并将该溶液与其他抗原进行重组，混匀重组抗原后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，再将沉淀用胶体金的金标抗原保存液溶解，最后将溶解液涂覆在玻璃纤维膜上，干燥后保存，从而制得胶体金垫。这种形式的试纸条由于含有胶体金垫，其不仅灵敏度较低，而且胶体金的原材料中含氯金酸，具有毒性。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于检测P24抗原的碳量子点试纸条的制备方法，通过该方法制备的试纸条不仅灵敏度较高，而且很少或无毒性。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：一种用于检测P24抗原的碳量子点试纸条的制备方法，包括在底板两端分别粘结样品垫和吸水垫的步骤，还包括以下步骤：
（1）P24碳量子点垫的制取和P24硝酸纤维素膜的制备；
（2）在所述底板上依次相互搭接地粘结所述样品垫、P24碳量子点垫、P24硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸板；
（3）将试纸板切割成若干条符合规定宽度的试纸条，并将试纸条密封保存。
作为优选，上述（1）中的P24碳量子点垫的制取按以下步骤进行：
1）制备、纯化碳量子点溶液：
a、用三口摇瓶收集碳灰与硝酸溶液，并混匀；
b、将上述混匀的溶液在100℃磁力搅拌下回流12h，再以3000rpm 、4℃离心10 min，分离未反应的碳灰；
c、收集上述溶液中清亮的棕黄色上清液，弃去沉淀；
d、加入3倍上述上清液体积的丙酮溶液，以14000rpm离心10 min，弃去上清液，收集沉淀；
e、将上述收集的沉淀干燥后，溶于去离子水中，用碳酸钠溶液调节pH至7.0。
f、将上述去离子水溶液于4℃、12000rpm离心30min，收集上清液；
g、将上述收集的上清液加入到透析袋中透析48h，去除杂质，得到纯化的水溶性碳量子点溶液。
2）利用上述碳量子点溶液制取P24碳量子点偶联抗体：
h、将P24抗体加入EDC和NHS混合溶液中，室温反应30min；
i、向上述混合溶液中加入巯基乙醇，淬灭未反应的EDC；
j、加入等体积的上述纯化的水溶性碳量子点溶液，室温下反应2h；
k、加入BSA溶液与NH4Cl溶液，室温放置10min；
n、用PBS透析除去未偶联的抗体及游离NHS，得到P24碳量子点偶联抗体。
3）将玻璃纤维膜放入含有蔗糖、BSA、吐温的磷酸缓冲液中浸透，取出干燥后放入上述制取的P24碳量子点偶联抗体中浸泡10 min，再取出晾干，得到P24碳量子点垫；
4）待上述P24碳量子点垫干燥后，4℃保存。
作为优选，上述（1）中P24硝酸纤维素膜制备是在硝酸纤维素膜上均匀地喷上分别针对Test区和Control区的P24抗体和羊抗鼠IgG，室温下干燥后用适当浓度的BSA溶液进行封闭，然后用Na2HPO4洗涤液漂洗三次，室温下充分干燥后，4℃保存。
从以上方案可知，本发明制备的碳量子点试纸条是一种以膜为固相载体的快速诊断技术，是将已知的特异性抗体或抗原先固定于纤维素膜的某一区带，当待测样品加到样本垫上后，由于毛细管虹吸作用，待测样品将沿着膜从一端向另一端移动，从而溶解碳量子点垫上的碳量子点标记试剂，并与之相互反应；当移至固有已知抗体或抗原的区域时，该已知的抗体或抗原会与待测样品，即碳量子点标记试剂的结合物发生特异性结合，使大量的碳量子点聚集在检测带上，当大量的免疫碳量子点聚集时可使该区域在紫外灯下发出明亮的光，从而实现特异性的免疫诊断。因此，根据本方法获得试纸条由于采用了碳量子点，其在检测时不仅灵敏度较高，而且少毒性或无毒性。
附图说明
图1是从左到右依次为检测P24标准品抗原1000 pg/ml ,100pg/ml,10pg/ml ,1 pg/ml , 0.1pg/ml；
图2是本实施例中400nm激发波长照射获得的水溶性碳量子点，用不同波长的滤光片拍摄的图片；
图3是本实施例中透射电镜检测碳量子点颗粒大小的图片。
具体实施方式
下面对本发明作进一步地详细说明：
本方法包括在底板两端分别粘结样品垫和吸水垫的步骤，该步骤为现有技术，底板、样品垫和吸水垫为现有产品，本方法还包括制取P24碳量子点垫和制备P24硝酸纤维素膜。所有产品准备好以后，在底板上依次相互搭接地粘结所述样品垫、P24碳量子点垫、P24硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸板；一般地两者搭接重叠2mm左右，以保证结合精密严实。所有产品粘结好以后，将试纸板切割成若干条符合规定宽度的试纸条，一般宽度为4mm左右，并将试纸条密封保存。
作为本发明的优选，P24碳量子点垫的制取按以下步骤进行：
1）制备、纯化碳量子点溶液；
2）利用上述碳量子点溶液制取P24碳量子点偶联抗体；
3）将玻璃纤维膜放入含有蔗糖、BSA、吐温的磷酸缓冲液中浸透，取出干燥后放入上述制取的P24碳量子点偶联抗体中浸泡10 min，再取出晾干，得到P24碳量子点垫；
4）待上述P24碳量子点垫干燥后，4℃保存。
本发明通过上述步骤制取碳量子点垫，然后将碳量子点垫粘结于底板上，从而发挥检测功能。
本发明在制备P24碳量子点垫过程中，制备、纯化碳量子点溶液优选采用以下方法：
a、用三口摇瓶收集碳灰与硝酸溶液，并混匀；
b、将上述混匀的溶液在100℃磁力搅拌下回流12h，再以3000rpm 、4℃离心10 min，分离未反应的碳灰；
c、收集上述溶液中清亮的棕黄色上清液，弃去沉淀；
d、加入3倍上述上清液体积的丙酮溶液，以14000rpm离心10 min，弃去上清液，收集沉淀；
e、将上述收集的沉淀干燥后，溶于去离子水中，用碳酸钠溶液调节pH至7.0。
f、将上述去离子水溶液于4℃、12000rpm离心30min，收集上清液；
g、将上述收集的上清液加入到透析袋中透析48h，去除杂质，得到纯化的水溶性碳量子点溶液。
上述制备、纯化碳量子点溶液的方法操作简单，无需特殊设备，成本较低，获得的水溶性碳量子点大小均匀，重复性较好，无需后续的钝化等修饰过程。
制备、纯化碳量子点溶液后，本发明利用上述纯化的碳量子点溶液制取P24碳量子点偶联抗体，优选以下方法：
h、将P24抗体加入EDC和NHS混合溶液中，室温反应30min；
i、向上述混合溶液中加入巯基乙醇，淬灭未反应的EDC；
j、加入等体积的上述纯化的水溶性碳量子点溶液，室温下反应2h；
k、加入BSA溶液与NH4Cl溶液，室温放置10min；
n、用PBS透析除去未偶联的抗体及游离NHS，得到P24碳量子点偶联抗体。
上述制取P24碳量子点偶联抗体的方法，不仅标记效率较高，而且操作简单，重复性较好。
本发明制备P24硝酸纤维素膜优选在硝酸纤维素膜上均匀地喷上分别针对该膜的Test区和Control区的P24抗体和羊抗鼠IgG，室温下干燥后用适当浓度的BSA溶液进行封闭，然后用Na2HPO4洗涤液漂洗三次，室温下充分干燥后，4℃保存。
实施例
用三口摇瓶收集50mg碳灰与30ml 5mol/L的硝酸溶液，并混匀，将混匀的溶液在100℃磁力搅拌下回流12h，再以3000rpm 、4℃离心10 min，分离未反应的碳灰后，收集溶液中清亮的棕黄色上清液，弃去沉淀，然后加入3倍上清液体积的丙酮溶液，以14000rpm离心10 min，弃去上清，收集沉淀，即碳量子点；将该沉淀干燥后，溶于去离子水中，用碳酸钠溶液调节pH至7.0，将该溶液于4℃、12000rpm离心30min，收集上清液到透析袋中透析48h，去除杂质，得到纯化的约2-6nm的水溶性碳量子点溶液，待用。
同时，一方面将1mg P24抗体加入0.4mg EDC和1mg NHS混合溶液中，室温反应30min，然后加入终浓度为20mM的巯基乙醇，淬灭未反应的EDC，接着加入等体积的上述待用的水溶性碳量子点溶液，室温下反应2h，再加入终浓度为0.1%的BSA溶液与100ul 1mol/L的NH4Cl溶液，室温放置10min，接着用PBS透析除去未偶联的抗体及游离NHS，得到P24碳量子点偶联抗体；另一方面将玻璃纤维膜放入含有蔗糖、BSA、吐温的磷酸缓冲液中浸透，取出并干燥。待玻璃纤维膜干燥后放入上述制取的P24碳量子点偶联抗体中浸泡10 min，再取出晾干，从而得到P24碳量子点垫，待彻底干燥后，4℃保存待用。
同时，在现有的硝酸纤维素膜上均匀地喷上分别针对该膜的Test区和Control区的P24抗体和羊抗鼠IgG，室温下干燥后用适当浓度的BSA溶液进行封闭，然后用Na2HPO4洗涤液漂洗三次，室温下充分干燥后，4℃保存待用；
接着，在PVC底板上依次相互搭接地粘结样品垫、P24碳量子点垫、P24硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸板；最后，将制得的试纸板切割成若干条符合规定宽度或指定宽度的试纸条，密封保存。
Claims (2)
1.一种用于检测P24抗原的碳量子点试纸条的制备方法，包括在底板两端分别粘结样品垫和吸水垫的步骤，其特征在于：还包括以下步骤：
(1)P24碳量子点垫的制取和P24硝酸纤维素膜的制备；P24碳量子点垫的制取按以下步骤进行：
1)制备、纯化碳量子点溶液，其步骤如下：
a、用三口摇瓶收集碳灰与硝酸溶液，并混匀；
b、将上述混匀的溶液在100℃磁力搅拌下回流12h，再以3000rpm、4℃离心10min，分离未反应的碳灰；
c、收集上述溶液中清亮的棕黄色上清液，弃去沉淀；
d、加入3倍上述上清液体积的丙酮溶液，以14000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀；
e、将上述收集的沉淀干燥后，溶于去离子水中，用碳酸钠溶液调节pH至7.0；
f、将调节pH值后的溶液于4℃、12000rpm离心30min，收集上清液；
g、将f中收集的上清液加入到透析袋中透析48h，去除杂质，得到纯化的水溶性碳量子点溶液；
2)利用上述碳量子点溶液制取P24碳量子点偶联抗体，其步骤如下：
h、将P24抗体加入EDC和NHS混合溶液中，室温反应30min；
i、向上述混合溶液中加入巯基乙醇，淬灭未反应的EDC；
j、加入等体积的g中纯化的水溶性碳量子点溶液，室温下反应2h；
k、接着加入BSA溶液与NH4Cl溶液，室温放置10min；
n、最后用PBS透析除去未偶联的抗体及游离NHS，得到P24碳量子点偶联抗体；
3)将玻璃纤维膜放入含有蔗糖、BSA、吐温的磷酸缓冲液中浸透，取出干燥后放入上述制取的P24碳量子点偶联抗体中浸泡10min，再取出晾干，得到P24碳量子点垫；
4)待上述P24碳量子点垫干燥后，4℃保存，
(2)在所述底板上依次相互搭接地粘结所述样品垫、P24碳量子点垫、P24硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸板；
(3)将试纸板切割成若干条符合规定宽度的试纸条，并将试纸条密封保存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：上述(1)中P24硝酸纤维素 膜制备是在硝酸纤维素膜上均匀地喷上分别针对Test区和Control区的P24抗体和羊抗鼠IgG，室温下干燥后用适当浓度的BSA溶液进行封闭，然后用Na2HPO4洗涤液漂洗三次，室温下充分干燥后，4℃保存。
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