CN101551398A - 药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条及其观测装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条/检测卡及其观测装置。本发明将量子点标记药物分子的抗体涂覆于玻璃纤维膜上，药物分子－载体蛋白偶联物与二抗分别包被在硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜上形成检测带与质控带；在聚酯或塑料板上将玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜制成免疫层析试纸条并组装外壳。通过观测装置的紫外LED光源激发试纸条上检测带和质控带的量子点，观察检测带和质控带的荧光强度变化，可以定性分析样品中药物分子的含量。本发明操作简单、高灵敏、快速定量，适用于食品中药物残留的检测，可在海关、机场、卫生监督部门、家庭等广泛使用。

Description

药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条及其观测装置

技术领域

本发明涉及生物快速检测技术，具体涉及一种药物残留竞争型量子点标记免疫层析检测卡及其观测装置。

背景技术

随着畜牧业的现代化、集约化、规模化和商品化生产，抗菌素和饲料添加剂在降低动物发病率与死亡率，提高饲料利用率、促生长等方面起到了十分显著的作用。但是，由于受经济利益的驱使，生产中滥用抗菌素和超标使用添加剂，使兽药在畜禽产品中的残留已严重影响到动物性食品的质量和卫生安全，对人们的生命安全构成威胁，主要表现为变态反应、细菌耐药性、三致作用(致癌、致畸、致突变)以及激素(样)作用等。除了食品安全的原因，应对绿色贸易壁垒，维护国家利益，也要求我们必须解决食品安全的检测技术问题。

2007年5月29日开始实施的日本食品中残留农业化学品肯定列表制度，这项制度涉及了所有农业化学品的管理，范围之广、标准之严前所未有，堪称为世界上最苛刻的残留标准，日本是我国农产品出口大市场，这一新标准将大大提高我国农产品企业的出口成本。其他一些国家和地区仿效日本，正在研究制订类似标准。“肯定列表”制度分为“暂定标准”和“一律标准”，前者对734种农药、兽药及饲料添加剂设定1万多个最大允许残留标准；后者则对尚不属于具体“暂定标准”的农药、兽药及饲料添加剂，设定0.01ppm(即0.01mg/kg)。“暂定标准”有50000多项，涉及农药500余种，兽药和饲料添加剂200余种。在“暂定标准”中，我国尚没有限量标准的农业化学品达492种、33418项，涉及食品、农产品262种；对同一种产品，日本暂定标准指标严于我国现行标准的有74种247项。这些绿色贸易壁垒不仅仅是对我国的农产品出口提出了挑战，更深层次的是对我们的检测技术和监控技术的挑战：即要实现检测的高通量、高灵敏度、高准确度和低成本。当前世界各国政府正在不断加强药物残留的监测工作，对药物残留检测灵敏度和效率的要求逐步提高，对快速检测分析新技术的开发也日益重视。常规的药物残留分析方法如液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱(MS)法等，均存在着样品前处理复杂、仪器设备昂贵、分析费时长、要求熟练的技术人员才能完成等问题。并且这些方法不能满足样品现场快速检测的要求，迫使人们运用新的原理和方法去开发特异性强、灵敏度高、方便快捷、准确安全的快速检测新技术。

免疫分析被称为使用抗体作为生物化学检测器的分析技术，它是基于抗原抗异性识别和结合反应为基础的分析方法。小分子量药物分子(MW＜2500)一般不具备免疫原性，不能刺激动物产生免疫反应。将药物小分子以半抗原的形式通过一定碳链长度的连接分子与分子量大的载体(一般为蛋白质)共价键相偶联制备成人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反应，产生对该药物具特异性的活性物质(免疫球蛋白或称抗体)来识别该药物分子并与之结合。这样结合反应不仅可在体内进行，也可在体外进行，符合质量作用定律，这是免疫分析的基础。通过对半抗原或抗体进行标记(酶、荧光物质、放射性同位素标记等)，利用标记物的生理或物理或化学放大作用，对样品中特定的药物残留进行定性定量检测。目前应用最多的免疫分析技术主要有ELISA方法和免疫层析，其中免疫胶体金层析试纸条最为快速、便捷和直观。但胶体金试纸条的很多产品检测限一般都在0.1ng/ml以上，针对食品中很多药物残留为不得检出的严格限量，因此免疫胶体金层析技术在灵敏度方面还没有达到目前检测行业的要求。

中国发明专利申请(公开号为CN 1811449A)涉及一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，将量子点标记目标物的抗体涂覆于玻璃纤维膜上，目标物的另一抗体与二抗分别包被在硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜上形成检测带与质控带，在聚脂或塑料板上将上面制备的玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜制成免疫层析试纸条，利用双抗体夹心法原理结合量子点的荧光性质检测样品中是否含有目标物，在普通紫外灯照射下，通过观察免疫层析试纸条上检测带与质控带的荧光线，判断检测结果；用不同粒径或种类的量子点标记不同目标物的抗体，能实现多组分的同时检测。此方法直观性强，检测灵敏度高，但只适合检测大分子质量待测物质，对于大多数药物分子(MW＜2500)的检测，则不再适用。因为待测小分子只具备单抗原决定位点，一旦和抗体一结合，抗体二很难再和小分子进行特异性结合。并且此方法选用的紫外灯为波长在320-400nm中心波长360nm的普通紫外灯，照射试纸条后，除了相应检测带和质控带被激发荧光外，由于385-400nm区域的可见紫光使膜背景提高，影响观测效果，另外偏向320nm波长小的光源照射使量子点产生的荧光强度高，影响检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条。

本发明的另一个目的在于提供一种用于观测上述免疫层析试纸条的观测装置。

本发明的试纸条包括样品垫、标记物垫、分析膜、吸水垫、终点指示带和底板。根据药物小分子只具备单抗原决定位点，利用竞争抑制免疫层析原理，制备试纸条各部分组件。

其中，标记物垫固定有量子点标记的药物分子抗体，所述标记物垫可以由玻璃纤维制成。所述量子点的内核可以是CdS、CdSe、CdTe，选择不同粒径大小(1-10nm)，外壳为ZnS、ZnSe或ZnTe，其外可再包裹SiO₂结构。制备的量子点荧光光谱特征各异，其荧光发射波长可涵盖整个可见光谱，用不同荧光光谱特征的量子点可实现对药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的多色标记。标记物垫可通过如下方法制备：首先对量子点表面进行修饰使其带有-COOH或-NH₂基团，用PBS将量子点稀释至1-10nM，将EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)和NHS(Nhydroxysuccinimide)的PBS溶液加入到量子点中，然后加入药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的PBS溶液，进行标记反应，纯化标记产物，然后将量子点标记的药物分子单克隆抗体或多克隆抗体稀释至0.5-2μg/ml，喷涂在标记物垫(玻璃纤维膜)上，真空干燥，即得。

其中，分析膜上具有检测带和质控带，所述检测带包被有药物分子-载体蛋白偶联物，所述质控带包被有二抗，所述分析膜可以是硝酸纤维膜或醋酸纤维膜。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。所述二抗可以为抗兔抗体或抗鼠抗体。分析膜上可喷涂浓度为10-500μg/ml药物分子-载体蛋白偶联物作检测带，喷涂浓度为10-200μg/ml抗兔抗体或抗鼠抗体作质控带，再用0.5-2％牛血清白蛋白封闭分析膜。制备时要求检测带与质控带平行，将膜干燥后放置于4℃待用。

其中，终点指示带可以是变色范围为5.5-9.0的精密pH试纸粘贴而成。

进一步可以将上述试纸条装入检测卡外壳中，以方便使用。本发明检测卡外壳具有加样孔、检测窗和终点指示窗，加样孔位于样品垫处，检测窗位于分析膜处，终点指示窗位于终点指示带处。

本发明还提供一种专用观测装置，该观测装置包括：

主体；

暗盒，位于主体内部，用于放置试纸条/检测卡；

紫外LED灯和紫外透过滤光片，位于暗盒顶部，光源经过紫外透过滤光片后给检测卡提供紫外光源，其提供的光源波长为365-370nm，优选为365nm。

观测窗，与暗盒相通，用于观测位于暗盒底部的试纸条/检测卡；

插槽，位于主体底部，与暗盒相通，用于将试纸条/检测卡插入暗盒中。

本发明试纸条灵敏度高，检测装置简单，成本低，特别适用于小分子药物残留的快速现场检测，其针对国家标准中规定在动物性食品中不得检出的药物具有显著的优势。可在海关、机场、卫生监督部门、家庭等广泛使用。

附图说明

图1是本发明试纸条结构示意图；

图2是装有试纸条的检测卡；

图3是被检药物分子浓度高时的竞争免疫反应的示意图；

图4是被检药物分子浓度低时的竞争免疫反应的示意图；

图5是对阴性样品进行检测时的竞争免疫反应的示意图；

图6是本发明观测装置的主视图；

图7是本发明观测装置的结构示意图。

图中，1、样品垫；2、标记物垫；3、检测带；4、质控带；5、吸水垫；6、终点指示带；7、分析膜；8、底板；9、加样孔；10、检测窗；11、试纸条；12、终点指示窗；13、检测卡外壳；14、主体；15、观测窗；16、插槽；17、紫外灯；18、电源；19、开关；20、紫外透过滤光片。

具体实施方式

如图1所示，本发明试纸条11包括样品垫1、标记物垫2、分析膜7、检测带3、质控带4、吸水垫5、终点指示带6、底板8组成。根据药物小分子只具备单抗原决定位点，利用竞争抑制免疫层析原理(图3、4、5)，依次制备试纸条11各部分组件。其包括：

a.样品垫1；

b.标记物垫2，选用玻璃纤维膜，其上固定有量子点标记药物分子抗体；

c.分析膜7，选用硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，其上有检测带3和质控带4，检测带3喷涂药物分子-载体蛋白偶联物，质控带4喷涂抗兔抗体或抗鼠抗体；

d.吸水垫5，通过虹吸作用提供液体流过整个试纸条11的动力；

e.终点指示带6，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸贴于吸水垫5上作为终点指示带6；

f.底板8，选用单面聚脂或塑料板，其中一面涂有粘胶；

上述样品垫1、标记物垫2、分析膜7、吸水垫5，通过粘胶固定于底板8上。

上述各部分之间是相互重叠的，保证了液体在试纸条11上流动的连续性。当进行检测时，将样品滴加到样品垫1上，样品通过渗透与虹吸作用进入标记物垫2，使其中的量子点标记药物分子抗体重新溶解游离，并在吸水垫5的虹吸作用下，离开标记物垫2进入分析膜7，在其内部向吸水垫5的方向流动。此过程量子点标记药物分子抗体、被检药物分子、检测带3上的药物分子-载体蛋白偶联物、质控带4上的二抗之间将特异地发生一定的免疫反应。剩余的液体基质继续向吸水垫5流动，并与其上pH试纸内的指示剂发生反应，使其由黄色变为绿色，变色后的试纸条11插入利用紫外LED(芯片波长在365-370nm)光源的观测装置进行判读。

如图2所示，将试纸条11包装到检测卡外壳13中，构成检测卡，从而方便使用。本发明检测卡的外壳具有加样孔9、检测窗10和终点指示窗13，加样孔9位于样品垫1处，检测窗10位于分析膜7处，终点指示窗13位于终点指示带6处。

如图6和7所示，本发明观测装置包括主体14、暗盒、观测窗15、插槽16、紫外灯17(LED)以及电源18和开关19和紫外透过滤光片20(可透过的光源波长为365-370nm，优选为365nm。)。所述暗盒位于主体14内，暗盒底部用于放置试纸条11或检测卡；紫外LED灯17位于暗盒顶部，用于提供观测光源；观察窗与暗盒相通，通过观察窗可以看到位于暗盒底部的试纸条11或检测卡的检测带3和质控带4；插槽16与暗盒相通，用于将试纸条11或检测卡插入暗盒中。试纸条11和检测卡不必要全部插入到暗盒中，只需将检测带3以及质控带4呈现在暗盒底部即可。

当对阳性样品进行检测时，可以分为两种情况：被检物浓度高、被检物浓度较低。

附图3为被检药物分子浓度高时的竞争免疫反应的示意图。当样品中被检物浓度高时，加样后样品中的被检药物分子和玻璃纤维膜2中的量子点标记药物分子抗体全部结合，因而，在吸水垫5的带动下，与样品中的液体基质一起进入分析膜7的只有量子点标记药物分子抗体与被检药物分子免疫复合物。当其流过检测带3，由于免疫复合物量子点标记药物分子抗体与被检药物分子结合，所以不能再与检测带3上药物分子-载体蛋白偶联物结合。量子点标记药物分子抗体与被检药物分子免疫复合物继续流动，当流过质控带4时发生免疫复合物中抗体与二抗的免疫反应，并将量子点标记药物分子抗体与被检药物分子免疫复合物固定其上，剩余的液体基质继续向吸水垫5流动，终点指示带6变色后将检测卡插入观测装置进行判读，检测带3无荧光线，质控带4有荧光线。

附图4为被检药物分子浓度低时的竞争免疫反应的示意图。当样品中被检物浓度较低时，加样后样品中的被检药物分子首先和结合垫中的量子点标记药物分子抗体相结合。然后，二者形成量子点标记药物分子抗体与被检药物分子的免疫复合物以及游离的量子点标记药物分子抗体，与样品中的液体基质一起在吸水垫5的带动下进入分析膜7。当其流过检测带3时，由于免疫复合物中量子点标记药物分子抗体已与被检药物分子结合，因而只有游离的量子点标记药物分子抗体可与检测带3上药物分子-载体蛋白偶联物结合，并被固定。剩余的量子点标记药物分子抗体与被检药物分子的免疫复合物继续流动，当流过质控带4时发生免疫复合物中抗体与二抗的免疫反应，并将量子点标记药物分子抗体与被检药物分子免疫复合物固定其上，剩余的液体基质继续向吸水垫5流动，终点指示带6变色后将检测卡插入观测装置进行判读，检测带3与质控带4上均有可见荧光，检测带3的荧光线强度与样品中含有的被检物浓度成反比。

附图5为对阴性样品进行检测时的竞争免疫反应的示意图。由于样品中不含有被检药物分子，因而重新溶解游离，并随样品的液体基质一起进入分析膜7的只有量子点标记药物分子抗体。其与检测带3上药物分子-载体蛋白偶联物、质控带4上的二抗均可结合。在观测装置中判读，检测带3和质控带4均有荧光线。但此时的检测带3的荧光线与阳性检测低浓度时相比达到最强。

本发明试纸条11可通过如下方式制备获得：

1、量子点标记目标物抗体

本发明选用量子点，具有多波长激发、高强度荧光发射，发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好、且无毒的特点，用于标记药物分子(即被测物)的抗体。所述的量子点内核，如：CdS、CdSe、CdTe，选择不同粒径大小(1-10nm)，外壳为ZnS、ZnSe或ZnTe，可制备多种荧光光谱特征各异的量子点，其荧光发射波长可涵盖整个可见光谱，用不同荧光光谱特征的量子点可实现对药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的多色标记。在对量子点表面进行修饰后带有-COOH或-NH₂基团，用PBS(pH7.2)将量子点稀释至1-10nM(pH7.5)，将EDC和NHS的PBS溶液加入到量子点中，然后加入药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的PBS溶液，16℃反应2h，用Tris终止反应，透析30-60分钟后，将标记产物上Sephadex G200层析柱，用PBS(pH7.4)洗脱，纯化得到量子点标记抗体产物，于4℃保存备用。

2、玻璃纤维膜2和分析膜7的处理

将量子点标记的药物分子单克隆抗体或多克隆抗体稀释至0.5-2μg/ml，喷涂在10mm×300mm玻璃纤维膜2上，真空干燥后封袋，4-8℃保存；分析膜7选用硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，其上喷涂浓度为10-500μg/ml药物分子-载体蛋白偶联物作检测带3，喷涂浓度为10-200μg/ml抗兔抗体或抗鼠抗体作质控带4，再用0.5-2％牛血清白蛋白封闭分析膜7。制备时要求检测带3与质控带4平行，将膜干燥后放置于4℃待用。

3、免疫层析检测卡的制备

在单面聚脂或塑料板上，依次粘贴样品垫1、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜2、已平行包被抗体的硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，以及吸水垫5和pH试纸，各层之间都要紧密相连，粘贴好后切成3-5mm宽的试纸条，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上，即得到免疫层析试纸条11，干燥后组装进检测卡封装，4-25℃避光保存。

4、样品的测试和结果判断

用滴管将待测样品液滴于样品槽中，待终点指示窗13颜色改变后插入观测装置的插槽16中，在经过紫外透过滤光片的紫外光激发下，观察检测带3和质控带4的荧光强度变化。当检测带3无荧光线，质控带4有荧光线时，表明样品中被检物浓度高于试纸条或检测卡的最低检出浓度；当检测带3与质控带4上均有可见荧光线，表明样品中被检物浓度低于试纸条或检测卡的最低检出浓度，检测带3的荧光线强度变化与样品中含有的被检物浓度成反比。当检测带3与质控带4处都没有荧光，说明检测无效。

下面结合实施例进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：

分别取NaBH₄ 0.5g以及Te粉1.68g溶解在20ml蒸馏水中，在氮气保护下反应生成NaHTe，然后用浓氨水调节pH值至8.5，加入CdCl₂·2.5H₂O 1.5g，水浴90℃，磁力搅拌，加热回流。在80分钟反应时间内，隔一定时间取出含CdTe的水溶液样品，反应时间不同得到的量子点的粒径不同，离心沉降后，用蒸馏水洗涤4次，即获得CdTe量子点，将CdTe制成0.5mg/ml的水溶液。然后在通Ar保护下，向CdTe量子点溶液中缓慢加入Zn前驱体与S前驱体至终浓度分别为0.45mg/ml、0.16mg/ml(新鲜配制的220mg/ml醋酸锌和1mg/ml硫化钠水溶液)，磁力搅拌，100℃水浴回流，充分反应后，即可得到黄色至粉红色胶状CdTe/ZnS核壳结构量子点。经洗涤、离心沉降和冷冻干燥后，即可得到粉末状的物质。将核壳结构CdTe/ZnS量子点样品粉末，分别分散在巯基乙酸中，搅拌、加热、回流，在40℃下反应12h后，产物用丙酮做清洗液反复离心分离、超声清洗以清除未和量子点化学结合的巯基乙酸。最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。经过表面改性后，CdTe/ZnS量子点可以稳定地分散在PBS中，没有浑浊沉淀现象。选用内核粒径为2.6-3nm的量子点，在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与克伦特罗(Clenbuterol，CLE)多克隆兔抗体(杭州宝兴科技有限公司)连接，室温搅拌反应2小时，用SephadexG-200层析柱分离纯化，得到量子点标记的CLE抗体。将标记好量子点的CLE抗体与CLE抗体等体积混合，均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺2平方厘米，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在硝酸纤维素膜上用机器划两条平行带，两条带间隔10mm，两条带宽都为1.5mm，其中一条带上喷涂克伦特罗-卵清蛋白(CLE-OVA)偶联物(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至3mg/mL)形成检测带；另一条带上喷涂羊抗兔二抗形成质控带，室温晾干20分钟后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在单面聚脂板上，依次粘贴上纤维素滤膜(长30cm，宽2cm)、涂有量子点标记的CLE抗体的玻璃纤维膜(长30cm，宽度根据抗体的滴度与实验要求确定，这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30cm，宽3cm)、已平行包被抗原抗体的硝酸纤维素膜(长30cm，宽2.5cm)、吸水纸(长30cm，宽2cm)、膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上，干燥后组装进检测卡封装，4-25℃避光保存。

在单面塑料板上，依次粘贴上玻璃纤维(长30厘米，宽2厘米)、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜(长30厘米，宽度根据抗体的滴度与实验要求确定，这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30厘米，宽3厘米)、已平行包被抗原抗体的硝酸纤维素膜(长30厘米，宽2.5厘米)，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水纸，吸收层析后多余的溶液，膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成5mm宽的免疫试纸条，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上，封装干燥下，4-25℃避光保存。

将采集的猪尿液直接滴加在检测卡的加样孔内，带指示窗内试纸显色后，将检测卡插入观测装置的插槽内，打开电源，在经过紫外透过滤光片的紫外光激发下观察结果。当检测带无荧光线，质控带有红色荧光线时，说明样品中CLE高于最低检出浓度；当检测带与质控带上均有红色荧光线，说明样品中CLE低于最低检出浓度，检测带的荧光线强度与样品中含有的CLE浓度成反比；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。按照该方法，对10份样品进行检测，并使用CLE金标检测卡(购自杭州宝兴科技有限公司)按说明书操作进行检测，结果表明两者的检测结果相一致。

使用克伦特罗标准品，配置以下浓度的标准品0.00ng/ml、0.05ng/ml、0.10ng/ml、0.4ng/ml、1.00ng/ml、4ng/ml，按照上述方法进行检测，结果表明该试纸条的检测灵敏度达0.1ng/mL，并且批内与批间重复性性较好，可用于食品中克伦特罗药物残留的检测。

实施例二：

将1.2mL 0.15mol/L CdSO₄以约20mL去离子水稀释，向此溶液中注入0.6mL质量分数为2.0％柠檬酸三钠溶液，再将0.75mL 0.2mol/L Na₂S加入此混合液中反应，隔一定时间取CdS溶液样品，反应时间不同得到的量子点的粒径不同，用丙酮破乳洗涤、离心分离，收集沉淀，即得产物CdS量子点。分别取NaBH₄ 0.5g以及Se粉0.5g溶解在20ml蒸馏水中，在氮气保护下反应生成NaHSe，然后用浓氨水调节pH值至8.8，然后将20mmol/L ZnCl和20mmol/L巯基丙酸等体积比混合，调节pH值至11，注入NaHSe溶液至浓度为3mmol/L，得到ZnSe溶液。然后CdS量子点溶液缓慢加入到ZnSe溶液中，CdTe量子点和ZnSe单体的摩尔比为1∶1，制得的溶液在96℃下反应15分钟可得到CdTe/ZnSe核壳型量子点。产物用丙酮做清洗液反复离心分离、超声清洗以清除未和量子点化学结合的巯基乙酸。最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。经过表面改性后，CdS/ZnSe量子点可以稳定地分散在PBS中，没有浑浊沉淀现象。选用内核粒径为5.2-6.2nm的量子点，在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)多克隆兔抗体(购自杭州宝兴科技有限公司)连接，室温搅拌反应2小时，用Sephadex G-200层析柱分离纯化，得到量子点标记的SAL抗体。选用内核粒径为2.6-3nm的量子点，在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与克伦特罗(Clenbuterol，CLE)多克隆兔抗体(购自杭州宝兴科技有限公司)连接，室温搅拌反应2小时，用Sephadex G-200层析柱分离纯化，得到量子点标记的CLE抗体。将标记好量子点的SAL抗体与CLE抗体等体积混合，均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺2平方厘米，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在硝酸纤维素膜上用机器划三条平行带，每条带间隔5mm，带宽都为1.5mm，第一条带上喷涂SAL-OVA偶连物(用0.05M pH 8.5磷酸盐缓冲液稀释至2.5mg/mL)形成检测带A；第二条带上喷涂CLE-OVA偶连物(用0.05M pH 8.5磷酸盐缓冲液稀释至2mg/mL)形成检测带B；第三条带上喷涂羊抗兔二抗形成质控带，室温晾干20分钟后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在单面塑料板上，依次粘贴上玻璃纤维(长30cm，宽2cm)、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜(长30cm，宽度根据抗体的滴度与实验要求确定，这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30cm，宽3cm)、已平行包被三种抗原抗体的硝酸纤维素膜(长30cm，宽2.5cm)，最后贴上长30cm，宽2cm的吸水纸，吸收层析后多余的溶液，膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成5mm宽的免疫试纸条，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上，封装干燥下，4-25℃避光保存。

将采集的猪尿液直接滴加在检测卡的加样孔内，待指示窗内试纸显色后，将检测卡插入观测装置的插槽内，打开电源，在经过紫外透过滤光片的紫外光激发下观察结果。如果膜上的检测带与质控带处都有荧光(检测带A为红色荧光，检测带B为绿色荧光，质控带黄色荧光)，即三条荧光，说明待测样品中的SAL和CLE均低于最低检出浓度；如果检测带A为红色荧光，检测带B无荧光，质控带为黄色荧光，说明待测样品中SAL低于最低检出浓度，而CLE高于最低检出浓度；如果检测带A无荧光，检测带B有绿色荧光，质控带为黄色荧光，说明待测样品中SAL高于最低检出浓度，而CLE低于最低检出浓度；如果只有质控带有黄色荧光，即一条荧光，说明待测样品中SAL和CLE均高于最低检出浓度；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。按照该方法，对10份样品进行检测，并使用SAL金标检测卡和CLE金标检测卡(购自杭州宝兴科技有限公司)按说明书操作进行检测，结果表明两者的检测结果相一致。

使用SAL以及CLE的标准品，分别配置以下浓度的标准品0.00ng/ml、0.05ng/ml、0.15ng/ml、0.45ng/ml、1.00ng/ml、4ng/ml，按照上述方法进行检测，结果表明该试纸条检测SAL的灵敏度为0.1ng/mL，检测CLE的灵敏度为0.1ng/mL，批内与批间重复性性较好，一次可检测食品中沙丁胺醇和克伦特罗药物残留。

实施例三：

分别取NaBH₄ 0.5g以及Se粉0.5g溶解在20ml蒸馏水中，在氮气保护下反应生成NaHSe，然后用浓氨水调节pH值至8.2，加入CdCl₂·2.5H₂O 1.5g，水浴90℃，磁力搅拌，加热回流。在100分钟反应时间内，隔一定时间取出含CdSe的水溶液样品，反应时间不同得到的量子点的粒径不同，离心沉降后，用蒸馏水洗涤4次，即获得CdSe量子点，将CdTe制成0.5mg/ml的水溶液。然后在通Ar保护下，向CdSe量子点溶液中缓慢加入Zn前驱体与S前驱体至终浓度分别为0.45mg/ml和0.16mg/ml(新鲜配制的220mg/ml醋酸锌和1mg/ml硫化钠水溶液)，磁力搅拌，100℃水浴回流，充分反应后，即可得到黄色至粉红色胶状CdSe/ZnS核壳结构量子点。经洗涤、离心沉降和冷冻干燥后，即可得到粉末状的物质。将制备的量子点分散于无水乙醇中，浓度控制在15mg/ml，移入三颈烧瓶中，通N2，室温下加入水、氨水(无水乙醇、水、氨水摩尔比为98∶31∶4)，适量DMF，温和搅拌15分钟后，加入适量正硅酸乙酯，剧烈搅拌反应2天，反应混合物经高速离心分离，水和无水乙醇交替洗涤后，重新分散于蒸馏水得最终量子点(硅壳量子点)，硅壳结构量子点无毒且生物亲和性也较好。将硅壳量子点样品粉末，分别分散在巯基乙酸中，搅拌、加热、回流，在40℃下反应12h后，产物用丙酮做清洗液反复离心分离、超声清洗以清除未和量子点化学结合的巯基乙酸。最后分散在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。经过表面改性后，CdSe/ZnS/SiO₂量子点可以稳定地分散在PBS中，没有浑浊沉淀现象。选用内核粒径为5.2-6.2nm的量子点，在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)多克隆兔抗体(购自杭州宝兴科技有限公司)连接，室温搅拌反应2小时，用Sephadex G-200层析柱分离纯化，得到量子点标记的抗体。将标记好量子点的抗体均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4平方厘米，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在硝酸纤维素膜上用机器划两条平行带，两条带间隔10mm，两条带宽都为1.5mm，其中一条带上喷涂莱克多巴胺-卵清蛋白(RAC-OVA)偶联物(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至3mg/mL)形成检测带；另一条带上喷涂羊抗兔二抗形成质控带，室温晾干20分钟后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在单面聚脂板上，依次粘贴上纤维素滤膜(长30cm，宽2cm)、涂有量子点标记的RAC抗体的玻璃纤维膜(长30cm，宽度根据抗体的滴度与实验要求确定，这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30cm，宽3cm)、已平行包被抗原抗体的硝酸纤维素膜(长30cm，宽2.5cm)、吸水纸(长30cm，宽2cm)、膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条，将变色范围5.5-9.0的精密pH试纸粘贴于吸水纸上，干燥后组装进检测卡封装，4-25℃避光保存。

将采集的猪尿液直接滴加在检测卡的加样孔内，带指示窗内试纸显色后，将检测卡插入观测装置的插槽内，打开电源，在经过紫外透过滤光片的紫外光激发下观察结果。当检测带无荧光线，质控带有红色荧光线时，说明样品中RAC高于最低检出浓度；当检测带与质控带上均有红色荧光线，说明样品中RAC低于最低检出浓度，检测带的荧光线强度与样品中含有的RAC浓度成反比；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。按照该方法，对10份样品进行检测，并使用RAC金标检测卡(购自杭州宝兴科技有限公司)按说明书操作进行检测，结果表明两者的检测结果相一致。

使用莱克多巴胺标准品，配置以下浓度的标准品0.00ng/ml、0.05ng/ml、0.15ng/ml、0.45ng/ml、1.00ng/ml、4ng/ml，按照上述方法进行检测，结果表明该试纸条的检测灵敏度达0.05ng/mL，并且批内与批间重复性性较好，可用于食品中莱克多巴胺药物残留的检测。

Claims (10)

1、一种药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条，包括标记物垫和分析膜，其特征在于所述标记物垫包被有量子点标记的药物分子单克隆抗体或多克隆抗体；所述分析膜上具有检测带和质控带，所述检测带包被有药物分子-载体蛋白偶联物，所述质控带包被有二抗。

2、如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述量子点为水溶性核壳结构量子点，内核为CdS、CdSe或CdTe，内核的粒径大小为1-10nm，外壳为ZnS、ZnSe或ZnTe。

3、如权利要求2所述的试纸条，其特征在于，在量子点外还包裹一层SiO₂结构。

4、如权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征在于，所述标记物垫通过如下方法制备：首先对量子点表面进行修饰使其带有-COOH或-NH₂基团，用PBS将量子点稀释至1-10nM，将EDC和NHS的PBS溶液加入到量子点中，然后加入药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的PBS溶液，然后加入药物分子单克隆抗体或多克隆抗体的PBS溶液，进行标记反应，纯化标记产物，然后将量子点标记的药物分子单克隆抗体或多克隆抗体稀释至0.5-2μg/ml，喷涂在标记物垫上，并真空干燥。

5、如权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征在于，所述分析膜通过如下方法制备：在分析膜上喷涂浓度为10-500μg/ml药物分子-载体蛋白偶联物作检测带，喷涂浓度为10-200μg/ml抗兔抗体或抗鼠抗体作质控带，再用0.5-2％牛血清白蛋白封闭分析膜。

6、如权利要求1-3任一项所述的试纸条，其还包括终点指示带，所述终点指示带的变色范围为pH5.5-9.0。

7、含有权利要求1-5任一项所述试纸条的检测卡，包括检测卡外壳，所述检测卡外壳具有点样孔、检测窗和终点指示窗。

8、一种用于权利要求1-6任一项所述试纸条或权利要求7所述检测卡的观测装置，其包括：主体；暗盒，位于主体内部，用于放置试纸条或检测卡；LED紫外灯和紫外透过滤光片，位于暗盒顶部，用于给检测卡提供紫外光源，其提供的光源波长为365-370nm，优选为365nm；观测窗，与暗盒相通，用于观测位于暗盒底部的试纸条或检测卡；插槽，位于主体底部，与暗盒相通，用于将试纸条或检测卡插入暗盒中；以及用于给LED紫外灯供电的电源。

9、权利要求1-6所述的试纸条或权利要求7所述的检测卡在检测药物残留中的应用。

10、一种检测药物残留的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品加入权利要求1-6所述试纸条或权利要求7所述检测卡的样品垫；

2)加样后待终点指示带显色，将试纸条或检测卡置于权利要求7所述的观测装置中；

3)判读：

当检测带无荧光线，质控带有荧光线时，表明样品中被检物浓度高于试纸条或检测卡的最低检出浓度；

当检测带与质控带上均有可见荧光线，表明样品中被检物浓度低于试纸条或检测卡的最低检出浓度，检测带的荧光线强度变化与样品中含有的被检物浓度成反比；

当检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。

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