发明内容
本发明的目的在于提供一种针对药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条。
本发明的另一个目的在于提供一种用于观测上述免疫层析试纸条的观测装置。
本发明的试纸条包括样品垫、标记物垫、分析膜、吸水垫、终点指示带和底板。根据药物小分子只具备单抗原决定位点,利用竞争抑制免疫层析原理,制备试纸条各部分组件。
其中,标记物垫固定有量子点标记的药物分子抗体,所述标记物垫可以由玻璃纤维制成。所述量子点的内核可以是CdS、CdSe、CdTe,选择不同粒径大小(1-10nm),外壳为ZnS、ZnSe或ZnTe,其外可再 包裹SiO2结构。制备的量子点荧光光谱特征各异,其荧光发射波长可涵盖整个可见光谱,用不同荧光光谱特征的量子点可实现对药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的多色标记。标记物垫可通过如下方法制备:首先对量子点表面进行修饰使其带有-COOH或-NH2基团,用PBS将量子点稀释至1-10nM,将EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)和NHS(Nhydroxysuccinimide)的PBS溶液加入到量子点中,然后加入药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的PBS溶液,进行标记反应,纯化标记产物,然后将量子点标记的药物分子单克隆抗体或多克隆抗体稀释至0.5-2μg/ml,喷涂在标记物垫(玻璃纤维膜)上,真空干燥,即得。
其中,分析膜上具有检测带和质控带,所述检测带包被有药物分子-载体蛋白偶联物,所述质控带包被有二抗,所述分析膜可以是硝酸纤维膜或醋酸纤维膜。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。所述二抗可以为抗兔抗体或抗鼠抗体。分析膜上可喷涂浓度为10-500μg/ml药物分子-载体蛋白偶联物作检测带,喷涂浓度为10-200μg/ml抗兔抗体或抗鼠抗体作质控带,再用0.5-2%牛血清白蛋白封闭分析膜。制备时要求检测带与质控带平行,将膜干燥后放置于4℃待用。
其中,终点指示带可以是变色范围为5.5-9.0的精密pH试纸粘贴而成。
进一步可以将上述试纸条装入检测卡外壳中,以方便使用。本发明检测卡外壳具有加样孔、检测窗和终点指示窗,加样孔位于样品垫处,检测窗位于分析膜处,终点指示窗位于终点指示带处。
本发明还提供一种专用观测装置,该观测装置包括:
主体;
暗盒,位于主体内部,用于放置试纸条/检测卡;
紫外LED灯和紫外透过滤光片,位于暗盒顶部,光源经过紫外透过滤光片后给检测卡提供紫外光源,其提供的光源波长为365-370nm,优选为365nm。
观测窗,与暗盒相通,用于观测位于暗盒底部的试纸条/检测卡;
插槽,位于主体底部,与暗盒相通,用于将试纸条/检测卡插入暗盒中。
本发明试纸条灵敏度高,检测装置简单,成本低,特别适用于小分子药物残留的快速现场检测,其针对国家标准中规定在动物性食品中不得检出的药物具有显著的优势。可在海关、机场、卫生监督部门、家庭等广泛使用。
具体实施方式
如图1所示,本发明试纸条11包括样品垫1、标记物垫2、分析膜7、检测带3、质控带4、吸水垫5、终点指示带6、底板8组成。根据药物小分子只具备单抗原决定位点,利用竞争抑制免疫层析原理 (图3、4、5),依次制备试纸条11各部分组件。其包括:
a.样品垫1;
b.标记物垫2,选用玻璃纤维膜,其上固定有量子点标记药物分子抗体;
c.分析膜7,选用硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜,其上有检测带3和质控带4,检测带3喷涂药物分子-载体蛋白偶联物,质控带4喷涂抗兔抗体或抗鼠抗体;
d.吸水垫5,通过虹吸作用提供液体流过整个试纸条11的动力;
e.终点指示带6,将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸贴于吸水垫5上作为终点指示带6;
f.底板8,选用单面聚脂或塑料板,其中一面涂有粘胶;
上述样品垫1、标记物垫2、分析膜7、吸水垫5,通过粘胶固定于底板8上。
上述各部分之间是相互重叠的,保证了液体在试纸条11上流动的连续性。当进行检测时,将样品滴加到样品垫1上,样品通过渗透与虹吸作用进入标记物垫2,使其中的量子点标记药物分子抗体重新溶解游离,并在吸水垫5的虹吸作用下,离开标记物垫2进入分析膜7,在其内部向吸水垫5的方向流动。此过程量子点标记药物分子抗体、被检药物分子、检测带3上的药物分子-载体蛋白偶联物、质控带4上的二抗之间将特异地发生一定的免疫反应。剩余的液体基质继续向吸水垫5流动,并与其上pH试纸内的指示剂发生反应,使其由黄色变为绿色,变色后的试纸条11插入利用紫外LED(芯片波长在365-370nm)光源的观测装置进行判读。
如图2所示,将试纸条11包装到检测卡外壳13中,构成检测卡,从而方便使用。本发明检测卡的外壳具有加样孔9、检测窗10和终点指示窗13,加样孔9位于样品垫1处,检测窗10位于分析膜7处,终点指示窗13位于终点指示带6处。
如图6和7所示,本发明观测装置包括主体14、暗盒、观测窗15、插槽16、紫外灯17(LED)以及电源18和开关19和紫外透过滤光片20(可透过的光源波长为365-370nm,优选为365nm。)。所述暗盒位于主体14内,暗盒底部用于放置试纸条11或检测卡;紫外LED灯17位于暗盒顶部,用于提供观测光源;观察窗与暗盒相通,通过观察窗可以看到位于暗盒底部的试纸条11或检测卡的检测带3和质控带4;插槽16与暗盒相通,用于将试纸条11或检测卡插入暗盒中。试纸条11和检测卡不必要全部插入到暗盒中,只需将检测带3以及质控带4呈现在暗盒底部即可。
当对阳性样品进行检测时,可以分为两种情况:被检物浓度高、被检物浓度较低。
附图3为被检药物分子浓度高时的竞争免疫反应的示意图。当样品中被检物浓度高时,加样后样品中的被检药物分子和玻璃纤维膜2中的量子点标记药物分子抗体全部结合,因而,在吸水垫5的带动下,与样品中的液体基质一起进入分析膜7的只有量子点标记药物分子抗体与被检药物分子免疫复合物。当其流过检测带3,由于免疫复合物量子点标记药物分子抗体与被检药物分子结合,所以不能再与检测带3上药物分子-载体蛋白偶联物结合。量子点标记药物分子抗体与被检药物分子免疫复合物继续流动,当流过质控带4时发生免疫复合物中抗体与二抗的免疫反应,并将量子点标记药物分子抗体与被检药物分子免疫复合物固定其上,剩余的液体基质继续向吸水垫5流动,终点指示带6变色后将检测卡插入观测装置进行判读,检测带3无荧光线,质控带4有荧光线。
附图4为被检药物分子浓度低时的竞争免疫反应的示意图。当样品中被检物浓度较低时,加样后样品中的被检药物分子首先和结合垫中的量子点标记药物分子抗体相结合。然后,二者形成量子点标记药物分子抗体与被检药物分子的免疫复合物以及游离的量子点标记药 物分子抗体,与样品中的液体基质一起在吸水垫5的带动下进入分析膜7。当其流过检测带3时,由于免疫复合物中量子点标记药物分子抗体已与被检药物分子结合,因而只有游离的量子点标记药物分子抗体可与检测带3上药物分子-载体蛋白偶联物结合,并被固定。剩余的量子点标记药物分子抗体与被检药物分子的免疫复合物继续流动,当流过质控带4时发生免疫复合物中抗体与二抗的免疫反应,并将量子点标记药物分子抗体与被检药物分子免疫复合物固定其上,剩余的液体基质继续向吸水垫5流动,终点指示带6变色后将检测卡插入观测装置进行判读,检测带3与质控带4上均有可见荧光,检测带3的荧光线强度与样品中含有的被检物浓度成反比。
附图5为对阴性样品进行检测时的竞争免疫反应的示意图。由于样品中不含有被检药物分子,因而重新溶解游离,并随样品的液体基质一起进入分析膜7的只有量子点标记药物分子抗体。其与检测带3上药物分子-载体蛋白偶联物、质控带4上的二抗均可结合。在观测装置中判读,检测带3和质控带4均有荧光线。但此时的检测带3的荧光线与阳性检测低浓度时相比达到最强。
本发明试纸条11可通过如下方式制备获得:
1、量子点标记目标物抗体
本发明选用量子点,具有多波长激发、高强度荧光发射,发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好、且无毒的特点,用于标记药物分子(即被测物)的抗体。所述的量子点内核,如:CdS、CdSe、CdTe,选择不同粒径大小(1-10nm),外壳为ZnS、ZnSe或ZnTe,可制备多种荧光光谱特征各异的量子点,其荧光发射波长可涵盖整个可见光谱,用不同荧光光谱特征的量子点可实现对药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的多色标记。在对量子点表面进行修饰后带有-COOH或-NH2基团,用PBS(pH7.2)将量子点稀释至1-10nM(pH7.5),将EDC和NHS的PBS溶液加入到量子点中,然后加入药物分子单克隆抗体或多克 隆抗体的PBS溶液,16℃反应2h,用Tris终止反应,透析30-60分钟后,将标记产物上Sephadex G200层析柱,用PBS(pH7.4)洗脱,纯化得到量子点标记抗体产物,于4℃保存备用。
2、玻璃纤维膜2和分析膜7的处理
将量子点标记的药物分子单克隆抗体或多克隆抗体稀释至0.5-2μg/ml,喷涂在10mm×300mm玻璃纤维膜2上,真空干燥后封袋,4-8℃保存;分析膜7选用硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜,其上喷涂浓度为10-500μg/ml药物分子-载体蛋白偶联物作检测带3,喷涂浓度为10-200μg/ml抗兔抗体或抗鼠抗体作质控带4,再用0.5-2%牛血清白蛋白封闭分析膜7。制备时要求检测带3与质控带4平行,将膜干燥后放置于4℃待用。
3、免疫层析检测卡的制备
在单面聚脂或塑料板上,依次粘贴样品垫1、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜2、已平行包被抗体的硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜,以及吸水垫5和pH试纸,各层之间都要紧密相连,粘贴好后切成3-5mm宽的试纸条,将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上,即得到免疫层析试纸条11,干燥后组装进检测卡封装,4-25℃避光保存。
4、样品的测试和结果判断
用滴管将待测样品液滴于样品槽中,待终点指示窗13颜色改变后插入观测装置的插槽16中,在经过紫外透过滤光片的紫外光激发下,观察检测带3和质控带4的荧光强度变化。当检测带3无荧光线,质控带4有荧光线时,表明样品中被检物浓度高于试纸条或检测卡的最低检出浓度;当检测带3与质控带4上均有可见荧光线,表明样品中被检物浓度低于试纸条或检测卡的最低检出浓度,检测带3的荧光线强度变化与样品中含有的被检物浓度成反比。当检测带3与质控带4处都没有荧光,说明检测无效。
下面结合实施例进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一:
分别取NaBH4 0.5g以及Te粉1.68g溶解在20ml蒸馏水中,在氮气保护下反应生成NaHTe,然后用浓氨水调节pH值至8.5,加入CdCl2·2.5H2O 1.5g,水浴90℃,磁力搅拌,加热回流。在80分钟反应时间内,隔一定时间取出含CdTe的水溶液样品,反应时间不同得到的量子点的粒径不同,离心沉降后,用蒸馏水洗涤4次,即获得CdTe量子点,将CdTe制成0.5mg/ml的水溶液。然后在通Ar保护下,向CdTe量子点溶液中缓慢加入Zn前驱体与S前驱体至终浓度分别为0.45mg/ml、0.16mg/ml(新鲜配制的220mg/ml醋酸锌和1mg/ml硫化钠水溶液),磁力搅拌,100℃水浴回流,充分反应后,即可得到黄色至粉红色胶状CdTe/ZnS核壳结构量子点。经洗涤、离心沉降和冷冻干燥后,即可得到粉末状的物质。将核壳结构CdTe/ZnS量子点样品粉末,分别分散在巯基乙酸中,搅拌、加热、回流,在40℃下反应12h后,产物用丙酮做清洗液反复离心分离、超声清洗以清除未和量子点化学结合的巯基乙酸。最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。经过表面改性后,CdTe/ZnS量子点可以稳定地分散在PBS中,没有浑浊沉淀现象。选用内核粒径为2.6-3nm的量子点,在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与克伦特罗(Clenbuterol,CLE)多克隆兔抗体(杭州宝兴科技有限公司)连接,室温搅拌反应2小时,用SephadexG-200层析柱分离纯化,得到量子点标记的CLE抗体。将标记好量子点的CLE抗体与CLE抗体等体积混合,均匀的喷涂在玻璃纤维膜上,每毫升溶液铺2平方厘米,干燥后封袋,放置4℃保存备用。
在硝酸纤维素膜上用机器划两条平行带,两条带间隔10mm,两条带宽都为1.5mm,其中一条带上喷涂克伦特罗-卵清蛋白(CLE-OVA)偶联物(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至3mg/mL)形成检测带;另一条带上喷涂羊抗兔二抗形成质控带,室温晾干20分钟后,再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟,干燥后封袋,放置4℃保存备用。
在单面聚脂板上,依次粘贴上纤维素滤膜(长30cm,宽2cm)、涂有量子点标记的CLE抗体的玻璃纤维膜(长30cm,宽度根据抗体的滴度与实验要求确定,这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30cm,宽3cm)、已平行包被抗原抗体的硝酸纤维素膜(长30cm,宽2.5cm)、吸水纸(长30cm,宽2cm)、膜与膜之间都要紧密相连,制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条,将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上,干燥后组装进检测卡封装,4-25℃避光保存。
在单面塑料板上,依次粘贴上玻璃纤维(长30厘米,宽2厘米)、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜(长30厘米,宽度根据抗体的滴度与实验要求确定,这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30厘米,宽3厘米)、已平行包被抗原抗体的硝酸纤维素膜(长30厘米,宽2.5厘米),最后贴上长30厘米,宽2厘米的吸水纸,吸收层析后多余的溶液,膜与膜之间都要紧密相连,制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成5mm宽的免疫试纸条,将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上,封装干燥下,4-25℃避光保存。
将采集的猪尿液直接滴加在检测卡的加样孔内,带指示窗内试纸显色后,将检测卡插入观测装置的插槽内,打开电源,在经过紫外透过滤光片的紫外光激发下观察结果。当检测带无荧光线,质控带有红色荧光线时,说明样品中CLE高于最低检出浓度;当检测带与质控带上均有红色荧光线,说明样品中CLE低于最低检出浓度,检测带 的荧光线强度与样品中含有的CLE浓度成反比;如果检测带与质控带处都没有荧光,说明检测无效。按照该方法,对10份样品进行检测,并使用CLE金标检测卡(购自杭州宝兴科技有限公司)按说明书操作进行检测,结果表明两者的检测结果相一致。
使用克伦特罗标准品,配置以下浓度的标准品0.00ng/ml、0.05ng/ml、0.10ng/ml、0.4ng/ml、1.00ng/ml、4ng/ml,按照上述方法进行检测,结果表明该试纸条的检测灵敏度达0.1ng/mL,并且批内与批间重复性性较好,可用于食品中克伦特罗药物残留的检测。
实施例二:
将1.2mL 0.15mol/L CdSO4以约20mL去离子水稀释,向此溶液中注入0.6mL质量分数为2.0%柠檬酸三钠溶液,再将0.75mL 0.2mol/L Na2S加入此混合液中反应,隔一定时间取CdS溶液样品,反应时间不同得到的量子点的粒径不同,用丙酮破乳洗涤、离心分离,收集沉淀,即得产物CdS量子点。分别取NaBH40.5g以及Se粉0.5g溶解在20ml蒸馏水中,在氮气保护下反应生成NaHSe,然后用浓氨水调节pH值至8.8,然后将20mmol/L ZnCl和20mmol/L巯基丙酸等体积比混合,调节pH值至11,注入NaHSe溶液至浓度为3mmol/L,得到ZnSe溶液。然后CdS量子点溶液缓慢加入到ZnSe溶液中,CdS量子点和ZnSe单体的摩尔比为1∶1,制得的溶液在96℃下反应15分钟可得到CdS/ZnSe核壳型量子点。产物用丙酮做清洗液反复离心分离、超声清洗以清除未和量子点化学结合的巯基乙酸。最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。经过表面改性后,CdS/ZnSe量子点可以稳定地分散在PBS中,没有浑浊沉淀现象。选用内核粒径为5.2-6.2nm的量子点,在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与沙丁胺醇(Salbutamol,SAL)多克隆兔抗体(购自杭州宝兴科技有限公司)连接,室温搅拌反应2小时,用Sephadex G-200层析柱分离纯化, 得到量子点标记的SAL抗体。选用内核粒径为2.6-3nm的量子点,在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与克伦特罗(Clenbuterol,CLE)多克隆兔抗体(购自杭州宝兴科技有限公司)连接,室温搅拌反应2小时,用Sephadex G-200层析柱分离纯化,得到量子点标记的CLE抗体。将标记好量子点的SAL抗体与CLE抗体等体积混合,均匀的喷涂在玻璃纤维膜上,每毫升溶液铺2平方厘米,干燥后封袋,放置4℃保存备用。
在硝酸纤维素膜上用机器划三条平行带,每条带间隔5mm,带宽都为1.5mm,第一条带上喷涂SAL-OVA偶连物(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至2.5mg/mL)形成检测带A;第二条带上喷涂CLE-OVA偶连物(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至2mg/mL)形成检测带B;第三条带上喷涂羊抗兔二抗形成质控带,室温晾干20分钟后,再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟,干燥后封袋,放置4℃保存备用。
在单面塑料板上,依次粘贴上玻璃纤维(长30cm,宽2cm)、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜(长30cm,宽度根据抗体的滴度与实验要求确定,这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30cm,宽3cm)、已平行包被三种抗原抗体的硝酸纤维素膜(长30cm,宽2.5cm),最后贴上长30cm,宽2cm的吸水纸,吸收层析后多余的溶液,膜与膜之间都要紧密相连,制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成5mm宽的免疫试纸条,将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上,封装干燥下,4-25℃避光保存。
将采集的猪尿液直接滴加在检测卡的加样孔内,待指示窗内试纸显色后,将检测卡插入观测装置的插槽内,打开电源,在经过紫外透过滤光片的紫外光激发下观察结果。如果膜上的检测带与质控带处都有荧光(检测带A为红色荧光,检测带B为绿色荧光,质控带黄色荧光),即三条荧光,说明待测样品中的SAL和CLE均低于最低检出浓 度;如果检测带A为红色荧光,检测带B无荧光,质控带为黄色荧光,说明待测样品中SAL低于最低检出浓度,而CLE高于最低检出浓度;如果检测带A无荧光,检测带B有绿色荧光,质控带为黄色荧光,说明待测样品中SAL高于最低检出浓度,而CLE低于最低检出浓度;如果只有质控带有黄色荧光,即一条荧光,说明待测样品中SAL和CLE均高于最低检出浓度;如果检测带与质控带处都没有荧光,说明检测无效。按照该方法,对10份样品进行检测,并使用SAL金标检测卡和CLE金标检测卡(购自杭州宝兴科技有限公司)按说明书操作进行检测,结果表明两者的检测结果相一致。
使用SAL以及CLE的标准品,分别配置以下浓度的标准品0.00ng/ml、0.05ng/ml、0.15ng/ml、0.45ng/ml、1.00ng/ml、4ng/ml,按照上述方法进行检测,结果表明该试纸条检测SAL的灵敏度为0.1ng/mL,检测CLE的灵敏度为0.1ng/mL,批内与批间重复性性较好,一次可检测食品中沙丁胺醇和克伦特罗药物残留。
实施例三:
分别取NaBH4 0.5g以及Se粉0.5g溶解在20ml蒸馏水中,在氮气保护下反应生成NaHSe,然后用浓氨水调节pH值至8.2,加入CdCl2·2.5H2O 1.5g,水浴90℃,磁力搅拌,加热回流。在100分钟反应时间内,隔一定时间取出含CdSe的水溶液样品,反应时间不同得到的量子点的粒径不同,离心沉降后,用蒸馏水洗涤4次,即获得CdSe量子点,将CdTe制成0.5mg/ml的水溶液。然后在通Ar保护下,向CdSe量子点溶液中缓慢加入Zn前驱体与S前驱体至终浓度分别为0.45mg/ml和0.16mg/ml(新鲜配制的220mg/ml醋酸锌和1mg/ml硫化钠水溶液),磁力搅拌,100℃水浴回流,充分反应后,即可得到黄色至粉红色胶状CdSe/ZnS核壳结构量子点。经洗涤、离心沉降和冷冻干燥后,即可得到粉末状的物质。将制备的量子点分散于无水乙醇中,浓度控制在15mg/ml,移入三颈烧瓶中,通N2,室 温下加入水、氨水(无水乙醇、水、氨水摩尔比为98∶31∶4),适量DMF,温和搅拌15分钟后,加入适量正硅酸乙酯,剧烈搅拌反应2天,反应混合物经高速离心分离,水和无水乙醇交替洗涤后,重新分散于蒸馏水得最终量子点(硅壳量子点),硅壳结构量子点无毒且生物亲和性也较好。将硅壳量子点样品粉末,分别分散在巯基乙酸中,搅拌、加热、回流,在40℃下反应12h后,产物用丙酮做清洗液反复离心分离、超声清洗以清除未和量子点化学结合的巯基乙酸。最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。经过表面改性后,CdSe/ZnS/SiO2量子点可以稳定地分散在PBS中,没有浑浊沉淀现象。选用内核粒径为5.2-6.2nm的量子点,在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)多克隆兔抗体(购自杭州宝兴科技有限公司)连接,室温搅拌反应2小时,用Sephadex G-200层析柱分离纯化,得到量子点标记的抗体。将标记好量子点的抗体均匀的喷涂在玻璃纤维膜上,每毫升溶液铺4平方厘米,干燥后封袋,放置4℃保存备用。
在硝酸纤维素膜上用机器划两条平行带,两条带间隔10mm,两条带宽都为1.5mm,其中一条带上喷涂莱克多巴胺-卵清蛋白(RAC-OVA)偶联物(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至3mg/mL)形成检测带;另一条带上喷涂羊抗兔二抗形成质控带,室温晾干20分钟后,再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟,干燥后封袋,放置4℃保存备用。
在单面聚脂板上,依次粘贴上纤维素滤膜(长30cm,宽2cm)、涂有量子点标记的RAC抗体的玻璃纤维膜(长30cm,宽度根据抗体的滴度与实验要求确定,这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30cm,宽3cm)、已平行包被抗原抗体的硝酸纤维素膜(长30cm,宽2.5cm)、吸水纸(长30cm,宽2cm)、膜与膜之间都要紧密相连,制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫 试纸条,将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上,干燥后组装进检测卡封装,4-25℃避光保存。
将采集的猪尿液直接滴加在检测卡的加样孔内,带指示窗内试纸显色后,将检测卡插入观测装置的插槽内,打开电源,在经过紫外透过滤光片的紫外光激发下观察结果。当检测带无荧光线,质控带有红色荧光线时,说明样品中RAC高于最低检出浓度;当检测带与质控带上均有红色荧光线,说明样品中RAC低于最低检出浓度,检测带的荧光线强度与样品中含有的RAC浓度成反比;如果检测带与质控带处都没有荧光,说明检测无效。按照该方法,对10份样品进行检测,并使用RAC金标检测卡(购自杭州宝兴科技有限公司)按说明书操作进行检测,结果表明两者的检测结果相一致。
使用莱克多巴胺标准品,配置以下浓度的标准品0.00ng/ml、0.05ng/ml、0.15ng/ml、0.45ng/ml、1.00ng/ml、4ng/ml,按照上述方法进行检测,结果表明该试纸条的检测灵敏度达0.05ng/mL,并且批内与批间重复性性较好,可用于食品中莱克多巴胺药物残留的检测。