CN102565386A - 一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法。该方法充分利用磁性纳米粒子及量子点的各自优良特性，并结合免疫层析技术，在优化试纸条结构和组成材料的基础上，进而实现的荧光定量检测。本发明所述方法具有信号放大作用，且与常规胶体金免疫层析方法相比，具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明提供了一种简便、准确、特异、价廉的检测工具，适用于血样、尿样、唾液、粪便等样本，因此可广泛应用于医学检验、食品安全、兽药残留、环境监测及毒品检测等领域。

Description

一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种以免疫层析技术为基础，并结合磁分离技术和荧光放大检测技术，特别涉及一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法，对病原体、重大疾病(如心血管疾病、肿瘤)、毒品、药物残留和食品安全等目标分析物进行定性及定量检测，属于荧光检测技术领域。

背景技术

免疫层析技术发轫于上世纪90年代，因简便、快速而引起人们的广泛重视。在过去的十几年中，人们不断对该技术进行研究和改进，已取得不少成果。特别是胶体金免疫层析技术，已在临床检验中得到了广泛的应用。然而该技术中免疫胶体金的制备体系通常涉及多种物质，常需采用高速离心去除未参加反应或者干扰反应的物质，具有操作时间长、设备要求高等缺点，并且离心后上清液的弃除，极易造成免疫胶体金数量的损失，不仅影响检测结果，同时也会提高产品成本。此外，目前的胶体金免疫层析受自身性质影响多为定性或半定量检测，具有一定的局限性，如当样品中含有目标分析物的浓度较低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度低。

磁性纳米粒子(Magnetic nano particles，MNPs)，是一种新型的纳米材料，具有独特的物理和化学性能，可应用于各种生物活性物质的固定、信号的检测和放大、待测物质的富集和浓缩等方面。它主要具有以下两个显著的特点：一是超顺磁性，即在外磁场存在时显示出磁性，而当磁场撤离时，该磁性又迅速消失，为磁分离技术提供了良好的条件；二是高分子特性，可以对微粒表面进行化学修饰从而赋予其表面多种功能基团(如-OH、-COOH、-NH₂等)。

磁性免疫层析技术中，尽管磁性纳米粒子的引入，利用其磁分离的特性极大程度上弥补了上述胶体金免疫层析中免疫胶体金的制备缺陷，但是作为定性检测，两者均具有灵敏度低，当检测样本中目标分析物含量过低时，很难用肉眼来判断，易出现误判以及基质效应明显等缺点。若作为定量检测，则需要配置用于磁信号检测的磁性读数仪，它是通过对整个定量带的透射检测来实现对目标分析物的定量分析，然而由于仪器中产生强磁场的线圈内容积有限，故对试纸条的制备要求较高，特别是定量带的宽度以及试纸条的厚度，常规的试纸条原材料很难达到要求，如塑料盒(扣卡)的厚度、吸水材料的厚度、底板的厚度等。

在免疫层析系统中，除胶体金、胶体硒、乳胶颗粒及碳颗粒以外，量子点亦可被用作可视或可被仪器检测的指示物质。它具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等众多优点，在荧光检测领域具有取代传统有机荧光染料的潜力，已成为新一代生物荧光标记物。在定量检测中，与胶体金颗粒的光吸收和光散射检测方式相比，量子点的荧光信号强度检测，具有灵敏度高、定量准确的优势。

发明内容

本发明要解决的技术问题为针对现有免疫层析技术中灵敏度低的缺点，提供了一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法，进而实现对样本中目标分析物的定量检测。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)以磁性纳米粒子为主体，通过化学交联偶联量子点构建磁性-荧光复合微球，该复合微球的球径为50～300nm，所用量子点的荧光发射波长范围为550～1300nm；

步骤2)用化学交联剂分别将分析物对应的配体和质控分子偶联至磁性-荧光复合微球表面，构成配体修饰的磁性-荧光复合微球和质控分子修饰的磁性-荧光复合微球，并将两种溶液混合，得到标记液；

步骤3)以样品垫、层析膜、吸水垫、底板以及扣卡组装免疫层析所用试纸条，其中层析膜上设定有定量带和质控带，定量带固定有能与分析物结合或与步骤2)所述配体竞争结合分析物的配体，质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，且所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和扣卡具有低荧光特性；

步骤4)将标记液与样本混合，反应结束后进行磁分离，去上清并将富集物洗涤、复溶，获得富集液；

步骤5)将富集液滴加于试纸条的样品垫处，进行免疫层析，当富集液流经定量带和质控带后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现对目标分析物的定量检测。

本发明磁性荧光微球免疫层析定量检测方法是一种以免疫层析技术为基础，结合磁分离技术及荧光放大检测技术，最终依据量子点的荧光信号强度实现目标分析物快速、灵敏、定量检测的新方法。

本发明磁性荧光微球免疫层析定量检测方法能够解决现有免疫层析技术中设备要求高、易浪费、灵敏度低、定量方法不准确等不足，通过荧光信号放大作用，可实现对微量样品的检测，且由于量子点的发射荧光受激发光干扰很小，其检测灵敏度可为传统染料或有色标记物检测方法的10～1000倍。

本发明所述磁性-荧光复合微球是以磁性纳米粒子为微球主体，便于磁分离作用，且表面通过化学交联方式偶联多个量子点，实现荧光信号放大。随后进一步采用化学交联分别将配体和质控分子连接到磁性-荧光复合微球表面，构成配体修饰的磁性-荧光复合微球，示意图如图2或图3所示，以及质控分子修饰的磁性-荧光复合微球。将两种溶液进行混合，即可得到标记液。

本发明所用磁性纳米粒子为选自磁性金属合金、氧化铁、四氧化三铁、铁氧体、氧化铬和氮化铁中的任意一种。

作为优选，在本发明的实施例中，磁性纳米粒子为四氧化三铁。

本发明所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP组成的组中选择的，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

为了提高信号与背景的区分度，本发明选用发射波长为550～1300nm的量子点。因在紫外照射下，层析膜、底板以及扣卡的荧光强度在550nm以下远强于550nm以上，从而对低浓度目标分析物的检测造成影响，故优选发射波长大于550nm的量子点。此外，层析膜、底板和扣卡在近红外区域(750～1300nm)的荧光强度极弱，结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750～1300nm)进一步提高检测灵敏度。

其中，配体修饰的量子点与质控分子修饰的量子点可选用相同发射波长的量子点，亦可选用两种发射波长不同的量子点，即为双色标记，有助于降低质控分子修饰的量子点对定量带及背景信号的影响。

作为优选，在本发明的一个实施例中，β亚基绒毛膜促性腺激素(β-hCG)的抗体修饰的量子点和质控分子修饰的量子点发射波长均为605nm。

作为优选，在本发明的另一个实施例中，有机磷抗体修饰的量子点发射波长为900nm，质控分子修饰的量子点发射波长为650nm。

作为优选，在本发明的实施例中，使用有机相方法合成605nm和650nm的CdSe/ZnS，并把量子点由脂溶性转为水溶性，此过程中量子点荧光无明显变化；使用水相方法合成900nm的InAs。

作为优选，磁性-荧光复合微球粒径选用50～300nm。

在本发明中的化学交联为：当量子点表面有活性基团时，可与磁性纳米粒子或配体或质控分子直接反应，不需用化学交联剂；反之可采用化学交联剂间接反应，其中化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等。

作为优选，在本发明的一个实施例中，肼化量子点直接与磁性纳米粒子及醛基化抗体交联。

作为优选，在本发明的另一个实施例中，采用EDC和戊二醛将量子点连接于磁性纳米粒子表面，并在EDC和NHS的共同作用下，将抗体交联至磁性-荧光复合微球的表面。

其中，量子点与磁性纳米粒子或抗体交联后，可采用磁分离方式进行纯化，与传统的离心、色谱、层析或超滤等纯化方式相比，具有设备简单、操作简便、省时快捷的优点。

本发明中免疫层析所用试纸条由样品垫、层析膜、吸水垫、底板以及扣卡组成，如图1所示，与常规免疫层析试纸条相比，无标记垫结构。其中，在试纸条层析膜上分别设有至少一条用于捕获目标分析物的定量带和至少一条用于捕获质控分子的质控带。该定量带是判定样品中目标分析物含量的主要指标，并且受质控带荧光信号强度校正，以提高定量准确度。此外，通过提高定量带的条数，可增加检测项目，亦可用于扩大试纸条的检测范围，避免出现HOOK效应。

作为优选，本发明的实施例中采用两条质控带和一条定量带，以实现分析物的准确定量，减少温度、湿度、基质等因素的影响。

为了降低对量子点荧光信号的影响，本发明采用弱荧光的层析膜、低荧光的底板以及低荧光的扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。

作为优选，在本发明的实施例中，底板为黑色，表面附有不干胶，且扣卡、层析膜、底板及不干胶均不含有荧光剂。

本发明的一个实施例中所用检测样本为尿样，且检测样本进一步还可包含全血、血清、血浆、唾液和粪便等。

本发明的样本检测方式为：首先将检测样本与适量标记液混合，得到反应液，当反应一定时间后，对其进行磁分离，收集试管内部沉淀，并采用缓冲液进行洗涤及重悬，进而获得富集液，然后将混匀的富集液滴加于试纸条的样品垫位置处，进行免疫层析。层析结束后，可通过荧光定量仪对试纸条进行检测，获取定量带及质控带的荧光信号强度，并依据标准曲线实现对目标分析物的定量检测。

本发明的荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块以及软件系统。其中激发光源模块包含光源及聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，且波长位于300～400nm之间或500～600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包括图像传感器或者光电倍增管。

层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号经滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，获得数字信号。其中所获质控带与定量带的荧光信号强度具有一定的相关性，主要影响因素包括温度、湿度、基质等。

本发明检测结果的定性判定方法：因磁性纳米粒子本身在自然光下具有颜色特性，故可对检测试纸条进行初步定性评估，即当试纸条质控带不可观测时，说明试纸条无效；反之试纸条有效，且当定量带呈现明显信号时，说明检测样本中含有目标分析物，并随着定量带颜色的加深，样本中目标分析物的含量亦增加，但若定量带不可观测，则说明样本中不含或目标分析物低于该试纸条的检测灵敏度。

本发明检测结果的定量判定方法：如果两条质控带荧光信号强度的比值超出荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；在检测结果有效前提下，定量带与质控带荧光信号强度的比值越高，表示样品中含有目标分析物的浓度越高，反之越低，且依据标准曲线可获得样本中目标分析物的具体含量。

本发明的标准曲线为：针对目标分析物，采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，并绘制标准品系列浓度与所对应的校正荧光信号强度关系曲线，即为标准曲线，关系式为F＝f(C)，其中校正荧光信号强度为F＝αF_定量带/F_质控带，式中α指校正系数，受温度、湿度和基质等因素影响。

本发明的主要优点如下：

1)本发明以磁性纳米粒子为微球主体，通过化学交联作用表面连接量子点，从而构建为磁性-荧光复合微球，且可进一步通过化学交联将配体或质控分子修饰至微球表面，以同时具备磁分离和荧光信号放大的作用，有助于修饰微球制备过程的纯化，以及检测过程中目标分析物与干扰物质的分离，进而可达到降低样本基质差异、提高系统检测灵敏度的目的。

2)本发明采用量子点作为荧光信号放大的指示物质，与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。且本发明中优选了550～1300nm的量子点，以提高信号与背景的区分度，从而提高检测灵敏度。

3)本发明试纸条组成部件中的扣卡、底板以及层析膜在大于550nm时均具有低的荧光特性，以减少对量子点荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比。

4)本发明只需改变量子点的粒径或种类，即可得到不同发射波长的荧光，采用不同类型的量子点构建磁性-荧光复合微球，可实现多组分的定量检测，方法简单快速，灵敏度高。

5)本发明既可进行定性分析又可实现对目标分析物的定量检测。本发明所述方法与常规胶体金免疫层析法相比，具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。

附图说明

图1为免疫层析所用试纸条的内部侧视组装示意图，其中1为样品垫，2为层析膜，3为吸水垫，4为定量带，5为质控带，6为底板。

图2为抗体修饰的磁性-荧光复合微球表面结构示意图。其中，1为Fe₃O₄磁性纳米粒子表面局部，2为量子点，3为特异性抗体。

图3为抗体修饰的磁性-荧光复合微球构建示意图。其中，1为Fe₃O₄磁性纳米粒子，2为带正电荷的羧甲基壳聚糖，3为带负电荷量子点，4为特异性抗体。

具体实施方式

本发明公开了一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的技术方案为：

一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)以磁性纳米粒子为主体，通过化学交联偶联量子点构建磁性-荧光复合微球，该复合微球的球径为50～300nm，所用量子点的荧光发射波长范围为550～1300nm；

步骤2)用化学交联剂分别将分析物对应的配体和质控分子偶联至磁性-荧光复合微球表面，构成配体修饰的磁性-荧光复合微球和质控分子修饰的磁性-荧光复合微球，并将两种溶液混合，得到标记液；

步骤3)以样品垫、层析膜、吸水垫、底板以及扣卡组装免疫层析所用试纸条，其中层析膜上设定有定量带和质控带，定量带固定有能与分析物结合或与步骤2)所述配体竞争结合分析物的配体，质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，且所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和扣卡具有低荧光特性；

步骤4)将标记液与样本混合，反应结束后进行磁分离，去上清并将富集物洗涤、复溶，获得富集液；

步骤5)将富集液滴加于试纸条的样品垫处，进行免疫层析，当富集液流经定量带和质控带后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现对目标分析物的定量检测。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：双抗体夹心测定人绒毛膜促性腺激素(hCG)

(一)磁性纳米粒子的合成及功能化

磁性纳米粒子的制备主要分为物理方法和化学方法，其中化学方法比较常用，主要又可分为共沉淀法、高温分解法、微乳液法、水热法以及超声化学法等。本发明实施例中选用共沉淀法，它具有设备简单、操作方便、成本低等优点，是磁性纳米粒子制备的传统方法。具体操作步骤如下：

1)将二价铁盐(FeCl₂·4H₂O)和三价铁盐(FeCl₃·6H₂O)溶液按照2∶1的摩尔比超声混合，并加入到三口圆底烧瓶中，氮气保护下将滴液漏斗中的沉淀剂NH₃·H₂O滴加到反应体系中，生成黑色沉淀，水浴恒温下持续剧烈搅拌30min即可得到以Fe₃O₄为成分的磁性纳米粒子，然后加入适量油酸，80℃下继续恒温搅拌30min，结束反应；

2)磁分离，水洗至中性，所得即为油酸修饰磁性纳米粒子；

3)称取5mg油酸修饰的磁性纳米粒子分散于1，4-二氧六环中至1mL，加入10μL 1％的OsO₄水溶液，避光超声反应30min，然后加入1.25mg的NaIO₄避光超声氧化1h。混合液于室温下，磁力搅拌继续避光反应24h，混合液的颜色逐渐由黑色转变为棕黑色。反应结束后，磁分离，水洗涤。所得即为表面醛基化的磁性纳米粒子，分散于硼酸缓冲液中，4℃备用。

(二)抗体的修饰

取1mg/mL的β亚基绒毛膜促性腺激素(β-hCG)单克隆抗体，加入等体积新鲜配制的NaIO₄溶液，室温下避光静置反应30min，随后加入0.1M的甘油终止反应，并采用透析或超滤纯化，浓缩至所需浓度，立即使用。

(三)抗体修饰磁性-荧光复合微球的制备，其结构示意图如图2所示

量取100μL表面醛基化的磁性纳米粒子与50μL发射波长为605nm的肼化量子点混合，室温避光持续振荡反应2～4h，1M的乙醇胺室温封闭反应30～60min，磁分离洗涤，并将沉淀重悬至150μL体积，引入50μL新制醛基化β亚基绒毛膜促性腺激素(β-hCG)单克隆抗体，室温避光反应2～4h或4℃反应过夜，再次磁分离洗涤，弃除溶液中未参加反应的物质，然后将收集的β亚基绒毛膜促性腺激素抗体修饰的磁性-荧光复合微球采用乙醇胺及牛血清白蛋白(BSA)进行室温封闭反应30～60min，并最终将修饰微球分散于4℃保存备用。

同理可制得兔IgG修饰的磁性-荧光复合微球，该微球的荧光发射波长位于605nm，与荧光发射波长同样为605nm的β亚基绒毛膜促性腺激素抗体修饰的磁性-荧光复合微球混合，构成为标记液，4℃保存备用。

(四)试纸条的构建

如图1所示，组装定量检测用荧光免疫层析试纸条：样品垫(1)、层析膜(2)、吸水垫(3)顺次粘贴于黑色底板(6)上，其中，样品垫为孔状隔膜，选择玻璃纤维，为检测样本收集区；层析膜上包含定量带(4)和质控带(5)，定量带和质控带的间隔R：3mm≤R≤8mm，且定量带固定有区别于标记液中β-hCG抗体的另一抗原表位β-hCG抗体，质控带包被了羊抗兔抗体，位于定量带的两侧。组装好后，按照要求切割为所需宽度，并置于扣卡中，加入干燥剂封装，与标记液、缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒，其缓冲液为含有牛血清白蛋白(0.05～2％)、蔗糖(1～15％)以及吐温20、曲拉通X-100等表面活性剂的硼酸缓冲液，且表面活性剂的含量在0.05～2％之间。

(五)样本的检测

首先分别配制含有β-hCG抗原的标准品溶液，浓度为2mIU/mL和20000mIU/mL，样本基质为尿液。然后依次按照5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4和0∶5的比例进行混合。每份样本测定3～4次，计算平均值。具体操作步骤为：

1)量取500μL含标准品的样本与10μL标记液均匀混合，静置反应3～10min；

2)将步骤1)中的混合液置于磁力架，进行磁分离；

3)弃上清，洗涤一次，并采用120μL的缓冲液将富集物复溶，所得即为富集液；

4)将步骤3)的富集液滴加于试纸条的样品垫处，进行免疫层析；

5)层析反应8～20min后，置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，并绘制相应的标准曲线；

6)同步骤1)～步骤4)操作，对实际样本进行检测，层析结束后，置于荧光定量仪内获取荧光信号强度，并依据步骤5)中的标准曲线分析该样本中β-hCG的含量；

7)输出检测报告。

(六)检测结果

结果表明，其最低检测限为1.5mIU/mL，最低定量限为5mIU/mL，且在报告范围内，批内与批间精密度均较好，相关系数R²＞0.99，对早孕诊断具有参考价值。

实施例2：竞争法测定有机磷

(一)磁性纳米粒子的合成

根据实施例1的方法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子。

(二)羧甲基壳聚糖的酸化

取羧甲基壳聚糖钠盐滴加1.5M的HCl至溶解，酸化30min，然后滴加入无水乙醇中，静置12h将羧甲基壳聚糖沉淀，15000rpm离心10min，无水乙醇重复多次洗涤，得到羧甲基壳聚糖CMCH。

(三)抗体修饰磁性-荧光复合微球的制备，其构建示意图如图3所示

首先将Fe₃O₄磁性纳米粒子与1mL的羧甲基壳聚糖溶液混合，并采用EDC作为交联剂，超声反应1h，磁分离，乙醇及去离子水洗涤，得到Fe₃O₄CMCH。取1mL的Fe₃O₄CMCH与2mL荧光发射波长为900nm的量子点及1μL的冰醋酸混合，氮气环境下搅拌反应15min，然后加入0.4μL的丙烯酸继续搅拌反应15min，80℃下填加过硫酸钾(KPS)反应2h，而后通过戊二醛于40℃下交联反应1h，磁分离、洗涤，获得Fe₃O₄CMCH/InAs磁性-荧光复合微球。在EDC/NHS的共同作用下，偶联有机磷单克隆抗体，即为有机磷抗体修饰的磁性-荧光复合微球，该微球的荧光发射波长为900nm，同理可制得荧光发射波长为650nm的兔IgG修饰的磁性-荧光复合微球，将两者混合，制得标记液，4℃保存备用。

(四)试纸条的构建

根据实施例1中的方式及规格组装试纸条，其中定量带处包被有机磷抗原。

(五)样本的检测

首先分别配制含有甲胺磷成份的标准品溶液，浓度为0.05mg/L和10mg/L。然后依次按照5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4和0∶5的比例进行混合。每份样本测定3～4次，计算平均值。具体操作步骤同实施例1。

(六)检测结果

结果表明，其最低检测限为0.02mg/L，最低定量限为0.05mg/L，且在报告范围内，批内与批间精密度均较好，相关系数R²＞0.99，可用于农药残留的检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (15)

1.一种磁性荧光微球免疫层析定量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)以磁性纳米粒子为主体，通过化学交联偶联量子点构建磁性-荧光复合微球，该复合微球的球径为50～300nm，所用量子点的荧光发射波长范围为550～1300nm；

步骤2)用化学交联分别将分析物对应的配体和质控分子偶联至磁性-荧光复合微球表面，构成配体修饰的磁性-荧光复合微球和质控分子修饰的磁性-荧光复合微球，并将两种溶液混合，得到标记液；

步骤3)以样品垫、层析膜、吸水垫、底板以及扣卡组装免疫层析所用试纸条，其中层析膜上设定有定量带和质控带，定量带固定有能与分析物结合或与步骤2)所述配体竞争结合分析物的配体，质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，且所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和扣卡具有低荧光特性；

步骤4)将标记液与样本混合，反应结束后进行磁分离，去上清并将富集物洗涤、复溶，获得富集液；

步骤5)将富集液滴加于试纸条的样品垫处，进行免疫层析，当富集液流经定量带和质控带后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现对目标分析物的定量检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述磁性纳米粒子为选自磁性金属合金、氧化铁、四氧化三铁、铁氧体、氧化铬和氮化铁中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述量子点为单一化合物形成的量子点或几种化合物组成的复合量子点。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述化合物为选自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP中的任意一种或几种，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述配体修饰的磁性-荧光复合微球与质控分子修饰的磁性-荧光复合微球的荧光发射波长均为605nm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述配体修饰的磁性-荧光复合微球与质控分子修饰的磁性-荧光复合微球的荧光发射波长分别为900nm和650nm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述配体包含抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和激素受体。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述层析膜在大于550nm时荧光很弱或不含荧光剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述底板为黑色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述扣卡具有低荧光特性或不含荧光剂。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述层析膜包含至少一条质控带和至少一条定量带。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述层析膜包含至少两条定量带，且两条定量带至少检测一种分析物。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述目标分析物包括小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌、病毒及其他生化标志物。

14.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述小分子包含药物或毒品。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述其他生化标志物包括心血管标志物、肿瘤标志物或自身免疫性疾病标志物。

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