CN103013490B - 一种量子点生物分子功能化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学和生物的学科交叉学科领域，公开了一种量子点生物分子功能化的方法。本发明所述方法以有机相法合成表面包覆有机物的量子点，并以烷基氢氧化铵和巯基化合物或聚合物将量子点转为水溶性，再修饰抗原、抗体或其他生物分子，从而使量子点生物分子功能化。本发明所述方法量子点转为水溶性前后荧光特性无明显影响，且转化效率高，生物分子功能化后，对生物分子的活性影响很小，得到的稳定量子点-生物功能分子复合物可用于分析检测、细胞成像及活体成像研究，具有良好的工业应用前景。

Description

一种量子点生物分子功能化的方法

技术领域

本发明属于化学和生物的学科交叉学科领域，具体涉及一种量子点生物分子功能化的方法。

背景技术

纳米技术是一项涵盖生物学、化学和物理学的多学科跨领域技术，已经广泛渗透于化学、生物、医学、材料等诸多领域。特别是功能纳米材料，对于化学生物分析的影响有着更加深远的意义，量子点是近年发展起来的一种半导体荧光纳米颗粒，具有许多优良的光谱性能，作为一种新型荧光探针，极大地推动了化学生物分析等研究领域的进展。

量子点又叫半导体纳米晶，通常是由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-V族元素组成的稳定的、尺寸介于lnm~20nm之间的纳米微晶体。其具有许多优良的光学特性：(1)量子点的荧光发射光谱窄而对称，荧光发射波长可调，且覆盖范围可从紫外到近红外区。(2)量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记。(3)量子点具有较强的光学稳定性。CdSe/ZnS量子点的光稳定性是罗丹明6G的100倍以上。(4)量子点摩尔吸光系数可以高达10⁶L·(mol·cm)^-1，且荧光量子产率高（50~80%），因而可产生较强荧光信号。(5)量子点斯托克斯位移较大，荧光寿命长（20~50ns），使得信号可以显著区分于背景和其它荧光基团。量子点是一种理想的应用于超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针。量子点荧光探针的主要应用有：(1)免疫荧光检测。将量子点与抗体结合用于荧光免疫分析和检测。(2)细胞成像。量子点纳米晶体用作细胞内的荧光标记物，可进行长时间、多分子同时检测。(3)病理组织检测。量子点荧光稳定性、灵敏度显著增强，广泛用于病理组织标本的多重标记和分子水平的分析。(4)活体成像。量子点作为荧光探针可追踪活体，用于活体方面的研究。

量子点的制备方法按照反应溶剂的不同，可简单分为水相和有机相合成两类。前者主要是采用巯基化合物（如巯基乙酸等）作为量子点的稳定剂。该方法虽合成简单，无需进一步表面亲水修饰即可应用，但是量子点的生长速率、结晶性、发光效率都远远不及有机相合成的材料。有机相合成由于反应温度较高，所得量子点荧光量子产率较高，带边吸收峰尖锐，荧光半峰宽较窄，因此更加得到人们的亲睐。量子点的有机相合成主要是以Cd、Zn的氧化物等为原料，采用长链脂肪酸、脂肪胺和其他种类的磷酸氧化物等作配体。以十八烯、三辛基氧化磷等高熔点有机化合物为溶剂，在高温条件下生长得到高质量的荧光量子点。

虽然有机相合成的量子点光学性质远较水相合成的优越，但有机相合成的量子点需要进行表面修饰，以应用于化学生物分析等领域。表面修饰策略主要有两种：一种是配体交换，用含巯基等的水溶性化合物取代量子点表面的有机配体，使量子点具有水溶性；另一种聚合物修饰，利用两亲性化合物与量子点表面包裹的有机配体化合物的疏水相互作用，将疏水分子自组装到量子点表面使其在水中稳定存在。采用配体交换的方法获得的量子点，由于交换过程中受配体及溶剂环境影响，转为水溶性后，量子点荧光性质有较大减弱，且稳定性也较差；聚合物修饰后量子点，虽其表面性质变化不大，但在修饰过程较复杂，量子点转化不完全，量子点荧光也有一定的减弱，如文献ACSNANO,2008,2(7):1341–1352。

量子点具有水溶性，可进一步生物分子功能化。最常用的方法是基于1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法对量子点进行生物功能分子（如蛋白质)修饰，将纯化后的量子点溶液与EDC/NHS混合，纯水或缓冲液作为反应介质，室温活化后，加入一定量的蛋白质，反应一定时间后，得到蛋白质修饰的量子点。专利200510096210.6，采用EDC/NHS方法，使氨基化二氧化硅纳米粒子与抗体结合，制得抗体-量子点复合物。

亦有直接把生物分子修饰到量子点表面的方法，如专利ZL03118483.9。可在有机溶剂中将蛋白质分子（如牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(IgG)等）修饰到量子点表面。该方法虽简单，但修饰效率很低，大量的量子点修饰过多或没修饰上蛋白质而团聚并不溶于水溶液中，并且修饰前后有较大的降低。

现有量子点标记技术主要存在如下缺点：

1、以巯基配体置换转为水溶性的量子点，置换前后量子点荧光有较大的减弱，且转化不完全；以聚合物包被转为水溶性的量子点，包被前后量子点转化不完全，且荧光有一定的减弱。

2、现有量子点生物功能化主要有物理吸附、化学交联和生物分子特异性结合三种。物理吸附易脱落、标记率低；化学交联常用EDC和NHS等作交联剂，交联前后量子点荧光特性有一定的减弱，且对生物分子活性有较大影响；商品化地量子点大多是链霉亲和素修饰，需使生物分子生物素化，才能交联，而链霉亲和素和生物素均很昂贵。

发明内容

本发明针对现有技术量子点水溶性修饰及生物功能化过程中，量子点荧光特性明显减弱、光照下荧光不稳定、生物分子活性大大降低的缺点，提供一种量子点生物分子功能化的方法，所述方法交联前后量子点荧光物明显改变，对生物分子的活性影响不明显，且修饰后量子点荧光在短时间光照下荧光增强，随后达到平台。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：通过有机相法合成脂溶性的量子点，并以烷基氢氧化铵和巯基化合物或聚合物将量子点转为水溶性，用氯仿清洗。往水溶性量子点中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和酰胺联氨化合物，反应得到联氨修饰的量子点；以偏高碘酸钠氧化生物功能分子，避光反应得到氧化的生物功能分子。混合联氨修饰的量子点和氧化的生物功能分子，反应0.5~4小时后，以葡萄糖封闭未反应位点，加入三乙酰氧基硼氢化钠溶液还原亚胺，以色谱分离量子点-生物功能分子复合物和自由的生物功能分子。

以下对本发明的技术解决方案作进一步说明：

本发明提供的量子点生物分子功能化的方法，包含以下步骤：

(1)以有机相法合成脂溶性的量子点；

(2)将巯基化合物或两性聚合物分别溶于含烷基氢氧化铵的氯仿溶液中，静置，弃上层液体，分别得到反应A液和B液；

(3)将(1)合成的量子点氯仿溶液溶于(2)所得A液中，静置反应1~3天，取出上层悬浮的量子点，并以氯仿清洗，即得到巯基化合物修饰的水溶性量子点，或将(1)合成的量子点氯仿溶液溶于(2)所得B液中，旋转蒸发后用水溶解量子点，超声分散，然后色谱分离纯化，即得到两性聚合物包被的水溶性量子点；

(4)取(3)制备的水溶性量子点加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和酰胺联氨化合物，反应0.5~6小时，去除过量小分子，得到联氨修饰的量子点；

(5)以偏高碘酸钠氧化生物功能分子，避光反应0.5~4小时，去除过量小分子，得到氧化的生物功能分子；

(6)混合联氨修饰的量子点和氧化的生物功能分子，反应0.5~4小时后，以葡萄糖封闭未反应位点，加入三乙酰氧基硼氢化钠溶液还原亚胺，以色谱分离量子点-生物功能分子复合物和自由的生物功能分子。

本发明为采用有机相法合成脂溶性量子点，其中量子点为单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点。形成化合物是从ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP组成的组中选择，且可掺杂Cu、Mn和Hg。具体为以Cd、Zn的氧化物或盐等为原料，采用长链脂肪酸、脂肪胺和其他种类的磷酸氧化物等充当配体。以十八烯、三辛基氧化磷等高熔点有机化合物为溶剂，在高温条件下生长得到高质量的荧光量子点。

本发明采用的量子点水溶性修饰方法主要有两个方案，其中一个以烷基氢氧化胺和巯基化合物为主要修饰试剂，其中烷基氢氧化胺与巯基化合物的摩尔比为10:1~1:10，量子点与巯基化合物的摩尔比为1∶1000~1∶10000。所得的巯基化合物置换的量子点。置换前后，量子点荧光强度无明显减弱，发射波长有少量蓝移，原因应为巯基置换量子点表面的疏水链，而改变了量子点的表面结构。

其中所述巯基化合物结构式如下：

HS-C_nH_m-COOH

其中，n≥1,m≥2。

优选为巯基乙酸、巯基丙酸等。还可为羟基、氨基和醛基，如巯基乙醇、巯基乙胺等，即也利用烷基氢氧化胺与巯基乙醇或巯基乙胺，使量子点表面官能团为羟基或氨基。

其中所述烷基氢氧化铵结构式如下

其中，x,y,n,m≥1。优选为四甲基氢氧化铵（TMAH）、四丁基氢氧化铵和十六烷基三甲基氢氧化铵等。

另一个方案以烷基氢氧化铵和聚合物为主要修饰试剂，其中烷基氢氧化铵与聚合物的摩尔比为100:1~1:10，量子点与聚合物的摩尔比1:100~1:2000。所得的聚合物包被的量子点。包被前后，量子点荧光发射波长和强度均无明显减弱，原因应为聚合物包被到量子点表面，与量子点表面疏水链相互作用，不影响量子点表面结构。

其中两性聚合物含与量子点表面分子相互作用的疏水链和用于量子点功能化的亲水官能团，亲水官能团还可包含羧基、氨基、羟基和醛基；在本发明的具体实施方式中，两性聚合物为辛胺修饰的聚丙烯酸。

本发明采用的量子点生物功能化地方法为：一定量的水溶性量子点混合EDC和酰胺联氨化合物（如肼（ADH）），，得到联氨修饰的量子点。以偏高碘酸钠氧化生物功能分子（如羊抗兔抗体、尿素酶抗原等）分子，反应得到氧化的生物功能分子。混合联氨修饰的量子点和氧化的生物功能分子，得到量子点-生物功能分子复合物，其中量子点与生物功能分子的摩尔比为1:1~1:30。

其中，所述酰胺联氨化合物包含两个联氨基团，不少于一个仲碳，其结构式如下：

H₂NHNCO(CH₂)_nCONHNH₂

其中，n≥1。

所述生物功能分子包含半抗原、抗原、抗体和链霉亲和素及其他蛋白质分子。

本发明采用葡萄糖封闭未反应的位点，以三乙酰氧基硼氢化钠换成连接量子点与生物功能分子的亚胺基团，从而得到稳定的量子点-生物功能分子复合物，并以色谱分离获得量子点-生物功能分子复合物。

将常规巯基置换所得的量子点和按照本发明所述方法所得的量子点分别以EDC/NHS常规方法交联得到量子点-羊抗兔抗体复合物。组装免疫层析试纸条，其中免疫层析膜上含包埋兔IgG的检测带。分别把以上所得三种量子点-羊抗兔抗体复合物加入结合垫中，加缓冲液层析。紫外照射下拍照，结果显示按本发明所述方法所得复合物层析后信号比EDC/NHS方法所得复合物层析后信号强4倍以上，较常规巯基置换所得量子点的量子点-抗体复合物层析信号强10倍以上。

本发明利用有机碱和巯基化合物把量子点转为水溶性，量子点相转移前后荧光特性无明显变化；并利用酰胺联氨化合物和偏高碘酸钠，使生物分子修饰到量子点表面后，交联试剂便宜，且对生物分子的活性影响不明显，更利于与相应功能分子结合，得到的稳定量子点-生物功能分子复合物可用于分析检测、细胞成像及活体成像等研究，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为量子点水溶性修饰及功能化的原理图，其中(a)为量子点水溶性修饰的原理图，(b)为量子点功能化修饰的原理图。

图2为量子点紫外吸收光谱，其中量子点为水溶性修饰前的脂溶性量子点、水溶性修饰后的聚合物包被的量子点和巯基丙酸置换的量子点。

图3为量子点荧光发射光谱，其中量子点为水溶性修饰前的脂溶性量子点、水溶性修饰后的聚合物包被的量子点和巯基丙酸置换的量子点。

具体实施方式

本发明公开了一种量子点水溶性修饰及生物分子功能化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的量子点水溶性修饰及生物分子功能化的方法，包括以下步骤：

以有机相法合成脂溶性的量子点；

将巯基化合物或两性聚合物分别溶于含烷基氢氧化铵的氯仿溶液中，静置，弃上层液体，分别得到反应A液和B液；将合成的量子点氯仿溶液溶于所得A液中，静置反应1~3天，取出上层悬浮的量子点，并以氯仿清洗，即得到巯基化合物修饰的水溶性量子点，或将合成的量子点氯仿溶液溶于所得B液中，旋转蒸发后用水溶解量子点，超声分散，然后色谱分离纯化，即得到两性聚合物包被的水溶性量子点，量子点水溶性修饰原理图见图1-a；

取制备的水溶性量子点加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和酰胺联氨化合物，反应0.5~6小时，去除过量小分子，得到联氨修饰的量子点；以偏高碘酸钠氧化生物功能分子，避光反应0.5~4小时，去除过量小分子，得到氧化的生物功能分子；混合联氨修饰的量子点和氧化的生物功能分子，反应0.5~4小时后，以葡萄糖封闭未反应位点，加入三乙酰氧基硼氢化钠溶液还原亚胺，以色谱分离量子点-生物功能分子复合物和自由的生物功能分子，量子点功能化修饰原理图见图1-b。所得量子点-生物功能分子复合物可用于分析检测等方面。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

1.量子点合成

取0.2375g硒粉、2.60mL十八烯和1.57mL三正辛基膦，依次加入25ml小试剂瓶中，加热瓶中混合液体并反复振荡直至硒粉全部溶解，即得硒前体。另取0.0368g氧化镉、0.342g硬脂酸和3.8ml十八烯，依次加入三颈烧瓶中，氮气保护下加热至氧化镉全部溶解。降温使溶液冷却至凝固。取2.25g十八胺和0.95g三辛基氧化膦，加入三颈烧瓶，并加热使固体融解，继续加热至280℃，注入4.2mL硒前体，升温至240℃，使CdSe量子点荧光发射波长增加到所需波长。并以甲醇纯化量子点。

取10mL十八烯、0.110g硫粉，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至硫粉溶解，即得硫前体。另取0.8375g氧化锌、9mL油酸和2mL十八烯，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至锌粉溶解，即得锌前体。取2mlCdSe量子点溶液，加入三颈烧瓶中，抽真空去除氯仿，取以上合成的硫前体和锌前体，以及5mL十八烯和1.4g十八胺，依次加入三颈烧瓶中，加热使固体融解，在氮气保护下加热使量子点生长至所需波长，并以甲醇纯化。表征CdSe/ZnS量子点荧光特征。

2.量子点水溶性修饰

取四甲基氢氧化铵和巯基丙酸加入氯仿中，其中四甲基氢氧化铵与巯基化合物的摩尔比为10:1~1:10，摇均后静置，去除上层液体，然后加入100μlCdSe/ZnS量子点溶液，量子点与巯基化合物的摩尔比为1:1000~1:10000。溶液中有红色沉淀析出，1~3天后取出红色悬浮物，以氯仿纯化后，溶于水或缓冲液中，得到巯基修饰的量子点。表征量子点荧光特征，图2为水溶性修饰前的脂溶性量子点、水溶性修饰后的聚合物包被的量子点和巯基丙酸置换的量子点的紫外吸收光谱。图3为水溶性修饰前的脂溶性量子点、水溶性修饰后的聚合物包被的量子点和巯基丙酸置换的量子点的荧光发射光谱。可见在相同浓度下，量子点荧光强度无明显减弱，发射波长有约3nm蓝移，原因应为巯基置换量子点表面的疏水链，而改变了量子点的表面结构。

3.量子点功能化修饰

取一定量的水溶性量子点，加入EDC和酰胺联氨化合物（如肼（ADH）），反应0.5~6小时，超滤离心以去除过量小分子，得到联氨修饰的量子点。以偏高碘酸钠氧化抗体（如羊抗兔抗体）分子，避光反应0.5~4小时，超滤离心以去除过量小分子，得到氧化的抗体。

混合联氨修饰的量子点和氧化的抗体，反应0.5~4小时后，以葡萄糖封闭未反应的位点，加入三乙酰氧基硼氢化钠溶液还原亚胺。以色谱分离量子点-抗体复合物和游离的抗体。量子点与抗体的摩尔比为1∶1~1:10。

将常规巯基置换所得的量子点和按照本发明所述方法所得的量子点分别以EDC/NHS常规方法交联得到量子点-羊抗兔抗体复合物。组装免疫层析试纸条，其中免疫层析膜上含包埋兔IgG的检测带。分别把以上所得三种量子点-羊抗兔抗体复合物加入结合垫中，加缓冲液层析。紫外照射下拍照，结果显示按本发明所述方法所得复合物层析后信号比EDC/NHS方法所得复合物层析后信号强4倍以上，较常规巯基置换所得量子点的量子点-抗体复合物层析信号强10倍以上。

实施例2：

1.量子点合成

根据实施例1所述方法合成CdSe量子点。

取10mL十八烯和0.150g硫粉，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至硫粉溶解，即得硫前体。另取1.20g氧化镉、10mL油酸和3mL十八烯，依次加入三颈烧瓶中，在氮气保护下加热至镉粉溶解，即得镉前体。取2mlCdSe量子点溶液，加入三颈烧瓶中，抽真空去除氯仿，取以上合成的硫前体和镉前体，以及5mL十八烯和1.4g十八胺，依次加入三颈烧瓶中，加热使固体融解，在氮气保护下加热使量子点生长至所需波长，并以甲醇纯化。表征CdSe/CdS量子点荧光特征。

2.量子点水溶性修饰

取一定量的辛胺修饰的聚丙烯酸氯仿溶液和四甲基氢氧化铵，加入氯仿溶液中，混均，然后加入CdSe/ZnS量子点溶液。其中烷基氢氧化铵与聚合物的摩尔比为100:1~1:10，量子点与聚合物的摩尔比1∶100~1:2000。旋转蒸发后，加水或缓冲液溶解，并超声10~30分钟，以色谱分离纯化，得到聚合物修饰的水溶性量子点。表征量子点荧光特征，图2为水溶性修饰前的脂溶性量子点、水溶性修饰后的聚合物包被的量子点和巯基丙酸置换的量子点的紫外吸收光谱。图3为水溶性修饰前的脂溶性量子点、水溶性修饰后的聚合物包被的量子点和巯基丙酸置换的量子点的荧光发射光谱。可见在相同浓度下，量子点荧光发射波长和强度均无明显减弱，原因应为聚合物包被到量子点表面，与量子点表面疏水链相互作用，不影响量子点表面结构。

3.量子点功能化修饰

取一定量的水溶性量子点，加入EDC和酰胺联氨化合物，反应0.5~6小时，超滤离心以去除过量小分子，得到联氨修饰的量子点。以偏高碘酸钠氧化抗原（如尿素酶抗原）分子，避光反应0.5~4小时，超滤离心以去除过量小分子，得到氧化的抗原。

混合联氨修饰的量子点和氧化的抗原，反应0.5~4小时后，以葡萄糖封闭未反应的位点，加入三乙酰氧基硼氢化钠溶液还原亚胺。以色谱分离量子点-抗原复合物和游离的抗原。量子点与抗原的摩尔比为1:1~1:30。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种量子点生物分子功能化的方法，包含以下步骤：

步骤(1)以有机相法合成脂溶性的量子点；

步骤(2)将巯基化合物溶于含烷基氢氧化铵的氯仿溶液中，静置，弃上层液体，得到反应A液；

步骤(3)将步骤(1)合成的量子点氯仿溶液溶于步骤(2)所得A液中，静置反应1～3天，取出上层悬浮的量子点，并以氯仿清洗，即得到巯基化合物修饰的水溶性量子点；

步骤(4)取步骤(3)制备的水溶性量子点加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺和酰胺联氨化合物，反应0.5～6小时，去除过量小分子，得到联氨修饰的量子点；

步骤(5)以偏高碘酸钠氧化生物功能分子，避光反应0.5～4小时，去除过量小分子，得到氧化的生物功能分子；

步骤(6)混合联氨修饰的量子点和氧化的生物功能分子，反应0.5～4小时后，以葡萄糖封闭未反应位点，加入三乙酰氧基硼氢化钠溶液还原亚胺，以色谱分离获得量子点-生物功能分子复合物；

步骤(4)所述酰胺联氨化合物包含两个联氨基团，其结构式如下

H₂NHNCO(CH₂)_nCONHNH₂

其中，n≥1。

2.如权利要求1所述的量子点生物分子功能化的方法，其特征在于，步骤(1)所述量子点为单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述化合物是从ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP组成的组中选择，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

4.如权利要求1所述的量子点生物分子功能化的方法，其特征在于，步骤(2)所述巯基化合物结构式如下：

HS-C_nH_m-COOH

其中，n≥1,m≥2。

5.如权利要求1所述的量子点生物分子功能化的方法，其特征在于，步骤(2)所述烷基氢氧化铵结构式如下

其中，x,y,n,m≥1。

6.如权利要求1所述的量子点生物分子功能化的方法，其特征在于，步骤(2)所述烷基氢氧化铵与巯基化合物的摩尔比为10:1～1:10。

7.如权利要求1所述的量子点生物分子功能化的方法，其特征在于，步骤(3)所述量子点与巯基化合物的摩尔比为1:1000～1:10000。

8.如权利要求1所述的量子点生物分子功能化的方法，其特征在于，步骤(5)所述生物功能分子为半抗原、抗原、抗体和链霉亲和素。

9.如权利要求1所述的量子点生物分子功能化的方法，其特征在于，步骤(6)所述量子点与生物功能分子的摩尔比为1:1～1:30。