CN104374909A - 基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法 - Google Patents

基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104374909A
CN104374909A CN201410653447.9A CN201410653447A CN104374909A CN 104374909 A CN104374909 A CN 104374909A CN 201410653447 A CN201410653447 A CN 201410653447A CN 104374909 A CN104374909 A CN 104374909A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
concentration
chloromycetin
conversion
tween
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410653447.9A
Other languages
English (en)
Inventor
马雪梅
於然
谢飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Technology
Original Assignee
Beijing University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Technology filed Critical Beijing University of Technology
Priority to CN201410653447.9A priority Critical patent/CN104374909A/zh
Publication of CN104374909A publication Critical patent/CN104374909A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法，属于纳米生物标记领域、免疫学领域以及光学检测领域。主要基于以下方面：将200nm-300nm的上转换荧光纳米颗粒进行羧基化修饰，使之成为水溶性好，分散性高且易于与生物分子偶联的标记物；将样品垫、上转换标记物处理过的结合垫、抗原抗体点样过的硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸通过粘性底衬结合起来，抗原为氯霉素-BSA做检测线(T)，抗体为羊抗鼠抗体做质控线(C)，且相距0.5cm。用切条机将组装好的试纸切成长6cm，宽4mm的试纸条，装备成壳，建立免疫层析试纸；将不同浓度梯度的氯霉素标准抗原加于试纸壳中的样品垫里，经10-15min静置后，放于上转换检测器里进行检测。本发明制备工艺和操作简单，不需要复杂的仪器设备就能完成，既快速又灵敏，对准确定量检测食品中氯霉素含量有重要意义。

Description

基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法
技术领域
本发明将上转换发光技术和免疫层析技术结合起来，特点是以上转换标记物为检测分子，以试纸为固相载体，以激光检测器为检测手段的新型检测技术，属于纳米生物标记领域、免疫学领域以及光学检测领域。
背景技术
上转换发光技术是近年来兴起的荧光检测技术，上转换荧光材料一般主要以单个稀土掺杂的氟化物或氧化物和双掺的氟化物为材料构成，其原理是在近红外光的激发下发射可见荧光。从微观上来看，主要以材料中的吸收子吸收红外光子而由基态跃迁至激发态，随后吸收子将能量传递给发射子而返回基态，发射子再从更高能级的激发态辐射能量而返回基态，属多光子跃迁机制。与传统的下转换发光相比(短波激发，长波辐射)，具有光稳定性强，不易光解，持续时间长，反斯托克斯位移大，无自发荧光干扰的优点，并且无生物毒性。由于上转换发光的优点，使得广泛应用于细胞成像，肿瘤的光动力治疗的生物医学领域。
免疫层析技术又称为侧向流动技术，是以固相试纸为载体的抗原抗体免疫检测技术。一般试纸分为样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸组成。样品垫和结合垫均是玻纤纸，样品垫为待测样品起始流动区，结合垫为标记物分子吸附区，NC膜一般由检测线和质控线构成，捕获分子位于检测线和指控线上，是免疫反应区，吸水纸为层析液的流动提供虹吸动力，是整个试纸的马达。竞争法检测是免疫层析的核心，当待测液是阴性时，结合垫上的标记物流经检测线时被检测线的生物分子所捕获，其他未被捕获的分子继续流动，最终被质控线所捕获，总共发生两次免疫反应；当待测液是阳性时，结合垫上的标记物与目标分子竞争结合与检测线上，余下的结合有目标分子的复合物和标记物被质控线所捕获，总共发生3次免疫反应，并且随着阳性程度越高，被检测线捕获的分子越少，而被质控线上捕获的分子越多。免疫层析技术最大的优点就是检出时间快，一般检测用时10-15min，不需要大型设备，可用于实时检测；一般胶体金为最常见的标记物，可用于各种食品，农产品，疾病等的检测，时间快，但存在两方面的缺点：一是胶体金标记物经物理吸附制备，层析过程中容易解离，造成假阳性的产生。二是经颜色反应判别结果，结果不可靠，灵敏度底。
氯霉素(Chloramphenicol CAP)是一种高效广谱的抗生素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，对机体有很严重的毒副作用，能引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，氯霉素在动物性食品中的残留对人类的健康构成了潜在危害。因此对其进行检测已经成为亟待解决的问题，欧盟、美国等发达国家已相继禁止氯霉素用于动物性食品，并明确规定其残留限量为不得检出；中国农业部已将氯霉素从2000年版中国兽药典中删除并列为禁药。目前国内外主要的检测手段为色谱法、胶体金免疫层析法、ELISA。色谱法可显著提高检测的灵敏度，但是操作复杂，步骤繁琐，不能用于现场检测；胶体金免疫层析法检测时间固然缩短，但假阳性高，灵敏度底的缺点限制了其应用；ELISA法需反复洗涤，检测时间长。总之，这些检测的技术手段费时费力，检测成本高，不能应用于样品的现场检测或精准定量的目的。
本发明公开一种基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测的方法，经文献调研后发现国内外还未曾报道过将上转换发光技术和免疫层析技术结合用于氯霉素检测的事例。其特征在于兼具了免疫层析检测时间快速和上转换发光技术精确、灵敏的优点。
发明内容
本发明在上转换纳米颗粒的基础上，对其进行修饰后偶联氯霉素单克隆抗体，用于免疫层析的标记物。所选用的上转换纳米材料为NaYF4:Yb3+,Er3+，电镜下成椭球形，粒径在200nm-300nm，疏水，在980nm激发下，发射583nm的强峰和658nm的弱峰，发出明亮的绿光。上转换荧光效率在所有已知的稀土类化合物荧光效率最高。
本发明采用反相微乳液法和表面接枝法对上转换纳米材料进行二氧化硅包覆后嫁接多羧基配体，制备出水溶性好，分散度高，粒径在80nm-200nm的羧基修饰的上转换纳米材料，与传统的配体交换法和配体氧化法相比，反应条件温和，与二步法相比，节省了氨基化的步骤，并且三羧基可以更多的偶联上单抗，偶联效率提高。
本发明采用1-(3-甲氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联合活化法偶联氯霉素单克隆抗体，即先以反应的活性中间酯为中间产物介导颗粒的羧基与抗体的氨基连接形成稳定的酰胺键。EDC与NHS质量比为2：1。反应条件温和，颗粒之间不易产生团聚，反应过程不会破坏抗体的构象，与传统的戊二醛偶联法相比可提高抗体的偶联效率。
本发明所用的NC膜和样品垫不需要任何的封闭处理，不仅简化了操作工艺，而且还可显著降低因NC膜处理而带来的检测背景，在一定程度上避免了本底干扰。所选用的层析液组分为：体积百分含量0.01％-1％Tween-20，质量浓度0.1％-1％BSA和1％-2％的蔗糖，溶剂为摩尔浓度为0.01mol/l-0.03mol/l、PH为7.0-7.4的磷酸盐缓冲液，保证了层析过程中适当的流速以及上转换标记物能完全从结合垫上解离下来，提高了检测的准确度。
本发明所涉及到的检测系统为980nm的泵浦光，波长连续且功率可调，检测激发波长功率设定为500mW。980nm波段为上转换荧光材料的最佳激发波段，红外激光经过透镜准直与聚焦后直接对试纸检测线和质控线进行激发，被捕捉到颗粒的多少直接表现为荧光强度的大小。
本发明的独特在于：上转换标记物采用共价结合，避免了物理吸附造成的解离，降低假阳性的产生；试纸的NC膜和样品垫不需处理，避免了本底干扰；优化了层析液的组分，进一步减少了检出时间；采用上转换发光技术，其红外光具有很强的穿透能力且不破坏试纸内部结构，使沉积在试纸底部的颗粒可以有效被激发出来，并且吸附于试纸表面的少量灰尘以及试纸内部成分不会被红外激发，从而提高了检测的灵敏度和降低背景干扰。
本发明具体分为以下几个部分步骤：
一种基于上转换免疫层析技术对食品中氯霉素含量进行检测的方法，特点是以上转换标记物为检测分子，以试纸为固相载体，以激光检测器为检测手段的新型检测技术，具体包括以下步骤：
(1)采用反相微乳液法和表面接枝法对上转换纳米材料进行二氧化硅包覆后嫁接多羧基配体：表面活性剂聚氧代乙烯壬基苯基醚(IGEPALCO520)加入到环己烷中，表面活性剂的浓度0.01g/ml-0.1g/ml，超声分散成透明均相溶液，称取上转换纳米颗粒加入到上述表面活性剂的环己烷溶液中，质量浓度为0.0069％-0.021％，不断超声搅拌形成透明溶液，将百分含量25％-28％氨水溶液加入到上述反应体系里，当溶液出现少许乳白色胶体时，超声并不断搅拌使之再次形成透明均相溶液，最后加入正硅酸乙酯，氨水和正硅酸乙酯的体积比为4：1。将反应器置于磁力搅拌器上，室温搅拌12-18h；当溶液由透明转为淡白色时，加入少许甲醇沉淀颗粒直至沉淀完全；采用差速离心法，离心分离去上清后得到核壳结构的纳米颗粒；
量取体积百分含量50％-70％乙醇水溶液，加入醋酸使溶液酸化，用上述酸化的乙醇水溶液将核壳结构的纳米颗粒重悬，使之成为乳白色溶液，往反应体系里加入N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠，边超声边搅拌，室温常压下反应4-24h；离心分离，沉淀用无水乙醇或去离子水洗1-3遍，即羧基修饰上转换纳米颗粒。其中乙醇水溶液：醋酸：N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠的用量关系为120ml：(10ul-100ul)：(25ul-1ml)；
采用活化反应、偶联反应、封闭反应对羧基修饰上转换纳米颗粒进行偶联：活化反应：将步骤(1)离心所得到的羧基修饰上转换纳米颗粒用2-(N-吗啡啉)乙磺酸吐温-20缓冲液(MEST)配制为1mg/ml的溶液，其中2-(N-吗啡啉)乙磺酸吐温-20缓冲液(MEST)中2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液与吐温-20的体积比20:1，2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液的浓度为0.01mol/L，将含有EDC和NHS的MEST加入到上述固体物质中形成MEST反应液，其中EDC和NHS的质量比为2:1，EDC和NHS在MEST中的含量分别为1.2mg/ml和0.6mg/ml，室温避光反应30min-1h，(一般EDC和NHS需现配现用)；
偶联反应：将活化反应后的体系离心数分钟，沉淀用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)洗涤2次，磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)中吐温-20的体积百分含量为0.05％-0.1％，磷酸盐水溶液的浓度为0.01mol/L，在除尽游离的EDC和NHS后得到活化的羧基修饰上转换纳米颗粒，用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)配制1mg/ml氯霉素单克隆抗体溶液，与活化的羧基修饰上转换纳米颗粒发生反应，涡旋并超声数秒，偶联反应数小时；
封闭反应：将上述偶联反应后的体系离心弃上清，沉淀用PBST洗涤2次，除去未偶联的氯霉素单克隆抗体，用牛血清白蛋白BSA室温封闭反应30min-1h，离心，沉淀用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)重悬，4℃保存；
(3)配制层析液，其中吐温-20的体积分数0.05％-1％，BSA质量浓度0.1％-1％和蔗糖质量浓度1％-2％，溶剂选用0.01mol/l-0.03mol/l的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液PH为7.0-7.4，取步骤(2)封闭反应后的悬浮液，离心去上清，沉淀用上述层析液重悬后，均匀涂抹在玻璃纤维纸上的结合垫区域，37℃干燥过夜，得到标记物处理过的玻纤纸结合垫；用PH为7.0-7.4、摩尔浓度为0.03mol/l的磷酸盐缓冲液分别配制1mg/ml的氯霉素-BSA溶液、2mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，用点样仪分别将氯霉素-BSA溶液和羊抗鼠IgG溶液均匀地在硝酸纤维膜(NC膜)上平行划线，其中氯霉素-BSA为试纸的检测线(为T)，羊抗鼠IgG为质控线(为C)，将NC膜置于37℃下干燥过夜；将上述处理过的NC膜粘于粘性底衬的中间部分，然后将标记物处理过的玻纤纸结合垫搭接粘于NC膜的上方，试纸的检测线相比质控线更接近标记物处理过的玻纤纸结合垫；未做处理的玻纤纸作为样品垫搭接粘于标记物处理过的玻纤纸结合垫的上方；最后将吸水纸搭接粘于NC膜的上方，上述沿粘性底衬平面依次按顺序为玻纤纸样品垫、玻纤纸标记物结合垫、NC膜和吸水纸，相邻量不同物质之间为搭接；
(4)检测：用步骤(3)配制的层析液将1mg/ml氯霉素按100-100000倍稀释成不同浓度梯度的标准液，用不含有氯霉素层析液作为阴性对照，取50-100ul的100-100000倍稀释的氯霉素标准液和不含有氯霉素的阴性对照滴加在试纸的样品垫中进行层析，待NC膜完全被层析液湿润后，室温静置10-15min检测；采用上转换激光检测系统和电脑建立荧光强度和浓度的关系，其中上转换激光检测系统分为红外光激发装置和荧光接受装置，红外光经准直透镜和聚焦透镜会聚到硝酸纤维膜(NC膜)的检测线和质控线处进行反射，反射光经光谱仪接收光谱，然后通过电脑建立荧光强度和浓度的关系；将待测的氯霉素溶液采用上述同样的方法检测其荧光强度，结合荧光强度和浓度的关系得知待测氯霉素溶液的浓度。
本发明步骤(1)上转换纳米材料为NaYF4:Yb3+,Er3+。优选粒径200nm-300nm。
上转换激光检测系统和电脑建立荧光强度和浓度的关系时，其中上转换激光检测系统分为红外光激发装置和荧光接受装置，红外光经准直透镜和聚焦透镜会聚到硝酸纤维膜(NC膜)的检测线和质控线处进行反射，反射光经光谱仪接收光谱，然后通过电脑建立荧光强度和浓度的关系，其中红外光激发装置激发光为980nm的泵浦光，波长连续且功率可调，检测激发波长功率为50mW-500mW；红外激光经准直透镜准直，聚焦透镜聚焦后在试纸检测线和质控线上形成长为4mm的绿线，其荧光强度经光纤探头检测到，最后转换成荧光信号响应值。
本发明步骤(4)红外光激发装置激发光为980nm的泵浦光，波长连续且功率可调，检测激发波长功率设定为50-500mW。红外激光经准直透镜准直，聚焦透镜聚焦后在试纸检测线和质控线上形成长为4mm的绿线，其荧光强度经光纤探头检测到，最后转换成荧光信号响应值。氯霉素浓度越底，越有更多的上转换荧光标记物被检测线捕捉到，荧光强度越高，而被质控线捕捉的颗粒越少，荧光强度越低，表现在检测线与质控线的荧光信号值越大，反之亦然。即氯霉素浓度的高低与检测线与质控线上转荧光强度值成反比。
本发明设一阴性对照，每个不同浓度梯度的待测液检测3次，其平均值为每个浓度所对应的上转换检测线和质控线的荧光强度比值。
附图说明
图1：上转换纳米颗粒的修饰过程示意图；
图2：免疫层析试纸壳和试纸条立体结构和平面结构示意图；
图3：上转换发光光路示意图；
图4：SiO2聚合物包被的核壳型上转换纳米颗粒透射电镜图；
图5：N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠修饰的上转换发光纳米颗粒红外光谱图；
图6：抗体标记的上转换发光纳米颗粒荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
所用的上转换纳米材料：NaYF4:Yb3+,Er3+
(1)将表面活性剂聚氧代乙烯壬基苯基醚(IGEPALCO520)加入到145ml环己烷中，超声分散成浓度为0.05g/ml透明均相溶液，称取上转换纳米颗粒加入到环己烷，不断超声搅拌形成透明溶液，上转换纳米颗粒浓度为0.013％。量取28％氨气的水溶液0.58ml加入到上述反应体系里，当溶液出现少许乳白色胶体时，超声并不断搅拌使之再次形成透明均相溶液，最后加入0.145ml正硅酸乙酯。将反应器置于磁力搅拌器上，室温常压下搅拌16h。当溶液由透明转为淡白色时，加入少许甲醇沉淀颗粒直至饱和。采用差速离心法，第一次5000r/min，离心10min后弃上清，沉淀用原体积一半的无水乙醇或去离子水重悬，第二次10000r/min,离心10min后弃上清。
(2)量取120ml55％乙醇溶液，加入0.1ml醋酸，将反应液重悬沉淀，使之成为乳白色溶液，往反应体系里加入0.2mlN-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠，边超声边搅拌，室温常压下反应18h。10000r/min离心分离8min，沉淀用为原体积一半的无水乙醇或去离子水洗一遍，即羧基修饰上转换纳米颗粒。
(3)采用活化、偶联、封闭对羧基修饰上转换纳米颗粒进行偶联。活化反应：将离心所得到的羧基修饰上转换纳米颗粒用0.05％的2-(N-吗啡啉)乙磺酸吐温-20缓冲液(MEST)配制为1mg/ml的溶液，量取0.5ml上述悬浊液加入到1.5ml量程的试管中，10000r/min离心3min，弃上清得固体物质，将此步骤重复2次。称取10mgEDC和NHS溶于1ml0.05％MEST缓冲液中，分别量取0.12mlEDC和0.06mlNHS重悬并分散离心得到的固体物质，用0.05％MEST缓冲液补足至0.5ml，室温避光反应30min(EDC和NHS需现配现用)；偶联反应：10000r/min离心3分钟，更换缓冲液，沉淀用0.5ml体积分数0.05％磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)洗涤2次，其中磷酸盐水溶液的浓度为0.01mol/L，PH值为7.2。除尽游离的EDC和NHS后得到活化的羧基修饰上转换纳米颗粒，用0.05％的PBST配制1mg/ml的氯霉素单克隆抗体溶液，量取0.05ml抗体溶液再次重悬活化的羧基修饰上转换纳米颗粒，并用0.05％磷酸盐吐温-20缓冲液补足至0.5ml，37℃偶联反应3小时；封闭反应：10000r/min离心3min弃上清，沉淀用PBST洗2遍，除去未偶联上的抗体，用1ml的1％牛血清白蛋白BSA室温封闭1h，10000r/min离心3min，沉淀用0.5ml的0.05％PBST重悬分散，4℃保存。
(4)配制含有体积分数为0.1％吐温-20，质量浓度为0.1％BSA和1％蔗糖的层析液，溶剂选用0.03mol/l的磷酸盐缓冲液，调PH为7.2，取出上转换标记物的悬浮液，离心去上清，沉淀用0.5ml上述层析液重悬后配制1mg/ml的上转换标记物悬浮液，均匀涂抹在玻璃纤维纸上的结合垫区域，37℃干燥过夜。
(5)用PH为7.2、摩尔浓度为0.03mol/l的磷酸盐缓冲液配制1mg/ml的氯霉素-BSA溶液，2mg/ml的羊抗鼠IgG，用点样仪将氯霉素-BSA和羊抗鼠IgG均匀地在NC膜划线，其中氯霉素-BSA为试纸的检测线(为T)，羊抗鼠IgG为质控线(为C)，且检测线和质控线相距0.5cm，将NC膜置于37℃下干燥过夜。
(6)取出粘性底衬，将处理过的NC膜最先粘于粘性底衬的中间部分，其次将标记物处理过的玻纤纸作为结合垫搭接粘于NC膜的上方，将未做处理的玻纤纸作为样品垫搭接粘于结合垫的上方，最后将吸水纸搭接粘于NC膜的上方，依次按顺序为玻纤纸样品垫、标记物吸附于玻纤纸的结合垫、NC膜和吸水纸。用切条机将试纸切成长6cm，宽4mm的纸条(见说明书附图2)，装壳备用。
(7)用步骤(4)层析液将1mg/ml氯霉素按100-100000倍稀释成不同浓度梯度的标准液，用不含有氯霉素的层析液作为阴性对照,取100ul溶液滴加在试纸的样品垫中进行层析，待NC膜完全被层析液湿润后，室温静置10-15min检测。每个浓度做3组平行对照。
所采用的上转换激光检测系统分为激发装置和荧光接受装置。上转换激光器为980nm的泵浦光，波长连续且功率可调，检测激发波长功率为500mW。红外激光经准直透镜准直，聚焦透镜聚焦后在试纸检测线和质控线上形成长为4mm的绿线，其荧光强度经光纤探头检测到，最后转换成荧光信号响应值。
实施例2
其他同实施例1，而其中的(4)和(7)中是如下方法制备的：
(4)配制含有体积分数为0.1％吐温-20，质量浓度为0.1％BSA和1％蔗糖的层析液，溶剂用0.03mol/l的磷酸盐缓冲液，调PH为7.2，取出上转换标记物的悬浮液，离心去上清，沉淀用上述层析液重悬待用；
(7)用上述层析液将1mg/ml氯霉素按100-100000倍稀释成不同浓度梯度的标准液，用不含有氯霉素的层析液作为阴性对照，取每个浓度标准液和对照液0.1ml加入到20ul质量浓度为1mg/ml的上转换标记物的悬浮液混匀，将实施例1(6)中制备好的试纸的样品垫浸没于待测液-上转换标记物的反应液中进行层析，待试纸完全湿润后，室温静置10-15min检测。
上转换纳米颗粒的修饰过程示意图，见图1；免疫层析试纸壳和试纸条立体结构和平面结构示意图见图2；上转换发光光路示意图见图3；SiO2聚合物包被的核壳型上转换纳米颗粒透射电镜图见图4；N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠修饰的上转换发光纳米颗粒红外光谱图见图5；抗体标记的上转换发光纳米颗粒荧光光谱图，见图6。
从上表中可以看出氯霉素浓度在10-2mg/ml到10-5mg/ml范围内具有良好的荧光信号响应值，其随氯霉素浓度的降低而增加，本发明至少能够检测到10ng/ml浓度的氯霉素含量，当浓度为1mg/ml，T线荧光信号响应值被抑制,在10-3mg/ml以下，检测线和质控线信号比值随浓度变化越明显。与胶体金相比，本发明可以达到精准定量，排除了胶体金法定性判别所导致的灵敏度低的缺点；比酶联免疫吸附测定法的检出时间要低3个小时。本发明可以为食源性毒素和农药残留的定量快速检测提供技术支持。

Claims (6)

1.一种基于上转换免疫层析技术对食品中氯霉素含量进行检测的方法，其特征在于，以上转换标记物为检测分子，以试纸为固相载体，以激光检测器为检测手段，具体包括以下步骤:
(1)采用反相微乳液法和表面接枝法对上转换纳米材料进行二氧化硅包覆后嫁接多羧基配体：表面活性剂聚氧代乙烯壬基苯基醚(IGEPALCO520)加入到环己烷中，表面活性剂的浓度0.01g/ml-0.1g/ml，超声分散成透明均相溶液，称取上转换纳米颗粒加入到上述表面活性剂的环己烷溶液中，不断超声搅拌形成透明溶液，将百分含量25％-28％氨水溶液加入到上述反应体系里，当溶液出现少许乳白色胶体时，超声并不断搅拌使之再次形成透明均相溶液，最后加入正硅酸乙酯，氨水和正硅酸乙酯的体积比为4：1；将反应器置于磁力搅拌器上，室温搅拌12-18h；当溶液由透明转为淡白色时，加入少许甲醇沉淀颗粒直至沉淀完全；采用差速离心法，离心分离去上清后得到核壳结构的纳米颗粒；
量取体积百分含量50％-70％乙醇水溶液，加入醋酸使溶液酸化，用上述酸化的乙醇水溶液将核壳结构的纳米颗粒重悬，使之成为乳白色溶液，往反应体系里加入的N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠，边超声边搅拌，室温反应4h-24h；离心分离，沉淀用无水乙醇或去离子水洗1-3遍，即羧基修饰上转换纳米颗粒，其中乙醇水溶液：醋酸：N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠的用量关系为120ml：(10ul-100ul)：(25ul-1ml)；
(2)采用活化反应、偶联反应、封闭反应对羧基修饰上转换纳米颗粒进行偶联：
活化反应：将步骤(1)离心所得到的羧基修饰上转换纳米颗粒用2-(N-吗啡啉)乙磺酸吐温-20缓冲液(MEST)配制为1mg/ml的溶液，其中2-(N-吗啡啉)乙磺酸吐温-20缓冲液(MEST)中2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液与吐温-20的体积比20:1，2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液的浓度为0.01mol/L，离心数分钟，弃上清得到固体物质；将含有EDC和NHS的MEST加入到上述固体物质中形成MEST反应液中，其中EDC和NHS的质量比为2:1，EDC在MEST中的含量分别为1.2mg和0.6mg，室温避光反应30min-1h，(一般EDC和NHS需现配现用)；
偶联反应：将活化反应后的体系离心数分钟，沉淀用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)洗涤，磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)中吐温-20的体积百分含量为0.05％-0.1％，磷酸盐水溶液的浓度为0.01mol/L，在除尽游离的EDC和NHS后得到活化的羧基修饰上转换纳米颗粒，用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)配制1mg/ml氯霉素单克隆抗体溶液，与活化的羧基修饰上转换纳米颗粒发生反应，涡旋并超声数秒，偶联反应数小时；
封闭反应：将上述偶联反应后的体系离心弃上清，沉淀用PBST洗涤，除去未偶联的氯霉素单克隆抗体，用牛血清白蛋白BSA室温封闭反应30min-1h，离心，沉淀用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)重悬，4℃保存；
(3)配制层析液，其中吐温-20体积分数0.05％-1％，BSA质量浓度0.1％-1％和蔗糖质量浓度1％-2％，溶剂选用0.01mol/l-0.03mol/l的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液PH为7.0-7.4，取步骤(2)封闭反应后的悬浮液，离心去上清，沉淀用上述层析液重悬后，均匀涂抹在玻璃纤维纸上的结合垫区域，37℃干燥过夜，得到标记物处理过的玻纤纸结合垫；用PH为7.0-7.4、摩尔浓度为0.03mol/l的磷酸盐缓冲液分别配制1mg/ml的氯霉素-BSA溶液、2mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，用点样仪分别将氯霉素-BSA溶液和羊抗鼠IgG溶液均匀地在硝酸纤维膜(NC膜)上平行划线，其中氯霉素-BSA为试纸的检测线(为T)，羊抗鼠IgG为质控线(为C)，将NC膜置于37℃下干燥过夜；将上述处理过的NC膜粘于粘性底衬的中间部分，然后将标记物处理过的玻纤纸结合垫搭接粘于NC膜的上方，试纸的检测线相比质控线更接近标记物处理过的玻纤纸结合垫；未做处理的玻纤纸作为样品垫搭接粘于标记物处理过的玻纤纸结合垫的上方；最后将吸水纸搭接粘于NC膜的下方，上述沿粘性底衬平面依次从上而下按顺序为玻纤纸样品垫、玻纤纸标记物结合垫、NC膜和吸水纸，相邻量不同物质之间为搭接；
用步骤(3)配制的层析液将1mg/ml氯霉素按100-10000倍稀释成不同浓度梯度的标准液，用不含有氯霉素层析液作为阴性对照，取50-100ul的100-10000倍稀释的氯霉素标准液和不含有氯霉素的阴性对照滴加在试纸的样品垫中进行层析，待NC膜完全被层析液湿润后，室温静置10-15min检测；采用上转换激光检测系统和电脑建立荧光强度和浓度的关系，其中上转换激光检测系统分为红外光激发装置和荧光接受装置，红外光经准直透镜和聚焦透镜会聚到硝酸纤维膜(NC膜)的检测线和质控线处进行反射，反射光经光谱仪接收光谱，然后通过电脑建立荧光强度和浓度的关系；将待测的氯霉素溶液采用上述同样的方法检测其荧光强度，结合荧光强度和浓度的关系得知待测氯霉素溶液的浓度。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(1)上转换纳米颗粒加入到上述表面活性剂的环己烷溶液中，质量浓度为0.0069％-0.021％为宜。
3.按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(1)上转换纳米材料为NaYF4:Yb3+,Er3+，粒径200nm-300nm。
4.按照权利要求1的方法，其特征在于，上转换激光检测系统和电脑建立荧光强度和浓度的关系时，其中上转换激光检测系统分为红外光激发装置和荧光接受装置，红外光经准直透镜和聚焦透镜会聚到硝酸纤维膜(NC膜)的检测线和质控线处进行反射，反射光经光谱仪接收光谱，然后通过电脑建立荧光强度和浓度的关系，其中红外光激发装置激发光为980nm的泵浦光，波长连续且功率可调，检测激发波长功率为50mW-500mW；红外激光经准直透镜准直，聚焦透镜聚焦后在试纸检测线和质控线上形成长为4mm的绿线，其荧光强度经光纤探头检测到，最后转换成荧光信号响应值。
5.一种基于上转换免疫层析技术对食品中氯霉素含量进行检测的试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用反相微乳液法和表面接枝法对上转换纳米材料进行二氧化硅包覆后嫁接多羧基配体：表面活性剂聚氧代乙烯壬基苯基醚(IGEPALCO520)加入到环己烷中，表面活性剂的浓度0.01g/ml-0.1g/ml，超声分散成透明均相溶液，称取上转换纳米颗粒加入到上述表面活性剂的环己烷溶液中，质量浓度优选为0.0069％-0.021％为宜，不断超声搅拌形成透明溶液，将百分含量25％-28％氨水溶液加入到上述反应体系里，当溶液出现少许乳白色胶体时，超声并不断搅拌使之再次形成透明均相溶液，最后加入正硅酸乙酯，氨水和正硅酸乙酯的体积比为4：1；将反应器置于磁力搅拌器上，室温搅拌12-18h；当溶液由透明转为淡白色时，加入少许甲醇沉淀颗粒直至沉淀完全；采用差速离心法，离心分离去上清后得到核壳结构的纳米颗粒；
量取体积百分含量50％-70％乙醇水溶液，加入醋酸使溶液酸化，用上述酸化的乙醇水溶液将核壳结构的纳米颗粒重悬，使之成为乳白色溶液，往反应体系里加入的N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠，边超声边搅拌，室温反应4h-24h；离心分离，沉淀用无水乙醇或去离子水洗1-3遍，即羧基修饰上转换纳米颗粒，其中乙醇水溶液：醋酸：N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠的用量关系为120ml：(10ul-100ul)：(25ul-1ml)；
(2)采用活化反应、偶联反应、封闭反应对羧基修饰上转换纳米颗粒进行偶联：
活化反应：将步骤(1)离心所得到的羧基修饰上转换纳米颗粒用2-(N-吗啡啉)乙磺酸吐温-20缓冲液(MEST)配制为1mg/ml的溶液，其中2-(N-吗啡啉)乙磺酸吐温-20缓冲液(MEST)中2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液与吐温-20的体积比20:1，2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液的浓度为0.01mol/L，离心数分钟，弃上清得到固体物质；将含有EDC和NHS的MEST加入到上述固体物质中形成MEST反应液中，其中EDC和NHS的质量比为2:1，EDC在MEST中的含量分别为1.2mg和0.6mg，室温避光反应30min-1h，(一般EDC和NHS需现配现用)；
偶联反应：将活化反应后的体系离心数分钟，沉淀用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)洗涤，磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)中吐温-20的体积百分含量为0.05％-0.1％，磷酸盐水溶液的浓度为0.01mol/L，在除尽游离的EDC和NHS后得到活化的羧基修饰上转换纳米颗粒，用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)配制1mg/ml氯霉素单克隆抗体溶液，与活化的羧基修饰上转换纳米颗粒发生反应，涡旋并超声数秒，偶联反应数小时；
封闭反应：将上述偶联反应后的体系离心弃上清，沉淀用PBST洗涤，除去未偶联的氯霉素单克隆抗体，用牛血清白蛋白BSA室温封闭反应30min-1h，离心，沉淀用磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)重悬，4℃保存；
(3)配制层析液，其中吐温-20体积分数0.05％-1％，BSA质量浓度0.1％-1％和蔗糖质量浓度1％-2％，溶剂选用0.01mol/l-0.03mol/l的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液PH为7.0-7.4，取步骤(2)封闭反应后的悬浮液，离心去上清，沉淀用上述层析液重悬后，均匀涂抹在玻璃纤维纸上的结合垫区域，37℃干燥过夜，得到标记物处理过的玻纤纸结合垫；用PH为7.0-7.4、摩尔浓度为0.03mol/l的磷酸盐缓冲液分别配制1mg/ml的氯霉素-BSA溶液、2mg/ml的羊抗鼠IgG溶液，用点样仪分别将氯霉素-BSA溶液和羊抗鼠IgG溶液均匀地在硝酸纤维膜(NC膜)上平行划线，其中氯霉素-BSA为试纸的检测线(为T)，羊抗鼠IgG为质控线(为C)，将NC膜置于37℃下干燥过夜；将上述处理过的NC膜粘于粘性底衬的中间部分，然后将标记物处理过的玻纤纸结合垫搭接粘于NC膜的上方，试纸的检测线相比质控线更接近标记物处理过的玻纤纸结合垫；未做处理的玻纤纸作为样品垫搭接粘于标记物处理过的玻纤纸结合垫的上方；最后将吸水纸搭接粘于NC膜的下方，上述沿粘性底衬平面依次从上而下按顺序为玻纤纸样品垫、玻纤纸标记物结合垫、NC膜和吸水纸，相邻量不同物质之间为搭接。
6.按照权利要求5得到的试纸。
CN201410653447.9A 2014-11-17 2014-11-17 基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法 Pending CN104374909A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410653447.9A CN104374909A (zh) 2014-11-17 2014-11-17 基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410653447.9A CN104374909A (zh) 2014-11-17 2014-11-17 基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104374909A true CN104374909A (zh) 2015-02-25

Family

ID=52553954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410653447.9A Pending CN104374909A (zh) 2014-11-17 2014-11-17 基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104374909A (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105717080A (zh) * 2016-01-27 2016-06-29 天津博硕东创科技发展有限公司 一种用于上转换荧光试纸条的检测方法
CN107525937A (zh) * 2017-08-25 2017-12-29 苏州优函信息科技有限公司 基于上转换发光标记物、蛋白芯片及检测方法
CN108139398A (zh) * 2015-10-23 2018-06-08 阿莫生命科学有限公司 颗粒的蛋白质固定方法
CN108148596A (zh) * 2018-01-15 2018-06-12 天津科技大学 一种利用上转换荧光材料荧光熄灭鉴别红葡萄酒的方法
CN108761093A (zh) * 2018-07-19 2018-11-06 河南百奥生物工程有限公司 一种口蹄疫病毒抗体评价试纸条
CN109324183A (zh) * 2018-11-23 2019-02-12 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种糖皮质激素免疫层析广谱检测卡及其制备方法与应用
CN111234819A (zh) * 2020-03-18 2020-06-05 厦门稀土材料研究所 稀土掺杂纳米探针及制备及新冠状病毒检测探针
CN113056674A (zh) * 2018-09-25 2021-06-29 悉尼科技大学 分析物的定量
CN115097119A (zh) * 2022-07-22 2022-09-23 厦门为正生物科技股份有限公司 一种病毒抗原检测试纸的金标记垫及其检测试纸的制备方法
CN117451984A (zh) * 2023-12-25 2024-01-26 苏州奎克泰生物技术有限公司 一种多项联检荧光免疫层析试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN201429598Y (zh) * 2009-07-07 2010-03-24 宁波博奥生物工程有限公司 定量快速检测氯霉素的上转磷光检测试纸条
CN102798720A (zh) * 2012-08-09 2012-11-28 河南省农业科学院 基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条及其制备方法
CN202814980U (zh) * 2012-08-09 2013-03-20 河南省农业科学院 基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条
CN103454423A (zh) * 2013-08-03 2013-12-18 河南百奥生物工程有限公司 用于新霉素定量检测的上转换荧光免疫层析试纸及制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN201429598Y (zh) * 2009-07-07 2010-03-24 宁波博奥生物工程有限公司 定量快速检测氯霉素的上转磷光检测试纸条
CN102798720A (zh) * 2012-08-09 2012-11-28 河南省农业科学院 基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条及其制备方法
CN202814980U (zh) * 2012-08-09 2013-03-20 河南省农业科学院 基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条
CN103454423A (zh) * 2013-08-03 2013-12-18 河南百奥生物工程有限公司 用于新霉素定量检测的上转换荧光免疫层析试纸及制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUYAO LIU ET AL: "Synthesis of stable carboxy-terminated NaYF4:Yb3+,Er3+@SiO2 nanoparticles with ultrathin shell for biolabeling application", 《NANOSCALE》, vol. 5, no. 3, 19 December 2012 (2012-12-19) *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108139398A (zh) * 2015-10-23 2018-06-08 阿莫生命科学有限公司 颗粒的蛋白质固定方法
US11169147B2 (en) 2015-10-23 2021-11-09 Amolifescience Co., Ltd. Method for immobilizing protein on particle
CN105717080A (zh) * 2016-01-27 2016-06-29 天津博硕东创科技发展有限公司 一种用于上转换荧光试纸条的检测方法
CN105717080B (zh) * 2016-01-27 2018-06-12 天津博硕东创科技发展有限公司 一种用于上转换荧光试纸条的检测方法
CN107525937A (zh) * 2017-08-25 2017-12-29 苏州优函信息科技有限公司 基于上转换发光标记物、蛋白芯片及检测方法
CN108148596A (zh) * 2018-01-15 2018-06-12 天津科技大学 一种利用上转换荧光材料荧光熄灭鉴别红葡萄酒的方法
CN108148596B (zh) * 2018-01-15 2021-06-29 天津科技大学 一种利用上转换荧光材料荧光熄灭鉴别红葡萄酒的方法
CN108761093B (zh) * 2018-07-19 2020-12-25 河南百奥生物工程有限公司 一种口蹄疫病毒抗体评价试纸条
CN108761093A (zh) * 2018-07-19 2018-11-06 河南百奥生物工程有限公司 一种口蹄疫病毒抗体评价试纸条
CN113056674A (zh) * 2018-09-25 2021-06-29 悉尼科技大学 分析物的定量
CN109324183A (zh) * 2018-11-23 2019-02-12 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种糖皮质激素免疫层析广谱检测卡及其制备方法与应用
CN109324183B (zh) * 2018-11-23 2022-03-29 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种糖皮质激素免疫层析广谱检测卡及其制备方法与应用
CN111234819A (zh) * 2020-03-18 2020-06-05 厦门稀土材料研究所 稀土掺杂纳米探针及制备及新冠状病毒检测探针
CN111234819B (zh) * 2020-03-18 2022-02-08 厦门稀土材料研究所 稀土掺杂纳米探针及制备及新冠状病毒检测探针
CN115097119A (zh) * 2022-07-22 2022-09-23 厦门为正生物科技股份有限公司 一种病毒抗原检测试纸的金标记垫及其检测试纸的制备方法
CN117451984A (zh) * 2023-12-25 2024-01-26 苏州奎克泰生物技术有限公司 一种多项联检荧光免疫层析试剂盒
CN117451984B (zh) * 2023-12-25 2024-02-23 苏州奎克泰生物技术有限公司 一种多项联检荧光免疫层析试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104374909A (zh) 基于上转换发光技术和免疫层析技术对氯霉素定量检测方法
Ullman et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.
CN101893623B (zh) 超灵敏量子点微球免疫层析试纸条快速检测方法
US10094793B2 (en) Nanomaterial-based photothermal immunosensing for quantitative detection of disease biomarkers
WO2014084260A1 (ja) イムノクロマトグラフィー、これに用いられる検出装置および試薬
JP5583092B2 (ja) イムノクロマトグラフィー用試験キット、これを用いた検出方法
JP5853703B2 (ja) アナライト検出プローブ、アナライト検出試薬およびこれを用いたアナライトの検出方法
CN1675545A (zh) 采用时间分辨荧光的基于膜的检测
CN102565386A (zh) 一种磁性荧光微球免疫层析定量检测方法
CN116539597A (zh) 一种cTnI均相化学发光检测试剂盒、检测方法与装置
JP2008216046A (ja) ローカルプラズモン増強蛍光センサ
CN108918882A (zh) 一种基于量子点的超敏c反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法
JP5006459B1 (ja) 標識用複合粒子
CN106443003A (zh) 基于适配体特异识别的荧光淬灭试纸条及制备方法与应用
JP2022062284A (ja) フェリチン検出用の検査キット及びフェリチンの検出方法
CN109459570A (zh) 一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法
JP2645211B2 (ja) 多価リガンドを使用した高感度凝集アッセイ
JP6162370B2 (ja) イムノクロマトグラフィー用試験片
Xu et al. Simultaneous detection of diethylstilbestrol and estradiol residues with a single immunochromatographic assay strip
JP2014153057A (ja) 標識抗体の製造方法
CN104698171B (zh) 一种基于胶体金与发光量子点二聚体的二级可选灵敏度侧向层析快速检测方法
CN108956992A (zh) 一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条的制备方法
CN116482083A (zh) 一种均相化学发光poct检测方法及利用该检测方法的装置
JP2017166911A (ja) 生体分子の検出又は定量方法、及び生体分子の検出又は定量用試験キット
CN109856076A (zh) 检测细胞的组合物及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150225

RJ01 Rejection of invention patent application after publication