CN113341149A - 一种用于检测氟喹诺酮类抗生素的试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，具体讲，涉及一种氟喹诺酮类抗生素的检测试剂盒和检测方法。该试剂盒包括：氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体、多孔化学发光酶标板、标记有生物素的氟喹诺酮类化合物、氟喹诺酮类化合物标准品、碱性磷酸酶的化学发光底物和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球。本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、检测范围宽、操作简单、特异性好等优点，对氟喹诺酮类化合物的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏侦检技术具有很好的指导意义。

Description

一种用于检测氟喹诺酮类抗生素的试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体讲，涉及一种用于检测氟喹诺酮类抗生素的试剂盒和检测方法。
背景技术
氟喹诺酮抗生素(FQs)包括洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星(NOR)、环丙沙星、左氧氟沙星等。氟喹诺酮类药物的抗菌机制是选择性抑制拓扑异构酶IV和DNA促旋酶，从而阻碍细菌DNA复制。它们被广泛用于畜禽疾病以及人类疾病的预防和治疗。其中，诺氟沙星是新一代的氟喹诺酮类抗生素，其广泛使用已导致残留和积累在人体中，对人体健康和环境造成极大伤害。诺氟沙星不仅会对人体健康造成危害，而且还可能引起严重的耐药性，对人类的生存有直接和间接的危害。因此，检测诺氟沙星残留具有重要意义。
目前，氟喹诺酮抗生素的检测方法主要包括高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)，免疫分析和电化学分析。但是，基于仪器的传统方法存在一些缺点，包括复杂的样品预处理，检测周期长以及专门的技术人员来进行实验。因此，有必要开发一种用于检测诺氟沙星的灵敏、快速的方法。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测氟喹诺酮类抗生素的试剂盒。
本发明的第二发明目的在于提供一种氟喹诺酮类抗生素的检测方法。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明实施例提出一种用于检测氟喹诺酮类化合物的试剂盒，该试剂盒包括：氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体、多孔化学发光酶标板、标记有生物素的氟喹诺酮类化合物、氟喹诺酮类化合物标准品和碱性磷酸酶的化学发光底物和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球，
优选的，该试剂盒包括：诺氟沙星单克隆抗体、多孔化学发光酶标板、标记有生物素的诺氟沙星化合物、诺氟沙星标准品和碱性磷酸酶的化学发光底物和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球。
本发明实施例还提出一种氟喹诺酮类化合物的检测方法，其特征在于，采用上述试剂盒，至少包括以下步骤：
S1、将所述氟喹诺酮类化合物抗体包被于多孔化学发光板，孵育、洗涤后，用BSA封闭；
S2、在所述多孔化学发光板的孔中添加所述标记有生物素的氟喹诺酮类化合物，然后添加所述氟喹诺酮类化合物标准品或待测样品，反应后洗涤；
S3、在所述多孔化学发光板的孔中继续添加所述偶联有量子点微球的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，孵育后洗涤；
S4、用酶标仪检测荧光，添加碱性磷酸酶的化学发光底物后，立即用化学发光免疫分析仪测量相对光单位；
S5、根据一系列稀释浓度的诺氟沙星标准品检测得到的荧光值和相对光单位分别绘制标准曲线；利用待测样品所对应的荧光值和相对光单位获得待测样品的浓度。
本发明至少具有以下有益的效果：
本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、检测范围宽、操作简单、特异性好等优点，对氟喹诺酮类化合物的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏侦检技术具有很好的指导意义。
附图说明
图1为根据本发明某一实施方式中，量子点微球及QDs-FM@ALP-SA的透射电子显微镜图；
图2为根据本发明某一实施方式中，量子点微球及QDs-FM@ALP-SA的动态光散射图；
图3为根据本发明某一实施方式中，量子点微球及QDs-FM@ALP-SA的Zeta电位表征图；
图4为根据本发明某一实施方式中，NOR-Biotin的傅里叶红外光谱图；
图5为根据本发明某一实施方式中，NOR-Biotin的飞行时间质谱表征图；
图6为根据本发明某一实施方式中，以诺氟沙星标准品浓度的对数值为横坐标，各浓度对应的B/B0％值为纵坐标绘制的化学发光信号的竞争曲线；
图7为根据本发明某一实施方式中，以诺氟沙星标准品浓度的对数值为横坐标，各浓度对应的B/B0％值为纵坐标绘制的荧光信号的竞争曲线；
图8为根据本发明某一实施方式中，不同ALP-SA的偶联量时的化学发光信号的实验结果；
图9为根据本发明某一实施方式中，不同ALP-SA的偶联量时的荧光信号的实验结果；
图10为根据本发明某一实施方式中，改变诺氟沙星抗体的稀释倍数时的化学发光信号的实验结果；
图11为根据本发明某一实施方式中，改变NOR-Bio的稀释倍数时的化学发光信号的实验结果；
图12为根据本发明某一实施方式中，改变甲醇PBS中甲醇的含量时的化学发光信号的实验结果；
图13为根据本发明某一实施方式中，改变缓冲溶液的pH值时的化学发光信号的实验结果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
本发明实施例提出一种氟喹诺酮类化合物的检测试剂盒，用于高灵敏的检测氟喹诺酮类化合物。具体的，该试剂盒包括：氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体、多孔化学发光酶标板、标记有生物素的氟喹诺酮类化合物、氟喹诺酮类化合物标准品、碱性磷酸酶的化学发光底物和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球。本发明的原理是游离氟喹诺酮类化合物标准品或样品和标记有生物素的氟喹诺酮类化合物与固相抗体的竞争反应。检测时，首先将氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体包被多孔化学发光微量滴定板，添加氟喹诺酮类化合物标准品和标记有生物素的氟喹诺酮类化合物，以直接竞争氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体。然后将偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球与标记有生物素的氟喹诺酮类化合物结合，最后分别检测量子点的荧光以及碱性磷酸酶的化学发光底物的化学发光这两种信号，以建立直接竞争化学发光/荧光免疫测定法(dc-CLIA/FIA)。
研究发现，偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球(QDs-FM@ALP-SA)是一种双功能载体，不仅可用作碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(ALP-SA)的化学发光信号放大载体，还可以用作具有自身荧光特性的荧光信号。在检测中，可以根据实验室的设备条件，选择化学发光或荧光信号输出方法。QDs-FM@ALP-SA与单独的ALP-SA相比，化学发光信号强度大大增加，本发明实施例试剂盒的检测灵敏度大大提高。
在已有技术中，小分子检测通常使用完全抗原进行信号传递，以进行间接竞争反应。但是完全抗原的合成过程非常复杂，并且产物稳定性不好。为了减少这些问题，本发明实施例中标记有生物素的氟喹诺酮类化合物使用点击反应合成，因为点击化学的合成过程简单，选择性、产量和产物稳定性比完全抗原要高。同时，由于点击化学具有模块化，高产率和高选择性的优点，所以生物素修饰的不同类型的抗生素类化合物(如氨基糖苷类、大环内酯类、青霉素类)可以通过点击化学容易地合成。从而可获得不同种类的抗生素类化合物检测试剂盒。
作为一种优选的实施方式，氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体包被于多孔化学发光酶标板上，多孔化学发光酶标板中每孔包被有氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体50～200μL/孔，更优选100μL/孔；其中，氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体的稀释倍数为1：500～4000，优选为1：2000。如果稀释倍数过高过或低，都会影响检测的灵敏度。
作为一种优选的实施方式，标记有生物素的氟喹诺酮类化合物的稀释倍数为1：500～4000，优选为1：1000。如果稀释倍数过高过或低，都会影响检测的灵敏度。
作为一种优选的实施方式，氟喹诺酮类化合物抗体的稀释倍数为1：500～4000，优选为1：2000。如果稀释倍数过高过或低，都会影响检测的灵敏度。
作为一种优选的实施方式，在本发明实施例的试剂盒中还含有稀释液1和稀释液2；稀释液1用于稀释标记有生物素的氟喹诺酮类化合物和氟喹诺酮类化合物标准品，稀释液2用于稀释氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球；稀释液1为含有甲醇、浓度为0.01M的PBS溶液，甲醇的体积百分比浓度为5～40％，优选为5％；优选的，稀释液1的pH为7.4。稀释液2为含有质量百分比浓度为1％的BSA和质量百分比浓度为5％的蔗糖的、浓度为0.01M的PBS溶液。
作为一种优选的实施方式，氟喹诺酮类化合物标准品的浓度范围为0.005～1000ng/mL；优选为1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005ng/mL。作为一种优选的实施方式，碱性磷酸酶的化学发光底物直接应用市售产品，例如无锡百格生物科技有限公司的产品。
作为一种优选的实施方式，偶联有量子点微球的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的浓度为10～50nM，优选为20nM。
作为一种优选的实施方式，量子点微球的直径为100～150nm。该特定尺寸的量子点微球能够满足修饰的要求。偶联有量子点微球的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素可采用本领域常规的方法制得，例如，利用126nm量子点微球和ALP-SA制备。
作为一种优选的实施方式，每400μmol量子点微球上偶联的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的质量为50～400μg，优选为200μg。
本发明还提供一种氟喹诺酮类化合物的检测方法，该方法包括以下步骤：
S1、将氟喹诺酮类化合物抗体包被于多孔化学发光板，孵育、洗涤后，用BSA封闭；
S2、在多孔化学发光板的孔中添加标记有生物素的氟喹诺酮类化合物，然后添加氟喹诺酮类化合物标准品或待测样品，反应后洗涤；
S3、在多孔化学发光板的孔中继续添加偶联有量子点微球的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，孵育后洗涤；
S4、用酶标仪检测荧光，添加碱性磷酸酶的化学发光底物后，立即用化学发光免疫分析仪测量相对光单位；
S5、根据一系列稀释浓度的诺氟沙星标准样品检测得到的荧光值和相对光单位分别绘制标准曲线；将待测样品所对应的荧光值和相对光单位获得待测样品的浓度。
在上述检测方法中，多孔化学发光板的每孔包被氟喹诺酮类化合物抗体50～200μL，更优选100μL；
氟喹诺酮类化合物标准品或待测样品每孔添加50μL；
偶联有量子点微球的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素每孔添加100μL。
在S1～S3中，反应的温度为37℃。
本发明实施例的方法和试剂盒可以用于氟喹诺酮类化合物，具体选自洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星。
以诺氟沙星为例，列举具体步骤为：
试剂盒包括：诺氟沙星单克隆抗体、多孔化学发光酶标板、标记有生物素的诺氟沙星化合物、诺氟沙星标准品、碱性磷酸酶的化学发光底物和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球、稀释液1和稀释液2。
(1)获取诺氟沙星-生物素(NOR-Biotin)；
(2)偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(ALP-SA)的量子点微球，即QDs-FM@ALP-SA；
(3)诺氟沙星单克隆抗体100μL/孔包被于96孔化学发光板，37℃孵育2h，洗涤三次；
(4)各孔添加1％BSA 100μL/孔，于37℃下封闭1h，洗涤三次；
(5)各孔添加50μL/孔的NOR-Biotin和50μL/孔的诺氟沙星标准品或样品，于37℃下孵育1h，洗涤三次；
(6)添加100μL/孔QDs-FM@ALP-SA，于37℃孵育50分钟，洗涤三次。
(7)洗涤后，用酶标仪SpectraMax M5测量荧光。之后，添加100μL/孔的碱性磷酸酶的化学发光底物，并立即用化学发光免疫分析仪测量相对光单位(RLU)。
本发明中，诺氟沙星单克隆抗体可以在实验室采用常规的免疫方法制备，也可直接从公司购买。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明的具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用中诺氟沙星标准品购自上海源叶生物科技有限公司、诺氟沙星抗体购自山东绿都生物科技有限公司、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素购自北京百奥莱博科技有限公司、ALP化学发光底物液购自无锡百迈格生物科技有限公司、量子点微球购自北京纳诺金生物科技有限公司、生物素-炔和氨基叠氮购自苏州爱玛特生物科技有限公司、CuSO4和柠檬酸购自天津市大茂化学试剂厂、N,N二甲基甲酰胺购自国药集团化学试剂有限公司、BSA、EDC和NHS购自美国Sigma-Aldrich公司、TLC硅胶板购自德国默克公司，实验中用到的Spectra Max M5酶标仪购自上海Molecular Devices公司、化学发光免疫分析仪购自北京泰格科信生物技术有限公司、96孔化学发光板购自美国Thermo Fisher公司。
实施例1：偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球(QDs-FM@ALP-SA)的制备
①分别取400μL 20mM MES缓冲液(pH＝6)和400μL QDs-FM(1μmol/L)于1.5mL EP管中，加入8μL 20mg/mL EDC-HCl和8μL 20mg/mL Sulfo-NHS，快速混匀后37℃反应1h以活化QDs-FM表面的羧基。12000g离心25min，弃上清，用10mM MES缓冲液(pH＝6)重悬至400μL，混匀，如有聚沉，超声辅助混匀。
②QDs-FM活化后，立既加入20μL待标记ALP-SA，混匀，37℃反应2h，12000g离心25min，弃上清。
③加入400μL 1％BSA封闭剂，混匀，如有聚沉，可超声辅助混匀。37℃反应1h，12000g离心25min，弃上清，采用稀释液2(含1％BSA和5％蔗糖的0.01M PBS)保存。
用400μL保护液(含1％BSA和5％蔗糖的0.01M PBS)重悬，分散。对合成的QDs-FM@ALP-SA进行透射电子显微镜、动态光散射和Zeta电位表征。
透射电子显微镜的实验结果如图1所示。其中，图1中A为QDs-FM，B为QDs-FM@ALP-SA；动态光散射的实验结果如图2所示，Zeta电位表征的实验结果如图3所示。
实施例2：标记有生物素的诺氟沙星化合物的制备：
Figure BDA0003108429440000091
①活化羧基
准确称量诺氟沙星(NOR)、EDC-HCl、Sulfo-NHS各0.958mg、5.751mg、8.685mg，摩尔比为NOR/EDC/NHS＝3/30/40，分别溶于200μL DMF。将三者加入EP管中，混匀，于37℃震荡4h。
②缩合反应合成NOR-N3中间产物
精确称量0.7356mg NH2-N3(6μmol)，用10μL DMF溶解，加入到羧基活化后的NOR反应溶液中，摩尔比为NOR/NH2-N3＝1/2，37℃避光震荡14h。薄层色谱法(TLC)分离纯化NOR-N3，展开剂为三氯甲烷/甲醇/浓氨水＝15/10/3，展开时间约30min。待TLC硅胶板干燥后，置于紫外分析仪(254nm或365nm)下观察，标记目的条带的位置，刮下硅胶移入1.5mL EP管，加入800μL DMF，室温下避光涡旋振荡30min提取NOR-N3。7000r/min离心10min，取上清，氮吹仪避光氮吹浓缩溶液至200μL，-20℃保存。
③点击化学合成标记有生物素的诺氟沙星化合物(NOR-Biotin)：
精确称量生物素-炔1.688mg(6μmol)，用100μL DMF溶解，逐滴加入到2.3.3的分离产物中，加入50μL 0.1M CuSO4和50μL 0.2M新鲜配制的柠檬酸溶液，混匀后室温震荡过夜。薄层色谱法(TLC)分离纯化NOR-Bio，展开剂为三氯甲烷/甲醇/浓氨水＝15/10/3，展开时间约30min。待TLC硅胶板干燥后，置于紫外分析仪(254nm或365nm)下观察，标记目的条带的位置，刮下硅胶移入1.5mL EP管，加入800μL DMF室温下避光涡旋振荡30min提取NOR-Bio。7000r/min离心10min，取上清，氮吹仪避光氮吹浓缩溶液至200μL，-20℃保存。
对合成的诺氟沙星-生物素缀合物进行了傅里叶变换红外光谱和飞行时间质谱表征，结果如图4和图5所示。
进行了直接竞争化学发光免疫学检测，来验证合成的NOR-Bio的免疫学活性，具体方法步骤：
(1)将连续稀释的诺氟沙星抗体(1：1000、1：2000、1：4000)100μL/孔包被于96孔化学发光板，37℃孵育2h，洗涤三次；
(2)各孔添加1％BSA 100μL，于37℃下封闭1h，洗涤三次；
(3)各孔添加100μL系列稀释的NOR-Biotin(1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200)，在37℃温育1小时并洗涤。
(4)各孔加入100μL的ALP-SA，于37℃孵育50分钟，洗涤三次。
(5)洗涤后，各孔添加100μL的ALP发光底物，并立即用化学发光免疫分析仪测量相对光单位(RLU)。
结果如表1和表2所示。
表1.NOR-Biotin免疫学活性验证的ΔRLU(ALP-SA)
Figure BDA0003108429440000111
表2.NOR-Biotin免疫学活性验证的ΔRLU(QDs-FM@ALP-SA)
Figure BDA0003108429440000112
由表可知，抗体稀释倍数为2000时：(1)用单独的ALP-SA作为信号输出方式，当NOR-Biotin稀释倍数在1600和3200时，ΔRLU分别为8971和8165；(2)用QDs-FM@ALP-SA作为信号输出方式，当NOR-Biotin稀释倍数为2000时，ΔRLU为26571，ΔRLU值提高了约3.2倍。
实施例3检测氟喹诺酮类抗生素
试剂盒组成：
诺氟沙星单克隆抗体、多孔化学发光酶标板、标记有生物素的诺氟沙星化合物、诺氟沙星标准品、碱性磷酸酶的化学发光底物和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球、稀释液1和稀释液2。
具体组成如表3所示：
表3
Figure BDA0003108429440000121
(1)诺氟沙星单克隆抗体(用稀释液2稀释至1：2000)100μL/孔包被于96孔化学发光板，37℃孵育2h，洗涤三次；
(2)各孔添加1％BSA 100μL，于37℃下封闭1h，洗涤三次；
(3)各孔添加50μL的NOR-Biotin(实施例2制备，用稀释液1稀释至1：1000)和50μL的诺氟沙星标准品(用稀释液1稀释至浓度为1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005ng/mL)或样品，于37℃下封闭1h，洗涤三次；
(4)添加100μL/孔QDs-FM@ALP-SA(实施例1制备)，浓度为20nM，于37℃孵育50分钟，洗涤三次。
(5)洗涤后，用酶标仪SpectraMax M5测量荧光。之后，添加100μL/孔的ALP发光底物，并立即用化学发光免疫分析仪测量相对光单位(RLU)。
在以上实验条件的情况下，使用一系列稀释浓度的诺氟沙星标准样品(1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005ng mL-1)，绘制标准曲线。化学发光强度和荧光强度随着诺氟沙星浓度的增加先降低而后趋于平缓，该趋势可以做如下解释：诺氟沙星与诺氟沙星-生物素竞争结合固相抗体，随着诺氟沙星标准品浓度增加，其与固相抗体结合的越多，而导致诺氟沙星-生物素与抗体的结合减少，与诺氟沙星-生物素特异性结合的QDs-FM@ALP-SA随之减少，因此，输出信号强度降低。随着诺氟沙星的浓度增加到一定程度，将几乎全部占据抗体结合位点，这时，随着诺氟沙星浓度增加，输出信号强度变化非常小，趋于平缓。不添加抑制物质的对照孔的化学发光值或荧光值为B0，添加了抑制物质的孔的化学发光值或荧光值为B，B/B0叫做结合率。以抑制物浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标，绘制标准曲线。dc-CLIA/FIA的灵敏度用半抑制浓度即IC50来表示。IC50是根据标准曲线计算得到的，在结合率为50％时所对应的抑制物的浓度叫做IC50。一般IC50的数值越小，半数抑制浓度越低，说明方法的灵敏度越高。化学发光结果如图6所示，荧光结果如图7所示。
由图6和图7所示，化学发光结果的IC50为0.345ng mL-1，检出限为3.4pg mL-1。荧光结果的IC50为1.206ng/mL，检出限为8.8pg mL-1。
实施例4特异性实验。
(1)诺氟沙星单克隆抗体(用稀释液2稀释至1：2000)100μL/孔包被于96孔化学发光板，37℃孵育2h，洗涤三次；
(2)各孔添加1％BSA 100μL，于37℃下封闭1h，洗涤三次；
(3)各孔添加50μL的NOR-Biotin(实施例2制备，用稀释液1稀释至1：1000)和50μL/孔连续稀释的诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星、恶喹酸、阿奇霉素、罗红霉素、氯霉素、四环素、土霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、林可霉素、克林霉素标准品，于37℃下封闭1h，洗涤三次；
(4)添加100μL/孔QDs-FM@ALP-SA(实施例1制备)，浓度为20nM，于37℃孵育50分钟，洗涤三次。
(5)洗涤后，用酶标仪SpectraMax M5测量荧光。之后，添加100μL/孔的ALP发光底物，并立即用化学发光免疫分析仪测量相对光单位(RLU)。
在优化的实验条件下研究了dc-CLIA/FIA的特异性。在以上实验条件的情况下，使用一系列稀释浓度的氟喹诺酮类恩诺沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星、恶喹酸标准品以及其他类型抗生素阿奇霉素、罗红霉素、氯霉素、四环素、土霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、林可霉素、克林霉素标准品(1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005ng mL-1)，来证明该检测体系的特异性。绘制标准曲线，计算IC50及交叉反应率。结果如表4。
表4
Figure BDA0003108429440000141
Figure BDA0003108429440000151
结果表明，本方法对于氟喹诺酮类结构类似物具有一定的交叉反应，但是对于其他类型的抗生素没有交叉反应，证明该方法在氟喹诺酮类抗生素的检测中具有优异的选择性。
实施例5实验条件的优化
为了获得最佳实验条件，提高检测体系的灵敏度，对一系列实验参数进行了优化。实验结果用RLUmax、IC50和RLUmax/IC50来表示，RLU为相对光单位(relative light unit，RLU)，当IC50越低、RLUmax/IC50越高时，检测方法的灵敏度越高。
(1)按照实施例1的方法制备、实施例3的方法检测，区别仅在于改变ALP-SA的偶联量(50μg、100μg、200μg、300μg、400μg)；化学发光和荧光信号的实验结果分别如图8和图9所示；
(2)按照实施例3的方法检测，区别仅在于改变诺氟沙星抗体的稀释倍数(1：1000、1：2000、1：3000、1：4000、1：5000)；化学发光的实验结果如图10所示；
(3)按照实施例3的方法检测，区别仅在于改变NOR-Bio的稀释倍数(1：1000、1：2000、1：3000、1：4000、1：5000)；化学发光的实验结果如图11所示；
(4)按照实施例3的方法检测，区别仅在于改变甲醇PBS中甲醇的含量(5％、10％、20％、30％、40％)；化学发光的实验结果如图12所示；
(5)按照实施例3的方法检测，区别仅在于改变反应体系(保存标记有生物素的氟喹诺酮类化合物、氟喹诺酮类化合物标准品、喹诺酮类化合物的单克隆抗体、偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球的溶液)的pH值(5.4、6.4、7.4、8.4、9.4)，化学发光的实验结果如图13所示。
图8和图9所示，ALP-SA的最佳偶联量为200μg。
图10所示，诺氟沙星单克隆抗体的最佳稀释倍数为2000倍；
图11所示，当NOR-Bio稀释倍数为1000倍时，IC50最小，同时RLUmax/IC50最大，因此，确定1000倍为NOR-Biotin的最佳稀释倍数；
图12所示，甲醇PBS的最佳浓度为5％。
图13所示，反应体系的最佳pH为7.4。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种用于检测氟喹诺酮类化合物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体、多孔化学发光酶标板、标记有生物素的氟喹诺酮类化合物、氟喹诺酮类化合物标准品和碱性磷酸酶的化学发光底物和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球，
优选的，该试剂盒包括：诺氟沙星单克隆抗体、多孔化学发光酶标板、标记有生物素的诺氟沙星化合物、诺氟沙星标准品和碱性磷酸酶的化学发光底物和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氟喹诺酮类化合物单克隆抗体包被于所述多孔化学发光酶标板上，
优选的，所述多孔化学发光酶标板中每孔包被有所述氟喹诺酮类化合物单克隆抗体50～200μL/孔，更优选100μL/孔；所述氟喹诺酮类化合物单克隆抗体的稀释倍数为1：500～4000，优选为1：2000。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记有生物素的氟喹诺酮类化合物的稀释倍数为1：500～4000，优选为1：1000。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有稀释液1和稀释液2；
所述稀释液1用于稀释所述标记有生物素的氟喹诺酮类化合物和所述氟喹诺酮类化合物标准品，所述稀释液2用于稀释所述氟喹诺酮类化合物的单克隆抗体和偶联有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的量子点微球；
所述稀释液1为含有甲醇、浓度为0.01M的PBS溶液，甲醇的体积百分比浓度为5～40％，优选为5％；优选的，所述稀释液1的pH为7.4；
所述稀释液2为含有质量百分比浓度为1％的BSA、质量百分比浓度为5％的蔗糖、浓度为0.01M的PBS溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，氟喹诺酮类化合物标准品的浓度范围为0.005～1000ng/mL；优选浓度为1000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005ng/mL；
优选的，偶联有量子点微球的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的浓度为10～50nM，优选为20nM。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每400μmol量子点微球上偶联的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的质量为50～400μg，优选为200μg。
7.一种氟喹诺酮类化合物的检测方法，其特征在于，采用权利要求1～6任一项所述的试剂盒，至少包括以下步骤：
S1、将所述氟喹诺酮类化合物抗体包被于多孔化学发光板，孵育、洗涤后，封闭；
S2、在所述多孔化学发光板的孔中添加所述标记有生物素的氟喹诺酮类化合物，然后添加所述氟喹诺酮类化合物标准品或待测样品，反应后洗涤；
S3、在所述多孔化学发光板的孔中继续添加所述偶联有量子点微球的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，孵育后洗涤；
S4、用酶标仪检测荧光，添加碱性磷酸酶的化学发光底物后，立即用化学发光免疫分析仪测量相对光单位；
S5、根据一系列稀释浓度的诺氟沙星标准品检测得到的荧光值和相对光单位分别绘制标准曲线；将待测样品所对应的荧光值和相对光单位获得待测样品的浓度。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述标记有生物素的氟喹诺酮类化合物以点击化学方法合成得到。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，多孔化学发光板的每孔包被氟喹诺酮类化合物抗体50～200μL，更优选100μL；
优选的，氟喹诺酮类化合物标准品或待测样品每孔添加50μL；
更优选的，偶联有量子点微球的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素每孔添加100μL。
更进一步优选的，在S1～S3中，反应的温度为37℃。
10.根据权利要求1～6任一项所述的检测试剂盒或7～9任一项所述的检测方法，所述氟喹诺酮类化合物选自洛美沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星。
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