CN103665119B - 纯化量子点与链霉亲和素偶联物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适合规模化高效纯化水溶性量子点链霉亲和素偶联物的新方法，属生物技术领域。针对目前量子点链霉亲和素偶联物纯化工艺复杂，回收率低，难以实现规模化生产的弊端，本发明通过采用单端氨基化聚乙二醇封闭量子点链霉亲和素偶联物的残留羧基，降低偶联产物的表面ζ电位，通过调整溶液pH值至4.5，进一步降低偶联产物在溶液中的净电荷含量、实现普通高速离心法规模化高效纯化量子点链霉亲和素偶联物。本发明简化了量子点链霉亲和素偶联物的实验操作流程，降低了对分离设备的要求，适合大批量纯化量子点链霉亲和素偶联物，得率在85%以上，且偶联产物的荧光特性以及生物活性未见明显变化。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料生物学修饰以及偶联物纯化的新方法，具体涉及一种规模化高效纯化量子点与链霉亲和素偶联物的新方法。
背景技术
链霉亲和素是一种与亲和素有相似生物学特性的蛋白质，可以高度特异性地结合一种水溶性的维生素：D-生物素，其与生物素的亲和力非常强，它们之间的Kd值接近10-15M。完整的链霉亲和素是由四条相同肽链组成的四聚体，总分子量约为66.5kDa，并且每一个链霉亲和素分子可以紧密结合四个生物素分子，平均每条肽链（单体）可以结合一个生物素分子。完整的四聚体链霉亲和素还具有热稳定性好，对强酸、十二烷基磺酸钠、尿素、盐酸胍的耐受性强等特点，这些特点使得生物素-链霉亲和素系统具有高亲和力、灵敏度高、特异性强、稳定性好，信号放大作用等众多优势，此外生物素具有非常易于与种类繁多的生物活性分子（如蛋白，核酸和糖类等）发生偶联的优点，使得生物素-链霉亲和素广泛应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域，并已经取得较好的效果。
量子点(Quantum Dots, QDs)是一种由II-VI或III-V族元素组成的半导体纳米晶体 (Semiconductor
nanocrystals)，由于量子点的极小物理尺寸，从而导致了一种量子限域效应，使得量子点显示出具有比常规有机染料、荧光蛋白更为优越的独特光学性质。首先，与常规有机染料相比，量子点的激发光谱宽且呈连续分布，其荧光发射光谱的半宽峰高与常规有机染料相比更窄，且呈对称分布。此外，量子点与常规荧光染料相比，激发和发射光谱之间的斯托克斯位移大，降低了量子点荧光信号的信噪比，大大提高了量子点的检测灵敏度。单个量子点的荧光强度是罗丹明染料的10-100倍之间，且量子点的荧光发射波长可通过调整量子点合成粒径的大小以及材料组分进行连续调谐，因此合成不同直径大小的量子点就能获得多种可以辨别的不同颜色荧光。由于不同尺寸大小的量子点能够采用单一波长的激发光产生不同颜色的荧光, 因而可方便实现对生物组分的多元检测。量子点与常规有机染料或荧光蛋白相比，具有较强的抗光漂白功能。量子点在连续光激发条件下，其荧光发射强度随时间变化不明显，而Alexa
488在没有添加抗漂白剂的情况下荧光强度呈指数下降。总之，作为一种新型的荧光标记物，量子点具有比常规有机染料以及荧光蛋白更为显著的优势，目前已广泛应用于细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及荧光标记的免疫学快速诊断技术等领域。其中羧基功能团表面的水溶性量子点应用最为广泛，采用多羧基以及疏水链的两性聚合物是油溶性量子点转化为羧基表面的水溶性量子点最常用方法。
由于链霉亲和素结合生物素类似于化学偶联的亲和效果，因此量子点链霉亲和素偶联产物被认为制备各类生物荧光探针的共同载体得到了广泛的应用。水溶性羧基化量子点与链霉亲和素常用偶联方法为EDC/NHSS介导的活泼酯方法。在水溶性羧基化量子点与链霉亲和素链霉亲和素偶联过程中，将量子点链霉亲和素偶联物与溶液中游离链霉亲和素进行高效分离，是保证量子点链霉亲和素偶联物广泛使用的前提。目前，量子点链霉亲和素偶联物纯化方法主要包括以下几种。第一，超速离心方法。链霉亲和素与量子点偶联后，由于蛋白质空间位阻效应，量子点表面仍含有大量的残留羧基，因此采用常规离心（低于30，000 g离心力），量子点链霉亲和素偶联物回收效率普遍偏低（小于40%），若要将量子点链霉亲和素偶联物回收效率提高至80%以上，离心速度一般需大于60，000 g。 第二种，凝胶色谱法。该方法利用量子点链霉亲和素偶联物与链霉亲和素的分子量差异（表现为光学以及水化粒径的差异），利用排阻层析原理进行分离。第三种，超滤分离法。该法利用超滤管的超滤膜截流分子量差异将链霉亲和素与量子点链霉亲和素偶联物进行分离的一种方法。同时还有基于琼脂糖凝胶以及琼脂糖-聚丙烯酰胺杂合凝胶电泳等的纯化分离方法。总之，利用以上纯化方法虽然可以获得较高质量的量子点链霉亲和素偶联物，但仍存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低等缺陷，很难实现规模化生产的缺陷。
发明内容
水溶性量子点是一种良好的纳米荧光标记材料，该材料通过与链霉亲和素、蛋白G以及配体或受体分子偶联，可广泛应用于细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及免疫快速诊断等诸多领域。但是传统的量子点链霉亲和素偶联物纯化方法存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低以及很难实现规模化生产等缺陷。
本发明的目的是提供一种操作简便、分离效率高、大批量纯化水溶性量子点链霉亲和素偶联物的新方法，具体包括以下步骤：
一种纯化量子点链霉亲和素偶联物的方法，包括如下步骤：（1）将水溶性羧基修饰的量子点活化，加入链霉亲和素溶液，调整溶液pH至7.5～8.5后，偶联反应；（2）偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇封闭偶联产物中量子点表面残留的羧基，将反应溶液pH值调整至弱酸性；（3）高速离心，弃上清液，取沉淀。
所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性羧基量子点。能与链霉亲和素偶联。
步骤（1）所述活化为将水溶性羧基修饰的量子点溶解于pH
5.0～6.0，0.05
mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时，活化量子点羧基。
所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与量子点的摩尔比均为100～200：1，优选为150:1；所述链霉亲和素与量子点的摩尔比为2～20：1。
步骤（2）加入单端氨基化聚乙二醇至单端氨基化聚乙二醇终浓度为1～2%，充分混匀15～30分钟。
步骤（2）将反应溶液pH值调整至弱酸性为将pH值调整至4.5。
步骤（3）高速离心离心力为28，000～30，000g。
还包括将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0～7.5磷酸盐缓冲液溶解备用的步骤。
步骤（1）用0.1～1.0 M NaOH溶液调整溶液pH至7.5～8.5。
原理见图2。
水溶性羧基修饰的量子点为核壳结构的量子点，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团，通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性量子点包裹在壳层内部。将量子点溶解于pH
6.0，0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入摩尔比为100～200：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时，将量子点表面羧基转化为酸性条件下稳定的活泼酯。加入链霉亲和素抗体溶液，其中链霉亲和素与量子点摩尔比为2～20：1，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至7.5～8.5。在pH 7.5～8.5条件下，链霉亲和素氨基酸残基中的氨基易于质子化，而量子点表面活泼酯化的羧基在弱碱性条件下发生水解，与质子化氨基偶联形成稳定的酰胺键，从而将链霉亲和素偶联至量子点表面。量子点与链霉亲和素偶联后，由于空间位阻的原因，量子点表面仍会残留大量未被偶联的羧基，因此量子点链霉亲和素偶联物仍旧保持较大的ζ电位，因此采用普通离心方法无法将量子点链霉亲和素偶联物与未偶联链霉亲和素进行有效分离。为了降低量子点链霉亲和素偶联物表面的ζ电位，本发明通过单端氨基化聚乙二醇的氨基封闭量子点表面游离羧基，使量子点链霉亲和素偶联物残留羧基转换为羟基，提高量子点链霉亲和素偶联物等电点，同时进一步通过终浓度为1%～2%单端氨基化聚乙二醇破坏链霉亲和素表面的水化层。经过大量的比较实验，令人意想不到的是当将溶液pH值调整至4.5时，水溶性量子点链霉亲和素偶联物在普通高速离心下（28，000 g～30，000 g）即可与溶液中未偶联链霉亲和素实现有效分离，其中水溶性量子点链霉亲和素偶联物的回收率大于90%。
为了验证单端氨基化聚乙二醇是否能有效降低羧基化量子点的ζ电位，我们以发射波长为602nm羧基化的水溶性量子点为原料，以单端氨基化聚乙二醇为封闭剂，采用EDC法封闭量子点表面羧基。然后采用0.1 M
HCl或 NaOH调整羧基化的量子点（浓度为0.1
µM）pH分别至2，3，4，5，6和7，同时加入同等量的0.1 M HCl或 NaOH溶液至相同浓度的羟基化量子点溶液中。以上两类不同pH值的量子点经马尔文表面电位粒径仪分析，结果见表1。从表1可知，在相同pH值下，单端氨基化聚乙二醇修饰的羟基化量子点表面电位显著低于羟基化量子点。
表1 不同pH条件下，羧基化以及羟基化量子点的表面电位
| pH | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 羧基化量子点 | -8.204 | -12.7 | -17.13 | -32.46 | -55.58 | -63.03 |
| 羟基化量子点 | 9.899 | -4.375 | -7.562 | -29.7 | -40.35 | -55.05 |
本发明方法操作过程中涉及调酸（pH 4.5）以及添加单端氨基化聚乙二醇，该过程是否会影响量子点的荧光量子产率，为了进一步验证本发明方法的可靠性，将羧基化的量子点（浓度为0.5
nmol/L，即对照组）、常规方法合成的量子点链霉亲和素偶联物（量子点浓度为0.5 nmol/L，即未经单端氨基化聚乙二醇封闭组）以及本实验方案制备的水溶性量子点链霉亲和素偶联物（量子点浓度为0.5 nmol/L，即单端氨基化聚乙二醇封闭组）进行荧光光谱分析，结果见图1。从图1结果可知，本实验方案制备的水溶性量子点链霉亲和素偶联物（单端氨基化聚乙二醇封闭组）以及常规方法合成的量子点链霉亲和素偶联物（未经单端氨基化聚乙二醇封闭组）的荧光强度与羧基化的量子点（对照组）相比，未见明显下降，结果表明调酸（pH
4.5）以及添加单端氨基化聚乙二醇不会影响量子点的荧光量子产率。
采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明方法通过添加单端氨基化聚乙二醇封闭量子点表面未被反应的羧基，使羧基转变为羟基，降低水溶性量子点链霉亲和素偶联物表面的ζ电位，同时破坏链霉亲和素表面的水化层，有利于水溶性量子点链霉亲和素偶联物从反应溶液中析出。
2、本发明方法借助调酸，改变反应溶液pH值至4.5左右，使水溶性量子点链霉亲和素偶联物在溶液中溶解性下降。
3、本发明技术通过添加单端氨基化聚乙二醇和调酸，使得水溶性量子点链霉亲和素偶联物在溶液中溶解性下降，采用普通离心方法28，000 g～30，000 g就可以将水溶性量子链霉亲和素偶联物与未偶联链霉亲和素进行高效分离（分离效率达85%以上）。与传统的水溶性量子点链霉亲和素偶联物纯化方法相比，具有操作简单，设备要求低（一般实验室均能达到），纯化效率高（85%以上）以及可以实现规模化生产等。
附图说明
图1三种量子点荧光图谱的比较。
图2本发明方法原理示意图。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
磷酸盐缓冲液（PBS，0.05 M，pH 7.4）的配置方法：NaCl 40 g，Na2HPO4 13.5 g, KH2PO41.0 g，KCl 1.0 g溶于1 L超纯水中。用0.1 M NaOH调pH值至8.0～9.0。
硼酸盐缓冲液（0.05 M，pH 6.0）的配制方法：取1.0 g硼酸溶于1 L超纯水。调pH值至6.0。
实施例中所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性羧基量子点购买自美国Ocean NanoTech公司，型号为QSH系列。
实施例1水溶性量子点链霉亲和素偶联物及纯化工艺
取5 mL羧基化水溶性量子点（浓度为50
nmol/L）与等体积pH 5.0的0.05
mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与量子点摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与量子点摩尔比为5：1的链霉亲和素溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为1.5%单端氨基化聚乙二醇，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05
mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离链霉亲和素的水溶性量子点链霉亲和素偶联物。本发明技术方案合成的水溶性量子点链霉亲和素偶联物经1.5%单端氨基化聚乙二醇处理后，偶联物离心纯化的回收率为88.6±1.1%。
Claims (9)
1.一种纯化量子点链霉亲和素偶联物的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将水溶性羧基修饰的量子点活化，加入链霉亲和素溶液，调整溶液pH至7.5～8.5后，偶联反应；（2）偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇封闭偶联产物中量子点表面残留的羧基，将反应溶液pH值调整至弱酸性；（3）高速离心，弃上清液，取沉淀；
步骤（2）将反应溶液pH值调整至弱酸性为将pH值调整至4.5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性羧基量子点。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述活化为将水溶性羧基修饰的量子点溶解于pH 5.0～6.0，0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时，活化量子点羧基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与量子点的摩尔比均为100～200：1；所述链霉亲和素与量子点的摩尔比为2～20：1。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与量子点的摩尔比均为150：1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）加入单端氨基化聚乙二醇至单端氨基化聚乙二醇终浓度为1～2%，充分混匀15～30分钟。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）高速离心离心力为28，000～30，000 g。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于还包括将沉淀用25%甘油， 0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0～7.5磷酸盐缓冲液溶解备用的步骤。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）用0.1～1.0 M NaOH溶液调整溶液pH至7.5～8.5。
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