CN102539771A - 一种高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，该方法利用量子点优良的荧光特性，结合量子点荧光标记技术和免疫渗滤技术，在优化免疫渗滤各组成部件的基础上，构建荧光免疫渗滤装置；免疫渗滤后，采用荧光定量仪检测定量点和质控点荧光信号强度，并以质控点校正定量点荧光强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线实现被测物的定量检测。本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏很高。与常规胶体金免疫渗滤方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明适用于血清、尿样、唾液和粪便等样本，可应用于重大疾病、毒品检测、食品安全等检测。

Description

一种高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测方法

技术领域

本发明公开了一种基于量子点的免疫渗滤荧光定量检测方法，可实现病原体、重大疾病(如肿瘤、心血管疾病等)、毒品检测、药品和食品安全等目标被测物的定量检测，属于荧光检测技术领域。

背景技术

免疫渗滤(IFA)是一种在临床检验中常见的方法，其基本原理是：以一硝酸纤维素(NC)膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。免疫渗滤实验最初是从斑点ELISA基础上发展建立起来的，应用的结合物是酶标记的。渗滤装置是IFA中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水塑料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约为0.4～0.8cm的小圆吸孔，盒内垫放吸水塑料，NC膜片安放在正对盒盖的圆孔下，紧密关闭盒盖，是NC膜片贴紧水塑料。如此即制备成一渗滤装置。20世纪90年代初发展了以胶体金为标记物的金免疫渗滤实验(GIFA)，省却了酶对底物的反应，更加简单、快速。

免疫金标记技术利用胶体金大量聚集而显色，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这种方法具有快速、简便、准确等优点，在检测抗原、抗体中得到了广泛使用。免疫胶体金在医学检验中最常用的有免疫胶体金斑点渗滤试验和免疫胶体金层析试验两种方法。相比较而言，由于免疫胶体金与样本中被测物之间的呈色标记反应在均相介质中进行，使反应充分，故免疫胶体金斑点渗滤技术具有非常敏感、非常可重复，快速又简便等特点，是发展敏感度和准确性更好的金标法快速斑点渗滤定量检测诊断试剂盒的前提。

中国专利200710044730.1提供了一种快速、简便、准确的快速定量检测C-反应蛋白的胶体金法。反应原理为固相双抗体夹心法的金标免疫斑点渗滤试验，样本经40～480倍稀释后与免疫胶体金在液相均质介质中混和均匀，再转加到反应板上，其中所含的、已与免疫胶体金在一起的被测物能为膜上固定的抗被测物另一决定簇的单抗或多抗特异性地捕获，呈红色斑点，斑点色泽与样本中CRP浓度旱正比。

量子点(Quantum dots，QDs)又叫半导体纳米晶，通常是由II～VI族或III～V族元素组成的稳定的、尺寸介于1～20nm之间的纳米微晶体，是20世纪90年代发展的一种具有优良光谱特性和光化学稳定性的生物荧光标记物。其具有许多优良的光学特性：(1)量子点的荧光发射光谱窄而对称，荧光发射波长可调，且覆盖范围可从紫外到近红外区。(2)量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记。(3)量子点具有较强的光学稳定性。CdSe/ZnS量子点的光稳定性是罗丹明6G的100倍以上。(4)量子点摩尔吸光系数可以高达10⁶L/(mol·cm)，且荧光量子产率高(50～80％)，因而可产生较强荧光信号。(5)量子点斯托克斯位移较大，荧光寿命长(20～50ns)，使得信号可以显著区分于背景和其它荧光基团。量子点是一种理想的应用于超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针，在荧光免疫分析和多组分检测、免疫示踪分子定位、纳米生物传感器、实时检测、细胞成像、体内成像、疾病诊断等方面具有独特的作用和广泛应用前景。根据文献报道，量子点作为新一代生物荧光标记物，具有取代传统有机染料的潜力。

相比于荧光检测，胶体金定量在灵敏度和线性范围上均有不足。而量子点荧光定量检测方法利用量子点多波长激发、高强度荧光强度、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，可提供一种量子点标记快速免疫渗滤检测方法，对被测物进行高灵敏定量检测。本方法只需改变量子点的粒径或种类，就可得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同的抗体，可产生多色荧光，实现多组分的检测，方法简单快速，灵敏度高。因此，需要一种方法使量子点应用于免疫渗滤检测，以克服胶体金定量在灵敏度和线性范围上的不足。

发明内容

本发明针对胶体金免疫渗滤定量技术的不足和缺陷，利用弱荧光层析膜、极弱荧光吸水垫、极弱荧光扣卡等降低荧光背景，利用量子点多波长激发、高强度荧光发射、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好、荧光发射波长可调等特性提高荧光信号，提供一种基于量子点的快速免疫渗滤法检测的试剂盒，对被测物进行半定量或定量检测。本发明方法简单、准确、快速、特异、灵敏，成本低，适用于血样、尿样、唾液、粪便等样本，应用于重大疾病(如肿瘤、心血管疾病等)、毒品检测、食品安全等检测，可在医院、海关、机场、家庭等场所使用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

步骤1)合成荧光发射波长范围为550～1300nm的量子点纳米颗粒；

步骤2)用化学交联或生物分子间特异性作用将配体和质控分子连接到量子点表面，得到配体修饰的量子点和质控分子修饰的量子点，混合均匀后得到量子点标记液；

步骤3)将弱荧光渗滤膜、极弱荧光吸水垫和极弱荧光扣卡按常规方法组装成免疫渗滤装置，在渗滤膜上设定质控点和定量点；

步骤4)滴加样本和量子点标记液进行免疫渗滤后，加缓冲液洗涤，检测定量点和质控点荧光信号强度，并以质控点荧光信号强度校正定量点荧光信号强度，进而实现被测物的定量检测。

本发明所提供方法的具体步骤为：将抗原或抗体包被在层析膜上形成定量点。并以另一对与被测物不相关的抗原或抗体形成质控点。将混合样本与标记生物功能分子的量子点复合物，加入试剂盒检测孔中，待完全浸透后，加入洗涤液清洗。利用免疫反应结合量子点的荧光性质检测样本中被测物的浓度。在紫外灯照射下，通过观察免疫渗滤试剂盒中定量点与质控点的荧光线强度，从而判断检测结果。由于量子点荧光受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10～1000倍。

本发明高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法是一种以量子点为荧光信号的、可在免疫渗滤装置上实现被测物快速灵敏检测的新方法。量子点荧光定量检测方法能够解决现有技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不明确的不足和缺陷，可实现对微量样本的检测。

这种方法是将被测物的配体，如抗原、抗体、DNA等修饰量子点，被测物的另一配体(或被测物的半抗原)固定在渗滤膜上，利用配体作用，如双抗体夹心法原理结合量子点的荧光性质检测样本中是否含有被测物。

为了提高与背景的区分度，本发明选用发射光波长为550～1300nm的量子点。因为在紫外照射下，渗滤膜、吸水纸和扣卡的荧光强度在550nm以下远强于550nm以上，从而对低浓度被测物检测时产生一定的影响，故可优选发射波长大于550nm的量子点。另外渗滤膜、吸水纸和扣卡在近红外区域(750～1300nm)荧光强度极弱，并结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750～1300nm)可进一步提高灵敏度。

本发明所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP组成的组中选择的，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

本发明中量子点主要有水相和有机相两种合成方法，本发明一个实施例采用水相法合成，一般方法为采用巯基化合物(如巯基乙酸、巯基甘油等)作为量子点的稳定剂，巯基通过和量子点表面原子配位来控制量子点生长，同时提供稳定的电荷层保证分散体系的稳定性。该方法虽合成简单，无需进一步表面亲水修饰即可应用，但量子点的生长速率、结晶性、发光效率都远不及有机相合成的量子点。

本发明另一个实施例中采用有机相合成量子点，一般为：主要是以Cd、Zn的氧化物或盐等为原料，采用长链脂肪酸、脂肪胺和其他种类的磷酸氧化物等充当配体。以十八烯、三辛基氧化磷等高熔点有机化合物为溶剂，在高温条件下生长得到高质量的荧光量子点。有机相合成由于反应温度较高，所得量子点荧光量子产率较高，荧光半峰宽较窄，因此更加得到人们的青睐。以巯基化合物和聚合物并把量子点由脂溶性转为水溶性，且量子点荧光无明显变化。

质控分子修饰的量子点与配体修饰的量子点可选用相同发射波长的量子点。在本发明一个实施例中，配体修饰的量子点和质控分子修饰的量子点发射波长均为630nm。

作为优选，在本发明另一个实施例中，为了减弱质控分子修饰的量子点对定量点及背景信号的影响，采用双色标记技术，即选用两种发射波长不同的量子点分别标记质控分子和配体。配体修饰的量子点的荧光发射波长为800nm，质控分子修饰的量子点的荧光发射波长为700nm。

本发明采用化学交联或生物分子间特异性作用将配体连接到量子点表面，得到配体修饰的量子点，其中配体为能与被测物特异性结合或者与被测物竞争反应。

本发明中的化学交联为：当量子点表面有活性基团，可与配体或质控分子直接反应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把配体修饰到量子点表面。

在本发明的实施例中用化学交联法对量子点进行配体修饰的方法为：利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将量子点表面的官能团(如羧基、氨基)与配体(如抗原、抗体等)表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。

作为优选，在本发明的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行修饰。一般为：将量子点溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的配体，以缓冲液为反应介质，培育4h，加入L-甘氨酸封闭，以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到配体修饰的量子点。

生物分子间特异性作用包括生物素-亲和素系统和抗原-抗体系统。作为优选，在本发明的另一个实施例中，采用生物素-亲和素系统的结合方式对配体进行量子点修饰，该结合方式具有放大信号的作用。具体为：以EDC将链霉亲和素连接到量子点表面，生物素连接到配体表面，通过亲和素-生物素间的相互作用，把配体连接到量子点表面。

本发明采用免疫渗滤装置对样本中的至少一种被测物进行定量检测，其中免疫渗滤装置包含渗滤膜、吸水垫和扣卡。渗滤膜包含至少一条固定捕获或竞争被测物的定量点，至少一条固定捕获质控蛋白质的质控点。

为区别于胶体金免疫渗滤装置的检测点，本发明中渗滤膜上固定捕获或竞争被测物的配体区域称为定量点，用于准确定量检测被测物的浓度，并以质控点作内质控校正定量点，以减弱样本、环境因素等的影响。

为了降低对量子点荧光信号的影响，本发明采用弱荧光渗滤膜、极弱荧光吸水纸和极弱荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。

作为优选，在本发明实施例中，渗滤膜、扣卡和吸水纸均不含有荧光剂。

本发明的实施例中所用样本分别为尿样和血清，且样本进一步包含唾液和粪便。

本发明的荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块和软件系统。其中激发光源模块包含光源和聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，波长选择300～400nm之间或500～600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包含图像传感器或光电倍增管。

层析结束后，在光源激发下，渗滤膜产生的荧光信号，经过滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，转换为数字信号。其中所获质控点与定量点的荧光强度有一定相关性，主要影响因素有温度、湿度、基质等。

本发明检测结果的判定方法为：如果质控点荧光信号强度超过荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；以双抗体夹心法为例，在检测结果有效的前提下，定量点荧光强度与质控点比值越高，表示被测物浓度越高，反之越低。

本发明采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F＝f(c)。校正荧光信号强度为F＝αF_定量点/F_质控点，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中被测物浓度。

本发明可广泛应用于病原体、重大疾病(如肿瘤、心血管疾病等)、违禁药品、毒品检测、食品安全等多种目标被测物的半定量与定量检测。

本发明的主要优点如下：

1)本发明采用量子点作为特异性抗体的荧光标记物，与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。并优选了550～1300nm的量子点，以提高与背景的区分度。

2)本发明免疫渗滤装置的组成部件：扣卡、吸水垫以及渗滤膜在大于550nm时均具有低的荧光特性，以减少对量子点荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的。

3)本发明采用荧光定量仪检测定量点和质控点荧光信号强度，并以质控点校正定量点荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线实现被测物的定量检测。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F＝f(c)。校正荧光信号强度为F＝αF_定量点/F_质控点，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中被测物浓度。

4)本发明只需改变量子点的粒径或种类，就可得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同的抗体，可产生多色荧光标记，实现多组分的检测；利用量子点多色标记技术，减少质控分子对被测物检测的影响，也可减少被测物间的交叉干扰，方法简单快速，灵敏度高，有利于高灵敏定量检测。

5)本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏很高。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。

具体实施方式

本发明公开了一种高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所提供的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测方法为：

步骤1)合成荧光发射波长范围为550～1300nm的量子点纳米颗粒；

步骤2)用化学交联或生物分子间特异性作用将配体和质控分子连接到量子点表面，得到配体修饰的量子点和质控分子修饰的量子点，混合均匀后得到量子点标记液；

步骤3)将弱荧光渗滤膜、极弱荧光吸水垫和极弱荧光扣卡按常规方法组装成免疫渗滤装置，在渗滤膜上设定质控点和定量点；

步骤4)滴加样本和量子点标记液进行免疫渗滤后，加缓冲液洗涤，采用荧光定量仪检测定量点和质控点荧光信号强度，并以质控点校正定量点荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线实现被测物的定量检测。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：双抗体夹心测定人绒毛膜促性腺激素(hCG)

(一)水相法合成水溶性量子点

CdTe量子点的合成，按体积比2∶1的比例依次向盛有适量的Te粉和硼氢化钠的反应器中加人无水乙醇和一次水，通氮气在60℃水浴中反应直至黑色Te粉完全消失。加人稍过量0.5mol/L H₂SO₄，产生H₂Te并被NaOH溶液吸收，得到NaHTe水溶液。

在氮气下将CdCl₂·2.5H₂O溶解到100mL超纯水中，然后加人巯基丙酸，在搅拌作用下滴加0.5mol/L NaOH溶液调节溶液的pH为11.2，最后注入0.1mmol NaHTe溶液，其中Cd∶Te∶巯基丙酸的比值为1.0∶0.5∶2.4。所得混合溶液在氮气下100℃加热回流，得到CdTe量子点，并以异丙醇纯化。

取适量CdTe量子点(浓度为1mmol/L)，之后加入巯基丙酸(52.4mg)和Cd²⁺(0.2mmol/L)的混合溶液。Se和NaHB₄反应产生NaHSe，加人0.5mmol/L硫酸后产生H₂Se气体，缓慢通入混合溶液中，在90℃水浴加热回流下得到羧基化CdTe/CdSe量子点，表征量子点荧光特征，荧光发射波长为700nm和800nm。

(二)量子点抗体复合物的制备

取60pmol量子点，加入10μg EDC和15μg NHS，活化量子点表面羧基，然后加入10～30μg的抗β亚基绒毛膜促性腺激素(β-hCG)的单抗，混合均匀并于室温下反应4小时，加入1mg甘氨酸封闭，用色谱或超滤离心分离纯化，得到β-hCG抗体修饰的量子点(荧光发射波长为800nm)。同理得到羊抗兔抗体修饰的量子点(荧光发射波长为700nm)。

以摩尔比1∶1的比例混合均匀上述两种量子点标记物，其中混合液中含有1～15％蔗糖、0.01～2％牛血清白蛋白(BSA)和吐温20、吐温80、曲拉通X-100等表面活性剂，其中表面活性剂含量在0.01～2％之间，得到量子点标记液，4℃下保存。

(三)免疫渗滤试剂盒的制备

封闭液成分为10mM pH7.4磷酸盐缓冲液，含0.1～2％BSA和0.05～2％Tween-20。

洗涤液成分为10mM pH7.4磷酸盐缓冲液，含0.05～2％Tween-20。

将吸水垫、渗滤膜和扣卡组装成免疫渗滤装置，吸水垫和渗滤膜之间都要紧密相连。其中渗滤膜、吸水垫和扣卡均为不含荧光剂。相应抗原(或抗体)分别点在渗滤膜上形成定量点及质控点，其中以加样孔中心为圆心，定量点和质控点处同心圆上。具体为质控点包埋兔IgG，浓度为0.2～2mg/ml。定量点所点抗a亚基绒毛膜促性腺激素(a-hCG)的多抗(用10mM pH7.4磷酸盐缓冲液)，浓度为1～5mg/ml。37度干燥后，加封闭液封闭渗滤膜上未结合蛋白质的位点。37度干燥后密封，4度下避光保存。免疫渗滤装置、封闭液、量子点标记液和洗涤液组成免疫渗滤试剂盒。

(四)样本检测

将hCG抗原的标准品溶液用正常人尿液作为稀释液，配置系列浓度标准品如下：0mIU/mL、25mIU/mL、100mIU/mL、300mIU/mL、500mIU/mL、800mIU/mL、1000mIU/mL、3000mIU/mL、5000mIU/mL、8000mIU/mL、10000mIU/mL和15000mIU/mL。

从4℃冰箱中取出试剂盒，置于室温下平衡5min～1h。加入2滴洗涤液，待充分浸透；将100μl标准品溶液滴加到试剂盒加样孔中，待充分浸透；加入3滴量子点标记液，待充分浸透；加入2滴洗涤液，待充分浸透后，以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试剂盒测定3次，取平均值)。分别把不同浓度的hCG抗原标准品加入不同渗滤试剂盒，并绘制标准曲线。其中质控点用于对试纸条有效性判断，并对定量点信号作相应的校正。

另取一试剂盒，加入2滴洗涤液，待充分浸透；将100μl尿液样本滴加到试剂盒加样孔中，待充分浸透；加入3滴量子点标记液，待充分浸透；加入2滴洗涤液，待充分浸透后，以荧光定量仪检测，依据标准曲线获得样本中hCG的浓度。

免疫层析的原理为：当尿液样本滴入试剂盒后，样本渗透到吸水纸，当样本中含有被测物(hCG抗原)时，被测物与定量点上的a-hCG结合。加入β-hCG修饰的量子点后，量子点结合到固定在定量点的被测物上，从而构成双抗体夹心复合物，使量子点停留在定量点。光源激发下，采用荧光定量仪获取定量点和质控点的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而分析样本中hCG浓度。样本中hCG含量越高，则结合到定量点的量子点越多，定量点荧光强度越强。无论样本中是否含有hCG，量子点标记的羊抗兔抗体会与包被的兔IgG结合，显现强荧光的质控点。

结果表明，其最低检测限为5mIU/mL，最低定量限为10mIU/mL，在定量检测范围内，相关系数R²＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为早早孕诊断提供参考。

实施例2：双抗原夹心测定幽门螺旋杆菌抗体(HP)

(一)有机相法合成脂溶性量子点及水溶性修饰

取0.2375g硒粉、2.60mL十八烯和1.57mL三正辛基膦，依次加入25ml小试剂瓶中，加热瓶中混合液体并反复振荡直至硒粉全部溶解，即得硒前体。另取0.0368g氧化镉、0.342g硬脂酸和3.8ml十八烯，依次加入三颈烧瓶中，氮气保护下加热至氧化镉全部溶解。降温使溶液冷却至凝固。取2.25g十八胺和0.95g三辛基氧化膦，加入三颈烧瓶，并加热使固体融解，继续加热至280℃，注入4.2mL硒前体，升温至240℃，使CdSe量子点荧光发射波长增加到所需波长。并以甲醇纯化量子点。

取10mL十八烯、0.110g硫粉，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至硫粉溶解，即得硫前体。另取0.8375g氧化锌、9mL油酸和2mL十八烯，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至锌粉溶解，即得锌前体。取2ml CdSe量子点溶液，加入三颈烧瓶中，抽真空去除氯仿，取以上合成的硫前体和锌前体，以及5mL十八烯和1.4g十八胺，依次加入三颈烧瓶中，加热使固体融解，在氮气保护下加热使量子点生长至所需波长，并以甲醇纯化。表征量子点荧光特征，CdSe/ZnS量子点荧光发射波长为630nm。

以巯基乙酸或聚合物把量子点由脂溶性转为水溶性，得到表面为羧基的CdSe/ZnS量子点，量子点相转移前后荧光特性无明显变化。

(二)量子点抗体复合物的制备

根据实施例1的方法，制备链霉亲和素修饰的量子点(荧光发射波长为630nm)。

将待生物素化的尿素酶用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)稀释到1mg/ml，用1ml二甲亚砜(DMSO)溶解1mg NHS活化的生物素(NHSB)，取1ml尿素酶抗原溶液加入120μl NHSB溶液，室温下反应4小时。加入9.6μL 1mol/L NH₄Cl，在室温下搅拌10分钟。以超滤离心管纯化，以除去游离的生物素，得到生物素化的尿素酶抗原。

以1∶3～1∶12的比例混合链霉亲和素修饰的量子点和生物素化的尿素酶抗原，得到尿素酶抗原修饰的量子点。同理得到羊抗兔抗体修饰的量子点(荧光发射波长为630nm)。

以摩尔比1∶1的比例混合均匀上述两种量子点标记物，其中混合液中含有1～15％蔗糖、0.01～2％牛血清白蛋白(B SA)和吐温20、吐温80、曲拉通X-100等表面活性剂，其中表面活性剂含量在0.01～2％之间，得到量子点标记液，4℃下保存。

(三)免疫渗滤试剂盒的制备

根据实施例1的方法组装试剂盒。其中以尿素酶修饰的量子点喷涂于结合垫上；以尿素酶抗原作为包被抗原包被于试纸条定量点，浓度为0.5～3mg/ml；以兔IgG包被于质控点。

(四)样本检测

将尿素酶抗体标准品溶液用正常人血清作为稀释液，依次按照5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4和0∶5的比例进行混合得到不同浓度标准品。

从4℃冰箱中取出试剂盒，置于室温下平衡5min～1h。加入2滴洗涤液，待充分浸透；从一系列不同浓度的血清中各取100μl样本分别滴加到不同试剂盒加样孔中，待充分浸透；加入3滴量子点标记液，待充分浸透；加入2滴洗涤液，待充分浸透后，以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试剂盒测定3次，取平均值)，分别把不同浓度的尿素酶抗体标准品加入不同渗滤试剂盒，并绘制标准曲线。其中质控点用于对试纸条有效性判断，并对定量点信号作相应的校正。

另取一试剂盒，加入2滴洗涤液，待充分浸透；将100μl尿液样本滴加到试剂盒加样孔中，待充分浸透；加入3滴量子点标记液，待充分浸透；加入2滴洗涤液，待充分浸透后，以荧光定量仪检测，依据标准曲线获得样本中尿素酶抗体的浓度。

免疫层析的原理为：当尿液样本滴入试剂盒后，样本渗透到吸水纸，当样本中含有被测物(尿素酶抗体)时，被测物与定量点上的尿素酶结合。加入尿素酶修饰的量子点后，量子点结合到固定在定量点的被测物上，从而使量子点停留在定量点，样本中被测物含量越高，则结合到定量点的量子点越多，定量点荧光强度越强；当样本中不含被测物(或被测物极少，低于检测下限)时，定量点将不会有红色荧光点出现。无论样本中是否含有被测物，量子点标记的羊抗兔抗体会与包被的兔IgG结合，显现强荧光的质控点。

并以补体结合反应确定尿素酶抗体浓度。检测结果与胶体金法对比，量子点方法比胶体金灵敏10倍以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)合成荧光发射波长范围为550～1300nm的量子点纳米颗粒；

步骤2)用化学交联或生物分子间特异性作用将配体和质控分子连接到量子点表面，得到配体修饰的量子点和质控分子修饰的量子点，混合均匀后得到量子点标记液；

步骤3)将弱荧光渗滤膜、极弱荧光吸水垫和极弱荧光扣卡按常规方法组装成免疫渗滤装置，在渗滤膜上设定质控点和定量点；

步骤4)滴加样本和量子点标记液进行免疫渗滤后，加缓冲液洗涤，检测定量点和质控点荧光信号强度，并以质控点荧光信号强度校正定量点荧光信号强度，进而实现被测物的定量检测。

2.如权利要求1所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，步骤1)所述量子点为单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点。

3.如权利要求2所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，所述化合物是从ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP组成的组中选择，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

4.如权利要求1所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，步骤2)所述配体包含抗原、半抗原、多克隆抗体、单克隆抗体和激素受体。

5.如权利要求1所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，步骤2)所述配体修饰的量子点的荧光发射波长为800nm，质控分子修饰的量子点的荧光发射波长为700nm。

6.如权利要求1所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，步骤2)配体修饰的量子点与质控分子修饰的量子点的荧光发射波长均为630nm。

7.如权利要求1所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，步骤3)所述弱荧光渗滤膜在大于550nm时荧光很弱或不含荧光剂。

8.如权利要求1所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，步骤3)所述渗滤膜包含至少一个用于竞争或捕获被测物的定量点，至少一个用于捕获质控分子的质控点，且以加样孔中心为圆心，定量点和质控点处同心圆上。

9.如权利要求1所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，步骤3)所述极弱荧光吸水垫和极弱荧光扣卡均为未加荧光剂。

10.如权利要求1所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，步骤3)所述免疫渗滤装置用于定量样本中的至少一种被测物。

11.如权利要求10所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，所述被测物包括小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物。

12.如权利要求11所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，所述小分子包含药物或毒品。

13.如权利要求11所述的高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测的方法，其特征在于，所述其他生化标志物包括心血管标志物、肿瘤标志物或自身免疫性疾病标志物。